ＲＮＡウイルス由来植物発現システム
【課題】植物、植物の部分、又は植物細胞において目的配列を発現させる。
【解決手段】植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：（ａ）転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、ここで、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）目的配列、を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる；及び（ｂ）目的配列を発現させること、を含む前記方法。
【解決手段】植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：（ａ）転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、ここで、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）目的配列、を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる；及び（ｂ）目的配列を発現させること、を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的配列を発現させるためのＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡを有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に関するものである。また、本発明は、目的配列を植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において発現させる方法を提供する。本方法及びベクターは、ＲＮＡウイルス由来ＲＮＡレプリコンの形成頻度が上昇した植物細胞を提供する。異種ＤＮＡ又はその部分は、植物の核染色体ＤＮＡ若しくはエピソームＤＮＡに安定に組込まれるか、又は一過性に送達されることができる。また、本発明は、（ＲＮＡ）ウイルスベクター又は（ＲＮＡ）ウイルスレプリコンを用いた植物のアグロバクテリウム介在形質転換法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物トランス遺伝子発現システムの中で、異種プロモーター制御下のトランス遺伝子発現がここ数年使用されている。そのような慣用の植物発現システムとは別に、ウイルスに基づいた発現システムは、植物における迅速なタンパク質産生に用いることができ（概説として：Ｐｏｒｔａ及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０、８１−９４を参照されたい）、機能ゲノミクス研究の強力な手段となっている（Ｄａｌｍａｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１２、３６９−３７９；Ｒａｔｃｌｉｆｆら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２５、２３７−２４５；Ｅｓｃｏｂａｒら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１５、１５０７−１５２３）。当該分野における多数の出版物及び特許は、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクターに基づいたシステムについて記載している（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５；Ｍｏｒら、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８１、４３０−４３７；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５９８１２３６号；ＷＯ０２／０８８３６９号；ＷＯ０２／０９７０８０号；ＷＯ９８／５４３４２号）。既存のウイルスベクターシステムは、最良の性能の点から見ると、通常、狭い宿主範囲に限定され、最も好ましい宿主におけるそのようなベクターの発現レベルでさえも、システムの生物学的上限を遙かに下回る。ウイルスに基づいたシステムの重要な課題は、ウイルスレプリコンを植物細胞へ送達する方法である。最も広範に利用される大量産生（例えば農場又は温室における多くの植物での同時産生）のための送達法は、ＲＮＡウイルスベクターの感染性コピーの使用である（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１６７９−１６８３）。組換えウイルスＲＮＡベクターは複製サイクルのあいだに異種挿入物を欠失する傾向が比較的高いため、この方法はＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を必要とし、その結果、非効率的で高価である。送達問題を解決するための他のアプローチは、ウイルスベクターの機能を補完することによって（例えばヘルパーウイルスを用いる−ＵＳ５９６５７９４号）又は他の調節されたスイッチシステムを使用することによって（例えば部位特異的組換え−ＵＳ６６３２９８０号）複製プロセスが誘発されると放出される、トランスジェニック植物の各細胞におけるウイルスＲＮＡレプリコン前駆体の存在であろう。
【０００３】
特許化技術を含めた当該分野における多くの出版物にもかかわらず、主に２つの主要な理由のために、十分な効率で作用し、商業的高収率産生を生ずるウイルスに基づいた大量産生システムは依然として存在しない。第１に、一過性の植物ウイルスに基づいた発現システムは、通常、環境因子への感受性のために大量培養に適さない特定の宿主に限定される。その上、このシステムは、通常、植物宿主の特定部分に限定され、大部分の植物バイオマスを産生プロセスから排除し、その結果、単位植物バイオマスあたりの組換え産物の相対収率を、トランスジェニック植物における慣用の転写プロモーターによって達成可能なレベルに匹敵するレベルまで最小化する。第２に、ウイルスレプリコン前駆体を各細胞に安定に組み込んだトランスジェニック植物宿主を作製することによってウイルスに基づいた産生システムをスケールアップする試みは、特に、その位置におけるレプリコンの性能の低さ、レプリコンから発現されるべき目的遺伝子の「漏出性」、及びそのベクターのための効率的スイッチシステムの不足のいずれかのために、解決策を提供していない。ＲＮＡレプリコン形成の誘因としてＰＴＧＳサイレンシングのサプレッサーを用いることによって、ＰＶＸに基づいたベクターである種の進歩は達成されたが（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）、ウイルスベクターの複製を誘発するスイッチ（ＰＴＧＳサプレッサー）の効率的制御に提供される解決策がないので、このシステムは依然として実用的ではない。しかしながら、このシステムは、このタイプのシステムについてこれまでに知られた中で最高である、全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の３％に達するＧＵＳ遺伝子の発現レベルを提供したが、依然として、強力なプロモーター制御下の慣用のトランス遺伝子発現システムに等しい。植物tripartite ＲＮＡウイルス、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）、に基づいた他の誘導性システム（Ｍｏｒｉら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２７、７９−８６）は、目的タンパク質の収率が非常に低かった（生の重量１ｇあたり３〜４μｇ）。これは標準的転写プロモーターによって提供される収率に匹敵する。
【０００４】
植物発現システムでこれまでに達成された発現レベルの低さが、これらのシステムが細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の発現システムにほとんど競合しない主な理由である。低発現レベルは、植物材料の巨大な背景において、タンパク質の単離及び精製のための非常に高い下流コストを生じさせる。したがって、単位植物バイオマスあたりの目的のタンパク質又は産物の収率が増加するにつれて、下流処理費用が急激に減少する。
【０００５】
現在のところ、その収率及び効率が十分に高く、細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の大規模発現システムと市場で競合するような大規模植物トランス遺伝子発現システムはない。そのような植物の発現は以下の基準をできる限り満たす必要があるであろう：
（ｉ） 高収率、できる限り多くの植物組織及びその組織の多くの細胞における目的タンパク質の発現を含む；
（ｉｉ） 植物増殖に対するタンパク質発現の有害効果を妨げるため、目的のタンパク質又は産物の発現は、所望の時点で発現のスイッチを入れることができるように切換可能である必要がある；
（ｉｉｉ） 切換は、１つの植物の全ての組織又は細胞で同時に又はほとんど同時に発現のスイッチを入れることができ、それと同時に、植物の選択したグループ全ての植物、例えば植物の選択したロット全ての植物で同時に又はほとんど同時に発現のスイッチを入れることができる必要がある。典型的には、目的のタンパク質又は産物は、ある時点まで産物又はタンパク質を産生する各細胞に蓄積する。しかしながら、蓄積のあいだ、目的のタンパク質又は産物の収率又は品質が低下する傾向にある分解プロセスが高頻度で進む。したがって、発現スイッチを入れた後、目的の産物又はタンパク質を回収すべき最適な時点がある。この最適な時点は、１つの植物の全ての組織又は細胞、及び選択したロットの全ての植物において同時に到達し、全体的なプロセスを効率的且つ有益にする必要がある。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、高収率植物発現システムのためのトランスジェニック植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を提供することである。本発明の他の目的は、目的配列を、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において一過性に発現させる方法を提供することである。本発明の他の目的は、１以上の目的配列を、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において効率的に発現させる方法を提供することであり、この方法は、大規模で効率的に用いることができる。更に、本発明の目的は、目的核酸配列の発現を、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において制御する方法を提供することであり、これは生態学的及び生物学的安全性を改善する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ５３１６９３１号
【特許文献２】ＵＳ５５８９３６７号
【特許文献３】ＵＳ５８６６７８５号
【特許文献４】ＵＳ５４９１０７６号
【特許文献５】ＵＳ５９７７４３８号
【特許文献６】ＵＳ５９８１２３６号
【特許文献７】ＷＯ０２／０８８３６９号
【特許文献８】ＷＯ０２／０９７０８０号
【特許文献９】ＷＯ９８／５４３４２号
【特許文献１０】ＵＳ５９６５７９４号
【特許文献１１】ＵＳ６６３２９８０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｏｒｔａ及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、２０９−２２１
【非特許文献２】Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０、８１−９４
【非特許文献３】Ｄａｌｍａｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１２、３６９−３７９
【非特許文献４】Ｒａｔｃｌｉｆｆら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２５、２３７−２４５
【非特許文献５】Ｅｓｃｏｂａｒら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１５、１５０７−１５２３
【非特許文献６】Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４２７−４３０
【非特許文献７】Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５
【非特許文献８】Ｍｏｒら、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８１、４３０−４３７
【非特許文献９】Ｋｕｍａｇａｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１６７９−１６８３
【非特許文献１０】Ｍｏｒｉら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２７、７９−８６
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
上記目的は、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する、形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物によって達成され、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
（ｉｉ） ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列に対応し、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮する。その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させることができる。植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞は、異種ＤＮＡで安定に形質転換されることが好ましい。
【００１０】
更に、上記目的は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法によって達成され、この方法は：
（ａ） 上で定義したとおりの異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、及び
（ｂ） 目的配列の発現を引き起こすこと、
を含む。
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞は、異種ＤＮＡで安定に又は一過性に形質転換することができる。
【００１１】
また、本発明は、上で定義したとおりの異種ＤＮＡで核染色体を安定に形質転換したトランスジェニック植物を作製する方法を提供し、この方法は、植物又は植物の部分を異種ＤＮＡを含有するベクターで形質転換し、核染色体に異種ＤＮＡを含有する植物の組織を選択し、そしてトランスジェニック植物を組織から再生することを含む。
【００１２】
更に、本発明は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を一過性に発現させる方法を提供し、この方法は：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡで形質転換させることを含み、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列
（ｉｉ） 目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮する。その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させることができる。
【００１３】
更に、本発明は、本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を作製するため、又は本発明の方法を実施するための核酸分子を提供する。この核酸分子は、特許請求の範囲に定義したとおりであり、更に、本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物、及び方法を参照して以下に記載のように定義される。
【００１４】
本発明者らは、ＲＮＡウイルスレプリコンをコードする異種ＤＮＡを植物又は植物の部分の核染色体に導入してＲＮＡレプリコンにコードされた目的タンパク質を発現させたところ、ＲＮＡレプリコンが細胞質に出現する頻度は非常に低く、異種ＤＮＡを含有する細胞の小さな画分でのみ起こることを見出した。したがって、目的タンパク質の発現レベルも非常に低かった。この問題について考えられる多くの理由には、染色体の位置効果、不適当な転写調節因子、遺伝子サイレンシング、核から細胞質へのレプリコンの欠陥輸送、転写に対する目的配列の有害効果、ＲＮＡプロセシング又はレプリコン機能などが挙げられると考えられた。このように、驚くべきことに、レプリコンのＡ／Ｔ（Ｕ）に富んだ特定の配列部分が、細胞質におけるレプリコン形成頻度の低さに関与することを見出した。Ａ／Ｔ（Ｕ）に富んだ配列部分の有害効果が抑制されると、細胞質におけるレプリコン形成頻度は強力に上昇し、目的タンパク質の収率が強力に増加した。
【００１５】
本発明の効率は、植物発現システムの新たな局面が達成されるものである。本発明で達成可能な発現レベルは、下流処理（目的タンパク質の分離及び精製を含む）費用が低く、本発明の方法が他の大量発現システムに十分競合するものである。安定に形質転換された植物を用いる先行技術発現システムでは、ウイルスに基づいたベクターを用いる場合であっても、レプリコンは細胞の小さな画分で産生されるため、発現レベルが低い。植物中に伝播したレプリコンは、伝播は遅く、特に長距離に及ぶため、この問題を是正できない。したがって、発現は植物内で均一に進行せず、植物のある部分では目的タンパク質の分解がすでに起こり、他ではタンパク質発現が開始してもいないであろう。本発明は、植物全体に均一に発現を誘発させる。レプリコンを産生しない細胞の小さな画分は、隣接細胞からレプリコンによって迅速に侵入され得る。本発明は、大規模で用いることができる最初の高収率植物発現システムを提供する。本発明は、同一細胞において２以上のレプリコンの産生も可能にし、２つのレプリコンを同一細胞に有する可能性は依然として非常に高い。更に、本発明の発現システムの効率は、ＲＮＡウイルスの植物特異性を限定するものが軽減されるものである。
【００１６】
上記のような改善された効率は、植物、植物の部分、又は植物細胞の一過性形質転換と同様に、安定な形質転換と組み合わせて達成することができる。
（場合により安定に）形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物、及び核酸分子は、ＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡを有する。ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
（ｉｉ） ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有する。
【００１７】
ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列（ｉｉ）を含有する。発現されるべき目的配列は、植物の機能を抑制するＲＮＡ干渉のためのＲＮＡのような目的ＲＮＡの形成をもたらすことができる。しかしながら、目的配列は目的タンパク質をコードし、例えばＲＮＡレプリコン又はＲＮＡレプリコンのサブゲノムＲＮＡから、目的タンパク質を翻訳するための調節配列を含有することが好ましい。目的配列は、目的タンパク質を特定細胞成分に標的化するか又は目的配列を分泌するための標的シグナルをコードする配列を含むことができる。目的タンパク質を標的シグナルから分離するためのアミノ酸配列をコードすることもできる。目的配列は、植物ＲＮＡウイルスのあらゆる配列に対して異種の配列である。即ち、本発明の方法は、植物又は植物の葉への野生型植物ＲＮＡウイルスの形質転換に限定される場合を含まない。したがって、目的タンパク質は、レプリコン機能に関する配列が由来する植物ＲＮＡウイルスによってコードされるタンパク質ではない。
【００１８】
ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列（ｉ）は、とりわけ前者は後者のＤＮＡコピーであり得る点で、植物ＲＮＡウイルスの配列に相当する。レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡレプリコンに、細胞質で複製するための機能を提供する。レプリコン機能に関する配列は、典型的には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）のような、複製に関与する１以上のタンパク質をコードする。レプリコン機能に関する配列は、移行タンパク質又はコートタンパク質のように、植物でＲＮＡウイルスの細胞間伝播又は全体伝播に関与する１以上のタンパク質のような、ＲＮＡレプリコンの機能を更にコードすることができる。植物ＲＮＡウイルスはレプリコン機能を容易に利用可能な供給源であるため、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列に由来することが好ましい。「由来する」とは、レプリコン機能に関する配列が本質的にＲＮＡウイルスの対応する配列のＤＮＡコピーであり、ＤＮＡコピーは細胞核に含有されるか又は導入されるべき異種ＤＮＡの一部を作り上げることを意味する。「由来する」とは、以下に記載するように、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの対応するＲＮＡ配列の正確なＤＮＡコピーではないが、機能保存的な相違を発揮することを更に意味する。相違が機能保存的であるため、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスで実施するのと同様のレプリコン機能を実施可能なタンパク質をコードすることが好ましい。しかしながら、そのような機能保存的な相違は、そのような機能保存的な相違がない場合と比較して、コードされたウイルスタンパク質の機能性の量的相違をもたらすことができる。１つの態様では、異種ＤＮＡ及びレプリコン機能に関する配列は、コートタンパク質（特にトバモウイルスコートタンパク質）のような長距離移行に要するタンパク質をコードしない。他の態様では、異種ＤＮＡは移行タンパク質を欠失する。したがって、異種ＤＮＡのレプリコン機能に関する配列は、レプリコン機能に関する配列が由来するＲＮＡウイルスの全ての機能をコードする必要はない。
【００１９】
レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる。その相違は、全体的プロセスのスイッチがいったん入れられると、植物細胞におけるレプリコン形成頻度上昇の原因となる（以下を参照されたい）。レプリコン形成頻度の上昇とその相違との因果関係は、相違を有するレプリコン機能に関する配列と、相違を有さないレプリコン機能に関する配列とのあいだのレプリコン形成頻度を比較することによって実験的に試験することができる。こうした実験的比較は、実施例に記載するように、例えば目的配列を発現するプロトプラストを計数することによって行なうことができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のように容易に検出可能なレポータータンパク質をコードする目的配列がこの目的に用いられることが好ましい。以下に更に記載するように、細胞間伝播可能ではないＲＮＡレプリコンとの実験的比較を実施することも好ましい。
【００２０】
機能保存的な相違は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置でレプリコン機能に関する配列に導入される。選択された位置は、核で転写されたＲＮＡレプリコンが細胞質に機能性レプリコンとして出現する確率の低さの原因である植物ＲＮＡウイルスのレプリコン機能に関する配列に位置する。そのような選択された位置は、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量、即ち高Ａ含量及び／又は高Ｔ含量（ＲＮＡレベルでは高Ｕ含量）を有するか、又は潜在スプライシング部位、即ち核スプライシング装置によってスプライシング部位として認識され得る配列部分を有することが好ましい。選択された位置は、以下に例示するように、ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを解析することによって、ＲＮＡレプリコンが基づくＲＮＡウイルス中に同定することができる。更に、選択された位置は、本発明による（機能保存的）相違を発揮しないＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡで形質転換した後、植物細胞で形成されるＲＮＡを解析することにって、実験的に同定することができる。この実験解析は、ＲＴ−ＰＣＲを、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定とともにすることによって行なうことができる。ＲＴ−ＰＣＲ試験では、細胞質に到達するＲＮＡレプリコンが増幅するのを妨げるため、例えばフレームシフト変異によって、レプリカーゼが機能しないことが好ましい；そのような増幅は、細胞質で、ＲＮＡ転写物と野生型ウイルスとの汚染や、増幅したＲＮＡレプリコンの過剰発現をもたらし得る。このようにして、ＲＮＡレプリコンを破壊するスプライシングイベントを示す望ましくないスプライシング産物が同定され得る。更に、望ましくないスプライシングの正確な部位は、機能保存的な相違を選択された位置に導入することによって同定され、したがって是正され得る。
【００２１】
したがって、本発明は、目的配列を植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において発現させる方法も提供する。ここで、（Ａ） 植物、植物の部分、又は植物細胞培養物は、本明細書に定義するとおりの異種ＤＮＡを備えるが、機能保存的な相違を欠失し、（Ｂ） 異種ＤＮＡに由来するＲＮＡをレプリコン機能に関する配列の望ましくないスプライシング産物について試験し（例えばＲＴ−ＰＣＲによって）、（Ｃ） 望ましくないスプライシングイベントの位置として選択された位置を（例えばＲＴ−ＰＣＲ産物の配列において）同定し、（Ｄ） 本発明の機能保存的な相違（例えばイントロン）を、工程（Ｃ）で同定した選択された位置又はその近傍で、本発明の異種ＤＮＡを産生するための工程（Ａ）の異種ＤＮＡに導入し、そして、本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において、例えば本発明の異種ＤＮＡで安定に又は一過性に形質転換された植物から目的配列を発現させる。
【００２２】
機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコン形成頻度に対する選択された位置の有害効果を抑制することによってＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる。機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコンをコードする配列のレプリコン機能に関する配列における高Ａ／Ｔ含量の低下によって、ＲＮＡレプリコンにおける高Ａ／Ｕ含量の低下を含むことができる。高Ａ／Ｕ含量は、相違が機能保存的である場合は、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換（例えば遺伝コードの縮重を用いて）によって低下させることができる。更に、植物ＲＮＡウイルスに由来する配列のＡ／Ｕに富んだ領域に隣接した潜在スプライシング部位を除去することができる。そのような機能保存的な相違は、１ヶ所の又は好ましくは数箇所の選択された位置に導入することができる。
【００２３】
好ましい機能保存的な相違は、１以上のイントロン、最も好ましくは核イントロンの挿入を含み、又は植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍若しくはその中に核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む。驚くべきことに、Ａ／Ｕに富んだ位置に又はその近傍にイントロンを組み込むことは、ＲＮＡレプリコン形成頻度の上昇をもたらすことが見出された。いくつかのイントロンを導入することができ、導入される多数のイントロンについて本明細書に例を挙げる。１より多いイントロンの効果は累積する。更に、イントロンの挿入は、他の選択された位置で他の機能保存的な相違と組み合わせることができる。
【００２４】
図８に、発現されるべき目的遺伝子内ではあるが、核イントロンを形成可能な配列の導入例を示す。図８の例では、イントロンは、リコンビナーゼで触媒される異種ＤＮＡの一部の反転により２つの半イントロンから形成される。この原理は、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列にも適用できる。２つの異なるＲＮＡレプリコンが同一細胞内で形成される態様では、２つの異なるレプリコン間の組換えが、異なるレプリコンに存在する２つの半イントロンからイントロン形成をもらすことができる。更に、ＲＮＡレプリコンは、いずれもレプリコンではない２つの前駆体間の組換えによって形成することができる。この場合も、イントロンは、異なる前駆体分子に由来する２つの半イントロンから組み立てることができる。
【００２５】
本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物は、異種ＤＮＡで安定に形質転換されることができる。「安定に形質転換された」とは、それらが、核染色体が維持されるように異種ＤＮＡが細胞核に維持されるように、異種ＤＮＡを細胞核に含有することを意味する。異種ＤＮＡはエピソーム配列に含有されるか又はエピソーム配列であることができる。しかしながら、異種ＤＮＡは、子孫細胞又は子孫植物へ遺伝し得るように、核染色体に安定に組み込まれていることが好ましい。安定に形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の作製方法は、植物バイオテクノロジーの分野で公知である。そのような方法は、通常、選択物質及び選択可能マーカー遺伝子を用いて、安定な形質転換について形質転換体を選択する必要がある。
【００２６】
高収率の目的タンパク質を得るには、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の全ての細胞が、核に異種ＤＮＡを含有することが好ましい。より好ましくは、細胞は、核染色体に安定に組み込まれた異種ＤＮＡを含有する。植物の場合、これは、植物がトランスジェニック植物であることを意味する。
【００２７】
ＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡは、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能である。あるいは、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能である。異種ＤＮＡ又は配列が転写プロモーターに機能可能に連結されている場合は、目的配列の発現を調節可能にするために、転写プロモーターは、誘導性、組織特異的又は発生的に調節されたプロモーターのような調節されたプロモーターであることが好ましい。より好ましくは、プロモーターは誘導性であるか発生的に調節されており、それぞれ、所望の時間に発現を誘導させるか、又は植物が定義した発生段階に到達したときに発現スイッチを入れる。例えば、プロモーターが種子特異的プロモーターである場合は、目的配列の発現スイッチを植物種子で入れることができる。本発明は、ＲＮＡレプリコンを有する特定組織（例えば種子組織）を提供することに非常に価値があり、その組織は、例えば葉組織よりも、レプリコンの細胞間伝播に好適でない。最も好ましいのは、植物組織の全て又は大部分で自由自在に発現スイッチを入れることができるため、化学的に調節されたプロモーターである。最も重要なことは、化学的に誘導性のプロモーターは、化学誘導物質は多数の植物に同時に適用可能であるため、大規模応用のために選択されるプロモーターであるということである。調節されたプロモーターの例は、当該分野に公知である。大規模応用は、選択した目的配列が多くの植物で同時に発現される応用である。そのような大規模応用は、温室で実施することができる。
【００２８】
あるいは、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、転写プロモーターに機能可能に連結可能であり、ＲＮＡレプリコンをコードする配列をプロモーターに機能可能に連結することによって目的配列の発現スイッチを入れることができる。この態様を実施するいくつかの方法がある。１つのオプションは、異種ＤＮＡ内で、プロモーターと異種ＤＮＡとのあいだの機能可能な連結を排除する配列ブロックによって、ＲＮＡレプリコンをコードする配列とプロモーターとを分離することである。配列ブロックは、組換え部位を認識するリコンビナーゼによって配列ブロックを切り出せるように組換え部位に隣接し得る。それにより、ＲＮＡレプリコンをコードする配列の転写のための機能可能な連結が確立し、発現スイッチを入れることができる。他のオプションは、転写に必要な配列部分（例えばプロモーター又はプロモーター部分）を反転方向で、組換え部位に隣接して有することである。好適なリコンビナーゼが配列部分を反転させて正しい方向に戻すことができれば、機能可能な連結は確立し得る。
【００２９】
本発明の１つの態様では、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする１以上のセグメントを有する。即ち、ＲＮＡレプリコンは１つの連続したＤＮＡにはコードされていない。その代わり、ＲＮＡレプリコンは、２以上のセグメントによって不連続にコードされ、セグメントは、好ましくは互いに隣接して同一染色体上に存在し得る。したがって、ＲＮＡレプリコンの形成には、例えば組換えによるセグメントの再構成を必要とし得る。例として、レプリコン機能に関する配列の一部（例えばレプリカーゼをコードする配列の一部）は、異種ＤＮＡ中に、そのような配列の他の部分に対して反転方向で存在し得る。反転部分は組換え部位に隣接し得る。したがって、レプリコン機能を提供できないため（例えば転写物は機能性レプリカーゼをコードしていないため）、異種ＤＮＡの転写物はレプリコンではないであろう。組換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを提供することにより、レプリコン機能が連続してコードされるようにセグメントの１つを反転させて戻すことができる。この態様では、リコンビナーゼの提供が、レプリコン形成及び目的配列の発現のスイッチを入れるためのスイッチとして機能する（更に以下を参照されたい）。この態様は、安定に形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に関連して実施することが好ましい。
【００３０】
あるいは、セグメントは異なる染色体上に存在することができる。その場合、ＲＮＡレプリコンの形成は、ＲＮＡレプリコンを組み立てるために２つのセグメントの転写及び２つの転写物のトランススプライシングを必要とするであろう。この態様は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に詳細に記載されているように、子孫植物又は細胞でＲＮＡレプリコンをいっしょにコードするセグメントを迅速に分離するために用いることができる。
【００３１】
本発明の方法は、工程（ａ）及び（ｂ）を含むことができる。工程（ａ）は、本発明の異種ＤＮＡで植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を安定に又は一過性に形質転換することを含むことができる。上で議論したように、核染色体の安定な形質転換が好ましい。好ましくは、本発明の方法は、目的配列によってコードされた目的タンパク質の発現方法である。工程（ｂ）は、目的配列の発現を引き起こすこと、例えば発現スイッチを入れることを含む。発現を引き起こす又は発現スイッチを入れるさまざまな方法が既に言及されている。例として、異種ＤＮＡに機能可能に連結された誘導性プロモーターを誘導すること；組換えによって異種ＤＮＡをプロモーターへの機能可能な連結下に置くこと；組換えによってレプリコンを形成するための配列の連続したコーディングを確立することなどが挙げられる。本発明の方法のスイッチを入れるためにリコンビナーゼを用いる場合、リコンビナーゼを植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に一過性に提供することができ、それにより、工程（ｂ）のスイッチとして作用するであろう。あるいは、リコンビナーゼは細胞に安定にコードされることができ、調節された、好ましくは誘導性のプロモーターの制御下、リコンビナーゼを発現する。したがって、プロモーターを誘導することによってリコンビナーゼの発現を誘導することにより、工程（ｂ）で発現を引き起こすことができる。一過性形質転換の場合、工程（ａ）を実施することによって工程（ｂ）を自動的に達成することができる。
【００３２】
好ましくは、本発明の方法は、（ａ）による多数の植物を準備し、例えば、化学的に誘導性のプロモーターに対する化学誘導物質を全ての植物に例えば噴霧によって適用することによって、全ての植物で（ｂ）による目的配列の発現を引き起こすことによって、１つの工程で、多数の植物を用いて平行して実施する。
【００３３】
本発明の方法の重要な態様では、植物又は植物の部分（例えば葉）は、目的配列を一過性発現させるために、本発明の異種ＤＮＡで一過性に形質転換されている。「一過性形質転換」という用語は、異種ＤＮＡを植物染色体に安定に組み込むために形質転換細胞を選択することなく異種ＤＮＡを導入することを意味する。一過性形質転換は、通常、異種ＤＮＡによってコードされる遺伝子の一過性発現を提供する。一過性形質転換は、以下に挙げる形質転換法のいずれかで達成することができる。しかしながら、本発明の異種ＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム介在一過性形質転換によって実施することが好ましい。アグロバクテリウム介在一過性形質転換の好ましい方法は、アグロ浸潤である。アグロ浸潤（アグロ接種）が最も好ましい。アグロ浸潤によって植物全体（即ち、全ての葉を含めた、土壌の上の部分）が形質転換される場合、目的配列の最速且つ最高の発現レベルを得ることができる。これは、植物をアグロバクテリウム懸濁液中に上下にさっと浸し、真空にし、そしてすぐに真空から開放することによって、達成することができる。
【００３４】
目的配列を一過性に発現させる方法の好ましい態様では、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、転写プロモーター、好ましくは構成的転写プロモーターに機能可能に連結されている。他の好ましい態様では、植物はタバコ属に属し、レプリコン機能に関する配列は、トバモウイルス、好ましくはタバコモザイクウイルスに由来する。特に好ましい態様では、茎及び全ての葉を含めたタバコ植物は、アグロ浸潤によって一過性に形質転換されている。後者の態様は、本発明の方法の大規模応用に用いることができる。大規模応用では、この方法は、多くの植物（少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１００の植物）に同時に適用される。
【００３５】
本発明は、原則として、感染性ＲＮＡウイルスが存在するあらゆる植物に適用することができる。好適な植物とＲＮＡウイルスのペアは、以下に示すＲＮＡウイルスのリストに由来することができる。本発明によるレプリコン形成効率が非常に高いため、植物ウイルスの植物種特異性は、本発明を実施する場合ほとんど目立たない。同様に、本発明は、いずれのＲＮＡウイルスに基づいたＲＮＡレプリコンにも用いることができる。ＲＮＡウイルスは、一般に、宿主植物の細胞核の外側で展開し、レプリコンが細胞核の内側で産生される場合、特にレプリコンが核染色体に安定にコードされる場合、そのようなウイルスに基づくレプリコンを非効率的にする選択された位置を有するであろう。本発明は、異なる植物ＲＮＡウイルスのあいだで改善レベルはさまざまであり得るが、全てのＲＮＡウイルスに適用することができる。本発明が基づく最も好ましい植物ＲＮＡウイルスは、トバモウイルス、特にタバコモザイクウイルス、及びジャガイモウイルスＸのようなポテクスウイルスである。タバコモザイクウイルスの場合、一般に、発現されるべき配列で置換されるのはコートタンパク質であろう。移行タンパク質は、除去又は発現されるべき配列で置換することができる。しかしながら、タバコザイクウイルスに由来するＲＮＡレプリコンは、移行タンパク質をコードし、コートタンパク質は発現されるべき配列で置換される必要があることが好ましい。異種ＤＮＡは、コートタンパク質又は移行タンパク質のような、植物ＲＮＡウイルスの少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失していることが非常に好ましい。
【００３６】
本発明の主要な適用は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物における目的タンパク質の産生である。目的タンパク質は目的配列にコードされる。目的配列は植物ＲＮＡウイルスに対して異種であることが好ましい。いずれにしても、目的配列は、ＲＮＡウイルスの機能を有した配列でもコードした配列でもない。
【００３７】
本発明の方法を植物で実施する場合、タバコ種のように（例えばベンサミアナタバコ、タバコ）ヒト又は動物の食物連鎖に入らない植物が好ましい。植物の部分とは、例えば植物の器官又は葉若しくは種子のような植物の特定の組織である。本明細書において、本発明の方法を、生長しているか又は親植物に付着している種子で行なう場合、種子を植物の部分とみなす。しかしながら、種子はまた、植物の特定の発達段階にあったとしても、植物とみなされる。最も好ましくは、本発明の植物は、種子として販売又は流通され、種子は植物に生長し、そして植物の所望の点で、目的配列の発現が誘導されるか又はスイッチを入れられる。
【００３８】
タバコ又はサトウダイコンのような多くの植物種は、これまで、アグロバクテリウム介在形質転換によってウイルスベクター又はレプリコンで形質転換することが不可能であった。この不可能の理由は、２つの病原体、即ちアグロバクテリウムとウイルスベクターによる植物の２重の課題に応じた植物の防御機構の活性化であったと推測することができる。本発明者らは、高度に希釈されたアグロバクテリウム懸濁液をアグロバクテリウム介在形質転換に使用することにより、ウイルスベクターでより高い形質転換効率を達成することができることを見出した。したがって、本発明は、アグロバクテリウム介在ウイルスベクター形質転換の多くの植物種への広範な適用を達成する。この態様のための高度に希釈されたアグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、計算された光学密度は、それぞれ、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液の少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される。本態様により最も好ましく形質転換される植物種はタバコである。
【００３９】
アグロバクテリウム介在（ＲＮＡ）ウイルスベクター形質転換の形質転換効率は、Ｔ−ＤＮＡ中に本発明の異種ＤＮＡを用いることによって更に向上させることができる。したがって、本発明は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法を提供し、この方法は：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物をアグロバクテリウム懸濁液で形質転換することを含み、アグロバクテリウムはＴ−ＤＮＡに、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なレプリコン（好ましくはＲＮＡレプリコン）をコードする配列を有する異種ＤＮＡを含有する。ここで、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ウイルス（好ましくは植物ＲＮＡウイルス）の配列に由来する、レプリコンのレプリコン機能に関する配列、
（ｉｉ） 発現されるべき目的配列、
を含有し、アグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、計算された光学密度は、それぞれ、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液の少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍
希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される。
【００４０】
本発明者らは、この方法が、アグロバクテリウム株の細胞が環境に広がる可能性を低下させるだけでなく、この方法の生物学的安全性を向上させることを見出した。この方法は、おそらく植物の病原体であるアグロバクテリウム株の感染による植物又は植物の葉への曝露及びストレスを低下させることによって、タンパク質発現効率も向上させる。驚くべきことに、本発明者らは、植物又は植物の部分を形質転換又は形質移入するために用いるアグロバクテリウム懸濁液の濃度の減少とともに、ある限度内で本方法の効率が上昇することを見出した。特に、これらアグロバクテリウム懸濁液の濃度の減少とともに、植物の細胞内で作製されたレプリコンの細胞間移行能が向上する。この予想外の現象の理由は、未だ同定されていない。この現象はアグロバクテリウム感染に対する植物の応答によるものであり、より低いアグロバクテリウム濃度ではこの応答は起こらない（又はより少ない範囲で起こる）と推測される。アグロバクテリウムを用いた先行技術形質転換法では、通常、６００ｎｍのＯＤが０．５〜１．０の範囲の非常に高濃度のアグロバクテリウムが用いられている。
【００４１】
植物又は植物の葉は、アグロバクテリウム株の細胞懸濁液に浸潤させることが好ましく、懸濁液は、６００ｎｍのＯＤ（光学密度）が１．０のアグロバクテリウム株の細胞懸濁液を少なくとも２５倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２５０倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に希釈することによって得ることが可能なアグロバクテリウム細胞濃度を有する。したがって、そのような希釈は、それぞれ、計算された６００ｎｍのＯＤ値が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１のアグロバクテリウム懸濁液を生ずる。
【００４２】
計算されたＯＤ値が０．０４以下のアグロバクテリウム懸濁液を用いるこの方法は、本発明に記載した他の態様と組み合わせることができる。浸潤又はアグロ浸潤は、アグロバクテリウム懸濁液を用いた形質転換法又はトランスフェクション法として定義することができ、アグロバクテリウムを植物組織（細胞間空間）へ押し付けるために圧力差が用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン形成頻度の増加に基づいた本発明の一般原理を表す。
【図２Ａ】図２は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を水平軸に示す。垂直軸は、対応する配列／配列領域がコード配列（コーディング）である確率、ドナー部位（ドナー）又はアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。円で囲んだ部分は、機能保存的な相違が導入されるべき選択された位置に相当する。
【図２Ｂ】図２は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を水平軸に示す。垂直軸は、対応する配列／配列領域がコード配列（コーディング）である確率、ドナー部位（ドナー）又はアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。円で囲んだ部分は、機能保存的な相違が導入されるべき選択された位置に相当する。
【図３】図３は、ベクターｐＩＣＨ１５４６６の転写領域の最初の半分のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、本発明による機能保存的な相違で改変されている（図２Ａ参照）。
【図４】図４は、ｐＩＣＨ１５９０の転写領域の２番目の半分のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、本発明による機能保存的な相違で改変されている（図２Ｂ参照）。
【図５Ａ】図５は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、挿入した６つの植物核イントロンに相当する。
【図５Ｂ】図５は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、挿入した６つの植物核イントロンに相当する。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明による機能保存的な相違を有する、及び有さない、ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明による機能保存的な相違を有する、及び有さない、ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の略図である。
【図７Ａ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域のベクター（ｐＩＣＨ）同定番号を示す。図７Ａはベンサミアナタバコ、アグロ浸潤後８日である。
【図７Ｂ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域のベクター（ｐＩＣＨ）同定番号を示す。図７Ｂはタバコ、アグロ浸潤後８日である。
【図７Ｃ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域のベクター（ｐＩＣＨ）同定番号を示す。図７Ｃはアグロ浸潤後５日に単離されたベンサミアナタバコのプロトプラストである。右の写真の多くの光のスポットは、非常に高いレプリコン形成頻度及びＧＦＰ発現を示す。
【図８】図８は、本発明にしたがいデザインされたＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン前駆体の略図であり、非誘導状態では目的遺伝子（ＧＦＰ、Ｇと表示）のゼロ発現レベルを生ずる。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終止領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図９】図９は、ダイレクト鎖（＋鎖）を用いたシロイヌナズナ減数分裂特異的遺伝子ＡｔＤＭＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７６６７０）に対するイントロン予測プロファイルを示す。イントロンコード領域を円で囲んでいる。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）のダイレクト鎖（＋鎖）内の潜在的問題領域（丸で囲んでいる）の予測を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）のダイレクト鎖（＋鎖）内の潜在的問題領域（丸で囲んでいる）の予測を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＲＮＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０３）のアルファルファモザイクウイルスゲノムのダイレクト鎖（＋鎖）の潜在的問題領域（円で囲んでいる）の予測を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０２）のアルファルファモザイクウイルスゲノムのダイレクト鎖（＋鎖）の潜在的問題領域（円で囲んでいる）の予測を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＲＮＡ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ００１６３）のアルファルファモザイクウイルスゲノムのダイレクト鎖（＋鎖）の潜在的問題領域（円で囲んでいる）の予測を示す。
【図１２】図１２は、構築体ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８のＴ−ＤＮＡ領域を表す。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終始領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図１３】図１３は、ｐＩＣＨ１２６９１又はｐＩＣＨ１６８８８のＴ−ＤＮＡ領域を有する安定に形質転換された異なるベンサミアナタバコ株のＵＶ光下の葉を示す。葉は、インテグラーゼを提供するベクター（ｐＩＣＨ１０８８１又はｐＩＣＨ１４３１３）でアグロ浸潤させた。
【図１４】図１４は、ｐＩＣＨ１８７１１でアグロ浸潤後１週間のサトウダイコンの葉を日光（左）及びＵＶ（右）照射で示す。右の写真の光のパッチは、ＧＦＰ蛍光を示す。下に示した構築体中のイントロン（斑点のある四角）を番号付けしている。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、本発明者らは、レプリコン機能に関する配列内で、植物イントロンを植物ウイルスＲＮＡベクターのある領域に組み込み、潜在イントロンを除去又は置換することにより、宿主植物の細胞質におけるＲＮＡレプリコンの出現効率を劇的に増加させることができる（少なくとも×１０2倍）ことを見出した。そのような効率増加は、少なく
とも１つの容易に測定可能なパラメータ：例えば上昇したレプリコン形成頻度でベクターの複製を示す細胞の相対位置に反映された。こうしたＲＮＡレプリコン形成の開始の最適化は、植物全体で目的配列の発現スイッチを同調して入れる能力をもたらし、非改変ベクターよりも短い時間で組換え目的タンパク質の収率の劇的な増加を生じた。
【００４５】
組換えＤＮＡのコード領域へのイントロンの組み込みによる核トランス遺伝子発現の増加に関する出版物にもかかわらず（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５、９１３−９２０；Ｂｏｕｒｄｏｎら、２００１、ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２、３９４−３９８；Ｒｏｓｅ，ＡＢ．、２００２、ＲＮＡ、８、１４４４−１４５３；ＵＳ５，９５５，３３０号）、ウイルスＲＮＡレプリコンへのイントロンの組み込みは、ウイルスレプリコン形成頻度に、続いてレプリコンによって提供される目的配列の発現レベルに正の効果をもたらすであろうと示す先行技術にはヒントがない。この効果は、核ｍＲＮＡ転写及びウイルスＲＮＡ複製が異なる細胞内区画で生ずることを考慮すると驚くべきことである。ウイルスレプリコンのｃＤＮＡコピーが核にある場合であっても、ウイルスレプリコン前駆体の最初のコピーのみが核で産生され、次に核とは異なる条件下において細胞質で増幅される。先行技術では、野生型ウイルスｃＤＮＡをクローニングするあいだの大腸菌におけるウイルス遺伝子の「漏出性」発現による細胞毒性を妨げるためのイントロンの使用が記載されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｉ．Ｅ．、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２４００−１２４０５；Ｙａｎｇら、１９９８、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４３、２４４３−２４５１；Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｙａ＆Ｇａｒｃｉａ、２０００、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、６８、９９−１０７）。イントロンを含めることがウイルスｃＤＮＡクローンからのレプリコン形成頻度を上昇させることができるというヒントはない。野生型ＲＮＡウイルス及びそれらのｃＤＮＡコピーについて得た結果は、ウイルスの高い感染性及び安定性のような野生型ウイルスの他の特性を圧倒的に犠牲にしており、植物における異種目的配列の発現のためにデザインされたウイルス由来発現ベクターに匹敵し得るものではない。感染性は、本発明の課題ではない。特に、感染性は、目的配列を安定に形質転換された植物において発現させる方法における課題ではない。Ｔ−ＤＮＡ中にＤＮＡベクターを含有するアグロバクテリウムで植物を形質転換する場合は、ウイルスＤＮＡベクター又はその転写物の感染性も課題ではない。
【００４６】
本発明は、ＲＮＡウイルスに由来するレプリコン形成頻度を根本的に上昇させるための方法を提供し、レプリコンはＤＮＡ前駆体の転写に由来し、目的配列の発現のためにデザインされている。この方法は、発現されるべき異種配列のサイズ限定及びベクターの高度な不安定性のような、既存のウイルスベクターに基づいた発現システムの限定を克服する。更に、この方法はより良いバイオセイフティの特徴を提供し、トランス遺伝子発現に対する漏出検査制御のデザインを可能にする（非誘導状態でゼロ発現レベル）。そのようなデザインはＲＮＡウイルスに由来するレプリコンのデザインのための戦略に組み込まれた部分であり得るためである。ＲＮＡウイルスに由来するレプリコン形成を高頻度に提供することにより、本明細書に記載のアプローチは、ＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物全体、植物の部分、又は植物細胞培養物において、目的配列の迅速な発現開始を可能にする。本発明を実施することによって、異種目的配列の発現のためにデザインされた植物ＲＮＡウイルス由来レプリコンの実際の性能を、レプリコン形成頻度の劇的増加を通して顕著に向上させることができる。
【００４７】
さまざまな分類群に属するＲＮＡウイルスが、本発明のＲＮＡレプリコンの構築に好適である。本発明を適用し得るＲＮＡウイルスのリストを以下に提示する。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示す。種名（属名）は標準体で示す。属又は科について正式命名のないウイルスが示されている：
ＲＮＡウイルス：
１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科、属：アルファモウイルス属、基準種：アルファルファモザイクウイルス、属：イラルウイルス属、基準種：タバコ条斑ウイルス、属：ブロモウイルス属、基準種：ブロムモザイクウイルス、属：ククモウイルス属、基準種：キュウリモザイクウイルス；
科：クロステロウイルス科、属：クロステロウイルス属、基準種：ビート黄斑ウイルス、属：クリニウイルス属、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、科：コモウイルス科、属：コモウイルス属、基準種：ササゲモザイクウイルス、属：ファバウイルス属、基準種：ソラマメ壊疽ウイルス１、属：ネポウイルス属、基準種：タバコ輪点ウイルス；
科：ポティウイルス科、属：ポティウイルス属、基準種：ジャガイモＹウイルス、属：ライモウイルス属、基準種：ライグラスモザイクウイルス、属：バイモウイルス属、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
科：セキウイルス科、属：セキウイルス属、基準種：パースニップｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋウイルス、属：ワイカウイルス属、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス；科：トンブスウイルス科、属：カルモウイルス属、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、属：ダイアントウイルス属、基準種：カーネーション輪点ウイルス、属：マクロモウイルス属、基準種：トウモロコシｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：ネクロウイルス属、基準種：タバコ壊死ウイルス、属：トンブスウイルス属、基準種：トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス、
属が未分類の１本鎖ＲＮＡウイルス、属：カピロウイルス科、基準種：リンゴｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇウイルス；
属：カーラウイルス属、基準種：カーネーション潜在ウイルス；属：エナモウイルス属、基準種：エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属：フロウイルス属、基準種：土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属：ホルデイウイルス属、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：イダエオウイルス属、基準種：ラズベリーｂｕｓｈｙ ｄｗａｒｆウイルス；
属：ルテオウイルス属、基準種：オオムギ黄萎ウイルス；属：マラフィウイルス属、基準種：トウモロコシｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス；属：ポテクスウイルス属、基準種：ジャガイモＸウイルス；属：ソベモウイルス属、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：テヌイウイルス属、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス属、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス属、基準種：タバコ茎壊疽ウイルス、
属：トリコウイルス属、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス；属：ティモウイルス属、基準種：カブ黄斑モザイクウイルス；属：アンブラウイルス属、基準種：ニンジンｍｏｔｔｌｅウイルス；マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：サイトラブドウイルス属、基準種：レタス壊死性黄変病ウイルス、属：ヌクレオラブドウイルス属、基準種：ジャガイモ黄萎病ウイルス；
マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス科、属：トスポウイルス属、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
２本鎖ＲＮＡウイルス：科：パーティティウイルス科、属：アルファクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス１、属：ベータクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス２、科：レオウイルス科、属：フィジーウイルス属、基準種：フィジー病ウイルス、属：ファイトレオウイルス属、基準種：創傷 腫瘍ウイルス、属：オリザウイルス属、基準種：イネｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未分類ウイルス：
ゲノム：１本鎖ＲＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅモザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ｏｕｒｍｉａ メロンウイルス、種：ペラルゴニウムｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス。
【００４８】
本発明の一般原理を図１に示す。植物ＲＮＡウイルス（例外はウイロイドである−植物細胞核で増幅する小さな非コードＲＮＡ−概説としてＤｉｅｎｅｒ，Ｔ．Ｏ．、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．、１５、２０３−２２０；Ｆｌｏｒｅｓ，Ｒ．、２００１、ＣＲ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ、３２４、９４３−９５２を参照されたい）は植物の核では決して生じないが、細胞質で生ずることが知られている。したがって、ＲＮＡウイルスの配列は、プレｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ前駆体を含めたプロセシングされたＲＮＡの細胞質への輸送を含めたプロセシング工程の複雑なシリーズに関与し得るモチーフの存在により、核のＲＮＡプロセシングイベントに抵抗するためには適合しないであろう。５’端キャッピング、スプライシング、３’端生成、ポリアデニル化、分解、塩基及び糖修飾、並びに（プラスチド及びミトコンドリアにおける）編集のようなプロセシングイベントが重点的に研究されている。しかしながら、そのようなイベントの多く
の要素は依然として不明なままである。核におけるプレｍＲＮＡに対する最も劇的な変化は、プレｍＲＮＡスプライシングのあいだに起こり、そのプロセスにより、介在ＲＮＡ配列（イントロン）が初期転写物から除去され、同時にエクソンが連結される。スプライシングは、ウリジル酸に富んだ小さな核リボヌクレオタンパク質粒子を含む複雑な構造であるスプライソソームによって介在される。スプライソソームは、２つの連続工程でスプライシング反応を実施する：最初の１工程−上流エクソン／イントロン接合部の５’スプライス部位を切断し、ラリアット形成をもたらす。第２工程−イントロン／下流エクソン接合部の３’スプライス部位を切断した後、上流及び下流エクソンが連結される（概説として：Ｋｒａｍｅｒ，Ａ．、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５、３６７−４０９；Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＧＧ．＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９９６、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１−４１を参照されたい）。イントロン配列に隣接する５’及び３’スプライス部位ジヌクレオチド（５’／ＧＵ；ＡＧ／３’）は、高等植物において高度に保存されており、１つのＧ置換は関与する部位のスプライシング活性を放棄するであろう。植物と動物とのあいだでスプライス部位が高度に保存されているにもかかわらず、植物において異種イントロンは、通常スプライシングされず、不正確なスプライシングもされないことは驚くべきことである（ｖａｎ Ｓａｎｔｅｎ，ＶＬ．ら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５６、２５３−２６５；Ｗｉｅｂａｕｅｒ，Ｋ．、Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．Ｊ．、Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、８、２０４２−２０５１）。植物ウイルスＲＮＡは、核のＲＮＡプロセシング装置に抵抗するための進化圧下になかったことを考慮すると、これらのＲＮＡは、核環境にいったん置かれると、スプライシングを含めたそのようなプロセシングの対象になる可能性が非常に高い。この状況は、核遺伝子にコードされるＲＮＡ転写物とは完全に異なっている。後者の転写物は核で起こるＲＮＡ修飾のシリーズにかかわらず機能性を保存するように進化的に適合されているためである。しかしながら、そのような修飾は、ウイルスＲＮＡレプリコン形成のための劇的な結果を有することができる。異種遺伝子用発現ベクターを作製するための植物ウイルスの再操作は、ウイルス起源のＲＮＡ配列と相互作用し得る更なる配列を付加するため、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンに不安定性を更に付加し、複製不可能な欠陥ＲＮＡを産生するであろう。本発明は、一過性の発現のため又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組込みのために、発現ベクターをＤＮＡ前駆体として植物又は植物細胞に組み込むと機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を顕著に上昇させる修飾を、発現ベクターに供することによってこうした問題に取り組む。ウイルス由来配列の修飾が、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの効率を増加させるための最も意義深い解決策であると考えられる。本発明では、ＲＮＡレプリコン形成の効率上昇に重要であるため、主に植物ＲＮＡウイルス由来配列の修飾（機能保存的な相違）に重点をおく。
【００４９】
驚くべきことに、潜在的に問題のある領域が存在する証拠を見出す最初の試みは成功した。そして更に驚くべきことに、予想外にもけた違いの改善を見出すことによって実験的確証を得た。潜在イントロン及びＲＮＡスプライシング部位の存在に関する、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いた発現ベクターｐＩＣＨ８５４３のＲＮＡウイルスに由来する配列の解析（実施例１、図６Ａ）は、核のＲＮＡプロセシング装置によってスプライシングされるであろうイントロン様領域の存在を示した（図２の円で囲んだ領域を参照されたい）。多様な生物のためのエクソン／イントロン予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）又はスプライシングシグナル予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／〜ｗｅｂｇｅｎｅ／ｗｗｗｓｐｌｉｃｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）のように、植物ウイルスＲＮＡ配列内で潜在的に問題のある領域（選択された位置）を同定するために使用できる他のプログラムが多数存在する。
【００５０】
既存の全てのプログラムは理想的でなく、ミスを逃れられないことを考慮すると、潜在的に問題のある領域は、実験的に決定することもできる。これは、核環境で試験対象ＤＮＡベクターに由来する転写物を、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）のような日常的技術で、又はさまざまな転写物の濃度の正確な定量に好適な、より上級版のリアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、６、９９５−１００１）と呼ばれる技術で解析し、好ましくはＰＣＲ増幅産物を配列決定することによって行なうことができる。本発明の機能保存的な相違は、例えばＡ／Ｕに富んだ領域（イントロン様）をＧ／Ｃに富んだ領域（エクソン様）で置換してサイレント変異を導入することによって、例えばイントロン様配列をエクソン様配列で置換することによって、ＲＮＡプロファイルを劇的に変化させる（図３、円で囲んだ領域を参照されたい）。植物イントロンはエクソンと異なり、通常Ａ／Ｔ（Ｕ）に富んでいる（Ｌｏｒｋｏｖｉｃ，ＺＪ．ら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、５、１６０−１６７；Ｂｒｏｗｎ，ＪＷ．及びＳｉｍｐｓｏｎ，ＣＧ．１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４９、７７−９５；Ｃｓａｎｋ，Ｃ．ら、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１８、５１３３−５１４１；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３）が、例外がある。例えば単子葉植物では、Ｇ／Ｃに富んだイントロンが発見された（Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０、２６３５−２６４４）。本発明を実施するには、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量の選択された位置は、少なくとも５５％以上、好ましくは少なくとも６５％以上、最も好ましくは８０％以上のＡ／Ｔ（Ｕ）含量を有する少なくとも長さ２０ヌクレオチドの配列ストレッチだけでなく、純粋にＡ／Ｔ（Ｕ）を含有する配列の列の６〜１９ヌクレオチドのより短いストレッチ（「アイランド」）をも含む。本明細書において、高Ａ／Ｕ含量の位置は、ＵよりもＡに富んだ配列、Ａに富んだ配列、ＡよりもＵに富んだ配列、及びＵに富んだ配列を含む。更に、転写された目的配列は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）によって、核酸配列に変化を引き起こす翻訳後修飾（例えばＲＮＡスプライシング）について試験することができる。オリジナルＲＮＡ転写物から配列を欠失させるような翻訳後修飾を免れないＲＮＡ内の領域を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを用いることは、当業者にとってささいな仕事である。実施例２では、Ａ／Ｕに富んだ領域の修飾が、ＧＦＰ発現細胞数を少なくとも１０倍に増加させることを立証する。これは、ｐＩＣＨ１５４６６（改変ベクター、図６Ａ）及びｐＩＣＨ１４８３３（対照ベクター、図６Ａ）でアグロ浸潤させた領域を比較することによって図７に明確に示されている。移行タンパク質（ＭＰ）を除去することにより、初期感染部位から隣接細胞への細胞間移行は起こらないため、機能性ＲＮＡレプリコンを所持する初代培養細胞の正確な計数を可能にする。実施例３では、多くの潜在スプライス部位を含有する他のＵに富んだイントロン様領域の修飾（図２Ｂ）、及び移行タンパク質（ＭＰ）のサブゲノムプロモーターの被覆（図４、円で囲んだ）を実施した。この修飾は、ウイルスベクターｐＩＣＨ１５９０からのレプリコン形成頻度の上昇に劇的効果を生ずる。プロトプラスト計数実験（実施例３）で確立されたように、試験したタバコ種−ベンサミアナタバコ及びタバコに関し、非改変ベクターｐＩＣＨ１４８３３と比較した上昇はおよそ１００倍であった（図７Ａ、７Ｂの対応する浸潤領域を参照されたい）。一般に、本発明に記載のアプローチを用いることによって、ＲＮＡレプリコン形成頻度をおよそ３００倍増加させることができる。即ち、機能性レプリコンを有する細胞の割合を約０．２％（対照ベクター）から５０％（改変ベクター）以上に増加させる。これは限界ではなく、頻度が１００％に達することも非常に現実的であると考えられる。
【００５１】
そのように高効率のレプリコン形成は、同一植物細胞内で、２つの異なるＲＮＡレプリコンから２以上の異なる遺伝子を発現させる道を開く。例えば植物ＲＮＡウイルスに基づいたベクターを用いることによって異なる遺伝子を共発現させる。「先着順」という原理はウイルスベクターに関して特に真実であるため、同一細胞で同時に、２以上のレプリコンの同調した放出を達成することはそのような共発現に重要である。異なるウイルスベクターは通常伝播領域が重複しないか又はそのような重複はわずかであるため、全体移行又は細胞間移行は役に立たない。単純な計算により、２つの目的配列の共発現を同一植物細胞で２つのレプリコンから達成するための本発明に記載の技術の重要性が立証される。機能性レプリコン形成頻度が全細胞のわずか０．２％である非最適化ウイルスベクターの場合、２つの異なるＲＮＡレプリコンから２つの遺伝子を共発現する細胞の割合は、０．２×０．２＝０．０４％であるが、機能性ＲＮＡレプリコン形成頻度が上昇した構築体（全細胞の５０％又は１／２）の場合、共発現する細胞の割合は、０．５×０．５＝０．２５又は２５％であり、例えば約６２５倍高い。最高性能のベクターの場合（例えばｐＩＣＨ１６１９１、図７Ｃ）、機能性レプリコンを有する細胞の割合は、約９０％に達する（図７Ｃ、右上）。これは、２つの異なる目的配列を２つの独立したレプリコンから発現させるためにそのようなベクターを使用することにより、共発現が全細胞の約８０％で起こり得ることを意味する。この技術は更に改善でき、１００％共発現を達成できる可能性は非常に高いと思われる。
【００５２】
ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的異種配列における機能保存的な相違は、特にレプリコン機能に関する配列における相違と組み合わせて、ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためにも使用できることに注目することは価値がある。例えば、レプリコンの形成及び／又はプロセシングに必要な修飾を目的配列内に導入することができる。
【００５３】
本発明の重要な態様では、レプリコン形成頻度は、核イントロンをレプリコン機能に関する配列に挿入することによって上昇する（実施例４）。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のコード領域にイントロンを組み込むことにより（実施例４及び８）、本明細書に定義したような（図６Ａ、６ＢのｐＩＣＨ１５０３４、ｐＩＣＨ１５０２５、ｐＩＣＨ１５４９９）機能保存的な相違を有するベクターからのレプリコン形成頻度に顕著な（少なくとも５０倍）上昇（図７Ａ、７Ｂ）をもたらす。シロイヌナズナ由来の挿入された６イントロンを含有するベクターのＲＮＡプロファイルを図５に示す。他の実施例では（実施例７）、イントロンのＭＰ配列への挿入は、レプリコン形成頻度を少なくとも１００倍に増加させる。
【００５４】
本発明を実施するために多くの核イントロンを用いることができる。そのようなイントロンの例としては、限定されるものではないが、イネｔｐｉ Ａｃｔ１遺伝子及びｓａｌＴ遺伝子（Ｒｅｔｈｍｅｉｅｒら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１２、８９５−８９９；Ｘｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１００、４５９−４６７；ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２、１６３−１７１）に由来のイントロン；トウモロコシ Ａｄｈ１、ＧａｐＡ１、アクチン及びＢｚ１遺伝子（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１、１１８３−１１２００；Ｄｏｎａｔｈら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８、６６７−６７６；Ｍａａｓら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１９９−２０７；Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ＆Ｍｅｔｔｌｅｒ、１９９２、ＷＥ．Ｃｏｈｎ、Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ編、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ２２９−２５７）に由来のイントロン；ｐｅｔｕｎｉａ ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子ＳＳＵ３０１（Ｄｅａｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１、２０１−２０８）に由来のイントロン；シロイヌナズナＡ１ ＥＦ１α、ＵＢＱ１０、ＵＢＱ３、ＰＡＴ１遺伝子（Ｃｕｒｉｅら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８、４２８−４３６；Ｎｏｒｒｉｓら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１、８９５−９０６；Ｒｏｓｅ及びＬａｓｔ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、４５５−４６４）に由来のイントロン；及び他の多くのものが挙げられる。合成イントロンを本発明に用いることもできる。最小の使用可能なイントロン又はそれらの部分は、通常内部イントロン配列に隣接するスプライスドナー及びアクセプター部位に限定することができる。好ましくは、イントロンのサイズは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは１００〜２００ヌクレオチドであるべきであるが、実際にはイントロンのサイズに限定はない。しかしながら、構築体のサイズは操作に好適である必要がある。イントロンの由来、その構造、及びサイズは、ベクターの性質に応じて個別に選択することができる。選択したイントロン又は対応するイントロン部分の効率を試験するために、一過性発現実験を用いることができる。
【００５５】
上記修飾は累積効果を有する。例えば、イントロン挿入をＭＰサブゲノムプロモーターの修飾と組み合わせる場合、レプリコン形成頻度の上昇はおよそ３００倍であり得る（実施例５）。ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためのイントロン挿入に好ましい領域は、本明細書において選択された位置と呼ばれる。そのような位置は、「イントロン様」構造を含有するかもしれない。これは、ＭＰサブゲノムプロモーターのように問題のある領域へ実際に近接して、イントロンをＭＰへ挿入するによって確認される（実施例７）。レプリコン形成頻度の１００倍上昇が観察された。「エクソン様」領域へのイントロンの挿入には、イントロン様領域への挿入のような目立った効果はない（実施例６）。
【００５６】
上で議論した実験は、植物細胞へのアグロバクテリウム介在ＤＮＡ前駆体送達に基づいた一過性発現システムを用いて行われた。しかしながら、本発明の最も有用な応用は、植物核染色体に安定に組み込まれたＲＮＡレプリコンのＤＮＡ前駆体を有するトランスジェニック植物であろう。これは、ウイルスベクターが許容できる異種配列の最大サイズに対する限定のような、植物ウイルスベクターに基づいたシステムの多くの限界を克服させる。ＤＮＡ前駆体はトランスジェニック植物の各細胞に存在するため、ＲＮＡレプリコンの全体移行又は細胞間移行（レプリコン伝播）に対する絶対的要求は無い。これは、本発明のＲＮＡレプリコンの高率の形成及び細胞質への輸送によって補填することができる。しかしながら、ＲＮＡレプリコン形成は全ての細胞で常に起こるわけではないため、ベクターの細胞間移行能には更なる価値があり得る。
【００５７】
異種ＤＮＡを有する植物細胞を作製するために異なる方法を用いることができる。アグロバクテリウムによって運ばれるＴｉ−プラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）によって、又は粒子若しくは微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）によって、ベクターは植物細胞に形質転換されることができる。マイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６号；ＷＯ０９４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１号）、又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換などのような他の植物形質転換法も用いることができる。ベクター送達法の選択は、形質転換される植物種に依存し得る。例えば、単子葉植物の形質転換には通常微粒子銃が好ましく、双子葉植物にはアグロバクテリウム介在形質転換が一般に良好な結果を与える。
【００５８】
以下に記載する実施例では、ベクター（異種ＤＮＡ）のタバコ細胞へのアグロバクテリウム介在送達を用いた。しかしながら、目的植物種の安定な又は一過性の形質転換に好適な標準技術のいずれかにしたがい、ベクターを植物に導入することができる。双子葉植物の形質転換技術は当該分野で周知であり、アグロバクテリウムに基づいた技術や、アグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術には、プロトプラスト又は細胞による外来遺伝物質の直接取り込みが含まれる。これらの技術には、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを介在した取り込み、粒子銃を介在した送達、及びマイクロインジェクションが含まれる。こらら技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．３、２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９、１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７、７０−７３（１９８７）に記載されている。いずれの場合でも、形質転換された細胞は、標準技術を用いて完全な植物に再生される。
【００５９】
アグロバクテリウム介在形質転換は、形質転換効率の高さ及び多くのさまざまな植物種を用いる広範な有用性のために、双子葉植物の形質転換に好ましい技術である。アグロバクテリウムで日常的に形質転換され得る多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、アブラナ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファ及びポプラが含まれる（ＥＰ ０ ３１７ ５１１号（綿）、ＥＰ ０ ２４９ ４３２号（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９号（アブラナ）、米国特許第４，７９５，８５５号号（ポプラ））。
【００６０】
アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、目的外来ＤＮＡを有するバイナリーベクターを、共耐性プラスミド又は染色体上に宿主アグロバクテリウム株によって運ばれるｖｉｒ遺伝子の相補体に依存し得る適切なアグロバクテリウム株に輸送することが含まれる（Ｕｋｎｅｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：１５９−１６９（１９９３）。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウムへの輸送は、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム株へ移動させることができる、組換えバイナリーベクターを有する大腸菌、ｐＲＫ２０１３のようなプラスミドを有するヘルパー大腸菌株、を用いる三親性交配法によって達成することができる。あるいは、形質転換によって組換えバイナリーベクターをアグロバクテリウムへ移動させることができる（Ｈｏｆｇｅｎ＆Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、９８７７（１９８８））。
【００６１】
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換には、通常、当該分野に公知のプロトコールにしたがったアグロバクテリウムと植物からの外植片との共培養が含まれる。バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡの境界間に存在する抗生物質耐性又は除草剤耐性マーカーを有する形質転換された組織は、選択可能培地で再生されることができる。これは、本発明の異種ＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡで核染色体を安定に形質転換したトランスジェニック植物の作製を可能にする。
【００６２】
本発明の例では、安定なアグロ形質転換と平行して、目的遺伝子を一過性発現させるためにＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム介在送達法であるアグロ接種を用いた（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１１１２８−１１１３３）。アグロ接種は、小規模から中規模の組換えタンパク質産生システムだけでなく、ベクター最適化システムの要素として、非常に有用なツールであり、さまざまな構築体の変異体を用いて迅速な結果を得ることができる。
【００６３】
本発明は、組換えタンパク質の大量／工業的産生にも用いることができる。実験ではアグロバクテリウムの一晩培養物を用いた。アグロ浸潤のために、先行技術に記載のように一晩培養物を準備した（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１、６８５３−６８５７）。通常、一晩培養は波長６００ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）が３〜３．５単位に達し、アグロ浸潤の前に３〜５回希釈され、一般に５〜９×１０9コロニー形成単位を生ずる（Ｔｕｒｐｅｎら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４２、２２７−２４０）。このような一晩培養物を１０2倍、好ましくは１０3倍、より好ましくは１０4倍に希釈すると、特に、本明細書に記載したような機能保存的な相違を有するレプリコン機能に関する配列と組み合わせて、非常に効率的に働くことを見出した。驚くべきことに、形質転換するアグロバクテリウムの希釈を上げるにつれて、浸潤させたタバコ葉中のベクターは更に性能が向上し、ＧＦＰのより良い収率を生じた。例えば、１０3倍希釈は、１０2倍希釈よりも良好な結果を与えた。１０2倍希釈は、１０倍希釈よりも良好なＧＦＰ収率を提供する。この現象の可能な説明
は、高度に濃縮したアグロバクテリウム懸濁液の、ウイルスベクター機能、例えば細胞間移行に対する負の効果、おそらく高濃度の病原体細菌に対する植物の反応の結果である。この現象には、アグロ浸潤を介した組換えタンパク質産生に要するアグロバクテリウム量を、先行技術の方法と比較して少なくとも１けた減少させるため、大規模工業的タンパク質発現法にとって特別な価値がある。
【００６４】
本発明の実施例９では、不活化ウイルスＲＮＡに基づいたレプリコンのＤＮＡ前駆体が、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれている。レプリコンは本発明にしたがい最適化されている。更に、レプリコンは、目的配列の発現を妨げる構造を含有する。機能性ＲＮＡレプリコンの発現及び形成は、部位特異的組換えにより、構築体の一部を反転させることによって誘発することができる。反転は、２つのイントロンの形成、及び機能性目的配列の組み立てをもたらすことができる。実施例９に記載のシステムは、ウイルスベクターの最適化だけでなく、染色体ＤＮＡに安定に組込まれた構築体の、構築体からの目的遺伝子の「漏出性」発現を含めた「漏出性」を避けるための解決策を示している。多くの応用では、特に細胞毒タンパク質に関して、又は技術的タンパク質又は医薬タンパク質を発現させるための植物発現システムを用いて高いバイオセイフティ基準を達成するため、非誘導状態でゼロレベルの発現を有することは重要である。
【００６５】
異種ＤＮＡ及び／又はリコンビナーゼの転写は、誘導性の又は他の調節された（例えば発生的に調節された）プロモーターの制御下に置くことができる。誘導性プロモーターは、誘導条件にしたがい２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるもの、及び生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるもの。第１のカテゴリーの例は、熱誘導性（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性（ＵＳ０５８４７１０２号）プロモーター、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号）、並びにテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学的誘導性システムの分野における最近の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れることができ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的誘導性システムの概説としては：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１、１４６−１５１）及びＰａｄｉｄａｍ，Ｍ（２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、６、１６９−１７７）を参照されたい。誘導性プロモーターの他の例は、植物の病原性関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターである。これらのプロモーターは、病原体攻撃に対応した植物シグナル伝達経路の重要成分であるサリチル酸で、又はＰＲ遺伝子発現を誘発可能な他の化学化合物（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール又はイソニコチン酸）で、植物を処理することによって誘導することができる（ＵＳ０５９４２６６２号）。
【００６６】
本発明は、実施例１〜９に記載のＴＭＶに基づいたベクターに限定されず、他の植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンに広げることができる。他の植物ウイルスＲＮＡ配列の解析（実施例１０、図１０、１１）は、ＴＭＶ、及び植物核遺伝子のプレｍＲＮＡの配列に関して記載したのと非常に類似した選択された位置を示している（図９）。これは、本発明に記載のアプローチを用いて、実際に、植物ＲＮＡウイルス由来レプリコンは、問題領域の除去／置換及び／又は核イントロンの挿入によって根本的に改善することができるという示唆を指示する強力な証拠である。
【００６７】
本発明は、高等多細胞植物、その部分、又はその細胞培養物を用いて実施することが好ましい。本発明に使用する植物には、農学的及び園芸学的に重要な種に関連した植物種が含まれる。本発明に使用するための一般的な作物には、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ルピナス、キビ、オートムギ、エンドウマメ、落花生、イネ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、ソラマメ、コムギ、フジ、及び堅果植物が含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種には、限定されるものではないが、イネ科、キク科、ナス科、及びバラ科の代表的なものが挙げられる。
【００６８】
本発明での使用に更に好ましい種は、以下の属に由来する植物である：シロイヌナズナ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、ライムギ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシ、及びＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ並びにその他多くのもの。
【００６９】
本発明に最も好ましい植物は、動物又はヒトの食物連鎖に入らないタバコ種のような植物、例えばベンサミアナタバコ及びタバコである。
本発明を用いて植物若しくは植物細胞で発現し得る目的タンパク質、その断片（機能性又は非機能性）、及びそれらの人工的誘導体には、限定されるものではないが、以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼφＣ３１、又はその活性断片又は変異体）、オイル修飾酵素（脂肪酸デサチュラーゼ、エロンガーゼなどのような）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維（traits altering fiber）、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア ヘルビコラ リコピン合
成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ（ketohydrolase）、アセトアセチルＣｏＡ レダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、ポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＦＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸 リン酸 ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルス レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルス レプリカーゼ、カリホルニアウンベルラリア Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、Ｄ６−不飽和化酵素、脂肪酸の生合成及び修飾、例えば植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームβ酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、など；５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、細菌ニトリラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ及びＲＮａｓｅ）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼなどを含めた細菌又はファージに由来する他の多くの酵素など。
【００７０】
本発明は、工業的酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼなど）及び線維性タンパク質（コラーゲン、クモの糸タンパク質など）を含めた、商業的に価値があり、医薬的に重要なタンパク質の分子農業（molecular farming）及び精製のために用いることができる。ヒト又は動物の健常なタンパク質は、本発明で記載したアプローチを用いて発現させ、精製することができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、病原体微生物に由来するものを含めた抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ソマトトロピン（ＨＧＨ）及びプロインスリンを含めたポリペプチドホルモン、サイトカイン及びそれらの受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素学的に活性なリソソーム酵素、線溶性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシン、トリプシノーゲン、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ヒト血清アルブミン、グルコセレブロシダーゼ、天然コレラ毒素Ｂ、トロンビン、ヒト胃リパーゼ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＭＦ）、セルピン、ラクトフェリン、リゾチーム、オレオシン、プロトロンビン、α−ガラクトシダーゼ、並びにフュージョンのような機能保存的タンパク質、上記タンパク質の変異体型及び合成誘導体が挙げられる。
【００７１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１２５３０号及びヨーロッパ特許出願第０４０１６０１２．９号の内容は、本明細書にその全体が援用される。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するために提示される。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、修飾及び改変がなされ得る。
実施例１
ＴＭＶに基づいたＲＮＡベクターの構築
アブラナ科植物感染性トバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈−ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８、２８７−２９８）のクローン化ｃＤＮＡを、モスクワ大学、ロシアのＡｔａｂｅｋｏｖ教授から得た。いくつかのクローニング工程で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するウイルスベクターを作製した。得られた構築体、ｐＩＣＨ８５４３（図６Ａ）は：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（ＡＣＴ２、参考文献 Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）由来の７８７ｂｐ断片、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するため、チミン５６０６がシトシンに変異している）の断片、「ｔａａ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｔ ｃｇａ ｇ」配列、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、及び最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを順番に含有する。断片全体を、ＣａｒｂR ｐＢＩＮ１９由来バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ１０のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだにクローン化した。ｐＩＣＨ８５４３で、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。３ｄｐｉで出現したＧＦＰ蛍光の焦点は、増殖してコンフルエントになった。驚くべきことに、ＧＦＰを発現する多くの独立した焦点によって検出されたように、浸潤領域の大部分の細胞が、ウイルス複製及び移行により、最終的にＧＦＰを発現したとしても、細胞のある画分のみがウイルス複製を開始した。３５Ｓプロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子を有するベンサミアナタバコ葉の浸潤は、浸潤領域のほとんど全ての細胞でＧＦＰ発現をもたらすため（図示していない）、限定要因は植物細胞へのＤＮＡ送達ではないことが明らかになった。
【００７３】
この観察を確認するため、ＭＰに変異を有するウイルスベクター構築体を作製した。ｐＩＣＨ１４８３３と呼ばれるこの構築体は、ｐＩＣＨ８５４３に類似するが、ＭＰ遺伝子における３８９ｂｐ、ＭＰに存在するＥｃｏＲＩ部位の上流、の欠失により異なっている。この欠失を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の配列を、配列番号１として付録に示す。完全なウイルス構築体（ＡＣＴ２プロモーターからＮｏｓターミネーターまで）を、ｐＢＩＮ１９由来ＫａｎR バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ４９のＴ−ＤＮＡの左の境界
と右の境界とのあいだにクローン化した。ＭＰにおける欠失のために、この構築体から産生されるレプリコンは細胞間を移行できないが、細胞内で自律複製可能である。ＭＰを、例えば、カリフラワー モザイクウイルス ３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターからトランスで提供すると、細胞間移行を回復させることができる。
【００７４】
ＭＰ発現構築体を作製するために、ＴＶＣＶ ＭＰ遺伝子をクローン化ＴＶＣＶ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ４８０２〜５６２８）からＰＣＲで増幅させ、３５Ｓプロモーターの制御下のバイナリーベクターにサブクローニングした。ｐＩＣＨ１０７４５（示していない）と呼ばれる得られた構築体と、ｐＩＣＨ１４８３３で、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、一晩培養物のさまざまな希釈物を、浸潤培地がアセトシリンゴンを欠失する以外はＥｎｇｌｉｓｈと同僚らによって記載されたようにして（１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１２、５９７−６０３）ベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。ｐＩＣＨ１４８３３単独の浸潤は、浸潤領域内で少量のＧＦＰ発現細胞を出現させた。浸潤領域から調製したプロトプラストを計数することによって、合計５００のプロトプラストのうち、わずか１〜３個のプロトプラスト（０．２〜０．６％）がＧＦＰを発現したことを発見した。ｐＩＣＨ１４８３３とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤は、各初期ＧＦＰ発現細胞から増殖したＧＦＰ発現焦点の形成をもたらした。最終的に、細胞間移行により、浸潤領域の大部分の細胞がＧＦＰを発現した（図７Ａ）。
【００７５】
トバモウイルスのようなＲＮＡウイルスは細胞質で複製するが、決して核には入らない。したがって、それらは、核のプレｍＲＮＡプロセシング装置に曝されない環境に展開した。その結果、核において人工ウイルス構築体から作製されたＲＮＡレプリコン転写物が、ＲＮＡプロセシング装置によって認識されず、適切にプロセシングされないことは驚くべきことではない。その上、ウイルスベクターに由来するＲＮＡレプリコンは非常に大きく、ＴＭＶに基づくレプリコンの場合はおよそ７，０００ヌクレオチドである。非常にわずかな植物遺伝子がそのように大きなサイズを有し、そのような遺伝子の大部分は、プレｍＲＮＡのプロセシングを容易にし、核から輸送され、プロセシングされた転写物の安定性を向上させるイントロンを含有する。したがって、本発明者らは、正確なプロセシング、及び正しくプロセシングされた転写物を核から細胞質へ輸送する効率を増加させるプレｍＲＮＡの修飾は、ウイルス複製を開始する細胞数の増加をもたらすであろうと仮定した。２つのアプローチを用いて、核へのＤＮＡ送達後、より効率的にウイルス複製を開始できる、ＲＮＡウイルスに基づいたベクターを作製することができることがわかった：（１） １つのアプローチは、望ましくないプロセシングイベント（潜在スプライス部位を用いた選択的スプライシングイベント、又は未成熟終止イベントなど）を誘導するかもしれない配列特徴の除去である；（２） 第２のアプローチは、適切にプロセシングされる転写物の量を増加させ、核から細胞質へのＲＮＡの輸送を改善し、及び／又は転写物の安定性を向上させるためのイントロンの付加である。
実施例２
イントロン様配列の除去は、細胞質におけるウイルスＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる
ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いてｐＩＣＨ４３５１に由来するＲＮＡレプリコンの配列を解析し、選択的スプライシングイベントを誘発するかもしれないいくつかのイントロン様配列特徴に気づいた。そのような特徴の１つは、ＲｄＲＰの初めにある０．６ｋｂのウリジンに富んだ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のヌクレオチド８２７〜１４６２に相当する）である（図２Ａ）。この領域は、ｐＩＣＨ１４８３３では、ＰＣＲで変異させた、５４ヌクレオチド置換によってオリジナル配列とは異なる配列に置換した（配列番号２として付録に示した配列；図３を参照されたい）。５２ヌクレオチドを置換し、Ｔに富んだ配列をよりＧＣに富んだ配列に置換した。ＲｄＲＰタンパク質配列が変化しないように、全てのヌクレオチド置換をサイレントにした。変異断片は、それぞれ推定の潜在スプライスドナー及びアクセプター部位を除去するために導入した２つのヌクレオチド置換も含有する（位置８２９及び１４５９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）。これらの変異の効果を試験するために、得られたクローンｐＩＣＨ１５４６６（図６Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５（トランスの移行タンパク質）とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させた。浸潤後８日に、ｐＩＣＨ１５４６６で浸潤させた領域においてＧＦＰ発現細胞数に１０倍の増加が観察された（ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、図７）。これは、ウイルスアンプリコンからのイントロン様配列の除去は、望ましくない選択的スプライシングイベントを妨げ、ウイルス複製をより効率的に開始させることを示唆する。ｐＩＣＨ１５４６６とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤は、非改変レプリコンと類似の速度で改変レプリコンの細胞間移行をもたらす。これは、ＲＮＡ配列の改変はウイルスベクターの細胞間移行に影響しなかったことを示している。
実施例３
ＭＰサブゲノムプロモーターにおけるイントロン様配列の除去
第２の潜在的に問題のある領域は、ＭＰサブゲノムプロモーターに相当する（図２Ｂ）。この領域は非常にＴに富んでおり、イントロン配列に非常に似ている。結果として、イントロン予測プログラムによって配列近傍に多くの潜在スプライスドナー及びアクセプター部位が予測される。残念なことに、サブゲノムプロモーター機能に影響を及ぼすことなくこの領域に修飾を容易に行うことができない。サブゲノムプロモーターに関し、全領域を完全に変異させ、ＭＰ発現の予測される喪失を補うためにトランスでＭＰを提供することにした。また、この構築体からＭＰは発現しないため、目的遺伝子の発現の駆動に必要なＣＰサブゲノムプロモーターを含有する３’配列以外は、ＭＰ配列の大部分を削除することにした。したがって、ｐＩＣＨ１４８３３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のｂｐ４５８４〜５４５５）中の３８３ｂｐ断片を２９７ｂｐの変異させた断片（配列番号３）で置換した。得られた構築体ｐＩＣＨ１５９００（図６Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させた。興味深いことに、ｐＩＣＨ１４８３３で浸潤させた葉領域と比較して、複製を開始する細胞数の莫大な増加を検出した。浸潤葉領域から調製したＧＦＰ発現プロトプラストを計数することによって、この修飾は、非改変ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、ウイルス複製を開始する細胞数を８０〜１００倍増加させると概算している。ｐＩＣＨ１５９００を、ｐＩＣＨ１０７４５（ｐ３５Ｓ−ＭＰ発現カセット）とともに共浸潤させたところ、細胞間移行によるＧＦＰ蛍光の増加を検出した。しかしながら、たとえ細胞間移行がなくとも、多くの細胞は既にＧＦＰを発現していたので、この増加は非常に限られたものであった。ｐＩＣＨ１５９００を含有するアグロバクテリウム懸濁液の１０００倍希釈（６００ｎｍの計算されたＯＤがおよそ０．００４に相当する）を、ｐＩＣＨ１０７４５を含有する５倍希釈したアグロバクテリウム懸濁液（６００ｎｍの計算されたＯＤがおよそ０．８に相当する）とともに共浸潤させたところ、ＧＦＰ発現焦点を分離させた。蛍光焦点は、ｐＩＣＨ１４８３３を用いて得られた対照焦点と同様に明るく、同じサイズであった。これは、ｐＩＣＨ１５９００の改変とＭＰのトランスでの送達とは、複製レベル、目的遺伝子の発現及び細胞間移行に関し、レプリコンの機能性を落とさないことを示している。同一構築体（ｐＩＣＨ１４９３３及びｐＩＣＨ１５９００、ｐＩＣＨ１０７４５とともにか又は伴わない）を、タバコ葉に共浸潤させた。ｐＩＣＨ１５９００における改変は、ベンサミアナタバコと同様に、複製を開始する細胞数を増加させた（ｐＩＣＨ１４８３３と比較して）。
実施例４
イントロンの付加は、細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
ウイルスプロレプリコン配列へのイントロンの付加が、複製開始頻度を上昇させるかどうかについて試験した。それぞれ３つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの２つの異なる領域に含有する、ｐＩＣＨ１５０２５及びｐＩＣＨ１５０３４の２つの構築体を作製した（図６Ａ）。イントロンをＲｄＲＰの中央に含有するように、ｐＩＣＨ１５０２５をデザインした。一方、ｐＩＣＨ１５０３４は、イントロンを、ＭＰサブゲノムプロモーターの上流である、ＲｄＲＰの３’端に含有する。イントロンをＰＣＲでシロイヌナズナ ゲノムＤＮＡから増幅させ、所定のイントロン／エクソン接合部位に重複するプライマーを用いてＰＣＲでウイルス配列に組み込んだ。イントロン含有断片を、ＡｖａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（付録の配列番号４）として、ｐＩＣＨ１４８３３にサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０２５を作製し、又はＰｓｔＩ−ＮｃｏＩ断片（付録の配列番号５）としてサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０３４を作製した。
【００７６】
２つの構築体を、ベンサミアナタバコ葉に別々にアグロ浸潤させ、ｐＩＣＨ１４８３３と比較した。２つの構築体は、ウイルス複製を開始する細胞数を顕著に増加させた（図７Ａ）。この増加は、ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、５０倍の改善であると概算した。また、２つの構築体をＭＰ発現クローンと共浸潤させ、細胞間移行がイントロンのないクローンと同一であることを発見した。また、２つの構築体をタバコで試験し、ベンサミアナタバコと同様の改善を観察した（図７Ｂ）。
【００７７】
６イントロン全てを含有する第３のクローンｐＩＣＨ１５４９９を作製した（図５、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ）。この構築体をベンサミアナタバコ及びタバコで試験した。この構築体は、３イントロンを有するそれぞれ個々の構築体よりも効率的であったが、改善は付加的ではなかった。
実施例５
イントロンの付加及びイントロン様配列の除去は、細胞質において機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
１つの構築体でイントロン様の特徴を除去し、追加のイントロンを付加することにより、２つのタイプの改変がウイルス複製の開始の向上に寄与できることを示した。変異したＭＰサブゲノムプロモーター領域を含有するｐＩＣＨ１５４９９の６イントロンをｐＩＣＨ１５９００へサブクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１５８６０（図６Ｂ）を、ベンサミアナタバコ葉に浸潤させ、およそ５０％〜９０％のＧＦＰを発現する全てのプロトプラストの範囲内でいずれの親クローンよりも顕著によく働くことを見出した（図７）。最高性能の構築体は、イントロンをＲｄＲＰ領域、及び改変ＭＰサブゲノムプロモーター領域に含有する（ｐＩＣＨ１６１９１、図７Ｃ）。全く改変していないクローンと比較すると、これは、８０〜３００倍の増加を示した。また、この構築体をＭＰ発現構築体（ｐＩＣＨ１０７４５）とともに共浸潤させ、改変が細胞間移行又は複製を傷つけないことを見出した。
実施例６
全てのイントロン付加が、細胞質において機能性ＲＮＡレプリコンの出現頻度を上昇させるわけではない。
【００７８】
２つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの初めに挿入し、クローンｐＩＣＨ１５４７７を得た（付録にこの領域の配列を配列番号６として示す）。この領域の配列は、イントロンの付加前に既に非常に「エクソン様」にみえる（例えば潜在スプライス部位をもたずにＧＣに富んでいる）。この構築体でウイルス複製開始の改善はみられなかった。したがって、全てのイントロン付加がウイルスベクターの改善をもたらすわけではないであろう。イントロンの挿入又は変異のために選択された位置は重要なパラメータであるようである。例えば、ＭＰサブゲノムプロモーターのように問題のある構造近傍の領域で作製される全てのイントロンの挿入又はヌクレオチド置換は、大きく改善されたが、既に「エクソン様」の配列へのイントロンの挿入は改善されなかった。
実施例７
ＭＰ配列へのイントロンの挿入はウイルスレプリコン形成頻度を上昇させる
初めに、制限酵素ＡｖｒＩＩによる消化、フィリング及び再連結によって、ＭＰにフレームシフトを作製した。次に、２つのイントロンをＭＰに挿入した。得られたクローンｐＩＣＨ１６４２２（図６Ｂ）をベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。機能性ウイルスレプリコンを含有する細胞数に約１００倍の増加が検出された。
実施例８
ＭＰ含有ベクターへのイントロンの挿入は、自律機能性クローンのウイルス複製の開始頻度を上昇させる
ｐＩＣＨ１５４９９からＫｐｎＩ−ＥｃｏＲｌＩ断片をｐＩＣＨ８５４３へサブクローニングした。得られたクローン１６７００（図６Ｂ）は、ＲｄＲＰに６イントロンを有する完全なウイルスベクターを含有した。このクローンをベンサミアナタバコ葉に浸潤させ、効率的に複製を開始させた。また、このクローンは、トランスでのＭＰの付加を要することなく細胞間移行可能であった。
実施例９
染色体に安定に組込まれた不活性レプリコンの活性化
また、イントロン含有ウイルスベクター構築体をトランスジェニック植物に安定に形質転換することが可能である。植物生長を阻害する有害なウイルス複製を避けるために、不活性クローン（プロレプリコン）を、アンチセンス方向で存在するベクターの一部を有することによって作製することができる（図８）。反転断片の先端での組換え部位及びイントロン配列の組込みは、適切なリコンビナーゼを用いることによって、この断片を正しい方向に「反転」させることができる。組換え部位はレプリコンからスプライシングによって完全に排除されるであろう。プロレプリコン中のイントロンは、組換え及び転写後、効率的な複製開始を可能にする。１つの特定の例では、組換え部位は目的遺伝子内でプロレプリコンの下流に位置する。このような立体配置は、組み換え前の遺伝子発現を妨げる。組換えが、ＲｄＲＰ内及びプロモーターの上流のような、プロレプリコンの他の領域に位置する他の立体配置が考えられる。組換え部位のイントロン配列は、組換えをレプリコンから完全に除去することを可能にする有益性を有するが、先に記載したように、ウイルス複製効率も上昇させる。
【００７９】
反転部分は、図１２に示すようにベクターの３’端、中央、又は５’端に位置することができる（図８に示すように）。２つの構築体ｐＩＣＨ１２６９１（１イントロンのみを組換え部位に含有する）及び追加の６イントロンをＲｄＲＰに含有するｐＩＣＨ１６８８８を作製した。ｐＩＣＨ１２６９１の完全なＴ−ＤＮＡ領域の配列を、配列番号７に示す。ｐＩＣＨ１６８８８はｐＨ１２６９１に類似するが、更に、ｐＩＣＨ１５０２５に記載の３つのイントロン（配列番号４）、及びｐＩＣＨ１５０３４に記載の３つのイントロン（配列番号５）を含有し、それぞれこれらの構築体と同一位置に挿入されている。ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８を、以下のように、カナマイシン選択を用いてベンサミアナタバコに安定に形質転換した。構築体ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１）に別々に固定し、微細な改変を伴うが、Ｈｏｒｓｈ及び同僚らによって記載されたようにして（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）、タバコ植物のアグロバクテリウム介在葉ディスク形質転換に別々に用いた。１ｍｇ／Ｌ α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．５ｍｇ／Ｌ ６−ベンズアミノプリン（ＢＡＰ）、２００μＭ アセトシリンゴン（ＡＳ）、ｐＨ５．５〜５．６を添加したムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）基本培地中のアグロバクテリウム懸濁液内で葉ディスクを３０分間共培養した。次に、過剰な液体を除去するために葉ディスクを滅菌ワットマン（登録商標）ろ紙上におき、固体共培養培地（上記のように添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）に移し、暗所において２２〜２３℃で４８時間培養した。共培養後、葉ディスクを選択再生培地（１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ５．７〜５．８）、３００ｍｇ／Ｌセファタキシム、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）においた。再生培地で３〜６週間の培養後、カナマイシン耐性植物細胞から再生した苗条を発根選択培地（３００ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２００ｍｇ／Ｌ ｔｉｍｅｎｔｉｎ（アグロバクテリウムの排除を容易にするため）、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、ｐＨ５．７〜５．８を添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）に移した。再生させた形質転換体を温室に移し、インテグラーゼ発現構築体（ｐＩＣＨ１０８８１：アクチン２プロモーター − φＣ３１インテグラーゼ；又はｐＩＣＨ１４３１３：トウモロコシ転位因子Ｓｐｍプロモーター − φＣ３１インテグラーゼ）を含有するアグロバクテリウム懸濁液を針のないシリンジで浸潤させることによって試験した。インテグラーゼ構築体で浸潤後、ｐＩＣＨ１２６９１の形質転換体よりもｐＩＣＨ１６８８８形質転換体のほうがウイルス複製増殖巣を多く示した（図１３）。更に、ｐＩＣＨ１６８８８の形質転換体は、浸潤あたり、より多くのウイルス開始増殖巣を示した。
実施例１０
植物ウイルスＲＮＡ配列は、潜在的不安定領域を含有する
選択した植物ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを、十分に特徴付けられた植物遺伝子（ＡｔＤＭＣ１）のものとともに、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析した。図９に示すＡｔＤＭＣ１のＲＮＡプロファイルは、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡの配列を比較することによって先に同定した１４イントロン（丸で囲んでいる）の存在を明確に反映している。２つの植物ウイルスのＲＮＡプロファイルは、それらを植物核環境におくとＲＮＡの安定性に問題を引き起こし得る領域を有することは明らかである（図１０、１１を参照されたい）。ブロムモザイクウイルス、ＴＭＶの異なる株、そして他の多くのもののような植物ＲＮＡウイルスのいくつかの他の代表的なもののＲＮＡプロファイルについて解析した（示していない）。それらの全ては、ＤＮＡ前駆体として植物細胞に送達された場合、植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン形成の効率を落としかねない、潜在的に問題のある領域を有している。
実施例１１
他の種で最適化ベクターが作用する
変異させた領域（ｐＩＣＨ１５４６６に記載）及び１６イントロン（ｐＩＣＨ１５８６０の６イントロン、ｐＩＣＨ１６４２２の２イントロン、及び追加の８イントロンを含む）を含有する完全に最適化した構築体を作製した。要約すれば、この構築体は以下の位置に挿入されたイントロンを含有する（ＴＶＣＶ配列に対して示す、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７）：ヌクレオチド２０９、ヌクレオチド８２８、ヌクレオチド１１６９、ヌクレオチド１３７８、ヌクレオチド１６２２、ヌクレオチド１８４４、ヌクレオチド２２２８、ヌクレオチド２５８９、ヌクレオチド２９４４、ヌクレオチド３１４３、ヌクレオチド３３８１、ヌクレオチド３６７２、ヌクレオチド３８５０、ヌクレオチド４２９９、ヌクレオチド５２８７、ヌクレオチド５４４４。
【００８０】
サトウダイコンでこの構築体の発現を試験した。以下に記載するように、完全な植物の浸潤を実施した。５０μｇ／ｍｌリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシン（バイナリーベクターについて選択）を含有する３００ｍｌのＬＢにｐＩＣＨ１８７１１を有するアグロバクテリウを接種し、飽和するまで増殖させた。細菌を４８００ｇで１０分間沈殿させ、３Ｌの浸潤バッファー（１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4）に再懸濁し、飽和アグロバクテリウム培養物を１０倍希釈した。浸潤溶液を含有するビーカーを、溶液にさっと浸した植物の地上部とともに乾燥器（直径３０ｍｍ）の中においた。ＫＮＦ Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（フライブルグ、ドイツ）製のＰＭ１６７６３−８６０．３型ポンプを用いて２分間真空を施し、０．５〜０．９ｂａｒに達した。植物を標準条件の温室に戻した。
【００８１】
ＧＦＰ発現はｐＩＣＨ１８７１１で浸潤させた植物の葉において高かった（図１４）。逆に、イントロンを含有しないｐＩＣＨ１６７００で浸潤させた対照植物では、わずか数個の小さなスポットのみが見られたであろう（図示していない）。
【００８２】
付録
配列番号１（ｐＩＣＨ１４８３３のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片）：
【００８３】
【化１】
【００８４】
配列番号２（ｐＩＣＨ１５４６６の部分）：
【００８５】
【化２】
【００８６】
配列番号３（ｐＩＣＨ１５９００の部分）：
【００８７】
【化３】
【００８８】
配列番号４（ｐＩＣＨ１５０２５の部分）：（下線を付したイタリック体で示した３イントロンを含有する）
【００８９】
【化４】
【００９０】
配列番号５（ｐＩＣＨ１５０３４の部分）：（下線を付したイタリック体で示した３イントロンを含有する）
【００９１】
【化５】
【００９２】
配列番号６（ｐＩＣＨ１５４７７の断片、下線を付したイタリック体で示した１イントロンを含有する）
【００９３】
【化６】
【００９４】
配列番号７：ｐＩＣＨ１２６９１のＴ−ＤＮＡ領域、ここで、配列セグメントは以下の機能を有している：
ヌクレオチド１〜２５：左の境界（反対鎖）、
ヌクレオチド８６〜１４８４：Ｎｏｓプロモーター−ＮＰＴＩＩコード配列−Ｎｏｓターミネーター（反対鎖上）、
ヌクレオチド１５０６〜１５５２：ＡｔｔＰ 組換え部位（反対鎖）、
ヌクレオチド１５５３〜１５９９：イントロン５’部分（反対鎖）、
ヌクレオチド１６００〜２０２２：ＴＶＣＶ ＲｄＲＰ ５’端（反対鎖）、
ヌクレオチド２０２３〜２８０９：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（反対鎖）、
ヌクレオチド２８３６〜２９０３：ＡｔｔＢ組換え部位、
ヌクレオチド２９０４〜２９５９：イントロン３’部分、
ヌクレオチド２９６０〜７９９１：ＴＶＣＶ ＲｄＲＰ ３’部分−ＭＰ５’部分、
ヌクレオチド７９９２〜８１６８：ｃｒ−ＴＭＶ ＭＰ ３’端、
ヌクレオチド８２４８〜８９６７：ＧＦＰコード配列、
ヌクレオチド８９６１〜９２１５：ｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳領域、
ヌクレオチド９２３４〜９４９７：Ｎｏｓターミネーター、
ヌクレオチド９５４９〜９４７３：Ｔ−ＤＮＡ右境界（反対鎖）：
【００９５】
【化７−１】
【００９６】
【化７−２】
【００９７】
【化７−３】
【００９８】
本発明を、好ましい態様を参照して具体的に示して説明するが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形式的に及び細部に種々の改変がなされ得ることが当業者には理解されるであろう。
［態様１］
転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する、安定に形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物であって、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
（ｉｉ） ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる、前記植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様２］
機能保存的な相違が、異種ＤＮＡ転写物の高Ａ／Ｕ含量によるＲＮＡレプリコン形成への細胞核における有害効果の軽減を含む、請求項１に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様３］
植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置が、高Ａ／Ｕ含量の位置である、請求項１又は２に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様４］
機能保存的な相違が、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列の高Ａ／Ｕ含量の低下を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様５］
高Ａ／Ｕ含量が、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換によって低下する、請求項４に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様６］
機能保存的な相違が、Ａ／Ｕに富んだ領域に隣接した潜在スプライシング部位の除去を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様７］
機能保存的な相違が、１以上の核イントロン又はレプリコン機能に関する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍若しくはその中で核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様８］
核イントロンを形成可能な配列が、部位特異的組換えにより核イントロンを形成可能である、請求項７に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様９］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする１以上のセグメントを有し、それにより、ＲＮＡレプリコンの形成がセグメントの再構成を必要とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１０］
植物の全ての細胞核が異種ＤＮＡを含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１１］
異種ＤＮＡが細胞核の染色体に含有される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１２］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の全ての細胞が、核染色体に異種ＤＮＡを含有する、請求項１１に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１３］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、目的配列の高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量の位置に、目的配列で相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる機能保存的な相違を更に含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１４］
植物ＲＮＡウイルスがトバモウイルスであり、好ましくはタバコモザイクウイルスである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１５］
機能保存的な相違が、機能サイレントである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１６］
植物の部分が種子である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の植物の部分。
［態様１７］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：（ａ） 転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、ここで、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）目的配列を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる；及び
（ｂ） 目的配列を発現させること、
を含む前記方法。
［態様１８］
異種ＤＮＡが核染色体に安定に組み込まれている、請求項１７に記載の方法。
［態様１９］
目的配列が目的タンパク質をコードし、工程（ｂ）は目的タンパク質の発現を引き起こすこと含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
［態様２０］
目的タンパク質の発現が、植物、植物の部分、又は植物細胞において所望の産物の産生をもたらす、請求項１９に記載の方法。
［態様２１］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする２以上のセグメントを有し、工程（ｂ）は、ＲＮＡレプリコン形成され得るようなセグメントの再構成を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
［態様２２］
セグメントの１つが組換え部位に隣接し、再構成が、リコンビナーゼによる部位特異的組換えを含む、請求項２１に記載の方法。
［態様２３］
工程（ｂ）が、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に部位特異的リコンビナーゼを提供することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
［態様２４］
部位特異的リコンビナーゼが、リコンビナーゼをコードするベクターの一過性トランスフェクションによって提供される、請求項２３に記載の方法。
［態様２５］
部位特異的リコンビナーゼが、調節されたプロモーターの制御下において核染色体に安定にコードされ、工程（ｂ）が、調節されたプロモーターの誘導を含む、請求項２３に記載の方法。
［態様２６］
リコンビナーゼが、ＣＲＥ、フリッパーゼ、リゾルベース、ＦＬＰ、ＳＳＶ１にコードされるインテグラーゼ、Ｒリコンビナーゼ、φＣ３１インテグラーゼ、Ｉｎｔｉインテグラーゼ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、及びＰ４ リコンビナーゼ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｃｉｎリコンビナーゼ、大腸菌ＸｅｒＣ及びＸｅｒＤリコンビナーゼ、バチルス・チューリンゲンシス リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
［態様２７］
リコンビナーゼが、植物細胞内でリコンビナーゼの非機能性断片から親和性相互作用によって形成される、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
［態様２８］
リコンビナーゼが、植物細胞内でリコンビナーゼの非機能性断片からインテイン介在タンパク質トランススプライシングによって形成される、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
［態様２９］
異種ＤＮＡ又はＲＮＡレプリコンをコードする配列が、調節された転写プロモーターに連結されている、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
［態様３０］
調節されたプロモーターが、化学的に誘導性のプロモーターである、請求項２９に記載の方法。
［態様３１］
工程（ａ）における準備が、異種ＤＮＡを含有する核酸分子による植物、植物の部分、又は植物細胞の形質転換を含む、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
［態様３２］
工程（ａ）における準備が、異種 ＤＮＡを含有する核酸分子による植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞の一過性形質転換を含む、請求項１７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
［態様３３］
工程（ａ）がアグロバクテリウム介在形質転換によって行われる、請求項１７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
［態様３４］
工程（ａ）が、異種ＤＮＡで安定に形質転換されたトランスジェニック植物の作製を含む、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
［態様３５］
請求項１で定義したとおりの異種ＤＮＡで核染色体を安定に形質転換したトランスジェニック植物を作製する方法であって、植物、又は植物の部分を異種ＤＮＡを含有するベクターで形質転換し、核染色体に異種ＤＮＡを含有する植物の組織を選択し、そしてトランスジェニック植物を組織から再生することを含む、前記方法。
［態様３６］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を一過性に発現させる方法であって：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡで形質転換させることを含み、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、
（ｉｉ）目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる、前記方法。
［態様３７］
形質転換が、異種ＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡによるアグロバクテリウム介在一過性形質転換によって実施される、請求項３６に記載の方法。
［態様３８］
形質転換が、タバコ植物の茎及び／又は全ての葉のアグロ浸潤によって実施される、請求項３６又は３７に記載の方法。
［態様３９］
機能保存的な相違が、異種ＤＮＡ転写物の高Ａ／Ｕ含量によるＲＮＡレプリコン形成への細胞核における有害効果の軽減を含む、請求項１７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
［態様４０］
植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置が高Ａ／Ｕ含量の位置である、請求項１７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
［態様４１］
機能保存的な相違が、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列における高Ａ／Ｕ含量の低下を含む、請求項１７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
［態様４２］
高Ａ／Ｕ含量が、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換によって低下する、請求項４１に記載の方法。
［態様４３］
機能保存的な相違が、Ａ／Ｕに富んだ領域に隣接した潜在スプライシング部位の除去を含む、請求項１７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
［態様４４］
機能保存的な相違が、１以上の核イントロン又はレプリコン機能に関する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍若しくはその中で核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む、請求項１７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
［態様４５］
核イントロンを形成可能な配列が、部位特異的組換えによって核イントロンを形成可能である、請求項４４に記載の方法。
［態様４６］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする１以上のセグメントを有し、それにより、ＲＮＡレプリコンの形成がセグメントの再構成を必要とする、請求項１７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
［態様４７］
全ての細胞核が異種ＤＮＡを含有する、請求項１７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
［態様４８］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、目的配列の高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量の位置に、機能保存的な相違を更に含有する、請求項１７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
［態様４９］
選択された位置が、
（Ａ）植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、機能保存的な相違を欠失している以外は請求項１７で定義した通りの異種ＤＮＡで形質転換し、
（Ｂ）植物、植物の部分、又は植物細胞培養物における工程（Ａ）の異種ＤＮＡに由来するＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施してＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を決定し、そして
（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列において、望ましくないスプライシングイベントの位置として選択された位置を同定すること、
によって同定される、請求項１７〜４８のいずれか１項に記載の方法。
［態様５０］
植物ＲＮＡウイルスがトバモウイルスであり、好ましくはタバコモザイクウイルである
、請求項１７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
［態様５１］
機能保存的な相違が機能サイレントである、請求項１７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
［態様５２］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物が２以上の異なる異種ＤＮＡを含有する方法であって、２つの異なる目的タンパク質が共発現する２つの異なるＲＮＡレプリコンの形成を含む、請求項１７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
［態様５３］
ＲＮＡレプリコンが、ＲＮＡレプリコンが由来するＲＮＡウイルスの天然宿主植物以外の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物においてレプリコン形成頻度の上昇を発揮可能である、請求項１７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
［態様５４］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に、それぞれ目的配列を有する２つの異なる異種ＤＮＡが提供され、それにより、２つの異なる目的配列が発現する、請求項１７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５５］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の形質転換が、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物にアグロバクテリウム懸濁液を浸透させることによって行われ、懸濁液の濃度は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当し、それにより、計算された光学密度は、それぞれ、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液の少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、請求項１７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
［態様５６］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡをＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウムの懸濁液で形質転換することを含み、レプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ウイルスの配列に由来する、レプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）目的配列、を含有し、それにより、アグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、それにより、計算された光学密度は、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液のそれぞれ少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、前記方法。
［態様５７］
転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡ配列を含有する核酸分子であって、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は植物ＲＮＡウイルスの配列に相当し、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、核酸分子を植物細胞又は植物に導入した場合に相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させることが可能である、前記核酸分子。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的配列を発現させるためのＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡを有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に関するものである。また、本発明は、目的配列を植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において発現させる方法を提供する。本方法及びベクターは、ＲＮＡウイルス由来ＲＮＡレプリコンの形成頻度が上昇した植物細胞を提供する。異種ＤＮＡ又はその部分は、植物の核染色体ＤＮＡ若しくはエピソームＤＮＡに安定に組込まれるか、又は一過性に送達されることができる。また、本発明は、（ＲＮＡ）ウイルスベクター又は（ＲＮＡ）ウイルスレプリコンを用いた植物のアグロバクテリウム介在形質転換法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物トランス遺伝子発現システムの中で、異種プロモーター制御下のトランス遺伝子発現がここ数年使用されている。そのような慣用の植物発現システムとは別に、ウイルスに基づいた発現システムは、植物における迅速なタンパク質産生に用いることができ（概説として：Ｐｏｒｔａ及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０、８１−９４を参照されたい）、機能ゲノミクス研究の強力な手段となっている（Ｄａｌｍａｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１２、３６９−３７９；Ｒａｔｃｌｉｆｆら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２５、２３７−２４５；Ｅｓｃｏｂａｒら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１５、１５０７−１５２３）。当該分野における多数の出版物及び特許は、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクターに基づいたシステムについて記載している（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５；Ｍｏｒら、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８１、４３０−４３７；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５９８１２３６号；ＷＯ０２／０８８３６９号；ＷＯ０２／０９７０８０号；ＷＯ９８／５４３４２号）。既存のウイルスベクターシステムは、最良の性能の点から見ると、通常、狭い宿主範囲に限定され、最も好ましい宿主におけるそのようなベクターの発現レベルでさえも、システムの生物学的上限を遙かに下回る。ウイルスに基づいたシステムの重要な課題は、ウイルスレプリコンを植物細胞へ送達する方法である。最も広範に利用される大量産生（例えば農場又は温室における多くの植物での同時産生）のための送達法は、ＲＮＡウイルスベクターの感染性コピーの使用である（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１６７９−１６８３）。組換えウイルスＲＮＡベクターは複製サイクルのあいだに異種挿入物を欠失する傾向が比較的高いため、この方法はＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を必要とし、その結果、非効率的で高価である。送達問題を解決するための他のアプローチは、ウイルスベクターの機能を補完することによって（例えばヘルパーウイルスを用いる−ＵＳ５９６５７９４号）又は他の調節されたスイッチシステムを使用することによって（例えば部位特異的組換え−ＵＳ６６３２９８０号）複製プロセスが誘発されると放出される、トランスジェニック植物の各細胞におけるウイルスＲＮＡレプリコン前駆体の存在であろう。
【０００３】
特許化技術を含めた当該分野における多くの出版物にもかかわらず、主に２つの主要な理由のために、十分な効率で作用し、商業的高収率産生を生ずるウイルスに基づいた大量産生システムは依然として存在しない。第１に、一過性の植物ウイルスに基づいた発現システムは、通常、環境因子への感受性のために大量培養に適さない特定の宿主に限定される。その上、このシステムは、通常、植物宿主の特定部分に限定され、大部分の植物バイオマスを産生プロセスから排除し、その結果、単位植物バイオマスあたりの組換え産物の相対収率を、トランスジェニック植物における慣用の転写プロモーターによって達成可能なレベルに匹敵するレベルまで最小化する。第２に、ウイルスレプリコン前駆体を各細胞に安定に組み込んだトランスジェニック植物宿主を作製することによってウイルスに基づいた産生システムをスケールアップする試みは、特に、その位置におけるレプリコンの性能の低さ、レプリコンから発現されるべき目的遺伝子の「漏出性」、及びそのベクターのための効率的スイッチシステムの不足のいずれかのために、解決策を提供していない。ＲＮＡレプリコン形成の誘因としてＰＴＧＳサイレンシングのサプレッサーを用いることによって、ＰＶＸに基づいたベクターである種の進歩は達成されたが（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）、ウイルスベクターの複製を誘発するスイッチ（ＰＴＧＳサプレッサー）の効率的制御に提供される解決策がないので、このシステムは依然として実用的ではない。しかしながら、このシステムは、このタイプのシステムについてこれまでに知られた中で最高である、全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の３％に達するＧＵＳ遺伝子の発現レベルを提供したが、依然として、強力なプロモーター制御下の慣用のトランス遺伝子発現システムに等しい。植物tripartite ＲＮＡウイルス、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）、に基づいた他の誘導性システム（Ｍｏｒｉら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２７、７９−８６）は、目的タンパク質の収率が非常に低かった（生の重量１ｇあたり３〜４μｇ）。これは標準的転写プロモーターによって提供される収率に匹敵する。
【０００４】
植物発現システムでこれまでに達成された発現レベルの低さが、これらのシステムが細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の発現システムにほとんど競合しない主な理由である。低発現レベルは、植物材料の巨大な背景において、タンパク質の単離及び精製のための非常に高い下流コストを生じさせる。したがって、単位植物バイオマスあたりの目的のタンパク質又は産物の収率が増加するにつれて、下流処理費用が急激に減少する。
【０００５】
現在のところ、その収率及び効率が十分に高く、細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の大規模発現システムと市場で競合するような大規模植物トランス遺伝子発現システムはない。そのような植物の発現は以下の基準をできる限り満たす必要があるであろう：
（ｉ） 高収率、できる限り多くの植物組織及びその組織の多くの細胞における目的タンパク質の発現を含む；
（ｉｉ） 植物増殖に対するタンパク質発現の有害効果を妨げるため、目的のタンパク質又は産物の発現は、所望の時点で発現のスイッチを入れることができるように切換可能である必要がある；
（ｉｉｉ） 切換は、１つの植物の全ての組織又は細胞で同時に又はほとんど同時に発現のスイッチを入れることができ、それと同時に、植物の選択したグループ全ての植物、例えば植物の選択したロット全ての植物で同時に又はほとんど同時に発現のスイッチを入れることができる必要がある。典型的には、目的のタンパク質又は産物は、ある時点まで産物又はタンパク質を産生する各細胞に蓄積する。しかしながら、蓄積のあいだ、目的のタンパク質又は産物の収率又は品質が低下する傾向にある分解プロセスが高頻度で進む。したがって、発現スイッチを入れた後、目的の産物又はタンパク質を回収すべき最適な時点がある。この最適な時点は、１つの植物の全ての組織又は細胞、及び選択したロットの全ての植物において同時に到達し、全体的なプロセスを効率的且つ有益にする必要がある。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、高収率植物発現システムのためのトランスジェニック植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を提供することである。本発明の他の目的は、目的配列を、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において一過性に発現させる方法を提供することである。本発明の他の目的は、１以上の目的配列を、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において効率的に発現させる方法を提供することであり、この方法は、大規模で効率的に用いることができる。更に、本発明の目的は、目的核酸配列の発現を、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において制御する方法を提供することであり、これは生態学的及び生物学的安全性を改善する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ５３１６９３１号
【特許文献２】ＵＳ５５８９３６７号
【特許文献３】ＵＳ５８６６７８５号
【特許文献４】ＵＳ５４９１０７６号
【特許文献５】ＵＳ５９７７４３８号
【特許文献６】ＵＳ５９８１２３６号
【特許文献７】ＷＯ０２／０８８３６９号
【特許文献８】ＷＯ０２／０９７０８０号
【特許文献９】ＷＯ９８／５４３４２号
【特許文献１０】ＵＳ５９６５７９４号
【特許文献１１】ＵＳ６６３２９８０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｏｒｔａ及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、２０９−２２１
【非特許文献２】Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０、８１−９４
【非特許文献３】Ｄａｌｍａｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１２、３６９−３７９
【非特許文献４】Ｒａｔｃｌｉｆｆら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２５、２３７−２４５
【非特許文献５】Ｅｓｃｏｂａｒら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１５、１５０７−１５２３
【非特許文献６】Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４２７−４３０
【非特許文献７】Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５
【非特許文献８】Ｍｏｒら、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８１、４３０−４３７
【非特許文献９】Ｋｕｍａｇａｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１６７９−１６８３
【非特許文献１０】Ｍｏｒｉら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２７、７９−８６
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
上記目的は、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する、形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物によって達成され、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
（ｉｉ） ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列に対応し、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮する。その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させることができる。植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞は、異種ＤＮＡで安定に形質転換されることが好ましい。
【００１０】
更に、上記目的は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法によって達成され、この方法は：
（ａ） 上で定義したとおりの異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、及び
（ｂ） 目的配列の発現を引き起こすこと、
を含む。
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞は、異種ＤＮＡで安定に又は一過性に形質転換することができる。
【００１１】
また、本発明は、上で定義したとおりの異種ＤＮＡで核染色体を安定に形質転換したトランスジェニック植物を作製する方法を提供し、この方法は、植物又は植物の部分を異種ＤＮＡを含有するベクターで形質転換し、核染色体に異種ＤＮＡを含有する植物の組織を選択し、そしてトランスジェニック植物を組織から再生することを含む。
【００１２】
更に、本発明は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を一過性に発現させる方法を提供し、この方法は：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡで形質転換させることを含み、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列
（ｉｉ） 目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮する。その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させることができる。
【００１３】
更に、本発明は、本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を作製するため、又は本発明の方法を実施するための核酸分子を提供する。この核酸分子は、特許請求の範囲に定義したとおりであり、更に、本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物、及び方法を参照して以下に記載のように定義される。
【００１４】
本発明者らは、ＲＮＡウイルスレプリコンをコードする異種ＤＮＡを植物又は植物の部分の核染色体に導入してＲＮＡレプリコンにコードされた目的タンパク質を発現させたところ、ＲＮＡレプリコンが細胞質に出現する頻度は非常に低く、異種ＤＮＡを含有する細胞の小さな画分でのみ起こることを見出した。したがって、目的タンパク質の発現レベルも非常に低かった。この問題について考えられる多くの理由には、染色体の位置効果、不適当な転写調節因子、遺伝子サイレンシング、核から細胞質へのレプリコンの欠陥輸送、転写に対する目的配列の有害効果、ＲＮＡプロセシング又はレプリコン機能などが挙げられると考えられた。このように、驚くべきことに、レプリコンのＡ／Ｔ（Ｕ）に富んだ特定の配列部分が、細胞質におけるレプリコン形成頻度の低さに関与することを見出した。Ａ／Ｔ（Ｕ）に富んだ配列部分の有害効果が抑制されると、細胞質におけるレプリコン形成頻度は強力に上昇し、目的タンパク質の収率が強力に増加した。
【００１５】
本発明の効率は、植物発現システムの新たな局面が達成されるものである。本発明で達成可能な発現レベルは、下流処理（目的タンパク質の分離及び精製を含む）費用が低く、本発明の方法が他の大量発現システムに十分競合するものである。安定に形質転換された植物を用いる先行技術発現システムでは、ウイルスに基づいたベクターを用いる場合であっても、レプリコンは細胞の小さな画分で産生されるため、発現レベルが低い。植物中に伝播したレプリコンは、伝播は遅く、特に長距離に及ぶため、この問題を是正できない。したがって、発現は植物内で均一に進行せず、植物のある部分では目的タンパク質の分解がすでに起こり、他ではタンパク質発現が開始してもいないであろう。本発明は、植物全体に均一に発現を誘発させる。レプリコンを産生しない細胞の小さな画分は、隣接細胞からレプリコンによって迅速に侵入され得る。本発明は、大規模で用いることができる最初の高収率植物発現システムを提供する。本発明は、同一細胞において２以上のレプリコンの産生も可能にし、２つのレプリコンを同一細胞に有する可能性は依然として非常に高い。更に、本発明の発現システムの効率は、ＲＮＡウイルスの植物特異性を限定するものが軽減されるものである。
【００１６】
上記のような改善された効率は、植物、植物の部分、又は植物細胞の一過性形質転換と同様に、安定な形質転換と組み合わせて達成することができる。
（場合により安定に）形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物、及び核酸分子は、ＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡを有する。ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
（ｉｉ） ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有する。
【００１７】
ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列（ｉｉ）を含有する。発現されるべき目的配列は、植物の機能を抑制するＲＮＡ干渉のためのＲＮＡのような目的ＲＮＡの形成をもたらすことができる。しかしながら、目的配列は目的タンパク質をコードし、例えばＲＮＡレプリコン又はＲＮＡレプリコンのサブゲノムＲＮＡから、目的タンパク質を翻訳するための調節配列を含有することが好ましい。目的配列は、目的タンパク質を特定細胞成分に標的化するか又は目的配列を分泌するための標的シグナルをコードする配列を含むことができる。目的タンパク質を標的シグナルから分離するためのアミノ酸配列をコードすることもできる。目的配列は、植物ＲＮＡウイルスのあらゆる配列に対して異種の配列である。即ち、本発明の方法は、植物又は植物の葉への野生型植物ＲＮＡウイルスの形質転換に限定される場合を含まない。したがって、目的タンパク質は、レプリコン機能に関する配列が由来する植物ＲＮＡウイルスによってコードされるタンパク質ではない。
【００１８】
ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列（ｉ）は、とりわけ前者は後者のＤＮＡコピーであり得る点で、植物ＲＮＡウイルスの配列に相当する。レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡレプリコンに、細胞質で複製するための機能を提供する。レプリコン機能に関する配列は、典型的には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）のような、複製に関与する１以上のタンパク質をコードする。レプリコン機能に関する配列は、移行タンパク質又はコートタンパク質のように、植物でＲＮＡウイルスの細胞間伝播又は全体伝播に関与する１以上のタンパク質のような、ＲＮＡレプリコンの機能を更にコードすることができる。植物ＲＮＡウイルスはレプリコン機能を容易に利用可能な供給源であるため、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列に由来することが好ましい。「由来する」とは、レプリコン機能に関する配列が本質的にＲＮＡウイルスの対応する配列のＤＮＡコピーであり、ＤＮＡコピーは細胞核に含有されるか又は導入されるべき異種ＤＮＡの一部を作り上げることを意味する。「由来する」とは、以下に記載するように、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの対応するＲＮＡ配列の正確なＤＮＡコピーではないが、機能保存的な相違を発揮することを更に意味する。相違が機能保存的であるため、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスで実施するのと同様のレプリコン機能を実施可能なタンパク質をコードすることが好ましい。しかしながら、そのような機能保存的な相違は、そのような機能保存的な相違がない場合と比較して、コードされたウイルスタンパク質の機能性の量的相違をもたらすことができる。１つの態様では、異種ＤＮＡ及びレプリコン機能に関する配列は、コートタンパク質（特にトバモウイルスコートタンパク質）のような長距離移行に要するタンパク質をコードしない。他の態様では、異種ＤＮＡは移行タンパク質を欠失する。したがって、異種ＤＮＡのレプリコン機能に関する配列は、レプリコン機能に関する配列が由来するＲＮＡウイルスの全ての機能をコードする必要はない。
【００１９】
レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる。その相違は、全体的プロセスのスイッチがいったん入れられると、植物細胞におけるレプリコン形成頻度上昇の原因となる（以下を参照されたい）。レプリコン形成頻度の上昇とその相違との因果関係は、相違を有するレプリコン機能に関する配列と、相違を有さないレプリコン機能に関する配列とのあいだのレプリコン形成頻度を比較することによって実験的に試験することができる。こうした実験的比較は、実施例に記載するように、例えば目的配列を発現するプロトプラストを計数することによって行なうことができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のように容易に検出可能なレポータータンパク質をコードする目的配列がこの目的に用いられることが好ましい。以下に更に記載するように、細胞間伝播可能ではないＲＮＡレプリコンとの実験的比較を実施することも好ましい。
【００２０】
機能保存的な相違は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置でレプリコン機能に関する配列に導入される。選択された位置は、核で転写されたＲＮＡレプリコンが細胞質に機能性レプリコンとして出現する確率の低さの原因である植物ＲＮＡウイルスのレプリコン機能に関する配列に位置する。そのような選択された位置は、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量、即ち高Ａ含量及び／又は高Ｔ含量（ＲＮＡレベルでは高Ｕ含量）を有するか、又は潜在スプライシング部位、即ち核スプライシング装置によってスプライシング部位として認識され得る配列部分を有することが好ましい。選択された位置は、以下に例示するように、ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを解析することによって、ＲＮＡレプリコンが基づくＲＮＡウイルス中に同定することができる。更に、選択された位置は、本発明による（機能保存的）相違を発揮しないＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡで形質転換した後、植物細胞で形成されるＲＮＡを解析することにって、実験的に同定することができる。この実験解析は、ＲＴ−ＰＣＲを、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定とともにすることによって行なうことができる。ＲＴ−ＰＣＲ試験では、細胞質に到達するＲＮＡレプリコンが増幅するのを妨げるため、例えばフレームシフト変異によって、レプリカーゼが機能しないことが好ましい；そのような増幅は、細胞質で、ＲＮＡ転写物と野生型ウイルスとの汚染や、増幅したＲＮＡレプリコンの過剰発現をもたらし得る。このようにして、ＲＮＡレプリコンを破壊するスプライシングイベントを示す望ましくないスプライシング産物が同定され得る。更に、望ましくないスプライシングの正確な部位は、機能保存的な相違を選択された位置に導入することによって同定され、したがって是正され得る。
【００２１】
したがって、本発明は、目的配列を植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において発現させる方法も提供する。ここで、（Ａ） 植物、植物の部分、又は植物細胞培養物は、本明細書に定義するとおりの異種ＤＮＡを備えるが、機能保存的な相違を欠失し、（Ｂ） 異種ＤＮＡに由来するＲＮＡをレプリコン機能に関する配列の望ましくないスプライシング産物について試験し（例えばＲＴ−ＰＣＲによって）、（Ｃ） 望ましくないスプライシングイベントの位置として選択された位置を（例えばＲＴ−ＰＣＲ産物の配列において）同定し、（Ｄ） 本発明の機能保存的な相違（例えばイントロン）を、工程（Ｃ）で同定した選択された位置又はその近傍で、本発明の異種ＤＮＡを産生するための工程（Ａ）の異種ＤＮＡに導入し、そして、本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において、例えば本発明の異種ＤＮＡで安定に又は一過性に形質転換された植物から目的配列を発現させる。
【００２２】
機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコン形成頻度に対する選択された位置の有害効果を抑制することによってＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる。機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコンをコードする配列のレプリコン機能に関する配列における高Ａ／Ｔ含量の低下によって、ＲＮＡレプリコンにおける高Ａ／Ｕ含量の低下を含むことができる。高Ａ／Ｕ含量は、相違が機能保存的である場合は、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換（例えば遺伝コードの縮重を用いて）によって低下させることができる。更に、植物ＲＮＡウイルスに由来する配列のＡ／Ｕに富んだ領域に隣接した潜在スプライシング部位を除去することができる。そのような機能保存的な相違は、１ヶ所の又は好ましくは数箇所の選択された位置に導入することができる。
【００２３】
好ましい機能保存的な相違は、１以上のイントロン、最も好ましくは核イントロンの挿入を含み、又は植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍若しくはその中に核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む。驚くべきことに、Ａ／Ｕに富んだ位置に又はその近傍にイントロンを組み込むことは、ＲＮＡレプリコン形成頻度の上昇をもたらすことが見出された。いくつかのイントロンを導入することができ、導入される多数のイントロンについて本明細書に例を挙げる。１より多いイントロンの効果は累積する。更に、イントロンの挿入は、他の選択された位置で他の機能保存的な相違と組み合わせることができる。
【００２４】
図８に、発現されるべき目的遺伝子内ではあるが、核イントロンを形成可能な配列の導入例を示す。図８の例では、イントロンは、リコンビナーゼで触媒される異種ＤＮＡの一部の反転により２つの半イントロンから形成される。この原理は、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列にも適用できる。２つの異なるＲＮＡレプリコンが同一細胞内で形成される態様では、２つの異なるレプリコン間の組換えが、異なるレプリコンに存在する２つの半イントロンからイントロン形成をもらすことができる。更に、ＲＮＡレプリコンは、いずれもレプリコンではない２つの前駆体間の組換えによって形成することができる。この場合も、イントロンは、異なる前駆体分子に由来する２つの半イントロンから組み立てることができる。
【００２５】
本発明の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物は、異種ＤＮＡで安定に形質転換されることができる。「安定に形質転換された」とは、それらが、核染色体が維持されるように異種ＤＮＡが細胞核に維持されるように、異種ＤＮＡを細胞核に含有することを意味する。異種ＤＮＡはエピソーム配列に含有されるか又はエピソーム配列であることができる。しかしながら、異種ＤＮＡは、子孫細胞又は子孫植物へ遺伝し得るように、核染色体に安定に組み込まれていることが好ましい。安定に形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の作製方法は、植物バイオテクノロジーの分野で公知である。そのような方法は、通常、選択物質及び選択可能マーカー遺伝子を用いて、安定な形質転換について形質転換体を選択する必要がある。
【００２６】
高収率の目的タンパク質を得るには、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の全ての細胞が、核に異種ＤＮＡを含有することが好ましい。より好ましくは、細胞は、核染色体に安定に組み込まれた異種ＤＮＡを含有する。植物の場合、これは、植物がトランスジェニック植物であることを意味する。
【００２７】
ＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡは、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能である。あるいは、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能である。異種ＤＮＡ又は配列が転写プロモーターに機能可能に連結されている場合は、目的配列の発現を調節可能にするために、転写プロモーターは、誘導性、組織特異的又は発生的に調節されたプロモーターのような調節されたプロモーターであることが好ましい。より好ましくは、プロモーターは誘導性であるか発生的に調節されており、それぞれ、所望の時間に発現を誘導させるか、又は植物が定義した発生段階に到達したときに発現スイッチを入れる。例えば、プロモーターが種子特異的プロモーターである場合は、目的配列の発現スイッチを植物種子で入れることができる。本発明は、ＲＮＡレプリコンを有する特定組織（例えば種子組織）を提供することに非常に価値があり、その組織は、例えば葉組織よりも、レプリコンの細胞間伝播に好適でない。最も好ましいのは、植物組織の全て又は大部分で自由自在に発現スイッチを入れることができるため、化学的に調節されたプロモーターである。最も重要なことは、化学的に誘導性のプロモーターは、化学誘導物質は多数の植物に同時に適用可能であるため、大規模応用のために選択されるプロモーターであるということである。調節されたプロモーターの例は、当該分野に公知である。大規模応用は、選択した目的配列が多くの植物で同時に発現される応用である。そのような大規模応用は、温室で実施することができる。
【００２８】
あるいは、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、転写プロモーターに機能可能に連結可能であり、ＲＮＡレプリコンをコードする配列をプロモーターに機能可能に連結することによって目的配列の発現スイッチを入れることができる。この態様を実施するいくつかの方法がある。１つのオプションは、異種ＤＮＡ内で、プロモーターと異種ＤＮＡとのあいだの機能可能な連結を排除する配列ブロックによって、ＲＮＡレプリコンをコードする配列とプロモーターとを分離することである。配列ブロックは、組換え部位を認識するリコンビナーゼによって配列ブロックを切り出せるように組換え部位に隣接し得る。それにより、ＲＮＡレプリコンをコードする配列の転写のための機能可能な連結が確立し、発現スイッチを入れることができる。他のオプションは、転写に必要な配列部分（例えばプロモーター又はプロモーター部分）を反転方向で、組換え部位に隣接して有することである。好適なリコンビナーゼが配列部分を反転させて正しい方向に戻すことができれば、機能可能な連結は確立し得る。
【００２９】
本発明の１つの態様では、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする１以上のセグメントを有する。即ち、ＲＮＡレプリコンは１つの連続したＤＮＡにはコードされていない。その代わり、ＲＮＡレプリコンは、２以上のセグメントによって不連続にコードされ、セグメントは、好ましくは互いに隣接して同一染色体上に存在し得る。したがって、ＲＮＡレプリコンの形成には、例えば組換えによるセグメントの再構成を必要とし得る。例として、レプリコン機能に関する配列の一部（例えばレプリカーゼをコードする配列の一部）は、異種ＤＮＡ中に、そのような配列の他の部分に対して反転方向で存在し得る。反転部分は組換え部位に隣接し得る。したがって、レプリコン機能を提供できないため（例えば転写物は機能性レプリカーゼをコードしていないため）、異種ＤＮＡの転写物はレプリコンではないであろう。組換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを提供することにより、レプリコン機能が連続してコードされるようにセグメントの１つを反転させて戻すことができる。この態様では、リコンビナーゼの提供が、レプリコン形成及び目的配列の発現のスイッチを入れるためのスイッチとして機能する（更に以下を参照されたい）。この態様は、安定に形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に関連して実施することが好ましい。
【００３０】
あるいは、セグメントは異なる染色体上に存在することができる。その場合、ＲＮＡレプリコンの形成は、ＲＮＡレプリコンを組み立てるために２つのセグメントの転写及び２つの転写物のトランススプライシングを必要とするであろう。この態様は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に詳細に記載されているように、子孫植物又は細胞でＲＮＡレプリコンをいっしょにコードするセグメントを迅速に分離するために用いることができる。
【００３１】
本発明の方法は、工程（ａ）及び（ｂ）を含むことができる。工程（ａ）は、本発明の異種ＤＮＡで植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を安定に又は一過性に形質転換することを含むことができる。上で議論したように、核染色体の安定な形質転換が好ましい。好ましくは、本発明の方法は、目的配列によってコードされた目的タンパク質の発現方法である。工程（ｂ）は、目的配列の発現を引き起こすこと、例えば発現スイッチを入れることを含む。発現を引き起こす又は発現スイッチを入れるさまざまな方法が既に言及されている。例として、異種ＤＮＡに機能可能に連結された誘導性プロモーターを誘導すること；組換えによって異種ＤＮＡをプロモーターへの機能可能な連結下に置くこと；組換えによってレプリコンを形成するための配列の連続したコーディングを確立することなどが挙げられる。本発明の方法のスイッチを入れるためにリコンビナーゼを用いる場合、リコンビナーゼを植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に一過性に提供することができ、それにより、工程（ｂ）のスイッチとして作用するであろう。あるいは、リコンビナーゼは細胞に安定にコードされることができ、調節された、好ましくは誘導性のプロモーターの制御下、リコンビナーゼを発現する。したがって、プロモーターを誘導することによってリコンビナーゼの発現を誘導することにより、工程（ｂ）で発現を引き起こすことができる。一過性形質転換の場合、工程（ａ）を実施することによって工程（ｂ）を自動的に達成することができる。
【００３２】
好ましくは、本発明の方法は、（ａ）による多数の植物を準備し、例えば、化学的に誘導性のプロモーターに対する化学誘導物質を全ての植物に例えば噴霧によって適用することによって、全ての植物で（ｂ）による目的配列の発現を引き起こすことによって、１つの工程で、多数の植物を用いて平行して実施する。
【００３３】
本発明の方法の重要な態様では、植物又は植物の部分（例えば葉）は、目的配列を一過性発現させるために、本発明の異種ＤＮＡで一過性に形質転換されている。「一過性形質転換」という用語は、異種ＤＮＡを植物染色体に安定に組み込むために形質転換細胞を選択することなく異種ＤＮＡを導入することを意味する。一過性形質転換は、通常、異種ＤＮＡによってコードされる遺伝子の一過性発現を提供する。一過性形質転換は、以下に挙げる形質転換法のいずれかで達成することができる。しかしながら、本発明の異種ＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム介在一過性形質転換によって実施することが好ましい。アグロバクテリウム介在一過性形質転換の好ましい方法は、アグロ浸潤である。アグロ浸潤（アグロ接種）が最も好ましい。アグロ浸潤によって植物全体（即ち、全ての葉を含めた、土壌の上の部分）が形質転換される場合、目的配列の最速且つ最高の発現レベルを得ることができる。これは、植物をアグロバクテリウム懸濁液中に上下にさっと浸し、真空にし、そしてすぐに真空から開放することによって、達成することができる。
【００３４】
目的配列を一過性に発現させる方法の好ましい態様では、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、転写プロモーター、好ましくは構成的転写プロモーターに機能可能に連結されている。他の好ましい態様では、植物はタバコ属に属し、レプリコン機能に関する配列は、トバモウイルス、好ましくはタバコモザイクウイルスに由来する。特に好ましい態様では、茎及び全ての葉を含めたタバコ植物は、アグロ浸潤によって一過性に形質転換されている。後者の態様は、本発明の方法の大規模応用に用いることができる。大規模応用では、この方法は、多くの植物（少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１００の植物）に同時に適用される。
【００３５】
本発明は、原則として、感染性ＲＮＡウイルスが存在するあらゆる植物に適用することができる。好適な植物とＲＮＡウイルスのペアは、以下に示すＲＮＡウイルスのリストに由来することができる。本発明によるレプリコン形成効率が非常に高いため、植物ウイルスの植物種特異性は、本発明を実施する場合ほとんど目立たない。同様に、本発明は、いずれのＲＮＡウイルスに基づいたＲＮＡレプリコンにも用いることができる。ＲＮＡウイルスは、一般に、宿主植物の細胞核の外側で展開し、レプリコンが細胞核の内側で産生される場合、特にレプリコンが核染色体に安定にコードされる場合、そのようなウイルスに基づくレプリコンを非効率的にする選択された位置を有するであろう。本発明は、異なる植物ＲＮＡウイルスのあいだで改善レベルはさまざまであり得るが、全てのＲＮＡウイルスに適用することができる。本発明が基づく最も好ましい植物ＲＮＡウイルスは、トバモウイルス、特にタバコモザイクウイルス、及びジャガイモウイルスＸのようなポテクスウイルスである。タバコモザイクウイルスの場合、一般に、発現されるべき配列で置換されるのはコートタンパク質であろう。移行タンパク質は、除去又は発現されるべき配列で置換することができる。しかしながら、タバコザイクウイルスに由来するＲＮＡレプリコンは、移行タンパク質をコードし、コートタンパク質は発現されるべき配列で置換される必要があることが好ましい。異種ＤＮＡは、コートタンパク質又は移行タンパク質のような、植物ＲＮＡウイルスの少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失していることが非常に好ましい。
【００３６】
本発明の主要な適用は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物における目的タンパク質の産生である。目的タンパク質は目的配列にコードされる。目的配列は植物ＲＮＡウイルスに対して異種であることが好ましい。いずれにしても、目的配列は、ＲＮＡウイルスの機能を有した配列でもコードした配列でもない。
【００３７】
本発明の方法を植物で実施する場合、タバコ種のように（例えばベンサミアナタバコ、タバコ）ヒト又は動物の食物連鎖に入らない植物が好ましい。植物の部分とは、例えば植物の器官又は葉若しくは種子のような植物の特定の組織である。本明細書において、本発明の方法を、生長しているか又は親植物に付着している種子で行なう場合、種子を植物の部分とみなす。しかしながら、種子はまた、植物の特定の発達段階にあったとしても、植物とみなされる。最も好ましくは、本発明の植物は、種子として販売又は流通され、種子は植物に生長し、そして植物の所望の点で、目的配列の発現が誘導されるか又はスイッチを入れられる。
【００３８】
タバコ又はサトウダイコンのような多くの植物種は、これまで、アグロバクテリウム介在形質転換によってウイルスベクター又はレプリコンで形質転換することが不可能であった。この不可能の理由は、２つの病原体、即ちアグロバクテリウムとウイルスベクターによる植物の２重の課題に応じた植物の防御機構の活性化であったと推測することができる。本発明者らは、高度に希釈されたアグロバクテリウム懸濁液をアグロバクテリウム介在形質転換に使用することにより、ウイルスベクターでより高い形質転換効率を達成することができることを見出した。したがって、本発明は、アグロバクテリウム介在ウイルスベクター形質転換の多くの植物種への広範な適用を達成する。この態様のための高度に希釈されたアグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、計算された光学密度は、それぞれ、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液の少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される。本態様により最も好ましく形質転換される植物種はタバコである。
【００３９】
アグロバクテリウム介在（ＲＮＡ）ウイルスベクター形質転換の形質転換効率は、Ｔ−ＤＮＡ中に本発明の異種ＤＮＡを用いることによって更に向上させることができる。したがって、本発明は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法を提供し、この方法は：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物をアグロバクテリウム懸濁液で形質転換することを含み、アグロバクテリウムはＴ−ＤＮＡに、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なレプリコン（好ましくはＲＮＡレプリコン）をコードする配列を有する異種ＤＮＡを含有する。ここで、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ウイルス（好ましくは植物ＲＮＡウイルス）の配列に由来する、レプリコンのレプリコン機能に関する配列、
（ｉｉ） 発現されるべき目的配列、
を含有し、アグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、計算された光学密度は、それぞれ、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液の少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍
希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される。
【００４０】
本発明者らは、この方法が、アグロバクテリウム株の細胞が環境に広がる可能性を低下させるだけでなく、この方法の生物学的安全性を向上させることを見出した。この方法は、おそらく植物の病原体であるアグロバクテリウム株の感染による植物又は植物の葉への曝露及びストレスを低下させることによって、タンパク質発現効率も向上させる。驚くべきことに、本発明者らは、植物又は植物の部分を形質転換又は形質移入するために用いるアグロバクテリウム懸濁液の濃度の減少とともに、ある限度内で本方法の効率が上昇することを見出した。特に、これらアグロバクテリウム懸濁液の濃度の減少とともに、植物の細胞内で作製されたレプリコンの細胞間移行能が向上する。この予想外の現象の理由は、未だ同定されていない。この現象はアグロバクテリウム感染に対する植物の応答によるものであり、より低いアグロバクテリウム濃度ではこの応答は起こらない（又はより少ない範囲で起こる）と推測される。アグロバクテリウムを用いた先行技術形質転換法では、通常、６００ｎｍのＯＤが０．５〜１．０の範囲の非常に高濃度のアグロバクテリウムが用いられている。
【００４１】
植物又は植物の葉は、アグロバクテリウム株の細胞懸濁液に浸潤させることが好ましく、懸濁液は、６００ｎｍのＯＤ（光学密度）が１．０のアグロバクテリウム株の細胞懸濁液を少なくとも２５倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２５０倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に希釈することによって得ることが可能なアグロバクテリウム細胞濃度を有する。したがって、そのような希釈は、それぞれ、計算された６００ｎｍのＯＤ値が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１のアグロバクテリウム懸濁液を生ずる。
【００４２】
計算されたＯＤ値が０．０４以下のアグロバクテリウム懸濁液を用いるこの方法は、本発明に記載した他の態様と組み合わせることができる。浸潤又はアグロ浸潤は、アグロバクテリウム懸濁液を用いた形質転換法又はトランスフェクション法として定義することができ、アグロバクテリウムを植物組織（細胞間空間）へ押し付けるために圧力差が用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン形成頻度の増加に基づいた本発明の一般原理を表す。
【図２Ａ】図２は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を水平軸に示す。垂直軸は、対応する配列／配列領域がコード配列（コーディング）である確率、ドナー部位（ドナー）又はアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。円で囲んだ部分は、機能保存的な相違が導入されるべき選択された位置に相当する。
【図２Ｂ】図２は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を水平軸に示す。垂直軸は、対応する配列／配列領域がコード配列（コーディング）である確率、ドナー部位（ドナー）又はアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。円で囲んだ部分は、機能保存的な相違が導入されるべき選択された位置に相当する。
【図３】図３は、ベクターｐＩＣＨ１５４６６の転写領域の最初の半分のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、本発明による機能保存的な相違で改変されている（図２Ａ参照）。
【図４】図４は、ｐＩＣＨ１５９０の転写領域の２番目の半分のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、本発明による機能保存的な相違で改変されている（図２Ｂ参照）。
【図５Ａ】図５は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、挿入した６つの植物核イントロンに相当する。
【図５Ｂ】図５は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。円で囲んだ領域は、挿入した６つの植物核イントロンに相当する。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明による機能保存的な相違を有する、及び有さない、ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明による機能保存的な相違を有する、及び有さない、ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の略図である。
【図７Ａ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域のベクター（ｐＩＣＨ）同定番号を示す。図７Ａはベンサミアナタバコ、アグロ浸潤後８日である。
【図７Ｂ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域のベクター（ｐＩＣＨ）同定番号を示す。図７Ｂはタバコ、アグロ浸潤後８日である。
【図７Ｃ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域のベクター（ｐＩＣＨ）同定番号を示す。図７Ｃはアグロ浸潤後５日に単離されたベンサミアナタバコのプロトプラストである。右の写真の多くの光のスポットは、非常に高いレプリコン形成頻度及びＧＦＰ発現を示す。
【図８】図８は、本発明にしたがいデザインされたＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン前駆体の略図であり、非誘導状態では目的遺伝子（ＧＦＰ、Ｇと表示）のゼロ発現レベルを生ずる。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終止領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図９】図９は、ダイレクト鎖（＋鎖）を用いたシロイヌナズナ減数分裂特異的遺伝子ＡｔＤＭＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７６６７０）に対するイントロン予測プロファイルを示す。イントロンコード領域を円で囲んでいる。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）のダイレクト鎖（＋鎖）内の潜在的問題領域（丸で囲んでいる）の予測を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）のダイレクト鎖（＋鎖）内の潜在的問題領域（丸で囲んでいる）の予測を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＲＮＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０３）のアルファルファモザイクウイルスゲノムのダイレクト鎖（＋鎖）の潜在的問題領域（円で囲んでいる）の予測を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０２）のアルファルファモザイクウイルスゲノムのダイレクト鎖（＋鎖）の潜在的問題領域（円で囲んでいる）の予測を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＲＮＡ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ００１６３）のアルファルファモザイクウイルスゲノムのダイレクト鎖（＋鎖）の潜在的問題領域（円で囲んでいる）の予測を示す。
【図１２】図１２は、構築体ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８のＴ−ＤＮＡ領域を表す。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終始領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図１３】図１３は、ｐＩＣＨ１２６９１又はｐＩＣＨ１６８８８のＴ−ＤＮＡ領域を有する安定に形質転換された異なるベンサミアナタバコ株のＵＶ光下の葉を示す。葉は、インテグラーゼを提供するベクター（ｐＩＣＨ１０８８１又はｐＩＣＨ１４３１３）でアグロ浸潤させた。
【図１４】図１４は、ｐＩＣＨ１８７１１でアグロ浸潤後１週間のサトウダイコンの葉を日光（左）及びＵＶ（右）照射で示す。右の写真の光のパッチは、ＧＦＰ蛍光を示す。下に示した構築体中のイントロン（斑点のある四角）を番号付けしている。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、本発明者らは、レプリコン機能に関する配列内で、植物イントロンを植物ウイルスＲＮＡベクターのある領域に組み込み、潜在イントロンを除去又は置換することにより、宿主植物の細胞質におけるＲＮＡレプリコンの出現効率を劇的に増加させることができる（少なくとも×１０2倍）ことを見出した。そのような効率増加は、少なく
とも１つの容易に測定可能なパラメータ：例えば上昇したレプリコン形成頻度でベクターの複製を示す細胞の相対位置に反映された。こうしたＲＮＡレプリコン形成の開始の最適化は、植物全体で目的配列の発現スイッチを同調して入れる能力をもたらし、非改変ベクターよりも短い時間で組換え目的タンパク質の収率の劇的な増加を生じた。
【００４５】
組換えＤＮＡのコード領域へのイントロンの組み込みによる核トランス遺伝子発現の増加に関する出版物にもかかわらず（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５、９１３−９２０；Ｂｏｕｒｄｏｎら、２００１、ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２、３９４−３９８；Ｒｏｓｅ，ＡＢ．、２００２、ＲＮＡ、８、１４４４−１４５３；ＵＳ５，９５５，３３０号）、ウイルスＲＮＡレプリコンへのイントロンの組み込みは、ウイルスレプリコン形成頻度に、続いてレプリコンによって提供される目的配列の発現レベルに正の効果をもたらすであろうと示す先行技術にはヒントがない。この効果は、核ｍＲＮＡ転写及びウイルスＲＮＡ複製が異なる細胞内区画で生ずることを考慮すると驚くべきことである。ウイルスレプリコンのｃＤＮＡコピーが核にある場合であっても、ウイルスレプリコン前駆体の最初のコピーのみが核で産生され、次に核とは異なる条件下において細胞質で増幅される。先行技術では、野生型ウイルスｃＤＮＡをクローニングするあいだの大腸菌におけるウイルス遺伝子の「漏出性」発現による細胞毒性を妨げるためのイントロンの使用が記載されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｉ．Ｅ．、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２４００−１２４０５；Ｙａｎｇら、１９９８、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４３、２４４３−２４５１；Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｙａ＆Ｇａｒｃｉａ、２０００、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、６８、９９−１０７）。イントロンを含めることがウイルスｃＤＮＡクローンからのレプリコン形成頻度を上昇させることができるというヒントはない。野生型ＲＮＡウイルス及びそれらのｃＤＮＡコピーについて得た結果は、ウイルスの高い感染性及び安定性のような野生型ウイルスの他の特性を圧倒的に犠牲にしており、植物における異種目的配列の発現のためにデザインされたウイルス由来発現ベクターに匹敵し得るものではない。感染性は、本発明の課題ではない。特に、感染性は、目的配列を安定に形質転換された植物において発現させる方法における課題ではない。Ｔ−ＤＮＡ中にＤＮＡベクターを含有するアグロバクテリウムで植物を形質転換する場合は、ウイルスＤＮＡベクター又はその転写物の感染性も課題ではない。
【００４６】
本発明は、ＲＮＡウイルスに由来するレプリコン形成頻度を根本的に上昇させるための方法を提供し、レプリコンはＤＮＡ前駆体の転写に由来し、目的配列の発現のためにデザインされている。この方法は、発現されるべき異種配列のサイズ限定及びベクターの高度な不安定性のような、既存のウイルスベクターに基づいた発現システムの限定を克服する。更に、この方法はより良いバイオセイフティの特徴を提供し、トランス遺伝子発現に対する漏出検査制御のデザインを可能にする（非誘導状態でゼロ発現レベル）。そのようなデザインはＲＮＡウイルスに由来するレプリコンのデザインのための戦略に組み込まれた部分であり得るためである。ＲＮＡウイルスに由来するレプリコン形成を高頻度に提供することにより、本明細書に記載のアプローチは、ＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物全体、植物の部分、又は植物細胞培養物において、目的配列の迅速な発現開始を可能にする。本発明を実施することによって、異種目的配列の発現のためにデザインされた植物ＲＮＡウイルス由来レプリコンの実際の性能を、レプリコン形成頻度の劇的増加を通して顕著に向上させることができる。
【００４７】
さまざまな分類群に属するＲＮＡウイルスが、本発明のＲＮＡレプリコンの構築に好適である。本発明を適用し得るＲＮＡウイルスのリストを以下に提示する。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示す。種名（属名）は標準体で示す。属又は科について正式命名のないウイルスが示されている：
ＲＮＡウイルス：
１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科、属：アルファモウイルス属、基準種：アルファルファモザイクウイルス、属：イラルウイルス属、基準種：タバコ条斑ウイルス、属：ブロモウイルス属、基準種：ブロムモザイクウイルス、属：ククモウイルス属、基準種：キュウリモザイクウイルス；
科：クロステロウイルス科、属：クロステロウイルス属、基準種：ビート黄斑ウイルス、属：クリニウイルス属、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、科：コモウイルス科、属：コモウイルス属、基準種：ササゲモザイクウイルス、属：ファバウイルス属、基準種：ソラマメ壊疽ウイルス１、属：ネポウイルス属、基準種：タバコ輪点ウイルス；
科：ポティウイルス科、属：ポティウイルス属、基準種：ジャガイモＹウイルス、属：ライモウイルス属、基準種：ライグラスモザイクウイルス、属：バイモウイルス属、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
科：セキウイルス科、属：セキウイルス属、基準種：パースニップｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋウイルス、属：ワイカウイルス属、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス；科：トンブスウイルス科、属：カルモウイルス属、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、属：ダイアントウイルス属、基準種：カーネーション輪点ウイルス、属：マクロモウイルス属、基準種：トウモロコシｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：ネクロウイルス属、基準種：タバコ壊死ウイルス、属：トンブスウイルス属、基準種：トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス、
属が未分類の１本鎖ＲＮＡウイルス、属：カピロウイルス科、基準種：リンゴｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇウイルス；
属：カーラウイルス属、基準種：カーネーション潜在ウイルス；属：エナモウイルス属、基準種：エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属：フロウイルス属、基準種：土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属：ホルデイウイルス属、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：イダエオウイルス属、基準種：ラズベリーｂｕｓｈｙ ｄｗａｒｆウイルス；
属：ルテオウイルス属、基準種：オオムギ黄萎ウイルス；属：マラフィウイルス属、基準種：トウモロコシｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス；属：ポテクスウイルス属、基準種：ジャガイモＸウイルス；属：ソベモウイルス属、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：テヌイウイルス属、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス属、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス属、基準種：タバコ茎壊疽ウイルス、
属：トリコウイルス属、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス；属：ティモウイルス属、基準種：カブ黄斑モザイクウイルス；属：アンブラウイルス属、基準種：ニンジンｍｏｔｔｌｅウイルス；マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：サイトラブドウイルス属、基準種：レタス壊死性黄変病ウイルス、属：ヌクレオラブドウイルス属、基準種：ジャガイモ黄萎病ウイルス；
マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス科、属：トスポウイルス属、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
２本鎖ＲＮＡウイルス：科：パーティティウイルス科、属：アルファクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス１、属：ベータクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス２、科：レオウイルス科、属：フィジーウイルス属、基準種：フィジー病ウイルス、属：ファイトレオウイルス属、基準種：創傷 腫瘍ウイルス、属：オリザウイルス属、基準種：イネｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未分類ウイルス：
ゲノム：１本鎖ＲＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅモザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ｏｕｒｍｉａ メロンウイルス、種：ペラルゴニウムｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス。
【００４８】
本発明の一般原理を図１に示す。植物ＲＮＡウイルス（例外はウイロイドである−植物細胞核で増幅する小さな非コードＲＮＡ−概説としてＤｉｅｎｅｒ，Ｔ．Ｏ．、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．、１５、２０３−２２０；Ｆｌｏｒｅｓ，Ｒ．、２００１、ＣＲ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ、３２４、９４３−９５２を参照されたい）は植物の核では決して生じないが、細胞質で生ずることが知られている。したがって、ＲＮＡウイルスの配列は、プレｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ前駆体を含めたプロセシングされたＲＮＡの細胞質への輸送を含めたプロセシング工程の複雑なシリーズに関与し得るモチーフの存在により、核のＲＮＡプロセシングイベントに抵抗するためには適合しないであろう。５’端キャッピング、スプライシング、３’端生成、ポリアデニル化、分解、塩基及び糖修飾、並びに（プラスチド及びミトコンドリアにおける）編集のようなプロセシングイベントが重点的に研究されている。しかしながら、そのようなイベントの多く
の要素は依然として不明なままである。核におけるプレｍＲＮＡに対する最も劇的な変化は、プレｍＲＮＡスプライシングのあいだに起こり、そのプロセスにより、介在ＲＮＡ配列（イントロン）が初期転写物から除去され、同時にエクソンが連結される。スプライシングは、ウリジル酸に富んだ小さな核リボヌクレオタンパク質粒子を含む複雑な構造であるスプライソソームによって介在される。スプライソソームは、２つの連続工程でスプライシング反応を実施する：最初の１工程−上流エクソン／イントロン接合部の５’スプライス部位を切断し、ラリアット形成をもたらす。第２工程−イントロン／下流エクソン接合部の３’スプライス部位を切断した後、上流及び下流エクソンが連結される（概説として：Ｋｒａｍｅｒ，Ａ．、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５、３６７−４０９；Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＧＧ．＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９９６、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１−４１を参照されたい）。イントロン配列に隣接する５’及び３’スプライス部位ジヌクレオチド（５’／ＧＵ；ＡＧ／３’）は、高等植物において高度に保存されており、１つのＧ置換は関与する部位のスプライシング活性を放棄するであろう。植物と動物とのあいだでスプライス部位が高度に保存されているにもかかわらず、植物において異種イントロンは、通常スプライシングされず、不正確なスプライシングもされないことは驚くべきことである（ｖａｎ Ｓａｎｔｅｎ，ＶＬ．ら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５６、２５３−２６５；Ｗｉｅｂａｕｅｒ，Ｋ．、Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．Ｊ．、Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、８、２０４２−２０５１）。植物ウイルスＲＮＡは、核のＲＮＡプロセシング装置に抵抗するための進化圧下になかったことを考慮すると、これらのＲＮＡは、核環境にいったん置かれると、スプライシングを含めたそのようなプロセシングの対象になる可能性が非常に高い。この状況は、核遺伝子にコードされるＲＮＡ転写物とは完全に異なっている。後者の転写物は核で起こるＲＮＡ修飾のシリーズにかかわらず機能性を保存するように進化的に適合されているためである。しかしながら、そのような修飾は、ウイルスＲＮＡレプリコン形成のための劇的な結果を有することができる。異種遺伝子用発現ベクターを作製するための植物ウイルスの再操作は、ウイルス起源のＲＮＡ配列と相互作用し得る更なる配列を付加するため、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンに不安定性を更に付加し、複製不可能な欠陥ＲＮＡを産生するであろう。本発明は、一過性の発現のため又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組込みのために、発現ベクターをＤＮＡ前駆体として植物又は植物細胞に組み込むと機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を顕著に上昇させる修飾を、発現ベクターに供することによってこうした問題に取り組む。ウイルス由来配列の修飾が、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの効率を増加させるための最も意義深い解決策であると考えられる。本発明では、ＲＮＡレプリコン形成の効率上昇に重要であるため、主に植物ＲＮＡウイルス由来配列の修飾（機能保存的な相違）に重点をおく。
【００４９】
驚くべきことに、潜在的に問題のある領域が存在する証拠を見出す最初の試みは成功した。そして更に驚くべきことに、予想外にもけた違いの改善を見出すことによって実験的確証を得た。潜在イントロン及びＲＮＡスプライシング部位の存在に関する、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いた発現ベクターｐＩＣＨ８５４３のＲＮＡウイルスに由来する配列の解析（実施例１、図６Ａ）は、核のＲＮＡプロセシング装置によってスプライシングされるであろうイントロン様領域の存在を示した（図２の円で囲んだ領域を参照されたい）。多様な生物のためのエクソン／イントロン予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）又はスプライシングシグナル予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／〜ｗｅｂｇｅｎｅ／ｗｗｗｓｐｌｉｃｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）のように、植物ウイルスＲＮＡ配列内で潜在的に問題のある領域（選択された位置）を同定するために使用できる他のプログラムが多数存在する。
【００５０】
既存の全てのプログラムは理想的でなく、ミスを逃れられないことを考慮すると、潜在的に問題のある領域は、実験的に決定することもできる。これは、核環境で試験対象ＤＮＡベクターに由来する転写物を、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）のような日常的技術で、又はさまざまな転写物の濃度の正確な定量に好適な、より上級版のリアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、６、９９５−１００１）と呼ばれる技術で解析し、好ましくはＰＣＲ増幅産物を配列決定することによって行なうことができる。本発明の機能保存的な相違は、例えばＡ／Ｕに富んだ領域（イントロン様）をＧ／Ｃに富んだ領域（エクソン様）で置換してサイレント変異を導入することによって、例えばイントロン様配列をエクソン様配列で置換することによって、ＲＮＡプロファイルを劇的に変化させる（図３、円で囲んだ領域を参照されたい）。植物イントロンはエクソンと異なり、通常Ａ／Ｔ（Ｕ）に富んでいる（Ｌｏｒｋｏｖｉｃ，ＺＪ．ら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、５、１６０−１６７；Ｂｒｏｗｎ，ＪＷ．及びＳｉｍｐｓｏｎ，ＣＧ．１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４９、７７−９５；Ｃｓａｎｋ，Ｃ．ら、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１８、５１３３−５１４１；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３）が、例外がある。例えば単子葉植物では、Ｇ／Ｃに富んだイントロンが発見された（Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０、２６３５−２６４４）。本発明を実施するには、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量の選択された位置は、少なくとも５５％以上、好ましくは少なくとも６５％以上、最も好ましくは８０％以上のＡ／Ｔ（Ｕ）含量を有する少なくとも長さ２０ヌクレオチドの配列ストレッチだけでなく、純粋にＡ／Ｔ（Ｕ）を含有する配列の列の６〜１９ヌクレオチドのより短いストレッチ（「アイランド」）をも含む。本明細書において、高Ａ／Ｕ含量の位置は、ＵよりもＡに富んだ配列、Ａに富んだ配列、ＡよりもＵに富んだ配列、及びＵに富んだ配列を含む。更に、転写された目的配列は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）によって、核酸配列に変化を引き起こす翻訳後修飾（例えばＲＮＡスプライシング）について試験することができる。オリジナルＲＮＡ転写物から配列を欠失させるような翻訳後修飾を免れないＲＮＡ内の領域を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを用いることは、当業者にとってささいな仕事である。実施例２では、Ａ／Ｕに富んだ領域の修飾が、ＧＦＰ発現細胞数を少なくとも１０倍に増加させることを立証する。これは、ｐＩＣＨ１５４６６（改変ベクター、図６Ａ）及びｐＩＣＨ１４８３３（対照ベクター、図６Ａ）でアグロ浸潤させた領域を比較することによって図７に明確に示されている。移行タンパク質（ＭＰ）を除去することにより、初期感染部位から隣接細胞への細胞間移行は起こらないため、機能性ＲＮＡレプリコンを所持する初代培養細胞の正確な計数を可能にする。実施例３では、多くの潜在スプライス部位を含有する他のＵに富んだイントロン様領域の修飾（図２Ｂ）、及び移行タンパク質（ＭＰ）のサブゲノムプロモーターの被覆（図４、円で囲んだ）を実施した。この修飾は、ウイルスベクターｐＩＣＨ１５９０からのレプリコン形成頻度の上昇に劇的効果を生ずる。プロトプラスト計数実験（実施例３）で確立されたように、試験したタバコ種−ベンサミアナタバコ及びタバコに関し、非改変ベクターｐＩＣＨ１４８３３と比較した上昇はおよそ１００倍であった（図７Ａ、７Ｂの対応する浸潤領域を参照されたい）。一般に、本発明に記載のアプローチを用いることによって、ＲＮＡレプリコン形成頻度をおよそ３００倍増加させることができる。即ち、機能性レプリコンを有する細胞の割合を約０．２％（対照ベクター）から５０％（改変ベクター）以上に増加させる。これは限界ではなく、頻度が１００％に達することも非常に現実的であると考えられる。
【００５１】
そのように高効率のレプリコン形成は、同一植物細胞内で、２つの異なるＲＮＡレプリコンから２以上の異なる遺伝子を発現させる道を開く。例えば植物ＲＮＡウイルスに基づいたベクターを用いることによって異なる遺伝子を共発現させる。「先着順」という原理はウイルスベクターに関して特に真実であるため、同一細胞で同時に、２以上のレプリコンの同調した放出を達成することはそのような共発現に重要である。異なるウイルスベクターは通常伝播領域が重複しないか又はそのような重複はわずかであるため、全体移行又は細胞間移行は役に立たない。単純な計算により、２つの目的配列の共発現を同一植物細胞で２つのレプリコンから達成するための本発明に記載の技術の重要性が立証される。機能性レプリコン形成頻度が全細胞のわずか０．２％である非最適化ウイルスベクターの場合、２つの異なるＲＮＡレプリコンから２つの遺伝子を共発現する細胞の割合は、０．２×０．２＝０．０４％であるが、機能性ＲＮＡレプリコン形成頻度が上昇した構築体（全細胞の５０％又は１／２）の場合、共発現する細胞の割合は、０．５×０．５＝０．２５又は２５％であり、例えば約６２５倍高い。最高性能のベクターの場合（例えばｐＩＣＨ１６１９１、図７Ｃ）、機能性レプリコンを有する細胞の割合は、約９０％に達する（図７Ｃ、右上）。これは、２つの異なる目的配列を２つの独立したレプリコンから発現させるためにそのようなベクターを使用することにより、共発現が全細胞の約８０％で起こり得ることを意味する。この技術は更に改善でき、１００％共発現を達成できる可能性は非常に高いと思われる。
【００５２】
ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的異種配列における機能保存的な相違は、特にレプリコン機能に関する配列における相違と組み合わせて、ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためにも使用できることに注目することは価値がある。例えば、レプリコンの形成及び／又はプロセシングに必要な修飾を目的配列内に導入することができる。
【００５３】
本発明の重要な態様では、レプリコン形成頻度は、核イントロンをレプリコン機能に関する配列に挿入することによって上昇する（実施例４）。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のコード領域にイントロンを組み込むことにより（実施例４及び８）、本明細書に定義したような（図６Ａ、６ＢのｐＩＣＨ１５０３４、ｐＩＣＨ１５０２５、ｐＩＣＨ１５４９９）機能保存的な相違を有するベクターからのレプリコン形成頻度に顕著な（少なくとも５０倍）上昇（図７Ａ、７Ｂ）をもたらす。シロイヌナズナ由来の挿入された６イントロンを含有するベクターのＲＮＡプロファイルを図５に示す。他の実施例では（実施例７）、イントロンのＭＰ配列への挿入は、レプリコン形成頻度を少なくとも１００倍に増加させる。
【００５４】
本発明を実施するために多くの核イントロンを用いることができる。そのようなイントロンの例としては、限定されるものではないが、イネｔｐｉ Ａｃｔ１遺伝子及びｓａｌＴ遺伝子（Ｒｅｔｈｍｅｉｅｒら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１２、８９５−８９９；Ｘｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１００、４５９−４６７；ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２、１６３−１７１）に由来のイントロン；トウモロコシ Ａｄｈ１、ＧａｐＡ１、アクチン及びＢｚ１遺伝子（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１、１１８３−１１２００；Ｄｏｎａｔｈら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８、６６７−６７６；Ｍａａｓら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１９９−２０７；Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ＆Ｍｅｔｔｌｅｒ、１９９２、ＷＥ．Ｃｏｈｎ、Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ編、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ２２９−２５７）に由来のイントロン；ｐｅｔｕｎｉａ ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子ＳＳＵ３０１（Ｄｅａｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１、２０１−２０８）に由来のイントロン；シロイヌナズナＡ１ ＥＦ１α、ＵＢＱ１０、ＵＢＱ３、ＰＡＴ１遺伝子（Ｃｕｒｉｅら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８、４２８−４３６；Ｎｏｒｒｉｓら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１、８９５−９０６；Ｒｏｓｅ及びＬａｓｔ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、４５５−４６４）に由来のイントロン；及び他の多くのものが挙げられる。合成イントロンを本発明に用いることもできる。最小の使用可能なイントロン又はそれらの部分は、通常内部イントロン配列に隣接するスプライスドナー及びアクセプター部位に限定することができる。好ましくは、イントロンのサイズは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは１００〜２００ヌクレオチドであるべきであるが、実際にはイントロンのサイズに限定はない。しかしながら、構築体のサイズは操作に好適である必要がある。イントロンの由来、その構造、及びサイズは、ベクターの性質に応じて個別に選択することができる。選択したイントロン又は対応するイントロン部分の効率を試験するために、一過性発現実験を用いることができる。
【００５５】
上記修飾は累積効果を有する。例えば、イントロン挿入をＭＰサブゲノムプロモーターの修飾と組み合わせる場合、レプリコン形成頻度の上昇はおよそ３００倍であり得る（実施例５）。ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためのイントロン挿入に好ましい領域は、本明細書において選択された位置と呼ばれる。そのような位置は、「イントロン様」構造を含有するかもしれない。これは、ＭＰサブゲノムプロモーターのように問題のある領域へ実際に近接して、イントロンをＭＰへ挿入するによって確認される（実施例７）。レプリコン形成頻度の１００倍上昇が観察された。「エクソン様」領域へのイントロンの挿入には、イントロン様領域への挿入のような目立った効果はない（実施例６）。
【００５６】
上で議論した実験は、植物細胞へのアグロバクテリウム介在ＤＮＡ前駆体送達に基づいた一過性発現システムを用いて行われた。しかしながら、本発明の最も有用な応用は、植物核染色体に安定に組み込まれたＲＮＡレプリコンのＤＮＡ前駆体を有するトランスジェニック植物であろう。これは、ウイルスベクターが許容できる異種配列の最大サイズに対する限定のような、植物ウイルスベクターに基づいたシステムの多くの限界を克服させる。ＤＮＡ前駆体はトランスジェニック植物の各細胞に存在するため、ＲＮＡレプリコンの全体移行又は細胞間移行（レプリコン伝播）に対する絶対的要求は無い。これは、本発明のＲＮＡレプリコンの高率の形成及び細胞質への輸送によって補填することができる。しかしながら、ＲＮＡレプリコン形成は全ての細胞で常に起こるわけではないため、ベクターの細胞間移行能には更なる価値があり得る。
【００５７】
異種ＤＮＡを有する植物細胞を作製するために異なる方法を用いることができる。アグロバクテリウムによって運ばれるＴｉ−プラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）によって、又は粒子若しくは微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）によって、ベクターは植物細胞に形質転換されることができる。マイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６号；ＷＯ０９４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１号）、又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換などのような他の植物形質転換法も用いることができる。ベクター送達法の選択は、形質転換される植物種に依存し得る。例えば、単子葉植物の形質転換には通常微粒子銃が好ましく、双子葉植物にはアグロバクテリウム介在形質転換が一般に良好な結果を与える。
【００５８】
以下に記載する実施例では、ベクター（異種ＤＮＡ）のタバコ細胞へのアグロバクテリウム介在送達を用いた。しかしながら、目的植物種の安定な又は一過性の形質転換に好適な標準技術のいずれかにしたがい、ベクターを植物に導入することができる。双子葉植物の形質転換技術は当該分野で周知であり、アグロバクテリウムに基づいた技術や、アグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術には、プロトプラスト又は細胞による外来遺伝物質の直接取り込みが含まれる。これらの技術には、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを介在した取り込み、粒子銃を介在した送達、及びマイクロインジェクションが含まれる。こらら技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．３、２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９、１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７、７０−７３（１９８７）に記載されている。いずれの場合でも、形質転換された細胞は、標準技術を用いて完全な植物に再生される。
【００５９】
アグロバクテリウム介在形質転換は、形質転換効率の高さ及び多くのさまざまな植物種を用いる広範な有用性のために、双子葉植物の形質転換に好ましい技術である。アグロバクテリウムで日常的に形質転換され得る多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、アブラナ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファ及びポプラが含まれる（ＥＰ ０ ３１７ ５１１号（綿）、ＥＰ ０ ２４９ ４３２号（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９号（アブラナ）、米国特許第４，７９５，８５５号号（ポプラ））。
【００６０】
アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、目的外来ＤＮＡを有するバイナリーベクターを、共耐性プラスミド又は染色体上に宿主アグロバクテリウム株によって運ばれるｖｉｒ遺伝子の相補体に依存し得る適切なアグロバクテリウム株に輸送することが含まれる（Ｕｋｎｅｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：１５９−１６９（１９９３）。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウムへの輸送は、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム株へ移動させることができる、組換えバイナリーベクターを有する大腸菌、ｐＲＫ２０１３のようなプラスミドを有するヘルパー大腸菌株、を用いる三親性交配法によって達成することができる。あるいは、形質転換によって組換えバイナリーベクターをアグロバクテリウムへ移動させることができる（Ｈｏｆｇｅｎ＆Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、９８７７（１９８８））。
【００６１】
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換には、通常、当該分野に公知のプロトコールにしたがったアグロバクテリウムと植物からの外植片との共培養が含まれる。バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡの境界間に存在する抗生物質耐性又は除草剤耐性マーカーを有する形質転換された組織は、選択可能培地で再生されることができる。これは、本発明の異種ＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡで核染色体を安定に形質転換したトランスジェニック植物の作製を可能にする。
【００６２】
本発明の例では、安定なアグロ形質転換と平行して、目的遺伝子を一過性発現させるためにＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム介在送達法であるアグロ接種を用いた（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１１１２８−１１１３３）。アグロ接種は、小規模から中規模の組換えタンパク質産生システムだけでなく、ベクター最適化システムの要素として、非常に有用なツールであり、さまざまな構築体の変異体を用いて迅速な結果を得ることができる。
【００６３】
本発明は、組換えタンパク質の大量／工業的産生にも用いることができる。実験ではアグロバクテリウムの一晩培養物を用いた。アグロ浸潤のために、先行技術に記載のように一晩培養物を準備した（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１、６８５３−６８５７）。通常、一晩培養は波長６００ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）が３〜３．５単位に達し、アグロ浸潤の前に３〜５回希釈され、一般に５〜９×１０9コロニー形成単位を生ずる（Ｔｕｒｐｅｎら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４２、２２７−２４０）。このような一晩培養物を１０2倍、好ましくは１０3倍、より好ましくは１０4倍に希釈すると、特に、本明細書に記載したような機能保存的な相違を有するレプリコン機能に関する配列と組み合わせて、非常に効率的に働くことを見出した。驚くべきことに、形質転換するアグロバクテリウムの希釈を上げるにつれて、浸潤させたタバコ葉中のベクターは更に性能が向上し、ＧＦＰのより良い収率を生じた。例えば、１０3倍希釈は、１０2倍希釈よりも良好な結果を与えた。１０2倍希釈は、１０倍希釈よりも良好なＧＦＰ収率を提供する。この現象の可能な説明
は、高度に濃縮したアグロバクテリウム懸濁液の、ウイルスベクター機能、例えば細胞間移行に対する負の効果、おそらく高濃度の病原体細菌に対する植物の反応の結果である。この現象には、アグロ浸潤を介した組換えタンパク質産生に要するアグロバクテリウム量を、先行技術の方法と比較して少なくとも１けた減少させるため、大規模工業的タンパク質発現法にとって特別な価値がある。
【００６４】
本発明の実施例９では、不活化ウイルスＲＮＡに基づいたレプリコンのＤＮＡ前駆体が、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれている。レプリコンは本発明にしたがい最適化されている。更に、レプリコンは、目的配列の発現を妨げる構造を含有する。機能性ＲＮＡレプリコンの発現及び形成は、部位特異的組換えにより、構築体の一部を反転させることによって誘発することができる。反転は、２つのイントロンの形成、及び機能性目的配列の組み立てをもたらすことができる。実施例９に記載のシステムは、ウイルスベクターの最適化だけでなく、染色体ＤＮＡに安定に組込まれた構築体の、構築体からの目的遺伝子の「漏出性」発現を含めた「漏出性」を避けるための解決策を示している。多くの応用では、特に細胞毒タンパク質に関して、又は技術的タンパク質又は医薬タンパク質を発現させるための植物発現システムを用いて高いバイオセイフティ基準を達成するため、非誘導状態でゼロレベルの発現を有することは重要である。
【００６５】
異種ＤＮＡ及び／又はリコンビナーゼの転写は、誘導性の又は他の調節された（例えば発生的に調節された）プロモーターの制御下に置くことができる。誘導性プロモーターは、誘導条件にしたがい２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるもの、及び生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるもの。第１のカテゴリーの例は、熱誘導性（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性（ＵＳ０５８４７１０２号）プロモーター、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号）、並びにテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学的誘導性システムの分野における最近の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れることができ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的誘導性システムの概説としては：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１、１４６−１５１）及びＰａｄｉｄａｍ，Ｍ（２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、６、１６９−１７７）を参照されたい。誘導性プロモーターの他の例は、植物の病原性関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターである。これらのプロモーターは、病原体攻撃に対応した植物シグナル伝達経路の重要成分であるサリチル酸で、又はＰＲ遺伝子発現を誘発可能な他の化学化合物（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール又はイソニコチン酸）で、植物を処理することによって誘導することができる（ＵＳ０５９４２６６２号）。
【００６６】
本発明は、実施例１〜９に記載のＴＭＶに基づいたベクターに限定されず、他の植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンに広げることができる。他の植物ウイルスＲＮＡ配列の解析（実施例１０、図１０、１１）は、ＴＭＶ、及び植物核遺伝子のプレｍＲＮＡの配列に関して記載したのと非常に類似した選択された位置を示している（図９）。これは、本発明に記載のアプローチを用いて、実際に、植物ＲＮＡウイルス由来レプリコンは、問題領域の除去／置換及び／又は核イントロンの挿入によって根本的に改善することができるという示唆を指示する強力な証拠である。
【００６７】
本発明は、高等多細胞植物、その部分、又はその細胞培養物を用いて実施することが好ましい。本発明に使用する植物には、農学的及び園芸学的に重要な種に関連した植物種が含まれる。本発明に使用するための一般的な作物には、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ルピナス、キビ、オートムギ、エンドウマメ、落花生、イネ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、ソラマメ、コムギ、フジ、及び堅果植物が含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種には、限定されるものではないが、イネ科、キク科、ナス科、及びバラ科の代表的なものが挙げられる。
【００６８】
本発明での使用に更に好ましい種は、以下の属に由来する植物である：シロイヌナズナ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、ライムギ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシ、及びＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ並びにその他多くのもの。
【００６９】
本発明に最も好ましい植物は、動物又はヒトの食物連鎖に入らないタバコ種のような植物、例えばベンサミアナタバコ及びタバコである。
本発明を用いて植物若しくは植物細胞で発現し得る目的タンパク質、その断片（機能性又は非機能性）、及びそれらの人工的誘導体には、限定されるものではないが、以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼφＣ３１、又はその活性断片又は変異体）、オイル修飾酵素（脂肪酸デサチュラーゼ、エロンガーゼなどのような）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維（traits altering fiber）、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア ヘルビコラ リコピン合
成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ（ketohydrolase）、アセトアセチルＣｏＡ レダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、ポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＦＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸 リン酸 ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルス レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルス レプリカーゼ、カリホルニアウンベルラリア Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、Ｄ６−不飽和化酵素、脂肪酸の生合成及び修飾、例えば植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームβ酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、など；５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、細菌ニトリラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ及びＲＮａｓｅ）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼなどを含めた細菌又はファージに由来する他の多くの酵素など。
【００７０】
本発明は、工業的酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼなど）及び線維性タンパク質（コラーゲン、クモの糸タンパク質など）を含めた、商業的に価値があり、医薬的に重要なタンパク質の分子農業（molecular farming）及び精製のために用いることができる。ヒト又は動物の健常なタンパク質は、本発明で記載したアプローチを用いて発現させ、精製することができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、病原体微生物に由来するものを含めた抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ソマトトロピン（ＨＧＨ）及びプロインスリンを含めたポリペプチドホルモン、サイトカイン及びそれらの受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素学的に活性なリソソーム酵素、線溶性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシン、トリプシノーゲン、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ヒト血清アルブミン、グルコセレブロシダーゼ、天然コレラ毒素Ｂ、トロンビン、ヒト胃リパーゼ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＭＦ）、セルピン、ラクトフェリン、リゾチーム、オレオシン、プロトロンビン、α−ガラクトシダーゼ、並びにフュージョンのような機能保存的タンパク質、上記タンパク質の変異体型及び合成誘導体が挙げられる。
【００７１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１２５３０号及びヨーロッパ特許出願第０４０１６０１２．９号の内容は、本明細書にその全体が援用される。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するために提示される。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、修飾及び改変がなされ得る。
実施例１
ＴＭＶに基づいたＲＮＡベクターの構築
アブラナ科植物感染性トバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈−ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８、２８７−２９８）のクローン化ｃＤＮＡを、モスクワ大学、ロシアのＡｔａｂｅｋｏｖ教授から得た。いくつかのクローニング工程で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するウイルスベクターを作製した。得られた構築体、ｐＩＣＨ８５４３（図６Ａ）は：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（ＡＣＴ２、参考文献 Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）由来の７８７ｂｐ断片、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するため、チミン５６０６がシトシンに変異している）の断片、「ｔａａ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｔ ｃｇａ ｇ」配列、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、及び最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを順番に含有する。断片全体を、ＣａｒｂR ｐＢＩＮ１９由来バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ１０のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだにクローン化した。ｐＩＣＨ８５４３で、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。３ｄｐｉで出現したＧＦＰ蛍光の焦点は、増殖してコンフルエントになった。驚くべきことに、ＧＦＰを発現する多くの独立した焦点によって検出されたように、浸潤領域の大部分の細胞が、ウイルス複製及び移行により、最終的にＧＦＰを発現したとしても、細胞のある画分のみがウイルス複製を開始した。３５Ｓプロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子を有するベンサミアナタバコ葉の浸潤は、浸潤領域のほとんど全ての細胞でＧＦＰ発現をもたらすため（図示していない）、限定要因は植物細胞へのＤＮＡ送達ではないことが明らかになった。
【００７３】
この観察を確認するため、ＭＰに変異を有するウイルスベクター構築体を作製した。ｐＩＣＨ１４８３３と呼ばれるこの構築体は、ｐＩＣＨ８５４３に類似するが、ＭＰ遺伝子における３８９ｂｐ、ＭＰに存在するＥｃｏＲＩ部位の上流、の欠失により異なっている。この欠失を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の配列を、配列番号１として付録に示す。完全なウイルス構築体（ＡＣＴ２プロモーターからＮｏｓターミネーターまで）を、ｐＢＩＮ１９由来ＫａｎR バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ４９のＴ−ＤＮＡの左の境界
と右の境界とのあいだにクローン化した。ＭＰにおける欠失のために、この構築体から産生されるレプリコンは細胞間を移行できないが、細胞内で自律複製可能である。ＭＰを、例えば、カリフラワー モザイクウイルス ３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターからトランスで提供すると、細胞間移行を回復させることができる。
【００７４】
ＭＰ発現構築体を作製するために、ＴＶＣＶ ＭＰ遺伝子をクローン化ＴＶＣＶ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ４８０２〜５６２８）からＰＣＲで増幅させ、３５Ｓプロモーターの制御下のバイナリーベクターにサブクローニングした。ｐＩＣＨ１０７４５（示していない）と呼ばれる得られた構築体と、ｐＩＣＨ１４８３３で、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、一晩培養物のさまざまな希釈物を、浸潤培地がアセトシリンゴンを欠失する以外はＥｎｇｌｉｓｈと同僚らによって記載されたようにして（１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１２、５９７−６０３）ベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。ｐＩＣＨ１４８３３単独の浸潤は、浸潤領域内で少量のＧＦＰ発現細胞を出現させた。浸潤領域から調製したプロトプラストを計数することによって、合計５００のプロトプラストのうち、わずか１〜３個のプロトプラスト（０．２〜０．６％）がＧＦＰを発現したことを発見した。ｐＩＣＨ１４８３３とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤は、各初期ＧＦＰ発現細胞から増殖したＧＦＰ発現焦点の形成をもたらした。最終的に、細胞間移行により、浸潤領域の大部分の細胞がＧＦＰを発現した（図７Ａ）。
【００７５】
トバモウイルスのようなＲＮＡウイルスは細胞質で複製するが、決して核には入らない。したがって、それらは、核のプレｍＲＮＡプロセシング装置に曝されない環境に展開した。その結果、核において人工ウイルス構築体から作製されたＲＮＡレプリコン転写物が、ＲＮＡプロセシング装置によって認識されず、適切にプロセシングされないことは驚くべきことではない。その上、ウイルスベクターに由来するＲＮＡレプリコンは非常に大きく、ＴＭＶに基づくレプリコンの場合はおよそ７，０００ヌクレオチドである。非常にわずかな植物遺伝子がそのように大きなサイズを有し、そのような遺伝子の大部分は、プレｍＲＮＡのプロセシングを容易にし、核から輸送され、プロセシングされた転写物の安定性を向上させるイントロンを含有する。したがって、本発明者らは、正確なプロセシング、及び正しくプロセシングされた転写物を核から細胞質へ輸送する効率を増加させるプレｍＲＮＡの修飾は、ウイルス複製を開始する細胞数の増加をもたらすであろうと仮定した。２つのアプローチを用いて、核へのＤＮＡ送達後、より効率的にウイルス複製を開始できる、ＲＮＡウイルスに基づいたベクターを作製することができることがわかった：（１） １つのアプローチは、望ましくないプロセシングイベント（潜在スプライス部位を用いた選択的スプライシングイベント、又は未成熟終止イベントなど）を誘導するかもしれない配列特徴の除去である；（２） 第２のアプローチは、適切にプロセシングされる転写物の量を増加させ、核から細胞質へのＲＮＡの輸送を改善し、及び／又は転写物の安定性を向上させるためのイントロンの付加である。
実施例２
イントロン様配列の除去は、細胞質におけるウイルスＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる
ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いてｐＩＣＨ４３５１に由来するＲＮＡレプリコンの配列を解析し、選択的スプライシングイベントを誘発するかもしれないいくつかのイントロン様配列特徴に気づいた。そのような特徴の１つは、ＲｄＲＰの初めにある０．６ｋｂのウリジンに富んだ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のヌクレオチド８２７〜１４６２に相当する）である（図２Ａ）。この領域は、ｐＩＣＨ１４８３３では、ＰＣＲで変異させた、５４ヌクレオチド置換によってオリジナル配列とは異なる配列に置換した（配列番号２として付録に示した配列；図３を参照されたい）。５２ヌクレオチドを置換し、Ｔに富んだ配列をよりＧＣに富んだ配列に置換した。ＲｄＲＰタンパク質配列が変化しないように、全てのヌクレオチド置換をサイレントにした。変異断片は、それぞれ推定の潜在スプライスドナー及びアクセプター部位を除去するために導入した２つのヌクレオチド置換も含有する（位置８２９及び１４５９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）。これらの変異の効果を試験するために、得られたクローンｐＩＣＨ１５４６６（図６Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５（トランスの移行タンパク質）とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させた。浸潤後８日に、ｐＩＣＨ１５４６６で浸潤させた領域においてＧＦＰ発現細胞数に１０倍の増加が観察された（ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、図７）。これは、ウイルスアンプリコンからのイントロン様配列の除去は、望ましくない選択的スプライシングイベントを妨げ、ウイルス複製をより効率的に開始させることを示唆する。ｐＩＣＨ１５４６６とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤は、非改変レプリコンと類似の速度で改変レプリコンの細胞間移行をもたらす。これは、ＲＮＡ配列の改変はウイルスベクターの細胞間移行に影響しなかったことを示している。
実施例３
ＭＰサブゲノムプロモーターにおけるイントロン様配列の除去
第２の潜在的に問題のある領域は、ＭＰサブゲノムプロモーターに相当する（図２Ｂ）。この領域は非常にＴに富んでおり、イントロン配列に非常に似ている。結果として、イントロン予測プログラムによって配列近傍に多くの潜在スプライスドナー及びアクセプター部位が予測される。残念なことに、サブゲノムプロモーター機能に影響を及ぼすことなくこの領域に修飾を容易に行うことができない。サブゲノムプロモーターに関し、全領域を完全に変異させ、ＭＰ発現の予測される喪失を補うためにトランスでＭＰを提供することにした。また、この構築体からＭＰは発現しないため、目的遺伝子の発現の駆動に必要なＣＰサブゲノムプロモーターを含有する３’配列以外は、ＭＰ配列の大部分を削除することにした。したがって、ｐＩＣＨ１４８３３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のｂｐ４５８４〜５４５５）中の３８３ｂｐ断片を２９７ｂｐの変異させた断片（配列番号３）で置換した。得られた構築体ｐＩＣＨ１５９００（図６Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させた。興味深いことに、ｐＩＣＨ１４８３３で浸潤させた葉領域と比較して、複製を開始する細胞数の莫大な増加を検出した。浸潤葉領域から調製したＧＦＰ発現プロトプラストを計数することによって、この修飾は、非改変ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、ウイルス複製を開始する細胞数を８０〜１００倍増加させると概算している。ｐＩＣＨ１５９００を、ｐＩＣＨ１０７４５（ｐ３５Ｓ−ＭＰ発現カセット）とともに共浸潤させたところ、細胞間移行によるＧＦＰ蛍光の増加を検出した。しかしながら、たとえ細胞間移行がなくとも、多くの細胞は既にＧＦＰを発現していたので、この増加は非常に限られたものであった。ｐＩＣＨ１５９００を含有するアグロバクテリウム懸濁液の１０００倍希釈（６００ｎｍの計算されたＯＤがおよそ０．００４に相当する）を、ｐＩＣＨ１０７４５を含有する５倍希釈したアグロバクテリウム懸濁液（６００ｎｍの計算されたＯＤがおよそ０．８に相当する）とともに共浸潤させたところ、ＧＦＰ発現焦点を分離させた。蛍光焦点は、ｐＩＣＨ１４８３３を用いて得られた対照焦点と同様に明るく、同じサイズであった。これは、ｐＩＣＨ１５９００の改変とＭＰのトランスでの送達とは、複製レベル、目的遺伝子の発現及び細胞間移行に関し、レプリコンの機能性を落とさないことを示している。同一構築体（ｐＩＣＨ１４９３３及びｐＩＣＨ１５９００、ｐＩＣＨ１０７４５とともにか又は伴わない）を、タバコ葉に共浸潤させた。ｐＩＣＨ１５９００における改変は、ベンサミアナタバコと同様に、複製を開始する細胞数を増加させた（ｐＩＣＨ１４８３３と比較して）。
実施例４
イントロンの付加は、細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
ウイルスプロレプリコン配列へのイントロンの付加が、複製開始頻度を上昇させるかどうかについて試験した。それぞれ３つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの２つの異なる領域に含有する、ｐＩＣＨ１５０２５及びｐＩＣＨ１５０３４の２つの構築体を作製した（図６Ａ）。イントロンをＲｄＲＰの中央に含有するように、ｐＩＣＨ１５０２５をデザインした。一方、ｐＩＣＨ１５０３４は、イントロンを、ＭＰサブゲノムプロモーターの上流である、ＲｄＲＰの３’端に含有する。イントロンをＰＣＲでシロイヌナズナ ゲノムＤＮＡから増幅させ、所定のイントロン／エクソン接合部位に重複するプライマーを用いてＰＣＲでウイルス配列に組み込んだ。イントロン含有断片を、ＡｖａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（付録の配列番号４）として、ｐＩＣＨ１４８３３にサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０２５を作製し、又はＰｓｔＩ−ＮｃｏＩ断片（付録の配列番号５）としてサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０３４を作製した。
【００７６】
２つの構築体を、ベンサミアナタバコ葉に別々にアグロ浸潤させ、ｐＩＣＨ１４８３３と比較した。２つの構築体は、ウイルス複製を開始する細胞数を顕著に増加させた（図７Ａ）。この増加は、ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、５０倍の改善であると概算した。また、２つの構築体をＭＰ発現クローンと共浸潤させ、細胞間移行がイントロンのないクローンと同一であることを発見した。また、２つの構築体をタバコで試験し、ベンサミアナタバコと同様の改善を観察した（図７Ｂ）。
【００７７】
６イントロン全てを含有する第３のクローンｐＩＣＨ１５４９９を作製した（図５、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ）。この構築体をベンサミアナタバコ及びタバコで試験した。この構築体は、３イントロンを有するそれぞれ個々の構築体よりも効率的であったが、改善は付加的ではなかった。
実施例５
イントロンの付加及びイントロン様配列の除去は、細胞質において機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
１つの構築体でイントロン様の特徴を除去し、追加のイントロンを付加することにより、２つのタイプの改変がウイルス複製の開始の向上に寄与できることを示した。変異したＭＰサブゲノムプロモーター領域を含有するｐＩＣＨ１５４９９の６イントロンをｐＩＣＨ１５９００へサブクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１５８６０（図６Ｂ）を、ベンサミアナタバコ葉に浸潤させ、およそ５０％〜９０％のＧＦＰを発現する全てのプロトプラストの範囲内でいずれの親クローンよりも顕著によく働くことを見出した（図７）。最高性能の構築体は、イントロンをＲｄＲＰ領域、及び改変ＭＰサブゲノムプロモーター領域に含有する（ｐＩＣＨ１６１９１、図７Ｃ）。全く改変していないクローンと比較すると、これは、８０〜３００倍の増加を示した。また、この構築体をＭＰ発現構築体（ｐＩＣＨ１０７４５）とともに共浸潤させ、改変が細胞間移行又は複製を傷つけないことを見出した。
実施例６
全てのイントロン付加が、細胞質において機能性ＲＮＡレプリコンの出現頻度を上昇させるわけではない。
【００７８】
２つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの初めに挿入し、クローンｐＩＣＨ１５４７７を得た（付録にこの領域の配列を配列番号６として示す）。この領域の配列は、イントロンの付加前に既に非常に「エクソン様」にみえる（例えば潜在スプライス部位をもたずにＧＣに富んでいる）。この構築体でウイルス複製開始の改善はみられなかった。したがって、全てのイントロン付加がウイルスベクターの改善をもたらすわけではないであろう。イントロンの挿入又は変異のために選択された位置は重要なパラメータであるようである。例えば、ＭＰサブゲノムプロモーターのように問題のある構造近傍の領域で作製される全てのイントロンの挿入又はヌクレオチド置換は、大きく改善されたが、既に「エクソン様」の配列へのイントロンの挿入は改善されなかった。
実施例７
ＭＰ配列へのイントロンの挿入はウイルスレプリコン形成頻度を上昇させる
初めに、制限酵素ＡｖｒＩＩによる消化、フィリング及び再連結によって、ＭＰにフレームシフトを作製した。次に、２つのイントロンをＭＰに挿入した。得られたクローンｐＩＣＨ１６４２２（図６Ｂ）をベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。機能性ウイルスレプリコンを含有する細胞数に約１００倍の増加が検出された。
実施例８
ＭＰ含有ベクターへのイントロンの挿入は、自律機能性クローンのウイルス複製の開始頻度を上昇させる
ｐＩＣＨ１５４９９からＫｐｎＩ−ＥｃｏＲｌＩ断片をｐＩＣＨ８５４３へサブクローニングした。得られたクローン１６７００（図６Ｂ）は、ＲｄＲＰに６イントロンを有する完全なウイルスベクターを含有した。このクローンをベンサミアナタバコ葉に浸潤させ、効率的に複製を開始させた。また、このクローンは、トランスでのＭＰの付加を要することなく細胞間移行可能であった。
実施例９
染色体に安定に組込まれた不活性レプリコンの活性化
また、イントロン含有ウイルスベクター構築体をトランスジェニック植物に安定に形質転換することが可能である。植物生長を阻害する有害なウイルス複製を避けるために、不活性クローン（プロレプリコン）を、アンチセンス方向で存在するベクターの一部を有することによって作製することができる（図８）。反転断片の先端での組換え部位及びイントロン配列の組込みは、適切なリコンビナーゼを用いることによって、この断片を正しい方向に「反転」させることができる。組換え部位はレプリコンからスプライシングによって完全に排除されるであろう。プロレプリコン中のイントロンは、組換え及び転写後、効率的な複製開始を可能にする。１つの特定の例では、組換え部位は目的遺伝子内でプロレプリコンの下流に位置する。このような立体配置は、組み換え前の遺伝子発現を妨げる。組換えが、ＲｄＲＰ内及びプロモーターの上流のような、プロレプリコンの他の領域に位置する他の立体配置が考えられる。組換え部位のイントロン配列は、組換えをレプリコンから完全に除去することを可能にする有益性を有するが、先に記載したように、ウイルス複製効率も上昇させる。
【００７９】
反転部分は、図１２に示すようにベクターの３’端、中央、又は５’端に位置することができる（図８に示すように）。２つの構築体ｐＩＣＨ１２６９１（１イントロンのみを組換え部位に含有する）及び追加の６イントロンをＲｄＲＰに含有するｐＩＣＨ１６８８８を作製した。ｐＩＣＨ１２６９１の完全なＴ−ＤＮＡ領域の配列を、配列番号７に示す。ｐＩＣＨ１６８８８はｐＨ１２６９１に類似するが、更に、ｐＩＣＨ１５０２５に記載の３つのイントロン（配列番号４）、及びｐＩＣＨ１５０３４に記載の３つのイントロン（配列番号５）を含有し、それぞれこれらの構築体と同一位置に挿入されている。ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８を、以下のように、カナマイシン選択を用いてベンサミアナタバコに安定に形質転換した。構築体ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１）に別々に固定し、微細な改変を伴うが、Ｈｏｒｓｈ及び同僚らによって記載されたようにして（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）、タバコ植物のアグロバクテリウム介在葉ディスク形質転換に別々に用いた。１ｍｇ／Ｌ α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．５ｍｇ／Ｌ ６−ベンズアミノプリン（ＢＡＰ）、２００μＭ アセトシリンゴン（ＡＳ）、ｐＨ５．５〜５．６を添加したムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）基本培地中のアグロバクテリウム懸濁液内で葉ディスクを３０分間共培養した。次に、過剰な液体を除去するために葉ディスクを滅菌ワットマン（登録商標）ろ紙上におき、固体共培養培地（上記のように添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）に移し、暗所において２２〜２３℃で４８時間培養した。共培養後、葉ディスクを選択再生培地（１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ５．７〜５．８）、３００ｍｇ／Ｌセファタキシム、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）においた。再生培地で３〜６週間の培養後、カナマイシン耐性植物細胞から再生した苗条を発根選択培地（３００ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２００ｍｇ／Ｌ ｔｉｍｅｎｔｉｎ（アグロバクテリウムの排除を容易にするため）、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、ｐＨ５．７〜５．８を添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）に移した。再生させた形質転換体を温室に移し、インテグラーゼ発現構築体（ｐＩＣＨ１０８８１：アクチン２プロモーター − φＣ３１インテグラーゼ；又はｐＩＣＨ１４３１３：トウモロコシ転位因子Ｓｐｍプロモーター − φＣ３１インテグラーゼ）を含有するアグロバクテリウム懸濁液を針のないシリンジで浸潤させることによって試験した。インテグラーゼ構築体で浸潤後、ｐＩＣＨ１２６９１の形質転換体よりもｐＩＣＨ１６８８８形質転換体のほうがウイルス複製増殖巣を多く示した（図１３）。更に、ｐＩＣＨ１６８８８の形質転換体は、浸潤あたり、より多くのウイルス開始増殖巣を示した。
実施例１０
植物ウイルスＲＮＡ配列は、潜在的不安定領域を含有する
選択した植物ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを、十分に特徴付けられた植物遺伝子（ＡｔＤＭＣ１）のものとともに、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析した。図９に示すＡｔＤＭＣ１のＲＮＡプロファイルは、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡの配列を比較することによって先に同定した１４イントロン（丸で囲んでいる）の存在を明確に反映している。２つの植物ウイルスのＲＮＡプロファイルは、それらを植物核環境におくとＲＮＡの安定性に問題を引き起こし得る領域を有することは明らかである（図１０、１１を参照されたい）。ブロムモザイクウイルス、ＴＭＶの異なる株、そして他の多くのもののような植物ＲＮＡウイルスのいくつかの他の代表的なもののＲＮＡプロファイルについて解析した（示していない）。それらの全ては、ＤＮＡ前駆体として植物細胞に送達された場合、植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン形成の効率を落としかねない、潜在的に問題のある領域を有している。
実施例１１
他の種で最適化ベクターが作用する
変異させた領域（ｐＩＣＨ１５４６６に記載）及び１６イントロン（ｐＩＣＨ１５８６０の６イントロン、ｐＩＣＨ１６４２２の２イントロン、及び追加の８イントロンを含む）を含有する完全に最適化した構築体を作製した。要約すれば、この構築体は以下の位置に挿入されたイントロンを含有する（ＴＶＣＶ配列に対して示す、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７）：ヌクレオチド２０９、ヌクレオチド８２８、ヌクレオチド１１６９、ヌクレオチド１３７８、ヌクレオチド１６２２、ヌクレオチド１８４４、ヌクレオチド２２２８、ヌクレオチド２５８９、ヌクレオチド２９４４、ヌクレオチド３１４３、ヌクレオチド３３８１、ヌクレオチド３６７２、ヌクレオチド３８５０、ヌクレオチド４２９９、ヌクレオチド５２８７、ヌクレオチド５４４４。
【００８０】
サトウダイコンでこの構築体の発現を試験した。以下に記載するように、完全な植物の浸潤を実施した。５０μｇ／ｍｌリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシン（バイナリーベクターについて選択）を含有する３００ｍｌのＬＢにｐＩＣＨ１８７１１を有するアグロバクテリウを接種し、飽和するまで増殖させた。細菌を４８００ｇで１０分間沈殿させ、３Ｌの浸潤バッファー（１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4）に再懸濁し、飽和アグロバクテリウム培養物を１０倍希釈した。浸潤溶液を含有するビーカーを、溶液にさっと浸した植物の地上部とともに乾燥器（直径３０ｍｍ）の中においた。ＫＮＦ Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（フライブルグ、ドイツ）製のＰＭ１６７６３−８６０．３型ポンプを用いて２分間真空を施し、０．５〜０．９ｂａｒに達した。植物を標準条件の温室に戻した。
【００８１】
ＧＦＰ発現はｐＩＣＨ１８７１１で浸潤させた植物の葉において高かった（図１４）。逆に、イントロンを含有しないｐＩＣＨ１６７００で浸潤させた対照植物では、わずか数個の小さなスポットのみが見られたであろう（図示していない）。
【００８２】
付録
配列番号１（ｐＩＣＨ１４８３３のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片）：
【００８３】
【化１】
【００８４】
配列番号２（ｐＩＣＨ１５４６６の部分）：
【００８５】
【化２】
【００８６】
配列番号３（ｐＩＣＨ１５９００の部分）：
【００８７】
【化３】
【００８８】
配列番号４（ｐＩＣＨ１５０２５の部分）：（下線を付したイタリック体で示した３イントロンを含有する）
【００８９】
【化４】
【００９０】
配列番号５（ｐＩＣＨ１５０３４の部分）：（下線を付したイタリック体で示した３イントロンを含有する）
【００９１】
【化５】
【００９２】
配列番号６（ｐＩＣＨ１５４７７の断片、下線を付したイタリック体で示した１イントロンを含有する）
【００９３】
【化６】
【００９４】
配列番号７：ｐＩＣＨ１２６９１のＴ−ＤＮＡ領域、ここで、配列セグメントは以下の機能を有している：
ヌクレオチド１〜２５：左の境界（反対鎖）、
ヌクレオチド８６〜１４８４：Ｎｏｓプロモーター−ＮＰＴＩＩコード配列−Ｎｏｓターミネーター（反対鎖上）、
ヌクレオチド１５０６〜１５５２：ＡｔｔＰ 組換え部位（反対鎖）、
ヌクレオチド１５５３〜１５９９：イントロン５’部分（反対鎖）、
ヌクレオチド１６００〜２０２２：ＴＶＣＶ ＲｄＲＰ ５’端（反対鎖）、
ヌクレオチド２０２３〜２８０９：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（反対鎖）、
ヌクレオチド２８３６〜２９０３：ＡｔｔＢ組換え部位、
ヌクレオチド２９０４〜２９５９：イントロン３’部分、
ヌクレオチド２９６０〜７９９１：ＴＶＣＶ ＲｄＲＰ ３’部分−ＭＰ５’部分、
ヌクレオチド７９９２〜８１６８：ｃｒ−ＴＭＶ ＭＰ ３’端、
ヌクレオチド８２４８〜８９６７：ＧＦＰコード配列、
ヌクレオチド８９６１〜９２１５：ｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳領域、
ヌクレオチド９２３４〜９４９７：Ｎｏｓターミネーター、
ヌクレオチド９５４９〜９４７３：Ｔ−ＤＮＡ右境界（反対鎖）：
【００９５】
【化７−１】
【００９６】
【化７−２】
【００９７】
【化７−３】
【００９８】
本発明を、好ましい態様を参照して具体的に示して説明するが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形式的に及び細部に種々の改変がなされ得ることが当業者には理解されるであろう。
［態様１］
転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する、安定に形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物であって、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
（ｉｉ） ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる、前記植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様２］
機能保存的な相違が、異種ＤＮＡ転写物の高Ａ／Ｕ含量によるＲＮＡレプリコン形成への細胞核における有害効果の軽減を含む、請求項１に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様３］
植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置が、高Ａ／Ｕ含量の位置である、請求項１又は２に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様４］
機能保存的な相違が、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列の高Ａ／Ｕ含量の低下を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様５］
高Ａ／Ｕ含量が、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換によって低下する、請求項４に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様６］
機能保存的な相違が、Ａ／Ｕに富んだ領域に隣接した潜在スプライシング部位の除去を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様７］
機能保存的な相違が、１以上の核イントロン又はレプリコン機能に関する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍若しくはその中で核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様８］
核イントロンを形成可能な配列が、部位特異的組換えにより核イントロンを形成可能である、請求項７に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様９］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする１以上のセグメントを有し、それにより、ＲＮＡレプリコンの形成がセグメントの再構成を必要とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１０］
植物の全ての細胞核が異種ＤＮＡを含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１１］
異種ＤＮＡが細胞核の染色体に含有される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１２］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の全ての細胞が、核染色体に異種ＤＮＡを含有する、請求項１１に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１３］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、目的配列の高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量の位置に、目的配列で相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる機能保存的な相違を更に含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１４］
植物ＲＮＡウイルスがトバモウイルスであり、好ましくはタバコモザイクウイルスである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１５］
機能保存的な相違が、機能サイレントである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
［態様１６］
植物の部分が種子である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の植物の部分。
［態様１７］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：（ａ） 転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、ここで、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）目的配列を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる；及び
（ｂ） 目的配列を発現させること、
を含む前記方法。
［態様１８］
異種ＤＮＡが核染色体に安定に組み込まれている、請求項１７に記載の方法。
［態様１９］
目的配列が目的タンパク質をコードし、工程（ｂ）は目的タンパク質の発現を引き起こすこと含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
［態様２０］
目的タンパク質の発現が、植物、植物の部分、又は植物細胞において所望の産物の産生をもたらす、請求項１９に記載の方法。
［態様２１］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする２以上のセグメントを有し、工程（ｂ）は、ＲＮＡレプリコン形成され得るようなセグメントの再構成を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
［態様２２］
セグメントの１つが組換え部位に隣接し、再構成が、リコンビナーゼによる部位特異的組換えを含む、請求項２１に記載の方法。
［態様２３］
工程（ｂ）が、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に部位特異的リコンビナーゼを提供することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
［態様２４］
部位特異的リコンビナーゼが、リコンビナーゼをコードするベクターの一過性トランスフェクションによって提供される、請求項２３に記載の方法。
［態様２５］
部位特異的リコンビナーゼが、調節されたプロモーターの制御下において核染色体に安定にコードされ、工程（ｂ）が、調節されたプロモーターの誘導を含む、請求項２３に記載の方法。
［態様２６］
リコンビナーゼが、ＣＲＥ、フリッパーゼ、リゾルベース、ＦＬＰ、ＳＳＶ１にコードされるインテグラーゼ、Ｒリコンビナーゼ、φＣ３１インテグラーゼ、Ｉｎｔｉインテグラーゼ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、及びＰ４ リコンビナーゼ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｃｉｎリコンビナーゼ、大腸菌ＸｅｒＣ及びＸｅｒＤリコンビナーゼ、バチルス・チューリンゲンシス リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
［態様２７］
リコンビナーゼが、植物細胞内でリコンビナーゼの非機能性断片から親和性相互作用によって形成される、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
［態様２８］
リコンビナーゼが、植物細胞内でリコンビナーゼの非機能性断片からインテイン介在タンパク質トランススプライシングによって形成される、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
［態様２９］
異種ＤＮＡ又はＲＮＡレプリコンをコードする配列が、調節された転写プロモーターに連結されている、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
［態様３０］
調節されたプロモーターが、化学的に誘導性のプロモーターである、請求項２９に記載の方法。
［態様３１］
工程（ａ）における準備が、異種ＤＮＡを含有する核酸分子による植物、植物の部分、又は植物細胞の形質転換を含む、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
［態様３２］
工程（ａ）における準備が、異種 ＤＮＡを含有する核酸分子による植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞の一過性形質転換を含む、請求項１７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
［態様３３］
工程（ａ）がアグロバクテリウム介在形質転換によって行われる、請求項１７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
［態様３４］
工程（ａ）が、異種ＤＮＡで安定に形質転換されたトランスジェニック植物の作製を含む、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
［態様３５］
請求項１で定義したとおりの異種ＤＮＡで核染色体を安定に形質転換したトランスジェニック植物を作製する方法であって、植物、又は植物の部分を異種ＤＮＡを含有するベクターで形質転換し、核染色体に異種ＤＮＡを含有する植物の組織を選択し、そしてトランスジェニック植物を組織から再生することを含む、前記方法。
［態様３６］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を一過性に発現させる方法であって：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡで形質転換させることを含み、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、
（ｉｉ）目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる、前記方法。
［態様３７］
形質転換が、異種ＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡによるアグロバクテリウム介在一過性形質転換によって実施される、請求項３６に記載の方法。
［態様３８］
形質転換が、タバコ植物の茎及び／又は全ての葉のアグロ浸潤によって実施される、請求項３６又は３７に記載の方法。
［態様３９］
機能保存的な相違が、異種ＤＮＡ転写物の高Ａ／Ｕ含量によるＲＮＡレプリコン形成への細胞核における有害効果の軽減を含む、請求項１７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
［態様４０］
植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置が高Ａ／Ｕ含量の位置である、請求項１７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
［態様４１］
機能保存的な相違が、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列における高Ａ／Ｕ含量の低下を含む、請求項１７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
［態様４２］
高Ａ／Ｕ含量が、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換によって低下する、請求項４１に記載の方法。
［態様４３］
機能保存的な相違が、Ａ／Ｕに富んだ領域に隣接した潜在スプライシング部位の除去を含む、請求項１７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
［態様４４］
機能保存的な相違が、１以上の核イントロン又はレプリコン機能に関する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍若しくはその中で核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む、請求項１７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
［態様４５］
核イントロンを形成可能な配列が、部位特異的組換えによって核イントロンを形成可能である、請求項４４に記載の方法。
［態様４６］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、ＲＮＡレプリコンをいっしょにコードする１以上のセグメントを有し、それにより、ＲＮＡレプリコンの形成がセグメントの再構成を必要とする、請求項１７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
［態様４７］
全ての細胞核が異種ＤＮＡを含有する、請求項１７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
［態様４８］
ＲＮＡレプリコンをコードする配列が、目的配列の高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量の位置に、機能保存的な相違を更に含有する、請求項１７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
［態様４９］
選択された位置が、
（Ａ）植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、機能保存的な相違を欠失している以外は請求項１７で定義した通りの異種ＤＮＡで形質転換し、
（Ｂ）植物、植物の部分、又は植物細胞培養物における工程（Ａ）の異種ＤＮＡに由来するＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施してＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を決定し、そして
（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列において、望ましくないスプライシングイベントの位置として選択された位置を同定すること、
によって同定される、請求項１７〜４８のいずれか１項に記載の方法。
［態様５０］
植物ＲＮＡウイルスがトバモウイルスであり、好ましくはタバコモザイクウイルである
、請求項１７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
［態様５１］
機能保存的な相違が機能サイレントである、請求項１７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
［態様５２］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物が２以上の異なる異種ＤＮＡを含有する方法であって、２つの異なる目的タンパク質が共発現する２つの異なるＲＮＡレプリコンの形成を含む、請求項１７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
［態様５３］
ＲＮＡレプリコンが、ＲＮＡレプリコンが由来するＲＮＡウイルスの天然宿主植物以外の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物においてレプリコン形成頻度の上昇を発揮可能である、請求項１７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
［態様５４］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に、それぞれ目的配列を有する２つの異なる異種ＤＮＡが提供され、それにより、２つの異なる目的配列が発現する、請求項１７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５５］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の形質転換が、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物にアグロバクテリウム懸濁液を浸透させることによって行われ、懸濁液の濃度は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当し、それにより、計算された光学密度は、それぞれ、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液の少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、請求項１７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
［態様５６］
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡをＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウムの懸濁液で形質転換することを含み、レプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ウイルスの配列に由来する、レプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）目的配列、を含有し、それにより、アグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、それにより、計算された光学密度は、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液のそれぞれ少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、前記方法。
［態様５７］
転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡ配列を含有する核酸分子であって、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、（ｉ）植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列、（ｉｉ）ＲＮＡレプリコンから発現されるべき目的配列、を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は植物ＲＮＡウイルスの配列に相当し、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、核酸分子を植物細胞又は植物に導入した場合に相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させることが可能である、前記核酸分子。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡをＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウムの懸濁液で形質転換することを含み、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスの配列に由来する、レプリコンのレプリコン機能に関する配列、
（ｉｉ）目的配列、
を含有し、それにより、アグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、それにより、計算された光学密度は、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液のそれぞれ少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、前記方法。
【請求項１】
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって：植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なレプリコンをコードする配列を有する異種ＤＮＡをＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウムの懸濁液で形質転換することを含み、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスの配列に由来する、レプリコンのレプリコン機能に関する配列、
（ｉｉ）目的配列、
を含有し、それにより、アグロバクテリウム懸濁液は、計算された６００ｎｍの光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、それにより、計算された光学密度は、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液のそれぞれ少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、前記方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−２４５９１（Ｐ２０１１−２４５９１Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１１３１９（Ｐ２０１０−２１１３１９）
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【分割の表示】特願２００６−５３８７８８（Ｐ２００６−５３８７８８）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（５０７２５４９９７）アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【分割の表示】特願２００６−５３８７８８（Ｐ２００６−５３８７８８）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（５０７２５４９９７）アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
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