突然変異βＣＴＦ９９を発現するアルツハイマー病誘発形質転換マウス
本発明は、アルツハイマー病誘発形質転換動物に関し、より具体的には、インディアナ突然変異（βＣＴＦ９９）を有する突然変異ヒトベータアミロイドタンパク質のＣ末端切片を含む動物形質転換用ベクター、及び、これを受精卵の核に移植して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスに関する。本発明の形質転換マウスは、認知能力及び記憶力の減少、不安感の増加のようなアルツハイマー病の臨床的症状を現わした。したがって、本発明の形質転換マウスは、アルツハイマー病を研究するための動物モデルになり得る。特に、本発明の形質転換マウスは、当業界に公知のアルツハイマー病に関する他の形質転換動物モデルよりさらに著しく不安感の増加を現わすため、不安感に関わる疾患用動物モデルとして使用できる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、アルツハイマー病誘発形質転換マウスに関し、より具体的には、突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質の一部を導入して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ベータ−アミロイドペプチド（β−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「Ａβ」と略称する）の生産量増加は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）の病理症状において必須に作用すると報告された。Ａβは、β−セクレターゼ（ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）及びγ−セクレターゼによってＡＰＰタンパク質が順次プロテオリティック（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断されて形成される。プレセニリン−１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１、以下「ＰＳ１」と略称する）は、γ−セクレターゼ及びその基質のトラフィック（ｔｒａｆｆｉｃ）を調節するか、γ−セクレターゼの主要素になり得る（Ｅｓｌｅｒ ＷＰ ａｎｄ Ｗｏｌｆｅ ＭＳ、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１４４９−１４５４）。したがって、ＰＳ１はアルツハイマー病の症状の発現を遅らせるか、これを治療するための標的になると考えられた（Ｅｓｌｅｒ ＷＰ ａｎｄ Ｗｏｌｆｅ ＭＳ、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１４４９−１４５４；Ｌｉ ＹＭ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０５：６８９−６９４）。しかし、γ−セクレターゼ抑制剤を使用したとき、β−セクレターゼによって切断されたカルボキシル末端切片（βＣＴＦ）が蓄積される可能性は、実際に明らかであるとはされていない。
【０００３】
条件的遺伝子除去（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）方法に関する近年の研究においては、ＰＳ１欠損マウスの致死を回避しながらも、脳特異的にＰＳ１が欠損された大人マウスを生産した（Ｙｕ Ｈ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｎｅｕｒｏｎ、３１：７１３−７２６；Ｄｅｗａｃｈｔｅｒ Ｉ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２：３４４５−３４５３）。ＰＳ１条件的突然変異遺伝子及びＡＰＰＶ７１７Ｉ突然変異遺伝子を共に発現する二重突然変異マウスに関する研究においては、ＰＳ１によるγ−セクレターゼ活性の除去によってＡβの生産を減少させ、プラークが蓄積され、かつ、海馬ＬＴＰの不均衡から解放されたものの、ＡＰＰＶ７１７Ｉ形質転換マウスで現れる記憶力の欠陷を修正できず（Ｄｅｗａｃｈｔｅｒ Ｉ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２：３４４５−３４５３）、相変らず脳では増加する神経生理学的（ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または病理学的徴候が進行された。たとえ基本的な作用機序がまだ完成されてはいないが、脳におけるγ−セクレターゼ活性減少によってβＣＴＦ９９が蓄積されるということを見せることで、これがプラーク蓄積の消失から現れる認識の欠陷を誘発することに潜在的な役割をすることを提案した。しかし、ＡＰＰＶ７１７Ｉ形質転換マウスで現れる他の生化学的不均衡または行動学的変化が復帰されたということに関してはまだ知られていない。ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）（Ｎａｒｕｓｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｎｅｕｒｏｎ、２１：１２１３−１２２１；Ｓｏｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９６：６９５９−６９５３）及びＮ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）プロセッシング（Ｍａｒａｍｂａｕｄ Ｐ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｃｅｌｌ、１１４：６３５−６４５）を含む脳における公知のＰＳ１の複合的機能の場合、二重突然変異マウスで観察される記憶力の消失がβＣＴＦ９９によって完全に形成されるかに関しては確かではない。
【０００４】
脳においてβＣＴＦ９９を発現する突然変異マウスを研究することで、生体内βＣＴＦ９９の作用に関するさらに直接的な証拠が得られる。これを確認するため、８つの個別的な研究グループにおいて、脳でヒトＡＰＰの多様な形態のＣＴＦを発現する形質転換マウスを製造した。これらの中４つのラインでは、１２ないし２８ヶ月齢で神経細胞的消失（Ｏｓｔｅｒ−Ｇｒａｎｉｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１６：６７３２−６７４１；Ｎａｌｂａｎｔｏｇｌｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８７：５００−５０５；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓｏｒｄ、８：２９６−３０７）または非正常的学習能力（Ｎａｌｂａｎｔｏｇｌｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８７：５００−５０５；Ｂｅｒｇｅｒ−Ｓｗｅｅｎｅｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、６６：１５０−１６２；Ｌａｒｏｎｄｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、９５６：３６−４４）を示したが、他の４つのラインでは神経細胞的消失または認知能力不均衡において明らかな欠陥を示していなかった（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６６：２１３３１−２１３３４；Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２：１００−１０６；Ｓｂｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７１：７２３−７３１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７２：２４７９−２４８７；Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．、１２：１１０−１２０）。したがって、前記開発されたＣＴＦを発現する形質転換マウスは、症状がないものからアルツハイマー病類似病理症状までの相反した結果を示すことが分かる。なぜなら、このような相反する結果の原因が確かではないため、βＣＴＦ９９の生体内作用に関しては正確に定義しにくい。
【０００５】
これに、本発明者らは、アルツハイマー病のモデル動物を製造するための努力を重ね、アルツハイマー病の臨床的特徴を表すのに必須のβＣＴＦ９９を大量に発現する形質転換マウスを製造し、これがアルツハイマー病の臨床的特徴を効果的に表せることを確認することで本発明を完成した。
【０００６】
〔発明の開示〕
〔技術的課題〕
本発明の目的は、アルツハイマー病誘発用形質転換ベクター及びこれを受精卵の核に移植して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスを提供することである。
【０００７】
〔技術的解決方法〕
前記の目的を達成するため、本発明は、突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端切片（ＣＴＦ）をコードする遺伝子を含むアルツハイマー病誘発用形質転換ベクターを提供する。
【０００８】
また、本発明は前記形質転換ベクターをマウスの受精卵の核に移植して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスを提供する。
【０００９】
〔発明の効果〕
本発明の形質転換マウスは、モリスの水迷路テストでは、正常マウスに比べて認知能力が衰え記憶力が減少する結果を示し、受動的回避テストでは、記憶力維持能力が減少した。また、高架式十字迷路テストでは、正常マウスに比べて相当な不安感の増加をみせ、従来に製作されたアルツハイマー病のモデル動物よりアルツハイマー病の臨床的特徴をよく表していることを確認した。したがって、本発明において製造した形質転換マウスは、記憶力及び認知能力の減少、不安感増加のようなアルツハイマー病の臨床的特徴をそのまま表すことが分かり、アルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【００１０】
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１１】
本発明は、突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端切片（Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＣＴＦ）をコードする遺伝子を含むアルツハイマー病誘発用形質転換ベクターを提供する。
【００１２】
前記突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端切片は、配列番号１で記載されるＡＰＰ７７０タンパク質の７１７番目アミノ酸バリン（Ｖ）をフェニルアラニン（Ｆ）で置換したＶ７１７Ｆ突然変異が誘導されたＡＰＰＶ７１７Ｆタンパク質のＣ末端切片アミノ酸を含むタンパク質である。すなわち、突然変異誘導されたＡＰＰＶ７１７Ｆタンパク質のＣ末端切片アミノ酸は、配列番号３で記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質であることが望ましい。本発明の望ましい実施例においては、配列番号２で記載されるＡＰＰＶ７１７ＦｃＤＮＡの２番目半ば部分を鋳型として用いてＰＣＲ増幅することで配列番号３で記載される突然変異βＣＴＦ９９を製造し、これを「βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）」と命名した。
【００１３】
また、本発明の形質転換ベクターは、ＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする、突然変異遺伝子（βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ））及びＳＶ４０ポリアデニル化遺伝子を含むことが望ましい。前記突然変異遺伝子の前側には、翻訳効率を高めるためにコザック配列（Ｋｏｚａｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含ませることもできる。本発明においては、ＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、コザック配列、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする、突然変異遺伝子（βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ））及びＳＶ４０ポリアデニル化遺伝子を含むように形質転換ベクターを製造し、これを「ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ」と命名した（図１参照）。
【００１４】
また、本発明の形質転換ベクターは、ＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子とβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子間に、さらにヒトβ−グロビン遺伝子から誘導されたイントロンＢ遺伝子を含むことが望ましい。前記ヒトβ−グロビン遺伝子から誘導されたイントロンＢ遺伝子は、突然変異遺伝子の発現効率を増加させ、転写安定度を増加させるために挿入したものであり、本発明においてはＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、ヒトβ−グロビン遺伝子から誘導されたイントロンＢ遺伝子、コザック配列、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする、突然変異遺伝子（βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ））及びＳＶ４０ポリアデニル化遺伝子を含むように形質転換ベクターを製造し、これを「ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ」と命名した（図１Ａ参照）。
【００１５】
また、本発明は、前記形質転換ベクターをマウスに導入して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスを提供する。
【００１６】
本発明の形質転換マウスに導入される形質転換ベクターは、ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡまたはＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡであることが望ましく、ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡであることがさらに望ましい。本発明の望ましい実施例においては、前記ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡまたはＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターをそれぞれＣ７５ＢＬ／６マウスの未受精卵の前核に微細注入し、これを代理母に移植して生まれた子孫及びこれを近交配して生まれた子孫から発現されるβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子の発現様相を比べた結果、イントロンが導入されたＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターが導入された形質転換マウスにおいて、より高い発現を示し、本発明のβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を効率的に導入させて高い発現を示すためにはＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターで導入することが望ましいことが分かった。
【００１７】
本発明においては、ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターを受精卵の核に移植して製造した形質転換マウスを「Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６」と名付け、前記マウスにおいてβＣＴＦ遺伝子の発現及びβＣＴＦタンパク質の発現水準を分析した後、本発明の突然変異βＣＴＦ遺伝子が効果的に導入されてタンパク質水準まで発現することを確認し、２００３年３月１０日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０６０９ＢＰ）。
【００１８】
本発明のアルツハイマー病誘発形質転換マウス（Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６）は、海馬でカルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）とリン酸化されたＣＲＥＢタンパク質の発現量が漸進的に、そして年齢依存的に減少する傾向を呈する。また、ヒトアルツハイマー病患者の脳で発見される臨床的特徴である神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、運動性の減少（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｔ）、認知能力消失（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｔ）及び不安感の増加を示す。
【００１９】
まず、本発明の望ましい実施例においては、１４ないし１５ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬部位でカルビンジンの発現が非常に減少することを確認した（図５参照）。カルビンジンは、パルブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ）とカルレチニン（ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）とともにカルシウム結合タンパク質を構成し、これは前頭（ｆｒｏｎｔａｌ）、側頭（ｔｅｍｐｏｒａｌ）及び内側嗅領（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ）及び海馬を含む多様な部位の脳においてＧＡＢＡ性（ＧＡＢＡｅｒｇｉｎ）及びピラミッド細胞型のニューロンを示す（Ｍｉｋｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、９２：５１５−５３２）。カルシウム結合タンパク質は、これらの緩衝作用によって細胞内におけるカルシウム濃度を調節する。細胞内カルシウム濃度の恒常性が保たれなければ、正常細胞の作用が不均衡になるか神経細胞の細胞毒性を誘発する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｎｅｕｒｏｎ、２１：１３−２６；Ｍａｔｔｓｏｎ、ＭＰ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２１：５３−５７；Ｃａｒａｆｏｌｉ、Ｅ．、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：１１１５−１１２２）。カルビンジンが欠乏されたマウスは、空間記憶力及びＬＴＰにおいて不均衡を見せた（Ｍｏｌｉｎａｒｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．、１９９６．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３：８０２８−８０３３）。老化するか神経変性が起こり、脳においてカルビンジンの発現が減少し、これにより病理学的変化が起きるようになる（Ｉａｃｏｐｉｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８７：４０７８−４０８２；Ｌｅｕｂａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１５２：２７８−２９１；Ｂｕ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１８２：２２０−２３１）。アルツハイマー病モデルが多く開発されたにもかかわらず、カルビンジンの減少と認知能力減少間の関係についての文献は、近年に製造されたヒト突然変異ＡＰＰを発現する形質転換マウスに関するものしかない（Ｐａｌｏｐ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１００：９５７２−９５７７）。したがって、本発明において確認したカルシウム結合タンパク質の減少は、認知能力の不均衡及びアルツハイマー病患者から発見される他の欠陷の原因になることが分かる。
【００２０】
次に、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスの海馬部位でリン酸化されたＣＲＥＢの発現が減少することを確認した（図６）。海馬において、アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドにより誘導されたＣＲＥＢ遺伝子の欠陷は長期間の記憶力形成不均衡を示し（Ｇｕｚｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４：２６９３−２６９８）、異性体ＣＲＥＢβの標的突然変異は非正常的な学習と記憶力を示した（Ｂｏｕｒｅｃｈｕｌａｄｚｅ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：５９−６８；Ｂｌｅｎｄｙ ｅｔ ａｌ．、１９９６、ＥＭＢＯ Ｊ．、１５：１０９８−１１０６）。一方、脳におけるＣＲＥＢ水準の増加は長期間の記憶力維持を増進させた（Ｊｏｓｓｅｌｙｎ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２１：２４０４−２４１２）。したがって、本発明の形質転換マウスにおいて現れるリン酸化されたＣＲＥＢの発現減少はアルツハイマー病患者から現れるものと同じ結果を示すことが確認でき、年齢依存的に認知力不均衡、神経変性及び不安感の増加を示すことがこのような結果によって現れることを確認し、本発明の形質転換マウスがアルツハイマー病誘発用マウスとして適していることが分かる。
【００２１】
次に、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスは、二重突然変異誘発形質転換マウスであるＴｇ２５７６＋ＰＳ１Ｐ２４６Ｌモデル（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）において観察される症状である増加したＪＮＫ活性をそのまま示し（図３参照）、アルツハイマー病患者の脳で観察される特性をそのまま示すことを確認した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７６：４３５−４４１；Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）。単一突然変異誘発形質転換マウスであるＴｇ２５７６マウスまたはＴｇ−ＰＳ１Ｐ２４６Ｌマウスは、リン酸化されたＪＮＫ活性の変化を見せなかったが（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）、本発明の形質転換マウスはリン酸化されたＪＮＫ活性の変化を見せた。しかも、本発明の形質転換マウスの脳ではＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現不均衡を見せた（図４参照）。本発明の形質転換マウスの脳においては、Ｂｃｌ−２、Ｂａｄ及びＢａｘタンパク質の発現がかなり増加する一方、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の発現は減少してＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現不均衡を見せていることが分かった。したがって、本発明の形質転換マウスで観察されるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現不均衡は、アルツハイマー病患者から見られる症状と類似であり（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ、１８：５６５−５７１；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、７８０：２６０−２６９）、本発明の形質転換マウスがアルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【００２２】
また、本発明の形質転換マウス（Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６）は、アルツハイマー病の臨床的特徴である運動性の減少（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｔ）、認知能力の消失（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｔ）及び不安感の増加を示した（図８ないし図１０参照）。本発明の望ましい実施例においては、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスがアルツハイマー病の臨床的特徴を示すかを確認するため、認知能力を分析できる開放範囲（Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）テスト、ロタ−ロッド（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ）テスト、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）テスト及び受動的回避（Ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ）テストを行い、不安感の増加症状を分析するために高架式十字迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ）テストを行った。その結果、開放範囲テストでは、正常マウスと移動能力において特に差がなかったが（図８Ａ参照）、ロタ−ロッドテストでは、正常マウスに比べて運動均衡能力において少し減少したことを示すものの有意性は示さなかった（図８Ｂ参照）。モリス水迷路テストでは、正常マウスに比べて認知能力が衰えて記憶力が減少する結果を示し（図９ＡないしＣ参照）、受動的回避テストでは記憶力維持能力が減少した（図９Ｄ参照）。また、高架式十字迷路テストでは、正常マウスに比べて不安感がかなり増加した（図１０参照）。したがって、本発明において製造した形質転換マウスは、記憶力及び認知能力の減少、不安感の増加のようなアルツハイマー病の臨床的特徴をそのまま示すことが分かり、アルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【００２３】
〔発明の実施のための形態〕
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。
【００２４】
但し、下記の実施例は本発明を例示するものであるだけであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００２５】
＜実施例１＞ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質ｃＤＮＡ遺伝子の確保及びβＣＴＦ９９突然変異遺伝子の製造
＜１−１＞ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質ｃＤＮＡ遺伝子の確保
ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ。以下「ＡＰＰ」と略称する）をコードするｃＤＮＡ遺伝子をヒト脳で構築されたマラソン−レディーライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）からＰＣＲ増幅して製造した。前記ｃＤＮＡはＡＰＰ７７０を基準として開放読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）の大きさが約２．３ｋｂであるため、一度に増幅しにくく、前記ｃＤＮＡを２つの部分に分けて前半部は配列番号６で記載されるａｐｐ−１ｆプライマー（５’−ｇｃａａｇｇｇｔｃｇｃｇａｔｇｃｔｇｃｃｃｇｇｔｔｔｇ−３’、下線はＮｒｕＩ制限酵素認識部位を示す）及び配列番号９で記載されるａｐｐ−２ｒプライマー（５’−ｇａｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｃｇｇｔｇｃｔｔｇｇｃｃ−５’）で増幅してからＮｕｒＩ及びＸｈｏＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）のＳｍａＩ及びＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いて挿入し、後半部は配列番号８で記載されるａｐｐ−２ｆプライマー（５’−ｃｃｔａｃｃａｃａｇｃａｇｃｃａｇｔａｃｃｃｃｔｇ−３’）及び配列番号７で記載されるａｐｐ−１ｒプライマー（５’−ｇｇｇｇｇａｃｔａｇｔｔｃｔｇｃａｔｃｔｇｃｔｃ−３’、下線はＳｐｅＩ制限酵素認識部位を示す）で増幅してからＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターのＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いて挿入した。前記ｃＤＮＡの前半部がクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断して生成されたＤＮＡ切片と、後半部がクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターをＸｂａＩ及びＸｈｏＩで切断して生成されたＣＮＡ切片とを、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターとともに結紮して全長ＡＰＰ ｃＤＮＡが挿入されたベクターコンストラクトを製造した。一方、選択的スプライシングによって、ヒトベータアミルロイドの同一遺伝子からコードされるタンパク質のアミノ酸残基の個数に応じて３つの異なる形態の異性体が生成される。すなわち、コードされるタンパク質のアミノ酸残基の個数に応じ、ＡＰＰ ｃＤＮＡにはＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ６９５が存在する。前記クローニングされたｃＤＮＡをＤＮＡ塩基配列分析を通じて確認した結果、前記３つの異性体の中、ＡＰＰ７５１（配列番号２）をコードする配列番号１で記載されるＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡであることが確認できた。
【００２６】
＜１−２＞ＡＰＰ７５１突然変異遺伝子の製造
ＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡにＰＣＲ方法で「Ｖ７１７Ｆ突然変異（ＡＰＰ７７０異性体を基準として７１７番目アミノ酸がバリンからフェニルアラニンに置換された突然変異）」を導入した。具体的に、前記実施例１−１で製造したＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡの後半部がクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターを鋳型にして配列番号８で記載されるａｐｐ−２ｆプライマーと配列番号１１で記載されるａｐｐ−７１７−ｒプライマー（５’−ｃａａｇｇｔｇａｔｇａａｇａｔｃａｃｔｇｔｃｇｃ−３’）で９５℃で１分間熱変性、５７℃で４０秒間プライマー結合、７２℃で１分間伸長反応を３２回繰り返す条件でＰＣＲ反応を施した。その後、配列番号１２で記載されるａｐｐ７１７−ｆプライマー（５’−ｇｃｇａｃａｇｔｇａｔｃｔｔｃａｔｃａｃｃｔｔｇ−３’）と配列番号７で記載されるａｐｐ−１ｒプライマー対を用いて前記と同じ条件でＰＣＲ反応を施した。前記２つのＰＣＲ反応の結果生成されたＰＣＲ産物は「Ｖ１７１Ｆ突然変異」部分を共通の配列として有しているので、前記２つのＰＣＲ産物を分離させた後、徐冷して、クレノウ酵素で延長して１つの切片に連結した。その後、前記繋がれた切片をａｐｐ−２ｆプライマー上に存在するＸｈｏＩ制限酵素認識部位、及び、ａｐｐ−１ｒプライマーに挿入されたＳｐｅＩ制限酵素認識部位を用いてＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで切断し、同様にあらかじめＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで切断したＡＰＰ ｃＤＮＡの後半部が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターに挿入し、突然変異ＡＰＰ７５１後半部ｃＤＮＡを製造した。一方、突然変異が誘発された前記ＤＮＡ切片でＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡ全長が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターの該当部位を置換して配列番号４で記載されるタンパク質をコードする配列番号３で記載される突然変異ＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡを製造し、これを「ｈＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ）」と命名した。突然変異されたｈＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子の塩基配列はＤＮＡ塩基配列分析を通じて確認した。
【００２７】
＜実施例１−３＞βＣＴＦ９９突然変異遺伝子の製造
配列番号１で記載されるヒトアミロイドベータ前駆タンパク質の７１７番目アミノ酸部位にＶ７１７Ｆ突然変異が誘導され、前記タンパク質のＣ末端アミノ酸配列を含むタンパク質を製造しようとした。具体的に、配列番号２で記載されるＡＰＰタンパク質にインディアナ突然変異を誘導したＡＰＰ７５１Ｖ７１７Ｆタンパク質（配列番号４）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３）を鋳型にして、Ｃ末端（６７２番目から７５１番目）断片をＰＣＲ増幅して突然変異遺伝子を製造した。前記実施例１及び２で製造したｈＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ） ｃＤＮＡが挿入されたベクターを鋳型にして配列番号２４で記載されるプライマーａｐｐ９９ｆ（５’−ｃｇａａｔｔｃｇａｔｇｃａｇａａｔｔｃｃ−３’）と配列番号７で記載されるａｐｐｒ−１ｒプライマーで９５℃で１分間熱変性、５７℃で４０秒間プライマー結合、７２℃で１分間伸長反応を３２回繰り返す条件でＰＣＲ反応を施した。生成されたＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で連結した。突然変異誘導されたＡＰＰタンパク質のＣ末端タンパク質は、配列番号１０で記載されるタンパク質であり、これをコードする配列番号５で記載される突然変異遺伝子を「βＣＴＦ９９」と命名した。突然変異された遺伝子の塩基配列はＤＮＡ塩基配列分析を通じて確認した。
【００２８】
前記製造された突然変異に信号ペプチドを挿入するため、信号ペプチドを有しているｐＫＳ−ａａｐ６９６−１／２ベクターを鋳型にして信号ペプチド部位をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーとしては、ＢｇｌII認識部位を有している配列番号２２で記載されるａｐｐ−ｓｉｇ−１ｆプライマー及びＥｃｏＲＩ認識部位を有している配列番号２３で記載されるａｐｐ−ｓｉｇ−１ｆプライマー対を使用し、９５℃で１分間熱変性、５５℃で１分間プライマー結合、７２℃で１分間伸長反応を３２回繰り返す条件でＰＣＲ反応を施した。ＰＣＲ増幅された産物はＢｇｌIIで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＥｃｏＲＩで切断した位置にサブクローニングした。
【００２９】
また、前記信号ペプチドタンパク質の翻訳効率を高めるため、前記信号ペプチドが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターを鋳型にしてＸｂａＩ認識部位及びコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｐｕｅｎｃｅ、ＧＡＣＣ）を有している配列番号１５で記載されるａｐｐ−ｋｏｚ−ｆプライマー及びＮｏｔＩ認識部位を有している配列番号２１で記載されるａｐｐ−ｋｏｚ−ｆプライマー対を用いてＰＣＲ増幅することで、信号ペプチドの開始コドン（ＡＴＧ）の前にコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＧＡＣＣ）を挿入した。前記ＰＣＲ増幅された産物をＸｂａＩ及びＮｏｔＩで切断した後、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳと連結してｐＫＳ−ｋｏｚａｐｐｓｉｇベクターを製作した。製作されたベクターをＥｃｏＲＩで切断し、前記製作されたβＣＴＦ９９ベクターをＥｃｏＲＩで切断して連結させれば、信号ペプチドとβＣＴＦ９９が結合された融合タンパク質を生産するベクターが製作される。このようにコザック配列、信号ペプチド、インディアナ突然変異誘導されたβＣＴＦ９９タンパク質をコードする遺伝子順に製造された再組み換えタンパク質を「βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）」と命名した。
【００３０】
＜実施例２＞βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を含む形質転換用発現カセットの製造
アルツハイマー性痴呆動物モデルを生産するため、βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を含む形質転換用発現カセットを製造した。具体的に、まず、配列番号１３で記載されるＳＶ４０ｐＡ−ｆプライマー（５’−ｔｃｃｃｃｇｃｇｇｒｃｃａｇａｃａｔｇａｔａａｇａｔａｃａｔｔｇａ−３’、下線はＳａｃII制限酵素認識部位を示す）と配列番号１４で記載されるＳＶ４０ｐＡ−ｒプライマー（５’−ｇｔｔｃｇａｇｃｔｃａｔａａｔｃａｇｃｃａｔａｃｃａｃａｔｔｔｇ−５’、下線はＳａｃＩ制限酵素認識部位を示す）でｐＧＫ−ｎｅｏ−ｐＡベクター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００２、１５：７９３１−７９４０）を増幅して、突然変異遺伝子のポリアデニル化信号のための大きさ２４７ｂｐのＳＶ４０−ｐＡ切片を収得し、これをＳａｃII及びＳａｃＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターに挿入した。次いで、ｐｓｉｓＣＡＴ６ａベクター（Ｓａｄａｈａｒａ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１９９１、６４（１）：２１７−２７）をＸｂａＩで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＨｉｎｄIIIで切断し、ヒト血小板来由成長因子ベータ（ｐｌａｔｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ、ＰＤＧＦ−ｂｅｔａ）プロモーター切片を収得した。その後、ＳａｌＩで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＨｉｎｄIIIで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターに前記収得したＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター切片を挿入した。次いで、前記ＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター切片が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIで切断して収得した大きさ約１．５ｋｂのＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター切片を、前記ＳＶ４０ ｐＡ部位が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターのＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIII部位を通じて挿入した。このようにして生成されたベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターの多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）の両側にそれぞれＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター及びＳＶ４０−ｐＡ部位が存在する構造になる。前記のように製造されたベクターに、開始コドンの前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＧＡＣＣ）を有する前記実施例１で製造したβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子を挿入して形質転換用発現カセットを製造した。最終的に、ＰＤＧＦ−βプロモーター−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡの順に発現カセットを製作し、これを「ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ」と命名した（図１Ａ）。
【００３１】
＜実施例３＞イントロンとβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を含む形質転換用発現カセットの製造
イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）は、突然変異遺伝子の発現効率を増加させ、転写安定度を増加させる。これに、本発明の突然変異遺伝子をより効率的に動物に導入させるため、ヒトβ−グロビン遺伝子（ｈｕｍａｎ β−ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ）から誘導されたイントロンＢ遺伝子（９１８ ｂｐ）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎｅ １９９１、ｐ．３０７０−３０７４；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、１９９１、８８：４７８−４８２）を前記実施例２で製造した発現用カセットに導入した。具体的に、ヒト神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＳＨ−ＳＹ５ＹからゲノムＤＮＡを分離した後、配列番号１６で記載されるｈｇｌｏｂ−ｆプライマーと配列番号１７で記載されるｈｇｌｏｂ−ｒプライマー対を用いてヒトβ−グロビン遺伝子のイントロンＢ遺伝子を増幅した。増幅されたヒトβ−グロビン遺伝子のイントロンＢ遺伝子産物（９１８ ｂｐ）をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）にサブクローニングし、これを前記実施例２で製造したＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ発現用カセットのＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子とβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子間に挿入させた。このようにして製造された形質転換用発現ベクターを「ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ」と命名した（図１Ａ）。
【００３２】
＜実施例４＞形質転換動物生産
前記実施例２で製造したＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ発現カセットと前記実施例３で製造したＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ発現カセットとを制限酵素（ＢｓｓＨII）で切断し、大きさ約３．１ｋｂの線形化された切断産物を収得した後、近交配（ｉｎｂｒｅｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの受精卵（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｅｇｇ）の前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ）に微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。注入された受精卵はＩＣＲ代理母マウスの卵管（ｏｖｉｄｕｃｔ）へ伝達された。本発明で用いた微細注入方法のような形質転換動物製作過程は、通常の方法によって行った（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５；Ｈｉｓａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６）。
【００３３】
＜実施例５＞突然変異遺伝子の受精卵の核移植の確認
前記実施例４において施した形質転換動物製作によって生まれた子孫（Ｆ１）のしっぽからゲノムＤＮＡを分離した後、ゲノムＰＣＲ増幅を通じて突然変異遺伝子の受精卵の核移植を確認した。具体的に、イントロンを含まない発現カセット（ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫の分析には、配列番号１８で記載されるｔｒａｐｐ−ｆｓプライマーと配列番号１９で記載されるｔｒａｐｐ−ｒ１プライマー対を用いてＰＣＲ増幅反応を施し、イントロンを含む発現カセット（ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫の分析には、配列番号２０で記載されるｔｒｉｎｔ−ｆ１プライマーと配列番号１４で記載されるｓｖ４０ｐＡ−ｒ１プライマー対を用いてＰＣＲ増幅反応を施した。
【００３４】
その結果、イントロンを含まない発現カセット（ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫は１６匹に前記発現カセットが導入されたことを確認したし、イントロンを含む発現カセット（ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−ＡＰＰ（Ｓｗ、Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫は２匹で前記発現カセットが導入されたことを確認した。
【００３５】
次に、サザンブロット分析を通じて本発明の発現カセットが導入されたことを確認した。具体的に、前記実施例４で施した形質転換動物製作によって生まれた子孫（Ｆ１）のしっぽからゲノムＤＮＡを分離した後、１５μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩで切断した。切断されたゲノムＤＮＡをアガロースゲルに電気泳動した後、ニトロセルロースメンブレインに伝達させ、ＡＰＰ ｃＤＮＡのＣ末端ＳｐｅＩ切片（３５０ ｂｐ）を３２Ｐで同位元素標識させたプローブを用いて混成化反応を施した後、Ｘ−ｒａｙフィルムに現像した。
【００３６】
その結果、前記ゲノムＰＣＲで分析したように、イントロンを含まない発現カセット（ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入したマウスにおいては、１６匹に前記発現カセットが導入されたし、イントロンを含む発現カセット（ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入したマウスにおいては、２匹で前記発現カセットが導入されたことを確認した（図１Ｂ）。
【００３７】
前記ゲノムＰＣＲ及びサザンブロット分析を通じて本発明の突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が導入されたことを確認した形質転換マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと近交配して繁殖させた。
【００３８】
＜実施例６＞形質導入された遺伝子の発現分析
本発明において製造した形質転換動物にβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子が導入され遺伝子が発現するかを確認するため、形質導入確認されたマウスの脳から全体ＲＮＡを分離した後、ノーザンブロット分析を行った。ノーザンブロット分析方法はリ等の方法（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００２、１５：７９３１−７９４０）に従って行った。具体的に、前記実施例４及び実施例５で突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が形質導入されたことを確認した２ヶ月齢のマウス及び正常マウスから全体ＲＮＡを分離した。全体ＲＮＡはトリゾール溶液（Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて分離し、分離した３０μｇの全体ＲＮＡを１％変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）アガロースゲル（１％アガロース、６．２％ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ １ ＭＯＰＳ）で電気泳動した。電気泳動されたアガロースゲルのＲＮＡを、ニトロセルロースメンブレインに伝達させた後、前記実施例５のサザンブロット分析で用いたＡＰＰ ｃＤＮＡのＣ末端ＳｐｅＩ切片（３５０ ｂｐ）を３２Ｐで同位元素標識させたプローブを用いて混成化反応を施した後、Ｘ−ｒａｙフィルムに現像した。前記プローブＤＮＡは内部ＡＰＰ転写体（〜３．５ｋｂ）及び突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）転写体（〜７００ｋｂ）を共に認識できるプローブである。
【００３９】
その結果、イントロンを含むか、または、含まない突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子を形質導入したマウスは、内部ＡＰＰ遺伝子の発現に比べ突然変異ＡＰＰ遺伝子の転写体発現が大部分高く現れた。その中でも、イントロンを含む突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子を形質導入したマウス（特に、Ｆ１７と命名したマウス）の場合、βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）の発現量が非常に高く現れた（図１Ｃ）。このようにイントロンを含み高い水準のβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を発現する形質転換マウスを「Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６」と命名し、以後の実験で用いた。
【００４０】
また、前記形質転換マウスＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６を２００３年３月１０日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０６０９ＢＰ）。
【００４１】
＜実施例７＞形質導入された遺伝子から生産されるタンパク質の確認
前記実施例６において、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換動物がβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を発現することを確認し、このように発現された遺伝子がタンパク質として生産されるかを確認するために、４ヶ月齢ないし５ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６マウス及び対照群正常マウスの脳から全体タンパク質を分離した後、ウエスタンブロット分析を行った。ウエスタンブロット分析はリ等の方法（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、１９９９、７０：１１６−１２４）によって行った。具体的に、マウスの脳組織を摘出した後、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）及びプロテアーゼ抑制剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む４℃で保管された溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）に入れて均質化させた。均質化された脳のサンプルを１３，０００ ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄液を収得した。上澄液に含まれたタンパク質をＢＣＡ定量キット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて測定した。３０μｇのタンパク質をアクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に伝達させた。タンパク質の伝達されたメンブレインは５％脱脂粉乳、２％ＢＳＡ、４％ＦＢＳ、４％馬血清及び４％ヤギ血清を含むＴｒｉｓ緩衝された食塩水及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０でブロッキングさせた。突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）タンパク質の生成を確認するため、約１２ｋＤ βＣＴＦ９９タンパク質を認識するポリクローナル抗体（Ａ８７１７；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ、ＵＳＡ）及び約１０ｋＤ αＣＴＦ８３（ｐ３切片）タンパク質を認識するポリクローナル抗体（５１−２７００：Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて免疫反応させた。前記βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質はそれぞれ正常マウスにあるβ−セクレターゼ及びα−セクレターゼへの活性によって生成されるタンパク質である。また、免疫分析はＥＣＬ検出試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて検出した。
【００４２】
βＣＴＦ９９を検出するためには、マウスの脳を摘出した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）及びプロテアーゼ抑制剤（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むＴｒｉｓ緩衝された生理食塩水（ＴＢＳ）に１：１０（ｇ／ｖｏｌ）割合で入れた後、均質化させた。５０μｇのタンパク質サンプルを同量の１０％β−メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合した後、１０分間沸騰させ１６．５％Ｔｒｉｓ／ｔｒｉｃｉｎｅアガロースゲルに電気泳動させた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９）。電気泳動が終わったゲルのタンパク質をＰＶＤＦメンブレインに伝達させた後、ポリクローナル抗−ＣＴＦ抗体で混成化反応させた。免疫ブロットはＥＣＬ検出試薬を用いて検出した。
【００４３】
その結果、Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質の生産が正常マウスに比べて相当量増加した。また、ウエスタンブロット分析を通じて現れたβＣＴＦタンパク質の発現量をデンシトメータを用いてコンピュータープログラムを使って分析した結果、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳においては、βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質の発現量が内部βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質の発現量に比べ、それぞれ２．６３±０．３７倍及び２．６１±０．２倍ほどさらに高く現れた（図２Ａ）。
【００４４】
＜実施例８＞形質転換マウス脳の免疫組職学的分析
免疫組職学的分析を行うため、マウスは０．９％生理食塩水で上行大動脈に還流させ、続けて４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（以下「ＰＢ」と略称する、ｐＨ ７．４）を還流させた。次いで、４℃で固定溶液に固定させた。固定された脳は、切断機（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）を用いて４０μｍの厚さに切断した。切断されたセクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）を０．１ Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．４）に溶かした３％過酸化水素溶液で３０分間反応させ、ＰＢで洗浄した。洗浄されたセクションは、５％正常ヤギ血清、２％ＢＳＡ、２％ＦＢＳを含む溶液で２時間常温でブロッキングさせた。ブロッキング緩衝液に一次抗体を入れた後、４℃で一晩中反応させた。ＰＢ溶液で洗浄した後、１：２００倍に希釈したビオチン化された二次抗体を入れ、次に１：１００倍に希釈したアビジン及びビオチン化されたＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を入れて１時間反応させた。その後、発色反応を誘導するため、０．０５％ ３，３’−ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及び０．００１％過酸化水素を含む０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）溶液を処理した。分析した脳組織としては、大脳皮質（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ、以下「ＣＸ」と略称する）、ＣＡ１ないしＣＡ３部位のピラミッド細胞（以下「ＣＡ１」ないし「ＣＡ３」と略称する）、海馬（ｈｉｐｏｃａｍｐｕｓ、以下「ＨＰ」と略称する）、歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ、以下「ＤＧ」と略称する）部位を用いた。
【００４５】
その結果、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスは、大脳皮質を含む脳全体の神経細胞でβＣＴＦ９９タンパク質の発現が増加した（図２Ｂ及びＣ）。しかし、１８ヶ月齢までのＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスの脳では、プラーク類似Ａβ−沈着が確認できなかった。そして、Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスの約９２％は４８０日以上まで生存し、対照群正常マウスに比べて致死率が増加するものの既存の形質転換マウスに比べてより長く生きることができ、動物モデルとしてさらに効果的に使用できることが分かった。
【００４６】
＜実施例９＞形質転換マウス脳における他のタンパク質の発現変化分析
突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）タンパク質の導入により、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳において発現の影響を受けたタンパク質を分析しようとした。具体的に、前記実施例７に記載されたウエスタンブロット分析方法と同様に脳組職を用いてウエスタンブロット分析を行った。分析時用いた抗体としては、抗−リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏ）−ＪＮＫ抗体（９２５１Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗−リン酸−ｃ−Ｊｕｎ抗体（９２６１Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−リン酸−ｐ３８抗体（９２１１Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−ＪＮＫ３抗体（０６−７４９；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）、抗−ＣＲＥＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−リン酸−ＣＲＥＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−ＭＡＰ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−カルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）抗体（Ｃ９８４８；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、抗−パルブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ）（Ｐ３０８８；Ｓｉｇｍａ）、抗−カルレチニン（ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）抗体（ＡＢ５０５４；Ｃｈｅｍｉ−Ｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗−ＪＮＫ１抗体（１５７０１Ａ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗−ＪＮＫ２抗体（ｓｃ−５７２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗−リン酸−ＥＲＫ抗体（ｓｃ−７３８３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−ＥＲＫ抗体（ｓｃ−１５４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−Ｂｃｌ−２抗体（ｓｃ−７８３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−Ｂａｄ抗体（ｓｃ−９４２−Ｇ）、抗−Ｂａｘ抗体（ｓｃ−６２３６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−Ｂｃｌ−ｘＬ（ｓｃ−７１９５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。
【００４７】
アルツハイマー病の脳ではリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏ）−ＪＮＫタンパク質の発現が増加すると知られている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７６：４３５−４４１；Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）。それ故に、本発明の形質転換マウスの脳でリン酸−ＪＮＫタンパク質の発現がいかに変化するかを調べるためにウエスタンブロット分析した結果、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、リン酸−ＪＮＫタンパク質及びリン酸−ｃ−Ｊｕｎタンパク質の発現量が同一年齢の対照群正常マウスに比べて増加した一方、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、リン酸−ＥＲＫ、ＥＲＫ及びリン酸−ｐ３８の発現量は変化しなかった（図３）。
【００４８】
Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質は抗−細胞死滅作用をし、Ｂａｘ及びＢａｄタンパク質は前駆−細胞死滅作用をし、前記４つの遺伝子はＢ−細胞白血病−２（Ｂｃｌ−２）ファミリータンパク質に属する（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｔｒｅｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１８：３５５−３５８）。それ故に、本発明の形質転換マウスの脳でＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現様相の変化を確認するためにウエスタンブロット分析した結果、１４ヶ月齢ないし１６ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、Ｂｃｌ−２、Ｂａｄ及びＢａｘタンパク質の発現量が対照群正常マウスに比べてかなり増加したが、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の発現は減少した（図４Ａ）。したがって、本発明のβＣＴＦ９９（Ｌｄ）突然変異遺伝子の導入によってＢｃｌタンパク質の発現が不均衡になることが分かった。また、前記結果を基に、Ｂａｄタンパク質及びＢａｘタンパク質の発現が海馬のピラミッド細胞レイヤーであるＣＡ１部位でいかに発現されるかを調べるため、前記実施例８と同様に組職免疫学的分析を行った結果、前記ウエスタンブロット分析のようにＣＡ１部位でＢａｄタンパク質及びＢａｘタンパク質の発現が増加することが分かった（図４Ｂ）。
【００４９】
アルツハイマー病患者の脳では、カルシウム−結合タンパク質の発現が増加すると知られている（Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．、８７：４０７８−４０８２；Ｍｉｋｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、９２：５１５−５３２；Ｂｕ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１８２：２２０−２３１）。それ故に、カルシウム結合タンパク質であるカルビンジン、パルブアルブミン、カルレチニンの発現水準をウエスタンブロット及び免疫組職学的分析で分析した結果、１４ヶ月齢ないし１６ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの海馬部位、ＣＡ１、ＣＡ３部位及び歯状回部位（ＤＧ）においては、カルビンジンの発現量が対照群正常マウスに比べて減少した（図５Ａ−ウエスタンブロット、図５Ｂ−免疫組職学的に分析）。また、カルビンジンの発現は４ないし５ヶ月齢のマウスでは検出できず、パルブアルブミンとカルレチニンの発現は対照群正常マウスと差がなかった。
【００５０】
アルツハイマー病患者の脳では、全体ＣＲＥＢタンパク質の変化とは関係なくリン酸化されたＣＲＥＢタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣＲＥＢ）の発現水準が減少すると知られている（Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：１８５８−１８６７）。また、神経細胞的活性中のＣＲＥＢタンパク質の発現増加は長期間のシナプス可塑性（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）、特に海馬−基礎的記憶力を誘導すると知られている（Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１５：４６３−４７０；Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２３：３５４７−３５５４；Ｖｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０：ＲＣ１１２（１−５））。それ故に、本発明の形質転換マウスにおけるリン酸化されたＣＲＥＢタンパク質の発現をウエスタンブロット及び免疫組職学的に分析した結果、１４ヶ月齢ないし１６ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、全体ＣＲＥＢタンパク質の量は変化しなかったが、リン酸化されたＣＲＥＢタンパク質は海馬部位、ＣＡ１部位及び大脳皮質（ＣＸ）部位で正常マウスに比べ発現量が減少した（図６Ａ−ウエスタンブロット、図６ＡないしＫ−免疫組職学的分析）。しかし、５ないし７ヶ月齢の形質転換マウスにおいては正常マウスと同様な発現量を示した。
【００５１】
次に、本発明のβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子が神経細胞的減少に影響を与えるか否かを確認するために神経細胞特異的マーカーであるＭＡＰ−２タンパク質の発現様相を分析した結果、１５ないし１８ヶ月齢の本発明の形質転換マウスの大脳皮質（ＣＸ）及び海馬のＣＡ１部位では、ＭＡＰ−２タンパク質の発現量が減少して神経細胞形成過程に影響を与えたことが分かった（図７ＡないしＨ）。しかし、７ヶ月齢の形質転換マウスにおいては、前記のような明白な差は確認できなかった。
【００５２】
次に、本発明のβＣＴＦ９９（Ｌｄ）突然変異遺伝子が神経細胞的変性に影響を与えるか否かを確認するためにＮｅｕタンパク質の発現様相を分析した結果、１１ないし１２ヶ月齢には生存する神経細胞の数が約５ないし１０％減少し、１８ヶ月齢には生存する神経細胞の数が２５％程度減少して漸進的な神経細胞変性（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を起こすことが分かった（図７Ｉ）。
【００５３】
＜実施例１０＞形質転換マウスの認知機能分析
アルツハイマー病患者の組職病理学的特徴は（１）細胞外老人斑（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅｓ）の沈着、（２）細胞内神経原線維濃縮体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）の形成、（３）神経細胞の突起及びシナプスの退化及び神経細胞の消失などが挙げられ、このような特徴は組職学的方法で検査可能である。アルツハイマー病の他の生理的特徴は（４）神経細胞消失による脳機能の喪失であり、特に認知機能の喪失はアルツハイマー病の最も特徴的かつ重要な外形的、臨床的症状として見なされる。したがって、最も理想的なアルツハイマー病痴呆動物モデルが取り揃えなければならない部分は、老人斑の沈着のような組職学的特徴も重要ではあるが、認知機能が低下する特徴を見せることも重要である。それ故に、本発明者らは、痴呆モデルの候補動物の認知知能の喪失有無を判定するのに使うため、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）テスト、受動的回避（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ）テスト、開放範囲（ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）テストなどを適用して調査した。
【００５４】
認知機能の分析を行うためのマウスは、温度及び湿度が調節された環境において１２時間間隔の昼／夜サイクル（朝７時に点灯）に合わし、動物の飼育は梨花女子医科大学の動物飼育指針に従って行った。コンピューター化されたビデオ−トラッキングシステム（ＳＭＡＲＴ；Ｐａｎｌａｂ Ｓ．Ｉ．、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）を用いてマウスの行動を評価した。
【００５５】
すべての実験を行った後、２つのサンプルの結果を比べるために、スチューデントｔ−テストを行い、複合比較のためには単一方向ＡＮＯＶＡテストを行い、ニューマン・クールズ（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）複合範囲テストを引き継いで行った。すべてのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示し、統計的相違点は他の表示がなければ５％水準で受容した。
【００５６】
＜１０−１＞開放範囲テスト（Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ）
移動性能力は白のプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）チェンバー（４５×４５×４０cm）の開放範囲で測定した。チェンバーの照明は７０ルクス（ｌｕｘ）に調整した。マウスを開放範囲に露出させる３０分前に同じ環境に位置させた。各マウスは個別的に開放範囲の中央に位置させ、６０分間移動を記録した。水平的移動活動力は、マウスの移動距離をもって判断した。内部３０％範囲は中央部分と判断した。
【００５７】
その結果、７ヶ月齢または１１ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの運動性は対照群正常マウスと差がなかった。そして、１４ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの運動性は、対照群正常マウスに比べて増加したが有意性はなかった（図８Ａ）。また、開放範囲の中央に接近する程度（不安感に対する指標の１つ）の場合も大差を見せなかった。
【００５８】
＜１０−２＞ロタ−ロッドテスト（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）
運動調整能力（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）と運動学習能力（ｍｏｔｏｒ ｌｅａｒｎｉｎｇ）は、ロタ−ロッド（ｒｏｔａ−ｒｏｄ）テストを通じて測定された。ロタ−ロッドは速度調節機を有する回転シリンダ（直径：４．５cm）で構成されている。マウスは堅いグリップが提供されるシリンダの一番の上に位置させた。ロタ−ロッドは５ないし２０ｒｐｍの速度で固定して回転させ、漸進的に速度を高める状態にマウスを位置させてテストを行った。カット−オフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）時間は３分にし、試行間間隔は６０分にした。落ちずにロッドにとどまる時間を測定した。
【００５９】
その結果、５．５ヶ月齢において対照群マウスと本発明の形質転換マウスとで運動均衡能力の差が現れなかった。しかし、１１ヶ月齢においては、対照群に比べて本発明の形質転換マウスで運動均衡能力が少し減少したものと示されたが有意性を示してはいなかった（図８Ｂ）。
【００６０】
＜１０−３＞モリス水迷路テスト（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）
モリス水迷路テストは、遠い距離の刺激及び隠された脱出プラットホーム間の関係を学習して憶える動物の能力に依存する海馬−依存的遂行方法である（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９７、７０１）。すなわち、モリス水迷路テストは、マウスが強制に泳ぐか、または、プラットホームに安着している間に覚えた周辺の空間的な指標を用いてプラットホームの位置をいかに早く見つけ出すかを測定することで、マウスの空間認知能力をプラットホームに辿り着くまで永ぐ間の運動した距離または時間を測定して定量的に比べる方法である。この場合、必要によってマウスがプールに進入する位置を変えることもあり、既存に位置した座標から他の座標にプラットホームの位置を変化させて空間的な指標の位置をそのままにして記憶力の検索だけを行い得る。具体的に、水迷路器具は直径９０cmのシリンダプールで構成され、プールには２２℃の牛乳を混ぜた水を溜め、目視では見えないようにした。不透明な水の表面から四分円の１．５cm下に１０cm直径のプラットホームを隠しておいた。プールは幾多の条件の環境及び窓、椅子及びポスターを含む人為的暗示（ｃｕｅ）を有する部屋に位置させた。毎日のテスト過程で、マウスはそれぞれの四分面に成功的に到逹するようにし、最大９０秒間永ぐようにした。プラットホームに到着すれば、マウスは次の訓練が始まるまでプラットホームで３０秒間休ませた。前記２つの各訓練において、プラットホームを見つけ出すまでの潜伏期及び訓練の平均を記録した。
【００６１】
その結果、７ヶ月齢、１１ヶ月齢及び１４ヶ月齢の対照群正常マウスは、モリス水迷路にある隠されたプラットホームの位置する座標を認識でき、このような成果は訓練の回数に比例して認識能力が増加した。しかし、７ヶ月齢、１１ヶ月齢及び１４ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの場合、モリス水迷路にある隠されたプラットホームが位置していた座標を認識する能力が同一年齢の対照群正常マウスに比べかなり衰えて座標を認識する時間が長くなり、毎日の差は有意性を示さなかった（図９Ａ及びＢ）。しかし、７ヶ月齢、１１ヶ月齢及び１４ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスのスイミング速度は、対照群マウスと差がなかった（図９Ｃ）。したがって、前記結果を通じてＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、正常マウスに比べ認知能力の欠陷が増加することが分かった。
【００６２】
＜１０−４＞受動的回避テスト（Ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）
マウスは暗い所を好む性質があり、明るいチェンバーと暗いチェンバーの中の１つを選択させると素早く暗いチェンバーに移動して行く。マウスが明るいチェンバーから暗いチェンバーに移動した後、強い電気刺激を与え（すなわち、訓練後）、再び明るいチェンバーと暗いチェンバーの中の１つを選択させると、正常動物の場合、好きな暗いチェンバーに行かず、嫌がりながらも電気刺激のなかった明るいチェンバーに残り続けようとする行動を見せる。このように、受動的回避テストを通じた認知機能の測定は、明るいチェンバーと暗いチェンバーという空間的情報と電気刺激という事件を連携させる学習及び記憶が維持されるか否かを測定するものである。
【００６３】
具体的に、本発明の受動的回避テストは、明るいチェンバーと暗いチェンバー（それぞれの容積は１５×１５×１５cm）で構成され、２つのチェンバーの間にある廊下とドアにはショック−格子を設けた。テスト一日目の間、各マウスは明るいチェンバーに入れておき、明るい部屋及び暗い部屋を見つけ出せるようにするために各チェンバーで５分間経験させた。２日目、マウスを明るいチェンバーに入れておいた。３０秒後に中間ドアを開けた後、マウスが暗いチェンバーに入るまで遅滞する時間を測定した。マウスが暗い部屋に入ると、ドアを閉めて格子−床を通じて連続的な電気足裏−ショック（１００Ｖ、０．３ｍＡ、２秒）を伝達させた。訓練させた後、マウスは暮していたケージに戻した。２４時間後にそれぞれのマウスは再び明るいチェンバーに入れておき、暗いチェンバーに入るのに遅滞する時間を測定した。
【００６４】
その結果、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の対照群正常マウスと本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６マウスは、ショックを与える前の場合（ｐｒｅ−ｓｈｏｃｋ）、暗いチェンバーへの移動にあまり差を示していなかった。しかし、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６マウスはショックを与えた後の場合（ｐｏｓｔ−ｓｈｏｃｋ）、訓練した後にも暗いチェンバーに入る遅滞時間が正常マウスに比べて非常に短かった（図９Ｄ）。したがって、本発明の形質転換マウスは認知力能力が低下することが分かる。
【００６５】
＜１０−５＞高架式十字迷路テスト（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）
ヒトアルツハイマー疾患患者の一番の問題になる症状の１つは、不安感が増加するということである（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｂｙｌｓｍａ、１９９９、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｄｓ ｂｙ Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．、）２ｎｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。それ故に、本発明者らはＴｇ−ＡＰＰ／Ｂ６形質転換マウスの不安感がＡＰＰ突然変異遺伝子の導入によって変化するか否かを確認しようとした。高架式十字迷路テストは、黒いプレキシグラスで製作した。迷路装置は右側角から１つの他方向に４つの通路（ａｒｍｓ）（３０×７cm）を位置させ、これは底から５０cm上側に位置させた。２つの通路は２０cmの高い壁を有し（閉められた通路）、残り２つは壁を有していなかった（開けられた通路）。中心における明るさは、４０ルクス（ｌｕｘ）に合わせた。テストを行うためにマウスは、初めにはプラットホームの中央に位置させて５分間通路を経験させた。開けられた地域と閉められた地域に進入する回数と進入にかかる時間の割合を記録した。マウスのすべての４つの足がそれぞれのセクターに入ることをもって、それぞれの通路への進入を点数化した。
【００６６】
その結果、７ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、同一年齢の対照群正常マウスと類似に開けられた通路及び閉められた通路における進入結果を見せた。しかし、１３ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、同一年齢の対照群正常マウスに比べ、開けられた通路に進入する回数が少なく、開けられた通路で過ごす時間が少なくなった。この結果から、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、不安感が増加することが分かった（図１０）。
【００６７】
〔産業上の利用可能性〕
以上、説明したように、本発明の形質転換マウスは、モリス水迷路テストでは正常マウスに比べて認知能力が衰えて記憶力が減少する結果を示し、受動的回避テストでは記憶力維持能力が減少した。また、高架式十字迷路テストでは正常マウスに比べて不安感がかなり増加することを見せ、従来に製作されたアルツハイマー病のモデル動物よりアルツハイマー病の臨床的特徴をよく示していることを確認した。したがって、本発明で製造した形質転換マウスは、記憶力及び認知能力の減少、不安感増加のようなアルツハイマー病の臨床的特徴をそのまま示すことが分かり、アルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１Ａは、本発明において製造した形質転換ベクターＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ及びＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡを示した模式図である。図１Ｂは、本発明において製造した形質転換動物Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（−ｉｎｔｒｏｎ）及びＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（＋ｉｎｔｒｏｎ）に突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が挿入されたか否かを確認したサザンブロット分析写真である。図面において矢印は、ＳｐｅＩによって切断された３５０ｂｐ βＣＴＦ９９切片を示す。図１Ｃは、本発明において製造した形質転換動物Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（−ｉｎｔｒｏｎ）及びＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（＋ｉｎｔｒｏｎ）に突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が発現されるか否かを確認したノーザンブロット分析写真である。図面において上側矢印は、内部に存在するβＣＴＦ９９転写体（３．５ｋｂ）を示し、下側矢印は本発明の突然変異βＣＴＦ９９転写体（７００ｂｐ）を示す。
【図２】図２Ａは、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスがβＣＴＦ９９タンパク質を生産するか否かを確認したウエスタンブロット分析写真（左側パネル）及びこれの値を数値化したグラフ（右側パネル）である。ウエスタンブロット分析写真において上側パネルはαＣＴＦ抗体、下側パネルはβＣＴＦ抗体を使用して分析したものである。また、グラフにおいて、各データは４つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図２Ｂ及びＣは、正常マウス（Ｂ）と比べ、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス（Ｃ）の大脳皮質（ＣＸ）でβＣＴＦタンパク質を発現するか否かを確認した免疫組職学的に分析写真である。
【図３】図３Ａは、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスで発現されるｐ−ＪＮＫ、ｐ−ｃ−Ｊｕｎ、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ｐ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８及びｐ３８αタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真である。図３Ｂは、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスで発現されるｐ−ＪＮＫ（左側パネル）及びｐ−ｃ−Ｊｕｎ（右側パネル）の発現量を数値化したグラフである。各データはｐ−ＪＮＫ及びｐ−ｃ−Ｊｕｎに対してそれぞれ６つ及び４つの動物（ｎ＝４−６）を用いて７回及び４回の他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【図４】図４Ａは、１４ないし１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスにおいて発現されるＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｄ及びＢａｘタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真（左側パネル）、及び、これを数値化したグラフ（右側パネル）である。各データは、３つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図４Ｂは、１４ないし１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１、ＣＡ３及びＤＧ部位において発現されるＢａｄ及びＢａｘタンパク質の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。写真で、１つの上側パネルにあるスケールバーは２００μｍであり、３つの下側パネルにあるスケールバーは５００μｍを示す。
【図５】図５Ａは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳において発現されるカルビンジンタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真（左側パネル）及びこれを数値化したグラフ（右側パネル）である。各データは３つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図５Ｂは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１、ＣＡ３及びＤＧ部位において発現されるカルビンジンタンパク質の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。写真で、１つの上側パネルにあるスケールバーは２００μｍであり、２つの下側パネルにあるスケールバーは５００μｍを示す。
【図６】図６Ａは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳において発現されるＣＲＥＢ及びリン酸化−ＣＲＥＢタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真（左側パネル）及びこれを数値化したグラフ（右側パネル）である。グラフにおいて、各データは３つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図６ＢないしＫは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１、ＣＸ（大脳皮質）及びＤＧ部位において発現されるＣＲＥＢ及びリン酸化−ＣＲＥＢタンパク質の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。パネルＣ、Ｅ及びＫにあるスケールバーは５０μｍを示す。
【図７】図７ＡないしＨは、正常対照群マウス及び１８ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の大脳皮質（ＣＸ）及び海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１部位で発現されるＮｅｕ−Ｎタンパク質（ＡないしＤ）及びＭＡＰ２タンパク質（ＥないしＨ）の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。Ａ：正常対照群マウスの前駆（ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ）皮質を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｂ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの前駆皮質を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｃ：正常対照群マウスの錐体（ｐｙｒａｍｉｄａｌ）細胞を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｄ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの錐体細胞を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｅ：正常対照群マウスの前駆皮質を抗ＭＡＰ２抗体で染色、Ｆ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの前駆皮質を抗ＭＡＰ２抗体で染色、Ｇ：正常対照群マウスのＣＡ１部位を抗ＭＡＰ２抗体で染色、Ｈ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスのＣＡ１部位を抗ＭＡＰ２抗体で染色。図７Ｉは、１２ヶ月齢及び１８ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳でＮｅｕタンパク質の発現を調査することで、漸進的な神経細胞的変性を分析したグラフである。
【図８】図８Ａは、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて運動性不均衡を分析した開放範囲分析結果である。図８Ｂは、５．５ヶ月齢及び１１ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて運動性不均衡を分析したロタ−ロッド分析結果である。グラフにおいてデータは、６ないし１５個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【図９】図９Ａ及びＢは、７ヶ月齢（Ａ）及び１４ヶ月齢（Ｂ）の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて認知能力不均衡を分析するために隠されたプラットホームを見つけ出すのに遅滞する時間を分析したモリス水迷路実験結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは６ないし８個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図９Ｃは、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて認知能力不均衡を分析するために隠されたプラットホームを見つけ出すため永いだ速度を分析したモリス水迷路実験結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは６ないし８個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図９Ｄは、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて記憶力遅滞を分析した受動的回避実験結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは６ないし８個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【図１０】図１０は、１３ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて不安感増加現象を分析した高架式十字迷路テストの結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは７ないし１０個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、アルツハイマー病誘発形質転換マウスに関し、より具体的には、突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質の一部を導入して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ベータ−アミロイドペプチド（β−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「Ａβ」と略称する）の生産量増加は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）の病理症状において必須に作用すると報告された。Ａβは、β−セクレターゼ（ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）及びγ−セクレターゼによってＡＰＰタンパク質が順次プロテオリティック（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断されて形成される。プレセニリン−１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１、以下「ＰＳ１」と略称する）は、γ−セクレターゼ及びその基質のトラフィック（ｔｒａｆｆｉｃ）を調節するか、γ−セクレターゼの主要素になり得る（Ｅｓｌｅｒ ＷＰ ａｎｄ Ｗｏｌｆｅ ＭＳ、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１４４９−１４５４）。したがって、ＰＳ１はアルツハイマー病の症状の発現を遅らせるか、これを治療するための標的になると考えられた（Ｅｓｌｅｒ ＷＰ ａｎｄ Ｗｏｌｆｅ ＭＳ、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１４４９−１４５４；Ｌｉ ＹＭ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０５：６８９−６９４）。しかし、γ−セクレターゼ抑制剤を使用したとき、β−セクレターゼによって切断されたカルボキシル末端切片（βＣＴＦ）が蓄積される可能性は、実際に明らかであるとはされていない。
【０００３】
条件的遺伝子除去（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）方法に関する近年の研究においては、ＰＳ１欠損マウスの致死を回避しながらも、脳特異的にＰＳ１が欠損された大人マウスを生産した（Ｙｕ Ｈ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｎｅｕｒｏｎ、３１：７１３−７２６；Ｄｅｗａｃｈｔｅｒ Ｉ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２：３４４５−３４５３）。ＰＳ１条件的突然変異遺伝子及びＡＰＰＶ７１７Ｉ突然変異遺伝子を共に発現する二重突然変異マウスに関する研究においては、ＰＳ１によるγ−セクレターゼ活性の除去によってＡβの生産を減少させ、プラークが蓄積され、かつ、海馬ＬＴＰの不均衡から解放されたものの、ＡＰＰＶ７１７Ｉ形質転換マウスで現れる記憶力の欠陷を修正できず（Ｄｅｗａｃｈｔｅｒ Ｉ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２：３４４５−３４５３）、相変らず脳では増加する神経生理学的（ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または病理学的徴候が進行された。たとえ基本的な作用機序がまだ完成されてはいないが、脳におけるγ−セクレターゼ活性減少によってβＣＴＦ９９が蓄積されるということを見せることで、これがプラーク蓄積の消失から現れる認識の欠陷を誘発することに潜在的な役割をすることを提案した。しかし、ＡＰＰＶ７１７Ｉ形質転換マウスで現れる他の生化学的不均衡または行動学的変化が復帰されたということに関してはまだ知られていない。ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）（Ｎａｒｕｓｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｎｅｕｒｏｎ、２１：１２１３−１２２１；Ｓｏｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９６：６９５９−６９５３）及びＮ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）プロセッシング（Ｍａｒａｍｂａｕｄ Ｐ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｃｅｌｌ、１１４：６３５−６４５）を含む脳における公知のＰＳ１の複合的機能の場合、二重突然変異マウスで観察される記憶力の消失がβＣＴＦ９９によって完全に形成されるかに関しては確かではない。
【０００４】
脳においてβＣＴＦ９９を発現する突然変異マウスを研究することで、生体内βＣＴＦ９９の作用に関するさらに直接的な証拠が得られる。これを確認するため、８つの個別的な研究グループにおいて、脳でヒトＡＰＰの多様な形態のＣＴＦを発現する形質転換マウスを製造した。これらの中４つのラインでは、１２ないし２８ヶ月齢で神経細胞的消失（Ｏｓｔｅｒ−Ｇｒａｎｉｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１６：６７３２−６７４１；Ｎａｌｂａｎｔｏｇｌｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８７：５００−５０５；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓｏｒｄ、８：２９６−３０７）または非正常的学習能力（Ｎａｌｂａｎｔｏｇｌｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８７：５００−５０５；Ｂｅｒｇｅｒ−Ｓｗｅｅｎｅｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、６６：１５０−１６２；Ｌａｒｏｎｄｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、９５６：３６−４４）を示したが、他の４つのラインでは神経細胞的消失または認知能力不均衡において明らかな欠陥を示していなかった（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６６：２１３３１−２１３３４；Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２：１００−１０６；Ｓｂｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７１：７２３−７３１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７２：２４７９−２４８７；Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．、１２：１１０−１２０）。したがって、前記開発されたＣＴＦを発現する形質転換マウスは、症状がないものからアルツハイマー病類似病理症状までの相反した結果を示すことが分かる。なぜなら、このような相反する結果の原因が確かではないため、βＣＴＦ９９の生体内作用に関しては正確に定義しにくい。
【０００５】
これに、本発明者らは、アルツハイマー病のモデル動物を製造するための努力を重ね、アルツハイマー病の臨床的特徴を表すのに必須のβＣＴＦ９９を大量に発現する形質転換マウスを製造し、これがアルツハイマー病の臨床的特徴を効果的に表せることを確認することで本発明を完成した。
【０００６】
〔発明の開示〕
〔技術的課題〕
本発明の目的は、アルツハイマー病誘発用形質転換ベクター及びこれを受精卵の核に移植して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスを提供することである。
【０００７】
〔技術的解決方法〕
前記の目的を達成するため、本発明は、突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端切片（ＣＴＦ）をコードする遺伝子を含むアルツハイマー病誘発用形質転換ベクターを提供する。
【０００８】
また、本発明は前記形質転換ベクターをマウスの受精卵の核に移植して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスを提供する。
【０００９】
〔発明の効果〕
本発明の形質転換マウスは、モリスの水迷路テストでは、正常マウスに比べて認知能力が衰え記憶力が減少する結果を示し、受動的回避テストでは、記憶力維持能力が減少した。また、高架式十字迷路テストでは、正常マウスに比べて相当な不安感の増加をみせ、従来に製作されたアルツハイマー病のモデル動物よりアルツハイマー病の臨床的特徴をよく表していることを確認した。したがって、本発明において製造した形質転換マウスは、記憶力及び認知能力の減少、不安感増加のようなアルツハイマー病の臨床的特徴をそのまま表すことが分かり、アルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【００１０】
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１１】
本発明は、突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端切片（Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＣＴＦ）をコードする遺伝子を含むアルツハイマー病誘発用形質転換ベクターを提供する。
【００１２】
前記突然変異ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端切片は、配列番号１で記載されるＡＰＰ７７０タンパク質の７１７番目アミノ酸バリン（Ｖ）をフェニルアラニン（Ｆ）で置換したＶ７１７Ｆ突然変異が誘導されたＡＰＰＶ７１７Ｆタンパク質のＣ末端切片アミノ酸を含むタンパク質である。すなわち、突然変異誘導されたＡＰＰＶ７１７Ｆタンパク質のＣ末端切片アミノ酸は、配列番号３で記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質であることが望ましい。本発明の望ましい実施例においては、配列番号２で記載されるＡＰＰＶ７１７ＦｃＤＮＡの２番目半ば部分を鋳型として用いてＰＣＲ増幅することで配列番号３で記載される突然変異βＣＴＦ９９を製造し、これを「βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）」と命名した。
【００１３】
また、本発明の形質転換ベクターは、ＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする、突然変異遺伝子（βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ））及びＳＶ４０ポリアデニル化遺伝子を含むことが望ましい。前記突然変異遺伝子の前側には、翻訳効率を高めるためにコザック配列（Ｋｏｚａｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含ませることもできる。本発明においては、ＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、コザック配列、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする、突然変異遺伝子（βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ））及びＳＶ４０ポリアデニル化遺伝子を含むように形質転換ベクターを製造し、これを「ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ」と命名した（図１参照）。
【００１４】
また、本発明の形質転換ベクターは、ＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子とβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子間に、さらにヒトβ−グロビン遺伝子から誘導されたイントロンＢ遺伝子を含むことが望ましい。前記ヒトβ−グロビン遺伝子から誘導されたイントロンＢ遺伝子は、突然変異遺伝子の発現効率を増加させ、転写安定度を増加させるために挿入したものであり、本発明においてはＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、ヒトβ−グロビン遺伝子から誘導されたイントロンＢ遺伝子、コザック配列、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする、突然変異遺伝子（βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ））及びＳＶ４０ポリアデニル化遺伝子を含むように形質転換ベクターを製造し、これを「ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ」と命名した（図１Ａ参照）。
【００１５】
また、本発明は、前記形質転換ベクターをマウスに導入して製造したアルツハイマー病誘発形質転換マウスを提供する。
【００１６】
本発明の形質転換マウスに導入される形質転換ベクターは、ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡまたはＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡであることが望ましく、ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡであることがさらに望ましい。本発明の望ましい実施例においては、前記ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡまたはＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターをそれぞれＣ７５ＢＬ／６マウスの未受精卵の前核に微細注入し、これを代理母に移植して生まれた子孫及びこれを近交配して生まれた子孫から発現されるβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子の発現様相を比べた結果、イントロンが導入されたＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターが導入された形質転換マウスにおいて、より高い発現を示し、本発明のβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を効率的に導入させて高い発現を示すためにはＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターで導入することが望ましいことが分かった。
【００１７】
本発明においては、ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐｏｌｙＡ形質転換ベクターを受精卵の核に移植して製造した形質転換マウスを「Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６」と名付け、前記マウスにおいてβＣＴＦ遺伝子の発現及びβＣＴＦタンパク質の発現水準を分析した後、本発明の突然変異βＣＴＦ遺伝子が効果的に導入されてタンパク質水準まで発現することを確認し、２００３年３月１０日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０６０９ＢＰ）。
【００１８】
本発明のアルツハイマー病誘発形質転換マウス（Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６）は、海馬でカルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）とリン酸化されたＣＲＥＢタンパク質の発現量が漸進的に、そして年齢依存的に減少する傾向を呈する。また、ヒトアルツハイマー病患者の脳で発見される臨床的特徴である神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、運動性の減少（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｔ）、認知能力消失（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｔ）及び不安感の増加を示す。
【００１９】
まず、本発明の望ましい実施例においては、１４ないし１５ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬部位でカルビンジンの発現が非常に減少することを確認した（図５参照）。カルビンジンは、パルブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ）とカルレチニン（ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）とともにカルシウム結合タンパク質を構成し、これは前頭（ｆｒｏｎｔａｌ）、側頭（ｔｅｍｐｏｒａｌ）及び内側嗅領（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ）及び海馬を含む多様な部位の脳においてＧＡＢＡ性（ＧＡＢＡｅｒｇｉｎ）及びピラミッド細胞型のニューロンを示す（Ｍｉｋｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、９２：５１５−５３２）。カルシウム結合タンパク質は、これらの緩衝作用によって細胞内におけるカルシウム濃度を調節する。細胞内カルシウム濃度の恒常性が保たれなければ、正常細胞の作用が不均衡になるか神経細胞の細胞毒性を誘発する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｎｅｕｒｏｎ、２１：１３−２６；Ｍａｔｔｓｏｎ、ＭＰ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２１：５３−５７；Ｃａｒａｆｏｌｉ、Ｅ．、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：１１１５−１１２２）。カルビンジンが欠乏されたマウスは、空間記憶力及びＬＴＰにおいて不均衡を見せた（Ｍｏｌｉｎａｒｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．、１９９６．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３：８０２８−８０３３）。老化するか神経変性が起こり、脳においてカルビンジンの発現が減少し、これにより病理学的変化が起きるようになる（Ｉａｃｏｐｉｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８７：４０７８−４０８２；Ｌｅｕｂａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１５２：２７８−２９１；Ｂｕ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１８２：２２０−２３１）。アルツハイマー病モデルが多く開発されたにもかかわらず、カルビンジンの減少と認知能力減少間の関係についての文献は、近年に製造されたヒト突然変異ＡＰＰを発現する形質転換マウスに関するものしかない（Ｐａｌｏｐ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１００：９５７２−９５７７）。したがって、本発明において確認したカルシウム結合タンパク質の減少は、認知能力の不均衡及びアルツハイマー病患者から発見される他の欠陷の原因になることが分かる。
【００２０】
次に、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスの海馬部位でリン酸化されたＣＲＥＢの発現が減少することを確認した（図６）。海馬において、アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドにより誘導されたＣＲＥＢ遺伝子の欠陷は長期間の記憶力形成不均衡を示し（Ｇｕｚｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４：２６９３−２６９８）、異性体ＣＲＥＢβの標的突然変異は非正常的な学習と記憶力を示した（Ｂｏｕｒｅｃｈｕｌａｄｚｅ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：５９−６８；Ｂｌｅｎｄｙ ｅｔ ａｌ．、１９９６、ＥＭＢＯ Ｊ．、１５：１０９８−１１０６）。一方、脳におけるＣＲＥＢ水準の増加は長期間の記憶力維持を増進させた（Ｊｏｓｓｅｌｙｎ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２１：２４０４−２４１２）。したがって、本発明の形質転換マウスにおいて現れるリン酸化されたＣＲＥＢの発現減少はアルツハイマー病患者から現れるものと同じ結果を示すことが確認でき、年齢依存的に認知力不均衡、神経変性及び不安感の増加を示すことがこのような結果によって現れることを確認し、本発明の形質転換マウスがアルツハイマー病誘発用マウスとして適していることが分かる。
【００２１】
次に、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスは、二重突然変異誘発形質転換マウスであるＴｇ２５７６＋ＰＳ１Ｐ２４６Ｌモデル（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）において観察される症状である増加したＪＮＫ活性をそのまま示し（図３参照）、アルツハイマー病患者の脳で観察される特性をそのまま示すことを確認した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７６：４３５−４４１；Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）。単一突然変異誘発形質転換マウスであるＴｇ２５７６マウスまたはＴｇ−ＰＳ１Ｐ２４６Ｌマウスは、リン酸化されたＪＮＫ活性の変化を見せなかったが（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）、本発明の形質転換マウスはリン酸化されたＪＮＫ活性の変化を見せた。しかも、本発明の形質転換マウスの脳ではＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現不均衡を見せた（図４参照）。本発明の形質転換マウスの脳においては、Ｂｃｌ−２、Ｂａｄ及びＢａｘタンパク質の発現がかなり増加する一方、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の発現は減少してＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現不均衡を見せていることが分かった。したがって、本発明の形質転換マウスで観察されるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現不均衡は、アルツハイマー病患者から見られる症状と類似であり（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ、１８：５６５−５７１；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、７８０：２６０−２６９）、本発明の形質転換マウスがアルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【００２２】
また、本発明の形質転換マウス（Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６）は、アルツハイマー病の臨床的特徴である運動性の減少（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｔ）、認知能力の消失（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｔ）及び不安感の増加を示した（図８ないし図１０参照）。本発明の望ましい実施例においては、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスがアルツハイマー病の臨床的特徴を示すかを確認するため、認知能力を分析できる開放範囲（Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）テスト、ロタ−ロッド（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ）テスト、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）テスト及び受動的回避（Ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ）テストを行い、不安感の増加症状を分析するために高架式十字迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ）テストを行った。その結果、開放範囲テストでは、正常マウスと移動能力において特に差がなかったが（図８Ａ参照）、ロタ−ロッドテストでは、正常マウスに比べて運動均衡能力において少し減少したことを示すものの有意性は示さなかった（図８Ｂ参照）。モリス水迷路テストでは、正常マウスに比べて認知能力が衰えて記憶力が減少する結果を示し（図９ＡないしＣ参照）、受動的回避テストでは記憶力維持能力が減少した（図９Ｄ参照）。また、高架式十字迷路テストでは、正常マウスに比べて不安感がかなり増加した（図１０参照）。したがって、本発明において製造した形質転換マウスは、記憶力及び認知能力の減少、不安感の増加のようなアルツハイマー病の臨床的特徴をそのまま示すことが分かり、アルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【００２３】
〔発明の実施のための形態〕
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。
【００２４】
但し、下記の実施例は本発明を例示するものであるだけであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００２５】
＜実施例１＞ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質ｃＤＮＡ遺伝子の確保及びβＣＴＦ９９突然変異遺伝子の製造
＜１−１＞ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質ｃＤＮＡ遺伝子の確保
ヒトアミロイドベータ前駆タンパク質（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ。以下「ＡＰＰ」と略称する）をコードするｃＤＮＡ遺伝子をヒト脳で構築されたマラソン−レディーライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）からＰＣＲ増幅して製造した。前記ｃＤＮＡはＡＰＰ７７０を基準として開放読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）の大きさが約２．３ｋｂであるため、一度に増幅しにくく、前記ｃＤＮＡを２つの部分に分けて前半部は配列番号６で記載されるａｐｐ−１ｆプライマー（５’−ｇｃａａｇｇｇｔｃｇｃｇａｔｇｃｔｇｃｃｃｇｇｔｔｔｇ−３’、下線はＮｒｕＩ制限酵素認識部位を示す）及び配列番号９で記載されるａｐｐ−２ｒプライマー（５’−ｇａｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｃｇｇｔｇｃｔｔｇｇｃｃ−５’）で増幅してからＮｕｒＩ及びＸｈｏＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）のＳｍａＩ及びＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いて挿入し、後半部は配列番号８で記載されるａｐｐ−２ｆプライマー（５’−ｃｃｔａｃｃａｃａｇｃａｇｃｃａｇｔａｃｃｃｃｔｇ−３’）及び配列番号７で記載されるａｐｐ−１ｒプライマー（５’−ｇｇｇｇｇａｃｔａｇｔｔｃｔｇｃａｔｃｔｇｃｔｃ−３’、下線はＳｐｅＩ制限酵素認識部位を示す）で増幅してからＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターのＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いて挿入した。前記ｃＤＮＡの前半部がクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断して生成されたＤＮＡ切片と、後半部がクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターをＸｂａＩ及びＸｈｏＩで切断して生成されたＣＮＡ切片とを、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターとともに結紮して全長ＡＰＰ ｃＤＮＡが挿入されたベクターコンストラクトを製造した。一方、選択的スプライシングによって、ヒトベータアミルロイドの同一遺伝子からコードされるタンパク質のアミノ酸残基の個数に応じて３つの異なる形態の異性体が生成される。すなわち、コードされるタンパク質のアミノ酸残基の個数に応じ、ＡＰＰ ｃＤＮＡにはＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ６９５が存在する。前記クローニングされたｃＤＮＡをＤＮＡ塩基配列分析を通じて確認した結果、前記３つの異性体の中、ＡＰＰ７５１（配列番号２）をコードする配列番号１で記載されるＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡであることが確認できた。
【００２６】
＜１−２＞ＡＰＰ７５１突然変異遺伝子の製造
ＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡにＰＣＲ方法で「Ｖ７１７Ｆ突然変異（ＡＰＰ７７０異性体を基準として７１７番目アミノ酸がバリンからフェニルアラニンに置換された突然変異）」を導入した。具体的に、前記実施例１−１で製造したＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡの後半部がクローニングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターを鋳型にして配列番号８で記載されるａｐｐ−２ｆプライマーと配列番号１１で記載されるａｐｐ−７１７−ｒプライマー（５’−ｃａａｇｇｔｇａｔｇａａｇａｔｃａｃｔｇｔｃｇｃ−３’）で９５℃で１分間熱変性、５７℃で４０秒間プライマー結合、７２℃で１分間伸長反応を３２回繰り返す条件でＰＣＲ反応を施した。その後、配列番号１２で記載されるａｐｐ７１７−ｆプライマー（５’−ｇｃｇａｃａｇｔｇａｔｃｔｔｃａｔｃａｃｃｔｔｇ−３’）と配列番号７で記載されるａｐｐ−１ｒプライマー対を用いて前記と同じ条件でＰＣＲ反応を施した。前記２つのＰＣＲ反応の結果生成されたＰＣＲ産物は「Ｖ１７１Ｆ突然変異」部分を共通の配列として有しているので、前記２つのＰＣＲ産物を分離させた後、徐冷して、クレノウ酵素で延長して１つの切片に連結した。その後、前記繋がれた切片をａｐｐ−２ｆプライマー上に存在するＸｈｏＩ制限酵素認識部位、及び、ａｐｐ−１ｒプライマーに挿入されたＳｐｅＩ制限酵素認識部位を用いてＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで切断し、同様にあらかじめＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで切断したＡＰＰ ｃＤＮＡの後半部が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターに挿入し、突然変異ＡＰＰ７５１後半部ｃＤＮＡを製造した。一方、突然変異が誘発された前記ＤＮＡ切片でＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡ全長が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターの該当部位を置換して配列番号４で記載されるタンパク質をコードする配列番号３で記載される突然変異ＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡを製造し、これを「ｈＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ）」と命名した。突然変異されたｈＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子の塩基配列はＤＮＡ塩基配列分析を通じて確認した。
【００２７】
＜実施例１−３＞βＣＴＦ９９突然変異遺伝子の製造
配列番号１で記載されるヒトアミロイドベータ前駆タンパク質の７１７番目アミノ酸部位にＶ７１７Ｆ突然変異が誘導され、前記タンパク質のＣ末端アミノ酸配列を含むタンパク質を製造しようとした。具体的に、配列番号２で記載されるＡＰＰタンパク質にインディアナ突然変異を誘導したＡＰＰ７５１Ｖ７１７Ｆタンパク質（配列番号４）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３）を鋳型にして、Ｃ末端（６７２番目から７５１番目）断片をＰＣＲ増幅して突然変異遺伝子を製造した。前記実施例１及び２で製造したｈＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ） ｃＤＮＡが挿入されたベクターを鋳型にして配列番号２４で記載されるプライマーａｐｐ９９ｆ（５’−ｃｇａａｔｔｃｇａｔｇｃａｇａａｔｔｃｃ−３’）と配列番号７で記載されるａｐｐｒ−１ｒプライマーで９５℃で１分間熱変性、５７℃で４０秒間プライマー結合、７２℃で１分間伸長反応を３２回繰り返す条件でＰＣＲ反応を施した。生成されたＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で連結した。突然変異誘導されたＡＰＰタンパク質のＣ末端タンパク質は、配列番号１０で記載されるタンパク質であり、これをコードする配列番号５で記載される突然変異遺伝子を「βＣＴＦ９９」と命名した。突然変異された遺伝子の塩基配列はＤＮＡ塩基配列分析を通じて確認した。
【００２８】
前記製造された突然変異に信号ペプチドを挿入するため、信号ペプチドを有しているｐＫＳ−ａａｐ６９６−１／２ベクターを鋳型にして信号ペプチド部位をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーとしては、ＢｇｌII認識部位を有している配列番号２２で記載されるａｐｐ−ｓｉｇ−１ｆプライマー及びＥｃｏＲＩ認識部位を有している配列番号２３で記載されるａｐｐ−ｓｉｇ−１ｆプライマー対を使用し、９５℃で１分間熱変性、５５℃で１分間プライマー結合、７２℃で１分間伸長反応を３２回繰り返す条件でＰＣＲ反応を施した。ＰＣＲ増幅された産物はＢｇｌIIで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＥｃｏＲＩで切断した位置にサブクローニングした。
【００２９】
また、前記信号ペプチドタンパク質の翻訳効率を高めるため、前記信号ペプチドが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターを鋳型にしてＸｂａＩ認識部位及びコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｐｕｅｎｃｅ、ＧＡＣＣ）を有している配列番号１５で記載されるａｐｐ−ｋｏｚ−ｆプライマー及びＮｏｔＩ認識部位を有している配列番号２１で記載されるａｐｐ−ｋｏｚ−ｆプライマー対を用いてＰＣＲ増幅することで、信号ペプチドの開始コドン（ＡＴＧ）の前にコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＧＡＣＣ）を挿入した。前記ＰＣＲ増幅された産物をＸｂａＩ及びＮｏｔＩで切断した後、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳと連結してｐＫＳ−ｋｏｚａｐｐｓｉｇベクターを製作した。製作されたベクターをＥｃｏＲＩで切断し、前記製作されたβＣＴＦ９９ベクターをＥｃｏＲＩで切断して連結させれば、信号ペプチドとβＣＴＦ９９が結合された融合タンパク質を生産するベクターが製作される。このようにコザック配列、信号ペプチド、インディアナ突然変異誘導されたβＣＴＦ９９タンパク質をコードする遺伝子順に製造された再組み換えタンパク質を「βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）」と命名した。
【００３０】
＜実施例２＞βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を含む形質転換用発現カセットの製造
アルツハイマー性痴呆動物モデルを生産するため、βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を含む形質転換用発現カセットを製造した。具体的に、まず、配列番号１３で記載されるＳＶ４０ｐＡ−ｆプライマー（５’−ｔｃｃｃｃｇｃｇｇｒｃｃａｇａｃａｔｇａｔａａｇａｔａｃａｔｔｇａ−３’、下線はＳａｃII制限酵素認識部位を示す）と配列番号１４で記載されるＳＶ４０ｐＡ−ｒプライマー（５’−ｇｔｔｃｇａｇｃｔｃａｔａａｔｃａｇｃｃａｔａｃｃａｃａｔｔｔｇ−５’、下線はＳａｃＩ制限酵素認識部位を示す）でｐＧＫ−ｎｅｏ−ｐＡベクター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００２、１５：７９３１−７９４０）を増幅して、突然変異遺伝子のポリアデニル化信号のための大きさ２４７ｂｐのＳＶ４０−ｐＡ切片を収得し、これをＳａｃII及びＳａｃＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターに挿入した。次いで、ｐｓｉｓＣＡＴ６ａベクター（Ｓａｄａｈａｒａ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１９９１、６４（１）：２１７−２７）をＸｂａＩで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＨｉｎｄIIIで切断し、ヒト血小板来由成長因子ベータ（ｐｌａｔｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ、ＰＤＧＦ−ｂｅｔａ）プロモーター切片を収得した。その後、ＳａｌＩで切断した後、クレノウ酵素で平滑化してＨｉｎｄIIIで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターに前記収得したＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター切片を挿入した。次いで、前記ＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター切片が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIで切断して収得した大きさ約１．５ｋｂのＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター切片を、前記ＳＶ４０ ｐＡ部位が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターのＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIII部位を通じて挿入した。このようにして生成されたベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳベクターの多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）の両側にそれぞれＰＤＧＦ−ｂｅｔａプロモーター及びＳＶ４０−ｐＡ部位が存在する構造になる。前記のように製造されたベクターに、開始コドンの前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＧＡＣＣ）を有する前記実施例１で製造したβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子を挿入して形質転換用発現カセットを製造した。最終的に、ＰＤＧＦ−βプロモーター−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡの順に発現カセットを製作し、これを「ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ」と命名した（図１Ａ）。
【００３１】
＜実施例３＞イントロンとβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を含む形質転換用発現カセットの製造
イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）は、突然変異遺伝子の発現効率を増加させ、転写安定度を増加させる。これに、本発明の突然変異遺伝子をより効率的に動物に導入させるため、ヒトβ−グロビン遺伝子（ｈｕｍａｎ β−ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ）から誘導されたイントロンＢ遺伝子（９１８ ｂｐ）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎｅ １９９１、ｐ．３０７０−３０７４；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、１９９１、８８：４７８−４８２）を前記実施例２で製造した発現用カセットに導入した。具体的に、ヒト神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＳＨ−ＳＹ５ＹからゲノムＤＮＡを分離した後、配列番号１６で記載されるｈｇｌｏｂ−ｆプライマーと配列番号１７で記載されるｈｇｌｏｂ−ｒプライマー対を用いてヒトβ−グロビン遺伝子のイントロンＢ遺伝子を増幅した。増幅されたヒトβ−グロビン遺伝子のイントロンＢ遺伝子産物（９１８ ｂｐ）をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）にサブクローニングし、これを前記実施例２で製造したＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ発現用カセットのＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子とβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子間に挿入させた。このようにして製造された形質転換用発現ベクターを「ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ」と命名した（図１Ａ）。
【００３２】
＜実施例４＞形質転換動物生産
前記実施例２で製造したＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ発現カセットと前記実施例３で製造したＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ発現カセットとを制限酵素（ＢｓｓＨII）で切断し、大きさ約３．１ｋｂの線形化された切断産物を収得した後、近交配（ｉｎｂｒｅｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの受精卵（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｅｇｇ）の前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ）に微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。注入された受精卵はＩＣＲ代理母マウスの卵管（ｏｖｉｄｕｃｔ）へ伝達された。本発明で用いた微細注入方法のような形質転換動物製作過程は、通常の方法によって行った（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５；Ｈｉｓａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６）。
【００３３】
＜実施例５＞突然変異遺伝子の受精卵の核移植の確認
前記実施例４において施した形質転換動物製作によって生まれた子孫（Ｆ１）のしっぽからゲノムＤＮＡを分離した後、ゲノムＰＣＲ増幅を通じて突然変異遺伝子の受精卵の核移植を確認した。具体的に、イントロンを含まない発現カセット（ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫の分析には、配列番号１８で記載されるｔｒａｐｐ−ｆｓプライマーと配列番号１９で記載されるｔｒａｐｐ−ｒ１プライマー対を用いてＰＣＲ増幅反応を施し、イントロンを含む発現カセット（ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫の分析には、配列番号２０で記載されるｔｒｉｎｔ−ｆ１プライマーと配列番号１４で記載されるｓｖ４０ｐＡ−ｒ１プライマー対を用いてＰＣＲ増幅反応を施した。
【００３４】
その結果、イントロンを含まない発現カセット（ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫は１６匹に前記発現カセットが導入されたことを確認したし、イントロンを含む発現カセット（ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−ＡＰＰ（Ｓｗ、Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入して生まれた子孫は２匹で前記発現カセットが導入されたことを確認した。
【００３５】
次に、サザンブロット分析を通じて本発明の発現カセットが導入されたことを確認した。具体的に、前記実施例４で施した形質転換動物製作によって生まれた子孫（Ｆ１）のしっぽからゲノムＤＮＡを分離した後、１５μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩで切断した。切断されたゲノムＤＮＡをアガロースゲルに電気泳動した後、ニトロセルロースメンブレインに伝達させ、ＡＰＰ ｃＤＮＡのＣ末端ＳｐｅＩ切片（３５０ ｂｐ）を３２Ｐで同位元素標識させたプローブを用いて混成化反応を施した後、Ｘ−ｒａｙフィルムに現像した。
【００３６】
その結果、前記ゲノムＰＣＲで分析したように、イントロンを含まない発現カセット（ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入したマウスにおいては、１６匹に前記発現カセットが導入されたし、イントロンを含む発現カセット（ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ）を導入したマウスにおいては、２匹で前記発現カセットが導入されたことを確認した（図１Ｂ）。
【００３７】
前記ゲノムＰＣＲ及びサザンブロット分析を通じて本発明の突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が導入されたことを確認した形質転換マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと近交配して繁殖させた。
【００３８】
＜実施例６＞形質導入された遺伝子の発現分析
本発明において製造した形質転換動物にβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子が導入され遺伝子が発現するかを確認するため、形質導入確認されたマウスの脳から全体ＲＮＡを分離した後、ノーザンブロット分析を行った。ノーザンブロット分析方法はリ等の方法（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００２、１５：７９３１−７９４０）に従って行った。具体的に、前記実施例４及び実施例５で突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が形質導入されたことを確認した２ヶ月齢のマウス及び正常マウスから全体ＲＮＡを分離した。全体ＲＮＡはトリゾール溶液（Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて分離し、分離した３０μｇの全体ＲＮＡを１％変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）アガロースゲル（１％アガロース、６．２％ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ １ ＭＯＰＳ）で電気泳動した。電気泳動されたアガロースゲルのＲＮＡを、ニトロセルロースメンブレインに伝達させた後、前記実施例５のサザンブロット分析で用いたＡＰＰ ｃＤＮＡのＣ末端ＳｐｅＩ切片（３５０ ｂｐ）を３２Ｐで同位元素標識させたプローブを用いて混成化反応を施した後、Ｘ−ｒａｙフィルムに現像した。前記プローブＤＮＡは内部ＡＰＰ転写体（〜３．５ｋｂ）及び突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）転写体（〜７００ｋｂ）を共に認識できるプローブである。
【００３９】
その結果、イントロンを含むか、または、含まない突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子を形質導入したマウスは、内部ＡＰＰ遺伝子の発現に比べ突然変異ＡＰＰ遺伝子の転写体発現が大部分高く現れた。その中でも、イントロンを含む突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子を形質導入したマウス（特に、Ｆ１７と命名したマウス）の場合、βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）の発現量が非常に高く現れた（図１Ｃ）。このようにイントロンを含み高い水準のβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を発現する形質転換マウスを「Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６」と命名し、以後の実験で用いた。
【００４０】
また、前記形質転換マウスＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６を２００３年３月１０日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０６０９ＢＰ）。
【００４１】
＜実施例７＞形質導入された遺伝子から生産されるタンパク質の確認
前記実施例６において、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換動物がβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子を発現することを確認し、このように発現された遺伝子がタンパク質として生産されるかを確認するために、４ヶ月齢ないし５ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６マウス及び対照群正常マウスの脳から全体タンパク質を分離した後、ウエスタンブロット分析を行った。ウエスタンブロット分析はリ等の方法（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、１９９９、７０：１１６−１２４）によって行った。具体的に、マウスの脳組織を摘出した後、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）及びプロテアーゼ抑制剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む４℃で保管された溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）に入れて均質化させた。均質化された脳のサンプルを１３，０００ ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄液を収得した。上澄液に含まれたタンパク質をＢＣＡ定量キット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて測定した。３０μｇのタンパク質をアクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に伝達させた。タンパク質の伝達されたメンブレインは５％脱脂粉乳、２％ＢＳＡ、４％ＦＢＳ、４％馬血清及び４％ヤギ血清を含むＴｒｉｓ緩衝された食塩水及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０でブロッキングさせた。突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）タンパク質の生成を確認するため、約１２ｋＤ βＣＴＦ９９タンパク質を認識するポリクローナル抗体（Ａ８７１７；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ、ＵＳＡ）及び約１０ｋＤ αＣＴＦ８３（ｐ３切片）タンパク質を認識するポリクローナル抗体（５１−２７００：Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて免疫反応させた。前記βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質はそれぞれ正常マウスにあるβ−セクレターゼ及びα−セクレターゼへの活性によって生成されるタンパク質である。また、免疫分析はＥＣＬ検出試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて検出した。
【００４２】
βＣＴＦ９９を検出するためには、マウスの脳を摘出した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）及びプロテアーゼ抑制剤（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むＴｒｉｓ緩衝された生理食塩水（ＴＢＳ）に１：１０（ｇ／ｖｏｌ）割合で入れた後、均質化させた。５０μｇのタンパク質サンプルを同量の１０％β−メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合した後、１０分間沸騰させ１６．５％Ｔｒｉｓ／ｔｒｉｃｉｎｅアガロースゲルに電気泳動させた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９）。電気泳動が終わったゲルのタンパク質をＰＶＤＦメンブレインに伝達させた後、ポリクローナル抗−ＣＴＦ抗体で混成化反応させた。免疫ブロットはＥＣＬ検出試薬を用いて検出した。
【００４３】
その結果、Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質の生産が正常マウスに比べて相当量増加した。また、ウエスタンブロット分析を通じて現れたβＣＴＦタンパク質の発現量をデンシトメータを用いてコンピュータープログラムを使って分析した結果、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳においては、βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質の発現量が内部βＣＴＦ９９タンパク質及びαＣＴＦ８３タンパク質の発現量に比べ、それぞれ２．６３±０．３７倍及び２．６１±０．２倍ほどさらに高く現れた（図２Ａ）。
【００４４】
＜実施例８＞形質転換マウス脳の免疫組職学的分析
免疫組職学的分析を行うため、マウスは０．９％生理食塩水で上行大動脈に還流させ、続けて４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（以下「ＰＢ」と略称する、ｐＨ ７．４）を還流させた。次いで、４℃で固定溶液に固定させた。固定された脳は、切断機（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）を用いて４０μｍの厚さに切断した。切断されたセクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）を０．１ Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．４）に溶かした３％過酸化水素溶液で３０分間反応させ、ＰＢで洗浄した。洗浄されたセクションは、５％正常ヤギ血清、２％ＢＳＡ、２％ＦＢＳを含む溶液で２時間常温でブロッキングさせた。ブロッキング緩衝液に一次抗体を入れた後、４℃で一晩中反応させた。ＰＢ溶液で洗浄した後、１：２００倍に希釈したビオチン化された二次抗体を入れ、次に１：１００倍に希釈したアビジン及びビオチン化されたＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を入れて１時間反応させた。その後、発色反応を誘導するため、０．０５％ ３，３’−ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及び０．００１％過酸化水素を含む０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）溶液を処理した。分析した脳組織としては、大脳皮質（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ、以下「ＣＸ」と略称する）、ＣＡ１ないしＣＡ３部位のピラミッド細胞（以下「ＣＡ１」ないし「ＣＡ３」と略称する）、海馬（ｈｉｐｏｃａｍｐｕｓ、以下「ＨＰ」と略称する）、歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ、以下「ＤＧ」と略称する）部位を用いた。
【００４５】
その結果、本発明のＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスは、大脳皮質を含む脳全体の神経細胞でβＣＴＦ９９タンパク質の発現が増加した（図２Ｂ及びＣ）。しかし、１８ヶ月齢までのＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスの脳では、プラーク類似Ａβ−沈着が確認できなかった。そして、Ｔｇ−βＣＴＦ／Ｂ６形質転換マウスの約９２％は４８０日以上まで生存し、対照群正常マウスに比べて致死率が増加するものの既存の形質転換マウスに比べてより長く生きることができ、動物モデルとしてさらに効果的に使用できることが分かった。
【００４６】
＜実施例９＞形質転換マウス脳における他のタンパク質の発現変化分析
突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）タンパク質の導入により、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳において発現の影響を受けたタンパク質を分析しようとした。具体的に、前記実施例７に記載されたウエスタンブロット分析方法と同様に脳組職を用いてウエスタンブロット分析を行った。分析時用いた抗体としては、抗−リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏ）−ＪＮＫ抗体（９２５１Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗−リン酸−ｃ−Ｊｕｎ抗体（９２６１Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−リン酸−ｐ３８抗体（９２１１Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗−ＪＮＫ３抗体（０６−７４９；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）、抗−ＣＲＥＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−リン酸−ＣＲＥＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−ＭＡＰ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−カルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）抗体（Ｃ９８４８；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、抗−パルブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ）（Ｐ３０８８；Ｓｉｇｍａ）、抗−カルレチニン（ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）抗体（ＡＢ５０５４；Ｃｈｅｍｉ−Ｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗−ＪＮＫ１抗体（１５７０１Ａ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗−ＪＮＫ２抗体（ｓｃ−５７２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗−リン酸−ＥＲＫ抗体（ｓｃ−７３８３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−ＥＲＫ抗体（ｓｃ−１５４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−Ｂｃｌ−２抗体（ｓｃ−７８３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−Ｂａｄ抗体（ｓｃ−９４２−Ｇ）、抗−Ｂａｘ抗体（ｓｃ−６２３６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−Ｂｃｌ−ｘＬ（ｓｃ−７１９５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。
【００４７】
アルツハイマー病の脳ではリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏ）−ＪＮＫタンパク質の発現が増加すると知られている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７６：４３５−４４１；Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３３７６−３３８５）。それ故に、本発明の形質転換マウスの脳でリン酸−ＪＮＫタンパク質の発現がいかに変化するかを調べるためにウエスタンブロット分析した結果、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、リン酸−ＪＮＫタンパク質及びリン酸−ｃ−Ｊｕｎタンパク質の発現量が同一年齢の対照群正常マウスに比べて増加した一方、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、リン酸−ＥＲＫ、ＥＲＫ及びリン酸−ｐ３８の発現量は変化しなかった（図３）。
【００４８】
Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質は抗−細胞死滅作用をし、Ｂａｘ及びＢａｄタンパク質は前駆−細胞死滅作用をし、前記４つの遺伝子はＢ−細胞白血病−２（Ｂｃｌ−２）ファミリータンパク質に属する（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｔｒｅｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１８：３５５−３５８）。それ故に、本発明の形質転換マウスの脳でＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現様相の変化を確認するためにウエスタンブロット分析した結果、１４ヶ月齢ないし１６ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、Ｂｃｌ−２、Ｂａｄ及びＢａｘタンパク質の発現量が対照群正常マウスに比べてかなり増加したが、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の発現は減少した（図４Ａ）。したがって、本発明のβＣＴＦ９９（Ｌｄ）突然変異遺伝子の導入によってＢｃｌタンパク質の発現が不均衡になることが分かった。また、前記結果を基に、Ｂａｄタンパク質及びＢａｘタンパク質の発現が海馬のピラミッド細胞レイヤーであるＣＡ１部位でいかに発現されるかを調べるため、前記実施例８と同様に組職免疫学的分析を行った結果、前記ウエスタンブロット分析のようにＣＡ１部位でＢａｄタンパク質及びＢａｘタンパク質の発現が増加することが分かった（図４Ｂ）。
【００４９】
アルツハイマー病患者の脳では、カルシウム−結合タンパク質の発現が増加すると知られている（Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．、８７：４０７８−４０８２；Ｍｉｋｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、９２：５１５−５３２；Ｂｕ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１８２：２２０−２３１）。それ故に、カルシウム結合タンパク質であるカルビンジン、パルブアルブミン、カルレチニンの発現水準をウエスタンブロット及び免疫組職学的分析で分析した結果、１４ヶ月齢ないし１６ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの海馬部位、ＣＡ１、ＣＡ３部位及び歯状回部位（ＤＧ）においては、カルビンジンの発現量が対照群正常マウスに比べて減少した（図５Ａ−ウエスタンブロット、図５Ｂ−免疫組職学的に分析）。また、カルビンジンの発現は４ないし５ヶ月齢のマウスでは検出できず、パルブアルブミンとカルレチニンの発現は対照群正常マウスと差がなかった。
【００５０】
アルツハイマー病患者の脳では、全体ＣＲＥＢタンパク質の変化とは関係なくリン酸化されたＣＲＥＢタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣＲＥＢ）の発現水準が減少すると知られている（Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：１８５８−１８６７）。また、神経細胞的活性中のＣＲＥＢタンパク質の発現増加は長期間のシナプス可塑性（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）、特に海馬−基礎的記憶力を誘導すると知られている（Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１５：４６３−４７０；Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２３：３５４７−３５５４；Ｖｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０：ＲＣ１１２（１−５））。それ故に、本発明の形質転換マウスにおけるリン酸化されたＣＲＥＢタンパク質の発現をウエスタンブロット及び免疫組職学的に分析した結果、１４ヶ月齢ないし１６ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳では、全体ＣＲＥＢタンパク質の量は変化しなかったが、リン酸化されたＣＲＥＢタンパク質は海馬部位、ＣＡ１部位及び大脳皮質（ＣＸ）部位で正常マウスに比べ発現量が減少した（図６Ａ−ウエスタンブロット、図６ＡないしＫ−免疫組職学的分析）。しかし、５ないし７ヶ月齢の形質転換マウスにおいては正常マウスと同様な発現量を示した。
【００５１】
次に、本発明のβＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）突然変異遺伝子が神経細胞的減少に影響を与えるか否かを確認するために神経細胞特異的マーカーであるＭＡＰ−２タンパク質の発現様相を分析した結果、１５ないし１８ヶ月齢の本発明の形質転換マウスの大脳皮質（ＣＸ）及び海馬のＣＡ１部位では、ＭＡＰ−２タンパク質の発現量が減少して神経細胞形成過程に影響を与えたことが分かった（図７ＡないしＨ）。しかし、７ヶ月齢の形質転換マウスにおいては、前記のような明白な差は確認できなかった。
【００５２】
次に、本発明のβＣＴＦ９９（Ｌｄ）突然変異遺伝子が神経細胞的変性に影響を与えるか否かを確認するためにＮｅｕタンパク質の発現様相を分析した結果、１１ないし１２ヶ月齢には生存する神経細胞の数が約５ないし１０％減少し、１８ヶ月齢には生存する神経細胞の数が２５％程度減少して漸進的な神経細胞変性（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を起こすことが分かった（図７Ｉ）。
【００５３】
＜実施例１０＞形質転換マウスの認知機能分析
アルツハイマー病患者の組職病理学的特徴は（１）細胞外老人斑（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅｓ）の沈着、（２）細胞内神経原線維濃縮体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）の形成、（３）神経細胞の突起及びシナプスの退化及び神経細胞の消失などが挙げられ、このような特徴は組職学的方法で検査可能である。アルツハイマー病の他の生理的特徴は（４）神経細胞消失による脳機能の喪失であり、特に認知機能の喪失はアルツハイマー病の最も特徴的かつ重要な外形的、臨床的症状として見なされる。したがって、最も理想的なアルツハイマー病痴呆動物モデルが取り揃えなければならない部分は、老人斑の沈着のような組職学的特徴も重要ではあるが、認知機能が低下する特徴を見せることも重要である。それ故に、本発明者らは、痴呆モデルの候補動物の認知知能の喪失有無を判定するのに使うため、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）テスト、受動的回避（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ）テスト、開放範囲（ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）テストなどを適用して調査した。
【００５４】
認知機能の分析を行うためのマウスは、温度及び湿度が調節された環境において１２時間間隔の昼／夜サイクル（朝７時に点灯）に合わし、動物の飼育は梨花女子医科大学の動物飼育指針に従って行った。コンピューター化されたビデオ−トラッキングシステム（ＳＭＡＲＴ；Ｐａｎｌａｂ Ｓ．Ｉ．、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）を用いてマウスの行動を評価した。
【００５５】
すべての実験を行った後、２つのサンプルの結果を比べるために、スチューデントｔ−テストを行い、複合比較のためには単一方向ＡＮＯＶＡテストを行い、ニューマン・クールズ（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）複合範囲テストを引き継いで行った。すべてのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示し、統計的相違点は他の表示がなければ５％水準で受容した。
【００５６】
＜１０−１＞開放範囲テスト（Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ）
移動性能力は白のプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）チェンバー（４５×４５×４０cm）の開放範囲で測定した。チェンバーの照明は７０ルクス（ｌｕｘ）に調整した。マウスを開放範囲に露出させる３０分前に同じ環境に位置させた。各マウスは個別的に開放範囲の中央に位置させ、６０分間移動を記録した。水平的移動活動力は、マウスの移動距離をもって判断した。内部３０％範囲は中央部分と判断した。
【００５７】
その結果、７ヶ月齢または１１ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの運動性は対照群正常マウスと差がなかった。そして、１４ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの運動性は、対照群正常マウスに比べて増加したが有意性はなかった（図８Ａ）。また、開放範囲の中央に接近する程度（不安感に対する指標の１つ）の場合も大差を見せなかった。
【００５８】
＜１０−２＞ロタ−ロッドテスト（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）
運動調整能力（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）と運動学習能力（ｍｏｔｏｒ ｌｅａｒｎｉｎｇ）は、ロタ−ロッド（ｒｏｔａ−ｒｏｄ）テストを通じて測定された。ロタ−ロッドは速度調節機を有する回転シリンダ（直径：４．５cm）で構成されている。マウスは堅いグリップが提供されるシリンダの一番の上に位置させた。ロタ−ロッドは５ないし２０ｒｐｍの速度で固定して回転させ、漸進的に速度を高める状態にマウスを位置させてテストを行った。カット−オフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）時間は３分にし、試行間間隔は６０分にした。落ちずにロッドにとどまる時間を測定した。
【００５９】
その結果、５．５ヶ月齢において対照群マウスと本発明の形質転換マウスとで運動均衡能力の差が現れなかった。しかし、１１ヶ月齢においては、対照群に比べて本発明の形質転換マウスで運動均衡能力が少し減少したものと示されたが有意性を示してはいなかった（図８Ｂ）。
【００６０】
＜１０−３＞モリス水迷路テスト（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）
モリス水迷路テストは、遠い距離の刺激及び隠された脱出プラットホーム間の関係を学習して憶える動物の能力に依存する海馬−依存的遂行方法である（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９７、７０１）。すなわち、モリス水迷路テストは、マウスが強制に泳ぐか、または、プラットホームに安着している間に覚えた周辺の空間的な指標を用いてプラットホームの位置をいかに早く見つけ出すかを測定することで、マウスの空間認知能力をプラットホームに辿り着くまで永ぐ間の運動した距離または時間を測定して定量的に比べる方法である。この場合、必要によってマウスがプールに進入する位置を変えることもあり、既存に位置した座標から他の座標にプラットホームの位置を変化させて空間的な指標の位置をそのままにして記憶力の検索だけを行い得る。具体的に、水迷路器具は直径９０cmのシリンダプールで構成され、プールには２２℃の牛乳を混ぜた水を溜め、目視では見えないようにした。不透明な水の表面から四分円の１．５cm下に１０cm直径のプラットホームを隠しておいた。プールは幾多の条件の環境及び窓、椅子及びポスターを含む人為的暗示（ｃｕｅ）を有する部屋に位置させた。毎日のテスト過程で、マウスはそれぞれの四分面に成功的に到逹するようにし、最大９０秒間永ぐようにした。プラットホームに到着すれば、マウスは次の訓練が始まるまでプラットホームで３０秒間休ませた。前記２つの各訓練において、プラットホームを見つけ出すまでの潜伏期及び訓練の平均を記録した。
【００６１】
その結果、７ヶ月齢、１１ヶ月齢及び１４ヶ月齢の対照群正常マウスは、モリス水迷路にある隠されたプラットホームの位置する座標を認識でき、このような成果は訓練の回数に比例して認識能力が増加した。しかし、７ヶ月齢、１１ヶ月齢及び１４ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの場合、モリス水迷路にある隠されたプラットホームが位置していた座標を認識する能力が同一年齢の対照群正常マウスに比べかなり衰えて座標を認識する時間が長くなり、毎日の差は有意性を示さなかった（図９Ａ及びＢ）。しかし、７ヶ月齢、１１ヶ月齢及び１４ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスのスイミング速度は、対照群マウスと差がなかった（図９Ｃ）。したがって、前記結果を通じてＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、正常マウスに比べ認知能力の欠陷が増加することが分かった。
【００６２】
＜１０−４＞受動的回避テスト（Ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）
マウスは暗い所を好む性質があり、明るいチェンバーと暗いチェンバーの中の１つを選択させると素早く暗いチェンバーに移動して行く。マウスが明るいチェンバーから暗いチェンバーに移動した後、強い電気刺激を与え（すなわち、訓練後）、再び明るいチェンバーと暗いチェンバーの中の１つを選択させると、正常動物の場合、好きな暗いチェンバーに行かず、嫌がりながらも電気刺激のなかった明るいチェンバーに残り続けようとする行動を見せる。このように、受動的回避テストを通じた認知機能の測定は、明るいチェンバーと暗いチェンバーという空間的情報と電気刺激という事件を連携させる学習及び記憶が維持されるか否かを測定するものである。
【００６３】
具体的に、本発明の受動的回避テストは、明るいチェンバーと暗いチェンバー（それぞれの容積は１５×１５×１５cm）で構成され、２つのチェンバーの間にある廊下とドアにはショック−格子を設けた。テスト一日目の間、各マウスは明るいチェンバーに入れておき、明るい部屋及び暗い部屋を見つけ出せるようにするために各チェンバーで５分間経験させた。２日目、マウスを明るいチェンバーに入れておいた。３０秒後に中間ドアを開けた後、マウスが暗いチェンバーに入るまで遅滞する時間を測定した。マウスが暗い部屋に入ると、ドアを閉めて格子−床を通じて連続的な電気足裏−ショック（１００Ｖ、０．３ｍＡ、２秒）を伝達させた。訓練させた後、マウスは暮していたケージに戻した。２４時間後にそれぞれのマウスは再び明るいチェンバーに入れておき、暗いチェンバーに入るのに遅滞する時間を測定した。
【００６４】
その結果、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の対照群正常マウスと本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６マウスは、ショックを与える前の場合（ｐｒｅ−ｓｈｏｃｋ）、暗いチェンバーへの移動にあまり差を示していなかった。しかし、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６マウスはショックを与えた後の場合（ｐｏｓｔ−ｓｈｏｃｋ）、訓練した後にも暗いチェンバーに入る遅滞時間が正常マウスに比べて非常に短かった（図９Ｄ）。したがって、本発明の形質転換マウスは認知力能力が低下することが分かる。
【００６５】
＜１０−５＞高架式十字迷路テスト（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）
ヒトアルツハイマー疾患患者の一番の問題になる症状の１つは、不安感が増加するということである（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｂｙｌｓｍａ、１９９９、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｄｓ ｂｙ Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．、）２ｎｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。それ故に、本発明者らはＴｇ−ＡＰＰ／Ｂ６形質転換マウスの不安感がＡＰＰ突然変異遺伝子の導入によって変化するか否かを確認しようとした。高架式十字迷路テストは、黒いプレキシグラスで製作した。迷路装置は右側角から１つの他方向に４つの通路（ａｒｍｓ）（３０×７cm）を位置させ、これは底から５０cm上側に位置させた。２つの通路は２０cmの高い壁を有し（閉められた通路）、残り２つは壁を有していなかった（開けられた通路）。中心における明るさは、４０ルクス（ｌｕｘ）に合わせた。テストを行うためにマウスは、初めにはプラットホームの中央に位置させて５分間通路を経験させた。開けられた地域と閉められた地域に進入する回数と進入にかかる時間の割合を記録した。マウスのすべての４つの足がそれぞれのセクターに入ることをもって、それぞれの通路への進入を点数化した。
【００６６】
その結果、７ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、同一年齢の対照群正常マウスと類似に開けられた通路及び閉められた通路における進入結果を見せた。しかし、１３ヶ月齢のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、同一年齢の対照群正常マウスに比べ、開けられた通路に進入する回数が少なく、開けられた通路で過ごす時間が少なくなった。この結果から、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスは、不安感が増加することが分かった（図１０）。
【００６７】
〔産業上の利用可能性〕
以上、説明したように、本発明の形質転換マウスは、モリス水迷路テストでは正常マウスに比べて認知能力が衰えて記憶力が減少する結果を示し、受動的回避テストでは記憶力維持能力が減少した。また、高架式十字迷路テストでは正常マウスに比べて不安感がかなり増加することを見せ、従来に製作されたアルツハイマー病のモデル動物よりアルツハイマー病の臨床的特徴をよく示していることを確認した。したがって、本発明で製造した形質転換マウスは、記憶力及び認知能力の減少、不安感増加のようなアルツハイマー病の臨床的特徴をそのまま示すことが分かり、アルツハイマー病のモデル動物として有用であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１Ａは、本発明において製造した形質転換ベクターＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡ及びＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡを示した模式図である。図１Ｂは、本発明において製造した形質転換動物Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（−ｉｎｔｒｏｎ）及びＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（＋ｉｎｔｒｏｎ）に突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が挿入されたか否かを確認したサザンブロット分析写真である。図面において矢印は、ＳｐｅＩによって切断された３５０ｂｐ βＣＴＦ９９切片を示す。図１Ｃは、本発明において製造した形質転換動物Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（−ｉｎｔｒｏｎ）及びＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６（＋ｉｎｔｒｏｎ）に突然変異βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）遺伝子が発現されるか否かを確認したノーザンブロット分析写真である。図面において上側矢印は、内部に存在するβＣＴＦ９９転写体（３．５ｋｂ）を示し、下側矢印は本発明の突然変異βＣＴＦ９９転写体（７００ｂｐ）を示す。
【図２】図２Ａは、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスがβＣＴＦ９９タンパク質を生産するか否かを確認したウエスタンブロット分析写真（左側パネル）及びこれの値を数値化したグラフ（右側パネル）である。ウエスタンブロット分析写真において上側パネルはαＣＴＦ抗体、下側パネルはβＣＴＦ抗体を使用して分析したものである。また、グラフにおいて、各データは４つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図２Ｂ及びＣは、正常マウス（Ｂ）と比べ、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス（Ｃ）の大脳皮質（ＣＸ）でβＣＴＦタンパク質を発現するか否かを確認した免疫組職学的に分析写真である。
【図３】図３Ａは、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスで発現されるｐ−ＪＮＫ、ｐ−ｃ−Ｊｕｎ、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ｐ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８及びｐ３８αタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真である。図３Ｂは、本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスで発現されるｐ−ＪＮＫ（左側パネル）及びｐ−ｃ−Ｊｕｎ（右側パネル）の発現量を数値化したグラフである。各データはｐ−ＪＮＫ及びｐ−ｃ−Ｊｕｎに対してそれぞれ６つ及び４つの動物（ｎ＝４−６）を用いて７回及び４回の他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【図４】図４Ａは、１４ないし１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスにおいて発現されるＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｄ及びＢａｘタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真（左側パネル）、及び、これを数値化したグラフ（右側パネル）である。各データは、３つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図４Ｂは、１４ないし１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１、ＣＡ３及びＤＧ部位において発現されるＢａｄ及びＢａｘタンパク質の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。写真で、１つの上側パネルにあるスケールバーは２００μｍであり、３つの下側パネルにあるスケールバーは５００μｍを示す。
【図５】図５Ａは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳において発現されるカルビンジンタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真（左側パネル）及びこれを数値化したグラフ（右側パネル）である。各データは３つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図５Ｂは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１、ＣＡ３及びＤＧ部位において発現されるカルビンジンタンパク質の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。写真で、１つの上側パネルにあるスケールバーは２００μｍであり、２つの下側パネルにあるスケールバーは５００μｍを示す。
【図６】図６Ａは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳において発現されるＣＲＥＢ及びリン酸化−ＣＲＥＢタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析した写真（左側パネル）及びこれを数値化したグラフ（右側パネル）である。グラフにおいて、各データは３つの他の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図６ＢないしＫは、１５ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１、ＣＸ（大脳皮質）及びＤＧ部位において発現されるＣＲＥＢ及びリン酸化−ＣＲＥＢタンパク質の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。パネルＣ、Ｅ及びＫにあるスケールバーは５０μｍを示す。
【図７】図７ＡないしＨは、正常対照群マウス及び１８ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウス脳の大脳皮質（ＣＸ）及び海馬（ＨＰ）にあるＣＡ１部位で発現されるＮｅｕ−Ｎタンパク質（ＡないしＤ）及びＭＡＰ２タンパク質（ＥないしＨ）の発現量を免疫組職学的に分析した写真である。Ａ：正常対照群マウスの前駆（ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ）皮質を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｂ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの前駆皮質を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｃ：正常対照群マウスの錐体（ｐｙｒａｍｉｄａｌ）細胞を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｄ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの錐体細胞を抗Ｎｅｕ−Ｎ抗体で染色、Ｅ：正常対照群マウスの前駆皮質を抗ＭＡＰ２抗体で染色、Ｆ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの前駆皮質を抗ＭＡＰ２抗体で染色、Ｇ：正常対照群マウスのＣＡ１部位を抗ＭＡＰ２抗体で染色、Ｈ：Ｔｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスのＣＡ１部位を抗ＭＡＰ２抗体で染色。図７Ｉは、１２ヶ月齢及び１８ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスの脳でＮｅｕタンパク質の発現を調査することで、漸進的な神経細胞的変性を分析したグラフである。
【図８】図８Ａは、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて運動性不均衡を分析した開放範囲分析結果である。図８Ｂは、５．５ヶ月齢及び１１ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて運動性不均衡を分析したロタ−ロッド分析結果である。グラフにおいてデータは、６ないし１５個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【図９】図９Ａ及びＢは、７ヶ月齢（Ａ）及び１４ヶ月齢（Ｂ）の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて認知能力不均衡を分析するために隠されたプラットホームを見つけ出すのに遅滞する時間を分析したモリス水迷路実験結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは６ないし８個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図９Ｃは、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて認知能力不均衡を分析するために隠されたプラットホームを見つけ出すため永いだ速度を分析したモリス水迷路実験結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは６ないし８個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。図９Ｄは、７ヶ月齢及び１４ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて記憶力遅滞を分析した受動的回避実験結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは６ないし８個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【図１０】図１０は、１３ヶ月齢の本発明のＴｇ−βＣＴＦ９９／Ｂ６形質転換マウスを用いて不安感増加現象を分析した高架式十字迷路テストの結果である。グラフで＊は、スチューデントｔ−テストを通じて各実験群でｐ＜０．０５の有意性を有するものを示す。また、データは７ないし１０個の実験群の結果を平均±ＳＥＭで示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰ７５１タンパク質の、６９８番目アミノ酸バリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換された突然変異ヒトアミロイドベータ前駆体タンパク質のＣ末端部位を含む配列番号１０で記載されるタンパク質をコードする遺伝子を含むアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項２】
プロモーター及びポリアデニル化部位をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項３】
前記プロモーターはヒトＰＤＧＦ−βプロモーターであることを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項４】
前記ポリアデニル化部位はＳＶ４０ｐＡであることを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項５】
プロモーター及び突然変異ヒトアミロイドベータ前駆体タンパク質のＣ末端部位をコードする遺伝子の間にコザック配列をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項６】
ヒトアミロイドベータ前駆体タンパク質のＣ末端部位をコードする遺伝子前部にシグナルペプチドをコードする核酸配列がさらに含まれることを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項７】
核酸配列は配列番号２５であることを特徴とする請求項６に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項８】
ヒトＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする突然変異遺伝子及びＳＶ４０ｐＡを順次含み、裂開地図ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡで示されることを特徴とする請求項２に記載の形質転換ベクター。
【請求項９】
プロモーター及び突然変異タンパク質をコードする遺伝子の間にイントロンがさらに含まれることを特徴とする請求項２ないし請求項７のいずれか一項に記載のアルツハイマー誘発用形質転換ベクター。
【請求項１０】
前記イントロンはヒトベータ−グロビン遺伝子から来由されたイントロンＢであることを特徴とする請求項９に記載のアルツハイモ誘発用形質転換ベクター。
【請求項１１】
ヒトＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子と配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする突然変異遺伝子の間にヒトベータ−グロビン遺伝子から来由されたイントロンＢ遺伝子を順次含み、裂開地図ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡで示されることを特徴とする請求項９に記載のアルツハイモ誘発用形質転換ベクター。
【請求項１２】
請求項１の形質転換用発現ベクターを導入して製造したアルツハイマー病誘発用形質転換マウス。
【請求項１３】
前記アルツハイマー病の臨床的特徴である運動性の減少、記憶力及び認知能力の消失、不安症状の増加を示すことを特徴とする請求項１２に記載の受託番号ＫＣＴＣ１０６０９ＢＰで寄託されたアルツハイマー病モデル形質転換マウスＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６。
【請求項１】
ＡＰ７５１タンパク質の、６９８番目アミノ酸バリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換された突然変異ヒトアミロイドベータ前駆体タンパク質のＣ末端部位を含む配列番号１０で記載されるタンパク質をコードする遺伝子を含むアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項２】
プロモーター及びポリアデニル化部位をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項３】
前記プロモーターはヒトＰＤＧＦ−βプロモーターであることを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項４】
前記ポリアデニル化部位はＳＶ４０ｐＡであることを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項５】
プロモーター及び突然変異ヒトアミロイドベータ前駆体タンパク質のＣ末端部位をコードする遺伝子の間にコザック配列をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項６】
ヒトアミロイドベータ前駆体タンパク質のＣ末端部位をコードする遺伝子前部にシグナルペプチドをコードする核酸配列がさらに含まれることを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項７】
核酸配列は配列番号２５であることを特徴とする請求項６に記載のアルツハイマー病誘発用形質転換ベクター。
【請求項８】
ヒトＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子、配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする突然変異遺伝子及びＳＶ４０ｐＡを順次含み、裂開地図ＰＤＧＦ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡで示されることを特徴とする請求項２に記載の形質転換ベクター。
【請求項９】
プロモーター及び突然変異タンパク質をコードする遺伝子の間にイントロンがさらに含まれることを特徴とする請求項２ないし請求項７のいずれか一項に記載のアルツハイマー誘発用形質転換ベクター。
【請求項１０】
前記イントロンはヒトベータ−グロビン遺伝子から来由されたイントロンＢであることを特徴とする請求項９に記載のアルツハイモ誘発用形質転換ベクター。
【請求項１１】
ヒトＰＤＧＦ−βプロモーター遺伝子と配列番号３で記載されるアミノ酸配列をコードする突然変異遺伝子の間にヒトベータ−グロビン遺伝子から来由されたイントロンＢ遺伝子を順次含み、裂開地図ＰＤＧＦ−ｉｎｔｒｏｎ−βＣＴＦ９９（Ｖ７１７Ｆ）−ｐＡで示されることを特徴とする請求項９に記載のアルツハイモ誘発用形質転換ベクター。
【請求項１２】
請求項１の形質転換用発現ベクターを導入して製造したアルツハイマー病誘発用形質転換マウス。
【請求項１３】
前記アルツハイマー病の臨床的特徴である運動性の減少、記憶力及び認知能力の消失、不安症状の増加を示すことを特徴とする請求項１２に記載の受託番号ＫＣＴＣ１０６０９ＢＰで寄託されたアルツハイマー病モデル形質転換マウスＴｇ−βＣＴＦ／Ｂ６。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５３００７２（Ｐ２００７−５３００７２Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６０８８（Ｐ２００７−５０６０８８）
【出願日】平成１７年４月１日（２００５．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００４３０６
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０５２７４３７９）ニューロテック ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１日（２００５．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００４３０６
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０５２７４３７９）ニューロテック ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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