βアミロイド生成抑制剤
【課題】 アミロイド前駆体切断酵素を阻害することなくβアミロイドの生成を抑制し得る新規なアルツハイマー治療薬の提供。
【解決手段】 Ｘ１１Lリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合増強剤、アミロイド前駆体の代謝抑制剤、βアミロイド生成抑制剤、並びにＸ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物、アミロイド前駆体の代謝を抑制し得る化合物、βアミロイド生成を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
【解決手段】 Ｘ１１Lリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合増強剤、アミロイド前駆体の代謝抑制剤、βアミロイド生成抑制剤、並びにＸ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物、アミロイド前駆体の代謝を抑制し得る化合物、βアミロイド生成を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、βアミロイド生成抑制方法及びβアミロイド生成抑制剤に関し、特にＸ１１Ｌとアミロイド前駆体との結合を増強することによりアミロイド前駆体の代謝を抑制してβアミロイドの生成を抑制する方法及びβアミロイドの生成を抑制し得る剤に関する。さらに本発明はβアミロイド生成抑制に有用な化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）の治療薬としては、（１）βアミロイド（Ａβ）の生成阻害、（２）Ａβの凝集阻害、（３）分泌されたＡβの分解促進、（４）沈着したＡβの除去等の方法が開発途中である。（１）のＡβの生成阻害としては、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断酵素ＢＡＣＥ（β−ｓｉｔｅ ＡＴＰ Ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）及びγ−セクリターゼの阻害物質の開発が進められている。これらは切断酵素を直接阻害するため、生体内の他の基質の切断も阻害し、副作用の可能性を除去できない。（２）のＡβの凝集阻害は、細胞外に分泌したＡβの凝集を阻害する薬剤である。Ａβは凝集体形成が神経毒性を示すとされており効果が期待されているが臨床試験にまで進んでいる薬剤は少ない。（３）の分泌されたＡβの分解促進は、Ａβを分解することを目的とした治療方法である。Ａβ分解酵素としてはネプリライシン及びインスリン分解酵素が候補として挙げられており、分解活性を細胞外で示すネプリライシンの活性化、発現量増大を惹起する方法が開発されている。この方法も、細胞外刺激が可能な薬剤の開発により臨床試験までたどり着いている。（４）はＡβ免疫療法であり、ＥＬＡＮ社を筆頭に臨床試験を行ったが、脳炎の副作用で一時中断しており、現在免疫方法の改善等が行われている。
【０００３】
一方、Ｘ１１Ｌタンパク質は、ＡＰＰに結合する神経特異的タンパク質として単離された。Ｘ１１ＬはＡＰＰの細胞質ドメインに結合し、ＡＰＰの代謝を安定化する（非特許文献１）。Ｘ１１Ｌはさらにタンパク質Ａｌｃａｄｅｉｎと結合し、神経細胞ではＡＰＰ−Ｘ１１Ｌ−Ａｌｃａｄｅｉｎの三量体として存在する。三量体中のＡＰＰはより代謝的に安定化され、ＡＤの発症原因とされるＡβの生成が強く抑制される（非特許文献２）。Ｘ１１Ｌが複合体から解離すると、ＡＰＰとＡｌｃａｄｅｉｎは協調的な代謝を受け始め、ＡＰＰからＡβが生成し始める（非特許文献３）。ＡＤ患者脳切片を用いた免疫染色から、ＡＰＰとＡｌｃａｄｅｉｎはＡβが沈着した老人斑周辺の神経変性を起こしつつある神経細胞の肥大化した末端（腫大神経突起部）に蓄積している（非特許文献２）が、Ｘ１１Ｌはむしろ老人斑に検出できる（非特許文献４）ことがわかった。また、Ｘ１１Ｌを過剰発現したトランスジェニック（Ｔｇ）マウスをＡＰＰのスウェーデン型変異を持つＴｇマウス（Ｔｇ２５７６）と交配させると、Ａβの脳内産生量が減少する（非特許文献５）。これまでの知見は、Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合維持がＡＰＰの代謝を安定化させＡβの生成を抑制することを示しており、Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合制御を利用した新たなＡβ抑制剤の開発がＡＤの治療薬として有望であることを示唆している（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００３−１６４２９８号公報
【非特許文献１】Tomita S, Ozaki T, Taru H, Oguchi S, Takeda S, Yagi Y, Sakiyama S, Kirino Y, Suzuki T. Interaction of a neuron-specific protein containing PDZ domains with Alzheimer's amyloid precursor protein. J Biol Chem. 1999 Jan 22;274(4):2243-54.
【非特許文献２】Araki Y, Tomita S, Yamaguchi H, Miyagi N, Sumioka A, Kirino Y, Suzuki T. Novel cadherin-related membrane proteins, Alcadeins, enhance the X11-like protein-mediated stabilization of amyloid beta-protein precursor metabolism. J Biol Chem. 2003 Dec 5;278(49):49448-58.
【非特許文献３】Araki Y, Miyagi N, Kato N, Yoshida T, Wada S, Nishimura M, Komano H, Yamamoto T, De Strooper B, Yamamoto K, Suzuki T. Coordinated metabolism of Alcadein and amyloid beta-protein precursor regulates FE65-dependent gene transactivation. J Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23):24343-54.
【非特許文献４】McLoughlin DM, Irving NG, Brownlees J, Brion JP, Leroy K, Miller CC. Mint2/X11-like colocalizes with the Alzheimer's disease amyloid precursor protein and is associated with neuritic plaques in Alzheimer's disease.Eur J Neurosci. 1999 Jun;11(6):1988-94.
【非特許文献５】Lee JH, Lau KF, Perkinton MS, Standen CL, Rogelj B, Falinska A, McLoughlin DM, Miller CC. The neuronal adaptor protein X11beta reduces amyloid beta-protein levels and amyloid plaque formation in the brains of transgenic mice. J Biol Chem. 2004 Nov 19;279(47):49099-104.
【非特許文献６】Uhlik MT, Abell AN, Johnson NL, Sun W, Cuevas BD, Lobel-Rice KE, Horne EA, Dell'Acqua ML, Johnson GL. Rac-MEKK3-MKK3 scaffolding for p38 MAPK activation during hyperosmotic shock. Nat Cell Biol. 2003 Dec;5(12):1104-10.
【非特許文献７】Seet BT, Pawson T. MAPK signaling: Sho business. Curr Biol. 2004 Sep 7;14(17):R708-10. Review.
【非特許文献８】Saiardi A, Bhandari R, Resnick AC, Snowman AM, Snyder SH. Phosphorylation of proteins by inositol pyrophosphates. Science. 2004 Dec 17;306(5704):2101-5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記（１）に属する、新規なＡＤ治療薬の開発を目的とする。具体的には直接ＡＰＰ切断酵素を阻害することなく、上記（３）の方法と同様に、細胞外からの薬剤による活性化が可能なＡβ生成抑制剤の提供、それを含むＡＤ治療薬の提供及びそれを得る為のスクリーニング方法の提供等を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、以下の知見を得た。
１）細胞を高浸透圧処理した場合、ＡＰＰへのＸ１１Ｌの結合が増加すること、
２）高浸透圧刺激は、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進し、このリン酸化がＡＰＰへの結合を強めること、
３）Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合サイトは中央のＰｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ（ＰＩ）ドメイン（アミノ酸番号３６８〜５５５）であるが、ＡＰＰへの結合を強める領域はＰＩドメインのＮ末端側２２１〜２５０の間にあること、及び
４）Ｘ１１Ｌの２２１〜２５０領域のリン酸化可能アミノ酸に変異を導入し、高浸透圧刺激でＡＰＰへの結合が増加しないことを指標に、２箇所のリン酸化サイトとして２３６番目のセリン（以下、Ｓｅｒ２３６ともいう）及び２３８番目のセリン（以下、Ｓｅｒ２３８ともいう）が同定されたこと。
これらの知見をもとに、Ｘ１１Ｌのリン酸化を制御することによってＸ１１ＬのＡＰＰへの結合を強化しＡＰＰからＡβの生成を抑制し得ることが可能になった。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００６】
〔１〕Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合増強剤。
〔２〕Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体の代謝抑制剤。
〔３〕Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、βアミロイド生成抑制剤。
〔４〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ
酸番号２２１〜２５０の領域内にある、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔５〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤を含む、βアミロイドが関連する疾患の予防・治療剤。
〔７〕βアミロイドが関連する疾患が、アルツハイマー病である、上記〔６〕記載の予防・治療剤。
〔８〕Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体タンパク質とＸ１１Ｌタンパク質との結合を増強する方法。
〔９〕Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制する方法。
〔１０〕Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、βアミロイドの生成を抑制する方法。
【０００７】
〔１１〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、上記〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、上記〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物のスクリーニング方法。
〔１４〕Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
〔１５〕Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、βアミロイドの生成を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
〔１６〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、上記〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１７〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、上記〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１８〕リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いることを特徴とする上記〔１３〕〜〔１７〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＡＰＰが代謝を受けＡβが産生されるのを効果的に抑制することができ、従って、アルツハイマー病等の、Ａβがその発症原因の一つといわれている種々の疾患の新しい予防法や治療法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
細胞に高浸透圧刺激を与えた場合、Ｘ１１Ｌのリン酸化が促進され、このリン酸化がＡＰＰへの結合を強めている、という、本発明者らが得た知見は、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物がＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強してＡＰＰの代謝を抑制し、それによってＡβの生成を抑制し得ることを示している。従って本発明は、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有するＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合増強剤、ＡＰＰの代謝抑制剤及びＡβ生成抑制剤を提供する。また、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強する方法、ＡＰＰの代謝を抑制する方法及びＡβ生成を抑制する方法を提供する。
本発明において有効成分として含められるＸ１１Ｌのリン酸化促進作用を有する化合物としては、Ｘ１１Ｌタンパク質のリン酸化を促進する化合物であれば特に限定されないが、詳細には、Ｘ１１Ｌタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０領域内にあるリン酸化部位のリン酸化、より好ましくはＳｅｒ２３６及び／又はＳｅｒ２３８をリン酸化し得る化合物である。より好ましくはＳｅｒ２３６及びＳｅｒ２３８の両方のセリン残基をリン酸化し得る化合物である。
【００１０】
高浸透圧刺激により活性化される細胞内情報伝達系リン酸化酵素としては、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーが考えられる（非特許文献６）。これらのリン酸化酵素群を活性化する化合物として高浸透圧剤の他に、例えば過酸化水素、熱ショック、タンパク質合成阻害剤、紫外線、放射線、抗ガン剤、ＬＰＳ、炎症性サイトカイン、ＴＧＦ−β、ＦＡＳ、カプサイシン酸のいわゆるストレス応答惹起物質および環境が考えられる。しかしながら、Ｘ１１Ｌのリン酸化を行うキナーゼが、これら既知の情報伝達系によって活性化されるキナーゼ以外である可能性もあり、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進、もしくはＡＰＰとの結合を促進する化合物であればＭＡＰキナーゼスーパーファミリー以外のキナーゼを介してリン酸化を促進、もしくはＡＰＰとの結合を促進してもよい。酵母では、高浸透圧を感知する細胞膜受容体Ｓｈｏ１、Ｓｌｎ１が知られており、その下流に位置するキナーゼとしてＨｏｇ１（ＭＡＰＫ）が同定されており、このキナーゼによる何らかの基質リン酸化が、酵母の高浸透圧耐性反応を惹起していると考えられている（非特許文献７）。哺乳類ではＳｈｏ１／Ｓｌｎ１からＨｏｇ１に相当する情報伝達系が明らかになっていないが、このような哺乳類において未同定の経路を活性化する薬剤であっても、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進、もしくはＡＰＰとの結合を促進する効果があればよい。また、最近キナーゼを介さず、イノシトールピロリン酸と呼ばれる高エネルギー結合を持ったイノシトールリン酸が直接、タンパク質をリン酸化する経路が見いだされており（非特許文献８）、Ｘ１１Ｌのリン酸化がこのような新規経路によって促進され、その結果としてＡＰＰとの結合を促進する場合は、キナーゼを介さないタンパク質リン酸化経路を活性化する薬剤であっても差し支えない。
【００１１】
本発明において、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物の、Ｘ１１ＬのＡβへの結合を増強する能力（結合能の増強）は、当該化合物で処理した場合のＸ１１ＬのＡβへの結合能における変化を、例えば、エピトープタグを用いた共役免疫沈降（例えば、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法）、共鳴プラズモン相互作用解析などにより評価することができる。結合能の評価として、具体的には、下記方法等が挙げられる。
尚、本発明において結合能評価方法で用いる細胞は、Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰを発現し得る細胞であれば特に限定されず、本来の性質としてＸ１１Ｌ及びＡＰＰを発現しＡβを生成し得るものであっても、各タンパク質発現プラスミドをトランスフェクトすることによって各タンパク質を発現するように改変されたものであってもよい。
Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰを発現し得る細胞として具体的には、これらの遺伝子を含有するベクターで形質転換した形質転換体を用いることができるが、他にＩＭＲ−３２、ＰＣ１２ｈ、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（Ｎ２ａ）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨなどの細胞株、又はＡＰＰとＸ１１Ｌを導入したＨＥＫ−２９３などの細胞株を用いることもできる。
【００１２】
結合能評価方法１（共免疫沈降法）
（１）ＦＬＡＧ等のタグ配列を有するＸ１１Ｌ又はＡＰＰ発現プラスミド（シグナル配列の下流にＦＬＡＧ等のタグ配列を有するＡＰＰ発現プラスミド（ＦＬＡＧ−ＡＰＰ）又はＸ１１ＬのＮ−末又はＣ−末等にＦＬＡＧ等のタグ配列を有するＸ１１Ｌ発現プラスミド（ＦＬＡＧ−Ｘ１１Ｌ又はＸ１１Ｌ−ＦＬＡＧ））を得るステップ；
（２）細胞に、前記ステップ（１）で得られたＦＬＡＧ−Ｘ１１Ｌ発現プラスミド（又はＦＬＡＧ−ＡＰＰ発現プラスミド）とＡＰＰ発現プラスミド（又はＸ１１Ｌ発現プラスミド）とを、一過的にコトランスフェクトして、コトランスフェクタントを得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られたコトランスフェクタントを培養して、培養細胞を得るステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた培養細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（５）前記ステップ（４）で得られた処理後の培養細胞から、細胞抽出液を得るステップ；
（６）前記ステップ（５）で得られた細胞抽出液に抗ＦＬＡＧ抗体を加えて共免疫沈降を行なうステップ；並びに
（７）共免疫沈降を、ウエスタンブロット解析により検出するステップ；を含む方法。
かかる評価方法１においては、抗ＦＬＡＧ抗体を用いる場合において、Ｘ１１Ｌ−ＡＰＰの複合体の沈降がみられることをＸ１１ＬとＡＰＰとが結合することの指標とし、その程度を評価する。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１３】
結合能評価方法２（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法）
（１）Ｘ１１Ｌ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を培養して培養細胞を得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られた培養細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた処理後の培養細胞から細胞抽出液を得るステップ；（５）ＧＳＴとＡＰＰとからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＡＰＰ）、好ましくはＧＳＴとＡＰＰ細胞質ドメインとからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔ）を得るステップ（ＡＰＰはアミノ酸残基６９５からなるタンパク質であり、全てをＧＳＴ−融合タンパク質で生合成し回収するのは難しい。従って、Ｘ１１Ｌの結合部位であるＡＰＰの細胞質ドメイン４７アミノ酸だけＧＳＴ融合タンパク質として調製する。この方法はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２２４３−２２５４（１９９９）に記載されている）；
（６）融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＰＰ（好ましくはＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔ）と前記ステップ（４）で得られた細胞抽出液とを接触させるステップ；
（７）グルタチオンビーズでタンパク質を、回収するステップ；並びに
（８）抗Ｘ１１Ｌ抗体を用いたウエスタンブロット解析を行い、ＧＳＴ−ＡＰＰ（好ましくはＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔ）とＸ１１Ｌとの複合体を検出するステップ；を含む方法。
かかる評価方法２においては、ＧＳＴ−ＡＰＰとＸ１１Ｌとの複合体の存在をＸ１１ＬとＡＰＰとが結合することの指標とする。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１４】
結合能評価方法３（共鳴プラズモン相互作用解析）
（１）Ｘ１１Ｌ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を培養して培養細胞を得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られた培養細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた処理後の培養細胞から細胞抽出液を得、Ｘ１１Ｌを得るステップ；
（５）ＡＰＰを固定化したチップに、前記ステップ（４）で得られたＸ１１Ｌを一定の流速で、送液するステップ；及び
（６）適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度など）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳなど）〕により相互作用を検出するステップ；を含む方法。
ここで、Ｘ１１ＬとＡＰＰとからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、Ｘ１１ＬとＡＰＰとが結合することの指標とする。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１５】
結合能評価方法４（ＦＲＥＴ法）
Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰに蛍光タンパク質を融合させたｃＤＮＡを細胞に発現させ、当該細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理する。Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰの両者の結合をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）で検出する。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１６】
結合能評価方法５（レポーターアッセイ法）
ＡＰＰの細胞質ドメイン断片（ＡＩＣＤ）がｇｅｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ活性を示す（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３，１１５−１２０（２００１））ことが知られており、この特性を利用してＸ１１ＬとＡＰＰとの結合能を評価することができる。具体的には以下のような手順で行うことができる（図１４参照）
（１）酵母転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとＸ１１Ｌの融合タンパク質Ｇａｌ４ＢＤ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミドおよび、Ｇａｌ４の転写活性化ドメインとＡＩＣＤの融合蛋白質ＡＩＣＤ−Ｇａｌ４ＡＤをコードするプラスミドを作成するステップ；
（２）レポーター遺伝子として、Ｇａｌ４結合配列を上流にもつルシフェラーゼもしくはＧＦＰもしくは抗生物質耐性タンパク質遺伝子を作成するステップ；
（３）前記（１）のプラスミド２種および（２）のプラスミドを細胞に導入し、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を細胞に作用させるステップ；
（４）Ｘ１１ＬとＡＩＣＤとの結合が促進されることにより、レポーター遺伝子の発現が増加する事をレポーター遺伝子産物による細胞の発色または死滅でアッセイする。
【００１７】
また、ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が増強されたことによるＡＰＰの代謝抑制作用は、例えば、パルスチェイス法、免疫測定法などにより評価することができる。パルスチェイス法は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９５８２（２００３）のＦｉｇ．５に記載した方法等を用いることが出来る。
【００１８】
具体的には、例えば、下記方法が挙げられる。
代謝分解抑制能評価方法１（パルスチェイス法）
（１）Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰ発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（３）前記ステップ（１）で得られた細胞を、３５Ｓ−標識メチオニン含有培地で一定時間培養し、ついで、過剰量のメチオニンを添加するステップ；
（４）培養液と細胞抽出液とを調製し、抗ＡＰＰ抗体を用いた免疫沈降により、タンパク質を回収するステップ；及び
（５）回収されたタンパク質をゲル上で電気泳動して分離し、シグナルの解析を行い、それにより量的変動を調べるステップ；を含む方法。
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。また、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物での処理は３５Ｓ−標識メチオニン含有培地における培養と同時か、あるいは培養より前に行われることが好ましい。
【００１９】
代謝分解抑制能評価方法２（免疫測定法）
（１）Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰ発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；及び
（３）前記ステップ（２）により得られた処理後の細胞の培養上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡβ濃度を測定するステップ；を含む方法。
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００２０】
さらに、ＡＰＰ代謝が制御されたことによるＡβ生成の抑制作用は、例えば上記代謝分解抑制機能評価方法２と同様にしてＡβ濃度を測定することによって確認することができる。
【００２１】
各タンパク質（ポリペプチド）の発現プラスミドや各融合タンパク質の合成、細胞へのトランスフェクション、免疫沈降等の種々の操作は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができる。
【００２２】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物は、上述のようにＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し、それによってＡＰＰの代謝を抑制し、ひいてはＡβの生成を抑制する。従ってＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物は、Ａβが関連する疾患、特にＡβの生成が不都合な疾患の予防又は治療に有用である。Ａβの生成が不都合な疾患とは、Ａβがその発症原因になっているか、あるいは増悪因子である疾患であり、特にアルツハイマー病が挙げられる。
【００２３】
本発明に有効成分として含められる、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物は塩を形成していてもよく、そのような塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
【００２４】
金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。
【００２５】
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
【００２６】
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
【００２７】
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【００２８】
このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、又は酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
【００２９】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を上記の医薬として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質を用いる場合には生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。
【００３０】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００３１】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒト又は温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。製剤中の有効成分の含有量、該製剤の投与量及びその投与回数は、投与化合物の種類、投与対象、症状、投与方法などに応じて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し、ＡＰＰの代謝を抑制し、且つＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうる範囲で適宜設定され得る。
【００３２】
投与手段は、特に神経細胞に作用し得、ＡＰＰの代謝を制御し、かつＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうるものであれば、特に限定されるものではない。
【００３３】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することによりＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が増強されてＡＰＰ代謝が抑制され、Ａβの生成が抑制されるという本発明で得られた知見に基づいて、Ｘ１１Ｌのリン酸化の程度を測定することを含む、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰと
Ｘ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰの代謝を抑制し得る化合物及びＡβの生成を抑制し得る化合物（以下、これらの化合物をあわせて本発明化合物と称する）のスクリーニング方法が提供される。本発明化合物は上記同様、Ａβが関連する疾患、特にアルツハイマー病の予防又は治療に有効である。
【００３４】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルの上昇は、当分野で通常実施されている方法を用いて間接的に、又直接的に測定することができる。リン酸化は好ましくはＸ１１Ｌタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にあるリン酸化可能部位で行われ、特に好ましくはＳｅｒ２３６及び／又はＳｅｒ２３８でリン酸化が起こる。
ここで、「Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルの測定」とは、Ｘ１１Ｌのリン酸化の有無を調べることに加え、例えば、２３６番目及び２３８番目のいずれか一方のセリンがリン酸化されているのか、あるいは両方ともリン酸化されているのか、等のＸ１１Ｌのリン酸化様式を調べることも含まれる。Ｘ１１Ｌのリン酸化様式を調べる方法としては、各リン酸化サイト特異抗体（後述）を用いて認識する方法や、Ｘ１１Ｌをトリプシン等のプロテアーゼで分解し、その分解産物を質量分析で解析しリン酸化サイトを同定する方法等が挙げられる。
リン酸化レベルの間接的な測定方法としては、Ｘ１１Ｌがリン酸化されるとＡＰＰとの結合が増強されるという本発明で得られた知見から、両者の結合能の増加でもって調べる方法が挙げられる。例えば、Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰに蛍光タンパク質を融合させたｃＤＮＡを細胞に発現させ、両者の結合増加をＦＲＥＴで検出する方法等が例示される。直接的な測定方法としては、Ｘ１１Ｌ特異抗体やリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いた方法等が挙げられる。
リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体としては、当分野で通常実施されている方法によって作製することができ、好ましくはモノクローナル抗体である。好ましいリン酸化Ｘ１１Ｌ抗体は、Ｓｅｒ２３６のリン酸化を認識する抗体、Ｓｅｒ２３８のリン酸化を認識する抗体、Ｓｅｒ２３６とＳｅｒ２３８の両方のリン酸化を認識する抗体の３種であり、それらを併用することがいっそう好ましい。リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体は、リン酸化されたＸ１１Ｌタンパク質（特にＳｅｒ２３６及び／又はＳｅｒ２３８がリン酸化されている）をリン酸化特異的に認識することができるので、試料、好ましくは細胞抽出液等の試料溶液中のリン酸化されたＸ１１Ｌタンパク質の定量、組織染色等による検出に利用することができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法においてリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いてリン酸化Ｘ１１Ｌを定量する工程は、特に制限されるべきものではなく、試料中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法及びサンドイッチ法が好適に用いられる。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００３６】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担
体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラスなどが用いられる。サンドイッチ法においては不溶化したモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化したモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量等を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤及び不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法によるリン酸化Ｘ１１Ｌタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられるモノクローナル抗体は、当該タンパク質に結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応及び２次反応に用いられる抗体は、例えば、Ｘ１１Ｌ特異抗体とリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体の組み合わせであり得る。
【００３７】
サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどを用いることもできる。
【００３８】
これら個々の免疫学的測定法を本発明のスクリーニング方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３９】
本発明化合物の候補となり得る試験化合物は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４０】
ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物は、Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングすることによって得られる。具体的なスクリーニング方法は、例えば、以下の手順にて行うことができる（図１５参照）。
（１）Ｘ１１ＬのＳｅｒ２３６又はＳｅｒ２３８、及びＳｅｒ２３６とＳｅｒ２３８の両方がリン酸化された状態を特異的に認識する抗体を作成するステップ−抗原としてＳｅｒ２３６がリン酸化されたペプチド、Ｓｅｒ２３８がリン酸化されたペプチド、及びＳｅｒ２３６とＳｅｒ２３８の両方がリン酸化されたペプチドを用いて、これらのサイトが特異的にリン酸化されたＸ１１Ｌと特異的に反応するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の作成を行う。方法はＴｈｒ６６８でリン酸化されたＡＰＰを特異的に認識する抗体を作成する方法(文献 Methods in Molecular Medicine Vol32:Alzheimer’s Disease: Me
thods and Protocols (Edited by N. H. Hooper Humana Press) pp271-282
“Phosphorylation of amyloid precursor protein (APP) family protein”, Suzuki, T., Ando, K., Iijima, K., Oguchi, S., & Takeda, S.)に準じる；
（２）Ｘ１１Ｌ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られた細胞を培養して培養細胞を得るステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた培養細胞を試験化合物で処理するステップ；
（５）前記ステップ（４）で得られた処理後の培養細胞から細胞抽出液を得、Ｘ１１Ｌを得るステップ；
（６）ＥＬＩＳＡプレートにＸ１１Ｌ抗体を固定するステップ；
（７）固定化したプレートに前記（５）で得たＸ１１Ｌを含む細胞抽出液を加え、抗体と反応させるステップ；
（８）洗浄後、前記（１）で得られた抗Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体でプレートにトラップしたリン酸化Ｘ１１Ｌを挟むステップ；
（９）適当な手段（酵素発色反応）等で、リン酸化Ｘ１１Ｌを検出するステップ。
上記方法では、一次抗体（キャプチャー）としてＸ１１Ｌ抗体を用い、二次抗体としてＸ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いたが、逆でもよい。
また、前記（５）の細胞抽出液をニトロセルロース膜等にスポットし、これに対してＸ１１Ｌリン酸化特異抗体を反応させるイムノドットブロット法でも良い（図１６参照）。また、細胞を固定し、Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体で染色させる方法（いわゆるＣｙｔｏｂｌｏｔ法）でもよい（図１７参照）。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、リン酸化Ｘ１１Ｌ抗体を用いたＸ１１Ｌのリン酸化レベルの測定を一次スクリーニングとし、Ａβの産生量の測定を二次スクリーニングとしてもよい。一次スクリーニングで選別された試験化合物の存在下又は非存在下におけるＡβの産生量を測定し、比較する。Ａβの測定法には種々の方法が用いられるが、Ａβ特異的抗体を用いる免疫化学的方法を用いることが好ましい。これらの方法には、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法あるいはそれらの組み合わせ方法が用いられる。Ａβ特異的抗体としては、ポリクローナル抗体を用いても良いが、例えば、ＢＡＮ５０、ＢＮＴ７７、ＢＳ８５、ＢＡ２７、ＢＣ０５（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，１０２７２−１０２７８（１９９５））又は６Ｅ１０、４Ｇ８などのモノクローナル抗体を用いても良い。とりわけ、ＢＡ２７及びＢＣ０５は、それぞれＡβ４０及びＡβ４２／４３に選択的な抗体であるため、これらの抗体、あるいは同様な選択性を有する抗体を用いれば、Ａβ４０の産生を阻害する化合物、Ａβ４２／４３の産生を阻害する化合物、あるいはＡβ４０及びＡβ４２／４３いずれの産生も阻害する化合物を選択することが可能となる。さらに、分泌型ＡＰＰ量はＡβの産生を間接的に反映すると考えられることから、分泌型ＡＰＰ量を免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法などの免疫化学的方法で検出しても良い。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、試験化合物の存在下におけるＡβ産生量が、試験化合物の非存在下におけるＡβ産生量に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少している試験化合物をＡβの産生を阻害する化合物又はその塩として選択することができる。また、コントロールとして、ＡＰＰを発現していない細胞を用いて、試験化合物の存在下におけるＡβ産生量を測定することもできる。
【００４３】
上記したスクリーニング方法で得られた化合物又はそれから誘導される化合物は、塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水
素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
【００４４】
上記した本発明のスクリーニング方法で得られた化合物は、Ａβの産生を効率良く阻害することができるので、Ａβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療剤として使用することができる。本発明のスクリーニング方法で得られた化合物を含有する医薬は、それ自体又は適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記化合物又はその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。また、例えば非経口投与に適する剤形としては、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与剤、経皮投与剤、軟膏剤など）、座剤（例、直腸剤、膣座剤など）、徐放剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）、ペレット、点滴剤などが用いられる。
【００４５】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒト又は温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。製剤中の有効成分の含有量、該製剤の投与量及びその投与回数は、投与化合物の種類、投与対象、症状、投与方法などに応じて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し、ＡＰＰの代謝を抑制し、且つＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうる範囲で適宜設定され得る。
【００４６】
リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体は上記スクリーニング方法に用いられるだけでなく、当該抗体を用いＸ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することによって、Ａβに関連する各種疾患の診断を行なうことができる。例えば、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルが低下している場合は、ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が弱くＡＰＰが代謝されてＡβが過剰に生産されている。一方Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルが上昇している場合にはＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が強くＡＰＰが代謝を受けにくい状態にあり、従ってＡβの産生が抑制されている。前者の場合、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβ関連疾患（例えばアルツハイマー病など）などの疾病である可能性ありと診断することができる。一方、後者の場合でも、異常なレベルの変化は、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβ関連疾患などの疾病である可能性ありと診断することができる。
【００４７】
本発明化合物のスクリーニング方法としては、例えば以下のようなプロトコルが例示される。
（１）Ｘ１１Ｌ発現細胞に対し、試験化合物を作用させる。培地を除去し、当該細胞から細胞抽出液を得て、Ｘ１１Ｌ特異抗体とリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体で挟むサンドイッチエライザ法で解析し、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを上昇させる化合物（陽性化合物）をスクリーニングする。陽性化合物をＡＰＰとＸ１１Ｌとを共発現している細胞に作用させ、培地中に分泌されるＡβ量を測定してＡβ量の分泌量が抑制されている化合物を選択する工程を二次スクリーニングとして行ってもよい。
（２）Ｘ１１Ｌ発現細胞に対し、試験化合物を作用させる。培地を除去した後、細胞を溶解し、得られた抽出液を膜上にブロットし、リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いたイムノブ
ロットで解析し、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを上昇させる化合物（陽性化合物）をスクリーニングする。陽性化合物について（１）と同様に二次スクリーニングを行う。
（３）Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰに蛍光タンパク質を融合させたｃＤＮＡを細胞に発現させ、試験化合物を作用させ、両者の結合増加をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）で検出することで、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを上昇させる化合物（陽性化合物）をスクリーニングする。Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合量増加は、ＦＲＥＴの発色で検出することができる。
いずれの方法についても、試験化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分〜数時間程度である。処理時の温度も用いる細胞の種類に応じて適宜設定された培養温度と同様なものが利用できる。
【００４８】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【００４９】
実施例１：神経細胞におけるＸ１１Ｌ及びＸ１１のリン酸化（図１）
（方法）
１８日齢ラット胎児海馬を摘出し、トリプシンで分散させた後、ポリ−Ｄ−リジンでコートした培養プレートに５×１０５細胞／ｍＬ濃度で播種した。細胞は０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン及び０．０１ｍｇ／ｍＬ ピルビン酸を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中３７℃で培養した。７日間培養後、培地をリン酸を含まない培地に置換し、これに[３２Ｐ]オルソリン酸塩を添加した。添加から２時間後に細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液（１０ｍＭ
ＣＨＡＰＳ，５μｇ／ｍＬ キモスタチン，５μｇ／ｍＬ ロイペプチン，５μｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，１ｍＭ ＮａＦ及び０．５ｍＭ マイクロシスチンＬ−Ｒを含有するＰＢＳ）で可溶化し、抗Ｘ１１Ｌモノクローナル抗体（Ｍｉｎｔ２ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｒｙ Ｃａｔ＃ Ｍ７６１２０）で免疫沈降した。これをプロテインＧセファロースで回収し、洗浄した。これを細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ；ｔａｋａｒａ）の存在下（ＢＡＰ処理）、あるいは非存在下（対照）でインキュベートし、再度セファロースを洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加した。サンプルを７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ゲルを濾紙上で乾燥させ、Ｘ線フィルムに感光させ、オートラジオグラフィーによりリン酸化Ｘ１１Ｌを検出した。同様な方法でリン酸化Ｘ１１を検出した。
（結果）
Ｘ１１Ｌ及びファミリー分子Ｘ１１が神経細胞でリン酸化されていることが明らかとなった。
【００５０】
実施例２：ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌの結合増強効果（１）（図２）
（方法）
ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで培養したＨＥＫ２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＦＬＡＧ−ＡＰＰをコードするプラスミド（０．６μｇ）及びＨＡ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミド（０．２μｇ）を導入した。ＦＬＡＧ−ＡＰＰをコードするプラスミドとしては、ＡＰＰ６９５（６９５個のアミノ酸からなるＡＰＰアイソフォーム）の１７番目のアラニン（Ａｌａ１７）と１８番目のロイシン（Ｌｅｕ１８）との間にＦＬＡＧ配列が挿入されているＦＬＡＧ−ＡＰＰをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだものを用いた（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，４４２１−４４２７（１９９９））。ＨＡ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミドとしては、Ｘ１１ＬのＮ末端にＨＡタグが付いたＨＡ−Ｘ１１ＬをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだものを用いた（ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−Ｘ１１Ｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９４５８（２００３））。
導入から２４時間後に培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ又はこれにオカダ酸（終濃度４００ｎＭ、３時間処理）若しくはソルビトール（終濃度０．５Ｍ、４５分間処理）を添加し、処理後の細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳｉｇｍａのＭ２）で共役免疫沈降を行った。これをプロテインＧセファロースで回収し洗浄した。これらにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜のＨＡ−Ｘ１１Ｌは抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅの１２ＣＡ５）、ＦＬＡＧ−ＡＰＰは抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットにより検出した。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
細胞をソルビトールで刺激した場合に、細胞内におけるＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が増強することが明らかになった。オカダ酸は効果を示さなかった。
【００５１】
実施例３：ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌの結合増強効果（２）（図３）
（方法）
ＨＥＫ２９３細胞にＨＡ−ｈＸ１１ＬをコードするプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入した（ｈＸ１１Ｌ発現細胞）。ＨＡ−ｈＸ１１Ｌをコードするプラスミドとしては、ｈＸ１１ＬのＮ末端にＨＡタグが付いたＨＡ−ｈＸ１１ＬをｐｃＤＮＡ３
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだものを用いた（ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−ｈＸ１１Ｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２１６２８−３６（２００４））。
２４時間後、０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した（高浸透圧刺激）。ソルビトールを含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで同様に４５分間処理したものを対照群とした。その後、細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し細胞溶解物とした。
ＡＰＰ細胞内領域タンパク質（ＡＰＰ６９５アイソフォームのＡＰＰ６４９−６９５）のアミノ末端側にＧＳＴタンパク質を融合させたタンパク質（ＧＳＴ−ＡＰＰ）を大腸菌に発現させ、培養後、グルタチオンセファロースで精製し、融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＰＰを得た。これを先に得られた細胞溶解物と混合し４℃で２時間インキュベートした後、グルタチオンセファロースでＧＳＴ−ＡＰＰを回収し、洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加して７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜のＸ１１Ｌは抗Ｘ１１Ｌモノクローナル抗体を用いたイムノブロットにより検出した。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
Ｘ１１Ｌを発現している細胞にソルビトール刺激を行ったところ、細胞溶解物中のＸ１１ＬはＧＳＴ−ＡＰＰ細胞質ドメインにより多く結合する。本結果よりソルビトール刺激がＸ１１Ｌを修飾してＡＰＰとの結合を増強していることが示された。
【００５２】
実施例４：Ｘ１１Ｌの脱リン酸化とＡＰＰへの結合能の消失（図４）
（方法）
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルの培養皿で培養し、０．７μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−Ｘ１１Ｌを導入してＨＡ−Ｘ１１Ｌを強制発現させた。２４時間後、０．５Ｍソルビトールにより刺激した（図４中、ソルビトール ＋）。一方で、ソルビトール刺激しない細胞を調製した（図４中、ソルビトール −）。２００μＬのλＰＰａｓｅ溶解バッファーにより可溶化後遠心しＬｙｓａｔｅとし、５倍量のλＰＰａｓｅ反応バッファー中で３０℃、３０分反応させ脱リン酸化処理を行った（図４中、λＰＰａｓｅ ＋）。一方で、脱リン酸化処理を行わなかったサンプルを調製した（図４中、λＰＰａｓｅ −）。５μｇのＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔを結合させたｒｅｓｉｎに反応液（ｉｎｐｕｔ）と終濃度２ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、全量２００μＬにてＣＨＡＰＳバッファー中で２時間インキュベートした。３回のＣＨＡＰＳバッファーでの洗浄後サンプルバッファーで溶出しＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。ＨＡ−Ｘ１１Ｌの検出には抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔの検出には抗ＧＳＴ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）をそれぞれ用いた。また脱リン酸化処理の指標としてＸ１１Ｌの３０４番目のＴｈｒがリン酸化した状態に反応するＵＴ３３抗体（Ando K, Oishi M, Takeda S, Iijima K, Isohara T, Nairn AC, Kirino Y, Greengard P, Suzuki T. Role of phosphorylation of Alzheimer's amyloid precursor protein during neuronal differentiation. J
Neurosci. 1999 Jun 1;19(11):4421-7.を参照して調製できる）を用いた。Ｖｅｒｓａ Ｄｏｃ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により定量化し、高浸透圧、脱リン酸化ともに未処理のサンプルを１としてグラフ化した。
・λＰＰａｓｅ溶解バッファー：０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
・λＰＰａｓｅ反応バッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＢＲＩＪ３５（１０×ｂｕｆｆｅｒ），２ｍＭ ＭｎＣｌ２（１０×ＭｎＣｌ２），１０μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１０μｇ／ｍＬ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，１０μｇ／ｍＬ ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ
・４００ユニットのλＰＰａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）／１５μＬ ｌｙｓａｔｅ又は１ｍＭ ＮａＦ＋１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４ （コントロール用）
・ＣＨＡＰＳバッファー：１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，１０ｍＭ Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．４，５μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍＬ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，５μｇ／ｍＬ ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ，１μＭ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ
【００５３】
実施例５：Ｘ１１Ｌのリン酸化を介したＡＰＰへの結合能増強とＪＮＫ（図５）
（方法）
実施例３と同様にして、ＨＥＫ２９３細胞にＸ１１Ｌをコードするプラスミドを導入した。２４時間後、ＪＮＫ阻害剤であるＳＰ６００１２５（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）を０、２５、１００μＭ存在下、０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した（高浸透圧刺激）。ソルビトールを含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで同様に４５分間処理したものを対照群とした。これとは別に、ＨＥＫ２９３細胞に、Ｘ１１Ｌ及びＪＮＫ阻害効果を持つＪＢＤ（ＪＮＫ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）又はＪＮＫタンパク質をコードするプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入した。ＪＢＤをコードするプラスミドとしてｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＪＢＤを、ＪＮＫをコードするプラスミドとしてｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＪＮＫを用いた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２１６２８−２１６３６（２００４））。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ソルビトールを含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで同様に４５分間処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し細胞溶解物とした。これの１／１００量をタンパク質発現チェック用のサンプルとした。図５中ではｉｎｐｕｔとして示した。
実施例３と同様にして、得られた細胞溶解物と、ＡＰＰの細胞質ドメイン（ＡＰＰｃｙｔ）とＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔをインキュベートして、細胞溶解物中のＸ１１ＬとＡＰＰｃｙｔとの結合をイムノブロットにより調べた。ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＡＰＰｃｙｔ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２１６２８−２１６３６（２００４））で発現させた。
（結果）
ソルビトール刺激で活性化する代表的なタンパク質リン酸化酵素は、ストレスキナーゼであるＪＮＫである。しかしながら、本実験からＪＮＫの阻害剤、阻害ペプチド（ＪＢＤ）はソルビトール刺激によるＸ１１ＬのＡＰＰ結合増強を阻害しないことがわかった。ま
た、ＪＮＫの強制発現もソルビトール刺激によるＸ１１ＬのＡＰＰ結合をさらに増強しなかった（この条件下でＪＮＫが活性化されているということは別途確認済み）。すなわち、Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合増強を行うＸ１１Ｌリン酸化酵素がＪＮＫではないことが示された。
【００５４】
実施例６：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域の同定（その１：Ｎ末端領域の解析）（図６）
（方法）
Ｘ１１Ｌタンパク質の各ドメインを含む構築プラスミドを作成し、それぞれ、Ｎ＋ＰＩ（１〜５５５アミノ酸）、ＰＩ＋Ｃ（３６８〜７４９アミノ酸）、ΔＭＩ（２６８〜７４９アミノ酸）、ΔＰＤＺ２（１〜６６０アミノ酸）とした（図６下）。これらのＮ末端側にはＦＬＡＧ配列が付加してある。
各プラスミドは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２２４３−２２５４（１９９９）に記載される方法に準じて調製した。
Ｘ１１Ｌ：Ｘ１１Ｌ（１−７４９全長） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ
Ｎ＋ＰＩ：Ｘ１１Ｌ（１−５５５） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ（Ｎ＋ＰＩ）
ＰＩ＋Ｃ：Ｘ１１Ｌ（３６８−７４９） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ（ＰＩ＋Ｃ）
ΔＭＩ：Ｘ１１Ｌ（２６８−７４９） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１ＬＭＩ
ΔＰＤＺ２：Ｘ１１Ｌ（１−６６０） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１ＬΔＰＤＺ２
実施例２と同様の手順でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてこれらのＸ１１Ｌコンストラクト（０．４μｇ）とＡＰＰをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５；０．７μｇ）をＨＥＫ２９３細胞に導入した。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、抗ＦＬＡＧ抗体で共役免疫沈降を行った。免疫沈降物をプロテインＧセファロースで回収し、洗浄した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜上のＡＰＰ及びＸ１１Ｌについて抗ＡＰＰポリクローナル抗体（Ｇ３６９抗体；Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ大学のＳａｍｕｅｌ Ｇａｎｄｙ博士から供与された；Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３，１１１−１２３，１９９７）及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
ソルビトール刺激によるＸ１１ＬとＡＰＰとの結合増強にはＸ１１ＬのＰＩドメインよりＮ末端側の領域が必要であることが明らかになった。ＰＩドメインはＡＰＰへの結合領域である。特にＮ末端領域の前半２６７アミノ酸を欠失したＸ１１ＬはＡＰＰへの結合増強能力を失っていたので、この領域にＡＰＰへの結合能を制御するＸ１１Ｌのリン酸化サイトが含まれる事が明らかになった。
【００５５】
実施例７：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域の同定（その２：Ｎ末端領域の解析）（図７）
（方法）
Ｘ１１Ｌの２２１から２５０アミノ酸を欠失したコンストラクトをコードするプラスミド（Ｘ１１ＬΔ２２１−２５０）は、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ｈＸ１１Ｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２００７０−２００７８ １９９９）を鋳型にメガプライマー法を用いて作成し、このＮ末端側にＦＬＡＧ配列を付加した（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１ＬΔ２２１−２５０）。実施例２と同様な手順で、０．４μｇのＸ１１ＬΔ２２１−２５０もしくはＸ１１Ｌをコードするプラスミド（それぞれ、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈ
Ｘ１１ＬΔ２２１−２５０又はｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ）と０．６μｇのＡＰＰをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５）とをＨＥＫ２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入した。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、抗ＡＰＰポリクローナル抗体（Ｇ３６９）で共役免疫沈降を行った。免疫沈降物をプロテインＧセファロースで回収し、洗浄した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜上のＡＰＰ及びＸ１１Ｌについて抗ＡＰＰポリクローナル抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
図７から明らかなように、Ｘ１１Ｌの２２１から２５０アミノ酸を欠失したＸ１１Ｌは、ソルビトール処理によるＡＰＰへの結合増強能が失われていた。
【００５６】
実施例８：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域の同定（その３：インビトロにおける結合解析）（図８）
実施例７と同様にして作成したＸ１１ＬΔ２２１−２５０（Ｎ末端側にＦＬＡＧ配列が付加されている）又はＸ１１ＬをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入し、２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、細胞溶解物とした。
実施例３と同様にして作成したＧＳＴ−ＡＰＰをこの細胞溶解物と混合し、４℃で２時間インキュベートした後、グルタチオンセファロースでＧＳＴ−ＡＰＰを回収し、洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加して７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜のＸ１１Ｌを抗Ｘ１１Ｌモノクローナル抗体を用いたイムノブロットにより検出した。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
実施例７で示した２２１〜２５０領域を欠失したＸ１１Ｌは、ソルビトール処理によるＡＰＰへの結合増強能を失うことがインビトロで示された。２２１〜２５０領域を欠失したＸ１１Ｌは、ソルビトール刺激後もＡＰＰ細胞質ドメインに結合する能力の増強程度が著しく低下していることがインビトロで明らかになった。
【００５７】
実施例９：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位の同定（その１）（図９、図１０）
（方法）
Ｎ末端にＨＡタグの付いたＸ１１Ｌをｗｔとし、以下の変異体をメガプライマー法によって作成した（図９参照）。尚、Ｓ２３６は、２３６番目のセリンを意味し、同様に「アミノ酸の種類−その位置」の記載様式で各位置のアミノ酸を示す。
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌａｌｌ（ａｌｌ；Ｓ２３６，Ｓ２３８，Ｔ２４０，Ｓ２４１，Ｔ２４３，Ｓ２４４，Ｓ２４６，Ｓ２４９全てをアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｆｏｒ（ｆｏｒ；Ｓ２３６，Ｓ２３８，Ｔ２４０，Ｓ２４１をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｂａｃｋ（ｂａｃｋ；Ｔ２４３，Ｓ２４４，Ｓ２４６，Ｓ２４９をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｍｉｄ（ｍｉｄ；Ｔ２４０，Ｓ２４１，Ｔ２４３，Ｓ２４４をアラニンに置換したもの）
実施例２と同様の手順でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてこれらのＮＨＡ−Ｘ１１Ｌ（ｗｔ，ａｌｌ，ｆｏｒ，ｂａｃｋ，ｍｉｄのいずれか）をコードするプラスミド（例
えばｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−Ｘ１１Ｌａｌｌ）０．４μｇとＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ（ＡＰＰのＮ末端にＦＬＡＧタグが付されている）をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５）０．２μｇとをＨＥＫ２９３細胞に導入した。Ｘ１１Ｌのプラスミドを入れていない実験では、空のｐｃＤＮＡ３ベクターを同量加えた。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化した。遠心後の上清を細胞溶解物とし抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）で免疫沈降した。反応物を６％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写、ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌについては抗ＨＡ抗体、ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰについては抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
実施例８で同定したＸ１１Ｌの２２１から２５０アミノ酸には、図９で示す様に８個のリン酸化可能なセリン、スレオニン残基が存在する。これらのアラニン置換変異を導入した４種類のＸ１１Ｌコンストラクト（ａｌｌ，ｆｏｒ，ｂａｃｋ，ｍｉｄ）のソルビトール刺激によるＡＰＰ結合能増強効果を測定したところ、ａｌｌ及びｆｏｒコンストラクトがＡＰＰ結合増強効果を有意に失っていた（図１０）。この結果、ＡＰＰ結合能増強に影響を与えるリン酸化サイトはｆｏｒコンストラクト内に含まれる４つのアミノ酸のうちｍｉｄコンストラクトに含まれない最初の２つのＳｅｒ残基である可能性が示唆された。
【００５８】
実施例１０：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位の同定（その２）（図１１〜１３）
（方法）
Ｎ末端にＨＡタグの付いたＸ１１Ｌをｗｔとし、以下の変異体をメガプライマー法によって作成した（図１１参照）。
ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３６Ａ（Ｓ２３６をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３８Ａ（Ｓ２３８をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３６／２３８Ａ（Ｓ２３６とＳ２３８の両方をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｆｏｒ（ｆｏｒ；Ｓ２３６，Ｓ２３８，Ｔ２４０，Ｓ２４１をアラニンに置換したもの）
実施例２と同様の手順でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてこれらのＮＨＡ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−Ｘ１１Ｌ−Ｓ２３６Ａ）０．４μｇとＮＦＬＡＧ−ＡＰＰをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５）０．２μｇとをＨＥＫ２９３細胞に導入した。Ｘ１１Ｌのプラスミドを入れていない実験では、空のｐｃＤＮＡ３ベクターを同量加えた。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化した。遠心後の上清を細胞溶解物とし抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で免疫沈降した。反応物を６％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写、ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌについては抗ＨＡ抗体、ＦＬＡＧ−ＡＰＰについては抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
実施例９より同定したＳｅｒ２３６及びＳｅｒ２３８のいずれか、又は両方をアラニンに置換したコンストラクトを図１１に示すように作成し、ソルビトール刺激によるＡＰＰ結合能増強効果を測定したところ、いずれか一方にＡｌａ変異を導入した場合は、その効果は強く失われていた（図１２）。この結果、ソルビトール刺激によるＸ１１ＬのＡＰＰ結合能強化には、Ｓｅｒ２３６及びＳｅｒ２３８のリン酸化が必要であることが明らかになった。Ｘ１１Ｌと同様にリン酸化され（実施例１）、又、Ａβ生成抑制阻害効果を持つ
Ｘ１１中にもこのリン酸化部位が保存されている（図１３参照）。一方、Ｘ１１、Ｘ１１Ｌとは異なり、神経細胞での特異的発現を示さないＸ１１Ｌ２にはこのリン酸化部位は含まれていない。
【００５９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］Ｘ１１Ｌをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：２］Ｘ１１Ｌのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：３］Ｘ１１Ｌの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：４］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌａｌｌの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：５］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｆｏｒの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：６］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｂａｃｋの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：７］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｍｉｄの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：８］ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３６Ａの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：９］ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３８Ａの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：１０］Ｓ２３６とＳ２３８がともにアラニンに置換された、Ｎ末端にＨＡタグの付いたＸ１１Ｌの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：１１］ヒトＸ１１Ｌ（ｈＸ１１Ｌ）の部分アミノ酸配列（２２０〜２５０）を示す。
［配列番号：１２］ラットＸ１１Ｌ（ｒＸ１１Ｌ）の部分アミノ酸配列（２２１〜２５１）を示す。
［配列番号：１３］ヒトＸ１１（ｈＸ１１）の部分アミノ酸配列（２６４〜２９４）を示す。
［配列番号：１４］ラットＸ１１（ｒＸ１１）の部分アミノ酸配列（２６５〜２９５）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】（Ａ）は、神経細胞におけるＸ１１Ｌ及びＸ１１のリン酸化を示した図である。（Ｂ）は、Ｘ１１及びＸ１１Ｌのタンパク質構造を模式的に示したものである。
【図２】ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合増強効果を示す図である。ＩＰのレーン：抗ＦＬＡＧ抗体で抽出物を免疫沈降させた沈降物を試料として用いた場合の結果。ｃｒｕｄｅのレーン：抽出物そのものを試料として用いた場合の結果。
【図３】ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌの結合増強効果を示す図である。ｉｎｐｕｔのレーン：細胞溶解物をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ＧＳＴ−ＡＰＰのレーン：細胞溶解物とＧＳＴ−ＡＰＰとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ＧＳＴのレーン：細胞溶解物とＧＳＴとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。
【図４】Ｘ１１Ｌの脱リン酸化によりＡＰＰへの結合能が消失することを示した図である。ｌｙｓａｔｅのレーン：ソルビトール刺激した（又はしていない）細胞の溶解物（Ｌｙｓａｔｅ）をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ｉｎｐｕｔのレーン：ＬｙｓａｔｅをλＰＰａｓｅで脱リン酸化処理した（又はしていない）試料を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ｂｏｕｎｄのレーン：ＬｙｓａｔｅをλＰＰａｓｅで脱リン酸化処理した（又はしていない）試料とＧＳＴ−ＡＰＰとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。下図は上記結果（ｂｏｕｎｄのレーン）を比で数値化したグラフである。
【図５】Ｘ１１Ｌのリン酸化を介したＡＰＰへの結合能増強へのＪＮＫの関与を調べた結果を示す図である。ｐｕｌｌ ｄｏｗｎのレーン：細胞溶解物とＧＳＴ−ＡＰＰとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ｉｎｐｕｔ：細胞溶解物をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。
【図６】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域を同定した結果を示す図である。 左側上段は抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降物を抗ＡＰＰ抗体でイムノブロットした結果であり、中段は溶解物をそのまま抗ＡＰＰ抗体でイムノブロットした結果であり、下段は溶解物をそのまま抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果である。下側は各Ｘ１１Ｌコンストラクトの構造を模式的に示したものである。
【図７】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域を同定した結果を示す図である。ＩＰ：Ｇ３６９のレーン；細胞溶解物を抗ＡＰＰポリクローナル抗体（Ｇ３６９）で免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＡＰＰ抗体（Ｃ末端ＡＰＰ抗体）でイムノブロットした結果。ｃｒｕｄｅのレーン；細胞溶解物をそのまま抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＡＰＰ抗体（Ｃ末端ＡＰＰ抗体）でイムノブロットした結果。
【図８】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域を同定した結果を示す図である。ｐｕｌｌ ｄｏｗｎのレーン：細胞溶解物をＧＳＴ−ＡＰＰと混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物をイムノブロットした結果。ｉｎｐｕｔのレーン：細胞溶解物をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。
【図９】Ｘ１１Ｌのリン酸化が可能な部位をアラニンに置換することによって得られる各種変異体の部分アミノ酸配列を示した図である。
【図１０】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位を同定した結果を示す図である。ＩＰのレーン：細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、沈降物を抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。Ｌｙｓａｔｅのレーン：細胞溶解物をそのまま抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。
【図１１】Ｘ１１Ｌのリン酸化が可能な部位をアラニンに置換することによって得られる各種変異体の部分アミノ酸配列を示した図である。
【図１２】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位を同定した結果を示す図である。ＩＰのレーン：細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、沈降物を抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。Ｌｙｓａｔｅのレーン：細胞溶解物をそのまま抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。
【図１３】ヒト及びラットのＸ１１Ｌ、並びにヒト及びラットのＸ１１の部分アミノ酸配列を示す図である。
【図１４】ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合能を評価する為の方法の一例（レポーターアッセイ法）を示す図である。
【図１５】Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングする方法（サンドイッチ法）の一例を示す図である。
【図１６】Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングする方法（イムノブロット）の一例を示す図である。
【図１７】Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングする方法（Ｃｙｔｏｂｌｏｔ法）の一例を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、βアミロイド生成抑制方法及びβアミロイド生成抑制剤に関し、特にＸ１１Ｌとアミロイド前駆体との結合を増強することによりアミロイド前駆体の代謝を抑制してβアミロイドの生成を抑制する方法及びβアミロイドの生成を抑制し得る剤に関する。さらに本発明はβアミロイド生成抑制に有用な化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）の治療薬としては、（１）βアミロイド（Ａβ）の生成阻害、（２）Ａβの凝集阻害、（３）分泌されたＡβの分解促進、（４）沈着したＡβの除去等の方法が開発途中である。（１）のＡβの生成阻害としては、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断酵素ＢＡＣＥ（β−ｓｉｔｅ ＡＴＰ Ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）及びγ−セクリターゼの阻害物質の開発が進められている。これらは切断酵素を直接阻害するため、生体内の他の基質の切断も阻害し、副作用の可能性を除去できない。（２）のＡβの凝集阻害は、細胞外に分泌したＡβの凝集を阻害する薬剤である。Ａβは凝集体形成が神経毒性を示すとされており効果が期待されているが臨床試験にまで進んでいる薬剤は少ない。（３）の分泌されたＡβの分解促進は、Ａβを分解することを目的とした治療方法である。Ａβ分解酵素としてはネプリライシン及びインスリン分解酵素が候補として挙げられており、分解活性を細胞外で示すネプリライシンの活性化、発現量増大を惹起する方法が開発されている。この方法も、細胞外刺激が可能な薬剤の開発により臨床試験までたどり着いている。（４）はＡβ免疫療法であり、ＥＬＡＮ社を筆頭に臨床試験を行ったが、脳炎の副作用で一時中断しており、現在免疫方法の改善等が行われている。
【０００３】
一方、Ｘ１１Ｌタンパク質は、ＡＰＰに結合する神経特異的タンパク質として単離された。Ｘ１１ＬはＡＰＰの細胞質ドメインに結合し、ＡＰＰの代謝を安定化する（非特許文献１）。Ｘ１１Ｌはさらにタンパク質Ａｌｃａｄｅｉｎと結合し、神経細胞ではＡＰＰ−Ｘ１１Ｌ−Ａｌｃａｄｅｉｎの三量体として存在する。三量体中のＡＰＰはより代謝的に安定化され、ＡＤの発症原因とされるＡβの生成が強く抑制される（非特許文献２）。Ｘ１１Ｌが複合体から解離すると、ＡＰＰとＡｌｃａｄｅｉｎは協調的な代謝を受け始め、ＡＰＰからＡβが生成し始める（非特許文献３）。ＡＤ患者脳切片を用いた免疫染色から、ＡＰＰとＡｌｃａｄｅｉｎはＡβが沈着した老人斑周辺の神経変性を起こしつつある神経細胞の肥大化した末端（腫大神経突起部）に蓄積している（非特許文献２）が、Ｘ１１Ｌはむしろ老人斑に検出できる（非特許文献４）ことがわかった。また、Ｘ１１Ｌを過剰発現したトランスジェニック（Ｔｇ）マウスをＡＰＰのスウェーデン型変異を持つＴｇマウス（Ｔｇ２５７６）と交配させると、Ａβの脳内産生量が減少する（非特許文献５）。これまでの知見は、Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合維持がＡＰＰの代謝を安定化させＡβの生成を抑制することを示しており、Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合制御を利用した新たなＡβ抑制剤の開発がＡＤの治療薬として有望であることを示唆している（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００３−１６４２９８号公報
【非特許文献１】Tomita S, Ozaki T, Taru H, Oguchi S, Takeda S, Yagi Y, Sakiyama S, Kirino Y, Suzuki T. Interaction of a neuron-specific protein containing PDZ domains with Alzheimer's amyloid precursor protein. J Biol Chem. 1999 Jan 22;274(4):2243-54.
【非特許文献２】Araki Y, Tomita S, Yamaguchi H, Miyagi N, Sumioka A, Kirino Y, Suzuki T. Novel cadherin-related membrane proteins, Alcadeins, enhance the X11-like protein-mediated stabilization of amyloid beta-protein precursor metabolism. J Biol Chem. 2003 Dec 5;278(49):49448-58.
【非特許文献３】Araki Y, Miyagi N, Kato N, Yoshida T, Wada S, Nishimura M, Komano H, Yamamoto T, De Strooper B, Yamamoto K, Suzuki T. Coordinated metabolism of Alcadein and amyloid beta-protein precursor regulates FE65-dependent gene transactivation. J Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23):24343-54.
【非特許文献４】McLoughlin DM, Irving NG, Brownlees J, Brion JP, Leroy K, Miller CC. Mint2/X11-like colocalizes with the Alzheimer's disease amyloid precursor protein and is associated with neuritic plaques in Alzheimer's disease.Eur J Neurosci. 1999 Jun;11(6):1988-94.
【非特許文献５】Lee JH, Lau KF, Perkinton MS, Standen CL, Rogelj B, Falinska A, McLoughlin DM, Miller CC. The neuronal adaptor protein X11beta reduces amyloid beta-protein levels and amyloid plaque formation in the brains of transgenic mice. J Biol Chem. 2004 Nov 19;279(47):49099-104.
【非特許文献６】Uhlik MT, Abell AN, Johnson NL, Sun W, Cuevas BD, Lobel-Rice KE, Horne EA, Dell'Acqua ML, Johnson GL. Rac-MEKK3-MKK3 scaffolding for p38 MAPK activation during hyperosmotic shock. Nat Cell Biol. 2003 Dec;5(12):1104-10.
【非特許文献７】Seet BT, Pawson T. MAPK signaling: Sho business. Curr Biol. 2004 Sep 7;14(17):R708-10. Review.
【非特許文献８】Saiardi A, Bhandari R, Resnick AC, Snowman AM, Snyder SH. Phosphorylation of proteins by inositol pyrophosphates. Science. 2004 Dec 17;306(5704):2101-5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記（１）に属する、新規なＡＤ治療薬の開発を目的とする。具体的には直接ＡＰＰ切断酵素を阻害することなく、上記（３）の方法と同様に、細胞外からの薬剤による活性化が可能なＡβ生成抑制剤の提供、それを含むＡＤ治療薬の提供及びそれを得る為のスクリーニング方法の提供等を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、以下の知見を得た。
１）細胞を高浸透圧処理した場合、ＡＰＰへのＸ１１Ｌの結合が増加すること、
２）高浸透圧刺激は、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進し、このリン酸化がＡＰＰへの結合を強めること、
３）Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合サイトは中央のＰｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ（ＰＩ）ドメイン（アミノ酸番号３６８〜５５５）であるが、ＡＰＰへの結合を強める領域はＰＩドメインのＮ末端側２２１〜２５０の間にあること、及び
４）Ｘ１１Ｌの２２１〜２５０領域のリン酸化可能アミノ酸に変異を導入し、高浸透圧刺激でＡＰＰへの結合が増加しないことを指標に、２箇所のリン酸化サイトとして２３６番目のセリン（以下、Ｓｅｒ２３６ともいう）及び２３８番目のセリン（以下、Ｓｅｒ２３８ともいう）が同定されたこと。
これらの知見をもとに、Ｘ１１Ｌのリン酸化を制御することによってＸ１１ＬのＡＰＰへの結合を強化しＡＰＰからＡβの生成を抑制し得ることが可能になった。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００６】
〔１〕Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合増強剤。
〔２〕Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体の代謝抑制剤。
〔３〕Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、βアミロイド生成抑制剤。
〔４〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ
酸番号２２１〜２５０の領域内にある、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔５〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤を含む、βアミロイドが関連する疾患の予防・治療剤。
〔７〕βアミロイドが関連する疾患が、アルツハイマー病である、上記〔６〕記載の予防・治療剤。
〔８〕Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体タンパク質とＸ１１Ｌタンパク質との結合を増強する方法。
〔９〕Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制する方法。
〔１０〕Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、βアミロイドの生成を抑制する方法。
【０００７】
〔１１〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、上記〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、上記〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物のスクリーニング方法。
〔１４〕Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
〔１５〕Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、βアミロイドの生成を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
〔１６〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、上記〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１７〕Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、上記〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１８〕リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いることを特徴とする上記〔１３〕〜〔１７〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＡＰＰが代謝を受けＡβが産生されるのを効果的に抑制することができ、従って、アルツハイマー病等の、Ａβがその発症原因の一つといわれている種々の疾患の新しい予防法や治療法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
細胞に高浸透圧刺激を与えた場合、Ｘ１１Ｌのリン酸化が促進され、このリン酸化がＡＰＰへの結合を強めている、という、本発明者らが得た知見は、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物がＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強してＡＰＰの代謝を抑制し、それによってＡβの生成を抑制し得ることを示している。従って本発明は、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有するＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合増強剤、ＡＰＰの代謝抑制剤及びＡβ生成抑制剤を提供する。また、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強する方法、ＡＰＰの代謝を抑制する方法及びＡβ生成を抑制する方法を提供する。
本発明において有効成分として含められるＸ１１Ｌのリン酸化促進作用を有する化合物としては、Ｘ１１Ｌタンパク質のリン酸化を促進する化合物であれば特に限定されないが、詳細には、Ｘ１１Ｌタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０領域内にあるリン酸化部位のリン酸化、より好ましくはＳｅｒ２３６及び／又はＳｅｒ２３８をリン酸化し得る化合物である。より好ましくはＳｅｒ２３６及びＳｅｒ２３８の両方のセリン残基をリン酸化し得る化合物である。
【００１０】
高浸透圧刺激により活性化される細胞内情報伝達系リン酸化酵素としては、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーが考えられる（非特許文献６）。これらのリン酸化酵素群を活性化する化合物として高浸透圧剤の他に、例えば過酸化水素、熱ショック、タンパク質合成阻害剤、紫外線、放射線、抗ガン剤、ＬＰＳ、炎症性サイトカイン、ＴＧＦ−β、ＦＡＳ、カプサイシン酸のいわゆるストレス応答惹起物質および環境が考えられる。しかしながら、Ｘ１１Ｌのリン酸化を行うキナーゼが、これら既知の情報伝達系によって活性化されるキナーゼ以外である可能性もあり、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進、もしくはＡＰＰとの結合を促進する化合物であればＭＡＰキナーゼスーパーファミリー以外のキナーゼを介してリン酸化を促進、もしくはＡＰＰとの結合を促進してもよい。酵母では、高浸透圧を感知する細胞膜受容体Ｓｈｏ１、Ｓｌｎ１が知られており、その下流に位置するキナーゼとしてＨｏｇ１（ＭＡＰＫ）が同定されており、このキナーゼによる何らかの基質リン酸化が、酵母の高浸透圧耐性反応を惹起していると考えられている（非特許文献７）。哺乳類ではＳｈｏ１／Ｓｌｎ１からＨｏｇ１に相当する情報伝達系が明らかになっていないが、このような哺乳類において未同定の経路を活性化する薬剤であっても、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進、もしくはＡＰＰとの結合を促進する効果があればよい。また、最近キナーゼを介さず、イノシトールピロリン酸と呼ばれる高エネルギー結合を持ったイノシトールリン酸が直接、タンパク質をリン酸化する経路が見いだされており（非特許文献８）、Ｘ１１Ｌのリン酸化がこのような新規経路によって促進され、その結果としてＡＰＰとの結合を促進する場合は、キナーゼを介さないタンパク質リン酸化経路を活性化する薬剤であっても差し支えない。
【００１１】
本発明において、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物の、Ｘ１１ＬのＡβへの結合を増強する能力（結合能の増強）は、当該化合物で処理した場合のＸ１１ＬのＡβへの結合能における変化を、例えば、エピトープタグを用いた共役免疫沈降（例えば、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法）、共鳴プラズモン相互作用解析などにより評価することができる。結合能の評価として、具体的には、下記方法等が挙げられる。
尚、本発明において結合能評価方法で用いる細胞は、Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰを発現し得る細胞であれば特に限定されず、本来の性質としてＸ１１Ｌ及びＡＰＰを発現しＡβを生成し得るものであっても、各タンパク質発現プラスミドをトランスフェクトすることによって各タンパク質を発現するように改変されたものであってもよい。
Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰを発現し得る細胞として具体的には、これらの遺伝子を含有するベクターで形質転換した形質転換体を用いることができるが、他にＩＭＲ−３２、ＰＣ１２ｈ、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（Ｎ２ａ）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨなどの細胞株、又はＡＰＰとＸ１１Ｌを導入したＨＥＫ−２９３などの細胞株を用いることもできる。
【００１２】
結合能評価方法１（共免疫沈降法）
（１）ＦＬＡＧ等のタグ配列を有するＸ１１Ｌ又はＡＰＰ発現プラスミド（シグナル配列の下流にＦＬＡＧ等のタグ配列を有するＡＰＰ発現プラスミド（ＦＬＡＧ−ＡＰＰ）又はＸ１１ＬのＮ−末又はＣ−末等にＦＬＡＧ等のタグ配列を有するＸ１１Ｌ発現プラスミド（ＦＬＡＧ−Ｘ１１Ｌ又はＸ１１Ｌ−ＦＬＡＧ））を得るステップ；
（２）細胞に、前記ステップ（１）で得られたＦＬＡＧ−Ｘ１１Ｌ発現プラスミド（又はＦＬＡＧ−ＡＰＰ発現プラスミド）とＡＰＰ発現プラスミド（又はＸ１１Ｌ発現プラスミド）とを、一過的にコトランスフェクトして、コトランスフェクタントを得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られたコトランスフェクタントを培養して、培養細胞を得るステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた培養細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（５）前記ステップ（４）で得られた処理後の培養細胞から、細胞抽出液を得るステップ；
（６）前記ステップ（５）で得られた細胞抽出液に抗ＦＬＡＧ抗体を加えて共免疫沈降を行なうステップ；並びに
（７）共免疫沈降を、ウエスタンブロット解析により検出するステップ；を含む方法。
かかる評価方法１においては、抗ＦＬＡＧ抗体を用いる場合において、Ｘ１１Ｌ−ＡＰＰの複合体の沈降がみられることをＸ１１ＬとＡＰＰとが結合することの指標とし、その程度を評価する。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１３】
結合能評価方法２（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法）
（１）Ｘ１１Ｌ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を培養して培養細胞を得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られた培養細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた処理後の培養細胞から細胞抽出液を得るステップ；（５）ＧＳＴとＡＰＰとからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＡＰＰ）、好ましくはＧＳＴとＡＰＰ細胞質ドメインとからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔ）を得るステップ（ＡＰＰはアミノ酸残基６９５からなるタンパク質であり、全てをＧＳＴ−融合タンパク質で生合成し回収するのは難しい。従って、Ｘ１１Ｌの結合部位であるＡＰＰの細胞質ドメイン４７アミノ酸だけＧＳＴ融合タンパク質として調製する。この方法はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２２４３−２２５４（１９９９）に記載されている）；
（６）融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＰＰ（好ましくはＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔ）と前記ステップ（４）で得られた細胞抽出液とを接触させるステップ；
（７）グルタチオンビーズでタンパク質を、回収するステップ；並びに
（８）抗Ｘ１１Ｌ抗体を用いたウエスタンブロット解析を行い、ＧＳＴ−ＡＰＰ（好ましくはＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔ）とＸ１１Ｌとの複合体を検出するステップ；を含む方法。
かかる評価方法２においては、ＧＳＴ−ＡＰＰとＸ１１Ｌとの複合体の存在をＸ１１ＬとＡＰＰとが結合することの指標とする。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１４】
結合能評価方法３（共鳴プラズモン相互作用解析）
（１）Ｘ１１Ｌ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を培養して培養細胞を得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られた培養細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた処理後の培養細胞から細胞抽出液を得、Ｘ１１Ｌを得るステップ；
（５）ＡＰＰを固定化したチップに、前記ステップ（４）で得られたＸ１１Ｌを一定の流速で、送液するステップ；及び
（６）適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度など）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳなど）〕により相互作用を検出するステップ；を含む方法。
ここで、Ｘ１１ＬとＡＰＰとからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、Ｘ１１ＬとＡＰＰとが結合することの指標とする。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１５】
結合能評価方法４（ＦＲＥＴ法）
Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰに蛍光タンパク質を融合させたｃＤＮＡを細胞に発現させ、当該細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理する。Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰの両者の結合をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）で検出する。Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００１６】
結合能評価方法５（レポーターアッセイ法）
ＡＰＰの細胞質ドメイン断片（ＡＩＣＤ）がｇｅｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ活性を示す（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３，１１５−１２０（２００１））ことが知られており、この特性を利用してＸ１１ＬとＡＰＰとの結合能を評価することができる。具体的には以下のような手順で行うことができる（図１４参照）
（１）酵母転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとＸ１１Ｌの融合タンパク質Ｇａｌ４ＢＤ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミドおよび、Ｇａｌ４の転写活性化ドメインとＡＩＣＤの融合蛋白質ＡＩＣＤ−Ｇａｌ４ＡＤをコードするプラスミドを作成するステップ；
（２）レポーター遺伝子として、Ｇａｌ４結合配列を上流にもつルシフェラーゼもしくはＧＦＰもしくは抗生物質耐性タンパク質遺伝子を作成するステップ；
（３）前記（１）のプラスミド２種および（２）のプラスミドを細胞に導入し、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を細胞に作用させるステップ；
（４）Ｘ１１ＬとＡＩＣＤとの結合が促進されることにより、レポーター遺伝子の発現が増加する事をレポーター遺伝子産物による細胞の発色または死滅でアッセイする。
【００１７】
また、ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が増強されたことによるＡＰＰの代謝抑制作用は、例えば、パルスチェイス法、免疫測定法などにより評価することができる。パルスチェイス法は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９５８２（２００３）のＦｉｇ．５に記載した方法等を用いることが出来る。
【００１８】
具体的には、例えば、下記方法が挙げられる。
代謝分解抑制能評価方法１（パルスチェイス法）
（１）Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰ発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；
（３）前記ステップ（１）で得られた細胞を、３５Ｓ−標識メチオニン含有培地で一定時間培養し、ついで、過剰量のメチオニンを添加するステップ；
（４）培養液と細胞抽出液とを調製し、抗ＡＰＰ抗体を用いた免疫沈降により、タンパク質を回収するステップ；及び
（５）回収されたタンパク質をゲル上で電気泳動して分離し、シグナルの解析を行い、それにより量的変動を調べるステップ；を含む方法。
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。また、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物での処理は３５Ｓ−標識メチオニン含有培地における培養と同時か、あるいは培養より前に行われることが好ましい。
【００１９】
代謝分解抑制能評価方法２（免疫測定法）
（１）Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰ発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞をＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で処理するステップ；及び
（３）前記ステップ（２）により得られた処理後の細胞の培養上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡβ濃度を測定するステップ；を含む方法。
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分間〜２時間、好ましくは５分間〜１時間程度である。
【００２０】
さらに、ＡＰＰ代謝が制御されたことによるＡβ生成の抑制作用は、例えば上記代謝分解抑制機能評価方法２と同様にしてＡβ濃度を測定することによって確認することができる。
【００２１】
各タンパク質（ポリペプチド）の発現プラスミドや各融合タンパク質の合成、細胞へのトランスフェクション、免疫沈降等の種々の操作は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができる。
【００２２】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物は、上述のようにＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し、それによってＡＰＰの代謝を抑制し、ひいてはＡβの生成を抑制する。従ってＸ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物は、Ａβが関連する疾患、特にＡβの生成が不都合な疾患の予防又は治療に有用である。Ａβの生成が不都合な疾患とは、Ａβがその発症原因になっているか、あるいは増悪因子である疾患であり、特にアルツハイマー病が挙げられる。
【００２３】
本発明に有効成分として含められる、Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物は塩を形成していてもよく、そのような塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
【００２４】
金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。
【００２５】
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
【００２６】
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
【００２７】
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【００２８】
このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、又は酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
【００２９】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を上記の医薬として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質を用いる場合には生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。
【００３０】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００３１】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒト又は温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。製剤中の有効成分の含有量、該製剤の投与量及びその投与回数は、投与化合物の種類、投与対象、症状、投与方法などに応じて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し、ＡＰＰの代謝を抑制し、且つＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうる範囲で適宜設定され得る。
【００３２】
投与手段は、特に神経細胞に作用し得、ＡＰＰの代謝を制御し、かつＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうるものであれば、特に限定されるものではない。
【００３３】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することによりＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が増強されてＡＰＰ代謝が抑制され、Ａβの生成が抑制されるという本発明で得られた知見に基づいて、Ｘ１１Ｌのリン酸化の程度を測定することを含む、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰと
Ｘ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰの代謝を抑制し得る化合物及びＡβの生成を抑制し得る化合物（以下、これらの化合物をあわせて本発明化合物と称する）のスクリーニング方法が提供される。本発明化合物は上記同様、Ａβが関連する疾患、特にアルツハイマー病の予防又は治療に有効である。
【００３４】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルの上昇は、当分野で通常実施されている方法を用いて間接的に、又直接的に測定することができる。リン酸化は好ましくはＸ１１Ｌタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にあるリン酸化可能部位で行われ、特に好ましくはＳｅｒ２３６及び／又はＳｅｒ２３８でリン酸化が起こる。
ここで、「Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルの測定」とは、Ｘ１１Ｌのリン酸化の有無を調べることに加え、例えば、２３６番目及び２３８番目のいずれか一方のセリンがリン酸化されているのか、あるいは両方ともリン酸化されているのか、等のＸ１１Ｌのリン酸化様式を調べることも含まれる。Ｘ１１Ｌのリン酸化様式を調べる方法としては、各リン酸化サイト特異抗体（後述）を用いて認識する方法や、Ｘ１１Ｌをトリプシン等のプロテアーゼで分解し、その分解産物を質量分析で解析しリン酸化サイトを同定する方法等が挙げられる。
リン酸化レベルの間接的な測定方法としては、Ｘ１１Ｌがリン酸化されるとＡＰＰとの結合が増強されるという本発明で得られた知見から、両者の結合能の増加でもって調べる方法が挙げられる。例えば、Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰに蛍光タンパク質を融合させたｃＤＮＡを細胞に発現させ、両者の結合増加をＦＲＥＴで検出する方法等が例示される。直接的な測定方法としては、Ｘ１１Ｌ特異抗体やリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いた方法等が挙げられる。
リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体としては、当分野で通常実施されている方法によって作製することができ、好ましくはモノクローナル抗体である。好ましいリン酸化Ｘ１１Ｌ抗体は、Ｓｅｒ２３６のリン酸化を認識する抗体、Ｓｅｒ２３８のリン酸化を認識する抗体、Ｓｅｒ２３６とＳｅｒ２３８の両方のリン酸化を認識する抗体の３種であり、それらを併用することがいっそう好ましい。リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体は、リン酸化されたＸ１１Ｌタンパク質（特にＳｅｒ２３６及び／又はＳｅｒ２３８がリン酸化されている）をリン酸化特異的に認識することができるので、試料、好ましくは細胞抽出液等の試料溶液中のリン酸化されたＸ１１Ｌタンパク質の定量、組織染色等による検出に利用することができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法においてリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いてリン酸化Ｘ１１Ｌを定量する工程は、特に制限されるべきものではなく、試料中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法及びサンドイッチ法が好適に用いられる。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００３６】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担
体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラスなどが用いられる。サンドイッチ法においては不溶化したモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化したモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量等を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤及び不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法によるリン酸化Ｘ１１Ｌタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられるモノクローナル抗体は、当該タンパク質に結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応及び２次反応に用いられる抗体は、例えば、Ｘ１１Ｌ特異抗体とリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体の組み合わせであり得る。
【００３７】
サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどを用いることもできる。
【００３８】
これら個々の免疫学的測定法を本発明のスクリーニング方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３９】
本発明化合物の候補となり得る試験化合物は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４０】
ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物は、Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングすることによって得られる。具体的なスクリーニング方法は、例えば、以下の手順にて行うことができる（図１５参照）。
（１）Ｘ１１ＬのＳｅｒ２３６又はＳｅｒ２３８、及びＳｅｒ２３６とＳｅｒ２３８の両方がリン酸化された状態を特異的に認識する抗体を作成するステップ−抗原としてＳｅｒ２３６がリン酸化されたペプチド、Ｓｅｒ２３８がリン酸化されたペプチド、及びＳｅｒ２３６とＳｅｒ２３８の両方がリン酸化されたペプチドを用いて、これらのサイトが特異的にリン酸化されたＸ１１Ｌと特異的に反応するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の作成を行う。方法はＴｈｒ６６８でリン酸化されたＡＰＰを特異的に認識する抗体を作成する方法(文献 Methods in Molecular Medicine Vol32:Alzheimer’s Disease: Me
thods and Protocols (Edited by N. H. Hooper Humana Press) pp271-282
“Phosphorylation of amyloid precursor protein (APP) family protein”, Suzuki, T., Ando, K., Iijima, K., Oguchi, S., & Takeda, S.)に準じる；
（２）Ｘ１１Ｌ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られた細胞を培養して培養細胞を得るステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた培養細胞を試験化合物で処理するステップ；
（５）前記ステップ（４）で得られた処理後の培養細胞から細胞抽出液を得、Ｘ１１Ｌを得るステップ；
（６）ＥＬＩＳＡプレートにＸ１１Ｌ抗体を固定するステップ；
（７）固定化したプレートに前記（５）で得たＸ１１Ｌを含む細胞抽出液を加え、抗体と反応させるステップ；
（８）洗浄後、前記（１）で得られた抗Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体でプレートにトラップしたリン酸化Ｘ１１Ｌを挟むステップ；
（９）適当な手段（酵素発色反応）等で、リン酸化Ｘ１１Ｌを検出するステップ。
上記方法では、一次抗体（キャプチャー）としてＸ１１Ｌ抗体を用い、二次抗体としてＸ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いたが、逆でもよい。
また、前記（５）の細胞抽出液をニトロセルロース膜等にスポットし、これに対してＸ１１Ｌリン酸化特異抗体を反応させるイムノドットブロット法でも良い（図１６参照）。また、細胞を固定し、Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体で染色させる方法（いわゆるＣｙｔｏｂｌｏｔ法）でもよい（図１７参照）。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、リン酸化Ｘ１１Ｌ抗体を用いたＸ１１Ｌのリン酸化レベルの測定を一次スクリーニングとし、Ａβの産生量の測定を二次スクリーニングとしてもよい。一次スクリーニングで選別された試験化合物の存在下又は非存在下におけるＡβの産生量を測定し、比較する。Ａβの測定法には種々の方法が用いられるが、Ａβ特異的抗体を用いる免疫化学的方法を用いることが好ましい。これらの方法には、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法あるいはそれらの組み合わせ方法が用いられる。Ａβ特異的抗体としては、ポリクローナル抗体を用いても良いが、例えば、ＢＡＮ５０、ＢＮＴ７７、ＢＳ８５、ＢＡ２７、ＢＣ０５（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，１０２７２−１０２７８（１９９５））又は６Ｅ１０、４Ｇ８などのモノクローナル抗体を用いても良い。とりわけ、ＢＡ２７及びＢＣ０５は、それぞれＡβ４０及びＡβ４２／４３に選択的な抗体であるため、これらの抗体、あるいは同様な選択性を有する抗体を用いれば、Ａβ４０の産生を阻害する化合物、Ａβ４２／４３の産生を阻害する化合物、あるいはＡβ４０及びＡβ４２／４３いずれの産生も阻害する化合物を選択することが可能となる。さらに、分泌型ＡＰＰ量はＡβの産生を間接的に反映すると考えられることから、分泌型ＡＰＰ量を免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法などの免疫化学的方法で検出しても良い。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、試験化合物の存在下におけるＡβ産生量が、試験化合物の非存在下におけるＡβ産生量に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少している試験化合物をＡβの産生を阻害する化合物又はその塩として選択することができる。また、コントロールとして、ＡＰＰを発現していない細胞を用いて、試験化合物の存在下におけるＡβ産生量を測定することもできる。
【００４３】
上記したスクリーニング方法で得られた化合物又はそれから誘導される化合物は、塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水
素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
【００４４】
上記した本発明のスクリーニング方法で得られた化合物は、Ａβの産生を効率良く阻害することができるので、Ａβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療剤として使用することができる。本発明のスクリーニング方法で得られた化合物を含有する医薬は、それ自体又は適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記化合物又はその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。また、例えば非経口投与に適する剤形としては、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与剤、経皮投与剤、軟膏剤など）、座剤（例、直腸剤、膣座剤など）、徐放剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）、ペレット、点滴剤などが用いられる。
【００４５】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒト又は温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。製剤中の有効成分の含有量、該製剤の投与量及びその投与回数は、投与化合物の種類、投与対象、症状、投与方法などに応じて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進してＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合を増強し、ＡＰＰの代謝を抑制し、且つＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうる範囲で適宜設定され得る。
【００４６】
リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体は上記スクリーニング方法に用いられるだけでなく、当該抗体を用いＸ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することによって、Ａβに関連する各種疾患の診断を行なうことができる。例えば、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルが低下している場合は、ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が弱くＡＰＰが代謝されてＡβが過剰に生産されている。一方Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルが上昇している場合にはＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が強くＡＰＰが代謝を受けにくい状態にあり、従ってＡβの産生が抑制されている。前者の場合、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβ関連疾患（例えばアルツハイマー病など）などの疾病である可能性ありと診断することができる。一方、後者の場合でも、異常なレベルの変化は、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβ関連疾患などの疾病である可能性ありと診断することができる。
【００４７】
本発明化合物のスクリーニング方法としては、例えば以下のようなプロトコルが例示される。
（１）Ｘ１１Ｌ発現細胞に対し、試験化合物を作用させる。培地を除去し、当該細胞から細胞抽出液を得て、Ｘ１１Ｌ特異抗体とリン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体で挟むサンドイッチエライザ法で解析し、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを上昇させる化合物（陽性化合物）をスクリーニングする。陽性化合物をＡＰＰとＸ１１Ｌとを共発現している細胞に作用させ、培地中に分泌されるＡβ量を測定してＡβ量の分泌量が抑制されている化合物を選択する工程を二次スクリーニングとして行ってもよい。
（２）Ｘ１１Ｌ発現細胞に対し、試験化合物を作用させる。培地を除去した後、細胞を溶解し、得られた抽出液を膜上にブロットし、リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いたイムノブ
ロットで解析し、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを上昇させる化合物（陽性化合物）をスクリーニングする。陽性化合物について（１）と同様に二次スクリーニングを行う。
（３）Ｘ１１Ｌ及びＡＰＰに蛍光タンパク質を融合させたｃＤＮＡを細胞に発現させ、試験化合物を作用させ、両者の結合増加をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）で検出することで、Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを上昇させる化合物（陽性化合物）をスクリーニングする。Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合量増加は、ＦＲＥＴの発色で検出することができる。
いずれの方法についても、試験化合物で細胞を処理する時間は、用いる化合物や細胞の状態等によって適宜変更されるが、通常１分〜数時間程度である。処理時の温度も用いる細胞の種類に応じて適宜設定された培養温度と同様なものが利用できる。
【００４８】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【００４９】
実施例１：神経細胞におけるＸ１１Ｌ及びＸ１１のリン酸化（図１）
（方法）
１８日齢ラット胎児海馬を摘出し、トリプシンで分散させた後、ポリ−Ｄ−リジンでコートした培養プレートに５×１０５細胞／ｍＬ濃度で播種した。細胞は０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン及び０．０１ｍｇ／ｍＬ ピルビン酸を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中３７℃で培養した。７日間培養後、培地をリン酸を含まない培地に置換し、これに[３２Ｐ]オルソリン酸塩を添加した。添加から２時間後に細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液（１０ｍＭ
ＣＨＡＰＳ，５μｇ／ｍＬ キモスタチン，５μｇ／ｍＬ ロイペプチン，５μｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，１ｍＭ ＮａＦ及び０．５ｍＭ マイクロシスチンＬ−Ｒを含有するＰＢＳ）で可溶化し、抗Ｘ１１Ｌモノクローナル抗体（Ｍｉｎｔ２ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｒｙ Ｃａｔ＃ Ｍ７６１２０）で免疫沈降した。これをプロテインＧセファロースで回収し、洗浄した。これを細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ；ｔａｋａｒａ）の存在下（ＢＡＰ処理）、あるいは非存在下（対照）でインキュベートし、再度セファロースを洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加した。サンプルを７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ゲルを濾紙上で乾燥させ、Ｘ線フィルムに感光させ、オートラジオグラフィーによりリン酸化Ｘ１１Ｌを検出した。同様な方法でリン酸化Ｘ１１を検出した。
（結果）
Ｘ１１Ｌ及びファミリー分子Ｘ１１が神経細胞でリン酸化されていることが明らかとなった。
【００５０】
実施例２：ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌの結合増強効果（１）（図２）
（方法）
ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで培養したＨＥＫ２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＦＬＡＧ−ＡＰＰをコードするプラスミド（０．６μｇ）及びＨＡ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミド（０．２μｇ）を導入した。ＦＬＡＧ−ＡＰＰをコードするプラスミドとしては、ＡＰＰ６９５（６９５個のアミノ酸からなるＡＰＰアイソフォーム）の１７番目のアラニン（Ａｌａ１７）と１８番目のロイシン（Ｌｅｕ１８）との間にＦＬＡＧ配列が挿入されているＦＬＡＧ−ＡＰＰをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだものを用いた（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，４４２１−４４２７（１９９９））。ＨＡ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミドとしては、Ｘ１１ＬのＮ末端にＨＡタグが付いたＨＡ−Ｘ１１ＬをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだものを用いた（ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−Ｘ１１Ｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９４５８（２００３））。
導入から２４時間後に培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ又はこれにオカダ酸（終濃度４００ｎＭ、３時間処理）若しくはソルビトール（終濃度０．５Ｍ、４５分間処理）を添加し、処理後の細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳｉｇｍａのＭ２）で共役免疫沈降を行った。これをプロテインＧセファロースで回収し洗浄した。これらにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜のＨＡ−Ｘ１１Ｌは抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅの１２ＣＡ５）、ＦＬＡＧ−ＡＰＰは抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットにより検出した。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
細胞をソルビトールで刺激した場合に、細胞内におけるＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合が増強することが明らかになった。オカダ酸は効果を示さなかった。
【００５１】
実施例３：ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌの結合増強効果（２）（図３）
（方法）
ＨＥＫ２９３細胞にＨＡ−ｈＸ１１ＬをコードするプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入した（ｈＸ１１Ｌ発現細胞）。ＨＡ−ｈＸ１１Ｌをコードするプラスミドとしては、ｈＸ１１ＬのＮ末端にＨＡタグが付いたＨＡ−ｈＸ１１ＬをｐｃＤＮＡ３
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだものを用いた（ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−ｈＸ１１Ｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２１６２８−３６（２００４））。
２４時間後、０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した（高浸透圧刺激）。ソルビトールを含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで同様に４５分間処理したものを対照群とした。その後、細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し細胞溶解物とした。
ＡＰＰ細胞内領域タンパク質（ＡＰＰ６９５アイソフォームのＡＰＰ６４９−６９５）のアミノ末端側にＧＳＴタンパク質を融合させたタンパク質（ＧＳＴ−ＡＰＰ）を大腸菌に発現させ、培養後、グルタチオンセファロースで精製し、融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＰＰを得た。これを先に得られた細胞溶解物と混合し４℃で２時間インキュベートした後、グルタチオンセファロースでＧＳＴ−ＡＰＰを回収し、洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加して７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜のＸ１１Ｌは抗Ｘ１１Ｌモノクローナル抗体を用いたイムノブロットにより検出した。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
Ｘ１１Ｌを発現している細胞にソルビトール刺激を行ったところ、細胞溶解物中のＸ１１ＬはＧＳＴ−ＡＰＰ細胞質ドメインにより多く結合する。本結果よりソルビトール刺激がＸ１１Ｌを修飾してＡＰＰとの結合を増強していることが示された。
【００５２】
実施例４：Ｘ１１Ｌの脱リン酸化とＡＰＰへの結合能の消失（図４）
（方法）
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルの培養皿で培養し、０．７μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−Ｘ１１Ｌを導入してＨＡ−Ｘ１１Ｌを強制発現させた。２４時間後、０．５Ｍソルビトールにより刺激した（図４中、ソルビトール ＋）。一方で、ソルビトール刺激しない細胞を調製した（図４中、ソルビトール −）。２００μＬのλＰＰａｓｅ溶解バッファーにより可溶化後遠心しＬｙｓａｔｅとし、５倍量のλＰＰａｓｅ反応バッファー中で３０℃、３０分反応させ脱リン酸化処理を行った（図４中、λＰＰａｓｅ ＋）。一方で、脱リン酸化処理を行わなかったサンプルを調製した（図４中、λＰＰａｓｅ −）。５μｇのＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔを結合させたｒｅｓｉｎに反応液（ｉｎｐｕｔ）と終濃度２ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、全量２００μＬにてＣＨＡＰＳバッファー中で２時間インキュベートした。３回のＣＨＡＰＳバッファーでの洗浄後サンプルバッファーで溶出しＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。ＨＡ−Ｘ１１Ｌの検出には抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔの検出には抗ＧＳＴ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）をそれぞれ用いた。また脱リン酸化処理の指標としてＸ１１Ｌの３０４番目のＴｈｒがリン酸化した状態に反応するＵＴ３３抗体（Ando K, Oishi M, Takeda S, Iijima K, Isohara T, Nairn AC, Kirino Y, Greengard P, Suzuki T. Role of phosphorylation of Alzheimer's amyloid precursor protein during neuronal differentiation. J
Neurosci. 1999 Jun 1;19(11):4421-7.を参照して調製できる）を用いた。Ｖｅｒｓａ Ｄｏｃ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により定量化し、高浸透圧、脱リン酸化ともに未処理のサンプルを１としてグラフ化した。
・λＰＰａｓｅ溶解バッファー：０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
・λＰＰａｓｅ反応バッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＢＲＩＪ３５（１０×ｂｕｆｆｅｒ），２ｍＭ ＭｎＣｌ２（１０×ＭｎＣｌ２），１０μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１０μｇ／ｍＬ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，１０μｇ／ｍＬ ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ
・４００ユニットのλＰＰａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）／１５μＬ ｌｙｓａｔｅ又は１ｍＭ ＮａＦ＋１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４ （コントロール用）
・ＣＨＡＰＳバッファー：１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，１０ｍＭ Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．４，５μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍＬ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，５μｇ／ｍＬ ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ，１μＭ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ
【００５３】
実施例５：Ｘ１１Ｌのリン酸化を介したＡＰＰへの結合能増強とＪＮＫ（図５）
（方法）
実施例３と同様にして、ＨＥＫ２９３細胞にＸ１１Ｌをコードするプラスミドを導入した。２４時間後、ＪＮＫ阻害剤であるＳＰ６００１２５（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）を０、２５、１００μＭ存在下、０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した（高浸透圧刺激）。ソルビトールを含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで同様に４５分間処理したものを対照群とした。これとは別に、ＨＥＫ２９３細胞に、Ｘ１１Ｌ及びＪＮＫ阻害効果を持つＪＢＤ（ＪＮＫ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）又はＪＮＫタンパク質をコードするプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入した。ＪＢＤをコードするプラスミドとしてｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＪＢＤを、ＪＮＫをコードするプラスミドとしてｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＪＮＫを用いた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２１６２８−２１６３６（２００４））。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ソルビトールを含まないＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで同様に４５分間処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し細胞溶解物とした。これの１／１００量をタンパク質発現チェック用のサンプルとした。図５中ではｉｎｐｕｔとして示した。
実施例３と同様にして、得られた細胞溶解物と、ＡＰＰの細胞質ドメイン（ＡＰＰｃｙｔ）とＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔをインキュベートして、細胞溶解物中のＸ１１ＬとＡＰＰｃｙｔとの結合をイムノブロットにより調べた。ＧＳＴ−ＡＰＰｃｙｔは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＡＰＰｃｙｔ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２１６２８−２１６３６（２００４））で発現させた。
（結果）
ソルビトール刺激で活性化する代表的なタンパク質リン酸化酵素は、ストレスキナーゼであるＪＮＫである。しかしながら、本実験からＪＮＫの阻害剤、阻害ペプチド（ＪＢＤ）はソルビトール刺激によるＸ１１ＬのＡＰＰ結合増強を阻害しないことがわかった。ま
た、ＪＮＫの強制発現もソルビトール刺激によるＸ１１ＬのＡＰＰ結合をさらに増強しなかった（この条件下でＪＮＫが活性化されているということは別途確認済み）。すなわち、Ｘ１１ＬのＡＰＰへの結合増強を行うＸ１１Ｌリン酸化酵素がＪＮＫではないことが示された。
【００５４】
実施例６：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域の同定（その１：Ｎ末端領域の解析）（図６）
（方法）
Ｘ１１Ｌタンパク質の各ドメインを含む構築プラスミドを作成し、それぞれ、Ｎ＋ＰＩ（１〜５５５アミノ酸）、ＰＩ＋Ｃ（３６８〜７４９アミノ酸）、ΔＭＩ（２６８〜７４９アミノ酸）、ΔＰＤＺ２（１〜６６０アミノ酸）とした（図６下）。これらのＮ末端側にはＦＬＡＧ配列が付加してある。
各プラスミドは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２２４３−２２５４（１９９９）に記載される方法に準じて調製した。
Ｘ１１Ｌ：Ｘ１１Ｌ（１−７４９全長） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ
Ｎ＋ＰＩ：Ｘ１１Ｌ（１−５５５） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ（Ｎ＋ＰＩ）
ＰＩ＋Ｃ：Ｘ１１Ｌ（３６８−７４９） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ（ＰＩ＋Ｃ）
ΔＭＩ：Ｘ１１Ｌ（２６８−７４９） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１ＬＭＩ
ΔＰＤＺ２：Ｘ１１Ｌ（１−６６０） ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１ＬΔＰＤＺ２
実施例２と同様の手順でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてこれらのＸ１１Ｌコンストラクト（０．４μｇ）とＡＰＰをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５；０．７μｇ）をＨＥＫ２９３細胞に導入した。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、抗ＦＬＡＧ抗体で共役免疫沈降を行った。免疫沈降物をプロテインＧセファロースで回収し、洗浄した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜上のＡＰＰ及びＸ１１Ｌについて抗ＡＰＰポリクローナル抗体（Ｇ３６９抗体；Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ大学のＳａｍｕｅｌ Ｇａｎｄｙ博士から供与された；Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３，１１１−１２３，１９９７）及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
ソルビトール刺激によるＸ１１ＬとＡＰＰとの結合増強にはＸ１１ＬのＰＩドメインよりＮ末端側の領域が必要であることが明らかになった。ＰＩドメインはＡＰＰへの結合領域である。特にＮ末端領域の前半２６７アミノ酸を欠失したＸ１１ＬはＡＰＰへの結合増強能力を失っていたので、この領域にＡＰＰへの結合能を制御するＸ１１Ｌのリン酸化サイトが含まれる事が明らかになった。
【００５５】
実施例７：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域の同定（その２：Ｎ末端領域の解析）（図７）
（方法）
Ｘ１１Ｌの２２１から２５０アミノ酸を欠失したコンストラクトをコードするプラスミド（Ｘ１１ＬΔ２２１−２５０）は、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ｈＸ１１Ｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２００７０−２００７８ １９９９）を鋳型にメガプライマー法を用いて作成し、このＮ末端側にＦＬＡＧ配列を付加した（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１ＬΔ２２１−２５０）。実施例２と同様な手順で、０．４μｇのＸ１１ＬΔ２２１−２５０もしくはＸ１１Ｌをコードするプラスミド（それぞれ、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈ
Ｘ１１ＬΔ２２１−２５０又はｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＸ１１Ｌ）と０．６μｇのＡＰＰをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５）とをＨＥＫ２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入した。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、抗ＡＰＰポリクローナル抗体（Ｇ３６９）で共役免疫沈降を行った。免疫沈降物をプロテインＧセファロースで回収し、洗浄した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜上のＡＰＰ及びＸ１１Ｌについて抗ＡＰＰポリクローナル抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
図７から明らかなように、Ｘ１１Ｌの２２１から２５０アミノ酸を欠失したＸ１１Ｌは、ソルビトール処理によるＡＰＰへの結合増強能が失われていた。
【００５６】
実施例８：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域の同定（その３：インビトロにおける結合解析）（図８）
実施例７と同様にして作成したＸ１１ＬΔ２２１−２５０（Ｎ末端側にＦＬＡＧ配列が付加されている）又はＸ１１ＬをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて導入し、２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化し、細胞溶解物とした。
実施例３と同様にして作成したＧＳＴ−ＡＰＰをこの細胞溶解物と混合し、４℃で２時間インキュベートした後、グルタチオンセファロースでＧＳＴ−ＡＰＰを回収し、洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加して７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離、ニトロセルロース膜に転写した。転写した膜のＸ１１Ｌを抗Ｘ１１Ｌモノクローナル抗体を用いたイムノブロットにより検出した。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
実施例７で示した２２１〜２５０領域を欠失したＸ１１Ｌは、ソルビトール処理によるＡＰＰへの結合増強能を失うことがインビトロで示された。２２１〜２５０領域を欠失したＸ１１Ｌは、ソルビトール刺激後もＡＰＰ細胞質ドメインに結合する能力の増強程度が著しく低下していることがインビトロで明らかになった。
【００５７】
実施例９：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位の同定（その１）（図９、図１０）
（方法）
Ｎ末端にＨＡタグの付いたＸ１１Ｌをｗｔとし、以下の変異体をメガプライマー法によって作成した（図９参照）。尚、Ｓ２３６は、２３６番目のセリンを意味し、同様に「アミノ酸の種類−その位置」の記載様式で各位置のアミノ酸を示す。
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌａｌｌ（ａｌｌ；Ｓ２３６，Ｓ２３８，Ｔ２４０，Ｓ２４１，Ｔ２４３，Ｓ２４４，Ｓ２４６，Ｓ２４９全てをアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｆｏｒ（ｆｏｒ；Ｓ２３６，Ｓ２３８，Ｔ２４０，Ｓ２４１をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｂａｃｋ（ｂａｃｋ；Ｔ２４３，Ｓ２４４，Ｓ２４６，Ｓ２４９をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｍｉｄ（ｍｉｄ；Ｔ２４０，Ｓ２４１，Ｔ２４３，Ｓ２４４をアラニンに置換したもの）
実施例２と同様の手順でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてこれらのＮＨＡ−Ｘ１１Ｌ（ｗｔ，ａｌｌ，ｆｏｒ，ｂａｃｋ，ｍｉｄのいずれか）をコードするプラスミド（例
えばｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−Ｘ１１Ｌａｌｌ）０．４μｇとＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ（ＡＰＰのＮ末端にＦＬＡＧタグが付されている）をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５）０．２μｇとをＨＥＫ２９３細胞に導入した。Ｘ１１Ｌのプラスミドを入れていない実験では、空のｐｃＤＮＡ３ベクターを同量加えた。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化した。遠心後の上清を細胞溶解物とし抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）で免疫沈降した。反応物を６％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写、ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌについては抗ＨＡ抗体、ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰについては抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
実施例８で同定したＸ１１Ｌの２２１から２５０アミノ酸には、図９で示す様に８個のリン酸化可能なセリン、スレオニン残基が存在する。これらのアラニン置換変異を導入した４種類のＸ１１Ｌコンストラクト（ａｌｌ，ｆｏｒ，ｂａｃｋ，ｍｉｄ）のソルビトール刺激によるＡＰＰ結合能増強効果を測定したところ、ａｌｌ及びｆｏｒコンストラクトがＡＰＰ結合増強効果を有意に失っていた（図１０）。この結果、ＡＰＰ結合能増強に影響を与えるリン酸化サイトはｆｏｒコンストラクト内に含まれる４つのアミノ酸のうちｍｉｄコンストラクトに含まれない最初の２つのＳｅｒ残基である可能性が示唆された。
【００５８】
実施例１０：ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位の同定（その２）（図１１〜１３）
（方法）
Ｎ末端にＨＡタグの付いたＸ１１Ｌをｗｔとし、以下の変異体をメガプライマー法によって作成した（図１１参照）。
ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３６Ａ（Ｓ２３６をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３８Ａ（Ｓ２３８をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３６／２３８Ａ（Ｓ２３６とＳ２３８の両方をアラニンに置換したもの）
ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｆｏｒ（ｆｏｒ；Ｓ２３６，Ｓ２３８，Ｔ２４０，Ｓ２４１をアラニンに置換したもの）
実施例２と同様の手順でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてこれらのＮＨＡ−Ｘ１１Ｌをコードするプラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−Ｘ１１Ｌ−Ｓ２３６Ａ）０．４μｇとＮＦＬＡＧ−ＡＰＰをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＮＦＬＡＧ−ＡＰＰ６９５）０．２μｇとをＨＥＫ２９３細胞に導入した。Ｘ１１Ｌのプラスミドを入れていない実験では、空のｐｃＤＮＡ３ベクターを同量加えた。
２４時間後に０．５Ｍソルビトール（終濃度）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４５分間処理した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳのみで同様に処理したものを対照群とした。その後細胞を１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ溶液で可溶化した。遠心後の上清を細胞溶解物とし抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で免疫沈降した。反応物を６％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写、ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌについては抗ＨＡ抗体、ＦＬＡＧ−ＡＰＰについては抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットを行った。検出にはＥＣＬ検出キットを用いた。
（結果）
実施例９より同定したＳｅｒ２３６及びＳｅｒ２３８のいずれか、又は両方をアラニンに置換したコンストラクトを図１１に示すように作成し、ソルビトール刺激によるＡＰＰ結合能増強効果を測定したところ、いずれか一方にＡｌａ変異を導入した場合は、その効果は強く失われていた（図１２）。この結果、ソルビトール刺激によるＸ１１ＬのＡＰＰ結合能強化には、Ｓｅｒ２３６及びＳｅｒ２３８のリン酸化が必要であることが明らかになった。Ｘ１１Ｌと同様にリン酸化され（実施例１）、又、Ａβ生成抑制阻害効果を持つ
Ｘ１１中にもこのリン酸化部位が保存されている（図１３参照）。一方、Ｘ１１、Ｘ１１Ｌとは異なり、神経細胞での特異的発現を示さないＸ１１Ｌ２にはこのリン酸化部位は含まれていない。
【００５９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］Ｘ１１Ｌをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：２］Ｘ１１Ｌのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：３］Ｘ１１Ｌの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：４］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌａｌｌの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：５］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｆｏｒの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：６］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｂａｃｋの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：７］ＮＨＡ−Ｘ１１Ｌｍｉｄの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：８］ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３６Ａの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：９］ＮＨＡ−Ｘ１１ＬＳ２３８Ａの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：１０］Ｓ２３６とＳ２３８がともにアラニンに置換された、Ｎ末端にＨＡタグの付いたＸ１１Ｌの部分アミノ酸配列（２２１〜２５０）を示す。
［配列番号：１１］ヒトＸ１１Ｌ（ｈＸ１１Ｌ）の部分アミノ酸配列（２２０〜２５０）を示す。
［配列番号：１２］ラットＸ１１Ｌ（ｒＸ１１Ｌ）の部分アミノ酸配列（２２１〜２５１）を示す。
［配列番号：１３］ヒトＸ１１（ｈＸ１１）の部分アミノ酸配列（２６４〜２９４）を示す。
［配列番号：１４］ラットＸ１１（ｒＸ１１）の部分アミノ酸配列（２６５〜２９５）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】（Ａ）は、神経細胞におけるＸ１１Ｌ及びＸ１１のリン酸化を示した図である。（Ｂ）は、Ｘ１１及びＸ１１Ｌのタンパク質構造を模式的に示したものである。
【図２】ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合増強効果を示す図である。ＩＰのレーン：抗ＦＬＡＧ抗体で抽出物を免疫沈降させた沈降物を試料として用いた場合の結果。ｃｒｕｄｅのレーン：抽出物そのものを試料として用いた場合の結果。
【図３】ソルビトール刺激によるＡＰＰとＸ１１Ｌの結合増強効果を示す図である。ｉｎｐｕｔのレーン：細胞溶解物をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ＧＳＴ−ＡＰＰのレーン：細胞溶解物とＧＳＴ−ＡＰＰとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ＧＳＴのレーン：細胞溶解物とＧＳＴとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。
【図４】Ｘ１１Ｌの脱リン酸化によりＡＰＰへの結合能が消失することを示した図である。ｌｙｓａｔｅのレーン：ソルビトール刺激した（又はしていない）細胞の溶解物（Ｌｙｓａｔｅ）をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ｉｎｐｕｔのレーン：ＬｙｓａｔｅをλＰＰａｓｅで脱リン酸化処理した（又はしていない）試料を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ｂｏｕｎｄのレーン：ＬｙｓａｔｅをλＰＰａｓｅで脱リン酸化処理した（又はしていない）試料とＧＳＴ−ＡＰＰとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。下図は上記結果（ｂｏｕｎｄのレーン）を比で数値化したグラフである。
【図５】Ｘ１１Ｌのリン酸化を介したＡＰＰへの結合能増強へのＪＮＫの関与を調べた結果を示す図である。ｐｕｌｌ ｄｏｗｎのレーン：細胞溶解物とＧＳＴ−ＡＰＰとを混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物を抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。ｉｎｐｕｔ：細胞溶解物をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。
【図６】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域を同定した結果を示す図である。 左側上段は抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降物を抗ＡＰＰ抗体でイムノブロットした結果であり、中段は溶解物をそのまま抗ＡＰＰ抗体でイムノブロットした結果であり、下段は溶解物をそのまま抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果である。下側は各Ｘ１１Ｌコンストラクトの構造を模式的に示したものである。
【図７】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域を同定した結果を示す図である。ＩＰ：Ｇ３６９のレーン；細胞溶解物を抗ＡＰＰポリクローナル抗体（Ｇ３６９）で免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＡＰＰ抗体（Ｃ末端ＡＰＰ抗体）でイムノブロットした結果。ｃｒｕｄｅのレーン；細胞溶解物をそのまま抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＡＰＰ抗体（Ｃ末端ＡＰＰ抗体）でイムノブロットした結果。
【図８】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化領域を同定した結果を示す図である。ｐｕｌｌ ｄｏｗｎのレーン：細胞溶解物をＧＳＴ−ＡＰＰと混合した後、グルタチオンセファロースで回収した沈降物をイムノブロットした結果。ｉｎｐｕｔのレーン：細胞溶解物をそのまま抗Ｘ１１Ｌ抗体でイムノブロットした結果。
【図９】Ｘ１１Ｌのリン酸化が可能な部位をアラニンに置換することによって得られる各種変異体の部分アミノ酸配列を示した図である。
【図１０】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位を同定した結果を示す図である。ＩＰのレーン：細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、沈降物を抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。Ｌｙｓａｔｅのレーン：細胞溶解物をそのまま抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。
【図１１】Ｘ１１Ｌのリン酸化が可能な部位をアラニンに置換することによって得られる各種変異体の部分アミノ酸配列を示した図である。
【図１２】ＡＰＰへの結合能に影響を与えるＸ１１Ｌリン酸化部位を同定した結果を示す図である。ＩＰのレーン：細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、沈降物を抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。Ｌｙｓａｔｅのレーン：細胞溶解物をそのまま抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットした結果。
【図１３】ヒト及びラットのＸ１１Ｌ、並びにヒト及びラットのＸ１１の部分アミノ酸配列を示す図である。
【図１４】ＡＰＰとＸ１１Ｌとの結合能を評価する為の方法の一例（レポーターアッセイ法）を示す図である。
【図１５】Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングする方法（サンドイッチ法）の一例を示す図である。
【図１６】Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングする方法（イムノブロット）の一例を示す図である。
【図１７】Ｘ１１Ｌリン酸化特異抗体を用いて、Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進する化合物をスクリーニングする方法（Ｃｙｔｏｂｌｏｔ法）の一例を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合増強剤。
【請求項２】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体の代謝抑制剤。
【請求項３】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、βアミロイド生成抑制剤。
【請求項４】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤を含む、βアミロイドが関連する疾患の予防・治療剤。
【請求項７】
βアミロイドが関連する疾患が、アルツハイマー病である、請求項６記載の予防・治療剤。
【請求項８】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体タンパク質とＸ１１Ｌタンパク質との結合を増強する方法。
【請求項９】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制する方法。
【請求項１０】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、βアミロイドの生成を抑制する方法。
【請求項１１】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、βアミロイドの生成を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合増強剤。
【請求項２】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、アミロイド前駆体の代謝抑制剤。
【請求項３】
Ｘ１１Ｌリン酸化促進作用を有する化合物を有効成分として含有する、βアミロイド生成抑制剤。
【請求項４】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤を含む、βアミロイドが関連する疾患の予防・治療剤。
【請求項７】
βアミロイドが関連する疾患が、アルツハイマー病である、請求項６記載の予防・治療剤。
【請求項８】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体タンパク質とＸ１１Ｌタンパク質との結合を増強する方法。
【請求項９】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制する方法。
【請求項１０】
Ｘ１１Ｌのリン酸化を促進することを含む、βアミロイドの生成を抑制する方法。
【請求項１１】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体とＸ１１Ｌとの結合を増強し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、アミロイド前駆体の代謝を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
Ｘ１１Ｌのリン酸化レベルを測定することを含む、βアミロイドの生成を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、アミノ酸番号２２１〜２５０の領域内にある、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
Ｘ１１Ｌのリン酸化部位が該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中、２３６番目のセリン及び／又は２３８番目のセリンである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
リン酸化Ｘ１１Ｌ特異抗体を用いることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００６−３１５９８２（Ｐ２００６−３１５９８２Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１３９１１４（Ｐ２００５−１３９１１４）
【出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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