ＨＲＰの測定方法
【目的】 ＨＲＰの測定条件を確立してその検出感度を向上させる。
【構成】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定する際に、上記発光測定試薬の緩衝液としてトリス緩衝液を用いると共に、この発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)とする。好ましくはＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)とする。更に好ましくはルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)とする。
【構成】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定する際に、上記発光測定試薬の緩衝液としてトリス緩衝液を用いると共に、この発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)とする。好ましくはＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)とする。更に好ましくはルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)とする。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床検査、微量分析等における西洋わさびペルオキシターゼ（ホースラディッシュペルオキシターゼ；ＨＲＰ）の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＨＲＰは生化学分析、臨床検査等の分野でよく用いられる代表的な酵素であり、特に微量分析が期待できるので、様々な測定に用いられている。
【０００３】このＨＲＰを用いた測定における測定条件は、例えば1986 G.H.G.Thorpe Methods in Enzymology 133,331-353、Enhanced Chemiluminescent reactions Catalyzed by Horseradish Peroxidase等の文献に述べられており、通常は以下のような測定条件が用いられている。
【０００４】
【表１】
発光測定試薬（0.1mol/l Tris buffer pＨ8.5) ルミノール（luminol） 61.6(μmol/l) 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2） 20.6(mmol/l) Ｐ−ヨードフェノール（P-iodophenol） 374(μmol/l)（最終濃度）
（各１ml）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＨＲＰを高感度に測定する事はそのＨＲＰを検出系に利用した測定系そのものの感度を上昇させることになり、実用上の意義はきわめて大きい。
【０００６】しかし、ＨＲＰの検出時における測定条件は未だ確立されてはおらず、最適なＨＲＰ測定条件の選定が求められている。
【０００７】本発明は上記背景のもとになされたものであり、ＨＲＰの測定条件を確立してその検出感度を向上させることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段及び作用】上記課題を解決するため、請求項１記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【０００９】請求項２記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１０】請求項３記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬は緩衝液としてトリス緩衝液を用いると共に、この発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)とし、かつ前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１１】請求項４記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１２】請求項５記載の発明は請求項３記載のＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１３】上記各請求項記載の発明においてはＰ−ヨードフェノール濃度、Ｈ2Ｏ2濃度、ルミノール濃度によってＨＲＰの測定感度が変化する。
【００１４】上記Ｐ−ヨードフェノールはその濃度を0.1×364(μmol/l)〜10×364(μmol/l)として測定を行うことが好ましく、特に濃度を182(μmol/l)とすると高い測定精度が得られる。
【００１５】また、Ｈ2Ｏ2はその濃度を0.1×20.6(mmol/l)〜2×20.6(mmol/l)として測定を行うことが好ましく、特に濃度を4.12(mmol/l)とすると高い測定精度が得られる。
【００１６】更に、ルミノールはその濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)として測定を行うことが好ましく、特に濃度を４.１２(μmol/l)とすると高い測定精度が得られる。
【００１７】また、ＨＲＰの測定を行う際のトリス緩衝液濃度には特に制限はなく、通常のＨＲＰ測定時と同じ濃度としてよい。好ましくはトリス緩衝液としては0.1(mol)，pＨ8.5のものを用いる。
【００１８】
【実施例】
実施例１本実施例においてはＨＲＰの測定試薬としてルミノール、過酸化水素、Ｐ−ヨードフェノールを含むトリス緩衝液を用い、この測定試薬におけるＰ−ヨードフェノールの濃度を変化させてＨＲＰの測定を行い、最適なＰ−ヨードフェノール濃度を求めた。尚、ＨＲＰの測定器としては明電舎製のルミノメータＵＰＤ−８０００を用いた。
【００１９】まず、ＨＲＰを１×１０-4(mol/l)の濃度に調製し、このＨＲＰ溶液を順次希釈してＨＲＰ濃度１０-12〜１０-7(mol/l)の標準液を調製した。
【００２０】次に、ルミノール（シグマ製）２８.５(mg)を０.２(mol/l)炭酸塩緩衝液（carbonate buffer，pＨ９.８）に溶解し、２５(ml)に調製した。
【００２１】同様に、Ｐ−ヨードフェノール（P-iodophenol，東京化成製）１００(mg)をＤＭＳＯに溶解し、２５(ml)に調製して１８.２(mmol/l)の溶液を得た。
【００２２】過酸化水素は市販の１０(mol/l)のものを用いた。
【００２３】
【表２】
基本測定試薬 ６ (mmol/l) luminol １(ml) １０ (mol/l) Ｈ2Ｏ2 ２０(μl) １８.２ (mmol/l) P-iodophenol ２(ml) ０.１ (mol/l) Tris buffer pＨ８．５ １００(ml)上記基本測定試薬を用いて、６(mmol/l)のルミノール１(ml)、１０(mmol/l)のＨ2Ｏ2２０(μl)、及びＰ−ヨードフェノールを含むトリス緩衝液１００(ml)を調整し、上記ＨＲＰの各標準液と発光反応を行った。この際、Ｐ−ヨードフェノールの最終濃度が0，0.1×364(μmol/l)，0.5×364(μmol/l)，1×364(μmol/l)，2×364(μmol/l)，10×364(μmol/l)となるようにそれぞれ試料液ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅを作成してそれぞれ検量線を作成した。その結果を順次図１のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆの各線にて示す。
【００２４】上記検量線においては、１．バックグラウンドが低い（ＨＲＰ濃度０における発光値が低い）
２．検量線の立ち上がりが良い（Ｓ／Ｎ比が大きい）
３．検量線のカーブがスムーズであることという３点を判断基準とする。
【００２５】図から明らかなように、Ｐ−ヨードフェノールの濃度が上がるにつれてバックグラウンドは低くなるが、検量線の傾きは小さくなっており試料液ｄ，ｅの検量線は良好とはいいがたい。これに対し、試料液ａ，ｂ，ｃにおいては検量線の傾きが大きく、良い検量線が得られている。最も良い検量線は試料液ｂ（Ｐ−ヨードフェノール濃度１８２(μmol/l)：最終濃度）のものである。
【００２６】実施例２実施例１と同様に、ＨＲＰを１×１０-4(mol/l)の濃度に調製して順次希釈することにより、１０-13〜１０-7(mol/l)の検量線用の標準液を作成した。
【００２７】次に、実施例１に示した基本測定試薬を用いて６(mmol/l)のルミノール1(ml)、１０(mol/l)のＨ2Ｏ2２０(μl)、３６４(μmol/l)のＰ−ヨードフェノール２(ml)を含む0.1(mol/l)のトリス緩衝液１００(ml)を調整し、上記ＨＲＰの各標準液と発光反応を行った。
【００２８】この際、上記トリス緩衝液におけるＨ2Ｏ2濃度を0，0.1×20.6(mmol/l)，0.2×20.6(mmol/l)，0.5×20.6(mmol/l)，１×20.6(mmol/l)，２×20.6(mmol/l)としてそれぞれ試料液ｆ，ｇ，ｈ，ｉ，ｊ，ｋを作成し、それぞれ検量線を作成した。その結果を順次図２のＦ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋの各線にて示す。
【００２９】実施例１と同様に、上記検量線においては、１．バックグラウンドが低い（ＨＲＰ濃度０における発光値が低い）
２．検量線の立ち上がりが良い（Ｓ／Ｎ比が大きい）
３．検量線のカーブがスムーズであることという３点を判断基準とする。
【００３０】図２から明らかなように、Ｐ−ヨードフェノールの濃度が上がるにつれてバックグラウンドは高くなり、検量線の傾きも小さくなって検量線の精度が低くなっていることがわかる。
【００３１】しかし、Ｈ〜Ｋ線にてはＨＲＰ濃度が10-12(mol/l)程度で検量線が立ち上がるのに対し、Ｐ−ヨードフェノール濃度が0.1×20.6(mmol/l)と低いＧ線にては，ＨＲＰ濃度10-11(mol/l)程度にてようやく検量線が立ち上がっており、検量線の立ち上がりが悪くなっている。
【００３２】従って、最も良い検量線は試料液ｈ（Ｈ2Ｏ2濃度４.１２(mmol/l)：最終濃度）のものであるが、試料液ｇ，ｉ，ｊ，ｋおける検量線においても比較的良好な検量線が得られていることがわかる。
【００３３】実施例３実施例１と同様に、ＨＲＰを１×１０-4(mol/l)の濃度に調製して順次希釈することにより、１０-13〜１０-7(mol/l)の検量線用の標準液を作成した。
【００３４】次に、実施例１に示した基本測定試薬を用いて、ルミノール、１０(mol/l)のＨ2Ｏ220(μl)、１８.２(mmol/l)のＰ−ヨードフェノール２(ml)を含む0.1(mol/l)のトリス緩衝液１００(ml)を調整し、上記ＨＲＰの各標準液と発光反応を行った。
【００３５】この際、上記トリス緩衝液におけるルミノール濃度を20.6(μmol/l)としたものを基本として、ルミノール濃度がそれぞれ0，0.1×20.6(μmol/l)，0.2×20.6(μmol/l)，0.5×20.6(μmol/l)，１×20.6(μmol/l)である試料液ｌ，ｍ，ｎ，ｏ，ｐを作成し、それぞれ検量線を作成した。その結果を順次図３のＬ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐの各線にて示す。
【００３６】実施例１と同様に、上記検量線においては、１．バックグラウンドが低い（ＨＲＰ濃度０における発光値が低い）
２．検量線の立ち上がりが良い（Ｓ／Ｎ比が大きい）
３．検量線のカーブがスムーズであることという３点を判断基準とする。
【００３７】図３から明らかなように、ルミノールの濃度が上がるにつれてバックグラウンドは高くなり、検量線の傾きも小さくなる（検量線Ｏ，Ｐ）。従って検量線の精度が低くなることがわかる。
【００３８】これに対し、ルミノール濃度が低くなると検量線の立ち上がりが悪くなり、低濃度領域を測定することが困難となる（検量線Ｍ）。
【００３９】従って、最も良い検量線は試料液ｎの検量線Ｎ（ルミノール濃度４.１２(μmol/l)：最終濃度）であるが、試料液ｍ，ｏにおいても比較的良好な検量線Ｍ，Ｏが得られていることがわかる。
【００４０】
【発明の効果】本発明によれば、ＨＲＰを高感度に検出できるので様々な測定系を高感度化できる。
【００４１】また、特殊な設備や試薬等を必要としないので、容易に測定を行うことができ、経済的にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各Ｐ−ヨードフェノール濃度におけるＨＲＰ濃度と発光強度との相関を示すグラフ。
【図２】各Ｈ2Ｏ2濃度におけるＨＲＰ濃度と発光強度との相関を示すグラフ。
【図３】各ルミノール濃度におけるＨＲＰ濃度と発光強度との相関を示すグラフ。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床検査、微量分析等における西洋わさびペルオキシターゼ（ホースラディッシュペルオキシターゼ；ＨＲＰ）の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＨＲＰは生化学分析、臨床検査等の分野でよく用いられる代表的な酵素であり、特に微量分析が期待できるので、様々な測定に用いられている。
【０００３】このＨＲＰを用いた測定における測定条件は、例えば1986 G.H.G.Thorpe Methods in Enzymology 133,331-353、Enhanced Chemiluminescent reactions Catalyzed by Horseradish Peroxidase等の文献に述べられており、通常は以下のような測定条件が用いられている。
【０００４】
【表１】
発光測定試薬（0.1mol/l Tris buffer pＨ8.5) ルミノール（luminol） 61.6(μmol/l) 過酸化水素（Ｈ2Ｏ2） 20.6(mmol/l) Ｐ−ヨードフェノール（P-iodophenol） 374(μmol/l)（最終濃度）
（各１ml）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＨＲＰを高感度に測定する事はそのＨＲＰを検出系に利用した測定系そのものの感度を上昇させることになり、実用上の意義はきわめて大きい。
【０００６】しかし、ＨＲＰの検出時における測定条件は未だ確立されてはおらず、最適なＨＲＰ測定条件の選定が求められている。
【０００７】本発明は上記背景のもとになされたものであり、ＨＲＰの測定条件を確立してその検出感度を向上させることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段及び作用】上記課題を解決するため、請求項１記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【０００９】請求項２記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１０】請求項３記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬は緩衝液としてトリス緩衝液を用いると共に、この発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)とし、かつ前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１１】請求項４記載の発明はルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１２】請求項５記載の発明は請求項３記載のＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法を提供する。
【００１３】上記各請求項記載の発明においてはＰ−ヨードフェノール濃度、Ｈ2Ｏ2濃度、ルミノール濃度によってＨＲＰの測定感度が変化する。
【００１４】上記Ｐ−ヨードフェノールはその濃度を0.1×364(μmol/l)〜10×364(μmol/l)として測定を行うことが好ましく、特に濃度を182(μmol/l)とすると高い測定精度が得られる。
【００１５】また、Ｈ2Ｏ2はその濃度を0.1×20.6(mmol/l)〜2×20.6(mmol/l)として測定を行うことが好ましく、特に濃度を4.12(mmol/l)とすると高い測定精度が得られる。
【００１６】更に、ルミノールはその濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)として測定を行うことが好ましく、特に濃度を４.１２(μmol/l)とすると高い測定精度が得られる。
【００１７】また、ＨＲＰの測定を行う際のトリス緩衝液濃度には特に制限はなく、通常のＨＲＰ測定時と同じ濃度としてよい。好ましくはトリス緩衝液としては0.1(mol)，pＨ8.5のものを用いる。
【００１８】
【実施例】
実施例１本実施例においてはＨＲＰの測定試薬としてルミノール、過酸化水素、Ｐ−ヨードフェノールを含むトリス緩衝液を用い、この測定試薬におけるＰ−ヨードフェノールの濃度を変化させてＨＲＰの測定を行い、最適なＰ−ヨードフェノール濃度を求めた。尚、ＨＲＰの測定器としては明電舎製のルミノメータＵＰＤ−８０００を用いた。
【００１９】まず、ＨＲＰを１×１０-4(mol/l)の濃度に調製し、このＨＲＰ溶液を順次希釈してＨＲＰ濃度１０-12〜１０-7(mol/l)の標準液を調製した。
【００２０】次に、ルミノール（シグマ製）２８.５(mg)を０.２(mol/l)炭酸塩緩衝液（carbonate buffer，pＨ９.８）に溶解し、２５(ml)に調製した。
【００２１】同様に、Ｐ−ヨードフェノール（P-iodophenol，東京化成製）１００(mg)をＤＭＳＯに溶解し、２５(ml)に調製して１８.２(mmol/l)の溶液を得た。
【００２２】過酸化水素は市販の１０(mol/l)のものを用いた。
【００２３】
【表２】
基本測定試薬 ６ (mmol/l) luminol １(ml) １０ (mol/l) Ｈ2Ｏ2 ２０(μl) １８.２ (mmol/l) P-iodophenol ２(ml) ０.１ (mol/l) Tris buffer pＨ８．５ １００(ml)上記基本測定試薬を用いて、６(mmol/l)のルミノール１(ml)、１０(mmol/l)のＨ2Ｏ2２０(μl)、及びＰ−ヨードフェノールを含むトリス緩衝液１００(ml)を調整し、上記ＨＲＰの各標準液と発光反応を行った。この際、Ｐ−ヨードフェノールの最終濃度が0，0.1×364(μmol/l)，0.5×364(μmol/l)，1×364(μmol/l)，2×364(μmol/l)，10×364(μmol/l)となるようにそれぞれ試料液ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅを作成してそれぞれ検量線を作成した。その結果を順次図１のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆの各線にて示す。
【００２４】上記検量線においては、１．バックグラウンドが低い（ＨＲＰ濃度０における発光値が低い）
２．検量線の立ち上がりが良い（Ｓ／Ｎ比が大きい）
３．検量線のカーブがスムーズであることという３点を判断基準とする。
【００２５】図から明らかなように、Ｐ−ヨードフェノールの濃度が上がるにつれてバックグラウンドは低くなるが、検量線の傾きは小さくなっており試料液ｄ，ｅの検量線は良好とはいいがたい。これに対し、試料液ａ，ｂ，ｃにおいては検量線の傾きが大きく、良い検量線が得られている。最も良い検量線は試料液ｂ（Ｐ−ヨードフェノール濃度１８２(μmol/l)：最終濃度）のものである。
【００２６】実施例２実施例１と同様に、ＨＲＰを１×１０-4(mol/l)の濃度に調製して順次希釈することにより、１０-13〜１０-7(mol/l)の検量線用の標準液を作成した。
【００２７】次に、実施例１に示した基本測定試薬を用いて６(mmol/l)のルミノール1(ml)、１０(mol/l)のＨ2Ｏ2２０(μl)、３６４(μmol/l)のＰ−ヨードフェノール２(ml)を含む0.1(mol/l)のトリス緩衝液１００(ml)を調整し、上記ＨＲＰの各標準液と発光反応を行った。
【００２８】この際、上記トリス緩衝液におけるＨ2Ｏ2濃度を0，0.1×20.6(mmol/l)，0.2×20.6(mmol/l)，0.5×20.6(mmol/l)，１×20.6(mmol/l)，２×20.6(mmol/l)としてそれぞれ試料液ｆ，ｇ，ｈ，ｉ，ｊ，ｋを作成し、それぞれ検量線を作成した。その結果を順次図２のＦ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋの各線にて示す。
【００２９】実施例１と同様に、上記検量線においては、１．バックグラウンドが低い（ＨＲＰ濃度０における発光値が低い）
２．検量線の立ち上がりが良い（Ｓ／Ｎ比が大きい）
３．検量線のカーブがスムーズであることという３点を判断基準とする。
【００３０】図２から明らかなように、Ｐ−ヨードフェノールの濃度が上がるにつれてバックグラウンドは高くなり、検量線の傾きも小さくなって検量線の精度が低くなっていることがわかる。
【００３１】しかし、Ｈ〜Ｋ線にてはＨＲＰ濃度が10-12(mol/l)程度で検量線が立ち上がるのに対し、Ｐ−ヨードフェノール濃度が0.1×20.6(mmol/l)と低いＧ線にては，ＨＲＰ濃度10-11(mol/l)程度にてようやく検量線が立ち上がっており、検量線の立ち上がりが悪くなっている。
【００３２】従って、最も良い検量線は試料液ｈ（Ｈ2Ｏ2濃度４.１２(mmol/l)：最終濃度）のものであるが、試料液ｇ，ｉ，ｊ，ｋおける検量線においても比較的良好な検量線が得られていることがわかる。
【００３３】実施例３実施例１と同様に、ＨＲＰを１×１０-4(mol/l)の濃度に調製して順次希釈することにより、１０-13〜１０-7(mol/l)の検量線用の標準液を作成した。
【００３４】次に、実施例１に示した基本測定試薬を用いて、ルミノール、１０(mol/l)のＨ2Ｏ220(μl)、１８.２(mmol/l)のＰ−ヨードフェノール２(ml)を含む0.1(mol/l)のトリス緩衝液１００(ml)を調整し、上記ＨＲＰの各標準液と発光反応を行った。
【００３５】この際、上記トリス緩衝液におけるルミノール濃度を20.6(μmol/l)としたものを基本として、ルミノール濃度がそれぞれ0，0.1×20.6(μmol/l)，0.2×20.6(μmol/l)，0.5×20.6(μmol/l)，１×20.6(μmol/l)である試料液ｌ，ｍ，ｎ，ｏ，ｐを作成し、それぞれ検量線を作成した。その結果を順次図３のＬ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐの各線にて示す。
【００３６】実施例１と同様に、上記検量線においては、１．バックグラウンドが低い（ＨＲＰ濃度０における発光値が低い）
２．検量線の立ち上がりが良い（Ｓ／Ｎ比が大きい）
３．検量線のカーブがスムーズであることという３点を判断基準とする。
【００３７】図３から明らかなように、ルミノールの濃度が上がるにつれてバックグラウンドは高くなり、検量線の傾きも小さくなる（検量線Ｏ，Ｐ）。従って検量線の精度が低くなることがわかる。
【００３８】これに対し、ルミノール濃度が低くなると検量線の立ち上がりが悪くなり、低濃度領域を測定することが困難となる（検量線Ｍ）。
【００３９】従って、最も良い検量線は試料液ｎの検量線Ｎ（ルミノール濃度４.１２(μmol/l)：最終濃度）であるが、試料液ｍ，ｏにおいても比較的良好な検量線Ｍ，Ｏが得られていることがわかる。
【００４０】
【発明の効果】本発明によれば、ＨＲＰを高感度に検出できるので様々な測定系を高感度化できる。
【００４１】また、特殊な設備や試薬等を必要としないので、容易に測定を行うことができ、経済的にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各Ｐ−ヨードフェノール濃度におけるＨＲＰ濃度と発光強度との相関を示すグラフ。
【図２】各Ｈ2Ｏ2濃度におけるＨＲＰ濃度と発光強度との相関を示すグラフ。
【図３】各ルミノール濃度におけるＨＲＰ濃度と発光強度との相関を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項２】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項３】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬は緩衝液としてトリス緩衝液を用いると共に、この発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)とし、かつ前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項４】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項５】 請求項３記載のＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項１】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項２】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項３】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬は緩衝液としてトリス緩衝液を用いると共に、この発光測定試薬中のＨ2Ｏ2濃度を２.０６〜４１.２(mmol/l)とし、かつ前記発光測定試薬中のＰ−ヨードフェノール濃度を３６.４〜３６４(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項４】 ルミノール、Ｈ2Ｏ2、Ｐ−ヨードフェノールを含む発光測定試薬とＨＲＰとを反応させ、この反応時における発光量に基づいてＨＲＰの濃度を決定するＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【請求項５】 請求項３記載のＨＲＰの測定方法において、前記発光測定試薬中のルミノール濃度を２.０６〜１０.３(μmol/l)としたことを特徴とするＨＲＰの測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開平６−１６９７９７
【公開日】平成６年（１９９４）６月２１日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−１１０８２０
【出願日】平成５年（１９９３）５月１３日
【出願人】（０００００６１０５）株式会社明電舎 (1,739)
【公開日】平成６年（１９９４）６月２１日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）５月１３日
【出願人】（０００００６１０５）株式会社明電舎 (1,739)
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