アデノウイルスベクターおよびその作製方法
【課題】本発明は、比較的短い塩基長の外来塩基配列であっても、シャトルベクターを介することなく簡便に高効率に発現可能なアデノウイルスベクター（Ａｄベクター）を提供することを課題とする。さらには、該Ａｄベクターの作製方法に関する。
【解決手段】少なくともＥ１領域を欠損するＥ１領域欠損型Ａｄのゲノムや、Ｅ１タンパク質の一部の機能が欠失していたり、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でだけ起こるような制限増殖型Ａｄのゲノムを含み、当該ＡｄゲノムにプロモーターならびにＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなるＡｄベクターによる。
【解決手段】少なくともＥ１領域を欠損するＥ１領域欠損型Ａｄのゲノムや、Ｅ１タンパク質の一部の機能が欠失していたり、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でだけ起こるような制限増殖型Ａｄのゲノムを含み、当該ＡｄゲノムにプロモーターならびにＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなるＡｄベクターによる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来塩基配列を発現させるために使用されるアデノウイルスベクターおよびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の遺伝子治療や遺伝子導入による実験系は、多くの場合、目的（治療用）遺伝子の過剰発現に基づいたものであった。一方近年、２１−２９塩基長の二本鎖ＲＮＡ（small interfering RNA：ｓｉＲＮＡ）によって配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉（RNA interferance：ＲＮＡｉ）が注目されており、目的遺伝子の発現を抑制することによって、治療や遺伝子の機能解析を行う研究が盛んに行われている。ＲＮＡｉによる標的遺伝子の特異的な発現抑制は、合成ｓｉＲＮＡを用いる方法と、ｓｉＲＮＡを発現するベクターに大別されるが、これら合成ｓｉＲＮＡやｓｉＲＮＡを発現するベクターをいかに目的の細胞に導入するかというデリバリーの問題が、ＲＮＡｉを利用した研究を行う上で大きな課題のひとつとなっている。
【０００３】
合成ｓｉＲＮＡのデリバリーは、リポソームなどのトランスフェクション試薬を用いる方法が一般的である。一方、Ｕ６やＨ１、ｔＲＮＡなどのＲＮＡポリメラーゼIII系へのプロモーターにｓｉＲＮＡや、ヘアピン型ＲＮＡ（short hairpin RNA:ｓｈＲＮＡ）を発現するベクターをプラスミドベクターやウイルスベクターに搭載して利用することができる。ｓｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡからプロセシングにより産生されるものであるが、ｓｉＲＮＡを広義に解釈して、ｓｉＲＮＡにはｓｈＲＮＡの意味も含まれるものと考える場合もある。非ウイルスベクターであるプラスミドベクターを用いて遺伝子導入する場合は、遺伝子導入効率が低いため、遺伝子導入された細胞を、薬剤耐性遺伝子やグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を用いて選択しなければ、細胞集団全体としての遺伝子発現抑制効果は観察されないことが多い。一方、ウイルスベクターを用いた場合は、多くの細胞種で１００％に近い遺伝子導入効率が期待できるため、遺伝子導入細胞を選択する必要がなく、効率よく遺伝子の機能阻害研究を行うことができる。
【０００４】
ウイルスベクターを用いたＲＮＡｉ研究には、レンチウイルス、レトロウイルスやアデノウイルス等のベクターが汎用されている。レトロ・レンチウイルスベクターは、１〜数コピーの遺伝子が標的細胞の染色体に組み込まれるため安定細胞株の作製に適している。この場合、コピー数が少ないので、ｓｉＲＮＡのターゲット配列の検索の際には、”良く効く”配列を検索する必要がある。一方、アデノウイルスベクター（以下、単に「Ａｄベクター」という。）は１〜数十コピーの遺伝子を染色体外ＤＮＡとして細胞核内に導入でき、一過性の遺伝子発現を示す。また、Ａｄベクターはレトロ・レンチウイルスベクターに比べて、高い力価のウイルス液の調製が容易であり、動物個体への遺伝子導入に適している。これらのウイルスベクターは、感染域も異なっており、研究目的や用いる細胞に応じて、適したベクター系を使用することができる。
【０００５】
in vitroへの適用や高効率・高力価のウイルス溶液が容易に得られる点から、Ａｄベクターは、レトロ・レンチウイルスベクターに比べより広く用いられ、遺伝子機能解析のための基盤技術として、より多くの可能性を秘めていると考えられる。
【０００６】
Ａｄベクターについては、各種研究がなされており、例えば細胞に導入容易とするために、トリペプチドであるＲＧＤ配列をコードするＤＮＡを導入したベクターなどが開発されている（特許文献１、２）。ｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターの更なる普及のためには、簡便に高効率にベクターを作製する技術が必要となる。本発明者は、従来のＡｄベクター作製法を格段に簡略化し、簡単なin vitroライゲーションに基づいたプラスミド構築を利用してＡｄベクターを作製する技術を開発済みであり（特許文献３）、全世界で広く用いられている。例えば、目的の外来塩基配列を含むシャトルベクターを予め調製し、シャトルベクター上で得られた外来塩基配列の発現カセットを、Ａｄベクターに組み込ませて目的の外来塩基配列を発現させる方法なども報告されている（非特許文献１、２）。
【０００７】
ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡなどの発現ベクターについては、既に特許が成立し（特許文献４）、ベクター構築受託サービスなども既に実用化されている。しかしながら、Ａｄを発現ベクターとしてｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡなどの短い塩基長の外来塩基配列を発現させるためには、上述のようにシャトルベクターを介さなければならず、煩雑であった。
【特許文献１】特許第３６３５４６２号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０５６６号公開公報
【特許文献３】米国特許第６３０３３６２号公報
【特許文献４】特許第３６４２５７３号公報
【非特許文献１】Hum Gene Ther 9 (1998) 2577-83
【非特許文献２】Hum Gene Ther 10 (1999) 2013-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、比較的短い塩基長の外来塩基配列であっても、シャトルベクターを介することなく簡便に高効率に発現可能なＡｄベクターを提供することを課題とする。さらには、該Ａｄベクターの作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｅ１領域を欠損するＥ１領域欠損型Ａｄのゲノムや、Ｅ１タンパク質の一部の機能が欠失していたり、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でだけ起こるような、特定の細胞種でのみ複製できるようにした制限増殖型Ａｄのゲノムを含み、当該ＡｄゲノムにプロモーターならびにＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなるＡｄベクターを構築することにより、上記課題を達成しうることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．Ａｄのゲノムを含み、プロモーターおよびＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなることを特徴とするＡｄベクタープラスミド。
２．Ａｄに対してユニークな制限酵素の認識配列の少なくとも１が、プロモーター領域に配置されていることを特徴とする前項１に記載のＡｄベクタープラスミド。
３．Ａｄのゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄのゲノム、または制限増殖型Ａｄのゲノムである請求項１または２に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
４．プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである前項１〜３のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミド。
５．制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である前項１〜４のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミド。
６．以下の工程を含むアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法：
１）Ａｄのゲノムを準備する工程；
２）上記Ａｄのゲノムに、プロモーターを導入する工程；
３）上記Ａｄのゲノムに導入されたプロモーター領域に、Ａｄおよび該導入されたプロモーターに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数導入する工程。
７．Ａｄのゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄのゲノム、または制限増殖型Ａｄのゲノムである、請求項６に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
８．プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである前項６または７に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
９．制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である前項６〜８のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１０．前項６〜９のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法において、さらに外来塩基配列をライゲーションする工程を含むＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１１．外来塩基配列の塩基長が、２０〜８０ｂｐである前項１０に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１２．前記外来塩基配列が、ｓｉＲＮＡをコードする塩基配列を含む前項１０または１１に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１３．前項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したＡｄベクタープラスミドを、細胞にトランスフェクションすることによるＡｄベクターの作製方法。
１４．前項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したＡｄベクタープラスミドを制限酵素で切断し、直鎖状としたものを細胞にトランスフェクションすることによるＡｄベクターの作製方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＡｄベクタープラスミドにより、比較的短い塩基長の外来塩基配列、例えば目的の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列をコードする塩基配列、例えばｓｈＲＮＡをコードする塩基配列からなる合成オリゴＤＮＡを直接Ａｄベクタープラスミドに導入することが可能となった。これにより、シャトルベクターからＡｄベクタープラスミドへの組み込み作業の必要がなくなり、簡便となった。外来塩基配列がライゲーションされたＡｄベクタープラスミドを、例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションすることにより、容易に比較的短い塩基長の外来塩基配列の発現が達成可能なＡｄベクターが構築される。また、本発明のＡｄベクターにより産生したｓｈＲＮＡから得られるｓｉＲＮＡは、従来のシャトルベクターを介したＡｄベクターで産生したものと同様のＲＮＡｉ効果が確認された。
【００１２】
本発明のＡｄベクタープラスミドの作製方法を利用することにより、所望の外来塩基配列をＡｄベクタープラスミドにライゲーションするだけで外来塩基配列発現用Ａｄベクタープラスミドの作製が可能となる。また作製されたＡｄベクタープラスミドを例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションすることで、Ａｄベクターを極めて簡便に作製することができる。また、所望の外来塩基配列がｓｉＲＮＡの場合には、ｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターライブラリーの作製も容易になるため、創薬ターゲット遺伝子検索のための基盤技術の開発に応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＡｄベクタープラスミドは、Ａｄゲノムを含み、当該ＡｄゲノムにプロモーターおよびＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を少なくとも１種類備えてなることを特徴とする。本発明のＡｄベクターは、まず組換操作によってＡｄベクタープラスミドが作製され、Ａｄベクタープラスミドを細胞にトランスフェクションすることによって作製される。
【００１４】
本発明においてＡｄとは、アデノウイルスをさし、本発明において使用可能なＡｄは、in vivoまたはin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とするＡｄ２型、５型、１１型、３５型、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄおよびトリＡｄなどが挙げられる。
【００１５】
本発明においてＡｄのゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたＡｄのゲノム、具体的にはＥ１領域欠損型Ａｄや、制限増殖型Ａｄのゲノムなどが好適であり、特に好適にはＥ１領域欠損型のＡｄゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばＥ１領域欠損型Ａｄについては２９３細胞で、制限増殖型Ａｄについては２９３細胞や癌細胞でのみ増殖できることをいう。
【００１６】
Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノムとは、Ｅ１領域を欠損するＡｄゲノムをいい、制限酵素によりＥ１領域を切断し、欠損させたＡｄゲノムをいう。Ｅ１領域欠損とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現させないようにすることであり、Ｅ１タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、ＡｄにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外では増殖することができない。
【００１７】
５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）の場合においてＥ１領域とは、具体的には３４２〜３２５３番目に相当する。したがって、本発明のＡｄベクタープラスミドは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しないのであれば、３４２〜３２５３番目の領域の一部を有するものであってもよい。
【００１８】
本発明のＡｄベクタープラスミドは、Ｅ１領域の他に、例えばＥ３領域を欠損させた５型Ａｄゲノムの一部または全部であっても良い。５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のＥ３領域とは、２８１３３〜３０８１８番目または２７８６５〜３０９９５番目に相当する部位をいう。
【００１９】
制限増殖型Ａｄは、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるＡｄであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。
【００２０】
本発明のＡｄベクタープラスミドに備えられるプロモーターは、特に制限されない。例えば、ポリメラーゼII系（pol II系）またはポリメラーゼIII系（pol III系）のいかなるプロモーターであっても良い。具体的にはpol III系のプロモーターとしてＵ６プロモーターやＨ１プロモーターを例示することでき、pol II系のプロモーターとしてＣＭＶプロモーターを例示することできる。
【００２１】
本発明において、Ａｄゲノムに対するプロモーターの導入位置は特に限定されない。プロモーターの導入位置は、アデノウイルスの複製に影響を及ぼさない部位であればどこでもよい。例えば、Ｅ１欠損領域、Ｅ３領域やＥ４領域と３’ＩＴＲ（internal terminal repeat）の間の領域であってもよく、好適には、Ｅ１欠損領域が挙げられる。
【００２２】
本発明におけるＡｄに対してユニークな制限酵素とは、ＡｄゲノムＤＮＡに本来存在しない制限酵素を意味する。同様に、導入されたプロモーターに対してユニークな制限酵素とは、該導入されたプロモーターＤＮＡに本来存在しない制限酵素を意味する。このような制限酵素として、例えばＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩが挙げられる。本発明のＡｄベクタープラスミドに備えられる１または複数の制限酵素の認識部位は、上記に挙げられた制限酵素から１または複数、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜４、更に好ましくは１〜２の制限酵素を認識する配列であれば良い。より好適にはＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩおよびＣｓｐ４５Ｉから選択される１または複数の制限酵素を認識する配列を本発明のＡｄベクタープラスミドに備えることができる。
【００２３】
制限酵素認識配列の少なくとも１は、プロモーター領域の転写開始点付近に配置することが好ましく、例えば転写開始点から塩基数±２０、好適には±１０以内の領域に配置するのが好ましく、制限酵素認識配列中に転写開始点を含むように配置するのがより好ましい。
【００２４】
本発明のＡｄベクタープラスミドの作製工程において、１または複数の制限酵素の認識配列を、各々制限酵素で消化し、外来塩基配列をシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。導入する外来塩基配列の塩基長は、特に限定されないが、好ましくは１０ｋｂ以下であり、ライゲーションが従来困難であった比較的短い塩基長、例えば１５〜１００ｂｐ、好ましくは２０〜８０ｂｐの外来塩基配列をインビトロライゲーションにより導入することができる。導入する外来塩基配列は、特に限定されないが、例えば、タンパク質或いはペプチドをコードする塩基配列、所定の遺伝子の制御領域に存在する塩基配列、所定のタンパク質が結合できる塩基配列等、如何なる塩基配列であってもよい。特に、所定の遺伝子の制御に関連する塩基配列、例えば目的の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列若しくはｓｈＲＮＡをコードする塩基配列が好適である。このような塩基配列を有するオリゴＤＮＡを合成したものを使用することができる。
【００２５】
さらに、例えばＡｄゲノムのＥ３領域の欠損部位に、発現を制御するプロモーター配列、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子およびポリＡ配列をこの順で有する塩基配列を導入することで、ルシフェラーゼ活性を測定して導入効率を評価することができる。また、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に代えて、ＧＦＰをコードする遺伝子を用いた場合には、導入細胞におけるグリーン蛍光を測定することで、導入効率を評価することもできる。
【００２６】
上記により得られたＡｄベクタープラスミドは、上記プラスミドゲノム両末端を、制限酵素を用いて線状にし、これを例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションするだけで、外来塩基配列、例えばｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターの作製が可能となった。プラスミドゲノム両末端に存在する制限酵素の認識配列として、Ａｄに対してユニークな制限酵素であって、上記Ｅ１領域などのクローニングに使用していない制限酵素の認識配列を導入することができる。そのような条件において、例えばＰａｃＩ、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択されるいずれかの制限酵素の認識配列を導入することができる。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）Ａｄベクタープラスミドの作製
１．ｐＡｄＨＭ４の作製
Ｅ１領域およびＥ３領域の欠損型ＡｄベクターゲノムであるｐＡｄＨＭ４は、非特許文献１に記載の方法により作製した。
【００２９】
２．ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター配列の導入
次に、ｐＡｄＨＭ４のＥ１領域の欠損部位にｈＵ６プロモーター配列を導入し、ＡｄベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）を構築した（図１ａ）。
【００３０】
ｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを、直接的にｈＵ６プロモーター配列の下流領域に導入するために、ｈＵ６プロモーターの下流領域には、ユニークな制限酵素認識部位（例えばＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ）および転写開始部位が必要である（図１、図２）。このような、制限酵素認識部位を導入した変形ｈＵ６プロモーターとして、以下に示すｈＵ６（１）、ｈＵ６（２）およびｈＵ６（３）プロモーターを構築した。
【００３１】
ｈＵ６（１）およびｈＵ６（２）プロモーター配列は、ＣｌａＩ認識部位およびＸｂａＩ認識部位を含み、ｈＵ６（３）プロモーター配列は、ＳｗａＩ認識部位およびＸｂａＩ認識部位を含む。ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ、またはＸｂａＩで消化されたｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）のベクタープラスミドは、必要な配列を導入するために−２０℃で保存することができ、次回以降再度消化する必要がなく、便利である。
ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ、またはＸｂａＩで消化されたｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）等は、通常の方法により、大腸菌に形質転換した。
【００３２】
i)各種プロモーター配列の増幅
ヒトＵ６プロモーター配列は、ヒトｃＤＮＡライブラリー(Clontech社）を用いて以下のプライマーで増幅した。
hU6-S1：5'- aaggtcgggcaggaagagggccta-3'（配列番号１）
hU6-AS1：5'- ggtctagaagtatcgatgtttcgtcctttccacaagatata-3'（配列番号２）
制限酵素ＸｂａＩおよびＣｌａＩ認識部位は各々下線を施した。
hU6-AS2：5'- ggtctagaagtatcgattttcgtcctttccacaagatatat-3'（配列番号３）
制限酵素ＸｂａＩおよびＣｌａＩ認識部位は各々下線を施した。
hU6-AS3：5'- ggtctagaagtatttaaattcgtcctttccacaagatatataa-3'（配列番号４）
制限酵素ＸｂａＩおよびＳｗａＩ認識部位は各々下線を施した。
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００３３】
ｈＵ６（１）、ｈＵ６（２）およびｈＵ６（３）プロモーター配列は、各々hU6-S1/hU6-AS1、hU6-S1/hU6-AS2またはhU6-S1/hU6-AS3のプライマーセットを用いて増幅した（図２）。これらのプロモーター配列を、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ認識部位（非特許文献１、２）を用いてインビトロライゲーションによりｐＡｄＨＭ４（非特許文献２）の誘導体であるＥ１領域欠損型のベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４．１に導入した。Ａｄゲノムの外側にはＸｂａＩ認識部位はない。
【００３４】
３．ｓｉＲＮＡ発現用組換Ａｄベクタープラスミドの構築（ルシフェラーゼ）
ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）、またはＳｗａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に組込み、ルシフェラーゼを標的遺伝子とする場合のｓｉＲＮＡを発現するための組換Ａｄベクタープラスミドを作製した。各組換Ａｄベクタープラスミドは、各々、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−Ｌｕ、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−Ｌｕとした。
【００３５】
ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド
(a) 5'-cgacgctgagtacttcgaaatttcaagagaatttcgaagtactcagcgttttttggaaat-3'
（配列番号５）
(b) 5'-ctagatttccaaaaaacgctgagtacttcgaaattctcttgaaatttcgaagtactcagcgt-3'
（配列番号６）
(c) 5'-ccacgctgagtacttcgaaatttcaagagaatttcgaagtactcagcgttttttggaaat-3'
（配列番号７）
(d) 5'-ctagatttccaaaaaacgctgagtacttcgaaattctctcttgaaatttcgaagtactcagcgtgg-3'
（配列番号８）
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００３６】
配列番号５および６に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−Ｌｕが生じる。また、配列番号７と８に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−Ｌｕが生じる。
【００３７】
４．ｓｉＲＮＡ発現用組換Ａｄベクタープラスミドの構築（ｐ５３）
ｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド(Brummelkamp et al., Science, 296, 550-3, 2002)を合成し、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）またはＳｗａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に組込み、ｐ５３を標的遺伝子とする場合のｓｉＲＮＡを発現するための組換Ａｄベクタープラスミドを作製した。各組換ベクタープラスミドは、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）−ｐ５３，ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−ｐ５３，ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−ｐ５３）とした。
【００３８】
ｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド
(e) 5'-cgactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaat-3'
（配列番号９）
(f) 5'-ctagatttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagt-3'
（配列番号１０）
(g) 5'-cggactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaat-3'
（配列番号１１）
(h) 5'-ctagatttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagtc-3'
（配列番号１２）
(i) 5'-ccgactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaat-3'
（配列番号１３）
(j) 5'-ctagatttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagtcgg-3'
（配列番号１４）
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００３９】
配列番号９および１０に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）−ｐ５３が生じる。また、配列番号１１と１２に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−ｐ５３が生じる。同様に、配列番号１３と１４に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−ｐ５３が生じる。
【００４０】
ｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド配列が組み込まれた各組換ベクタープラスミドは、ＸｂａＩ認識部位では再度消化することができるが、ＣｌａＩまたはＳｗａＩ認識部位では消化されないようにデザインされている。
【００４１】
３．および４．により、ルシフェラーゼおよびｐ５３に対するｓｉＲＮＡの発現ベクタープラスミドを容易に作製した。９０％以上のＡｄベクタープラスミドには、正確にｓｉＲＮＡをコードする配列が導入されていた。
【００４２】
（実施例２）Ａｄベクターの構築
実施例１により得られたＡｄベクタープラスミドを、制限酵素により消化し、直鎖ベクタープラスミドとしたものを２９３細胞にトランスフェクションすることにより、Ａｄベクターを作製した。
具体的には、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−Ｌｕ、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−Ｌｕ、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ｐ５３、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）−ｐ５３、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−ｐ５３またはｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−ｐ５３）をＰａｃＩで消化し、２９３細胞にトランスフェクションすることにより、Ａｄ−ｈＵ６（２）−Ｌｕ、Ａｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕ、Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３などの各Ａｄベクターを作製した。
２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培養液を用いて１０日間培養し、各々直鎖ベクタープラスミドをトランスフェクションし、Ａｄベクターを作製した。作製したＡｄベクターをＣｓＣｌ２勾配遠心分離により精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(pH 7.5)，１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０％グリセロールを含む溶液で透析し、−７０℃で保存した。
【００４３】
（比較例１）従来法によるＡｄベクタープラスミドの構築
piGene ｈＵ６(iGENE Therapeutics, Tsukuba, Japan)から入手したインタクトｈＵ６プロモーター配列をシャトルベクタープラスミドｐＨＭ５に導入し、ｐＨＭ５−ｈＵ６を作製した。
【００４４】
以下は、ルシフェラーゼまたはｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの配列である。
(k) 5'-caccacgctgagtacttcgaaatttcaagagaatttcgaagtactcagcgtttttt -3'
（配列番号１５）
(l) 5'-tacgaaaaaacgctgagtacttcgaaattctcttgaaatttcgaagtactcagcgt-3'
（配列番号１６）
(m) 5'-caccgactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaa-3'
（配列番号１７）
(n) 5'-gcattttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagtc-3'
（配列番号１８）
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００４５】
配列番号１５と１６に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットで、以下の方法によりｐＨＭ５−ｈＵ６−Ｌｕを作製し、さらにこれをｐＡｄＨＭ４のＥ１領域にＩ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩ部位を用いて導入し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−Ｌｕが生じる。同様に、配列番号１７と１８に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＨＭ５−ｈＵ６−ｐ５３を作製し、さらにこれをｐＡｄＨＭ４のＥ１領域にＩ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩ部位を用いて導入し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ｐ５３が生じる。
【００４６】
使用説明書(iGENE Therapeutics. Inc.)に従い、ｐＨＭ５−ｈＵ６のＢｓｐＭＩ認識部位にルシフェラーゼまたはｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを導入して、ｓｈＲＮＡ発現カセットを作製した。次にｓｈＲＮＡ発現カセットをｐＡｄＨＭ４のＥ１領域にＩ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩ部位を用いて導入し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ＬｕまたはｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ｐ５３を構築した（非特許文献１）。
比較例１により得られたＡｄベクタープラスミドを、制限酵素により消化し、直鎖ベクタープラスミドとしたものを２９３細胞にトランスフェクションすることにより、Ａｄベクターを作製した。
【００４７】
（比較例２）標的配列を含まないＡｄベクターの構築
インタクトなｈＵ６プロモーター配列のみを有し、標的配列を含まないＡｄベクター（Ａｄ−ｈＵ６）も、実施例１および比較例１と同手法にてｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６およびｐＨＭ５−ｈＵ６により構築した。
【００４８】
（実験例１）ウイルスの生物学的タイターと物理化学的タイターの測定
Adeno-X Rapid Titer キット(Clontech, Palo Alto, CA, USA)を用いて生物学的タイター（infectious titer/ml）を、Maizel et al. (Maizel et al., Virology, 36, 115-25, 1968)の光学的手法により、物理化学的タイター（particle titer (PT)/ml）を測定した。生物学的タイターと物理化学的タイターの比は、Ａｄ−ｈＵ６で１：３６、Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕで１：３１、Ａｄ−ｈＵ６（２）−Ｌｕで１：２８、Ａｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕで１：２４、Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３で１：２２、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３で１：２９、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３で１：１２、Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３で１：１５であった。
【００４９】
（実験例２）細胞への形質導入およびルシフェラーゼアッセイ
ネオマイシン耐性遺伝子を有したルシフェラーゼ発現用プラスミドをＡ５４９細胞（肺癌細胞）にトランスフェクションし、安定にルシフェラーゼを発現するＡ５４９−Ｌｕｃ細胞を作製した。Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培養液を用いて培養した。Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞を２×１０５cellsを１２ウェルのディッシュに播種した。
【００５０】
翌日、ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクター、即ちルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡの発現ベクターであるＡｄ−ｈＵ６（２）−ＬｕまたはＡｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕについて、各々３００ＶＰ／cell、１０００ＶＰ／cellまたは３０００ＶＰ／cellをＡ５４９−Ｌｕｃ細胞に１．５時間形質導入した。同様にｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含まないベクター（Ａｄ−ｈＵ６）およびｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクター（Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３）を形質導入し、陰性コントロールとした。
【００５１】
Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞でのルシフェラーゼの産生のために７２時間細胞培養し、ｓｉＲＮＡの各発現ベクターのルシフェラーゼ産生抑制効果を調べた。細胞中のルシフェラーゼの産生は、ルシフェラーゼアッセイシステム （PicaGene LT2.0; 東洋インキ社）を用いて測定した。
【００５２】
その結果、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ＬｕまたはＡｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕを用いた場合は、ルシフェラーゼの発現は抑制された（図３）。
【００５３】
（実験例３）細胞への形質導入およびｐ５３のウエスタンブロッティング
次に、ｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクターを用いて、発現したｐ５３に対するｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果について確認した。ｐ５３遺伝子は癌抑制遺伝子の一種であり、遺伝子産物としてｐ５３タンパク質を発現する。
【００５４】
Ａｄ−ｈＵ６、Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕ、Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３またはＡｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３について、各々３００ＶＰ／cellまたは１０００ＶＰ／cellをＡ５４９細胞（肺癌細胞）に１．５時間形質導入し、３日間培養した。その後、Ａ５４９細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングによりｐ５３の発現を調べた。
【００５５】
細胞抽出液は、プロテアーゼインヒビターのカクテルを含む溶解緩衝液(25 mM Tris [pH 7.5], 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl)（シグマ社）を用いて調製した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準にして Bio-Rad assay kit （Bio-Rad社）を用いて測定した。
タンパク質試料液（１０μｇ）を、12.5% ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いてImmobilon-P膜（Millipore社）により電気泳動した。ブロックエース（大日本製薬）でブロックした後、膜を抗ｐ５３抗体 (Santa Cruz Biotechnology社）とともに加温し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（American Qualex Antibodies社）またはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Oncogene Research Products社）とともに加温したものについて、蛍光測定により計測した。シグナルは、 LAS-3000（富士フィルム社）を用いて計測し、Image Gauge Software（富士フィルム社）を用いて定量した。
【００５６】
その結果を図４に示した。図４において、各レーンに付した試料は、以下に示す各ベクターを形質導入したＡ５４９細胞である。
１：Ａｄ−ｈＵ６
２：Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕ
３：Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３
４：Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３
５：Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３
６：Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３
【００５７】
アクチンは、内在コントロールとした。Ａ５４９細胞（肺癌細胞）でのｐ５３の発現は、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３、Ａｄ−Ｕ６（２）−ｐ５３、Ａｄ−Ｕ６（３）−ｐ５３処理によりＡｄ−ｈＵ６−ｐ５３と同様の効果を示した。Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３またはＡｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３の抑制効果は、Ａｄ−Ｕ６（２）−ｐ５３またはＡｄ−Ｕ６（３）−ｐ５３で処理したときに比べて、１．５から２分の１程度劣った。Ａｄ−ｈＵ６およびＡｄ−ｈＵ６−Ｌｕについては、ｐ５３発現抑制は認められなかった（図４）。これらの結果から、ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ認識部位を転写開始部位に含む新規ｈＵ６プロモーターは、従来法で作製されたｈＵ６プロモーターと同様に効果的であり、本発明の作製方法により作製されたＡｄベクターは、標的遺伝子の発現を抑制しうることが確認された。
【００５８】
従来のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドでは、ＡｐａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ認識部位を有するＵ６またはＨ１プロモーターを用いていた(Brummelkamp et al., Science 296, 550-553, 2002; Lee et al., Nat Biotechnol., 2002; Paddison et al., Genes Dev 16, 2002; Paul et al., Nat Biotechnol., 20, 500-5, 2002; Sui et al., Proc Nstl Acad Sci USA, 99, 5515-20, 2002; Yu et al., Proc Nstl Acad Sci USA, 99, 6047-52, 2002; Boden et al., Nucleic Acids Res., 31, 5033-8, 2003)。
【００５９】
本実施例では、ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ認識部位を転写開始部位に含み、プロモーターの下流領域にＸｂａＩ認識部位を含むＵ６プロモーターを用いた。従来のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドに使用可能なすべてのプロモーターの改変、例えばＵ６またはＨ１プロモーターの改変は、効果的なＲＮＡｉ作用のために有効である。前記の改変は、Ｕ６またはＨ１プロモーターの機能を損なわない。近年、ポリメラーゼII系など多くのタイプのポリメラーゼが、ポリメラーゼIII系と同様にｓｉＲＮＡ発現用に用いられるようになった。本発明は、他のｓｉＲＮＡ発現用プロモーターを用いても使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のＡｄベクター並びにＡｄベクタープラスミドの作製方法を利用することにより、所望の外来塩基配列をＡｄベクタープラスミドにライゲーションするだけで外来塩基配列発現用Ａｄベクタープラスミドの作製が可能となり、例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）等にトランスフェクションすることで、Ａｄベクターを極めて簡便作製ことができる。また、所望の外来塩基配列がｓｉＲＮＡの場合には、ｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターライブラリーの作製も容易になるため、創薬ターゲット遺伝子検索のための基盤技術の開発に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１ａ】ｓｉＲＮＡの発現用のベクタープラスミド、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）を示す図である。ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）は、ＣｌａＩおよびＸｂａＩ認識部位含み、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）はＳｗａＩおよびＸｂａＩ認識部位を含む。
【図１ｂ】Ａｄベクター作製方法を示す図である。
【図２】（Ａ）インタクトなｈＵ６プロモーター配列を示す。（Ｂ）ｈＵ６（１）プロモーター配列を示す。このプロモーターにおいて、ＣｌａＩ認識部位は転写開始位置に備えられる。（Ｃ）ｈＵ６（２）プロモーター配列を示す。このプロモーターにおいて、ＣｌａＩ認識部位は転写開始位置に備えられる。（Ｄ）ｈＵ６（３）プロモーター配列を示す。このプロモーターにおいて、ＳｗａＩ認識部位は転写開始位置に備えられる。
【図３】ｓｉＲＮＡを発現するＡｄベクターを用いたときのＡ５４９−Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼの発現抑制効果を示す図である。
【図４】ｓｉＲＮＡを発現するＡｄベクターを用いたときのＡ５４９細胞におけるｐ５３の発現抑制効果を示す図である。
【符号の説明】
【００６２】
図４における符号は、以下のとおりである。
１：Ａｄ−ｈＵ６
２：Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕ
３：Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３
４：Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３
５：Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３
６：Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来塩基配列を発現させるために使用されるアデノウイルスベクターおよびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の遺伝子治療や遺伝子導入による実験系は、多くの場合、目的（治療用）遺伝子の過剰発現に基づいたものであった。一方近年、２１−２９塩基長の二本鎖ＲＮＡ（small interfering RNA：ｓｉＲＮＡ）によって配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉（RNA interferance：ＲＮＡｉ）が注目されており、目的遺伝子の発現を抑制することによって、治療や遺伝子の機能解析を行う研究が盛んに行われている。ＲＮＡｉによる標的遺伝子の特異的な発現抑制は、合成ｓｉＲＮＡを用いる方法と、ｓｉＲＮＡを発現するベクターに大別されるが、これら合成ｓｉＲＮＡやｓｉＲＮＡを発現するベクターをいかに目的の細胞に導入するかというデリバリーの問題が、ＲＮＡｉを利用した研究を行う上で大きな課題のひとつとなっている。
【０００３】
合成ｓｉＲＮＡのデリバリーは、リポソームなどのトランスフェクション試薬を用いる方法が一般的である。一方、Ｕ６やＨ１、ｔＲＮＡなどのＲＮＡポリメラーゼIII系へのプロモーターにｓｉＲＮＡや、ヘアピン型ＲＮＡ（short hairpin RNA:ｓｈＲＮＡ）を発現するベクターをプラスミドベクターやウイルスベクターに搭載して利用することができる。ｓｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡからプロセシングにより産生されるものであるが、ｓｉＲＮＡを広義に解釈して、ｓｉＲＮＡにはｓｈＲＮＡの意味も含まれるものと考える場合もある。非ウイルスベクターであるプラスミドベクターを用いて遺伝子導入する場合は、遺伝子導入効率が低いため、遺伝子導入された細胞を、薬剤耐性遺伝子やグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を用いて選択しなければ、細胞集団全体としての遺伝子発現抑制効果は観察されないことが多い。一方、ウイルスベクターを用いた場合は、多くの細胞種で１００％に近い遺伝子導入効率が期待できるため、遺伝子導入細胞を選択する必要がなく、効率よく遺伝子の機能阻害研究を行うことができる。
【０００４】
ウイルスベクターを用いたＲＮＡｉ研究には、レンチウイルス、レトロウイルスやアデノウイルス等のベクターが汎用されている。レトロ・レンチウイルスベクターは、１〜数コピーの遺伝子が標的細胞の染色体に組み込まれるため安定細胞株の作製に適している。この場合、コピー数が少ないので、ｓｉＲＮＡのターゲット配列の検索の際には、”良く効く”配列を検索する必要がある。一方、アデノウイルスベクター（以下、単に「Ａｄベクター」という。）は１〜数十コピーの遺伝子を染色体外ＤＮＡとして細胞核内に導入でき、一過性の遺伝子発現を示す。また、Ａｄベクターはレトロ・レンチウイルスベクターに比べて、高い力価のウイルス液の調製が容易であり、動物個体への遺伝子導入に適している。これらのウイルスベクターは、感染域も異なっており、研究目的や用いる細胞に応じて、適したベクター系を使用することができる。
【０００５】
in vitroへの適用や高効率・高力価のウイルス溶液が容易に得られる点から、Ａｄベクターは、レトロ・レンチウイルスベクターに比べより広く用いられ、遺伝子機能解析のための基盤技術として、より多くの可能性を秘めていると考えられる。
【０００６】
Ａｄベクターについては、各種研究がなされており、例えば細胞に導入容易とするために、トリペプチドであるＲＧＤ配列をコードするＤＮＡを導入したベクターなどが開発されている（特許文献１、２）。ｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターの更なる普及のためには、簡便に高効率にベクターを作製する技術が必要となる。本発明者は、従来のＡｄベクター作製法を格段に簡略化し、簡単なin vitroライゲーションに基づいたプラスミド構築を利用してＡｄベクターを作製する技術を開発済みであり（特許文献３）、全世界で広く用いられている。例えば、目的の外来塩基配列を含むシャトルベクターを予め調製し、シャトルベクター上で得られた外来塩基配列の発現カセットを、Ａｄベクターに組み込ませて目的の外来塩基配列を発現させる方法なども報告されている（非特許文献１、２）。
【０００７】
ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡなどの発現ベクターについては、既に特許が成立し（特許文献４）、ベクター構築受託サービスなども既に実用化されている。しかしながら、Ａｄを発現ベクターとしてｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡなどの短い塩基長の外来塩基配列を発現させるためには、上述のようにシャトルベクターを介さなければならず、煩雑であった。
【特許文献１】特許第３６３５４６２号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０５６６号公開公報
【特許文献３】米国特許第６３０３３６２号公報
【特許文献４】特許第３６４２５７３号公報
【非特許文献１】Hum Gene Ther 9 (1998) 2577-83
【非特許文献２】Hum Gene Ther 10 (1999) 2013-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、比較的短い塩基長の外来塩基配列であっても、シャトルベクターを介することなく簡便に高効率に発現可能なＡｄベクターを提供することを課題とする。さらには、該Ａｄベクターの作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｅ１領域を欠損するＥ１領域欠損型Ａｄのゲノムや、Ｅ１タンパク質の一部の機能が欠失していたり、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でだけ起こるような、特定の細胞種でのみ複製できるようにした制限増殖型Ａｄのゲノムを含み、当該ＡｄゲノムにプロモーターならびにＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなるＡｄベクターを構築することにより、上記課題を達成しうることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．Ａｄのゲノムを含み、プロモーターおよびＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなることを特徴とするＡｄベクタープラスミド。
２．Ａｄに対してユニークな制限酵素の認識配列の少なくとも１が、プロモーター領域に配置されていることを特徴とする前項１に記載のＡｄベクタープラスミド。
３．Ａｄのゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄのゲノム、または制限増殖型Ａｄのゲノムである請求項１または２に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
４．プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである前項１〜３のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミド。
５．制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である前項１〜４のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミド。
６．以下の工程を含むアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法：
１）Ａｄのゲノムを準備する工程；
２）上記Ａｄのゲノムに、プロモーターを導入する工程；
３）上記Ａｄのゲノムに導入されたプロモーター領域に、Ａｄおよび該導入されたプロモーターに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数導入する工程。
７．Ａｄのゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄのゲノム、または制限増殖型Ａｄのゲノムである、請求項６に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
８．プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである前項６または７に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
９．制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である前項６〜８のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１０．前項６〜９のいずれか１に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法において、さらに外来塩基配列をライゲーションする工程を含むＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１１．外来塩基配列の塩基長が、２０〜８０ｂｐである前項１０に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１２．前記外来塩基配列が、ｓｉＲＮＡをコードする塩基配列を含む前項１０または１１に記載のＡｄベクタープラスミドの作製方法。
１３．前項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したＡｄベクタープラスミドを、細胞にトランスフェクションすることによるＡｄベクターの作製方法。
１４．前項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したＡｄベクタープラスミドを制限酵素で切断し、直鎖状としたものを細胞にトランスフェクションすることによるＡｄベクターの作製方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＡｄベクタープラスミドにより、比較的短い塩基長の外来塩基配列、例えば目的の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列をコードする塩基配列、例えばｓｈＲＮＡをコードする塩基配列からなる合成オリゴＤＮＡを直接Ａｄベクタープラスミドに導入することが可能となった。これにより、シャトルベクターからＡｄベクタープラスミドへの組み込み作業の必要がなくなり、簡便となった。外来塩基配列がライゲーションされたＡｄベクタープラスミドを、例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションすることにより、容易に比較的短い塩基長の外来塩基配列の発現が達成可能なＡｄベクターが構築される。また、本発明のＡｄベクターにより産生したｓｈＲＮＡから得られるｓｉＲＮＡは、従来のシャトルベクターを介したＡｄベクターで産生したものと同様のＲＮＡｉ効果が確認された。
【００１２】
本発明のＡｄベクタープラスミドの作製方法を利用することにより、所望の外来塩基配列をＡｄベクタープラスミドにライゲーションするだけで外来塩基配列発現用Ａｄベクタープラスミドの作製が可能となる。また作製されたＡｄベクタープラスミドを例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションすることで、Ａｄベクターを極めて簡便に作製することができる。また、所望の外来塩基配列がｓｉＲＮＡの場合には、ｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターライブラリーの作製も容易になるため、創薬ターゲット遺伝子検索のための基盤技術の開発に応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＡｄベクタープラスミドは、Ａｄゲノムを含み、当該ＡｄゲノムにプロモーターおよびＡｄに対してユニークな制限酵素の認識配列を少なくとも１種類備えてなることを特徴とする。本発明のＡｄベクターは、まず組換操作によってＡｄベクタープラスミドが作製され、Ａｄベクタープラスミドを細胞にトランスフェクションすることによって作製される。
【００１４】
本発明においてＡｄとは、アデノウイルスをさし、本発明において使用可能なＡｄは、in vivoまたはin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とするＡｄ２型、５型、１１型、３５型、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄおよびトリＡｄなどが挙げられる。
【００１５】
本発明においてＡｄのゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたＡｄのゲノム、具体的にはＥ１領域欠損型Ａｄや、制限増殖型Ａｄのゲノムなどが好適であり、特に好適にはＥ１領域欠損型のＡｄゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばＥ１領域欠損型Ａｄについては２９３細胞で、制限増殖型Ａｄについては２９３細胞や癌細胞でのみ増殖できることをいう。
【００１６】
Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノムとは、Ｅ１領域を欠損するＡｄゲノムをいい、制限酵素によりＥ１領域を切断し、欠損させたＡｄゲノムをいう。Ｅ１領域欠損とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現させないようにすることであり、Ｅ１タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、ＡｄにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外では増殖することができない。
【００１７】
５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）の場合においてＥ１領域とは、具体的には３４２〜３２５３番目に相当する。したがって、本発明のＡｄベクタープラスミドは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しないのであれば、３４２〜３２５３番目の領域の一部を有するものであってもよい。
【００１８】
本発明のＡｄベクタープラスミドは、Ｅ１領域の他に、例えばＥ３領域を欠損させた５型Ａｄゲノムの一部または全部であっても良い。５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のＥ３領域とは、２８１３３〜３０８１８番目または２７８６５〜３０９９５番目に相当する部位をいう。
【００１９】
制限増殖型Ａｄは、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるＡｄであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。
【００２０】
本発明のＡｄベクタープラスミドに備えられるプロモーターは、特に制限されない。例えば、ポリメラーゼII系（pol II系）またはポリメラーゼIII系（pol III系）のいかなるプロモーターであっても良い。具体的にはpol III系のプロモーターとしてＵ６プロモーターやＨ１プロモーターを例示することでき、pol II系のプロモーターとしてＣＭＶプロモーターを例示することできる。
【００２１】
本発明において、Ａｄゲノムに対するプロモーターの導入位置は特に限定されない。プロモーターの導入位置は、アデノウイルスの複製に影響を及ぼさない部位であればどこでもよい。例えば、Ｅ１欠損領域、Ｅ３領域やＥ４領域と３’ＩＴＲ（internal terminal repeat）の間の領域であってもよく、好適には、Ｅ１欠損領域が挙げられる。
【００２２】
本発明におけるＡｄに対してユニークな制限酵素とは、ＡｄゲノムＤＮＡに本来存在しない制限酵素を意味する。同様に、導入されたプロモーターに対してユニークな制限酵素とは、該導入されたプロモーターＤＮＡに本来存在しない制限酵素を意味する。このような制限酵素として、例えばＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩが挙げられる。本発明のＡｄベクタープラスミドに備えられる１または複数の制限酵素の認識部位は、上記に挙げられた制限酵素から１または複数、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜４、更に好ましくは１〜２の制限酵素を認識する配列であれば良い。より好適にはＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩおよびＣｓｐ４５Ｉから選択される１または複数の制限酵素を認識する配列を本発明のＡｄベクタープラスミドに備えることができる。
【００２３】
制限酵素認識配列の少なくとも１は、プロモーター領域の転写開始点付近に配置することが好ましく、例えば転写開始点から塩基数±２０、好適には±１０以内の領域に配置するのが好ましく、制限酵素認識配列中に転写開始点を含むように配置するのがより好ましい。
【００２４】
本発明のＡｄベクタープラスミドの作製工程において、１または複数の制限酵素の認識配列を、各々制限酵素で消化し、外来塩基配列をシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。導入する外来塩基配列の塩基長は、特に限定されないが、好ましくは１０ｋｂ以下であり、ライゲーションが従来困難であった比較的短い塩基長、例えば１５〜１００ｂｐ、好ましくは２０〜８０ｂｐの外来塩基配列をインビトロライゲーションにより導入することができる。導入する外来塩基配列は、特に限定されないが、例えば、タンパク質或いはペプチドをコードする塩基配列、所定の遺伝子の制御領域に存在する塩基配列、所定のタンパク質が結合できる塩基配列等、如何なる塩基配列であってもよい。特に、所定の遺伝子の制御に関連する塩基配列、例えば目的の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列若しくはｓｈＲＮＡをコードする塩基配列が好適である。このような塩基配列を有するオリゴＤＮＡを合成したものを使用することができる。
【００２５】
さらに、例えばＡｄゲノムのＥ３領域の欠損部位に、発現を制御するプロモーター配列、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子およびポリＡ配列をこの順で有する塩基配列を導入することで、ルシフェラーゼ活性を測定して導入効率を評価することができる。また、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に代えて、ＧＦＰをコードする遺伝子を用いた場合には、導入細胞におけるグリーン蛍光を測定することで、導入効率を評価することもできる。
【００２６】
上記により得られたＡｄベクタープラスミドは、上記プラスミドゲノム両末端を、制限酵素を用いて線状にし、これを例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションするだけで、外来塩基配列、例えばｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターの作製が可能となった。プラスミドゲノム両末端に存在する制限酵素の認識配列として、Ａｄに対してユニークな制限酵素であって、上記Ｅ１領域などのクローニングに使用していない制限酵素の認識配列を導入することができる。そのような条件において、例えばＰａｃＩ、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択されるいずれかの制限酵素の認識配列を導入することができる。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）Ａｄベクタープラスミドの作製
１．ｐＡｄＨＭ４の作製
Ｅ１領域およびＥ３領域の欠損型ＡｄベクターゲノムであるｐＡｄＨＭ４は、非特許文献１に記載の方法により作製した。
【００２９】
２．ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター配列の導入
次に、ｐＡｄＨＭ４のＥ１領域の欠損部位にｈＵ６プロモーター配列を導入し、ＡｄベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）を構築した（図１ａ）。
【００３０】
ｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを、直接的にｈＵ６プロモーター配列の下流領域に導入するために、ｈＵ６プロモーターの下流領域には、ユニークな制限酵素認識部位（例えばＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ）および転写開始部位が必要である（図１、図２）。このような、制限酵素認識部位を導入した変形ｈＵ６プロモーターとして、以下に示すｈＵ６（１）、ｈＵ６（２）およびｈＵ６（３）プロモーターを構築した。
【００３１】
ｈＵ６（１）およびｈＵ６（２）プロモーター配列は、ＣｌａＩ認識部位およびＸｂａＩ認識部位を含み、ｈＵ６（３）プロモーター配列は、ＳｗａＩ認識部位およびＸｂａＩ認識部位を含む。ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ、またはＸｂａＩで消化されたｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）のベクタープラスミドは、必要な配列を導入するために−２０℃で保存することができ、次回以降再度消化する必要がなく、便利である。
ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ、またはＸｂａＩで消化されたｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）等は、通常の方法により、大腸菌に形質転換した。
【００３２】
i)各種プロモーター配列の増幅
ヒトＵ６プロモーター配列は、ヒトｃＤＮＡライブラリー(Clontech社）を用いて以下のプライマーで増幅した。
hU6-S1：5'- aaggtcgggcaggaagagggccta-3'（配列番号１）
hU6-AS1：5'- ggtctagaagtatcgatgtttcgtcctttccacaagatata-3'（配列番号２）
制限酵素ＸｂａＩおよびＣｌａＩ認識部位は各々下線を施した。
hU6-AS2：5'- ggtctagaagtatcgattttcgtcctttccacaagatatat-3'（配列番号３）
制限酵素ＸｂａＩおよびＣｌａＩ認識部位は各々下線を施した。
hU6-AS3：5'- ggtctagaagtatttaaattcgtcctttccacaagatatataa-3'（配列番号４）
制限酵素ＸｂａＩおよびＳｗａＩ認識部位は各々下線を施した。
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００３３】
ｈＵ６（１）、ｈＵ６（２）およびｈＵ６（３）プロモーター配列は、各々hU6-S1/hU6-AS1、hU6-S1/hU6-AS2またはhU6-S1/hU6-AS3のプライマーセットを用いて増幅した（図２）。これらのプロモーター配列を、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ認識部位（非特許文献１、２）を用いてインビトロライゲーションによりｐＡｄＨＭ４（非特許文献２）の誘導体であるＥ１領域欠損型のベクタープラスミドｐＡｄＨＭ４．１に導入した。Ａｄゲノムの外側にはＸｂａＩ認識部位はない。
【００３４】
３．ｓｉＲＮＡ発現用組換Ａｄベクタープラスミドの構築（ルシフェラーゼ）
ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）、またはＳｗａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に組込み、ルシフェラーゼを標的遺伝子とする場合のｓｉＲＮＡを発現するための組換Ａｄベクタープラスミドを作製した。各組換Ａｄベクタープラスミドは、各々、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−Ｌｕ、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−Ｌｕとした。
【００３５】
ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド
(a) 5'-cgacgctgagtacttcgaaatttcaagagaatttcgaagtactcagcgttttttggaaat-3'
（配列番号５）
(b) 5'-ctagatttccaaaaaacgctgagtacttcgaaattctcttgaaatttcgaagtactcagcgt-3'
（配列番号６）
(c) 5'-ccacgctgagtacttcgaaatttcaagagaatttcgaagtactcagcgttttttggaaat-3'
（配列番号７）
(d) 5'-ctagatttccaaaaaacgctgagtacttcgaaattctctcttgaaatttcgaagtactcagcgtgg-3'
（配列番号８）
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００３６】
配列番号５および６に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−Ｌｕが生じる。また、配列番号７と８に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−Ｌｕが生じる。
【００３７】
４．ｓｉＲＮＡ発現用組換Ａｄベクタープラスミドの構築（ｐ５３）
ｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド(Brummelkamp et al., Science, 296, 550-3, 2002)を合成し、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）またはＳｗａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に組込み、ｐ５３を標的遺伝子とする場合のｓｉＲＮＡを発現するための組換Ａｄベクタープラスミドを作製した。各組換ベクタープラスミドは、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）−ｐ５３，ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−ｐ５３，ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−ｐ５３）とした。
【００３８】
ｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド
(e) 5'-cgactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaat-3'
（配列番号９）
(f) 5'-ctagatttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagt-3'
（配列番号１０）
(g) 5'-cggactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaat-3'
（配列番号１１）
(h) 5'-ctagatttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagtc-3'
（配列番号１２）
(i) 5'-ccgactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaat-3'
（配列番号１３）
(j) 5'-ctagatttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagtcgg-3'
（配列番号１４）
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００３９】
配列番号９および１０に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）−ｐ５３が生じる。また、配列番号１１と１２に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−ｐ５３が生じる。同様に、配列番号１３と１４に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）に使用し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−ｐ５３が生じる。
【００４０】
ｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド配列が組み込まれた各組換ベクタープラスミドは、ＸｂａＩ認識部位では再度消化することができるが、ＣｌａＩまたはＳｗａＩ認識部位では消化されないようにデザインされている。
【００４１】
３．および４．により、ルシフェラーゼおよびｐ５３に対するｓｉＲＮＡの発現ベクタープラスミドを容易に作製した。９０％以上のＡｄベクタープラスミドには、正確にｓｉＲＮＡをコードする配列が導入されていた。
【００４２】
（実施例２）Ａｄベクターの構築
実施例１により得られたＡｄベクタープラスミドを、制限酵素により消化し、直鎖ベクタープラスミドとしたものを２９３細胞にトランスフェクションすることにより、Ａｄベクターを作製した。
具体的には、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−Ｌｕ、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−Ｌｕ、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ｐ５３、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）−ｐ５３、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）−ｐ５３またはｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）−ｐ５３）をＰａｃＩで消化し、２９３細胞にトランスフェクションすることにより、Ａｄ−ｈＵ６（２）−Ｌｕ、Ａｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕ、Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３などの各Ａｄベクターを作製した。
２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培養液を用いて１０日間培養し、各々直鎖ベクタープラスミドをトランスフェクションし、Ａｄベクターを作製した。作製したＡｄベクターをＣｓＣｌ２勾配遠心分離により精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(pH 7.5)，１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０％グリセロールを含む溶液で透析し、−７０℃で保存した。
【００４３】
（比較例１）従来法によるＡｄベクタープラスミドの構築
piGene ｈＵ６(iGENE Therapeutics, Tsukuba, Japan)から入手したインタクトｈＵ６プロモーター配列をシャトルベクタープラスミドｐＨＭ５に導入し、ｐＨＭ５−ｈＵ６を作製した。
【００４４】
以下は、ルシフェラーゼまたはｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの配列である。
(k) 5'-caccacgctgagtacttcgaaatttcaagagaatttcgaagtactcagcgtttttt -3'
（配列番号１５）
(l) 5'-tacgaaaaaacgctgagtacttcgaaattctcttgaaatttcgaagtactcagcgt-3'
（配列番号１６）
(m) 5'-caccgactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtctttttggaaa-3'
（配列番号１７）
(n) 5'-gcattttccaaaaagactccagtggtaatctactctcttgaagtagattaccactggagtc-3'
（配列番号１８）
配列は、ＤＮＡシークエンサー(ABI PRISM 310, Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００４５】
配列番号１５と１６に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットで、以下の方法によりｐＨＭ５−ｈＵ６−Ｌｕを作製し、さらにこれをｐＡｄＨＭ４のＥ１領域にＩ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩ部位を用いて導入し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−Ｌｕが生じる。同様に、配列番号１７と１８に記載のオリゴヌクレオチドが１セットで、このセットでｐＨＭ５−ｈＵ６−ｐ５３を作製し、さらにこれをｐＡｄＨＭ４のＥ１領域にＩ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩ部位を用いて導入し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ｐ５３が生じる。
【００４６】
使用説明書(iGENE Therapeutics. Inc.)に従い、ｐＨＭ５−ｈＵ６のＢｓｐＭＩ認識部位にルシフェラーゼまたはｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを導入して、ｓｈＲＮＡ発現カセットを作製した。次にｓｈＲＮＡ発現カセットをｐＡｄＨＭ４のＥ１領域にＩ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩ部位を用いて導入し、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ＬｕまたはｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６−ｐ５３を構築した（非特許文献１）。
比較例１により得られたＡｄベクタープラスミドを、制限酵素により消化し、直鎖ベクタープラスミドとしたものを２９３細胞にトランスフェクションすることにより、Ａｄベクターを作製した。
【００４７】
（比較例２）標的配列を含まないＡｄベクターの構築
インタクトなｈＵ６プロモーター配列のみを有し、標的配列を含まないＡｄベクター（Ａｄ−ｈＵ６）も、実施例１および比較例１と同手法にてｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６およびｐＨＭ５−ｈＵ６により構築した。
【００４８】
（実験例１）ウイルスの生物学的タイターと物理化学的タイターの測定
Adeno-X Rapid Titer キット(Clontech, Palo Alto, CA, USA)を用いて生物学的タイター（infectious titer/ml）を、Maizel et al. (Maizel et al., Virology, 36, 115-25, 1968)の光学的手法により、物理化学的タイター（particle titer (PT)/ml）を測定した。生物学的タイターと物理化学的タイターの比は、Ａｄ−ｈＵ６で１：３６、Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕで１：３１、Ａｄ−ｈＵ６（２）−Ｌｕで１：２８、Ａｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕで１：２４、Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３で１：２２、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３で１：２９、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３で１：１２、Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３で１：１５であった。
【００４９】
（実験例２）細胞への形質導入およびルシフェラーゼアッセイ
ネオマイシン耐性遺伝子を有したルシフェラーゼ発現用プラスミドをＡ５４９細胞（肺癌細胞）にトランスフェクションし、安定にルシフェラーゼを発現するＡ５４９−Ｌｕｃ細胞を作製した。Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培養液を用いて培養した。Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞を２×１０５cellsを１２ウェルのディッシュに播種した。
【００５０】
翌日、ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクター、即ちルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡの発現ベクターであるＡｄ−ｈＵ６（２）−ＬｕまたはＡｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕについて、各々３００ＶＰ／cell、１０００ＶＰ／cellまたは３０００ＶＰ／cellをＡ５４９−Ｌｕｃ細胞に１．５時間形質導入した。同様にｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含まないベクター（Ａｄ−ｈＵ６）およびｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクター（Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３）を形質導入し、陰性コントロールとした。
【００５１】
Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞でのルシフェラーゼの産生のために７２時間細胞培養し、ｓｉＲＮＡの各発現ベクターのルシフェラーゼ産生抑制効果を調べた。細胞中のルシフェラーゼの産生は、ルシフェラーゼアッセイシステム （PicaGene LT2.0; 東洋インキ社）を用いて測定した。
【００５２】
その結果、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ＬｕまたはＡｄ−ｈＵ６（３）−Ｌｕを用いた場合は、ルシフェラーゼの発現は抑制された（図３）。
【００５３】
（実験例３）細胞への形質導入およびｐ５３のウエスタンブロッティング
次に、ｐ５３に対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクターを用いて、発現したｐ５３に対するｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果について確認した。ｐ５３遺伝子は癌抑制遺伝子の一種であり、遺伝子産物としてｐ５３タンパク質を発現する。
【００５４】
Ａｄ−ｈＵ６、Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕ、Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３、Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３またはＡｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３について、各々３００ＶＰ／cellまたは１０００ＶＰ／cellをＡ５４９細胞（肺癌細胞）に１．５時間形質導入し、３日間培養した。その後、Ａ５４９細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングによりｐ５３の発現を調べた。
【００５５】
細胞抽出液は、プロテアーゼインヒビターのカクテルを含む溶解緩衝液(25 mM Tris [pH 7.5], 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl)（シグマ社）を用いて調製した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準にして Bio-Rad assay kit （Bio-Rad社）を用いて測定した。
タンパク質試料液（１０μｇ）を、12.5% ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いてImmobilon-P膜（Millipore社）により電気泳動した。ブロックエース（大日本製薬）でブロックした後、膜を抗ｐ５３抗体 (Santa Cruz Biotechnology社）とともに加温し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（American Qualex Antibodies社）またはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Oncogene Research Products社）とともに加温したものについて、蛍光測定により計測した。シグナルは、 LAS-3000（富士フィルム社）を用いて計測し、Image Gauge Software（富士フィルム社）を用いて定量した。
【００５６】
その結果を図４に示した。図４において、各レーンに付した試料は、以下に示す各ベクターを形質導入したＡ５４９細胞である。
１：Ａｄ−ｈＵ６
２：Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕ
３：Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３
４：Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３
５：Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３
６：Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３
【００５７】
アクチンは、内在コントロールとした。Ａ５４９細胞（肺癌細胞）でのｐ５３の発現は、Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３、Ａｄ−Ｕ６（２）−ｐ５３、Ａｄ−Ｕ６（３）−ｐ５３処理によりＡｄ−ｈＵ６−ｐ５３と同様の効果を示した。Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３またはＡｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３の抑制効果は、Ａｄ−Ｕ６（２）−ｐ５３またはＡｄ−Ｕ６（３）−ｐ５３で処理したときに比べて、１．５から２分の１程度劣った。Ａｄ−ｈＵ６およびＡｄ−ｈＵ６−Ｌｕについては、ｐ５３発現抑制は認められなかった（図４）。これらの結果から、ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ認識部位を転写開始部位に含む新規ｈＵ６プロモーターは、従来法で作製されたｈＵ６プロモーターと同様に効果的であり、本発明の作製方法により作製されたＡｄベクターは、標的遺伝子の発現を抑制しうることが確認された。
【００５８】
従来のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドでは、ＡｐａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ認識部位を有するＵ６またはＨ１プロモーターを用いていた(Brummelkamp et al., Science 296, 550-553, 2002; Lee et al., Nat Biotechnol., 2002; Paddison et al., Genes Dev 16, 2002; Paul et al., Nat Biotechnol., 20, 500-5, 2002; Sui et al., Proc Nstl Acad Sci USA, 99, 5515-20, 2002; Yu et al., Proc Nstl Acad Sci USA, 99, 6047-52, 2002; Boden et al., Nucleic Acids Res., 31, 5033-8, 2003)。
【００５９】
本実施例では、ＣｌａＩ若しくはＳｗａＩ認識部位を転写開始部位に含み、プロモーターの下流領域にＸｂａＩ認識部位を含むＵ６プロモーターを用いた。従来のｓｉＲＮＡ発現用プラスミドに使用可能なすべてのプロモーターの改変、例えばＵ６またはＨ１プロモーターの改変は、効果的なＲＮＡｉ作用のために有効である。前記の改変は、Ｕ６またはＨ１プロモーターの機能を損なわない。近年、ポリメラーゼII系など多くのタイプのポリメラーゼが、ポリメラーゼIII系と同様にｓｉＲＮＡ発現用に用いられるようになった。本発明は、他のｓｉＲＮＡ発現用プロモーターを用いても使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のＡｄベクター並びにＡｄベクタープラスミドの作製方法を利用することにより、所望の外来塩基配列をＡｄベクタープラスミドにライゲーションするだけで外来塩基配列発現用Ａｄベクタープラスミドの作製が可能となり、例えば２９３細胞（Ｅ１領域欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）等にトランスフェクションすることで、Ａｄベクターを極めて簡便作製ことができる。また、所望の外来塩基配列がｓｉＲＮＡの場合には、ｓｉＲＮＡ発現Ａｄベクターライブラリーの作製も容易になるため、創薬ターゲット遺伝子検索のための基盤技術の開発に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１ａ】ｓｉＲＮＡの発現用のベクタープラスミド、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）およびｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）を示す図である。ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（１）、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（２）は、ＣｌａＩおよびＸｂａＩ認識部位含み、ｐＡｄＨＭ４−ｈＵ６（３）はＳｗａＩおよびＸｂａＩ認識部位を含む。
【図１ｂ】Ａｄベクター作製方法を示す図である。
【図２】（Ａ）インタクトなｈＵ６プロモーター配列を示す。（Ｂ）ｈＵ６（１）プロモーター配列を示す。このプロモーターにおいて、ＣｌａＩ認識部位は転写開始位置に備えられる。（Ｃ）ｈＵ６（２）プロモーター配列を示す。このプロモーターにおいて、ＣｌａＩ認識部位は転写開始位置に備えられる。（Ｄ）ｈＵ６（３）プロモーター配列を示す。このプロモーターにおいて、ＳｗａＩ認識部位は転写開始位置に備えられる。
【図３】ｓｉＲＮＡを発現するＡｄベクターを用いたときのＡ５４９−Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼの発現抑制効果を示す図である。
【図４】ｓｉＲＮＡを発現するＡｄベクターを用いたときのＡ５４９細胞におけるｐ５３の発現抑制効果を示す図である。
【符号の説明】
【００６２】
図４における符号は、以下のとおりである。
１：Ａｄ−ｈＵ６
２：Ａｄ−ｈＵ６−Ｌｕ
３：Ａｄ−ｈＵ６−ｐ５３
４：Ａｄ−ｈＵ６（１）−ｐ５３
５：Ａｄ−ｈＵ６（２）−ｐ５３
６：Ａｄ−ｈＵ６（３）−ｐ５３
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスのゲノムを含み、プロモーターおよびアデノウイルスに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなることを特徴とするアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項２】
アデノウイルスに対してユニークな制限酵素の認識配列の少なくとも１が、プロモーター領域に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項３】
アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスのゲノム、または制限増殖型アデノウイルスのゲノムである請求項１または２に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項４】
プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである請求項１〜３のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項５】
制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である請求項１〜４のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項６】
以下の工程を含むアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法：
１）アデノウイルスのゲノムを準備する工程；
２）上記アデノウイルスのゲノムに、プロモーターを導入する工程；
３）上記アデノウイルスのゲノムに導入されたプロモーター領域に、アデノウイルスおよび該導入されたプロモーターに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数導入する工程。
【請求項７】
アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスのゲノム、または制限増殖型アデノウイルスのゲノムである、請求項６に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項８】
プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである請求項６または７に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項９】
制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である請求項６〜８のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法において、さらに外来塩基配列をライゲーションする工程を含むアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１１】
外来塩基配列の塩基長が、２０〜８０ｂｐである請求項１０に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１２】
前記外来塩基配列が、ｓｉＲＮＡをコードする塩基配列を含む請求項１０または１１に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したアデノウイルスベクタープラスミドを、細胞にトランスフェクションすることによるアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したアデノウイルスベクタープラスミドを、制限酵素で切断し、直鎖状としたものを細胞にトランスフェクションすることによるアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項１】
アデノウイルスのゲノムを含み、プロモーターおよびアデノウイルスに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数備えてなることを特徴とするアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項２】
アデノウイルスに対してユニークな制限酵素の認識配列の少なくとも１が、プロモーター領域に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項３】
アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスのゲノム、または制限増殖型アデノウイルスのゲノムである請求項１または２に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項４】
プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである請求項１〜３のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項５】
制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である請求項１〜４のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミド。
【請求項６】
以下の工程を含むアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法：
１）アデノウイルスのゲノムを準備する工程；
２）上記アデノウイルスのゲノムに、プロモーターを導入する工程；
３）上記アデノウイルスのゲノムに導入されたプロモーター領域に、アデノウイルスおよび該導入されたプロモーターに対してユニークな制限酵素の認識配列を１または複数導入する工程。
【請求項７】
アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスのゲノム、または制限増殖型アデノウイルスのゲノムである、請求項６に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項８】
プロモーターが、ポリメラーゼII系またはポリメラーゼIII系のプロモーターである請求項６または７に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項９】
制限酵素の認識配列が、ＣｌａＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＰａｃＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩから選択される１または複数の制限酵素の認識配列である請求項６〜８のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法において、さらに外来塩基配列をライゲーションする工程を含むアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１１】
外来塩基配列の塩基長が、２０〜８０ｂｐである請求項１０に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１２】
前記外来塩基配列が、ｓｉＲＮＡをコードする塩基配列を含む請求項１０または１１に記載のアデノウイルスベクタープラスミドの作製方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したアデノウイルスベクタープラスミドを、細胞にトランスフェクションすることによるアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか１に記載の作製方法で作製したアデノウイルスベクタープラスミドを、制限酵素で切断し、直鎖状としたものを細胞にトランスフェクションすることによるアデノウイルスベクターの作製方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−６１５８２（Ｐ２００８−６１５８２Ａ）
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４３４６４（Ｐ２００６−２４３４６４）
【出願日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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