アクリルアミド分解菌のスクリーニング
【課題】アクリルアミド分解性菌の効率的かつ簡易なスクリーニング方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド分解性菌を提供する。
【解決手段】制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびに一定濃度のアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド分解性菌。
【解決手段】制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびに一定濃度のアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド分解性菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド高分解性菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクリルアミドは、アクリル基（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−）とアミド基（−ＣＯ−ＮＨ−）をもつ有機化合物で、常温では無臭白色の結晶で、水やアルコールに溶けやすい性質である。室温や暗所では安定であるが、加熱や紫外線によって重合し、ポリアクリルアミドになる。工業的にはアクリルニトリルから加水分解により合成され、化学架橋剤や漆くいに使用され、ポリアクリルアミドは水処理剤、土壌凝固剤、漏水防止剤、紙力増強剤、アクリル系熱硬化性塗料原料、化粧品原料、バイオテクノロジー関係の研究室等などの多くの分野で使用されている。
【０００３】
しかし、アクリルアミドの摂取は健康への悪影響が懸念され、多くの人々が不安を持っている。アクリルアミドは人への皮膚障害、言語障害、末梢神経炎、小脳性失調等を起こし、中毒症状は主に神経症状と肝障害である。国際がん研究機関は、アクリルアミドを「ヒトに対しておそらく発がん性がある物質（２Ａ）」に分類している。その理由には、アクリルアミドが細胞の中のＤＮＡを傷付ける作用を持っていることが複数の試験から確認され、ヒトが食品から極微量にアクリルアミドを摂取し続けた場合にも、この作用が原因となってがんを引き起こす可能性があると考えられている。動物試験では、アクリルアミドの摂取量が増えると発がん率も増えることが報告され、ヒトでの研究では、食品からアクリルアミド摂取量が増えると子宮内膜がんと卵巣がんの発がんリスクを高くなることが報告されている。
【０００４】
工業原料であるアクリルアミドが、２００２年、日常的に摂取する食品や加熱加工食品に含まれることが報告された。各種食品を対象に分析が行われ、ポテトチップス、フライドポテト等のスナック、小麦を原料とするビスケット・焼き菓子、コーヒーやほうじ茶等や、家庭やレストラン等で調理された食品からもアクリルアミドが検出されたことが報告された。ノルウェーでの調査ではアクリルアミド食品別の摂取率は、コーヒーが最も多く約３割であり、次いで、ポテトチップス、パンの順であり、これらの合計で約６〜７割であることが示されている。日本では現在調査が進められている。
【０００５】
食品中でアクリルアミドが生成するメカニズムについても研究が進められている。食品原材料に含まれているアミノ酸の一種であるアスパラギンと果糖やブドウ糖等の還元糖とが、調理中の加熱よりアミノカルボニル反応を起こし、その過程でアクリルアミドが生成すると考えられている。しかし、アスパラギンや還元糖以外の食品成分が原因物質となっている可能性や、アミノカルボニル反応以外の反応経路からもアクリルアミドが生成することが報告されている。また、脂質が分解して生成するアクロレインの酸化による経路や、アスパラギン酸から生成したアクリル酸がアンモニアと反応して生成する経路、セリンやシステインといったアミノ酸から生成した乳酸がアンモニアと反応して生成する経路、アスパラギンの酵素的脱炭酸反応により生成した３−アミノプロパンアミドが脱アミノ反応する経路等も報告されている。
【０００６】
現在までに食品中のアクリルアミドの低減方法も研究され、食品原材料に含まれているアスパラギンの低減（例えば特許文献１、２参照）、加熱加工方法の工夫、（例えば特許文献３、４参照）、反応性の低いアミノ酸や糖質を使用した方法、原料の保存方法が報告されている。しかし、生成原因や経路が複雑であるために、アクリルアミド濃度を低減できない食品もあり、製造業者にとっては大きな課題である。
【０００７】
一方、加熱加工中の生成制御による低減方法以外には、加熱加工後に、生成したアクリルアミドを分解する方法が考えらえる。対象は食品ではない場合、アクリルアミドの分解に微生物を用いる方法が公知であり、例えば、ブレビバクテリウム・アンモニジェニスＡＴＣＣ１６４１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ１６４１）、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１ （Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ ＡＳ−１ ＮＣＩＢ１０５１５）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）がある（特許文献５〜７参照）。また、アミダーゼ遺伝子のクローニングも報告されている。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ロドコッカス・ロドクラウスＩＦＯ １５５６４（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＩＦＯ １５５６４）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１）、ブレビバクテリウムＲ３１２（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｒ３１２）、コマモナス・テストステロリ ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ）、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Ｐｓｅｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５）がある（特許文献８〜１３参照）。さらに、アミダーゼの製造についても報告がある。例えば、ロドコッカス ＮＣＩＭＢ４０８８９ やＮＣＩＭＢ４０７５５（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ＮＣＩＭＢ４０８８９、ＮＣＩＭＢ４０７５５）（特許文献１４参照）である。
【０００８】
このように種々の微生物において、アミダーゼ及びアミダーゼ遺伝子が知られていることから、これらの微生物酵素を用いて加工食品、とりわけ加熱食品中のアクリルアミドを分解低減することは可能であろう。しかし、上記微生物や他の遺伝子組み換え微生物は安全性という観点からは問題があり、食品への応用は困難である。
【０００９】
食品工業に利用可能な安全性の高い微生物からアクリルアミドを高分解する菌を見つけ出すことができれば、食品、とりわけ加熱加工食品中のアクリルアミド分解に利用し得る可能性がある。しかし、食品工業で利用できる微生物、或いは微生物由来酵素がアクリルアミドを特異的に分解することを報告した例は限られ、未利用微生物があることが考えられる。また、全ゲノム解析が終了した微生物である麹菌では、バイオインフォーマテックス技術によってアミダーゼ遺伝子の存在が知られているが、アクリルアミドを分解することは報告されていない。また、麹菌は、酒、味噌、醤油などの醸造産業において目的に応じた育種が繰り返され多様な株が存在する。麹菌以外でも、経済産業省の食品工業微生物リストや農林水産省の食品酵素の起源には多くの微生物が記載され、それらの変異株も存在する。そこで、それらを対象にして、効率的にアクリルアミド高分解性菌をスクリーニングする為には、簡易法の発見が必要である。
【特許文献１】特開２００５−１９２４３６号公報
【特許文献２】特表２００６−５０００７１号公報
【特許文献３】特開２００７−２３６２７３号公報
【特許文献４】特表２００８−５１１３２４号公報
【特許文献５】特許７９０１１３８９号
【特許文献６】米国特許第５１８８９５２号／ＥＵ特許０２７２０２６号
【特許文献７】国際公開第９９／００７７４８号
【特許文献８】国際公開第０６／４０３４５号
【特許文献９】特開平９−９９７３号公報
【特許文献１０】特開２００４−１０５１５２号公報
【特許文献１１】米国特許第５２６０２０８号
【特許文献１２】米国特許出願公開２００４／０２２５１１６号
【特許文献１３】特開２００６−３４０６３０号公報
【特許文献１４】米国特許第５９６２２８４号／ ＥＵ特許０９８８３７５号／国際公開第９９／００７８３８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の解決しようとする課題は、アクリルアミド分解性菌の効率的かつ簡易なスクリーニング方法、詳細には、アクリルアミドを直接分解することができる安全なアクリルアミド分解性菌をスクリーニングするための効率的かつ簡易な方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド分解性菌を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびに一定濃度のアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることにより、高アクリルアミド分解性菌を効率的かつ簡易にスクリーニングすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法、
（２）培地中のアクリルアミド濃度が０．００４〜０．２％（ｗ／ｖ）である（１）記載の方法、
（３）培地中のアクリルアミド濃度が０．０２〜０．２％（ｗ／ｖ）である（２）記載の方法、
（４）培地中の炭素源濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）以上である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）培地中の炭素源濃度が０．０３％〜３％（ｗ／ｖ）である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、
（６）培地中のアクリルアミド以外の窒素源濃度が０％〜０．３％（ｗ／ｖ）である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法、
（７）培地がアクリルアミド以外の窒素源を含有しないものである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法、
（８）培地が最小培地をベースにしたものである（１）〜（７）のいずれかに記載の方法、
（９）微生物が糸状菌である（１）〜（８）のいずれかに記載の方法、
（１０）糸状菌がアスペルギルス属菌である（９）記載の方法、
（１１）アスペルギルス属菌が麹菌である（１０）記載の方法、
（１２）培地がツァペック・ドックス最小培地をベースにしたものである（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法、
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法に使用される培地、
（１４）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法に使用される培地またはその成分を必須として含む、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング用キット、ならびに
（１５）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法または（１４）記載のキットにより得られるアクリルアミド分解性菌
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、アクリルアミド分解性菌の効率的なスクリーニング方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド高分解性菌が提供される。また本発明によれば、細菌のみならず糸状菌からもアクリルアミド分解性菌をスクリーニングすることができるので、麹菌などの安全な菌株からアクリルアミド分解性菌を効率よく得ることができる。さらに本発明のスクリーニングは上記培地にて候補微生物を培養し、その増殖・成長を観察するという極めて簡単な操作にて行うことができ、汎用性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、１の態様において、制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法の第１工程は、制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養する工程である。使用する培地はいかなる種類の培地であってもよく、天然培地、人工培地、それらの混合培地であってもよい。当業者は、スクリーニングすべき微生物の種類やその他の要因に応じて、培地の種類や成分、ならびに培養条件（温度、培養時間、通気量など）を選択することができる。ここに、微生物とは、細菌、酵母、糸状菌、放線菌を包含するものとする。食品の製造に用いられる細菌としては乳酸菌や納豆菌などが例示される。また、食品の製造に用いられる糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、例えば麹菌、かつおぶし製造菌など、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属糸状菌、例えばチーズ製造菌など、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属糸状菌およびムコール（Ｍｕｃｏｒ）属糸状菌、例えば東南アジア諸国における麹の製造、老酒の製造用の菌などが挙げられる。本明細書において、微生物と菌は同義である。本発明のスクリーニング方法に使用する培地の形状も特に制限はなく、液体培地であっても、固体培地（例えば、寒天平板培地、寒天斜面培地）であってもよい。なお、本発明においては、培地中の寒天は炭素源として扱わない。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法において、使用する培地中の炭素源濃度および／または窒素源濃度を制限濃度とする。その理由は、培地中の炭素源濃度および／または窒素源濃度が高すぎると、微生物がアクリルアミドを利用しなくなるからである。本明細書において、炭素源および窒素源の制限濃度とは、微生物に余分な栄養を与えずにアクリルアミドを利用させ、観察可能な程度に生育あるいは増殖させることのできる炭素源および窒素源の濃度をいう。本発明のスクリーニング方法に使用する培地中の炭素源の制限濃度は、微生物の種類、培養条件、およびその他の要因にもよるが、通常は例えば約０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、好ましくは約０．０３％（ｗ／ｖ）以上である。例えば、培地中の炭素源の制限濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）であり、最も好ましくは、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）である。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法に使用する培地中のアクリルアミド以外の窒素源の制限濃度は、微生物の種類、培養条件、およびその他の要因にもよるが、通常は例えば０％〜約１％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０％〜約０．５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０％〜０．３％（ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、培地中のアクリルアミド以外の炭素源の濃度を０％とすることによりアクリルアミドを唯一の窒素源として培養する。そうすることにより、微生物の生育・増殖の差異を明確化することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法に使用する培地中のアクリルアミド濃度は、微生物の種類、培養条件、およびその他の要因にもよるが、通常は例えば約０．００４〜約０．２％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約０．０２〜約０．２％（ｗ／ｖ）である。培地中のアクリルアミドが低すぎると、アクリルアミド分解能が生育あるいは増殖の差に反映されにくくなり、スクリーニングが困難となる。また、培地中のアクリルアミド濃度が高すぎると、毒性の影響により生育あるいは増殖が妨げられるので、やはりスクリーニングが困難となる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法において使用する培地は、最小培地をベースにしたものが好ましい。天然培地中には多種多様な炭素源、窒素源となる物質が含まれており、微生物がアクリルアミドよりもこれらの成分を利用してしまい、アクリルアミド利用による生育あるいは増殖の差異が出にくいからである。また、天然培地においては、炭素源、窒素源の濃度をコントロールすることが困難である。したがって、本発明のスクリーニング方法には、炭素源、窒素源の種類が明確で、それらの濃度をコントロールしやすい人工培地をベースにした培地を用いることが好ましく、最小培地をベースにした培地を用いることがさらに好ましい。本発明のスクリーニング方法に使用する最も好ましい培地は、上記範囲の制限濃度の炭素源および／または窒素源を含む最小培地に、上記濃度範囲のアクリルアミドを添加した培地である。このような培地を用いることにより、微生物がアクリルアミドを利用し、その利用の程度による生育や増殖の差異を観察しやすくなる。なお、本明細書において、最小培地をベースにした培地とは、最小培地にアクリルアミドを添加した培地をいい、その場合、最小培地の成分の種類、濃度は適宜変更されていてもよい。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法において、上記範囲の制限濃度の炭素源を含むが、上記濃度範囲のアクリルアミド以外の窒素源を含まない最小培地を用いることが最も好ましい。かかる培地を用いると、アクリルアミドの分解能の差異が微生物の生育・増殖の差異に反映されやすくなるので、スクリーニングの結果がより明確となる。
【００２１】
上述のごとく、本発明のスクリーニング方法にて試験される微生物に種類は特に限定されないが、細菌、酵母、糸状菌、放線菌には各々に適した最小培地が知られているので、適宜選択して用いることができる。例えば、糸状菌をスクリーニングする場合には、最小培地としてツァペック・ドックス最小培地が有名であり、これをベースにした培地を本発明のスクリーニング方法に使用することが好ましい。しかし、他の最小培地を用いてもかまわない。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法の第２工程は、上記培地にて微生物を培養し、その生育あるいは増殖を調べる工程である。本発明のスクリーニング方法において、微生物の生育あるいは増殖は、その微生物のアクリルアミド分解能を反映する。したがって、本発明の方法においてよく生育あるいは増殖する微生物は、アクリルアミド分解能が高いものとしてスクリーニングすることができる。このように、本発明の方法は、微生物の生育あるいは増殖を調べるだけで、アクリルアミド分解能が高い微生物をスクリーニングできる、極めて簡便な方法である。
【００２３】
微生物の生育あるいは増殖を調べる手段・方法は公知であり、微生物の種類、培地の種類、培養条件等に応じて適宜選択することができる。例えば、微生物が細菌であり、液体培地を用いる場合には、培地の濁度を測定することにより、微生物の生育あるいは増殖を調べることができる。例えば、微生物が糸状菌であり、液体培地を用いる場合には、培地中の菌体量を肉眼で観察することができる。また例えば、寒天培地を用いる場合には、培地上の微生物コロニーの大きさを肉眼で調べることもできる。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、本発明のスクリーニング方法に用いられる培地を提供する。かかる培地は上で説明したものであるが、上記範囲の制限濃度の炭素源、窒素源を含む最小培地をベースにしたものであって、上記濃度範囲のアクリルアミドを含有するものが好ましい。スクリーニングすべき微生物が糸状菌の場合には、上記範囲の制限濃度の炭素源、窒素源を含む最小培地をベースにしたものであって、上記濃度範囲のアクリルアミドを含有するツァペック・ドックス最小培地が好適である。
【００２５】
本発明は、さらなる態様において、本発明のスクリーニング方法に用いられる培地またはその成分を必須として含む、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング用キットを提供する。本発明の該キットは、培地の調製に必要な他の成分や器具類を含んでいてもよく、あるいは、例えば、微生物の生育・増殖を判定するための器具類を含んでいてもよい。通常、キットには取扱説明書が添付される。
【００２６】
本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明のスクリーニング方法あるいはキットを用いることにより得られたアクリルアミド分解性菌を提供する。よく生育あるいは増殖した微生物を選択することにより、アクリルアミド高分解性菌を得ることができる。例えば、食品製造に使用される菌株から本発明の方法あるいはキットを用いてスクリーニングされたアクリルアミド分解性菌は、食品のアクリルアミド分解・除去に使用することができる。また、本発明のスクリーニング方法あるいはキットを用いることにより得られたアクリルアミド分解性菌からアクリルアミド分解活性を有するアミダーゼを得て、これを使用してもよい。
【００２７】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２８】
使用菌株のアクリルアミド分解能を測定した。
【００２９】
（１）使用菌株
麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）６株（ＡＯ−Ａ、ＡＯ−Ｂ、ＡＯ−Ｃ、ＡＯ−Ｄ、ＡＯ−Ｅ、ＡＯ−Ｆ）をポテトデキストロース寒天培地（以下、ＰＤＢ培地と略す）で、３０℃、７日間培養し、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ １％（ｖ／ｖ）を含む無菌水を添加して分生子を懸濁した後、分生子以外の菌糸などを除去するために更に無菌水を加えて撹拌後、遠心分離を行った。同様の操作を3回繰り返し、分生子懸濁液とした。この分生子懸濁液の分生子数を血球計算盤によって計数した。
【００３０】
（２）培地
ツァペック・ドックス最小培地（炭素源：ショ糖３％（ｗ／ｖ）、窒素源：硝酸ナトリウム０．３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％（ｗ／ｖ）、塩化カリウム０．０５％（ｗ／ｖ）、硫酸鉄・７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．０１％（ｗ／ｖ）、以下、ＣＤ培地と略す）にアクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
【００３１】
（３）培養条件、測定及び観察
１５０ｍｌバッフル付きフラスコに各培地３０ｍｌを入れ、初発分生子濃度が１．０×１０６／ｍｌになるよう分生子懸濁液を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養した。７２時間後に生育状況を肉眼で観察した。同時に培地１．５ｍｌを採取し、アクリルアミド含量を測定した。
【００３２】
（４）アクリルアミド分析方法
採取した培地を０．４５μｍメンブレンフィルターでろ過し、高速液体クロマトグラフィーを用いてアクリルアミド含量を測定した。移動層は０．１％（ｗ／ｖ）リン酸を用いて、高速液体クロマトグラフィーは島津製作所ＣＬＡＳＳ−ＶＰ、カラムは資生堂製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８ ｔｙｐｅＳＧ１２０、５μｍ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、検出器はＵＶ２１０ｎｍである。
【表１】
【００３３】
培地中のアクリルアミド濃度の減少がみとめられた。しかし、生育状況は全て良好であり、差はみられなかった。
これらの菌株を以下の実験に使用した。
【実施例２】
【００３４】
培地中の炭素源及び窒素源の有無による生育状況を検証した。
【００３５】
（１）使用菌株
麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）２株 ＡＯ−Ａ、ＡＯ−ＢをＰＤＢ培地で、３０℃、７日間培養し、実施例１と同様に操作し、分生子懸濁液を調製後、分生子数を計数した。
【００３６】
（２）培地
ｉ）アクリルアミド添加ＣＤ培地
ＣＤ培地にアクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
ｉｉ）アクリルアミド添加炭素源なしＣＤ培地
ＣＤ培地からショ糖を除き、アクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
ｉｉｉ）アクリルアミド添加窒素源無しＣＤ培地
ＣＤ培地から硝酸ナトリウムを除き、アクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
ｉｖ）アクリルアミド添加炭素源なし、窒素源なしＣＤ培地
ＣＤ培地からショ糖及び硝酸ナトリウムを除き、アクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
【表２−１】
【表２−２】
【００３７】
炭素源を含まない培地では生育しない為、評価には適用できなかった。窒素源を抜き、アクリルアミド濃度を０．０２％〜０．２％（ｗ／ｖ）に調製することで、生育状況に差があり、アクリルアミドの分解能を反映していることを見出した。参考までに、生育状況（◎：良好、○：生育、△：弱い生育、×：生育せず）の典型例を図１に示す。
【実施例３】
【００３８】
窒素源を抜き、更に、炭素源濃度を制限することでアクリルアミド分解能を、生育状況で容易に判別できるか検討した。
【００３９】
（１）使用菌株
麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＡＯ−Ａ、ＡＯ−Ｃ をＰＤＢ培地で、３０℃、７日間培養し、実施例１と同様に操作し、分生子懸濁液を調製後、分生子数を計数した。
【００４０】
（２）培地
ＣＤ培地から窒素源である硝酸ナトリウムを除き、炭素源であるショ糖を５濃度（０．０００３％、０．００３％、０．０３％、０．３％、３％（ｗ／ｖ）になるように調製後、次に、各々にアクリルアミドを５濃度（０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
【表３−１】
【表３−２】
【００４１】
炭素源０．００３％（ｗ／ｖ）以下ではアクリルアミド分解能と生育状況の結果が一致しないため、０．０３％（ｗ／ｖ）以上の炭素源が必要であった。０．０３％（ｗ／ｖ）以上の炭素源濃度の培地においては、アクリルアミド分解能を、生育状況で容易に判別できることがわかった。
【実施例４】
【００４２】
実施例３の条件で麹菌以外の糸状菌を対象に生育状況でのアクリルアミド分解能を評価した。
【００４３】
（１）使用株
糸状菌８種１０株：麹菌ＡＯ−Ａ、ＡＯ−Ｃ、ＡＯ−Ｄ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アクチノムコアー・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｒ ｅｌｅｇａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍｅｒ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｎ）、各々の菌株をＰＤＢ培地で、３０℃、７日間培養し、実施例１と同様に操作し、分生子懸濁液を調製後、分生子数を計数した。
【００４４】
（２）培地
硝酸ナトリウムを含まないＣＤ培地にアクリルアミド０．０２％（ｗ／ｖ）を添加して作製した。
【００４５】
（３）培養条件、測定及び観察
上記培地３０ｍｌを１５０ｍｌバッフル付きフラスコに入れ、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養し、７２時間後に生育状況を肉眼で観察した。同時に、培地１．５ｍｌを採取し、培地中のアクリルアミド含量を測定した。
【表４】
【００４６】
上記結果から生育状況を観察するだけでアクリルアミド分解能を有する糸状菌を容易に選択できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、食品製造の分野、化学工業の分野などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本明細書の実施例における菌の生育状況（◎：良好、○：生育、△：弱い生育、×：生育せず）の典型例を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド高分解性菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクリルアミドは、アクリル基（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−）とアミド基（−ＣＯ−ＮＨ−）をもつ有機化合物で、常温では無臭白色の結晶で、水やアルコールに溶けやすい性質である。室温や暗所では安定であるが、加熱や紫外線によって重合し、ポリアクリルアミドになる。工業的にはアクリルニトリルから加水分解により合成され、化学架橋剤や漆くいに使用され、ポリアクリルアミドは水処理剤、土壌凝固剤、漏水防止剤、紙力増強剤、アクリル系熱硬化性塗料原料、化粧品原料、バイオテクノロジー関係の研究室等などの多くの分野で使用されている。
【０００３】
しかし、アクリルアミドの摂取は健康への悪影響が懸念され、多くの人々が不安を持っている。アクリルアミドは人への皮膚障害、言語障害、末梢神経炎、小脳性失調等を起こし、中毒症状は主に神経症状と肝障害である。国際がん研究機関は、アクリルアミドを「ヒトに対しておそらく発がん性がある物質（２Ａ）」に分類している。その理由には、アクリルアミドが細胞の中のＤＮＡを傷付ける作用を持っていることが複数の試験から確認され、ヒトが食品から極微量にアクリルアミドを摂取し続けた場合にも、この作用が原因となってがんを引き起こす可能性があると考えられている。動物試験では、アクリルアミドの摂取量が増えると発がん率も増えることが報告され、ヒトでの研究では、食品からアクリルアミド摂取量が増えると子宮内膜がんと卵巣がんの発がんリスクを高くなることが報告されている。
【０００４】
工業原料であるアクリルアミドが、２００２年、日常的に摂取する食品や加熱加工食品に含まれることが報告された。各種食品を対象に分析が行われ、ポテトチップス、フライドポテト等のスナック、小麦を原料とするビスケット・焼き菓子、コーヒーやほうじ茶等や、家庭やレストラン等で調理された食品からもアクリルアミドが検出されたことが報告された。ノルウェーでの調査ではアクリルアミド食品別の摂取率は、コーヒーが最も多く約３割であり、次いで、ポテトチップス、パンの順であり、これらの合計で約６〜７割であることが示されている。日本では現在調査が進められている。
【０００５】
食品中でアクリルアミドが生成するメカニズムについても研究が進められている。食品原材料に含まれているアミノ酸の一種であるアスパラギンと果糖やブドウ糖等の還元糖とが、調理中の加熱よりアミノカルボニル反応を起こし、その過程でアクリルアミドが生成すると考えられている。しかし、アスパラギンや還元糖以外の食品成分が原因物質となっている可能性や、アミノカルボニル反応以外の反応経路からもアクリルアミドが生成することが報告されている。また、脂質が分解して生成するアクロレインの酸化による経路や、アスパラギン酸から生成したアクリル酸がアンモニアと反応して生成する経路、セリンやシステインといったアミノ酸から生成した乳酸がアンモニアと反応して生成する経路、アスパラギンの酵素的脱炭酸反応により生成した３−アミノプロパンアミドが脱アミノ反応する経路等も報告されている。
【０００６】
現在までに食品中のアクリルアミドの低減方法も研究され、食品原材料に含まれているアスパラギンの低減（例えば特許文献１、２参照）、加熱加工方法の工夫、（例えば特許文献３、４参照）、反応性の低いアミノ酸や糖質を使用した方法、原料の保存方法が報告されている。しかし、生成原因や経路が複雑であるために、アクリルアミド濃度を低減できない食品もあり、製造業者にとっては大きな課題である。
【０００７】
一方、加熱加工中の生成制御による低減方法以外には、加熱加工後に、生成したアクリルアミドを分解する方法が考えらえる。対象は食品ではない場合、アクリルアミドの分解に微生物を用いる方法が公知であり、例えば、ブレビバクテリウム・アンモニジェニスＡＴＣＣ１６４１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ１６４１）、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１ （Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ ＡＳ−１ ＮＣＩＢ１０５１５）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）がある（特許文献５〜７参照）。また、アミダーゼ遺伝子のクローニングも報告されている。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ロドコッカス・ロドクラウスＩＦＯ １５５６４（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＩＦＯ １５５６４）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１）、ブレビバクテリウムＲ３１２（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｒ３１２）、コマモナス・テストステロリ ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ）、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Ｐｓｅｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５）がある（特許文献８〜１３参照）。さらに、アミダーゼの製造についても報告がある。例えば、ロドコッカス ＮＣＩＭＢ４０８８９ やＮＣＩＭＢ４０７５５（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ＮＣＩＭＢ４０８８９、ＮＣＩＭＢ４０７５５）（特許文献１４参照）である。
【０００８】
このように種々の微生物において、アミダーゼ及びアミダーゼ遺伝子が知られていることから、これらの微生物酵素を用いて加工食品、とりわけ加熱食品中のアクリルアミドを分解低減することは可能であろう。しかし、上記微生物や他の遺伝子組み換え微生物は安全性という観点からは問題があり、食品への応用は困難である。
【０００９】
食品工業に利用可能な安全性の高い微生物からアクリルアミドを高分解する菌を見つけ出すことができれば、食品、とりわけ加熱加工食品中のアクリルアミド分解に利用し得る可能性がある。しかし、食品工業で利用できる微生物、或いは微生物由来酵素がアクリルアミドを特異的に分解することを報告した例は限られ、未利用微生物があることが考えられる。また、全ゲノム解析が終了した微生物である麹菌では、バイオインフォーマテックス技術によってアミダーゼ遺伝子の存在が知られているが、アクリルアミドを分解することは報告されていない。また、麹菌は、酒、味噌、醤油などの醸造産業において目的に応じた育種が繰り返され多様な株が存在する。麹菌以外でも、経済産業省の食品工業微生物リストや農林水産省の食品酵素の起源には多くの微生物が記載され、それらの変異株も存在する。そこで、それらを対象にして、効率的にアクリルアミド高分解性菌をスクリーニングする為には、簡易法の発見が必要である。
【特許文献１】特開２００５−１９２４３６号公報
【特許文献２】特表２００６−５０００７１号公報
【特許文献３】特開２００７−２３６２７３号公報
【特許文献４】特表２００８−５１１３２４号公報
【特許文献５】特許７９０１１３８９号
【特許文献６】米国特許第５１８８９５２号／ＥＵ特許０２７２０２６号
【特許文献７】国際公開第９９／００７７４８号
【特許文献８】国際公開第０６／４０３４５号
【特許文献９】特開平９−９９７３号公報
【特許文献１０】特開２００４−１０５１５２号公報
【特許文献１１】米国特許第５２６０２０８号
【特許文献１２】米国特許出願公開２００４／０２２５１１６号
【特許文献１３】特開２００６−３４０６３０号公報
【特許文献１４】米国特許第５９６２２８４号／ ＥＵ特許０９８８３７５号／国際公開第９９／００７８３８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の解決しようとする課題は、アクリルアミド分解性菌の効率的かつ簡易なスクリーニング方法、詳細には、アクリルアミドを直接分解することができる安全なアクリルアミド分解性菌をスクリーニングするための効率的かつ簡易な方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド分解性菌を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびに一定濃度のアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることにより、高アクリルアミド分解性菌を効率的かつ簡易にスクリーニングすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法、
（２）培地中のアクリルアミド濃度が０．００４〜０．２％（ｗ／ｖ）である（１）記載の方法、
（３）培地中のアクリルアミド濃度が０．０２〜０．２％（ｗ／ｖ）である（２）記載の方法、
（４）培地中の炭素源濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）以上である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）培地中の炭素源濃度が０．０３％〜３％（ｗ／ｖ）である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、
（６）培地中のアクリルアミド以外の窒素源濃度が０％〜０．３％（ｗ／ｖ）である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法、
（７）培地がアクリルアミド以外の窒素源を含有しないものである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法、
（８）培地が最小培地をベースにしたものである（１）〜（７）のいずれかに記載の方法、
（９）微生物が糸状菌である（１）〜（８）のいずれかに記載の方法、
（１０）糸状菌がアスペルギルス属菌である（９）記載の方法、
（１１）アスペルギルス属菌が麹菌である（１０）記載の方法、
（１２）培地がツァペック・ドックス最小培地をベースにしたものである（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法、
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法に使用される培地、
（１４）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法に使用される培地またはその成分を必須として含む、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング用キット、ならびに
（１５）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法または（１４）記載のキットにより得られるアクリルアミド分解性菌
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、アクリルアミド分解性菌の効率的なスクリーニング方法、そのための培地およびキット、ならびに該方法により得られるアクリルアミド高分解性菌が提供される。また本発明によれば、細菌のみならず糸状菌からもアクリルアミド分解性菌をスクリーニングすることができるので、麹菌などの安全な菌株からアクリルアミド分解性菌を効率よく得ることができる。さらに本発明のスクリーニングは上記培地にて候補微生物を培養し、その増殖・成長を観察するという極めて簡単な操作にて行うことができ、汎用性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、１の態様において、制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法の第１工程は、制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養する工程である。使用する培地はいかなる種類の培地であってもよく、天然培地、人工培地、それらの混合培地であってもよい。当業者は、スクリーニングすべき微生物の種類やその他の要因に応じて、培地の種類や成分、ならびに培養条件（温度、培養時間、通気量など）を選択することができる。ここに、微生物とは、細菌、酵母、糸状菌、放線菌を包含するものとする。食品の製造に用いられる細菌としては乳酸菌や納豆菌などが例示される。また、食品の製造に用いられる糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、例えば麹菌、かつおぶし製造菌など、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属糸状菌、例えばチーズ製造菌など、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属糸状菌およびムコール（Ｍｕｃｏｒ）属糸状菌、例えば東南アジア諸国における麹の製造、老酒の製造用の菌などが挙げられる。本明細書において、微生物と菌は同義である。本発明のスクリーニング方法に使用する培地の形状も特に制限はなく、液体培地であっても、固体培地（例えば、寒天平板培地、寒天斜面培地）であってもよい。なお、本発明においては、培地中の寒天は炭素源として扱わない。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法において、使用する培地中の炭素源濃度および／または窒素源濃度を制限濃度とする。その理由は、培地中の炭素源濃度および／または窒素源濃度が高すぎると、微生物がアクリルアミドを利用しなくなるからである。本明細書において、炭素源および窒素源の制限濃度とは、微生物に余分な栄養を与えずにアクリルアミドを利用させ、観察可能な程度に生育あるいは増殖させることのできる炭素源および窒素源の濃度をいう。本発明のスクリーニング方法に使用する培地中の炭素源の制限濃度は、微生物の種類、培養条件、およびその他の要因にもよるが、通常は例えば約０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、好ましくは約０．０３％（ｗ／ｖ）以上である。例えば、培地中の炭素源の制限濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）であり、最も好ましくは、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）である。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法に使用する培地中のアクリルアミド以外の窒素源の制限濃度は、微生物の種類、培養条件、およびその他の要因にもよるが、通常は例えば０％〜約１％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０％〜約０．５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０％〜０．３％（ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、培地中のアクリルアミド以外の炭素源の濃度を０％とすることによりアクリルアミドを唯一の窒素源として培養する。そうすることにより、微生物の生育・増殖の差異を明確化することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法に使用する培地中のアクリルアミド濃度は、微生物の種類、培養条件、およびその他の要因にもよるが、通常は例えば約０．００４〜約０．２％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約０．０２〜約０．２％（ｗ／ｖ）である。培地中のアクリルアミドが低すぎると、アクリルアミド分解能が生育あるいは増殖の差に反映されにくくなり、スクリーニングが困難となる。また、培地中のアクリルアミド濃度が高すぎると、毒性の影響により生育あるいは増殖が妨げられるので、やはりスクリーニングが困難となる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法において使用する培地は、最小培地をベースにしたものが好ましい。天然培地中には多種多様な炭素源、窒素源となる物質が含まれており、微生物がアクリルアミドよりもこれらの成分を利用してしまい、アクリルアミド利用による生育あるいは増殖の差異が出にくいからである。また、天然培地においては、炭素源、窒素源の濃度をコントロールすることが困難である。したがって、本発明のスクリーニング方法には、炭素源、窒素源の種類が明確で、それらの濃度をコントロールしやすい人工培地をベースにした培地を用いることが好ましく、最小培地をベースにした培地を用いることがさらに好ましい。本発明のスクリーニング方法に使用する最も好ましい培地は、上記範囲の制限濃度の炭素源および／または窒素源を含む最小培地に、上記濃度範囲のアクリルアミドを添加した培地である。このような培地を用いることにより、微生物がアクリルアミドを利用し、その利用の程度による生育や増殖の差異を観察しやすくなる。なお、本明細書において、最小培地をベースにした培地とは、最小培地にアクリルアミドを添加した培地をいい、その場合、最小培地の成分の種類、濃度は適宜変更されていてもよい。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法において、上記範囲の制限濃度の炭素源を含むが、上記濃度範囲のアクリルアミド以外の窒素源を含まない最小培地を用いることが最も好ましい。かかる培地を用いると、アクリルアミドの分解能の差異が微生物の生育・増殖の差異に反映されやすくなるので、スクリーニングの結果がより明確となる。
【００２１】
上述のごとく、本発明のスクリーニング方法にて試験される微生物に種類は特に限定されないが、細菌、酵母、糸状菌、放線菌には各々に適した最小培地が知られているので、適宜選択して用いることができる。例えば、糸状菌をスクリーニングする場合には、最小培地としてツァペック・ドックス最小培地が有名であり、これをベースにした培地を本発明のスクリーニング方法に使用することが好ましい。しかし、他の最小培地を用いてもかまわない。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法の第２工程は、上記培地にて微生物を培養し、その生育あるいは増殖を調べる工程である。本発明のスクリーニング方法において、微生物の生育あるいは増殖は、その微生物のアクリルアミド分解能を反映する。したがって、本発明の方法においてよく生育あるいは増殖する微生物は、アクリルアミド分解能が高いものとしてスクリーニングすることができる。このように、本発明の方法は、微生物の生育あるいは増殖を調べるだけで、アクリルアミド分解能が高い微生物をスクリーニングできる、極めて簡便な方法である。
【００２３】
微生物の生育あるいは増殖を調べる手段・方法は公知であり、微生物の種類、培地の種類、培養条件等に応じて適宜選択することができる。例えば、微生物が細菌であり、液体培地を用いる場合には、培地の濁度を測定することにより、微生物の生育あるいは増殖を調べることができる。例えば、微生物が糸状菌であり、液体培地を用いる場合には、培地中の菌体量を肉眼で観察することができる。また例えば、寒天培地を用いる場合には、培地上の微生物コロニーの大きさを肉眼で調べることもできる。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、本発明のスクリーニング方法に用いられる培地を提供する。かかる培地は上で説明したものであるが、上記範囲の制限濃度の炭素源、窒素源を含む最小培地をベースにしたものであって、上記濃度範囲のアクリルアミドを含有するものが好ましい。スクリーニングすべき微生物が糸状菌の場合には、上記範囲の制限濃度の炭素源、窒素源を含む最小培地をベースにしたものであって、上記濃度範囲のアクリルアミドを含有するツァペック・ドックス最小培地が好適である。
【００２５】
本発明は、さらなる態様において、本発明のスクリーニング方法に用いられる培地またはその成分を必須として含む、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング用キットを提供する。本発明の該キットは、培地の調製に必要な他の成分や器具類を含んでいてもよく、あるいは、例えば、微生物の生育・増殖を判定するための器具類を含んでいてもよい。通常、キットには取扱説明書が添付される。
【００２６】
本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明のスクリーニング方法あるいはキットを用いることにより得られたアクリルアミド分解性菌を提供する。よく生育あるいは増殖した微生物を選択することにより、アクリルアミド高分解性菌を得ることができる。例えば、食品製造に使用される菌株から本発明の方法あるいはキットを用いてスクリーニングされたアクリルアミド分解性菌は、食品のアクリルアミド分解・除去に使用することができる。また、本発明のスクリーニング方法あるいはキットを用いることにより得られたアクリルアミド分解性菌からアクリルアミド分解活性を有するアミダーゼを得て、これを使用してもよい。
【００２７】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２８】
使用菌株のアクリルアミド分解能を測定した。
【００２９】
（１）使用菌株
麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）６株（ＡＯ−Ａ、ＡＯ−Ｂ、ＡＯ−Ｃ、ＡＯ−Ｄ、ＡＯ−Ｅ、ＡＯ−Ｆ）をポテトデキストロース寒天培地（以下、ＰＤＢ培地と略す）で、３０℃、７日間培養し、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ １％（ｖ／ｖ）を含む無菌水を添加して分生子を懸濁した後、分生子以外の菌糸などを除去するために更に無菌水を加えて撹拌後、遠心分離を行った。同様の操作を3回繰り返し、分生子懸濁液とした。この分生子懸濁液の分生子数を血球計算盤によって計数した。
【００３０】
（２）培地
ツァペック・ドックス最小培地（炭素源：ショ糖３％（ｗ／ｖ）、窒素源：硝酸ナトリウム０．３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％（ｗ／ｖ）、塩化カリウム０．０５％（ｗ／ｖ）、硫酸鉄・７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．０１％（ｗ／ｖ）、以下、ＣＤ培地と略す）にアクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
【００３１】
（３）培養条件、測定及び観察
１５０ｍｌバッフル付きフラスコに各培地３０ｍｌを入れ、初発分生子濃度が１．０×１０６／ｍｌになるよう分生子懸濁液を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養した。７２時間後に生育状況を肉眼で観察した。同時に培地１．５ｍｌを採取し、アクリルアミド含量を測定した。
【００３２】
（４）アクリルアミド分析方法
採取した培地を０．４５μｍメンブレンフィルターでろ過し、高速液体クロマトグラフィーを用いてアクリルアミド含量を測定した。移動層は０．１％（ｗ／ｖ）リン酸を用いて、高速液体クロマトグラフィーは島津製作所ＣＬＡＳＳ−ＶＰ、カラムは資生堂製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８ ｔｙｐｅＳＧ１２０、５μｍ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、検出器はＵＶ２１０ｎｍである。
【表１】
【００３３】
培地中のアクリルアミド濃度の減少がみとめられた。しかし、生育状況は全て良好であり、差はみられなかった。
これらの菌株を以下の実験に使用した。
【実施例２】
【００３４】
培地中の炭素源及び窒素源の有無による生育状況を検証した。
【００３５】
（１）使用菌株
麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）２株 ＡＯ−Ａ、ＡＯ−ＢをＰＤＢ培地で、３０℃、７日間培養し、実施例１と同様に操作し、分生子懸濁液を調製後、分生子数を計数した。
【００３６】
（２）培地
ｉ）アクリルアミド添加ＣＤ培地
ＣＤ培地にアクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
ｉｉ）アクリルアミド添加炭素源なしＣＤ培地
ＣＤ培地からショ糖を除き、アクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
ｉｉｉ）アクリルアミド添加窒素源無しＣＤ培地
ＣＤ培地から硝酸ナトリウムを除き、アクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
ｉｖ）アクリルアミド添加炭素源なし、窒素源なしＣＤ培地
ＣＤ培地からショ糖及び硝酸ナトリウムを除き、アクリルアミドを０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
【表２−１】
【表２−２】
【００３７】
炭素源を含まない培地では生育しない為、評価には適用できなかった。窒素源を抜き、アクリルアミド濃度を０．０２％〜０．２％（ｗ／ｖ）に調製することで、生育状況に差があり、アクリルアミドの分解能を反映していることを見出した。参考までに、生育状況（◎：良好、○：生育、△：弱い生育、×：生育せず）の典型例を図１に示す。
【実施例３】
【００３８】
窒素源を抜き、更に、炭素源濃度を制限することでアクリルアミド分解能を、生育状況で容易に判別できるか検討した。
【００３９】
（１）使用菌株
麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＡＯ−Ａ、ＡＯ−Ｃ をＰＤＢ培地で、３０℃、７日間培養し、実施例１と同様に操作し、分生子懸濁液を調製後、分生子数を計数した。
【００４０】
（２）培地
ＣＤ培地から窒素源である硝酸ナトリウムを除き、炭素源であるショ糖を５濃度（０．０００３％、０．００３％、０．０３％、０．３％、３％（ｗ／ｖ）になるように調製後、次に、各々にアクリルアミドを５濃度（０．００４％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％（ｗ／ｖ）になるよう添加した培地を作製した。
【表３−１】
【表３−２】
【００４１】
炭素源０．００３％（ｗ／ｖ）以下ではアクリルアミド分解能と生育状況の結果が一致しないため、０．０３％（ｗ／ｖ）以上の炭素源が必要であった。０．０３％（ｗ／ｖ）以上の炭素源濃度の培地においては、アクリルアミド分解能を、生育状況で容易に判別できることがわかった。
【実施例４】
【００４２】
実施例３の条件で麹菌以外の糸状菌を対象に生育状況でのアクリルアミド分解能を評価した。
【００４３】
（１）使用株
糸状菌８種１０株：麹菌ＡＯ−Ａ、ＡＯ−Ｃ、ＡＯ−Ｄ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アクチノムコアー・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｒ ｅｌｅｇａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍｅｒ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｎ）、各々の菌株をＰＤＢ培地で、３０℃、７日間培養し、実施例１と同様に操作し、分生子懸濁液を調製後、分生子数を計数した。
【００４４】
（２）培地
硝酸ナトリウムを含まないＣＤ培地にアクリルアミド０．０２％（ｗ／ｖ）を添加して作製した。
【００４５】
（３）培養条件、測定及び観察
上記培地３０ｍｌを１５０ｍｌバッフル付きフラスコに入れ、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養し、７２時間後に生育状況を肉眼で観察した。同時に、培地１．５ｍｌを採取し、培地中のアクリルアミド含量を測定した。
【表４】
【００４６】
上記結果から生育状況を観察するだけでアクリルアミド分解能を有する糸状菌を容易に選択できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、食品製造の分野、化学工業の分野などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本明細書の実施例における菌の生育状況（◎：良好、○：生育、△：弱い生育、×：生育せず）の典型例を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
培地中のアクリルアミド濃度が０．００４〜０．２％（ｗ／ｖ）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地中のアクリルアミド濃度が０．０２〜０．２％（ｗ／ｖ）である請求項２記載の方法。
【請求項４】
培地中の炭素源濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）以上である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
培地中の炭素源濃度が０．０３％〜３％（ｗ／ｖ）である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
培地中のアクリルアミド以外の窒素源濃度が０％〜０．３％（ｗ／ｖ）である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
培地がアクリルアミド以外の窒素源を含有しないものである請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
培地が最小培地をベースにしたものである請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
微生物が糸状菌である請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
糸状菌がアスペルギルス属菌である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アスペルギルス属菌が麹菌である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
培地がツァペック・ドックス最小培地をベースにしたものである請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法に使用される培地。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法に使用される培地またはその成分を必須として含む、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法または請求項１４記載のキットにより得られるアクリルアミド分解性菌。
【請求項１】
制限濃度の炭素源および／または窒素源、ならびにアクリルアミドを含有する培地にて微生物を培養し、その生育状況を調べることを特徴とする、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
培地中のアクリルアミド濃度が０．００４〜０．２％（ｗ／ｖ）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地中のアクリルアミド濃度が０．０２〜０．２％（ｗ／ｖ）である請求項２記載の方法。
【請求項４】
培地中の炭素源濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）以上である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
培地中の炭素源濃度が０．０３％〜３％（ｗ／ｖ）である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
培地中のアクリルアミド以外の窒素源濃度が０％〜０．３％（ｗ／ｖ）である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
培地がアクリルアミド以外の窒素源を含有しないものである請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
培地が最小培地をベースにしたものである請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
微生物が糸状菌である請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
糸状菌がアスペルギルス属菌である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アスペルギルス属菌が麹菌である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
培地がツァペック・ドックス最小培地をベースにしたものである請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法に使用される培地。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法に使用される培地またはその成分を必須として含む、アクリルアミド分解性菌のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法または請求項１４記載のキットにより得られるアクリルアミド分解性菌。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−３５４４９（Ｐ２０１０−３５４４９Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９９６４６（Ｐ２００８−１９９６４６）
【出願日】平成２０年８月１日（２００８．８．１）
【出願人】（５９３１６５４８７）学校法人金沢工業大学 (202)
【出願人】（３０００２２３９７）三興商事株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１日（２００８．８．１）
【出願人】（５９３１６５４８７）学校法人金沢工業大学 (202)
【出願人】（３０００２２３９７）三興商事株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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