ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスにおけるプレＢ細胞増殖及びリンパ芽球性白血病／高悪性度リンパ腫
マウスのようなトランスジェニック非ヒト動物は、該動物のＢ細胞における発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を有している核酸構築物を含むゲノムを有し、該転写調節配列はｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている。リンパ増殖性状態を治療すること及び予防することにおける剤の治療効力を試験する方法は、トランスジェニック非ヒト動物に対する該剤の効果（一つ又は複数）を評価することを含んでいる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府援助
本発明は、全体が又は部分的に、米国政府からの基金により支援された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
急性白血病は、骨髄及び血液中の芽球細胞と称される未成熟無機能性細胞の蓄積を生じる、骨髄及び血液の急速に進行する悪性疾患である。骨髄中での芽球細胞の蓄積は、正常血液細胞の発生を阻止する。その結果、赤血球、白血球及び血小板が十分な数で産生されない。該疾患が骨髄リンパ球前駆細胞で起こる場合、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を生じ、該疾患が骨髄系前駆細胞で起こる場合、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を生じる。
【０００３】
ＡＬＬは、骨髄リンパ球の悪性形質転換により開始される急速進行性癌である。ＡＬＬは、全年齢群で毎年３、０００の新規ケースを有する、小児白血病の最も一般的なタイプである。形質転換した（悪性になった）細胞は増殖し、そして白血病性リンパ芽球として骨髄に蓄積する。リンパ芽球は骨髄での正常血液細胞形成を阻止し、赤血球、白血球及び血小板の不十分な産生を生じる。
【０００４】
侵攻性リンパ腫としても知られている高悪性度リンパ腫には、もし治療されないならば比較的急速に進行する、リンパ腫のいくつかのサブタイプが含まれる。これらのサブタイプには、例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫及び小型非切れ込み核細胞性リンパ腫が含まれる。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と比較し、高悪性度リンパ腫はより侵襲的に挙動し、より強力な化学療法を必要とし、及び小児においてより頻繁に発生する。急速に分裂する細胞はより抗癌剤に感受性であるので、及び若年の患者は通常他の健康問題がないので、これらのリンパ腫のいくつかは、療法に対して劇的な応答を示す。急性リンパ芽球性白血病及び高悪性度リンパ腫は、小児において最も一般的な白血病及びリンパ腫である。これらの疾患は、大部分についてポリクローナルであり、悪性病変を誘発するにはわずかな遺伝子変化のみで十分であることを示唆している。
【０００５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的との相補性の程度に従って、標的とされたｍＲＮＡに結合することにより、及びそれらの翻訳を阻止することによるか又はそれらの分解を開始させることにより、転写レベル後に重要な調節的役割を果たす、大量の小さなＲＮＡの新規クラスを意味する。１９９３年のカエノルハブディテキス・エレガンスでのそれらの発見以来（Lee, R. et al., Cell 75:843-854 (1993)）、細胞増殖及び分化から脂質代謝の範囲に及ぶ、非常に多様な役割を有するタンパク質の大きなアレイの転写後調節に、これらの小さな分子を結びつける多数の報告がある（Nairz, K., et al., Dev. Biol. 291:314-324 (2006); Chen, J.F., et al, Nat. Genet. 33:228-233 (2006); Naguibneva, L, et al, Nat. Cell Biol. 8:278-284 (2006); Esau, C, et al, Cell Metab. 3:87-98 (2006）;及び Gauthier, B.R., et al, Nat. Med. 12:36-18 (2006)）。
【０００６】
ヒト及びマウスにおける造血系のｍｉＲＮＡプロファイリングは、ｍｉＲＮＡが血球発生の過程で差次的に発現されることを示した（Chen, C.Z., et al., Science 303:83-86 (2004); Chen, C.Z., et al., Semin. Immunol. 77:155-165 (2005）及び Ramkissoon, S.H., et al., Leuk. Res. 30:643-647 (2006)）。我々は、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）の６８％の場合において、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１が除去又は下方制御されていること（Calin, G.A., et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 99: 15524-15529 (2002）及び Calin, G.A., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:11755-11760 (2004)）、及びｍｉＲＮＡ遺伝子がしばしば脆弱部及び癌に関与するゲノム領域に位置していること（Calin, G.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2999-3004 (2004)）を示した。ｍｉＲ１５５及びＢＩＣ（その宿主遺伝子）転写体が、ヒトＢ細胞リンパ腫、特に、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Eis, P.S., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:3627-3632 (2005))、ホジキンリンパ腫（Kluvier, J., et al., J. Pathol. 207:243-249 (2006)）及び特定のタイプのバーキットリンパ腫（潜伏型ＩＩＩエプスタイン・バーウイルス陽性バーキットリンパ腫) (Kluvier, J., et al., Genes Chromosomes Cancer 45:147-153 (2006)）で蓄積されていることが示されている。
【０００７】
現在、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫）のようなリンパ球増殖性障害の治療のための治療可能性を有する候補剤を、スクリーニングする又は同定するために使用することができる動物を作製する緊急の必要性がある。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、その発現がＢ細胞を標的とし（例えば、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーを使用して）、最初に前白血病性プレＢ細胞増殖を示し（脾臓及び骨髄で明白）、及び後でＢ細胞悪性腫瘍を発生させる、ｍｉＲ１５５導入遺伝子を運んでいるトランスジェニックマウスの発見に基づいている。ｍｉＲ１５５を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ヒトリンパ球増殖性疾患に似ているリンパ球増殖性疾患を発生し、それ故、これらの疾患の開始及び／又は進行におけるｍｉＲ１５５を強く示唆している。Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスは、ヒトにおけるＢ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病、高悪性度リンパ腫）のようなリンパ球増殖性疾患の異なった形態を治療するための新規治療アプローチを考案するために有用である。
【０００９】
従って、一つの側面において、リンパ球増殖性障害のための新規動物モデルが本明細書において提供される。具体的には、一つの側面に従うと、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）及び新生物）のための動物モデルが提供される。
【００１０】
一つの態様において、そのゲノムが、ｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）が本明細書において提供される。特定の態様において、該ｍｉＲｌ５５遺伝子産物は、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、該ｍｉＲｌ５５遺伝子産物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる。さらに別の態様において、該ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１１】
一つの態様に従うと、該少なくとも一つの転写調節配列は、動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができるいずれかの配列であり得る。一つの態様において、該転写調節配列は、ＶＨプロモーター（例えば、マウス由来のＶＨプロモーター）を含んでなる。別の態様において、該転写調節配列は、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー（例えば、マウス由来のＩｇ重鎖Ｅμエンハンサー）を含んでなる。関連する態様において、該核酸構築物は、βグロビン遺伝子（例えば、ヒト又は他の哺乳類種由来のβグロビン遺伝子）の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含んでなる。
【００１２】
そのゲノムが、配列番号１及び／又は配列番号２を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、ＶＨプロモーター及びＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる核酸構築物を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物も本明細書において提供される。特定の態様において、該トランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、ＶＨプロモーター及びＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる核酸構築物を含んでなる。
【００１３】
特定の態様において、該トランスジェニック非ヒト動物は、適した対照動物におけるＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の集団と比較して、拡大したこの集団を、脾臓、骨髄又は脾臓及び骨髄の両方に有する。関連する態様において、該トランスジェニック非ヒト動物はリンパ球増殖性状態を示す。特定の態様において、該リンパ球増殖性状態はＢ細胞悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病；Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞新生物）である。さらなる態様において、該Ｂ細胞悪性腫瘍はヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す。さらに別の態様において、該リンパ球増殖性状態は前白血病の状態（例えば、プレＢ細胞増殖）である。追加の態様において、該トランスジェニック非ヒト動物は腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症、又はそれらの組み合わせを示す。
【００１４】
対象のリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおける剤の治療効力を試験する方法も本明細書において提供される。一つの態様に従うと、該方法は、そのゲノムが動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列（例えば、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー、それらの組み合わせ）を含んでなる核酸構築物を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）に該剤を投与することを含んでなり、該転写調節配列は配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に、機能可能なように連結されている。特定の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１５】
トランスジェニック動物に該剤を投与した後、トランスジェニック動物におけるリンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を、該剤が投与されていない同一ゲノムタイプの対照動物のそれらと比較する。もし、対照動物と比較して、剤が投与されたトランスジェニック動物において一つ又はそれより多くのリンパ球増殖性状態の症状及び／又は徴候が抑制され、予防され及び／又は軽減されているならば、該剤はリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおいて治療効力を有すると考えられる。特定の態様において、該リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候は、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００１６】
別の態様において、剤が対象におけるリンパ球増殖性状態に影響するかどうかを決定する方法が本明細書において提供される（例えば、リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの徴候及び／又は症状の検出能及び／又は出現比の相違に影響すること）。該方法は、本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物に剤を投与すること、そしてトランスジェニック動物における一つ又はそれより多くのリンパ球増殖性状態の症状及び／又は徴候を、同一ゲノムタイプの対照動物のそれらと比較することを含んでなり、ここで該対照動物には該剤は投与されていない。該対照動物と比較し、該トランスジェニック動物における検出能及び／又は出現比の相違は、該剤がリンパ球増殖性状態の影響していることを示す。
【００１７】
一つの態様において、リンパ球増殖性状態はＢ細胞悪性腫瘍である。特定の態様において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）、Ｂ細胞新生物及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。Ｂ細胞悪性腫瘍は、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はその両方の特質を示すことができる。別の態様において、リンパ球増殖性状態は、プレＢ細胞増殖により特徴づけられる状態のような前白血病状態である。
【００１８】
本発明のこれらならびに他の重要な側面は、以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の特定の態様の説明が以下に示される。
本明細書に例示され及び記述されるように、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ１５５を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ヒトの急性リンパ芽球性白血病及び高悪性度リンパ腫に似ているリンパ球増殖性疾患を発症する。本明細書で提供される結果は、ｍｉＲ１５５及び／又は他の遺伝子（単数又は複数）（例えば、癌で活性化される遺伝子（例えば、シグナル伝達遺伝子））の発癌性発現が、Ｂ細胞悪性腫瘍の開始及び／又は進行に関与していることを強く示している。従って、Ｂ細胞悪性腫瘍及び他のリンパ球増殖性状態の開始及び進行の根底にある機構を調べるために使用することができる動物モデルが本明細書で提供される。この動物モデルは、リンパ球増殖性障害を治療する又は予防することにおいて有用である新規治療剤の同定、開発及び試験にも使用することができる。
【００２０】
一つの態様において、そのゲノムが、ｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、Ｂ細胞への発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物又は導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック動物が本明細書において提供され、ここで該転写調節配列はｍｉＲｌ５５遺伝子産物をコードする核酸配列に機能可能なように連結されている。用語「導入遺伝子」とは、本明細書に記載されている方法によるようなヒト介入により、非ヒト動物の一つ又はそれより多くの細胞内に導入された核酸配列を指す。導入された遺伝子情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来性、特定の個々のレシピエントについてのみ外来性であるか、又は遺伝子情報はレシピエントによりすでにプロセシングされていることができる。後者の場合において、導入された遺伝子情報は、天然の内在性遺伝子と比較して差次的に発現されてもよい。
【００２１】
該トランスジェニック非ヒト動物は、ｍｉＲ１５５遺伝子産物を発現することができる核酸構築物／導入遺伝子を含んでなるゲノムを有する。ｍｉＲ遺伝子産物（本明細書においてマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ及びｍｉＲＮＡとも称される）はタンパク質に翻訳されないので、用語「ｍｉＲ遺伝子産物」はタンパク質を含んでいない。プロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写体は「ｍｉＲ前駆体」とも称され、そして典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写体を含んでなる。該ｍｉＲ前駆体は、活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子にプロセシングし得る（例えば、天然のプロセシング経路（例えば、無傷の細胞又は細胞溶解物を使用して）を介して、又は合成プロセシング経路（例えば、単離されたダイサー、アルゴノート又はＲＮＡｓｅ ＩＩＩ（例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ）のような単離されたプロセシング酵素を使用して）により）。この活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、「プロセシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写物又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも称される。本明細書においてマイクロＲＮＡが名称で呼ばれる場合、該名称は、特に示されない限り、前駆体及び成熟形の両方に対応する。
【００２２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ１５５遺伝子産物」とは、限定されるわけではないが、マウス（ハツカネズミ）からのｍｉＲ１５５遺伝子のような、ｍｉＲ１５５遺伝子からのプロセシングされていない（例えば、前駆体）又はプロセシングされた（例えば、成熟）ＲＮＡ転写体を指す。マウスからの前駆体ｍｉＲ１５５遺伝子産物はヌクレオチド配列：
5’-CUGUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUUUUGGCCUCUGACUGACUCCUACCUGUUAGCAUUAACAG-3’ （配列番号１）により表され、一方、プロセシングされた又は成熟マウスｍｉＲ１５５遺伝子産物はヌクレオチド配列：
5’- UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGG-3’（配列番号２；GenBank 寄託番号AJ459767）により表される。
【００２３】
特定の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号１及び／又は配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。特定の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号１のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号２のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２４】
二つの配列の実際の比較は、例えば、数学アルゴリズムを使用した公知の方法により達成し得る。こうした数学アルゴリズムの好ましい非制限例は、Karlin et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 90:5873-5877(1993)) 、に記載されている。こうしたアルゴリズムは、Schaffer et al( Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)) 、に記載されているようにBLASTN及びBLASTXプログラム（バージョン２．２）に組み込まれている。BLAST 及びGapped BLAST プログラムを利用する時、それぞれのプログラム（例えば、BLASTN；National Center for Biotechnology Informationのインターネットサイトから利用可能）のデフォルトパラメータを使用し得る。一つの態様において、探索されたデータベースは非冗長（ＮＲ）データベースであり、及び配列比較のためのパラメータは：フィルターなし：期待値１０；３のワードサイズ；のセットを使用することができ；マトリックスはBLOSUM62であり；及びギャップコストは１１のイグジステンス（Existence）及び１のエクステンション（Extension ）を有する。
【００２５】
配列の比較のために利用された数学アルゴリズムの別の非制限例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムはGCG（Accelrys, San Diego, California）配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウエイト残基テ−ブル、１２のギャップレングスペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用し得る。配列分析のための追加のアルゴリズムが当該技術分野で公知であり、Torellis and Robotti（Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5, 1994）に記載されているADVANCE及びADAM；及びPearson and Lipman（Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 2444-2448, 1988）に記載されているFASTAが含まれる。
【００２６】
別の態様において、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Blossom ６３マトリックスか又はＰＡＭ２５０マトリックス、及び１２、１０、８、６、又は４のギャップウエイト及び２、３、又は４のレングスウエイトを使用する、GCG ソフトウェアパッケージ中のGAP プログラム（Accelrys, San Diego, California）を使用して達成し得る。さらに別の態様において、二つの核酸配列間のパーセント同一性は、５０のギャップウエイト及び３のレングスウエイトを使用する、GCG ソフトウェアパッケージ中のGAP プログラム（Accelrys, San Diego, California）を使用して達成し得る。
【００２７】
一つの側面に従うと、該トランスジェニック非ヒト動物は、核酸配列が該動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列に、機能可能なように連結されたｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸構築物を含んでなるゲノムを有する。用語「転写調節配列」は、当該技術分野で認識されている意味に従って使用される。それは、その配列により、連結された遺伝子を特定の細胞中で上方か又は下方に調節させることができる、いずれのＤＮＡ配列も意味することを意図する。プロモーターの場合、該プロモーターは一般的にコード領域に隣接しているであろう。しかしながら、エンハンサーの場合、エンハンサー及びコード領域間に介在ＤＮＡ配列が存在するように、エンハンサーはコード領域からいくらか離れて機能することができる。特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（又は「コード領域」）を含むことができる遺伝子情報の発現を方向付けるため、目的のコード領域を少なくとも一つの転写調節配列に機能的様式で共役させることができる。該転写調節配列は、遺伝子の発現を、増加させる、減少させる、調節する、又は特定の組織に又は特定の発生の段階に指定するために使用することができる。該転写調節配列は、天然に存在する配列である必要はない。
【００２８】
それ故、本明細書に記載された一つの態様において、ｍｉＲ１５５をコードする配列はＢ細胞への発現を方向付けている転写調節配列（単数又は複数）に機能可能なように連結されており、組換え構築物又は導入遺伝子を発生する。該転写調節配列は、Ｂ細胞での発現を方向付けることができるいずれの配列でもあり得る。適した転写調節配列の例には、限定されるわけではないが、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー及びそれらの組み合わせが含まれる。特定の態様において、該転写調節配列はマウス転写調節配列又はマウス由来の転写調節配列である。
【００２９】
核酸分子は、もしそれが転写調節情報を含むヌクレオチド配列（単数又は複数）を含んでいるならば、マイクロＲＮＡを「発現できる」又は「発現を方向付けることができる」といわれており、及びこうした配列（単数又は複数）はマイクロＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（単数又は複数）に「機能可能なように連結」されている。機能可能なリンケージ（linkage）とは、調節核酸配列（単数又は複数）及び発現されようとするヌクレオチド配列（単数又は複数）が、遺伝子発現を可能にするように連結されているリンケージである。
【００３０】
一般に、遺伝子発現に必要とされる調節領域には、限定されるわけではないが、転写調節配列（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）、ならびに、ＲＮＡに転写された時に遺伝子転写体の安定性に寄与するＤＮＡ配列（単数又は複数）が含まれる。
【００３１】
用語「プロモーター」は、当該技術分野で認識されている意味に従って使用される。それは、ＲＮＡポリメラーゼを結合しそして該酵素を正しい転写開始部位へ方向付ける、通常、遺伝子のコード領域又はオペロンの上流のＤＮＡ領域を意味することを意図する。プロモーター領域は、もし該プロモーターがＤＮＡ配列の転写に影響できるならば、該ＤＮＡ配列に機能可能なように連結されている。
【００３２】
用語「エンハンサー」は、当該技術分野で認識されている意味に従って使用される。それは、研究されている遺伝子から数キロ塩基までに位置する（両方向で）場合、遺伝子からの転写を増加させることができる、真核生物及び特定の真核生物ウイルスに見いだされる配列を意味することを意図する。これらの配列は通常、問題とする遺伝子の５’側 （上流）にある場合、エンハンサーとして働く。しかしながら、いくつかのエンハンサーは、遺伝子の３’側 （下流）に位置している場合に活性である。一部の例では、エンハンサー要素は（既知の）プロモーターを有していない遺伝子からの転写を活性化し得る。
【００３３】
該核酸構築物は、該構築物及び／又は該構築物から発現された遺伝子産物の発現及び／又は安定性を促進する配列も含むことができる。特定の態様において、該核酸構築物は、βグロビン遺伝子（例えば、マウスβグロビン遺伝子）の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含んでなる。該構築物及び／又は該構築物から発現された遺伝子産物の発現及び／又は安定性を促進する他の配列が当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される。
【００３４】
本明細書で使用される用語「トランスジェニック非ヒト動物」は、ヒト以外の全ての脊椎動物を含む。一つの態様において、トランスジェニック非ヒト動物は哺乳動物である。こうしたトランスジェニック非ヒト動物には、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、及び他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が含まれる。加えて、げっ歯類ファミリーの他のメンバー、例えば、ラット及びモルモット、及びチンパンジーのような非ヒト霊長類を、本明細書に記載した態様を実施するために使用することができる。特定の態様において、トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。本明細書に記載されたトランスジェニック非ヒト動物には、胚胎児期を含むすべての発生段階のそれぞれの動物が含まれる。
【００３５】
「トランスジェニック動物」は、マイクロインジェクション又は組換え型ウイルスの感染によるような、細胞内レベルでの計画的遺伝子操作により、直接的又は間接的に受け取った遺伝子情報を運んでいる一つ又はそれより多くの細胞を含有する動物である。導入された核酸分子は、染色体内に組み入れられていてもよいし、又は染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。本明細書に記載された適したトランスジェニック動物には、限定されるわけではないが、遺伝子情報が生殖系列細胞内に導入され、それにより情報を子孫に伝達する能力を与える動物が含まれる。もしこうした子孫が、該情報のいくらか又は全てを実際に所有していれば、それらも又トランスジェニック動物である。
【００３６】
トランスジェニック動物を作製するためには、例えば、マイクロインジェクション、細胞銃の使用、トランスフェクション、リポソーム融合、エレクトロポレーションなどのような、胚内に組換え構築物又は導入遺伝子を導入するために当該技術分野で公知であるいずれの方法も使用することができる。特定の態様において、トランスジェニック動物を作製するための方法は、受精卵の雄性前核内にＤＮＡ分子を注入することを含む、マイクロインジェクションである（例えば、米国特許番号4,870,009; 5,550,316; 4,736,866；及び4,873,191を参照されたい）。哺乳類及びそれらの生殖細胞内に組換え型の構築物／導入遺伝子を導入するための方法は、もともとマウスにおいて開発された。こうした方法は、引き続いて、家畜種を含むより大きい動物での使用のために採用された（例えば、ＰＣＴ出願番号WO88/00239、WO90/05188及びWO92/11757を参照されたい）。接合体の細胞質内へのＤＮＡのマイクロインジェクションは、トランスジェニック動物を作製するためにも使用することができる。
【００３７】
導入された導入遺伝子の存在ならびにその発現を評価するための方法は、容易に利用可能であり及び当該技術分野では公知である。こうした方法には、限定されるわけではないが、外来性ＤＮＡを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を検出するためのブロットが含まれる。
【００３８】
本態様は、動物のいずれか一つの種に限定されるわけではなく、いずれかの適切な非ヒト脊椎動物種のために提供される。例えば、本明細書に記載した及び例示したトランスジェニックマウスを産生し得る。他の非制限例には、例えば、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジなどのような、本明細書に記載された他の非ヒト哺乳動物が含まれる。マイクロインジェクションによりトランスジェニック動物を作製する成功率はマウスにおいて最も高く、ＤＮＡが注入され及びメスに移植された受精マウス卵のおよそ２５％がトランスジェニックマウスに発育するであろう。より低い成功率がウサギ、ブタ、ヒツジ及びウシで達成されている。
【００３９】
特定の態様において、本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物は、脾臓、骨髄又は脾臓及び骨髄の両方において、適した対照動物におけるＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の集団と比較して、拡大したこの集団を示す。本明細書で使用される、用語「Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の拡大した集団」又は「Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の増加」とは、対照動物の集団と比較して、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の数における、及び／又はリンパ球系細胞の他のサブタイプと比較したＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の集団の増加を示す、リンパ球系細胞の集団を指す。
【００４０】
別の態様において、本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物は、リンパ球増殖性状態を示す。「リンパ球増殖性」とは、リンパ細網系の細胞の増殖に関する又は特徴付けられるものを指し；本用語は一般に、悪性新生物の群を指すために使用される。「リンパ細網」は、リンパ系及び細網内皮系の両方の細胞又は組織を指す。「リンパ球増殖性状態」（又は「リンパ球増殖性疾患 」又は「リンパ球増殖性障害」）とは、共通の多分化能、原始的リンパ細網細胞に関連する細胞から起こる悪性新生物の群の一つを指し、中でも、リンパ球性、組織球性及び単球性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ホジキン病、全リンパ球性リンパ腫、及び単クローン性免疫グロブリン血症に付随する免疫分泌性障害が含まれる。本明細書で使用される「リンパ球増殖性障害」「リンパ球増殖性疾患 」又は「リンパ球増殖性状態」は、リンパ細網系の細胞の増殖、増倍及び／又は蓄積が正常又は対照動物と比較して変化しているが、影響を受けた動物は上記の新生物の一つの症状をまだ必ずしも示していない生理学的状態も指すことができる。本明細書で使用される「前白血病」状態は、白血病の明白な症状の発生に先立つこうしたリンパ球増殖性状態を指す。
【００４１】
特定の態様において、リンパ球増殖性状態は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）；Ｂ細胞リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）、Ｂ細胞新生物）である。さらなる態様において、Ｂ細胞悪性腫瘍はヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す。さらに別の態様において、リンパ球増殖性状態は前白血病の状態（例えば、プレＢ細胞増殖）である。追加の態様において、トランスジェニック非ヒト動物は腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症、又はそれらの組み合わせを示す。
【００４２】
別の態様において、リンパ球増殖性障害（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）及び新生物））の研究のための、及び可能性がある発癌及び治療剤を試験するための実験モデルとしての、トランスジェニック非ヒト動物の使用についての方法が本明細書に記載されている。
【００４３】
別の側面において、対象のリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおける剤の治療効力を試験する方法が本明細書に記載されている。一つの態様に従うと、該方法は、該剤を本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）に投与することを含んでなる。一つの態様において、該トランスジェニック非ヒト動物は、動物のＢ細胞での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列（例えば、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー、それらの組み合わせ）を含んでなる、核酸構築物を含んでなるゲノムを有し、該転写調節配列は、ｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている。特定の態様において、該転写調節配列は、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列に機能可能なように連結されている。別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる。さらに別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００４４】
該剤を該トランスジェニック動物に投与した後、該トランスジェニック動物における一つ又はそれより多くのリンパ球増殖性状態症状及び／又は徴候を、該剤が投与されていない同一遺伝子型の対照動物と比較する。もし、該剤が、対照動物と比較して、それが投与された該トランスジェニック動物におけるリンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を抑制する、予防する及び／又は軽減するならば、該剤はリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおいて治療効力を有すると考えられる。特定の態様において、リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候は：Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００４５】
剤の治療効力を試験するために適しているリンパ球増殖性状態には、例えば、本明細書に記載されているものが含まれる。一つの態様において、リンパ球増殖性状態はＢ細胞悪性腫瘍である。特定の態様において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）、Ｂ細胞新生物及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。Ｂ細胞悪性腫瘍は、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はその両方の特質を示す。別の態様において、リンパ球増殖性状態は、プレＢ細胞増殖により特徴づけられる状態のような前白血病状態である。
【００４６】
本明細書に記載されるように、Ｂ細胞中でｍｉＲ１５５を発現するトランスジェニック非ヒト動物が本明細書において提供される。一つの態様において、そのゲノムが、Ｂ細胞への発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物又は導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック動物が提供され、該転写調節配列は、ｍｉＲ１５５をコードする核酸配列に機能可能なように連結されている。特定の態様において、該導入遺伝子は、ＶＨプロモーター及び／又はＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーの転写調節下に置かれている、ｍｉＲ１５５をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。こうした動物において、ｍｉＲ１５５発現は未成熟及び成熟Ｂ細胞に向けられる。一つの態様において、該トランスジェニック動物は、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団を発生するマウスである。
【００４７】
別の態様において、リンパ球増殖を示すトランスジェニック動物からの白血球細胞を、第二の動物（非トランスジェニック動物であってもよい）に移すことができ、それにより、第二の「レシピエント」動物においてリンパ球増殖性疾患の迅速な発症を誘発する。
【００４８】
別の態様に従うと、リンパ球増殖性障害を予防する及び／又は治療するための潜在的治療モダリティ（therapeutic modality）又は剤を、本明細書に記載した一つまたはそれより多くの様相に従って作り出された動物において、こうした様式の抗リンパ球増殖性活性を測定することにより試験することができる。こうした活性は、一つの態様に従って作り出されたトランスジェニック動物により、及び／又は別の態様に従って作り出された「レシピエント」動物において示される一つまたはそれより多くのリンパ球増殖性疾患の症状又は徴候を抑制する、予防する及び／又は消失させる潜在的治療モダリティの能力を測定することにより評価することができる。
【００４９】
タンパク質（例えば、抗体）、ペプチド、ペプチド模倣薬、有機小分子、核酸などのような多様な治療モダリティ又は剤を、リンパ球増殖性障害を予防する及び／又は治療することについて試験し得る。本明細書に記載した方法に従うと、複数の剤を個々にスクリーニングでき、又は一つまたはそれより多くの剤を同時に試験し得る。化合物の混合物が試験される場合、記載されたプロセスにより選択された化合物は、適した方法（例えば、配列決定、クロマトグラフィー）を使用して分離でき（必要に応じて）及び同定し得る。試験サンプル中の一つまたはそれより多くの化合物の存在も、これらの方法に従って決定し得る。
【００５０】
リンパ球増殖性障害を予防する及び／又は治療する剤は、例えば、本明細書に記載されたトランスジェニック動物により示される、一つまたはそれより多くのリンパ球増殖性疾患の症状又は徴候の抑制及び／又は予防を測定するアッセイにおいて、Chemical Repository of the National Cancer Institute のような分子のライブラリー又はコレクションをスクリーニングすることにより同定し得る。コンビナトリアル化学合成又は他の方法により作り出された化合物（例えば、有機化合物、組換え又は合成ペプチド、「ペプトイド」、核酸）のコンビナトリアルライブラリーのようなライブラリーを試験し得る（例えば、Zuckerman, R.N. et al,, J. Med. Chem., 37: 2678-2685 (1994）及びその中に引用されている文献を参照されたい；Ohlmeyer, M.H.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993）及び De Witt, S.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)、タグ付けされた化合物に関して；Rutter, WJ. et al., 米国特許第5,010,175 号; Huebner, V.D. et al., 米国特許第5,182,366 号;及びGeysen, H.M., 米国特許第4,833,092 号も参照されたい)。ライブラリーから選択された化合物が独特のタグを運んでいる場合、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が可能である。
【００５１】
同定された治療モダリティは、既知の方法に従ってさらに処方することができ、薬学的に許容できる組成物が作り出される。治療モダリティ又はこうした治療モダリティを含んでなる組成物は、多様な標準様式で対象（例えば、トランスジェニック動物）に投与することができる。例えば、剤は、例えば、経口的、食事性、局所的、経皮的、直腸的、非経口的（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内注射）及び吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入、鼻腔内点滴）を含む多様な経路を使用して投与し得る。投与は、示されているように局所的又は全身的であり得る。好ましい投与の様式は、投与されるべき抗体又は抗原結合断片、治療されている特定の状態（例えば、疾患）に依存して変化し得るが、経口又は非経口的投与が一般的に好ましい。
【００５２】
剤は、例えば、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は皮下注射のように非経口的に投与することができる。非経口投与は、該剤を溶液又は懸濁液に取り込ませることにより成し遂げ得る。こうした溶液又は懸濁液は、注射用水、生理食塩水、静菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール含有生理食塩水）、リン酸緩衝食塩水（本明細書においてＰＢＳと称される）、ハンクス液、乳酸リンゲル、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、及び他の合成溶媒のような無菌希釈液も含むことができる。非経口的製剤は 抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム）及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）も含むことができる。酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤、及び塩化ナトリウム及びデキストロースのような浸透圧を調節するための剤も加えることができる。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブル注射器、又はガラス又はプラスチック製の複数回用（multiple dose）バイアル中に封入し得る。
【実施例】
【００５３】
実施例１：Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスの作製
材料及び方法
トランスジェニックマウス：
ｍｉＲ１５５の前駆配列を含有する３１８ｂｐ断片をＰＣＲにより１２９ＳｖＪマウス（The Jackson Laboratory）のゲノムから増幅し、Ｉｇ重鎖のためのＥμエンハンサーＶＨプロモーター及びヒトβ−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）を含有し（図１）、及び以前にＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスにおける慢性リンパ球性白血病の発生のために使用されている（Bichi, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6955-6960 (2002)）、ｐＢＳＶＥ６ＢＫ（ｐＥμ）プラスミドのＥｃｏＲＶ及びＳａｌI部位内にクローン化した。該構築物をＢｓｓＨＩＩ及びＰｖｕＩで切断することにより単離された導入遺伝子を、妊娠ＦＶＢ／Ｎ及びＣ５７／Ｂ６マウスの受精卵母細胞の雄性前核内に注入した。Ｅμエンハンサー配列を標的にするように設計されたプローブを使用し、ＢａｍＨＩで消化した尾部抽出ＤＮＡに対して実施されたサザンブロット分析により、導入遺伝子の存在について子をスクリーニングした（図２Ａ、２Ｂ）。トランスジェニック初代を同定し、同年齢の野生型マウスと繁殖させた。トランスジェニックヘミ接合性マウスが誕生し、研究され、そしてそれらの野生型対応マウスと比較された。尾部抽出ＤＮＡに対して実施されたＰＣＲによりマウスの遺伝子型を同定した（データは示されていない）。
【００５４】
ノーザンブロット分析：
脾臓を二つのすりガラス間で解離させ、溶解物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）による低浸透圧性溶解により赤血球を枯渇させ、遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した。全ＲＮＡをトリゾール試薬（GIBCO,Invitrogen ）で抽出し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにロードし及び変性させ、Hybond N＋膜（Amersham Pharmacia）にブロットした。該膜を、成熟ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５配列のアンチセンス含有γ−３２Ｐ放射性プローブとハイブリダイズし、一晩インキュベートし、洗浄し、及びPhosphorImagerスクリーン（Molecular Dynamics）に暴露した。イメージはTyphoon イメージ処理システム（Amersham Biosciences）を使用して処理した（図３）。
【００５５】
結果
Ｂ細胞発生の後期プロB細胞段階で活性になるｍｍｕ−ｍｉＲ１５５（マウスｍｉＲ１５５）の発現が、ＶＨプロモーター−Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーの制御下であるトランスジェニックマウスが作製された。Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６バックグラウンドで７匹（Ｆ１〜Ｆ７と命名された）、及びＦＶＢ／Ｎバックグラウンドで８匹（Ｆ８〜Ｆ１５と命名された）、計１５匹のトランスジェニック初代がサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定された（図２Ａ、２Ｂ）。これらの初代を同一系統の野生型マウスと繁殖させて、１５の独立したトランスジェニック系統を作製した。
【００５６】
トランスジェニック及び野生型脾臓から抽出された全ＲＮＡに対して実施されたリアルタイムＰＣＲ（データは示されていない）及びノーザンブロット分析（図３）は、トランスジェニックマウスの五つの初代系統について高レベルのｍｉＲ１５５発現を示した。一つのトランスジェニック系統は完全に発現が欠如しており、一方、他の初代系統は導入遺伝子を発現した。野生型マウスは、以前に報告されているように（Monticelli, S., et al., Genome Biol. 6:R71 (2005)）、脾臓で成熟ｍｉＲ１５５を発現しない。
【００５７】
実施例２：Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスの表現型特徴付けは、Ｂ細胞悪性腫瘍を導く脾臓及び骨髄中のプレＢ細胞増殖を明らかにする
材料及び方法
体部測定
マウスを殺した後に秤量し、それらの脾臓を切り取り、計測し、及び秤量した。
【００５８】
白血球（ＷＢＣ）及び塗抹標本：
マウスの後眼窩血管から血液を抜き、すりガラススライド上に塗抹してギムザで染色するか、又は遠心分離し、ＰＢＳ中で洗浄し、塩化アンモニウムで処理した。細胞を細胞計数器チャンバーで計数した。
【００５９】
フローサイトメトリー分析：
脾細胞又は骨髄細胞の単細胞懸濁液は低浸透圧性溶解（０．１６５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ）により成熟赤血球を枯渇させ、以下の共役抗体で染色した：抗Ｂ２２０−ＰＥ、抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ、抗ＴＣＲ−ＰＥ ｃｙ５、抗ＣＤ５−ＰＥ、及び抗ＣＤ４３−ＦＩＴＣ。全ての抗体はBD PharMingen から入手した。フローサイトメトリーは、Becton Dickinson FACSCalibur で実施し、データはMac ソフトウエアのためのBecton Dickinson FACS CONVERT 1.0 を使用して解析した。
【００６０】
組織学及び免疫組織化学：
脾臓、大腿、及び胸骨を剖検したマウスから単離し、１０％ホルマリン緩衝液で固定し、パラフィン中に含ませ、４ミクロン切片に切断した。切片を、標準プロトコールに従ってヘマトキシリン／エオシンで染色した。脱ワックス工程のため切片を５５℃で１時間加熱し、段階的なエタノール系列及び蒸留水を通して再水和し、ＰＢＳに浸し、そして次ぎに中３７℃にて３０分、０．１％トリプシン含有トリス緩衝液で処理した。内在性ペルオキシダーゼは１０％正常血清でブロックした。ＣＤ４３、Ｂ２２０及びＶｐｒｅＢ１（ＣＤ１７９ａ）抗体（ＢＤ PharMingen）を一次抗体に使用した。二次抗体及びジアミノベンジジンは使用説明書に従って加えた。
【００６１】
結果
トランスジェニックマウスの脾臓は、野生型マウスの脾臓と比較して肥大しており（図４Ａ、４Ｂ）、脾臓重量／体重比は野生型マウスの比よりも３から４倍高かった（表１）。興味深いことに、該比は年齢であまり変化しなかった。
【００６２】
【表１】
【００６３】
３月齢トランスジェニックマウスの白血球数（ＷＢＣ）は、正常同年齢のマウスについての末梢血ｍｌ当たり４０Ｘ１０６±１．５Ｘ１０６と比較して、末梢血ｍｌ当たり１０Ｘ１０６±１Ｘ１０６であった。トランスジェニックマウスのＷＢＣについては、６月齢で幾分低く、野生型同年齢のマウスについて末梢血ｍｌ当たり４０Ｘ１０６±１．５Ｘ１０６の変化しない値と比較して、末梢血ｍｌ当たり６Ｘ１０６±０．５Ｘ１０６の値を有した。
【００６４】
３月齢トランスジェニックマウスの脾臓（ヘマトキシリン／エオシン染色）の病理組織診断は、赤色髄に侵入する及び拡大する一貫した非定型リンパ球集団を特色とする。胚濾胞は影響されておらず、及び二次血球生成の多病巣がある（図５Ａ）。組織学的には、６月齢のマウスは、著しい非定型性及び芽細胞外観を有し、赤色髄の血管通路中で増殖し、及び徐々に白色髄を置換している非常に増加した悪性リンパ球集団を示した。胚濾胞の数は減少しており、脾臓の全アーキテクチャが非定型リンパ球増殖により歪められていた（図５Ｂ）。組織学的に類似のリンパ球集団が６月齢マウスの骨髄に存在していた。増殖抗原、Ｋｉ６７の発現は、野生型マウスでは観察されなかった著しい非定型リンパ球増殖をトランスジェニックマウスで示した（図５Ｄ）。
【００６５】
トランスジェニック脾臓中の非定型リンパ球増殖の免疫組織学的分析は、Ｂ２２０及びＶｐｒｅＢｌ（ＣＤ１７９ａ）についての非定型拡大リンパ球の低い陽性を示したが、ＣＤ４３は陰性であった（データは示されていない）。トランスジェニックマウスの脾臓パラフィン包埋切片のＩｇＭ染色は、増殖しているリンパ球の細胞質中にμ鎖の存在を示した（図６）。対照的に、フローサイトメトリー分析は、これらの細胞の表面上に、ＩｇＭの発現を同定することに失敗しており、拡大リンパ球細胞は細胞質μ鎖を発現するが、表面ＩｇＭを発現しないことを示している。
【００６６】
３、６又は７週齢又は６月齢のトランスジェニック及び野生型マウスの、脾臓及び骨髄両方からのＷＢＣの単細胞懸濁液で実施したフローサイトメトリー分析は、トランスジェニックマウスの脾臓及び骨髄の両方におけるＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球の数が、野生型対応物のものと比較して、増加を示した。この表現型は、ヒト急性リンパ芽球性白血病又はリンパ芽球性リンパ腫で観察された増殖リンパ球の表現型と似ている。これらの発見は、３週齢のトランスジェニックマウスの脾臓においてのＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ系集団は、野生型マウスの脾臓中での１．６５％のみと比較し、全ゲーテッド（gated）リンパ系集団の９％である（一匹のトランスジェニック及び一匹の野生型マウスで評価された）。６週齢では、これらのパーセンテージはトランスジェニックマウスの脾臓で６．６±１．４％、及び７週齢では４．７±０．３％となったが、一方、野生型脾臓では変化しなかった（二匹のトランスジェニックマウスが二つの異なった初代系統から、及び二匹の野生型マウスが分析された）。
【００６７】
６月齢のトランスジェニックマウスの骨髄において、野生型と比較して、Ｂ２２０１ｏｗ／ＩｇＭ−発現により定義されるプレＢ細胞集団の増加が観察された（図７及び８）。Ｂ２２０１ｏｗ／ＩｇＭ−細胞集団の前方散乱分析は、これらの細胞が大型の芽球様細胞であることを示した（データは示されていない）。
フローサイトメトリー、組織学的及び免疫組織化学的分析に基づき、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−と定義されたプレＢ細胞増殖がトランスジェニックマウスの脾臓及び骨髄中で起こり、そして３週齢ですでに検出可能であった。この増殖は、最後には、しばしば高悪性度Ｂ細胞悪性腫瘍と関係があることを特色とする、脾腫、骨髄置換及び著しいリンパ球減少症を生じる。この特徴付けと一致して、全てのトランスジェニックマウスは６月齢までに、全て健康であった野生型対照と比較して（１１匹の内の１１匹の野生型マウス）、高悪性度Ｂ細胞新生物を発生した（７匹の内の７匹のトランスジェニックマウス）。とりわけ、ｍｉＲ１５５を過剰発現しないトランスジェニックマウス系統も又正常であった。
【００６８】
実施例３：Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスの細胞遺伝学的分析
材料及び方法
細胞遺伝学：
大腿骨髄をＲＰＭＩ培地１６４０／２０％ＦＢＳで洗い流し、５ｍｌの１％ヘパリン含有ＲＰＭＩ培地１６４０／２０％ＦＢＳに集めた。細胞を増殖させ、標準細胞学的技術を用いて染色体欠失、転座、逆位、及びメタフェーズの数を評価した。
【００６９】
Ｉｇ重鎖転位：
プローブは、以下のオリゴヌクレオチドプライマ−を使用してマウスゲノムＤＮＡのＩｇ重鎖領域のＪＨ４断片中の配列を増幅することにより設計した：フォワード、5’-TGAAGGATCTGCCAGAACTGAA-3’（配列番号３）及びリバース、5’-TGCAATGCTCAGAAAACTCCAT-3’（配列番号４）。
【００７０】
トランスジェニック及び野生型マウスの脾臓を、ＰＢＳ中、すりガラスの間で解離させ、塩化アンモニウムで処理して赤血球を溶解し、遠心分離し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。ＤＮＡを脾臓の白血球から抽出し、そしてＥｃｏＲＩ、ＳｔｕＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡをHybond N+ 膜上にブロットし、γ−３２Ｐで放射活性的に標識されたＪＨ４プローブとハイブリダイズさせ、PhosphorImager スクリーンへ暴露し、Typhoon スキャナーを使用して処理した。
【００７１】
結果
脾細胞の核型の細胞遺伝学的研究は、正常同腹子からの脾臓と比較し、トランスジェニックマウスからのからの脾臓における一貫した染色体異常を同定することに失敗した。しかしながら、いくつかのゲノム変化が時折観察された（図９；矢印参照）。これらの結果は、プレＢ細胞の拡大した集団は二倍体であり、及び細胞遺伝学的に準正常であることを示している。クローン性を検出するため、Ｖ（Ｄ）Ｊ転位を評価する多消化酵素を使用し、３から６週齢のマウスからの脾細胞ＤＮＡに対してサザンブロット分析を実施した。野生型マウスと比較し、トランスジェニックマウスにおいて転位したバンドの存在は検出されなかった（図１０）、但し一匹のトランスジェニックマウスは、異なった制限酵素のそれぞれで実施されたサザンブロット上に一貫した転位バンドを有していた（データは示されていない）。これらのデータは、この年齢のマウスにおけるＢ細胞集団は、大部分、少なくとも６週齢まではポリクローナルであったことを示している。悪性腫瘍の大部分はモノクローナルであるので、この発見は、ｍｉＲ１５５が、癌で活性化されるシグナル伝達経路の下流標的である可能性を示唆している。
【００７２】
興味深いことに、ｍｉＲ１５５の過剰発現は、乳癌及び結腸癌のような固形腫瘍、ならびに肺癌で観察されており、ｍｉＲ１５５の過剰発現は予後不良の指標であった（Volinia, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2257- 2261 (2006)）。
【００７３】
実施例４：マイクロアレイ発現プロファイリングはＶｐｒｅＢ１ ｍＲＮＡ及び他の標的の上方調節を明らかにする
材料及び方法
ＲＮＡ単離：
全ＲＮＡ単離は、使用説明書に従ってトリゾール試薬（Invitrogen）で実施した。
【００７４】
ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング：
ＲＮＡ標識及びｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ上のハイブリダイゼーションは記載されているように（Liu, C.G., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9740-9744）実施した。簡単には、５μｇの各サンプルからの全ＲＮＡは、５’ビオチン末端標識ランダムオクタマーオリゴヌクレオチドプライマ−を使用する逆転写によりビオチンで標識した。ビオチン標識化ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを、２４５のヒト及び２００のマウスｍｉＲＮＡ遺伝子を含む８００のｍｉＲＮＡプローブを含有するｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ（Ohio State University, Ver. 2.0）上で四重に実施した。ハイブリダイゼーションシグナルを、Axon スキャナー4000B（Axon Instruments, Union City, CA）を使用する、ビオチンへのストレプトアビジン−アレキサン（Alexa）６４７複合物の結合により検出した。画像はGENEPIX 6.0 ソフトウエア（Axon Instruments）により定量した。
【００７５】
ｍＲＮＡ発現プロファイリング：
４５，０００より多くの特徴付けられた遺伝子及び発現された配列タグのためのプローブセットを含有するGeneChip Mouse genom 430 2.0 アレイ（Affymetrix）を使用した。サンプル標識及びプロセシング、GeneChip ハイブリダイゼーション及びスキャニングはAffymetrix プロトコールに従って実施した。簡単には、二重鎖ｃＤＮＡを、３’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位（Genset, La Jolla, CA）を付加するSuperscript Choice System（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡから合成した。ビオチン化ｃＲＮＡをインビトロでｃＤＮＡから発生させ、BioArray Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ標識キット（Enzo Diagnostics）を使用して増幅した。ｃＲＮＡの精製後、RNeasyミニキット（Qiagen, Hilden, Germany）を使用し、２０μｇのｃＲＮＡを９４℃で３５分断片化した。およそ１２．５μｇの断片化ｃＲＮＡは、ハイブリダイゼーション効率の内部対照として働かせるためのニシン精子ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ；Promega）＋細菌及びファージ対照（１．５ｐＭ ＢｉｏＢ、５ｐＭ ＢｉｏＣ、２５ｐＭ ＢｉｏＤ及び１００ｐＭ Ｃｒｅ）、を含有する２５０μｌのハイブリダイゼーション混合物で使用した。混合物の一定分量（２００μｌ）を、GeneChip ハイブリダイゼーションオーブン６４０（Affymetrix）中、４５℃で１８時間、アレイにハイブリダイズさせた。各アレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Invitrogen）で染色し、そしてGeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix）上、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Vector Laboratories）で増幅した。アレイをGeneArray G7スキャナー（Affymetrix）でスキャンし、画像及びシグナル強度を得た。
【００７６】
結果
マイクロアレイ分析を、５匹のトランスジェニックマウス（ｍｉＲ１５５導入遺伝子を発現しない１匹のマウスを含む）の脾臓白血球、及び６匹の野生型同腹子対応動物の白血球から抽出した全ＲＮＡに対して実施した。該分析は、野生型同腹子対照マウスと比較し（データは示されていない）、ｍｉＲ１５５を過剰発現するトランスジェニックマウスはｍｉＲ１５５、ｍｉＲ１９４、ｍｉＲ２２４、ｍｉＲ２１７及びｍｉＲ１５１の発現が１０〜２０倍増加し（表３）、及びｍｉＲ１４６及びｍｉＲ１３８の発現は２〜３分の１に減少した。Affymetrix マイクロアレイチップを使用し、トランスジェニックマウスの同一群におけるｍＲＮＡの差次的発現を研究し、同腹子対照におけるｍＲＮＡ発現と比較した。Affymetrix マイクロアレイデータの統計的解析は、ｍｉＲ１５５過剰発現マウスにおいて、２００の増殖関連遺伝子が上方制御され、及び５０の遺伝子が下方制御されていたことを示した（表３）。とりわけ、プレＢ細胞の増殖が行われる時に起こることが予期されるＶｐｒｅＢｌ ｍＲＮＡが上方制御されていた。これらのデータは、フローサイトメトリー分析及び免疫組織化学からのデータを補完する。
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】
【００８３】
【表８】
【００８４】
【表９】
【００８５】
【表１０】
【００８６】
【表１１】
【００８７】
【表１２】
【００８８】
【表１３】
【００８９】
【表１４】
【００９０】
【表１５】
【００９１】
参照文献として明確に援用されていなかった、本明細書で引用されたすべての出版物の関連する教示は、その全体が本明細書において援用される。本発明はそれらの好ましい態様に関して特定的に示され及び記述されてきたが、付随する特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から離れることなく、形態及び詳細の多様な変更をその中で行えることを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成されている少なくとも一つの図を含む。カラーの図を含む本特許又は特許出願の印刷物は、依頼及び必要な料金の支払い後、本事務所により提供されるであろう。
【図１】図１は、妊娠中のＣ５７／Ｂ６及びＦＶＢ／Ｎメスマウスの卵母細胞の雄性前核に注入されたｍｉＲ１５５導入遺伝子構築物を示している模式図である。ｍｉＲ１５５導入遺伝子構築物は、ＶＨプロモーターＥμエンハンサーの下流のＥｃｏＲＶ及びＳａｌＩ部位間にｍｍｕ−ｍｉＲ１５５遺伝子を挿入することにより作製された。
【図２】図２Ａは、７匹のｍｉＲ１５５トランスジェニック初代（レーン１、３、５、６、７、１０及び１４）及びＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドを有する８匹の野生型（レーン２、４、８、９、１１、１２、１３及び１５）マウスの遺伝子型を示しているサザンブロットである。図２Ｂは、８匹のｍｉＲ１５５トランスジェニック初代（レーン１、３、５、７、９、１１、１３及び１５）及びＦＶＢ／Ｎｆバックグラウンドを有する７匹の野生型（レーン２、４、６、８、１０、１２及び１４）マウスの遺伝子型を示しているサザンブロットである。
【図３】図３は、プローブとしてｍｍｕ−ｍｉＲ１５５成熟配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、１５のトランスジェニック系統の内の６の３週齢マウスの脾臓から単離されたリンパ球中の、成熟ｍｉＲ１５５の発現を示している全ＲＮＡのノーザンブロット法である。脾細胞中に成熟ｍｉＲ１５５の最も高い発現を有する５トランスジェニック系統（レーン１、２、５、８及び９）をさらなる繁殖及び分析のために選択した。１つのトランスジェニック系統は導入遺伝子を発現しなかった（レーン３）。導入遺伝子発現は、野生型対照からはなかった（レーン４、６及び７）。
【図４】図４Ａは、６月齢で、野生型と比較し、臨床的に明白な脾腫のためにかなりの腹部腫脹（左）を有するトランスジェニックマウスを示している写真である。図４Ｂは、図４Ａで示したマウスの脾臓を示している写真である。トランスジェニックマウスの脾臓は（左）、白血病／リンパ腫細胞の拡大により肥大している。
【図５】図５Ａは、３週齢トランスジェニックマウス（マウス番号５０；初代番号１０）からの脾臓のヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。切片は、白色髄を圧迫している非定型リンパ増殖を示している。図５Ｂは、６月齢トランスジェニックマウス（初代番号８）からの脾臓のＨ＆Ｅ染色切片を示している１００倍での顕微鏡写真である。脾臓の全アーキテクチャは非定型リンパ様増殖により置き換えられている。ごくわずかな胚リンパ濾胞が残存し、それは大きさが非常に減少し、該増殖により圧縮されていた。図５Ｃは、６月齢トランスジェニックマウス（初代番号８）からの脾臓のＨ＆Ｅ染色切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。脾臓アーキテクチャはほとんど完全にリンパ芽球性増殖により削除されていた。２つの小さな圧縮されたリンパ濾胞の残余物が見られる。図５Ｄは、６月齢トランスジェニックマウス（初代番号８）からの骨髄のＨ＆Ｅ染色切片を示している４００倍での顕微鏡写真であり、造血増殖巣の置換を導く、骨髄中のリンパ芽球性増殖を示している。図５Ｅは、正常脾臓のＨ＆Ｅ染色切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。図５Ｆは、３週齢トランスジェニックマウス（マウス番号７２）からの脾臓の切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。切片はＫｉ６７について染色されており、脾臓中の増加した非定型リンパ様増殖を示している。
【図６】図６は、ＩｇＭについて免疫組織化学的染色された、３週齢トランスジェニックマウス（マウス番号５０）からの脾臓の切片における非定型リンパ様増殖を示している４００倍での顕微鏡写真である。トランスジェニックマウスにおいてＩｇＭは、褐色核周囲輪として増殖しているリンパ球の細胞質（ｃｌｇＭ）に存在し、一方、野生型リンパ球は、ｓＩｇＭ及びｃＩｇＭ両方の存在のため、明瞭な核を有さない、強い褐色である。
【図７】図７Ａは、初代の２つの異なった系統（初代８及び１０）からのトランスジェニックマウスの脾臓におけるリンパ球の、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−集団の拡大を示しているフローサイトメトリー分析プロファイルである。3週齢（トランスジェニックマウス番号７４、初代８（７４ＴＧ；左上）及び野生型マウス番号６８（６８ＷＴ；右上））及び７週齢（トランスジェニックマウス番号１５６、初代１０（１５６ＴＧ；左下）及び野生型マウス番号１５７（１５７ＷＴ；右下））での２匹のトランスジェニックマウス及び２匹の野生型マウスについてのゲーテッド脾細胞が示されている。野生型に関し、プロットの左上象限（Ｂ２２０＋ＩｇＭ集団をゲーティング）の比較は、トランスジェニック脾臓中の前駆体Ｂ細胞数の増加を示している。図７Ｂは、初代８からのトランスジェニックマウスの骨髄におけるリンパ球の、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−集団の拡大を示しているフローサイトメトリー分析プロファイルである。６月齢での、１匹のトランスジェニック及び１匹の野生型マウス（トランスジェニックマウス番号８（８ＴＧ；左）及び野生型マウス番号２４（２４ＷＴ；右））についてのゲーテッド骨髄白血球が示されている。野生型に関し、２つのプロットの右上象限の比較は、トランスジェニックマウスの骨髄の２００＋ＩｇＭ＋ゲーテッド成熟Ｂ細胞集団の減少を示している。
【図８】図８Ａは、７週齢での野生型マウス番号２２３（２２３ＷＴ）のＢ２２０＋ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＢ２２０−ＰＥ発現を示しているグラフである。図８Ｂは、７週齢での野生型マウス番号２２３（２２３ＷＴ）のＢ２２０＋ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＣＤ１０−ＦＩＴＣ発現を示しているグラフである。図８Ｃは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２２（２２２ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＢ２２０−ＰＥ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウスにおけるＢ２２０low集団（Ｂ２２０−及びＢ２２０＋の２つのピーク間に間在している）の注目すべき増加を示している。図８Ｄは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２２（２２２ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＣＤｌ０−ＦＩＴＣ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウス中のＢ２２０＋−ゲーテッド集団中にのみＣＤ１０＋集団のパーセンテージの増加を示しており、該Ｂ２２０ｌｏｗ増殖は、少なくとも一部、ＣＤ１０＋集団の増加によることを示している。図８Ｅは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２１（２２１ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＢ２２０−ＰＥ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウスにおけるＢ２２０low集団（Ｂ２２０−及びＢ２２０＋の２つのピーク間に間在している）の注目すべき増加を示している。図８Ｆは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２１（２２１ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＣＤｌ０−ＦＩＴＣ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウス中のＢ２２０＋−ゲーテッド集団中にのみＣＤ１０＋集団のパーセンテージの増加を示しており、該Ｂ２２０ｌｏｗ増殖は、少なくとも一部、ＣＤ１０＋集団の増加によることを示している。
【図９】図９は、染色体欠失、転座及び逆位、ならびにメタフェーズの数について分析された、トランスジェニック脾臓から単離されたリンパ球系細胞の核型である。矢印は、厚い余分のバンドの存在により同定された、染色体９中の異常を示している。
【図１０】図１０は、３から６週齢の間の、５匹のトランスジェニック（ＴＧ）及び４匹の野生型（ＷＴ）マウスの脾細胞から抽出されたＤＮＡについてのサザンブロットである。サザンブロットハイブリダイゼーションは、ＪＨ４プローブ及びレーンの上に示されている異なった消化酵素（ＳｔｕＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を使用して実施した。高分子量の厚いバンドは、生殖細胞系と一致する。野生型と比較して、トランスジェニック動物には転位したバンドはなかった。
【技術分野】
【０００１】
政府援助
本発明は、全体が又は部分的に、米国政府からの基金により支援された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
急性白血病は、骨髄及び血液中の芽球細胞と称される未成熟無機能性細胞の蓄積を生じる、骨髄及び血液の急速に進行する悪性疾患である。骨髄中での芽球細胞の蓄積は、正常血液細胞の発生を阻止する。その結果、赤血球、白血球及び血小板が十分な数で産生されない。該疾患が骨髄リンパ球前駆細胞で起こる場合、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を生じ、該疾患が骨髄系前駆細胞で起こる場合、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を生じる。
【０００３】
ＡＬＬは、骨髄リンパ球の悪性形質転換により開始される急速進行性癌である。ＡＬＬは、全年齢群で毎年３、０００の新規ケースを有する、小児白血病の最も一般的なタイプである。形質転換した（悪性になった）細胞は増殖し、そして白血病性リンパ芽球として骨髄に蓄積する。リンパ芽球は骨髄での正常血液細胞形成を阻止し、赤血球、白血球及び血小板の不十分な産生を生じる。
【０００４】
侵攻性リンパ腫としても知られている高悪性度リンパ腫には、もし治療されないならば比較的急速に進行する、リンパ腫のいくつかのサブタイプが含まれる。これらのサブタイプには、例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫及び小型非切れ込み核細胞性リンパ腫が含まれる。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と比較し、高悪性度リンパ腫はより侵襲的に挙動し、より強力な化学療法を必要とし、及び小児においてより頻繁に発生する。急速に分裂する細胞はより抗癌剤に感受性であるので、及び若年の患者は通常他の健康問題がないので、これらのリンパ腫のいくつかは、療法に対して劇的な応答を示す。急性リンパ芽球性白血病及び高悪性度リンパ腫は、小児において最も一般的な白血病及びリンパ腫である。これらの疾患は、大部分についてポリクローナルであり、悪性病変を誘発するにはわずかな遺伝子変化のみで十分であることを示唆している。
【０００５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的との相補性の程度に従って、標的とされたｍＲＮＡに結合することにより、及びそれらの翻訳を阻止することによるか又はそれらの分解を開始させることにより、転写レベル後に重要な調節的役割を果たす、大量の小さなＲＮＡの新規クラスを意味する。１９９３年のカエノルハブディテキス・エレガンスでのそれらの発見以来（Lee, R. et al., Cell 75:843-854 (1993)）、細胞増殖及び分化から脂質代謝の範囲に及ぶ、非常に多様な役割を有するタンパク質の大きなアレイの転写後調節に、これらの小さな分子を結びつける多数の報告がある（Nairz, K., et al., Dev. Biol. 291:314-324 (2006); Chen, J.F., et al, Nat. Genet. 33:228-233 (2006); Naguibneva, L, et al, Nat. Cell Biol. 8:278-284 (2006); Esau, C, et al, Cell Metab. 3:87-98 (2006）;及び Gauthier, B.R., et al, Nat. Med. 12:36-18 (2006)）。
【０００６】
ヒト及びマウスにおける造血系のｍｉＲＮＡプロファイリングは、ｍｉＲＮＡが血球発生の過程で差次的に発現されることを示した（Chen, C.Z., et al., Science 303:83-86 (2004); Chen, C.Z., et al., Semin. Immunol. 77:155-165 (2005）及び Ramkissoon, S.H., et al., Leuk. Res. 30:643-647 (2006)）。我々は、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）の６８％の場合において、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１が除去又は下方制御されていること（Calin, G.A., et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 99: 15524-15529 (2002）及び Calin, G.A., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:11755-11760 (2004)）、及びｍｉＲＮＡ遺伝子がしばしば脆弱部及び癌に関与するゲノム領域に位置していること（Calin, G.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2999-3004 (2004)）を示した。ｍｉＲ１５５及びＢＩＣ（その宿主遺伝子）転写体が、ヒトＢ細胞リンパ腫、特に、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Eis, P.S., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:3627-3632 (2005))、ホジキンリンパ腫（Kluvier, J., et al., J. Pathol. 207:243-249 (2006)）及び特定のタイプのバーキットリンパ腫（潜伏型ＩＩＩエプスタイン・バーウイルス陽性バーキットリンパ腫) (Kluvier, J., et al., Genes Chromosomes Cancer 45:147-153 (2006)）で蓄積されていることが示されている。
【０００７】
現在、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫）のようなリンパ球増殖性障害の治療のための治療可能性を有する候補剤を、スクリーニングする又は同定するために使用することができる動物を作製する緊急の必要性がある。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、その発現がＢ細胞を標的とし（例えば、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーを使用して）、最初に前白血病性プレＢ細胞増殖を示し（脾臓及び骨髄で明白）、及び後でＢ細胞悪性腫瘍を発生させる、ｍｉＲ１５５導入遺伝子を運んでいるトランスジェニックマウスの発見に基づいている。ｍｉＲ１５５を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ヒトリンパ球増殖性疾患に似ているリンパ球増殖性疾患を発生し、それ故、これらの疾患の開始及び／又は進行におけるｍｉＲ１５５を強く示唆している。Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスは、ヒトにおけるＢ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病、高悪性度リンパ腫）のようなリンパ球増殖性疾患の異なった形態を治療するための新規治療アプローチを考案するために有用である。
【０００９】
従って、一つの側面において、リンパ球増殖性障害のための新規動物モデルが本明細書において提供される。具体的には、一つの側面に従うと、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）及び新生物）のための動物モデルが提供される。
【００１０】
一つの態様において、そのゲノムが、ｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）が本明細書において提供される。特定の態様において、該ｍｉＲｌ５５遺伝子産物は、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、該ｍｉＲｌ５５遺伝子産物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる。さらに別の態様において、該ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１１】
一つの態様に従うと、該少なくとも一つの転写調節配列は、動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができるいずれかの配列であり得る。一つの態様において、該転写調節配列は、ＶＨプロモーター（例えば、マウス由来のＶＨプロモーター）を含んでなる。別の態様において、該転写調節配列は、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー（例えば、マウス由来のＩｇ重鎖Ｅμエンハンサー）を含んでなる。関連する態様において、該核酸構築物は、βグロビン遺伝子（例えば、ヒト又は他の哺乳類種由来のβグロビン遺伝子）の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含んでなる。
【００１２】
そのゲノムが、配列番号１及び／又は配列番号２を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、ＶＨプロモーター及びＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる核酸構築物を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物も本明細書において提供される。特定の態様において、該トランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、ＶＨプロモーター及びＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる核酸構築物を含んでなる。
【００１３】
特定の態様において、該トランスジェニック非ヒト動物は、適した対照動物におけるＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の集団と比較して、拡大したこの集団を、脾臓、骨髄又は脾臓及び骨髄の両方に有する。関連する態様において、該トランスジェニック非ヒト動物はリンパ球増殖性状態を示す。特定の態様において、該リンパ球増殖性状態はＢ細胞悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病；Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞新生物）である。さらなる態様において、該Ｂ細胞悪性腫瘍はヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す。さらに別の態様において、該リンパ球増殖性状態は前白血病の状態（例えば、プレＢ細胞増殖）である。追加の態様において、該トランスジェニック非ヒト動物は腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症、又はそれらの組み合わせを示す。
【００１４】
対象のリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおける剤の治療効力を試験する方法も本明細書において提供される。一つの態様に従うと、該方法は、そのゲノムが動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列（例えば、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー、それらの組み合わせ）を含んでなる核酸構築物を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）に該剤を投与することを含んでなり、該転写調節配列は配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に、機能可能なように連結されている。特定の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１５】
トランスジェニック動物に該剤を投与した後、トランスジェニック動物におけるリンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を、該剤が投与されていない同一ゲノムタイプの対照動物のそれらと比較する。もし、対照動物と比較して、剤が投与されたトランスジェニック動物において一つ又はそれより多くのリンパ球増殖性状態の症状及び／又は徴候が抑制され、予防され及び／又は軽減されているならば、該剤はリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおいて治療効力を有すると考えられる。特定の態様において、該リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候は、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００１６】
別の態様において、剤が対象におけるリンパ球増殖性状態に影響するかどうかを決定する方法が本明細書において提供される（例えば、リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの徴候及び／又は症状の検出能及び／又は出現比の相違に影響すること）。該方法は、本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物に剤を投与すること、そしてトランスジェニック動物における一つ又はそれより多くのリンパ球増殖性状態の症状及び／又は徴候を、同一ゲノムタイプの対照動物のそれらと比較することを含んでなり、ここで該対照動物には該剤は投与されていない。該対照動物と比較し、該トランスジェニック動物における検出能及び／又は出現比の相違は、該剤がリンパ球増殖性状態の影響していることを示す。
【００１７】
一つの態様において、リンパ球増殖性状態はＢ細胞悪性腫瘍である。特定の態様において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）、Ｂ細胞新生物及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。Ｂ細胞悪性腫瘍は、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はその両方の特質を示すことができる。別の態様において、リンパ球増殖性状態は、プレＢ細胞増殖により特徴づけられる状態のような前白血病状態である。
【００１８】
本発明のこれらならびに他の重要な側面は、以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の特定の態様の説明が以下に示される。
本明細書に例示され及び記述されるように、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ１５５を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ヒトの急性リンパ芽球性白血病及び高悪性度リンパ腫に似ているリンパ球増殖性疾患を発症する。本明細書で提供される結果は、ｍｉＲ１５５及び／又は他の遺伝子（単数又は複数）（例えば、癌で活性化される遺伝子（例えば、シグナル伝達遺伝子））の発癌性発現が、Ｂ細胞悪性腫瘍の開始及び／又は進行に関与していることを強く示している。従って、Ｂ細胞悪性腫瘍及び他のリンパ球増殖性状態の開始及び進行の根底にある機構を調べるために使用することができる動物モデルが本明細書で提供される。この動物モデルは、リンパ球増殖性障害を治療する又は予防することにおいて有用である新規治療剤の同定、開発及び試験にも使用することができる。
【００２０】
一つの態様において、そのゲノムが、ｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、Ｂ細胞への発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物又は導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック動物が本明細書において提供され、ここで該転写調節配列はｍｉＲｌ５５遺伝子産物をコードする核酸配列に機能可能なように連結されている。用語「導入遺伝子」とは、本明細書に記載されている方法によるようなヒト介入により、非ヒト動物の一つ又はそれより多くの細胞内に導入された核酸配列を指す。導入された遺伝子情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来性、特定の個々のレシピエントについてのみ外来性であるか、又は遺伝子情報はレシピエントによりすでにプロセシングされていることができる。後者の場合において、導入された遺伝子情報は、天然の内在性遺伝子と比較して差次的に発現されてもよい。
【００２１】
該トランスジェニック非ヒト動物は、ｍｉＲ１５５遺伝子産物を発現することができる核酸構築物／導入遺伝子を含んでなるゲノムを有する。ｍｉＲ遺伝子産物（本明細書においてマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ及びｍｉＲＮＡとも称される）はタンパク質に翻訳されないので、用語「ｍｉＲ遺伝子産物」はタンパク質を含んでいない。プロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写体は「ｍｉＲ前駆体」とも称され、そして典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写体を含んでなる。該ｍｉＲ前駆体は、活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子にプロセシングし得る（例えば、天然のプロセシング経路（例えば、無傷の細胞又は細胞溶解物を使用して）を介して、又は合成プロセシング経路（例えば、単離されたダイサー、アルゴノート又はＲＮＡｓｅ ＩＩＩ（例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ）のような単離されたプロセシング酵素を使用して）により）。この活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、「プロセシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写物又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも称される。本明細書においてマイクロＲＮＡが名称で呼ばれる場合、該名称は、特に示されない限り、前駆体及び成熟形の両方に対応する。
【００２２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ１５５遺伝子産物」とは、限定されるわけではないが、マウス（ハツカネズミ）からのｍｉＲ１５５遺伝子のような、ｍｉＲ１５５遺伝子からのプロセシングされていない（例えば、前駆体）又はプロセシングされた（例えば、成熟）ＲＮＡ転写体を指す。マウスからの前駆体ｍｉＲ１５５遺伝子産物はヌクレオチド配列：
5’-CUGUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUUUUGGCCUCUGACUGACUCCUACCUGUUAGCAUUAACAG-3’ （配列番号１）により表され、一方、プロセシングされた又は成熟マウスｍｉＲ１５５遺伝子産物はヌクレオチド配列：
5’- UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGG-3’（配列番号２；GenBank 寄託番号AJ459767）により表される。
【００２３】
特定の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号１及び／又は配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。特定の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号１のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号２のヌクレオチド配列と１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２４】
二つの配列の実際の比較は、例えば、数学アルゴリズムを使用した公知の方法により達成し得る。こうした数学アルゴリズムの好ましい非制限例は、Karlin et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 90:5873-5877(1993)) 、に記載されている。こうしたアルゴリズムは、Schaffer et al( Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)) 、に記載されているようにBLASTN及びBLASTXプログラム（バージョン２．２）に組み込まれている。BLAST 及びGapped BLAST プログラムを利用する時、それぞれのプログラム（例えば、BLASTN；National Center for Biotechnology Informationのインターネットサイトから利用可能）のデフォルトパラメータを使用し得る。一つの態様において、探索されたデータベースは非冗長（ＮＲ）データベースであり、及び配列比較のためのパラメータは：フィルターなし：期待値１０；３のワードサイズ；のセットを使用することができ；マトリックスはBLOSUM62であり；及びギャップコストは１１のイグジステンス（Existence）及び１のエクステンション（Extension ）を有する。
【００２５】
配列の比較のために利用された数学アルゴリズムの別の非制限例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムはGCG（Accelrys, San Diego, California）配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウエイト残基テ−ブル、１２のギャップレングスペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用し得る。配列分析のための追加のアルゴリズムが当該技術分野で公知であり、Torellis and Robotti（Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5, 1994）に記載されているADVANCE及びADAM；及びPearson and Lipman（Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 2444-2448, 1988）に記載されているFASTAが含まれる。
【００２６】
別の態様において、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Blossom ６３マトリックスか又はＰＡＭ２５０マトリックス、及び１２、１０、８、６、又は４のギャップウエイト及び２、３、又は４のレングスウエイトを使用する、GCG ソフトウェアパッケージ中のGAP プログラム（Accelrys, San Diego, California）を使用して達成し得る。さらに別の態様において、二つの核酸配列間のパーセント同一性は、５０のギャップウエイト及び３のレングスウエイトを使用する、GCG ソフトウェアパッケージ中のGAP プログラム（Accelrys, San Diego, California）を使用して達成し得る。
【００２７】
一つの側面に従うと、該トランスジェニック非ヒト動物は、核酸配列が該動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列に、機能可能なように連結されたｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸構築物を含んでなるゲノムを有する。用語「転写調節配列」は、当該技術分野で認識されている意味に従って使用される。それは、その配列により、連結された遺伝子を特定の細胞中で上方か又は下方に調節させることができる、いずれのＤＮＡ配列も意味することを意図する。プロモーターの場合、該プロモーターは一般的にコード領域に隣接しているであろう。しかしながら、エンハンサーの場合、エンハンサー及びコード領域間に介在ＤＮＡ配列が存在するように、エンハンサーはコード領域からいくらか離れて機能することができる。特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（又は「コード領域」）を含むことができる遺伝子情報の発現を方向付けるため、目的のコード領域を少なくとも一つの転写調節配列に機能的様式で共役させることができる。該転写調節配列は、遺伝子の発現を、増加させる、減少させる、調節する、又は特定の組織に又は特定の発生の段階に指定するために使用することができる。該転写調節配列は、天然に存在する配列である必要はない。
【００２８】
それ故、本明細書に記載された一つの態様において、ｍｉＲ１５５をコードする配列はＢ細胞への発現を方向付けている転写調節配列（単数又は複数）に機能可能なように連結されており、組換え構築物又は導入遺伝子を発生する。該転写調節配列は、Ｂ細胞での発現を方向付けることができるいずれの配列でもあり得る。適した転写調節配列の例には、限定されるわけではないが、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー及びそれらの組み合わせが含まれる。特定の態様において、該転写調節配列はマウス転写調節配列又はマウス由来の転写調節配列である。
【００２９】
核酸分子は、もしそれが転写調節情報を含むヌクレオチド配列（単数又は複数）を含んでいるならば、マイクロＲＮＡを「発現できる」又は「発現を方向付けることができる」といわれており、及びこうした配列（単数又は複数）はマイクロＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（単数又は複数）に「機能可能なように連結」されている。機能可能なリンケージ（linkage）とは、調節核酸配列（単数又は複数）及び発現されようとするヌクレオチド配列（単数又は複数）が、遺伝子発現を可能にするように連結されているリンケージである。
【００３０】
一般に、遺伝子発現に必要とされる調節領域には、限定されるわけではないが、転写調節配列（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）、ならびに、ＲＮＡに転写された時に遺伝子転写体の安定性に寄与するＤＮＡ配列（単数又は複数）が含まれる。
【００３１】
用語「プロモーター」は、当該技術分野で認識されている意味に従って使用される。それは、ＲＮＡポリメラーゼを結合しそして該酵素を正しい転写開始部位へ方向付ける、通常、遺伝子のコード領域又はオペロンの上流のＤＮＡ領域を意味することを意図する。プロモーター領域は、もし該プロモーターがＤＮＡ配列の転写に影響できるならば、該ＤＮＡ配列に機能可能なように連結されている。
【００３２】
用語「エンハンサー」は、当該技術分野で認識されている意味に従って使用される。それは、研究されている遺伝子から数キロ塩基までに位置する（両方向で）場合、遺伝子からの転写を増加させることができる、真核生物及び特定の真核生物ウイルスに見いだされる配列を意味することを意図する。これらの配列は通常、問題とする遺伝子の５’側 （上流）にある場合、エンハンサーとして働く。しかしながら、いくつかのエンハンサーは、遺伝子の３’側 （下流）に位置している場合に活性である。一部の例では、エンハンサー要素は（既知の）プロモーターを有していない遺伝子からの転写を活性化し得る。
【００３３】
該核酸構築物は、該構築物及び／又は該構築物から発現された遺伝子産物の発現及び／又は安定性を促進する配列も含むことができる。特定の態様において、該核酸構築物は、βグロビン遺伝子（例えば、マウスβグロビン遺伝子）の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含んでなる。該構築物及び／又は該構築物から発現された遺伝子産物の発現及び／又は安定性を促進する他の配列が当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される。
【００３４】
本明細書で使用される用語「トランスジェニック非ヒト動物」は、ヒト以外の全ての脊椎動物を含む。一つの態様において、トランスジェニック非ヒト動物は哺乳動物である。こうしたトランスジェニック非ヒト動物には、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、及び他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が含まれる。加えて、げっ歯類ファミリーの他のメンバー、例えば、ラット及びモルモット、及びチンパンジーのような非ヒト霊長類を、本明細書に記載した態様を実施するために使用することができる。特定の態様において、トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。本明細書に記載されたトランスジェニック非ヒト動物には、胚胎児期を含むすべての発生段階のそれぞれの動物が含まれる。
【００３５】
「トランスジェニック動物」は、マイクロインジェクション又は組換え型ウイルスの感染によるような、細胞内レベルでの計画的遺伝子操作により、直接的又は間接的に受け取った遺伝子情報を運んでいる一つ又はそれより多くの細胞を含有する動物である。導入された核酸分子は、染色体内に組み入れられていてもよいし、又は染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。本明細書に記載された適したトランスジェニック動物には、限定されるわけではないが、遺伝子情報が生殖系列細胞内に導入され、それにより情報を子孫に伝達する能力を与える動物が含まれる。もしこうした子孫が、該情報のいくらか又は全てを実際に所有していれば、それらも又トランスジェニック動物である。
【００３６】
トランスジェニック動物を作製するためには、例えば、マイクロインジェクション、細胞銃の使用、トランスフェクション、リポソーム融合、エレクトロポレーションなどのような、胚内に組換え構築物又は導入遺伝子を導入するために当該技術分野で公知であるいずれの方法も使用することができる。特定の態様において、トランスジェニック動物を作製するための方法は、受精卵の雄性前核内にＤＮＡ分子を注入することを含む、マイクロインジェクションである（例えば、米国特許番号4,870,009; 5,550,316; 4,736,866；及び4,873,191を参照されたい）。哺乳類及びそれらの生殖細胞内に組換え型の構築物／導入遺伝子を導入するための方法は、もともとマウスにおいて開発された。こうした方法は、引き続いて、家畜種を含むより大きい動物での使用のために採用された（例えば、ＰＣＴ出願番号WO88/00239、WO90/05188及びWO92/11757を参照されたい）。接合体の細胞質内へのＤＮＡのマイクロインジェクションは、トランスジェニック動物を作製するためにも使用することができる。
【００３７】
導入された導入遺伝子の存在ならびにその発現を評価するための方法は、容易に利用可能であり及び当該技術分野では公知である。こうした方法には、限定されるわけではないが、外来性ＤＮＡを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を検出するためのブロットが含まれる。
【００３８】
本態様は、動物のいずれか一つの種に限定されるわけではなく、いずれかの適切な非ヒト脊椎動物種のために提供される。例えば、本明細書に記載した及び例示したトランスジェニックマウスを産生し得る。他の非制限例には、例えば、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジなどのような、本明細書に記載された他の非ヒト哺乳動物が含まれる。マイクロインジェクションによりトランスジェニック動物を作製する成功率はマウスにおいて最も高く、ＤＮＡが注入され及びメスに移植された受精マウス卵のおよそ２５％がトランスジェニックマウスに発育するであろう。より低い成功率がウサギ、ブタ、ヒツジ及びウシで達成されている。
【００３９】
特定の態様において、本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物は、脾臓、骨髄又は脾臓及び骨髄の両方において、適した対照動物におけるＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の集団と比較して、拡大したこの集団を示す。本明細書で使用される、用語「Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の拡大した集団」又は「Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の増加」とは、対照動物の集団と比較して、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の数における、及び／又はリンパ球系細胞の他のサブタイプと比較したＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−細胞の集団の増加を示す、リンパ球系細胞の集団を指す。
【００４０】
別の態様において、本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物は、リンパ球増殖性状態を示す。「リンパ球増殖性」とは、リンパ細網系の細胞の増殖に関する又は特徴付けられるものを指し；本用語は一般に、悪性新生物の群を指すために使用される。「リンパ細網」は、リンパ系及び細網内皮系の両方の細胞又は組織を指す。「リンパ球増殖性状態」（又は「リンパ球増殖性疾患 」又は「リンパ球増殖性障害」）とは、共通の多分化能、原始的リンパ細網細胞に関連する細胞から起こる悪性新生物の群の一つを指し、中でも、リンパ球性、組織球性及び単球性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ホジキン病、全リンパ球性リンパ腫、及び単クローン性免疫グロブリン血症に付随する免疫分泌性障害が含まれる。本明細書で使用される「リンパ球増殖性障害」「リンパ球増殖性疾患 」又は「リンパ球増殖性状態」は、リンパ細網系の細胞の増殖、増倍及び／又は蓄積が正常又は対照動物と比較して変化しているが、影響を受けた動物は上記の新生物の一つの症状をまだ必ずしも示していない生理学的状態も指すことができる。本明細書で使用される「前白血病」状態は、白血病の明白な症状の発生に先立つこうしたリンパ球増殖性状態を指す。
【００４１】
特定の態様において、リンパ球増殖性状態は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、Ｂ細胞白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）；Ｂ細胞リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）、Ｂ細胞新生物）である。さらなる態様において、Ｂ細胞悪性腫瘍はヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す。さらに別の態様において、リンパ球増殖性状態は前白血病の状態（例えば、プレＢ細胞増殖）である。追加の態様において、トランスジェニック非ヒト動物は腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症、又はそれらの組み合わせを示す。
【００４２】
別の態様において、リンパ球増殖性障害（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）及び新生物））の研究のための、及び可能性がある発癌及び治療剤を試験するための実験モデルとしての、トランスジェニック非ヒト動物の使用についての方法が本明細書に記載されている。
【００４３】
別の側面において、対象のリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおける剤の治療効力を試験する方法が本明細書に記載されている。一つの態様に従うと、該方法は、該剤を本明細書に記載したトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）に投与することを含んでなる。一つの態様において、該トランスジェニック非ヒト動物は、動物のＢ細胞での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列（例えば、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー、それらの組み合わせ）を含んでなる、核酸構築物を含んでなるゲノムを有し、該転写調節配列は、ｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている。特定の態様において、該転写調節配列は、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列に機能可能なように連結されている。別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる。さらに別の態様において、ｍｉＲ１５５遺伝子産物は、配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００４４】
該剤を該トランスジェニック動物に投与した後、該トランスジェニック動物における一つ又はそれより多くのリンパ球増殖性状態症状及び／又は徴候を、該剤が投与されていない同一遺伝子型の対照動物と比較する。もし、該剤が、対照動物と比較して、それが投与された該トランスジェニック動物におけるリンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を抑制する、予防する及び／又は軽減するならば、該剤はリンパ球増殖性状態を治療する又は予防することにおいて治療効力を有すると考えられる。特定の態様において、リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候は：Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００４５】
剤の治療効力を試験するために適しているリンパ球増殖性状態には、例えば、本明細書に記載されているものが含まれる。一つの態様において、リンパ球増殖性状態はＢ細胞悪性腫瘍である。特定の態様において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、高悪性度リンパ腫）、Ｂ細胞新生物及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。Ｂ細胞悪性腫瘍は、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はその両方の特質を示す。別の態様において、リンパ球増殖性状態は、プレＢ細胞増殖により特徴づけられる状態のような前白血病状態である。
【００４６】
本明細書に記載されるように、Ｂ細胞中でｍｉＲ１５５を発現するトランスジェニック非ヒト動物が本明細書において提供される。一つの態様において、そのゲノムが、Ｂ細胞への発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物又は導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック動物が提供され、該転写調節配列は、ｍｉＲ１５５をコードする核酸配列に機能可能なように連結されている。特定の態様において、該導入遺伝子は、ＶＨプロモーター及び／又はＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーの転写調節下に置かれている、ｍｉＲ１５５をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。こうした動物において、ｍｉＲ１５５発現は未成熟及び成熟Ｂ細胞に向けられる。一つの態様において、該トランスジェニック動物は、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団を発生するマウスである。
【００４７】
別の態様において、リンパ球増殖を示すトランスジェニック動物からの白血球細胞を、第二の動物（非トランスジェニック動物であってもよい）に移すことができ、それにより、第二の「レシピエント」動物においてリンパ球増殖性疾患の迅速な発症を誘発する。
【００４８】
別の態様に従うと、リンパ球増殖性障害を予防する及び／又は治療するための潜在的治療モダリティ（therapeutic modality）又は剤を、本明細書に記載した一つまたはそれより多くの様相に従って作り出された動物において、こうした様式の抗リンパ球増殖性活性を測定することにより試験することができる。こうした活性は、一つの態様に従って作り出されたトランスジェニック動物により、及び／又は別の態様に従って作り出された「レシピエント」動物において示される一つまたはそれより多くのリンパ球増殖性疾患の症状又は徴候を抑制する、予防する及び／又は消失させる潜在的治療モダリティの能力を測定することにより評価することができる。
【００４９】
タンパク質（例えば、抗体）、ペプチド、ペプチド模倣薬、有機小分子、核酸などのような多様な治療モダリティ又は剤を、リンパ球増殖性障害を予防する及び／又は治療することについて試験し得る。本明細書に記載した方法に従うと、複数の剤を個々にスクリーニングでき、又は一つまたはそれより多くの剤を同時に試験し得る。化合物の混合物が試験される場合、記載されたプロセスにより選択された化合物は、適した方法（例えば、配列決定、クロマトグラフィー）を使用して分離でき（必要に応じて）及び同定し得る。試験サンプル中の一つまたはそれより多くの化合物の存在も、これらの方法に従って決定し得る。
【００５０】
リンパ球増殖性障害を予防する及び／又は治療する剤は、例えば、本明細書に記載されたトランスジェニック動物により示される、一つまたはそれより多くのリンパ球増殖性疾患の症状又は徴候の抑制及び／又は予防を測定するアッセイにおいて、Chemical Repository of the National Cancer Institute のような分子のライブラリー又はコレクションをスクリーニングすることにより同定し得る。コンビナトリアル化学合成又は他の方法により作り出された化合物（例えば、有機化合物、組換え又は合成ペプチド、「ペプトイド」、核酸）のコンビナトリアルライブラリーのようなライブラリーを試験し得る（例えば、Zuckerman, R.N. et al,, J. Med. Chem., 37: 2678-2685 (1994）及びその中に引用されている文献を参照されたい；Ohlmeyer, M.H.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993）及び De Witt, S.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)、タグ付けされた化合物に関して；Rutter, WJ. et al., 米国特許第5,010,175 号; Huebner, V.D. et al., 米国特許第5,182,366 号;及びGeysen, H.M., 米国特許第4,833,092 号も参照されたい)。ライブラリーから選択された化合物が独特のタグを運んでいる場合、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が可能である。
【００５１】
同定された治療モダリティは、既知の方法に従ってさらに処方することができ、薬学的に許容できる組成物が作り出される。治療モダリティ又はこうした治療モダリティを含んでなる組成物は、多様な標準様式で対象（例えば、トランスジェニック動物）に投与することができる。例えば、剤は、例えば、経口的、食事性、局所的、経皮的、直腸的、非経口的（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内注射）及び吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入、鼻腔内点滴）を含む多様な経路を使用して投与し得る。投与は、示されているように局所的又は全身的であり得る。好ましい投与の様式は、投与されるべき抗体又は抗原結合断片、治療されている特定の状態（例えば、疾患）に依存して変化し得るが、経口又は非経口的投与が一般的に好ましい。
【００５２】
剤は、例えば、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は皮下注射のように非経口的に投与することができる。非経口投与は、該剤を溶液又は懸濁液に取り込ませることにより成し遂げ得る。こうした溶液又は懸濁液は、注射用水、生理食塩水、静菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール含有生理食塩水）、リン酸緩衝食塩水（本明細書においてＰＢＳと称される）、ハンクス液、乳酸リンゲル、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、及び他の合成溶媒のような無菌希釈液も含むことができる。非経口的製剤は 抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム）及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）も含むことができる。酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤、及び塩化ナトリウム及びデキストロースのような浸透圧を調節するための剤も加えることができる。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブル注射器、又はガラス又はプラスチック製の複数回用（multiple dose）バイアル中に封入し得る。
【実施例】
【００５３】
実施例１：Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスの作製
材料及び方法
トランスジェニックマウス：
ｍｉＲ１５５の前駆配列を含有する３１８ｂｐ断片をＰＣＲにより１２９ＳｖＪマウス（The Jackson Laboratory）のゲノムから増幅し、Ｉｇ重鎖のためのＥμエンハンサーＶＨプロモーター及びヒトβ−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）を含有し（図１）、及び以前にＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスにおける慢性リンパ球性白血病の発生のために使用されている（Bichi, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6955-6960 (2002)）、ｐＢＳＶＥ６ＢＫ（ｐＥμ）プラスミドのＥｃｏＲＶ及びＳａｌI部位内にクローン化した。該構築物をＢｓｓＨＩＩ及びＰｖｕＩで切断することにより単離された導入遺伝子を、妊娠ＦＶＢ／Ｎ及びＣ５７／Ｂ６マウスの受精卵母細胞の雄性前核内に注入した。Ｅμエンハンサー配列を標的にするように設計されたプローブを使用し、ＢａｍＨＩで消化した尾部抽出ＤＮＡに対して実施されたサザンブロット分析により、導入遺伝子の存在について子をスクリーニングした（図２Ａ、２Ｂ）。トランスジェニック初代を同定し、同年齢の野生型マウスと繁殖させた。トランスジェニックヘミ接合性マウスが誕生し、研究され、そしてそれらの野生型対応マウスと比較された。尾部抽出ＤＮＡに対して実施されたＰＣＲによりマウスの遺伝子型を同定した（データは示されていない）。
【００５４】
ノーザンブロット分析：
脾臓を二つのすりガラス間で解離させ、溶解物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）による低浸透圧性溶解により赤血球を枯渇させ、遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した。全ＲＮＡをトリゾール試薬（GIBCO,Invitrogen ）で抽出し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにロードし及び変性させ、Hybond N＋膜（Amersham Pharmacia）にブロットした。該膜を、成熟ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５配列のアンチセンス含有γ−３２Ｐ放射性プローブとハイブリダイズし、一晩インキュベートし、洗浄し、及びPhosphorImagerスクリーン（Molecular Dynamics）に暴露した。イメージはTyphoon イメージ処理システム（Amersham Biosciences）を使用して処理した（図３）。
【００５５】
結果
Ｂ細胞発生の後期プロB細胞段階で活性になるｍｍｕ−ｍｉＲ１５５（マウスｍｉＲ１５５）の発現が、ＶＨプロモーター−Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーの制御下であるトランスジェニックマウスが作製された。Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６バックグラウンドで７匹（Ｆ１〜Ｆ７と命名された）、及びＦＶＢ／Ｎバックグラウンドで８匹（Ｆ８〜Ｆ１５と命名された）、計１５匹のトランスジェニック初代がサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定された（図２Ａ、２Ｂ）。これらの初代を同一系統の野生型マウスと繁殖させて、１５の独立したトランスジェニック系統を作製した。
【００５６】
トランスジェニック及び野生型脾臓から抽出された全ＲＮＡに対して実施されたリアルタイムＰＣＲ（データは示されていない）及びノーザンブロット分析（図３）は、トランスジェニックマウスの五つの初代系統について高レベルのｍｉＲ１５５発現を示した。一つのトランスジェニック系統は完全に発現が欠如しており、一方、他の初代系統は導入遺伝子を発現した。野生型マウスは、以前に報告されているように（Monticelli, S., et al., Genome Biol. 6:R71 (2005)）、脾臓で成熟ｍｉＲ１５５を発現しない。
【００５７】
実施例２：Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスの表現型特徴付けは、Ｂ細胞悪性腫瘍を導く脾臓及び骨髄中のプレＢ細胞増殖を明らかにする
材料及び方法
体部測定
マウスを殺した後に秤量し、それらの脾臓を切り取り、計測し、及び秤量した。
【００５８】
白血球（ＷＢＣ）及び塗抹標本：
マウスの後眼窩血管から血液を抜き、すりガラススライド上に塗抹してギムザで染色するか、又は遠心分離し、ＰＢＳ中で洗浄し、塩化アンモニウムで処理した。細胞を細胞計数器チャンバーで計数した。
【００５９】
フローサイトメトリー分析：
脾細胞又は骨髄細胞の単細胞懸濁液は低浸透圧性溶解（０．１６５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ）により成熟赤血球を枯渇させ、以下の共役抗体で染色した：抗Ｂ２２０−ＰＥ、抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ、抗ＴＣＲ−ＰＥ ｃｙ５、抗ＣＤ５−ＰＥ、及び抗ＣＤ４３−ＦＩＴＣ。全ての抗体はBD PharMingen から入手した。フローサイトメトリーは、Becton Dickinson FACSCalibur で実施し、データはMac ソフトウエアのためのBecton Dickinson FACS CONVERT 1.0 を使用して解析した。
【００６０】
組織学及び免疫組織化学：
脾臓、大腿、及び胸骨を剖検したマウスから単離し、１０％ホルマリン緩衝液で固定し、パラフィン中に含ませ、４ミクロン切片に切断した。切片を、標準プロトコールに従ってヘマトキシリン／エオシンで染色した。脱ワックス工程のため切片を５５℃で１時間加熱し、段階的なエタノール系列及び蒸留水を通して再水和し、ＰＢＳに浸し、そして次ぎに中３７℃にて３０分、０．１％トリプシン含有トリス緩衝液で処理した。内在性ペルオキシダーゼは１０％正常血清でブロックした。ＣＤ４３、Ｂ２２０及びＶｐｒｅＢ１（ＣＤ１７９ａ）抗体（ＢＤ PharMingen）を一次抗体に使用した。二次抗体及びジアミノベンジジンは使用説明書に従って加えた。
【００６１】
結果
トランスジェニックマウスの脾臓は、野生型マウスの脾臓と比較して肥大しており（図４Ａ、４Ｂ）、脾臓重量／体重比は野生型マウスの比よりも３から４倍高かった（表１）。興味深いことに、該比は年齢であまり変化しなかった。
【００６２】
【表１】
【００６３】
３月齢トランスジェニックマウスの白血球数（ＷＢＣ）は、正常同年齢のマウスについての末梢血ｍｌ当たり４０Ｘ１０６±１．５Ｘ１０６と比較して、末梢血ｍｌ当たり１０Ｘ１０６±１Ｘ１０６であった。トランスジェニックマウスのＷＢＣについては、６月齢で幾分低く、野生型同年齢のマウスについて末梢血ｍｌ当たり４０Ｘ１０６±１．５Ｘ１０６の変化しない値と比較して、末梢血ｍｌ当たり６Ｘ１０６±０．５Ｘ１０６の値を有した。
【００６４】
３月齢トランスジェニックマウスの脾臓（ヘマトキシリン／エオシン染色）の病理組織診断は、赤色髄に侵入する及び拡大する一貫した非定型リンパ球集団を特色とする。胚濾胞は影響されておらず、及び二次血球生成の多病巣がある（図５Ａ）。組織学的には、６月齢のマウスは、著しい非定型性及び芽細胞外観を有し、赤色髄の血管通路中で増殖し、及び徐々に白色髄を置換している非常に増加した悪性リンパ球集団を示した。胚濾胞の数は減少しており、脾臓の全アーキテクチャが非定型リンパ球増殖により歪められていた（図５Ｂ）。組織学的に類似のリンパ球集団が６月齢マウスの骨髄に存在していた。増殖抗原、Ｋｉ６７の発現は、野生型マウスでは観察されなかった著しい非定型リンパ球増殖をトランスジェニックマウスで示した（図５Ｄ）。
【００６５】
トランスジェニック脾臓中の非定型リンパ球増殖の免疫組織学的分析は、Ｂ２２０及びＶｐｒｅＢｌ（ＣＤ１７９ａ）についての非定型拡大リンパ球の低い陽性を示したが、ＣＤ４３は陰性であった（データは示されていない）。トランスジェニックマウスの脾臓パラフィン包埋切片のＩｇＭ染色は、増殖しているリンパ球の細胞質中にμ鎖の存在を示した（図６）。対照的に、フローサイトメトリー分析は、これらの細胞の表面上に、ＩｇＭの発現を同定することに失敗しており、拡大リンパ球細胞は細胞質μ鎖を発現するが、表面ＩｇＭを発現しないことを示している。
【００６６】
３、６又は７週齢又は６月齢のトランスジェニック及び野生型マウスの、脾臓及び骨髄両方からのＷＢＣの単細胞懸濁液で実施したフローサイトメトリー分析は、トランスジェニックマウスの脾臓及び骨髄の両方におけるＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球の数が、野生型対応物のものと比較して、増加を示した。この表現型は、ヒト急性リンパ芽球性白血病又はリンパ芽球性リンパ腫で観察された増殖リンパ球の表現型と似ている。これらの発見は、３週齢のトランスジェニックマウスの脾臓においてのＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ系集団は、野生型マウスの脾臓中での１．６５％のみと比較し、全ゲーテッド（gated）リンパ系集団の９％である（一匹のトランスジェニック及び一匹の野生型マウスで評価された）。６週齢では、これらのパーセンテージはトランスジェニックマウスの脾臓で６．６±１．４％、及び７週齢では４．７±０．３％となったが、一方、野生型脾臓では変化しなかった（二匹のトランスジェニックマウスが二つの異なった初代系統から、及び二匹の野生型マウスが分析された）。
【００６７】
６月齢のトランスジェニックマウスの骨髄において、野生型と比較して、Ｂ２２０１ｏｗ／ＩｇＭ−発現により定義されるプレＢ細胞集団の増加が観察された（図７及び８）。Ｂ２２０１ｏｗ／ＩｇＭ−細胞集団の前方散乱分析は、これらの細胞が大型の芽球様細胞であることを示した（データは示されていない）。
フローサイトメトリー、組織学的及び免疫組織化学的分析に基づき、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−と定義されたプレＢ細胞増殖がトランスジェニックマウスの脾臓及び骨髄中で起こり、そして３週齢ですでに検出可能であった。この増殖は、最後には、しばしば高悪性度Ｂ細胞悪性腫瘍と関係があることを特色とする、脾腫、骨髄置換及び著しいリンパ球減少症を生じる。この特徴付けと一致して、全てのトランスジェニックマウスは６月齢までに、全て健康であった野生型対照と比較して（１１匹の内の１１匹の野生型マウス）、高悪性度Ｂ細胞新生物を発生した（７匹の内の７匹のトランスジェニックマウス）。とりわけ、ｍｉＲ１５５を過剰発現しないトランスジェニックマウス系統も又正常であった。
【００６８】
実施例３：Ｅμ−ｍｍｕ−ｍｉＲ１５５トランスジェニックマウスの細胞遺伝学的分析
材料及び方法
細胞遺伝学：
大腿骨髄をＲＰＭＩ培地１６４０／２０％ＦＢＳで洗い流し、５ｍｌの１％ヘパリン含有ＲＰＭＩ培地１６４０／２０％ＦＢＳに集めた。細胞を増殖させ、標準細胞学的技術を用いて染色体欠失、転座、逆位、及びメタフェーズの数を評価した。
【００６９】
Ｉｇ重鎖転位：
プローブは、以下のオリゴヌクレオチドプライマ−を使用してマウスゲノムＤＮＡのＩｇ重鎖領域のＪＨ４断片中の配列を増幅することにより設計した：フォワード、5’-TGAAGGATCTGCCAGAACTGAA-3’（配列番号３）及びリバース、5’-TGCAATGCTCAGAAAACTCCAT-3’（配列番号４）。
【００７０】
トランスジェニック及び野生型マウスの脾臓を、ＰＢＳ中、すりガラスの間で解離させ、塩化アンモニウムで処理して赤血球を溶解し、遠心分離し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。ＤＮＡを脾臓の白血球から抽出し、そしてＥｃｏＲＩ、ＳｔｕＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡをHybond N+ 膜上にブロットし、γ−３２Ｐで放射活性的に標識されたＪＨ４プローブとハイブリダイズさせ、PhosphorImager スクリーンへ暴露し、Typhoon スキャナーを使用して処理した。
【００７１】
結果
脾細胞の核型の細胞遺伝学的研究は、正常同腹子からの脾臓と比較し、トランスジェニックマウスからのからの脾臓における一貫した染色体異常を同定することに失敗した。しかしながら、いくつかのゲノム変化が時折観察された（図９；矢印参照）。これらの結果は、プレＢ細胞の拡大した集団は二倍体であり、及び細胞遺伝学的に準正常であることを示している。クローン性を検出するため、Ｖ（Ｄ）Ｊ転位を評価する多消化酵素を使用し、３から６週齢のマウスからの脾細胞ＤＮＡに対してサザンブロット分析を実施した。野生型マウスと比較し、トランスジェニックマウスにおいて転位したバンドの存在は検出されなかった（図１０）、但し一匹のトランスジェニックマウスは、異なった制限酵素のそれぞれで実施されたサザンブロット上に一貫した転位バンドを有していた（データは示されていない）。これらのデータは、この年齢のマウスにおけるＢ細胞集団は、大部分、少なくとも６週齢まではポリクローナルであったことを示している。悪性腫瘍の大部分はモノクローナルであるので、この発見は、ｍｉＲ１５５が、癌で活性化されるシグナル伝達経路の下流標的である可能性を示唆している。
【００７２】
興味深いことに、ｍｉＲ１５５の過剰発現は、乳癌及び結腸癌のような固形腫瘍、ならびに肺癌で観察されており、ｍｉＲ１５５の過剰発現は予後不良の指標であった（Volinia, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2257- 2261 (2006)）。
【００７３】
実施例４：マイクロアレイ発現プロファイリングはＶｐｒｅＢ１ ｍＲＮＡ及び他の標的の上方調節を明らかにする
材料及び方法
ＲＮＡ単離：
全ＲＮＡ単離は、使用説明書に従ってトリゾール試薬（Invitrogen）で実施した。
【００７４】
ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング：
ＲＮＡ標識及びｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ上のハイブリダイゼーションは記載されているように（Liu, C.G., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9740-9744）実施した。簡単には、５μｇの各サンプルからの全ＲＮＡは、５’ビオチン末端標識ランダムオクタマーオリゴヌクレオチドプライマ−を使用する逆転写によりビオチンで標識した。ビオチン標識化ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを、２４５のヒト及び２００のマウスｍｉＲＮＡ遺伝子を含む８００のｍｉＲＮＡプローブを含有するｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ（Ohio State University, Ver. 2.0）上で四重に実施した。ハイブリダイゼーションシグナルを、Axon スキャナー4000B（Axon Instruments, Union City, CA）を使用する、ビオチンへのストレプトアビジン−アレキサン（Alexa）６４７複合物の結合により検出した。画像はGENEPIX 6.0 ソフトウエア（Axon Instruments）により定量した。
【００７５】
ｍＲＮＡ発現プロファイリング：
４５，０００より多くの特徴付けられた遺伝子及び発現された配列タグのためのプローブセットを含有するGeneChip Mouse genom 430 2.0 アレイ（Affymetrix）を使用した。サンプル標識及びプロセシング、GeneChip ハイブリダイゼーション及びスキャニングはAffymetrix プロトコールに従って実施した。簡単には、二重鎖ｃＤＮＡを、３’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位（Genset, La Jolla, CA）を付加するSuperscript Choice System（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡから合成した。ビオチン化ｃＲＮＡをインビトロでｃＤＮＡから発生させ、BioArray Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ標識キット（Enzo Diagnostics）を使用して増幅した。ｃＲＮＡの精製後、RNeasyミニキット（Qiagen, Hilden, Germany）を使用し、２０μｇのｃＲＮＡを９４℃で３５分断片化した。およそ１２．５μｇの断片化ｃＲＮＡは、ハイブリダイゼーション効率の内部対照として働かせるためのニシン精子ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ；Promega）＋細菌及びファージ対照（１．５ｐＭ ＢｉｏＢ、５ｐＭ ＢｉｏＣ、２５ｐＭ ＢｉｏＤ及び１００ｐＭ Ｃｒｅ）、を含有する２５０μｌのハイブリダイゼーション混合物で使用した。混合物の一定分量（２００μｌ）を、GeneChip ハイブリダイゼーションオーブン６４０（Affymetrix）中、４５℃で１８時間、アレイにハイブリダイズさせた。各アレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Invitrogen）で染色し、そしてGeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix）上、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Vector Laboratories）で増幅した。アレイをGeneArray G7スキャナー（Affymetrix）でスキャンし、画像及びシグナル強度を得た。
【００７６】
結果
マイクロアレイ分析を、５匹のトランスジェニックマウス（ｍｉＲ１５５導入遺伝子を発現しない１匹のマウスを含む）の脾臓白血球、及び６匹の野生型同腹子対応動物の白血球から抽出した全ＲＮＡに対して実施した。該分析は、野生型同腹子対照マウスと比較し（データは示されていない）、ｍｉＲ１５５を過剰発現するトランスジェニックマウスはｍｉＲ１５５、ｍｉＲ１９４、ｍｉＲ２２４、ｍｉＲ２１７及びｍｉＲ１５１の発現が１０〜２０倍増加し（表３）、及びｍｉＲ１４６及びｍｉＲ１３８の発現は２〜３分の１に減少した。Affymetrix マイクロアレイチップを使用し、トランスジェニックマウスの同一群におけるｍＲＮＡの差次的発現を研究し、同腹子対照におけるｍＲＮＡ発現と比較した。Affymetrix マイクロアレイデータの統計的解析は、ｍｉＲ１５５過剰発現マウスにおいて、２００の増殖関連遺伝子が上方制御され、及び５０の遺伝子が下方制御されていたことを示した（表３）。とりわけ、プレＢ細胞の増殖が行われる時に起こることが予期されるＶｐｒｅＢｌ ｍＲＮＡが上方制御されていた。これらのデータは、フローサイトメトリー分析及び免疫組織化学からのデータを補完する。
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】
【００８３】
【表８】
【００８４】
【表９】
【００８５】
【表１０】
【００８６】
【表１１】
【００８７】
【表１２】
【００８８】
【表１３】
【００８９】
【表１４】
【００９０】
【表１５】
【００９１】
参照文献として明確に援用されていなかった、本明細書で引用されたすべての出版物の関連する教示は、その全体が本明細書において援用される。本発明はそれらの好ましい態様に関して特定的に示され及び記述されてきたが、付随する特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から離れることなく、形態及び詳細の多様な変更をその中で行えることを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成されている少なくとも一つの図を含む。カラーの図を含む本特許又は特許出願の印刷物は、依頼及び必要な料金の支払い後、本事務所により提供されるであろう。
【図１】図１は、妊娠中のＣ５７／Ｂ６及びＦＶＢ／Ｎメスマウスの卵母細胞の雄性前核に注入されたｍｉＲ１５５導入遺伝子構築物を示している模式図である。ｍｉＲ１５５導入遺伝子構築物は、ＶＨプロモーターＥμエンハンサーの下流のＥｃｏＲＶ及びＳａｌＩ部位間にｍｍｕ−ｍｉＲ１５５遺伝子を挿入することにより作製された。
【図２】図２Ａは、７匹のｍｉＲ１５５トランスジェニック初代（レーン１、３、５、６、７、１０及び１４）及びＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドを有する８匹の野生型（レーン２、４、８、９、１１、１２、１３及び１５）マウスの遺伝子型を示しているサザンブロットである。図２Ｂは、８匹のｍｉＲ１５５トランスジェニック初代（レーン１、３、５、７、９、１１、１３及び１５）及びＦＶＢ／Ｎｆバックグラウンドを有する７匹の野生型（レーン２、４、６、８、１０、１２及び１４）マウスの遺伝子型を示しているサザンブロットである。
【図３】図３は、プローブとしてｍｍｕ−ｍｉＲ１５５成熟配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、１５のトランスジェニック系統の内の６の３週齢マウスの脾臓から単離されたリンパ球中の、成熟ｍｉＲ１５５の発現を示している全ＲＮＡのノーザンブロット法である。脾細胞中に成熟ｍｉＲ１５５の最も高い発現を有する５トランスジェニック系統（レーン１、２、５、８及び９）をさらなる繁殖及び分析のために選択した。１つのトランスジェニック系統は導入遺伝子を発現しなかった（レーン３）。導入遺伝子発現は、野生型対照からはなかった（レーン４、６及び７）。
【図４】図４Ａは、６月齢で、野生型と比較し、臨床的に明白な脾腫のためにかなりの腹部腫脹（左）を有するトランスジェニックマウスを示している写真である。図４Ｂは、図４Ａで示したマウスの脾臓を示している写真である。トランスジェニックマウスの脾臓は（左）、白血病／リンパ腫細胞の拡大により肥大している。
【図５】図５Ａは、３週齢トランスジェニックマウス（マウス番号５０；初代番号１０）からの脾臓のヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。切片は、白色髄を圧迫している非定型リンパ増殖を示している。図５Ｂは、６月齢トランスジェニックマウス（初代番号８）からの脾臓のＨ＆Ｅ染色切片を示している１００倍での顕微鏡写真である。脾臓の全アーキテクチャは非定型リンパ様増殖により置き換えられている。ごくわずかな胚リンパ濾胞が残存し、それは大きさが非常に減少し、該増殖により圧縮されていた。図５Ｃは、６月齢トランスジェニックマウス（初代番号８）からの脾臓のＨ＆Ｅ染色切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。脾臓アーキテクチャはほとんど完全にリンパ芽球性増殖により削除されていた。２つの小さな圧縮されたリンパ濾胞の残余物が見られる。図５Ｄは、６月齢トランスジェニックマウス（初代番号８）からの骨髄のＨ＆Ｅ染色切片を示している４００倍での顕微鏡写真であり、造血増殖巣の置換を導く、骨髄中のリンパ芽球性増殖を示している。図５Ｅは、正常脾臓のＨ＆Ｅ染色切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。図５Ｆは、３週齢トランスジェニックマウス（マウス番号７２）からの脾臓の切片を示している２００倍での顕微鏡写真である。切片はＫｉ６７について染色されており、脾臓中の増加した非定型リンパ様増殖を示している。
【図６】図６は、ＩｇＭについて免疫組織化学的染色された、３週齢トランスジェニックマウス（マウス番号５０）からの脾臓の切片における非定型リンパ様増殖を示している４００倍での顕微鏡写真である。トランスジェニックマウスにおいてＩｇＭは、褐色核周囲輪として増殖しているリンパ球の細胞質（ｃｌｇＭ）に存在し、一方、野生型リンパ球は、ｓＩｇＭ及びｃＩｇＭ両方の存在のため、明瞭な核を有さない、強い褐色である。
【図７】図７Ａは、初代の２つの異なった系統（初代８及び１０）からのトランスジェニックマウスの脾臓におけるリンパ球の、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−集団の拡大を示しているフローサイトメトリー分析プロファイルである。3週齢（トランスジェニックマウス番号７４、初代８（７４ＴＧ；左上）及び野生型マウス番号６８（６８ＷＴ；右上））及び７週齢（トランスジェニックマウス番号１５６、初代１０（１５６ＴＧ；左下）及び野生型マウス番号１５７（１５７ＷＴ；右下））での２匹のトランスジェニックマウス及び２匹の野生型マウスについてのゲーテッド脾細胞が示されている。野生型に関し、プロットの左上象限（Ｂ２２０＋ＩｇＭ集団をゲーティング）の比較は、トランスジェニック脾臓中の前駆体Ｂ細胞数の増加を示している。図７Ｂは、初代８からのトランスジェニックマウスの骨髄におけるリンパ球の、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９ｌｏｗ／ＣＤ１０ｌｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−集団の拡大を示しているフローサイトメトリー分析プロファイルである。６月齢での、１匹のトランスジェニック及び１匹の野生型マウス（トランスジェニックマウス番号８（８ＴＧ；左）及び野生型マウス番号２４（２４ＷＴ；右））についてのゲーテッド骨髄白血球が示されている。野生型に関し、２つのプロットの右上象限の比較は、トランスジェニックマウスの骨髄の２００＋ＩｇＭ＋ゲーテッド成熟Ｂ細胞集団の減少を示している。
【図８】図８Ａは、７週齢での野生型マウス番号２２３（２２３ＷＴ）のＢ２２０＋ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＢ２２０−ＰＥ発現を示しているグラフである。図８Ｂは、７週齢での野生型マウス番号２２３（２２３ＷＴ）のＢ２２０＋ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＣＤ１０−ＦＩＴＣ発現を示しているグラフである。図８Ｃは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２２（２２２ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＢ２２０−ＰＥ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウスにおけるＢ２２０low集団（Ｂ２２０−及びＢ２２０＋の２つのピーク間に間在している）の注目すべき増加を示している。図８Ｄは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２２（２２２ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＣＤｌ０−ＦＩＴＣ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウス中のＢ２２０＋−ゲーテッド集団中にのみＣＤ１０＋集団のパーセンテージの増加を示しており、該Ｂ２２０ｌｏｗ増殖は、少なくとも一部、ＣＤ１０＋集団の増加によることを示している。図８Ｅは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２１（２２１ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＢ２２０−ＰＥ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウスにおけるＢ２２０low集団（Ｂ２２０−及びＢ２２０＋の２つのピーク間に間在している）の注目すべき増加を示している。図８Ｆは、７週齢のトランスジェニックマウス番号２２１（２２１ＴＧ）のＢ２２０＋−ゲーテッド脾細胞に対するフローサイトメトリー分析により評価されたＣＤｌ０−ＦＩＴＣ発現を示しているグラフであり、野生型マウスと比較して、トランスジェニックマウス中のＢ２２０＋−ゲーテッド集団中にのみＣＤ１０＋集団のパーセンテージの増加を示しており、該Ｂ２２０ｌｏｗ増殖は、少なくとも一部、ＣＤ１０＋集団の増加によることを示している。
【図９】図９は、染色体欠失、転座及び逆位、ならびにメタフェーズの数について分析された、トランスジェニック脾臓から単離されたリンパ球系細胞の核型である。矢印は、厚い余分のバンドの存在により同定された、染色体９中の異常を示している。
【図１０】図１０は、３から６週齢の間の、５匹のトランスジェニック（ＴＧ）及び４匹の野生型（ＷＴ）マウスの脾細胞から抽出されたＤＮＡについてのサザンブロットである。サザンブロットハイブリダイゼーションは、ＪＨ４プローブ及びレーンの上に示されている異なった消化酵素（ＳｔｕＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を使用して実施した。高分子量の厚いバンドは、生殖細胞系と一致する。野生型と比較して、トランスジェニック動物には転位したバンドはなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムが該動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなり、前記転写調節配列が、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
該少なくとも一つの転写調節配列が、ＶＨプロモーターを含んでなる、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
該少なくとも一つの転写調節配列が、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
該核酸が、配列番号１及び／又は配列番号２を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
該ＶＨプロモーターがマウスに由来する、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
該Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーがマウスに由来する、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
該動物がマウスである、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
該動物が、適した対照と比較し、脾臓、骨髄又はその両方にＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９１ｏｗ／ＣＤ１０１ｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団を有する、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
該動物がリンパ球増殖性状態を示す、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
該リンパ球増殖性状態がＢ細胞悪性腫瘍である、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が白血病、リンパ腫又は新生物である、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
該リンパ球増殖性状態が前白血病の状態である、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
該動物がＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９１ｏｗ／ＣＤ１０１ｏｗ／ｌｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせを示す、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
該核酸構築物が、βグロビン遺伝子の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含んでなる、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１５】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムが、配列番号１及び／又は配列番号２を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている、ＶＨプロモーター及びＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる核酸構築物を含んでなる、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
剤が対象のリンパ球増殖性状態に影響するかどうかを決定する方法であって：
ａ）そのゲノムが、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、該動物のＢ細胞中での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物、を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物に前記剤を投与すること；及び
ｂ） 前記トランスジェニック動物に前記剤を投与した後、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を、同一遺伝子型の対照動物と比較することを含んでなり、ここで該対照動物に前記剤は投与されておらず、
前記対照動物と比較し、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の前記一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候の、検出能及び／又は出現比における相違は、該剤が該リンパ球増殖性状態の影響していることを示す、前記方法。
【請求項１８】
対象のリンパ球増殖性状態を治療すること又は予防することにおいての剤の治療効力を試験する方法であって：
（ａ）前記剤を、そのゲノムが該動物のＢ細胞中での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物に投与すること、ここで該転写調節配列は、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されており；及び
（ｂ）前記トランスジェニック動物に前記剤を投与した後、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を、同一遺伝子型の対照動物と比較することを含んでなり、ここで該対照動物に前記剤は投与されておらず、
もし前記剤が、前記対照動物と比較し、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の前記一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を抑制する、予防する及び／又は軽減するならば、前記剤は対象におけるリンパ球増殖性状態を治療すること又は予防することにおいて治療効力を有していると考えられる、前記方法。
【請求項１９】
該少なくとも一つの転写調節配列が、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー又はそれらの組み合わせを含んでなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
該転写調節配列がマウスに由来する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
該核酸が、配列番号１及び／又は配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
該トランスジェニック動物がマウスである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
該リンパ球増殖性状態がＢ細胞悪性腫瘍である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞新生物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
該リンパ球増殖性状態が前白血病状態である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
該前白血病の状態がプレＢ細胞増殖により特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記リンパ球増殖性状態の該一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候が、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９１ｏｗ／ＣＤ１０１ｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムが該動物のＢ細胞中の発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなり、前記転写調節配列が、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
該少なくとも一つの転写調節配列が、ＶＨプロモーターを含んでなる、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
該少なくとも一つの転写調節配列が、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
該核酸が、配列番号１及び／又は配列番号２を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
該ＶＨプロモーターがマウスに由来する、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
該Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサーがマウスに由来する、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
該動物がマウスである、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
該動物が、適した対照と比較し、脾臓、骨髄又はその両方にＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９１ｏｗ／ＣＤ１０１ｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団を有する、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
該動物がリンパ球増殖性状態を示す、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
該リンパ球増殖性状態がＢ細胞悪性腫瘍である、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が白血病、リンパ腫又は新生物である、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
該リンパ球増殖性状態が前白血病の状態である、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
該動物がＢ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９１ｏｗ／ＣＤ１０１ｏｗ／ｌｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせを示す、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
該核酸構築物が、βグロビン遺伝子の３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含んでなる、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１５】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す、前記請求項のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムが、配列番号１及び／又は配列番号２を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている、ＶＨプロモーター及びＩｇ重鎖Ｅμエンハンサーを含んでなる核酸構築物を含んでなる、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
剤が対象のリンパ球増殖性状態に影響するかどうかを決定する方法であって：
ａ）そのゲノムが、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、該動物のＢ細胞中での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物、を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物に前記剤を投与すること；及び
ｂ） 前記トランスジェニック動物に前記剤を投与した後、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を、同一遺伝子型の対照動物と比較することを含んでなり、ここで該対照動物に前記剤は投与されておらず、
前記対照動物と比較し、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の前記一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候の、検出能及び／又は出現比における相違は、該剤が該リンパ球増殖性状態の影響していることを示す、前記方法。
【請求項１８】
対象のリンパ球増殖性状態を治療すること又は予防することにおいての剤の治療効力を試験する方法であって：
（ａ）前記剤を、そのゲノムが該動物のＢ細胞中での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物に投与すること、ここで該転写調節配列は、配列番号１及び／又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列含んでなるｍｉＲ１５５遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されており；及び
（ｂ）前記トランスジェニック動物に前記剤を投与した後、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を、同一遺伝子型の対照動物と比較することを含んでなり、ここで該対照動物に前記剤は投与されておらず、
もし前記剤が、前記対照動物と比較し、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の前記一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候を抑制する、予防する及び／又は軽減するならば、前記剤は対象におけるリンパ球増殖性状態を治療すること又は予防することにおいて治療効力を有していると考えられる、前記方法。
【請求項１９】
該少なくとも一つの転写調節配列が、ＶＨプロモーター、Ｉｇ重鎖Ｅμエンハンサー又はそれらの組み合わせを含んでなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
該転写調節配列がマウスに由来する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
該核酸が、配列番号１及び／又は配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
該トランスジェニック動物がマウスである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
該リンパ球増殖性状態がＢ細胞悪性腫瘍である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞新生物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
該Ｂ細胞悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
該リンパ球増殖性状態が前白血病状態である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
該前白血病の状態がプレＢ細胞増殖により特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記リンパ球増殖性状態の該一つ又はそれより多くの症状及び／又は徴候が、Ｂ２２０１ｏｗ／ＣＤ１９１ｏｗ／ＣＤ１０１ｏｗ／ＩｇＭ−／ＴＣＲ−／ＣＤ４３−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５３４０５１（Ｐ２００９−５３４０５１Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０７７５５（Ｐ２００９−５０７７５５）
【出願日】平成１９年４月２４日（２００７．４．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００９９１０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２７１９０
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５９３１７２０５０）ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション (33)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＯＨＩＯ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２４日（２００７．４．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００９９１０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２７１９０
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５９３１７２０５０）ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション (33)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＯＨＩＯ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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