アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
本発明は、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法に関する。本方法は、先ず該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、続いて吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及びタンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでいる。本方法は、従前の分離方法に比べて、各々のリガンドがＳｐＡ又はプロテインＺの単量体又は二量体或いはその機能的変異体から本質的になる点で改良されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、さらに具体的には単量体又は二量体リガンドを含む分離マトリックスに関する。本発明はまた、前述のマトリックスを用いて興味深いタンパク質を分離する方法であって、容量が増加しかつ溶出ｐＨが上昇するという利点を有する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、世界中の団体によって製造又は開発されている最も普及したバイオ医薬品を代表している。それに対する高い商業的需要、したがってこの特定の治療薬市場の高い価値のため、製薬会社は関連するコストを抑制しながらそれぞれのｍＡｂ製造プロセスの生産性を最大化することに重きを置いてきた。大抵の場合、これらの免疫グロブリン分子（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体）の精製における基本段階の１つとしてアフィニティークロマトグラフィーが使用される。特に興味深い部類の親和性試薬は免疫グロブリン分子の不変部に特異的に結合できるタンパク質であり、かかる相互作用は抗体の抗原結合特異性とは無関係である。かかる試薬は、特に限定されないが血清又は血漿製剤或いは細胞培養物由来の供給原料のような様々な試料からアフィニティークロマトグラフィーで免疫グロブリンを回収するのに広く使用できる。かかるタンパク質の一例は、様々な種のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ及びＦａｂ部分に結合できるドメインを含んだブドウ球菌プロテインＡである。
【０００３】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）系試薬は、その高い親和性及び選択性のため、バイオテクノロジー分野で（例えば、抗体の捕捉及び精製並びに検出のためのアフィニティークロマトグラフィーで）広く用いられてきた。現在、ＳｐＡ系アフィニティー媒体は恐らく細胞培養物由来の工業用供給原料をはじめとする様々な試料からモノクローナル抗体及びそのフラグメントを単離するために最も広く使用されているアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡリガンドを含む各種のマトリックスが市販されており、例えば、天然プロテインＡの形態のもの（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン、ウプサラ））、組換えプロテインＡからなるもの（例えば、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）などがある。さらに具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で行われている遺伝子操作は、担体に対するそれの結合を容易にすることを目的としたものである。
【０００４】
これらの用途では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途と同じく、夾雑物を確実に除去することに包括的な注意を払う必要がある。かかる夾雑物とは、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウィルスをはじめとする所望されない生体分子や微生物のように、クロマトグラフィー操作で固定相又はマトリックスに吸着された非溶出性の分子であり得る。かかる夾雑物のマトリックスからの除去は、マトリックスを再生してから引き続いて使用するため、所望生成物の最初の溶出の後に行われるのが普通である。かかる除去では、通常クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる操作が行われ、その際には固定相から夾雑物を溶出することのできる試薬が使用される。かかる試薬として多用されるものには、前記固定相に流されるアルカリ性溶液がある。現時点で最も多用されている洗浄消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は汚染の程度及び性質に応じて０．１Ｍから例えば１Ｍの範囲にわたり得る。この方法では、マトリックスが１３を超えるｐＨ値に暴露されることを伴う。タンパク質系の親和性リガンドを含む多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに関しては、かかるアルカリ性環境は極めて過酷な条件であり、そのために関連する高ｐＨでのリガンドの不安定性によって容量低下を生じる。
【０００５】
そこで、アルカリ性ｐＨ値に耐える能力の向上した人工タンパク質リガンドの開発に集中して多大の研究が行われてきた。例えば、Ｇｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ（Ｓｕｓａｎｎｅ Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ−Ａｋｅ Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０（２０００），１６９−１７８）は、アルカリ環境における連鎖球菌のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためのタンパク質工学を示唆している。Ｇｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌは、４つのアスパラギン残基のすべてをロイシン（１残基）、アスパラギン酸（２残基）及びリシン（１残基）で置換したＡＢＤの変異体を作成した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌは、この変異体が天然タンパク質と同様の標的タンパク結合挙動を示すこと、及び人工リガンドを含むアフィニティーカラムがアルカリ性条件に繰返し暴露した後でも非人工親リガンドを用いて調製したカラムより高い結合容量を示すことを報告している。かくして、構造及び機能に顕著な影響を与えることなしに４つのアスパラギン残基のすべてを置換できると結論されている。
【０００６】
最近の研究は、プロテインＡ（ＳｐＡ）に変更を加えることで同様な性質に影響を及ぼし得ることを示している。米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号には、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、かかる変異は、ＳｐＡのＢドメイン又はプロテインＺ（ＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物（米国特許第５，１４３，８４４号））のような親ＳｐＡに比べて、約１３〜１４のｐＨ値にまで向上した化学的安定性を付与することが開示されている。著者らは、これらの変異タンパク質を親和性リガンドとして使用した場合、分離媒体は予想される通りアルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐え得ることを示している。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、変異したリガンドがプロテアーゼに一層よく耐え、したがって分離プロセスでのリガンドの漏れを低減させ得ることを示している。別の出願である米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリ安定性のＳｐＡドメインをさらに、例えばＧ２９Ａ変異により、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性は保持するように改変し得ることを示している。
【０００７】
歴史的には、５つのＩｇＧ結合ドメインを含む天然プロテインＡが、すべてのプロテインＡアフィニティー媒体の製造に使用されていた。組換え技術を用いて多数のプロテインＡ構築物が製造されてきたが、これらはいずれも４つ又は５つのＩｇＧ結合ドメインを含んでいた。
【０００８】
したがって、当技術分野では、より小さい反復数を有しながら四量体と同様な又は増加した結合容量を有するタンパク質リガンドを含む分離マトリックスを得ることが要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号明細書
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的の１つは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを好ましくはそのＦｃフラグメントを介して結合し得るタンパク質リガンドを含んでなるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供することである。これらのリガンドは単量体又は二量体として提示され、大きい反復数を有する多量体リガンド（例えば、五量体リガンド）に比べて高い相対結合容量を有する。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明のアフィニティーマトリックスを用いて１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を分離する方法を提供することである。単量体又は二量体の親和性リガンドを使用することで、本方法は意外にも標的分子に対する相対結合容量の増加を達成する。さらに、単量体リガンドを使用すれば溶出ｐＨが上昇する。
【００１２】
かくして本発明は、純粋な免疫グロブリン画分のような精製生成物又は別法として免疫グロブリンを除去した後の液体を製造する方法、或いは試料中における免疫グロブリンの存在を検出する方法を提供する。本発明のリガンドは容量の増加を示し、したがってかかるリガンドはコスト効率のよいラージスケール操作のための魅力的な候補品となる。
【００１３】
上述した目的の１以上は、添付の特許請求の範囲中に記載したようにして達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｚ１（破線）、Ｚ２（点線）及びＺ４（実線）に関する６分の滞留時間で記録した漏出曲線を示している。
【図２】図２は、Ｆｃ融合タンパク質（実線）及びＭＡｂ３（点線）に関するＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーを示している。
【図３】図３は、様々なＭＡｂ及びＦｃ融合タンパク質の低負荷量を各種のｚプロトタイプ上に適用した場合の溶出ｐＨを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書中で「タンパク質」という用語は、タンパク質並びにそのフラグメントを記述するために使用される。即ち、三次元構造を示すアミノ酸の連鎖が「タンパク質」という用語に包含され、したがってタンパク質フラグメントも包含される。
【００１６】
本明細書中では、タンパク質の「機能的変異体」という用語は、機能（本発明に関しては親和性及び安定性と定義される）が本質的に保持されている変異タンパク質を意味する。そこで、前記機能とは無関係の１以上のアミノ酸が置換されていてもよい。
【００１７】
本明細書中で「親分子」という用語は、本発明の変異が導入される前の対応タンパク質に関して使用される。
【００１８】
「構造的安定性」という用語は分子の三次元形態の健全性をいい、「化学的安定性」という用語は化学的分解に耐える能力をいう。
【００１９】
「Ｆｃフラグメント結合」タンパク質という用語は、当該タンパク質が免疫グロブリンのＦｃフラグメントに結合できることを意味する。ただし、Ｆｃフラグメント結合タンパク質が免疫グロブリンのＦａｂ領域のような他の領域にも結合できることを排除するものではない。
【００２０】
本明細書中では、アミノ酸について、その正式名称で記載しないときには慣用の一文字略号で表す。
【００２１】
本明細書中では、変異は置換位置の番号の前に野生型又は非変異型アミノ酸を付し、その後に変異したアミノ酸を付して定義する。例えば、２３位のアスパラギンのスレオニンへの変異はＮ２３Ｔと記載される。
【００２２】
一態様では、本発明は、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、（ｂ）免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでなる方法に関する。この方法では、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺのような単量体リガンドを使用することで免疫グロブリン分子に対するリガンドの結合容量の増加が得られる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、（ｂ）免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでなる方法に関する。この方法では、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺのような二量体リガンドを使用することで免疫グロブリン分子に対するリガンドの結合容量の増加が得られる。
【００２４】
免疫グロブリン結合タンパク質（即ち、リガンド）は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）又は連鎖球菌プロテインＧ（ＳｐＧ）のような、天然の免疫グロブリン結合能力を有する任意のタンパク質であり得る。他のかかるタンパク質の総説に関しては、例えば、Ｋｒｏｎｖａｌｌ，Ｇ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｋ．Ｒｅｃｅｐｔｉｎｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｒｍ ｆｏｒ ａｎ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１９９９ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１２（１）：３８−４４を参照されたい。単量体又は二量体リガンドは、ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの１以上を含み得る。さらに好ましくは、リガンドはプロテインＡのドメインＢ又は人工的に作製されたプロテインＺを含む。
【００２５】
一実施形態では、リガンドは、例えばＳｐＡドメインＢ又はプロテインＺの１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定化される。前述の通り、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号には、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、かかる変異は高ｐＨでの向上した化学的安定性をもたらすことが開示されている。さらに、これらのリガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐えることができる。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、変異したリガンドがプロテアーゼに一層よく耐え、したがって分離プロセスでのリガンドの漏れを低減させ得ることを示している。これらの出願の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなしている。
【００２６】
別の実施形態では、こうして製造されたリガンドは、抗体のＦｃ部分に対して親和性を有するが、抗体のＦａｂ部分に対する実質的な親和性を欠いている。若干の実施形態では、リガンドの１以上のグリシンがアラニンで置換されている。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリ安定性ドメインをさらに、例えばＧ２９Ａ変異により、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性は保持するように改変し得ることを示している。この出願の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなしている。本明細書中で使用されるアミノ酸の番号付けはこの技術分野で通常使用されているものであり、当業者は変異させるべき位置を容易に認識できよう。
【００２７】
有利な実施形態では、ドメインＢのアルカリ安定性が１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されていると共に、アルカリ安定性ドメインＢの２９位のアミノ酸残基の変異（例えば、Ｇ２９Ａ変異）が含まれる。
【００２８】
別の実施形態では、リガンドは、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性が達成されたプロテインＺである。有利な実施形態では、アルカリ安定性は少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている。別の実施形態では、アルカリ安定性タンパク質はアルカリ性条件下で実質的に安定な天然のタンパク質である。
【００２９】
当業者には、アルカリ安定性及びＧ−Ａ変異を生み出すための変異は、通常の分子生物学的技法を用いて任意の順序で実施できることが容易に理解されよう。さらに、かかるリガンドは、変異したタンパク質リガンドをエンコードする核酸配列を含むベクターによって発現させることができる。別法として、かかるリガンドはタンパク質合成技法によっても製造できる。所定配列のペプチド及びタンパク質を合成する方法は、当技術分野で公知であって一般に利用できる。
【００３０】
かくして、本発明では、「ブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定性ドメインＢ」という用語は、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号及び同第２００６／０１９４９５０号に記載されている変異タンパク質のような、ＳｐＡのドメインＢに基づくアルカリ安定化タンパク質、並びに他の起源を有するが機能的に同等なアミノ酸配列を有する他のアルカリ安定性タンパク質を意味する。
【００３１】
当業者には理解される通り、発現されたタンパク質は、担体に固定化する前に適当な程度まで精製すべきである。かかる精製方法は当技術分野で公知であり、担体へのタンパク質系リガンドの固定化は標準的な方法を用いて容易に実施される。好適な方法及び担体は以下に一層詳しく記載される。
【００３２】
したがって一実施形態では、本発明の変異タンパク質は、アスパラギン変異が２１位にないことを条件として、配列番号１又は配列番号２で規定される配列の約７５％以上、例えば８０％以上、好ましくは９５％以上を含んでいる。
【００３３】
本明細書中では、次の配列番号１はＳｐＡのＢドメインのアミノ酸配列を規定する。
Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ。
次の配列番号２はプロテインＺとして知られるタンパク質を規定する。
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ。
【００３４】
プロテインＺは、２９位のグリシンがアラニンに置換されたＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物である。例えば、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｃ．Ｆｌｅｃｋｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｗ．Ｄｒｅｗ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８−２２のＳｔａｈｌ ｅｔ ａｌ， １９９９： Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを参照されたい。
【００３５】
一実施形態では、上述の変異タンパク質は配列番号１又は配列番号２で規定されるアミノ酸配列或いはその機能的変異体を含んでいる。本明細書中で使用される「機能的変異体」という用語は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の親和性又はｐＨ値の上昇した環境におけるその向上した化学的安定性に影響を及ぼさないアミノ酸位置での１以上の追加変異を含む任意の類似配列を包含する。
【００３６】
有利な実施形態では、本発明の変異はＮ２３Ｔ、Ｎ２３ＴとＮ４３Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ６Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１ＳとＮ２３Ｔ、及びＮ６ＡとＮ２３Ｔからなる群から選択され、親分子が配列番号２で規定される配列を含むものである。上述の通り、アルカリ性条件下で長期にわたって高い結合容量を有するリガンドとして有用な変異タンパク質を得るためには、２１位のアスパラギン残基の変異は回避される。一実施形態では、３位のアスパラギン残基は変異されない。
【００３７】
最も有利な実施形態では、ロイシン残基とグルタミン残基との間に位置するアスパラギン残基が例えばトレオニン残基に変異している。そこで、一実施形態では、配列番号２で規定される配列の２３位のアスパラギン残基が、例えばトレオニン残基に変異している。特定の実施形態では、配列番号２で規定される配列の４３位のアスパラギン残基も例えばグルタミン酸に変異している。アミノ酸番号４３が変異した実施形態では、当該変異をＮ２３Ｔのような別の１以上の変異と組み合わせるのが最も有利であるように思われる。
【００３８】
ＳｐＡのＢドメイン及びプロテインＺの様々なアスパラギン残基が変異タンパク質の親和性及び安定性に異なった寄与をなし得るという知見は、特にＡＢＤのすべてのアスパラギン残基を何の内的区別もなく変異させることができたと結論づけたＧｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌの上述の教示内容に鑑みれば、全く予想外であった。
【００３９】
かくして、本発明には上述の単量体型変異タンパク質が包含される。ただし、かかるタンパク質単量体を合体させて二量体、三量体、四量体、五量体などの多量体とすることもできる。したがって、本発明の別の態様は、本発明の１以上の変異タンパク質を他の１以上の単位、好ましくは同じく本発明の変異タンパク質と共に含む多量体である。かくして、本発明は例えば２つの反復単位を含む二量体である。
【００４０】
一実施形態では、本発明の多量体は好ましくは０〜１５（例えば５〜１０）のアミノ酸からなるアミノ酸ストレッチで連結した複数の単量体単位を含んでいる。かかる連結の性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的コンホメーションを不安定にすべきでない。さらに、前記連結は好ましくはアルカリ性環境中で変異タンパク質単位の特性を損なわないように十分安定であるべきである。
【００４１】
一実施形態では、本発明の単量体リガンドは次の配列番号３の配列を含んでいる。
ＡｌａＧｌｎＧｌｙＴｈｒＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎ
ＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕ
ＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓ
ＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａ
ＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＰｒｏＬｙｓＣｙｓ。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは次の配列番号４の配列を含んでいる。
ＡｌａＧｌｎＧｌｙＴｈｒＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎ
ＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕ
ＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓ
ＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａ
ＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｌａ
ＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅ
ＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａ
ＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａ
ＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎ
ＡｌａＰｒｏＬｙｓＣｙｓ。
【００４３】
本発明では意外にも、リガンドの容量を比較した場合、四量体及び二量体に関して同等な高い動的結合容量が得られた一方、単量体は最高の相対容量（ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンド）を有することが見出された。一般に、リガンドのｚ単位数が少ないほど高い相対容量が得られることが見出される。我々のデータはまた、溶出ｐＨがリガンド密度に依存することを確認している。さらに、単位リガンドプロトタイプ上で精製した試料は他のプロトタイプに比べて高いｐＨで溶出するが、これは低いｐＨで凝集しやすい免疫グロブリンにとって有利である。平均時間では、宿主細胞タンパク質のクリアランスは単量体、二量体及び四量体に関してほぼ同等である。
【００４４】
本発明ではまた、意外にも、免疫グロブリンドメインを含む融合タンパク質のような大きい単量体に対しては、単量体及び二量体に関する動的結合容量が四量体に比べて高いことも見出された。さらに、単量体に関して最高の相対容量（即ち、ｍｇタンパク質／ｍｇリガンドとして表した容量）が得られた。我々の研究では、単量体及び二量体における増加した動的結合容量は主としてリガンド密度の効果ではなく、恐らくは（比較的バルキーな融合タンパク質に対する）立体障害の減少及び／又は急速な動力学によって引き起こされる結合部位の利用度の向上によることが示されている。
【００４５】
言うまでもないが、「免疫グロブリン含有タンパク質」という用語は、抗体の結合性が実質的に維持される限り、抗体及び抗体部分を含む融合タンパク質並びに抗体フラグメント及び変異抗体を包含する。抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗体は哺乳動物種（例えば、ヒト）由来のＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭである。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、アフィニティー分離用のマトリックスであって、免疫グロブリン結合タンパク質を含む単量体又は二量体リガンドが固体担体に結合してなるマトリックスに関する。好ましくは、タンパク質の１以上のアスパラギン残基がグルタミン以外のアミノ酸に変異している。本発明のマトリックスは、四量体リガンドを含むマトリックスと比較した場合、増加した結合容量を示す。変異タンパク質リガンドは好ましくはＦｃフラグメント結合タンパク質であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ（好ましくはＩｇＧ）の選択的結合のために使用できる。
【００４７】
本発明のマトリックスは、上述したいずれかの実施形態に係る変異タンパク質をリガンドとして含むことができる。最も好ましい実施形態では、固体担体上に存在するリガンドは上述の単量体を含む。
【００４８】
本発明のマトリックスの固体担体は、任意適宜の公知タイプのものであり得る。通常のアフィニティー分離マトリックスは多くは有機質のものであり、使用する水性媒体に親水性表面が露出されたポリマー、即ちその外面に（及び存在する場合には内面にも）ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ2或いはＮ置換型）、アミノ（−ＮＨ2或いは置換型）、オリゴ又はポリエチレンオキシ基が露出されたポリマーを基材としている。一実施形態では、ポリマーは例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロースなどの多糖類系のものであり、有利には適当な多孔性及び剛性を与えるために例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、１，２，３−トリハロ置換低級炭化水素で架橋されたものであり得る。最も好ましい実施形態では、固体担体は多孔性アガロースビーズである。本発明で使用される担体は逆懸濁ゲル化（Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎ： Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４））のような標準的方法に従って容易に製造できる。別法として、ベースマトリックスはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のような市販品である。ラージスケール分離のために特に有利な実施形態では、担体は、その剛性が増大し、したがってマトリックスが高い流速に対して一層適するように改変される。
【００４９】
別法として、固体担体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの合成ポリマーを基材としている。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼン系マトリックスのように疎水性ポリマーの場合には、上述のような親水基が周囲の水性液体に露出されるようにマトリックスの表面を親水化処理することが多い。かかるポリマーは標準的方法に従って容易に製造されるが、例えば“Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ．Ａｒｓｈａｄｙ： Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ'Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０−７５ （１９８８））を参照されたい。別法として、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のような市販品が使用される。
【００５０】
別の代替法では、本発明の固体担体は、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機質の担体を含む。
【００５１】
さらに別の実施形態では、固体担体は表面、チップ、毛管又はフィルターのような別の形態を取る。
【００５２】
本発明のマトリックスの形状に関しては、一実施形態では、マトリックスは多孔性モノリスの形態である。別の実施形態では、マトリックスはビーズ又は粒子形態であり、多孔性でも非多孔性でもよい。ビーズ又は粒子形態のマトリックスは充填ベッドとして使用することもできるし、或いは懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には膨張ベッドとして知られるもの及び純然たる懸濁物が包含され、そこでは粒子又はビーズが自由に運動できる。モノリス、充填ベッド及び膨張ベッドの場合、分離手順は一般に濃度勾配による通常のクロマトグラフィーに従う。純然たる懸濁物の場合には、回分法が使用される。
【００５３】
リガンドは、例えばリガンド中に存在するアミノ基及び／又はカルボキシ基を利用した通常のカップリング技法で担体に結合できる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などがよく知られたカップリング試薬である。担体とリガンドとの間には、スペーサーとして知られる分子を導入することができ、これはリガンドの利用可能性を向上させ、担体へのリガンドの化学的カップリングを容易にする。別法として、リガンドは物理的吸着又は生物特異的吸着のような非共有結合によって担体に結合することもできる。
【００５４】
有利な実施形態では、本発明のリガンドはチオエステル結合で担体に結合されている。かかるカップリングの実施方法は当技術分野で公知であり、標準的な技法及び機器を用いて当業者が容易に実施できる。有利な実施形態では、最初に、後にカップリングで使用するための末端システイン残基をリガンドに設ける。適切な精製段階も当業者が容易に実施できる。
【００５５】
本発明の若干の実施形態では、吸着段階のための条件は常用されている任意のものであってよく、標的抗体の性質（例えば、そのｐＩ）に応じて適当に改変することができる。任意の洗浄段階は、ＰＢＳ緩衝液のような常用緩衝液を用いて実施できる。
【００５６】
溶出は、任意の常用緩衝液を用いて実施できる。有利な実施形態では、抗体の回収は、単量体リガンド系の場合に４．０〜４．４、好ましくは４．２〜４．４の範囲内のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される。同様な実施形態では、抗体の回収は、二量体リガンド系の場合に３．８〜４．２、好ましくは３．９〜４．０の範囲内のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される。このように、これらの実施形態の利点は、標的抗体が溶出に際してプロテインＡ系リガンドと共に通常使用されるｐＨ値より概して高いｐＨ値に暴露されることである。これは、大抵の抗体に関し、低いｐＨによって引き起こされる変性のリスクの低下、凝集体の減少及び標的の収量の増加をもたらすであろう。
【００５７】
本発明の方法は、例えば治療用又は診断用の抗体の精製プロトコルの第１段階として、標的抗体を捕捉するために有用である。一実施形態では、７５％以上の抗体が回収される。有利な実施形態では、８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の抗体が、二量体リガンド系に関しては３．８〜４．２及び単量体リガンド系に関しては４．０〜４．４の範囲内のｐＨを有する溶離剤を用いて回収される。本発明の方法に続いて、他のクロマトグラフィー段階のような１以上の追加段階を実施することができる。かくして、特定の実施形態では、約９８％を超える抗体が回収される。
【００５８】
ＳｐＡ又はプロテインＺリガンドに関して前述した通り、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、これらの変異リガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐えることができる（米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号）。向上した安定性は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の初期親和性が長期にわたって本質的に保持されることを意味する。したがって、その結合容量はアルカリ性環境中では親分子の結合容量よりゆっくりと減少する。かかる環境はアルカリ性と定義することができ、ｐＨ値の上昇した環境を意味する。例えば、約１０超から約１３又は１４までのｐＨ値（即ち、１０〜１３又は１０〜１４のｐＨ値）であり、これは一般にアルカリ性条件と表される。別法として、かかる条件はＮａＯＨ濃度で定義することもでき、その濃度は約１．０Ｍ以下（例えば、０．７Ｍ、特に約０．５Ｍ）、したがって０．７〜１．０Ｍの範囲内であり得る。
【００５９】
このように、免疫グロブリンに対する親和性（即ち、本発明のリガンドの結合性）、したがってマトリックスの容量は、アルカリ剤での処理によって本質的に経時的な変化を示さない。通常、アフィニティー分離マトリックスのクリーニング・イン・プレイス処理に使用されるアルカリ剤はＮａＯＨであり、その濃度は０．７５Ｍ以下（例えば、０．５Ｍ）である。したがって、０．５Ｍ ＮａＯＨで７．５時間処理した後の結合容量の低下は約７０％未満、好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは約３０％未満（例えば約２８％）である。
【００６０】
本発明の変異タンパク質の向上した化学的安定性は、当業者であれば、例えば濃度０．５ＭのＮａＯＨでの日常処理によって容易に確認できる。これに関しては、上記と同様、「向上した」安定性とは初期安定性が親分子で達成されるものよりも長期間保持されることを意味すると理解すべきである。
【００６１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の単量体リガンド、二量体リガンド又はマトリックスを使用してＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを単離する方法に関する。かくして本発明は、上述の単量体リガンド、二量体リガンド又はマトリックスへの吸着によって１種以上の標的化合物を液体から分離するクロマトグラフィープロセスを包含する。所望の生成物は分離された化合物又は液体のいずれであり得る。かくして本発明のこの態様は、広く用いられている公知の分離技法であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。簡単に述べれば、最初の工程では、標的化合物（好ましくは上述の抗体）を含む溶液を、標的化合物が分離マトリックス上に存在するリガンドに吸着するような条件下で、前記マトリックスに流す。かかる条件は、例えばｐＨ及び／又は塩濃度（即ち、溶液中のイオン強度）によって制御される。マトリックスの容量を超えないように注意すべきであり、換言すれば、流速は満足すべき吸着が起こるように十分遅くすべきである。この段階では、溶液の他の成分は原則として妨害されずに通過する。任意には、保持された物質及び／又は緩く結合した物質を除去するため、次いでマトリックスが例えば水溶液で洗浄される。本発明のマトリックスは、溶剤、塩又は洗浄剤或いはこれらの混合物を用いる中間洗浄段階と共に使用するのが最も有利である。次の段階では、溶離剤といわれる第２の溶液を、標的化合物の脱着（即ち、遊離）が起こる条件下でマトリックスに流す。かかる条件は、通常はｐＨ、塩濃度（即ち、イオン強度）、疎水性などの変化でもたらされる。勾配溶出及び段階的溶出のような様々な溶出法が知られている。溶出はまた、マトリックス上の所望抗体に置き換わる競合物質を含む第２の溶液で達成することもできる。アフィニティークロマトグラフィーの原理に関する総説としては、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．２０００．Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７： １−６を参照されたい。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によって説明する。これらの実施例は例示を目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の技術的範囲を限定するものと解すべきでない。本明細書で引用したすべての参考文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００６３】
実施例１
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインＡの単量体、二量体及び四量体、即ちＳｕＲｅリガンドドメイン（以下、それぞれｚ１、ｚ２及びｚ４と名付ける）を固定化したアガロース系媒体プロトタイプの性能を以下の方法で比較することであった。
−ＣＨＯ細胞培養で発現された２種のモノクローナル抗体に対する動的結合容量の測定。
−各種のリガンドを用いて得られた溶出ｐＨの比較。
−１０％漏出点における動的結合容量の７０％の試料ロード量での宿主細胞タンパク質のクリアランスの測定。
【００６４】
１．実験
１．１ 媒体プロトタイプ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ：Ｌｏｔ ３１２２５７（リガンド密度５．６ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ１：Ｕ１９７５０９５（リガンド密度１．６４ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ２：Ｕ１９７５０９８（リガンド密度３．４６ｍｇ／ｍｌ）。
【００６５】
１．２ 化学薬品及び試料
ＰＢＳ緩衝液、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ。
ＮａＯＨ、Ｍｅｒｃｋ社、１．０６６４９．１０００。
クエン酸三ナトリウム無水物、Ｍｅｒｃｋ社、１．０６４４８．１０００。
ＭＡｂ１、宿主細胞清澄化供給液（ＨＣＣＦ）、１．１ｍｇ ＭＡｂ／ｍｌ。
ＭＡｂ２、宿主細胞清澄化供給液、１．８ｍｇ ＭＡｂ／ｍｌ。
【００６６】
１．３ システム
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００、ＡＬ Ｅ１００。
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０、ＨＨ Ｅ１０Ｓ。
分光光度計、ＵｌｔｒｏＳｐｅｃ ３０００ ｐｒｏ。
【００６７】
２．方法
２．１ 前端分析
ＭＡｂ（ＭＡｂ１及びＭＡｂ２）を含む２種の宿主細胞清澄化供給液に関して前端分析を実施した。
【００６８】
次の６つのブロックからなる予めプログラムしたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用した。
１．５ＣＶにわたりＰＢＳ緩衝液で平衡化を行う。
２．ＭＡｂの約８０％漏出点まで供給液をロードする。
３．１０ＣＶにわたりＰＢＳ緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
４．６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．０）から６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）までの２０ＣＶ勾配中で溶出する。
５．０．３ｍｌ／分の０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて１５分間ＣＩＰを行う。
６．ＰＢＳで再平衡化を行う。
【００６９】
２９５ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて漏出量を測定した。前端分析に先立ち、カラムをバイパスさせて供給液を注入することで、供給液中のＭＡｂ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び他の成分に対応する最大吸光度値を求めた。（カラムに結合しない供給液中の成分に対応する）初期試料適用時の「プラトー通過量」をＵＶ曲線から差し引き、得られた吸光度値を用いることで、式１に従って５％、１０％及び８０％漏出点での動的結合容量を算出した。
【００７０】
式１：ＱBX%＝（Ｖx%−Ｖ0）Ｃ0／Ｖc
式中、Ｖx%＝ｘ％漏出点での適用試料体積、Ｃo＝試料濃度（ｍｇ／ｍｌ）、Ｖc＝幾何学的総容積（ｍｌ）、Ｖo＝ボイド容積。
【００７１】
２．２ ＨＣＰクリアランス
ＱB10%値の７０％の最終ロード量まで試料を適用した。非結合物質を洗浄除去した後、６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．５）で溶出を行った。溶出画分をプールし、１／１０容の０．２Ｍリン酸ナトリウム、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ８．０）で希釈した。次いで、Ｇｙｒｏｓ法を用いて試料のＨＣＰ含有量を分析した。上澄み液の吸光度を２８０ｎｍで測定した。ランベルト−ベールの法則（式２）を用いてＭＡｂ濃度を算出した。次いで、ｎｇ／ｍｌ単位のＨＣＰ濃度をｍｇ／ｍｌ単位のＭＡｂ濃度で割ることでｐｐｍ単位のＨＣＰ濃度を求めた。
【００７２】
式２：Ａ＝Ｃ・ｌ・ε
式中、Ｃ＝タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ａ＝２８０ｎｍでの吸光度、ｌ＝光路長（ｃｍ）＝１、ε＝吸光係数（ｍｇ・ｍＬ-1・ｃｍ-1）＝１．７。
【００７３】
式３に従って収率を算出した。
【００７４】
式３：収率（％）＝１００・（Ｖpool・Ｃpool）／（Ｖin・Ｃ0）
式中、Ｖpool＝プールした画分の体積、Ｃpool＝プール中のＭＡｂ濃度、Ｖin＝カラム上にロードした試料の体積、Ｃ0＝試料濃度（ｍｇ／ｍｌ）。
【００７５】
２．３ 分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる純度の測定
マニュアルに従った標準的方法により、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出緩衝液はＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＳＩＧＭＡ社）であり、試料体積は２５μｌであった。ＭＡｂの純度はクロマトグラムの積分によって求めた。
【００７６】
３．結果及び考察
３．１ 前端分析
３．１．１ ＭＡｂ１
５％、１０％及び８０％漏出点に関して動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表１ａに示す。５％及び１０％漏出点でのＤＢＣはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ｚ４）及びｚ２に関しては同等であったが、ｚ１に関する値は低かった。しかし、表１ｂに示される通り、ｚ単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量（即ち、ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンドとして表した容量）が得られた（即ち、ｚ１＞ｚ２＞ｚ４）。
【００７７】
ＱB10%／ＱB80%の比較を動力学の尺度として使用した（高い値ほど速い動力学を表す）。結果は、ｚ１又はｚ２に比べ、ｚ４に関してやや遅い動力学が得られたことを示している。
【００７８】
ｐＨ勾配中での溶出では、ｚ４及びｚ２に関してはほぼ同じようｐＨ（ｐＨ３．６〜３．７）が得られたのに対し、ｚ１からはやや高いｐＨ（ｐＨ４．０）でＭＡｂが溶出した。
【００７９】
また、１〜２．４分の様々な滞留時間でもＤＢＣを測定した。予想された通り、ＤＢＣは滞留時間が短いほど（即ち、流速が大きいほど）減少する。しかし、ＤＢＣの減少はｚ４に比べてｚ２で少なく、ｚ１ではさらなる改善が得られる（表１ａ）。したがって、ＤＢＣの減少を最小にするには単量体リガンドが好ましい。
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
３．１．２ ＭＡｂ２
２．４分の滞留時間で前端分析を実施し、５％、１０％及び８０％漏出点に関して動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表２ａに示す。ＭＡｂ１と同じく、５％及び１０％漏出点でのＤＢＣはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ｚ４）及びｚ２に関しては同等であったが、ｚ１に関しては低い値が得られた。上記の通り、ｚ単位が少ないリガンドほど高い相対容量が得られた（即ち、ｚ１＞ｚ２＞ｚ４）。ＱB10%／ＱB80%を比較すれば、ｚ単位が少ないリガンドほど速い動力学が得られることがわかる（即ち、ｚ４＜ｚ２＜ｚ１）。
【００８２】
ｐＨ勾配中での溶出では、ｚ２に比べてｚ１で僅かに高い溶出ｐＨが得られた（ｚ４に関しては実験誤差のために値が得られなかった）。
【００８３】
【表３】
【００８４】
【表４】
３．２ ＨＣＰクリアランス
ＱB10%値の７０％の最終ロード量まで試料を適用し、溶出プールをＨＣＰ含有量について分析し、またＳｕｐｅｒｄｅｘ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。ＭＡｂ１及びＭＡｂ２の精製に関して得られた結果を表３に示す。ＨＣＰのクリアランスはｚ１、ｚ２及びｚ４に関してほぼ同等であった。しかし、ＨＣＰの相対低減率（即ち、Ｃstart material／Ｃpool）及び％収率はＭＡｂ２よりもＭＡｂ１について高かった。
【００８５】
両ＭＡｂに関する溶出プールは、分析用サイズ排除クロマトグラフィーで測定して４．４〜６．８％の二量体／凝集体を含んでいた。様々なリガンドに関しては、明確な傾向を認めることはできなかった。ｚ２媒体からより高いｐＨ（即ち、３．５の代わりに３．７５のｐＨ）でＭＡｂ２を溶出したところ、低い収率と共に、ＨＣＰ及び二量体／凝集体のやや高い低減率が得られた。
【００８６】
【表５】
４．結論
ｚ４及びｚ２に関しては最も高い動的結合容量が得られた。最も低いリガンド密度（１．６４ｍｇ／ｍｌ）を有するｚ１に関しては、最も低い容量が得られた。しかし、ｚ単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量（ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンド）が得られた。
【００８７】
ｚ単位が少ないリガンドを結合したアガロース系媒体プロトタイプに関しては、滞留時間が減少するほど速い動力学及び少ない動的結合容量減少が得られた。したがって、短い滞留時間における容量減少はｚ１で最も少なかった。
【００８８】
両ＭＡｂに関する溶出ｐＨは、ｚ１でやや高かった。高い溶出ｐＨは、低いｐＨで凝集しやすいＭＡｂにとって有利である得る。
【００８９】
ＨＣＰのクリアランスはｚ１、ｚ２及びｚ４に関してほぼ同等であった。
【００９０】
実施例２
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインＡの様々なバージョン、即ちＺドメインの単量体、二量体及び四量体（以下、それぞれＺ１、Ｚ２及びＺ４と名付ける）を結合したアガロース系媒体プロトタイプの性能を以下の方法で比較することであった。
−「ＭＡｂ３」に対する動的結合容量の測定。
−１０％漏出点における動的結合容量の７０％の試料ロード量での宿主細胞タンパク質のクリアランスの測定。
【００９１】
１．実験
１．１ クロマトグラフィー媒体及びフィルター
ＨＦＡ３５ Ｚ４：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｂａｔｃｈ １０００７５８９（リガンド密度５．９ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ１：Ｕ１９７５０９５（リガンド密度１．６４ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ２：Ｕ１９７５０９８（リガンド密度３．４６ｍｇ／ｍｌ）。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、２８−９０６５−６３。
【００９２】
１．２ 化学薬品
ＰＢＳ緩衝液、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ。
ＮａＣｌ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６４０４．１０００。
ＮａＯＨ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６６４９．１０００。
クエン酸、ＭＥＲＣＫ社、１．００２４４．０５００。
アセトン、ＭＥＲＣＫ社、１．０００１４．２５１１。
原料デキストラン、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ロット番号なし）。
ＥＬＩＳＡ用試料の希釈のための保存溶液：０．２Ｍリン酸ナトリウム，１％ＢＳＡ，０．５％Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ８）。
宿主細胞清澄化供給液（ＨＣＣＦ）中のＭＡｂ３［ＶＨ３］、３ｍｇ／ｍｌ（吸光係数１．４）。
【００９３】
１．３ システム
実施例１参照。
【００９４】
２．方法
２．１ 前端分析
ＭＡｂ３に関して前端分析を実施した。次の６つのブロックからなる予めプログラムしたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用した。
１．５ＣＶにわたりＰＢＳ緩衝液で平衡化を行う。
２．ＭＡｂの＞１０％漏出点まで供給液をロードする。
３．１０ＣＶにわたり平衡化緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
４．６ＣＶにわたり６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．５）で溶出する。
５．０．３ｍｌ／分の０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて１５分間ＣＩＰを行う。
６．平衡化緩衝液で再平衡化を行う。
本質的に実施例１に記載したようにして、２９５ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて漏出量を測定した。式１に従って１０％漏出点での動的結合容量を算出した。
【００９５】
２．２ ＨＣＰクリアランス
ＱB10%値の７０％の最終ロード量まで試料を適用した。非結合物質を洗浄除去した後、０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ３．３）で溶出を行った。溶出画分をプールし、１／１０容の保存溶液で希釈した。次いで、２．３記載の分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって試料のＨＣＰ含有量及び凝集体含有量を分析した。上澄み液の吸光度を２８０ｎｍで測定した。ランベルト−ベールの法則（式２）を用いてＭＡｂ濃度を算出した（ε＝吸光係数（ｍｇ・ｍＬ-1・ｃｍ-1）＝１．４）。次いで、ｎｇ／ｍｌ単位のＨＣＰ濃度をｍｇ／ｍｌ単位のＭＡｂ濃度で割ることでｐｐｍ単位のＨＣＰを求めた。
【００９６】
式３に従って抗体収率を算出した。
【００９７】
２．３ 分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる純度の測定
実施例１参照。
【００９８】
３．結果及び考察
３．１ 前端分析
１０％漏出点において、様々な滞留時間（１分、２．４分及び６分）での動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表４及び図１に示す。最も高いＤＢＣはＺ４（即ち、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）に関して得られ、次いでＺ２であった。最も低いＤＢＣはＺ１に関して得られた。しかし、表５に示される通り、ｚ単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量（即ち、ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンド）が得られた（Ｚ１＞Ｚ２＞Ｚ４）。この結果は、実施例１で得られた以前の結果に一致している。
【００９９】
【表６】
【０１００】
【表７】
３．２ ＨＣＰクリアランス、収率及び純度
２．４分の滞留時間において、１０％漏出点でのＤＢＣの７０％の最終ロード量まで試料を適用し、溶出プールをＨＣＰ含有量について分析し、またＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。結果を表６に示す。ＨＣＰのクリアランス、収率並びに高分子量及び低分子量物質のレベルは、Ｚ１、Ｚ２及びＺ４に関してほぼ同等であった。
【０１０１】
対照実験として、出発原料及びＨＦＡ３５ Ｚ１からの通過画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。通過液プール中にＭＡｂはほとんど検出できなかった。
【０１０２】
【表８】
実施例３
Ｆｃ結合タンパク質は、２種のタンパク質を化合させることで製造される組換えＤＮＡ薬物（融合タンパク質）である。それはヒトの可溶性ＴＮＦαレセプターをヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ1）のＦｃ成分に結合する。それは１５０ｋＤａの分子量を有する大きい分子であり、ＴＮＦαに結合して、ヒト及び他の動物における過度の炎症を伴う疾患（強直性脊椎炎、若年性間接リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ及び潜在的には過剰のＴＮＦαによって媒介されるその他各種の疾患のような自己免疫疾患を含む）でのそれの役割を減少させる。この治療学的ポテンシャルは、ＴＮＦαが多くの有機系において炎症応答の「マスターレギュレーター」であることに基づいている。
【０１０３】
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインＡの様々なバージョン、即ちＺドメインの単量体、二量体及び四量体（以下、それぞれＺ１、Ｚ２及びＺ４と名付ける）を結合したＨＦＡ３５系媒体プロトタイプの性能を、清澄化ＣＨＯ細胞培養物上澄み液に発現されたＦｃ融合タンパク質に対する動的結合容量を測定することで比較することであった。
【０１０４】
１．実験
１．１ クロマトグラフィー媒体及びフィルター
ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ロット１００２１３４６。
プレフィルター：５μｍポリプロピレンフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＡＮ５００４７００。
他の媒体に関しては、実施例２を参照されたい。
【０１０５】
１．２ 化学薬品
ＴＲＩＳ、ＭＥＲＣＫ社、１．０８３８２．１０００。
ＰＢＳ緩衝液、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ。
ＮａＣｌ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６４０４．１０００。
ＮａＯＨ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６６４９．１０００。
ＮａＮ3、ＭＥＲＣＫ社、Ｋ２８０６７８８。
ＨＣｌ、ＭＥＲＣＫ社、１．０９９７３．００１。
酢酸、ＭＥＲＣＫ社、１．０００６３．２５１１。
アセトン、ＭＥＲＣＫ社、１．０００１４．２５１１。
原料デキストラン、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ロット番号なし）。
ＣＨＯ細胞培養物上澄み液由来のＦｃ融合タンパク質を含む供給液。この供給液は、０．４８ｍｇ／ｍｌのＦｃ融合タンパク質１を含んでいた。
精製Ｆｃ融合タンパク質。
ＭＡｂ３。
【０１０６】
１．３ システム
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００、ＡＬ Ｅ１００。
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００、ＡＬ Ｌ１００。
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０、ＬＫ−Ｅ １０ＸＴ。
【０１０７】
２．方法
２．１ 試料の前処理
ＣＨＯ細胞培養物上澄み液を５μｍプレフィルターで濾過した。ＮａＮ3を０．０５％（ｗ／ｖ）の最終濃度に添加した。試料を冷蔵庫内に約６℃で貯蔵した。
【０１０８】
２．２ 前端分析
Ｆｃ融合タンパク質供給液に関して前端分析を実施した。次の６つのブロックからなる予めプログラムしたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用した。
１．５ＣＶにわたり２５ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化を行う。
２．融合タンパク質の＞１０％漏出点まで供給液をロードする。（低供給液濃度（０．４８ｍｇ Ｔ２／ｍｌ）のため、漏出量をＵＶ信号でモニターできたことに注意されたい。１．３ｍｌ画分を集め、下記のようにして分析した。）
３．１０ＣＶにわたり平衡化緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
４．６ＣＶにわたり０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３．６）で溶出する。
５．０．４ｍｌ／分の０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて１５分間ＣＩＰを行う。
試料ロード時に、上記と同じ緩衝液を使用しながらＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上で選択された画分を分析した。溶出ピークを積分し、ｍＡＵ×ｍｌ単位のピーク面積を出発原料に関するピーク面積と比較した。１０％漏出点で適用された体積（Ｖ10%）を、出発原料のピーク面積の１０％を有する画分から画定した。次いで、式１に従って動的結合容量（ＱB10%）を算出した。
【０１０９】
２．３ サイズ排除クロマトグラフィー
実施例１と同様にして分析用サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【０１１０】
各試料の保持体積（ＶR）はピーク頂点で求めた。ボイド容積（Ｖ0）は約５％の原料デキストランを用いて求め、総液体体積（Ｖt）はＰＢＳ緩衝液中５％アセトンを用いて求めた。
【０１１１】
分配係数（ＫD）は、所定の溶質種の拡散のために利用可能な固定相の分率を表す（Ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ Ｊ−ＣＪａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｌ Ｒｙｄｅｎ，ＶＨＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９．，Ｃｈ．３．）中のＬａｒｓ Ｈａｇｅｌ，Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）。次の式４に従ってＫDを算出した。
【０１１２】
ＫD＝（ＶR−Ｖ0）／Ｖｐ＝（ＶR−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）
式中、Ｖｐ＝細孔容積（＝Ｖt−Ｖ0）。
【０１１３】
３．結果及び考察
１０％漏出点において、２種の滞留時間（即ち、２．４分及び６分）でのＦｃ融合タンパク質に対する動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表７に示す。ＭＡｂについての以前の結果とは対照的に、Ｆｃ融合タンパク質に対するＤＢＣはＺ４に比べてＺ１及びＺ２に関して高い。
【０１１４】
【表９】
Ｚ１はＺ４より低いリガンド密度（それぞれ１．６５ｍｇ／ｍｌ及び５．９ｍｇ／ｍｌ）を有するものの、Ｚ１に関するＤＢＣは特に短い滞留時間で高い。また、Ｚ２（リガンド密度３．４６ｍｇ／ｍｌ）は、特に長い滞留時間でＺ４より高いＤＢＣを有する。最も高い相対容量（即ち、ｍｇ Ｆｃ融合タンパク質／ｍｇリガンドとして表した容量）は、Ｚ１に関して得られた（表８）。
【０１１５】
【表１０】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｆｃ融合タンパク質がＭＡｂ３より早く溶出することを示した（図２）。Ｆｃ融合タンパク質及びＭＡｂ３に関する分配係数（ＫD）は、それぞれ０．２８及び０．４３と計算された。このように、分子量の差は小さいものの、Ｆｃ融合タンパク質はＭＡｂより遙かにバルキーな分子（即ち、大きい溶質半径を有する分子）として挙動する。
【０１１６】
実施例４
この研究の目的は、アガロース系マトリックス上の様々なｚリガンドで精製された数種のモノクローナル抗体の溶出ｐＨを検討することであった。溶出は直線的なｐＨ勾配中で実施した。溶出ｐＨはピーク最大値で測定した。単量体リガンドプロトタイプで精製した試料は、他のプロトタイプに比べて僅かに高いｐＨで溶出した。結果はまた、溶出ｐＨがリガンド密度に依存することも示した。ポリクローナルＩｇＧに関して、高い試料ロード量も検討した。高い試料ロード量が溶出ｐＨに影響を及ぼす徴候は見られなかった。
【０１１７】
溶出条件は各ＭＡｂのさらなる最適化のために有利となり得る。ＭＡｂは中性ｐＨで捕捉され、酸性ｐＨで溶出される。ＭＡｂを上昇したｐＨで溶出させることができるならば、これは低いｐＨで凝集しやすいＭＡｂにとっての利点となり得る。高い溶出ｐＨは凝集体を防止し、一層高い回収率を与える。
【０１１８】
本実施例では、我々はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅリガンドドメインの様々なアルカリ安定化ｚリガンド上にある数種の免疫グロブリン分子の溶出ｐＨを検討した。我々はまた、様々なｚリガンド上にある高ロード量のポリクローナルＩｇＧの効果も検討した。
【０１１９】
１．実験
１．１ 材料／調査ユニット
１．１．１ カラム
様々なＺリガンドを有するアガロース系媒体：
アガロース系媒体 Ｚ１：Ｕ１９７５０７７（１．９８ｍｇ／ｍｌ）。
アガロース系媒体 Ｚ２：Ｕ１９７５０９８（３．４６ｍｇ／ｍｌ）。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｚ４）、ロット：３１２２５７（５．６ｍｇ／ｍｌ）。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｚ４）、ロット：３０６９２８（５．６ｍｇ／ｍｌ）。
【０１２０】
結合容量
【０１２１】
【表１１】
１．１．２ 緩衝液
１０ｍＭ リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ）。
６０ｍＭ クエン酸Ｎａ ｐＨ６（クエン酸Ｎａ Ｍ．２９４．１ｇ／ｍｏｌ）、ＨＣｌでｐＨ調整。
６０ｍＭ クエン酸Ｎａ ｐＨ３（クエン酸Ｎａ Ｍ．２９４．１ｇ／ｍｏｌ）、ＨＣｌでｐＨ調整。
０．３Ｍ ＮａＯＨ。
【０１２２】
１．１．３ 試料
すべての試料は純粋画分であった。緩衝液交換のためにはＰＤ−１０カラムを使用した。
ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社、ｇａｍｍａｎｏｒｍ）。
Ｍａｂ１。
Ｍａｂ２。
Ｆｃ融合タンパク質、ロット：１５１０。
ＩｇＧを含むＣＨＯ細胞上澄み液。
ＭＡｂ４（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ上で精製）。
ＭＡｂ３。
０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ媒体の試料をロードした。
【０１２３】
１．２ 方法
ＵＮＩＣＯＲＮ法
平衡化： ５ＣＶ。
試料体積： １ｍｌ（低ロード量）。
非結合試料の洗浄除去： ５ＣＶ。
溶出（勾配ｐＨ６〜ｐＨ３）： ２０ＣＶ。
再平衡化： ５ＣＶ。
滞留時間： ２．４分。
溶出は直線的なｐＨ勾配中で実施した。溶出ｐＨはピーク最大値で測定した。
【０１２４】
１．３ 装置
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０、ＴＦ＿Ｅ１０。
分光光度計、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｘｔｒａｍａｘ ＰＬＵＳ。
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｓｅｖｅｎ Ｅａｓｙ。
【０１２５】
２．結果
様々なｚリガンドプロトタイプ（即ち、様々なリガンド密度を有する単量体（Ｚ１）、二量体（Ｚ２）及びＳｕＲｅ（ｚ４））上で７種のＭＡｂ及びＦｃ結合タンパク質を精製した。プロトタイプＳｕＲｅ（１．３７ｍｇ／ｍｌ）上で溶出させたＦｃ融合タンパク質及びＭａｂ１のｐＨ値は、このカラム上での他の試料と異なっている。その説明は、これら２種の試料が適用前に凍結／解凍されたことにあるのかもしれない。
【０１２６】
ＭＡＢ３及びＭａｂ４試料は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ媒体（ｒプロテインＡ）上で精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ上でのＭＡＢ３の溶出ｐＨは、予想された通り、他のｚプロトタイプ上より低かった。ＭＡＢ３はＶＨ３部分を含んでいて、Ｆｃ部分及びＶＨ３部分は共にＭａｂＳｅｌｅｃｔ媒体に結合し、溶出のためには一層低いｐＨが必要とされる。
【０１２７】
結果は、リガンド密度に対する溶出ｐＨの依存性を示している。試料を単量体リガンドプロトタイプ上で精製した場合、それは他のプロトタイプに比べて僅かに高いｐＨで溶出した（図３）。
【０１２８】
図３は、各種のｚプロトタイプ上に適用した様々なＭＡｂ及びＦｃ融合タンパク質（低ロード量）の溶出ｐＨを示している。結果は、溶出ｐＨがリガンド密度に依存することを示している。単量体リガンドプロトタイプ上で精製した試料は、他のプロトタイプに比べて僅かに高いｐＨで溶出した。ポリクローナルＩｇＧに関して、高い試料ロード量も検討した。高い試料ロード量が溶出ｐＨに影響を及ぼす徴候は見られなかった。
【０１２９】
単量体リガンドプロトタイプからＭＡｂを溶出させるために一層高い溶出ｐＨが必要とされるので、これは溶出段階中の凝集を回避するために有利である。この特性及び他の特性により、単量体はアフィニティークロマトグラフィー用の良好なリガンドとなる。
【０１３０】
上記の実施例は本発明の特定の態様を例示ものであり、いかなる点でもその技術的範囲を限定することはなく、そのように解すべきでない。上記に示した本発明の教示の恩恵を受ける当業者は、それに対して多数の修正を行うことができる。これらの修正は、添付の特許請求の範囲に示す本発明の技術的範囲内に包含されると解すべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はアフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、さらに具体的には単量体又は二量体リガンドを含む分離マトリックスに関する。本発明はまた、前述のマトリックスを用いて興味深いタンパク質を分離する方法であって、容量が増加しかつ溶出ｐＨが上昇するという利点を有する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、世界中の団体によって製造又は開発されている最も普及したバイオ医薬品を代表している。それに対する高い商業的需要、したがってこの特定の治療薬市場の高い価値のため、製薬会社は関連するコストを抑制しながらそれぞれのｍＡｂ製造プロセスの生産性を最大化することに重きを置いてきた。大抵の場合、これらの免疫グロブリン分子（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体）の精製における基本段階の１つとしてアフィニティークロマトグラフィーが使用される。特に興味深い部類の親和性試薬は免疫グロブリン分子の不変部に特異的に結合できるタンパク質であり、かかる相互作用は抗体の抗原結合特異性とは無関係である。かかる試薬は、特に限定されないが血清又は血漿製剤或いは細胞培養物由来の供給原料のような様々な試料からアフィニティークロマトグラフィーで免疫グロブリンを回収するのに広く使用できる。かかるタンパク質の一例は、様々な種のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ及びＦａｂ部分に結合できるドメインを含んだブドウ球菌プロテインＡである。
【０００３】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）系試薬は、その高い親和性及び選択性のため、バイオテクノロジー分野で（例えば、抗体の捕捉及び精製並びに検出のためのアフィニティークロマトグラフィーで）広く用いられてきた。現在、ＳｐＡ系アフィニティー媒体は恐らく細胞培養物由来の工業用供給原料をはじめとする様々な試料からモノクローナル抗体及びそのフラグメントを単離するために最も広く使用されているアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡリガンドを含む各種のマトリックスが市販されており、例えば、天然プロテインＡの形態のもの（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン、ウプサラ））、組換えプロテインＡからなるもの（例えば、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）などがある。さらに具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で行われている遺伝子操作は、担体に対するそれの結合を容易にすることを目的としたものである。
【０００４】
これらの用途では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途と同じく、夾雑物を確実に除去することに包括的な注意を払う必要がある。かかる夾雑物とは、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウィルスをはじめとする所望されない生体分子や微生物のように、クロマトグラフィー操作で固定相又はマトリックスに吸着された非溶出性の分子であり得る。かかる夾雑物のマトリックスからの除去は、マトリックスを再生してから引き続いて使用するため、所望生成物の最初の溶出の後に行われるのが普通である。かかる除去では、通常クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる操作が行われ、その際には固定相から夾雑物を溶出することのできる試薬が使用される。かかる試薬として多用されるものには、前記固定相に流されるアルカリ性溶液がある。現時点で最も多用されている洗浄消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は汚染の程度及び性質に応じて０．１Ｍから例えば１Ｍの範囲にわたり得る。この方法では、マトリックスが１３を超えるｐＨ値に暴露されることを伴う。タンパク質系の親和性リガンドを含む多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに関しては、かかるアルカリ性環境は極めて過酷な条件であり、そのために関連する高ｐＨでのリガンドの不安定性によって容量低下を生じる。
【０００５】
そこで、アルカリ性ｐＨ値に耐える能力の向上した人工タンパク質リガンドの開発に集中して多大の研究が行われてきた。例えば、Ｇｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ（Ｓｕｓａｎｎｅ Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ−Ａｋｅ Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０（２０００），１６９−１７８）は、アルカリ環境における連鎖球菌のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためのタンパク質工学を示唆している。Ｇｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌは、４つのアスパラギン残基のすべてをロイシン（１残基）、アスパラギン酸（２残基）及びリシン（１残基）で置換したＡＢＤの変異体を作成した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌは、この変異体が天然タンパク質と同様の標的タンパク結合挙動を示すこと、及び人工リガンドを含むアフィニティーカラムがアルカリ性条件に繰返し暴露した後でも非人工親リガンドを用いて調製したカラムより高い結合容量を示すことを報告している。かくして、構造及び機能に顕著な影響を与えることなしに４つのアスパラギン残基のすべてを置換できると結論されている。
【０００６】
最近の研究は、プロテインＡ（ＳｐＡ）に変更を加えることで同様な性質に影響を及ぼし得ることを示している。米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号には、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、かかる変異は、ＳｐＡのＢドメイン又はプロテインＺ（ＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物（米国特許第５，１４３，８４４号））のような親ＳｐＡに比べて、約１３〜１４のｐＨ値にまで向上した化学的安定性を付与することが開示されている。著者らは、これらの変異タンパク質を親和性リガンドとして使用した場合、分離媒体は予想される通りアルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐え得ることを示している。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、変異したリガンドがプロテアーゼに一層よく耐え、したがって分離プロセスでのリガンドの漏れを低減させ得ることを示している。別の出願である米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリ安定性のＳｐＡドメインをさらに、例えばＧ２９Ａ変異により、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性は保持するように改変し得ることを示している。
【０００７】
歴史的には、５つのＩｇＧ結合ドメインを含む天然プロテインＡが、すべてのプロテインＡアフィニティー媒体の製造に使用されていた。組換え技術を用いて多数のプロテインＡ構築物が製造されてきたが、これらはいずれも４つ又は５つのＩｇＧ結合ドメインを含んでいた。
【０００８】
したがって、当技術分野では、より小さい反復数を有しながら四量体と同様な又は増加した結合容量を有するタンパク質リガンドを含む分離マトリックスを得ることが要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号明細書
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的の１つは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを好ましくはそのＦｃフラグメントを介して結合し得るタンパク質リガンドを含んでなるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供することである。これらのリガンドは単量体又は二量体として提示され、大きい反復数を有する多量体リガンド（例えば、五量体リガンド）に比べて高い相対結合容量を有する。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明のアフィニティーマトリックスを用いて１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を分離する方法を提供することである。単量体又は二量体の親和性リガンドを使用することで、本方法は意外にも標的分子に対する相対結合容量の増加を達成する。さらに、単量体リガンドを使用すれば溶出ｐＨが上昇する。
【００１２】
かくして本発明は、純粋な免疫グロブリン画分のような精製生成物又は別法として免疫グロブリンを除去した後の液体を製造する方法、或いは試料中における免疫グロブリンの存在を検出する方法を提供する。本発明のリガンドは容量の増加を示し、したがってかかるリガンドはコスト効率のよいラージスケール操作のための魅力的な候補品となる。
【００１３】
上述した目的の１以上は、添付の特許請求の範囲中に記載したようにして達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｚ１（破線）、Ｚ２（点線）及びＺ４（実線）に関する６分の滞留時間で記録した漏出曲線を示している。
【図２】図２は、Ｆｃ融合タンパク質（実線）及びＭＡｂ３（点線）に関するＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーを示している。
【図３】図３は、様々なＭＡｂ及びＦｃ融合タンパク質の低負荷量を各種のｚプロトタイプ上に適用した場合の溶出ｐＨを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書中で「タンパク質」という用語は、タンパク質並びにそのフラグメントを記述するために使用される。即ち、三次元構造を示すアミノ酸の連鎖が「タンパク質」という用語に包含され、したがってタンパク質フラグメントも包含される。
【００１６】
本明細書中では、タンパク質の「機能的変異体」という用語は、機能（本発明に関しては親和性及び安定性と定義される）が本質的に保持されている変異タンパク質を意味する。そこで、前記機能とは無関係の１以上のアミノ酸が置換されていてもよい。
【００１７】
本明細書中で「親分子」という用語は、本発明の変異が導入される前の対応タンパク質に関して使用される。
【００１８】
「構造的安定性」という用語は分子の三次元形態の健全性をいい、「化学的安定性」という用語は化学的分解に耐える能力をいう。
【００１９】
「Ｆｃフラグメント結合」タンパク質という用語は、当該タンパク質が免疫グロブリンのＦｃフラグメントに結合できることを意味する。ただし、Ｆｃフラグメント結合タンパク質が免疫グロブリンのＦａｂ領域のような他の領域にも結合できることを排除するものではない。
【００２０】
本明細書中では、アミノ酸について、その正式名称で記載しないときには慣用の一文字略号で表す。
【００２１】
本明細書中では、変異は置換位置の番号の前に野生型又は非変異型アミノ酸を付し、その後に変異したアミノ酸を付して定義する。例えば、２３位のアスパラギンのスレオニンへの変異はＮ２３Ｔと記載される。
【００２２】
一態様では、本発明は、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、（ｂ）免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでなる方法に関する。この方法では、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺのような単量体リガンドを使用することで免疫グロブリン分子に対するリガンドの結合容量の増加が得られる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、（ｂ）免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでなる方法に関する。この方法では、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺのような二量体リガンドを使用することで免疫グロブリン分子に対するリガンドの結合容量の増加が得られる。
【００２４】
免疫グロブリン結合タンパク質（即ち、リガンド）は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）又は連鎖球菌プロテインＧ（ＳｐＧ）のような、天然の免疫グロブリン結合能力を有する任意のタンパク質であり得る。他のかかるタンパク質の総説に関しては、例えば、Ｋｒｏｎｖａｌｌ，Ｇ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｋ．Ｒｅｃｅｐｔｉｎｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｒｍ ｆｏｒ ａｎ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１９９９ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１２（１）：３８−４４を参照されたい。単量体又は二量体リガンドは、ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの１以上を含み得る。さらに好ましくは、リガンドはプロテインＡのドメインＢ又は人工的に作製されたプロテインＺを含む。
【００２５】
一実施形態では、リガンドは、例えばＳｐＡドメインＢ又はプロテインＺの１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定化される。前述の通り、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号には、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、かかる変異は高ｐＨでの向上した化学的安定性をもたらすことが開示されている。さらに、これらのリガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐えることができる。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、変異したリガンドがプロテアーゼに一層よく耐え、したがって分離プロセスでのリガンドの漏れを低減させ得ることを示している。これらの出願の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなしている。
【００２６】
別の実施形態では、こうして製造されたリガンドは、抗体のＦｃ部分に対して親和性を有するが、抗体のＦａｂ部分に対する実質的な親和性を欠いている。若干の実施形態では、リガンドの１以上のグリシンがアラニンで置換されている。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリ安定性ドメインをさらに、例えばＧ２９Ａ変異により、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性は保持するように改変し得ることを示している。この出願の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなしている。本明細書中で使用されるアミノ酸の番号付けはこの技術分野で通常使用されているものであり、当業者は変異させるべき位置を容易に認識できよう。
【００２７】
有利な実施形態では、ドメインＢのアルカリ安定性が１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されていると共に、アルカリ安定性ドメインＢの２９位のアミノ酸残基の変異（例えば、Ｇ２９Ａ変異）が含まれる。
【００２８】
別の実施形態では、リガンドは、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性が達成されたプロテインＺである。有利な実施形態では、アルカリ安定性は少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている。別の実施形態では、アルカリ安定性タンパク質はアルカリ性条件下で実質的に安定な天然のタンパク質である。
【００２９】
当業者には、アルカリ安定性及びＧ−Ａ変異を生み出すための変異は、通常の分子生物学的技法を用いて任意の順序で実施できることが容易に理解されよう。さらに、かかるリガンドは、変異したタンパク質リガンドをエンコードする核酸配列を含むベクターによって発現させることができる。別法として、かかるリガンドはタンパク質合成技法によっても製造できる。所定配列のペプチド及びタンパク質を合成する方法は、当技術分野で公知であって一般に利用できる。
【００３０】
かくして、本発明では、「ブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定性ドメインＢ」という用語は、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号及び同第２００６／０１９４９５０号に記載されている変異タンパク質のような、ＳｐＡのドメインＢに基づくアルカリ安定化タンパク質、並びに他の起源を有するが機能的に同等なアミノ酸配列を有する他のアルカリ安定性タンパク質を意味する。
【００３１】
当業者には理解される通り、発現されたタンパク質は、担体に固定化する前に適当な程度まで精製すべきである。かかる精製方法は当技術分野で公知であり、担体へのタンパク質系リガンドの固定化は標準的な方法を用いて容易に実施される。好適な方法及び担体は以下に一層詳しく記載される。
【００３２】
したがって一実施形態では、本発明の変異タンパク質は、アスパラギン変異が２１位にないことを条件として、配列番号１又は配列番号２で規定される配列の約７５％以上、例えば８０％以上、好ましくは９５％以上を含んでいる。
【００３３】
本明細書中では、次の配列番号１はＳｐＡのＢドメインのアミノ酸配列を規定する。
Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ。
次の配列番号２はプロテインＺとして知られるタンパク質を規定する。
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ。
【００３４】
プロテインＺは、２９位のグリシンがアラニンに置換されたＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物である。例えば、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｃ．Ｆｌｅｃｋｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｗ．Ｄｒｅｗ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８−２２のＳｔａｈｌ ｅｔ ａｌ， １９９９： Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを参照されたい。
【００３５】
一実施形態では、上述の変異タンパク質は配列番号１又は配列番号２で規定されるアミノ酸配列或いはその機能的変異体を含んでいる。本明細書中で使用される「機能的変異体」という用語は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の親和性又はｐＨ値の上昇した環境におけるその向上した化学的安定性に影響を及ぼさないアミノ酸位置での１以上の追加変異を含む任意の類似配列を包含する。
【００３６】
有利な実施形態では、本発明の変異はＮ２３Ｔ、Ｎ２３ＴとＮ４３Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ６Ａ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ１１ＳとＮ２３Ｔ、及びＮ６ＡとＮ２３Ｔからなる群から選択され、親分子が配列番号２で規定される配列を含むものである。上述の通り、アルカリ性条件下で長期にわたって高い結合容量を有するリガンドとして有用な変異タンパク質を得るためには、２１位のアスパラギン残基の変異は回避される。一実施形態では、３位のアスパラギン残基は変異されない。
【００３７】
最も有利な実施形態では、ロイシン残基とグルタミン残基との間に位置するアスパラギン残基が例えばトレオニン残基に変異している。そこで、一実施形態では、配列番号２で規定される配列の２３位のアスパラギン残基が、例えばトレオニン残基に変異している。特定の実施形態では、配列番号２で規定される配列の４３位のアスパラギン残基も例えばグルタミン酸に変異している。アミノ酸番号４３が変異した実施形態では、当該変異をＮ２３Ｔのような別の１以上の変異と組み合わせるのが最も有利であるように思われる。
【００３８】
ＳｐＡのＢドメイン及びプロテインＺの様々なアスパラギン残基が変異タンパク質の親和性及び安定性に異なった寄与をなし得るという知見は、特にＡＢＤのすべてのアスパラギン残基を何の内的区別もなく変異させることができたと結論づけたＧｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌの上述の教示内容に鑑みれば、全く予想外であった。
【００３９】
かくして、本発明には上述の単量体型変異タンパク質が包含される。ただし、かかるタンパク質単量体を合体させて二量体、三量体、四量体、五量体などの多量体とすることもできる。したがって、本発明の別の態様は、本発明の１以上の変異タンパク質を他の１以上の単位、好ましくは同じく本発明の変異タンパク質と共に含む多量体である。かくして、本発明は例えば２つの反復単位を含む二量体である。
【００４０】
一実施形態では、本発明の多量体は好ましくは０〜１５（例えば５〜１０）のアミノ酸からなるアミノ酸ストレッチで連結した複数の単量体単位を含んでいる。かかる連結の性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的コンホメーションを不安定にすべきでない。さらに、前記連結は好ましくはアルカリ性環境中で変異タンパク質単位の特性を損なわないように十分安定であるべきである。
【００４１】
一実施形態では、本発明の単量体リガンドは次の配列番号３の配列を含んでいる。
ＡｌａＧｌｎＧｌｙＴｈｒＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎ
ＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕ
ＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓ
ＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａ
ＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＰｒｏＬｙｓＣｙｓ。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは次の配列番号４の配列を含んでいる。
ＡｌａＧｌｎＧｌｙＴｈｒＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎ
ＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕ
ＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓ
ＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａ
ＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｌａ
ＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅ
ＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａ
ＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａ
ＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎ
ＡｌａＰｒｏＬｙｓＣｙｓ。
【００４３】
本発明では意外にも、リガンドの容量を比較した場合、四量体及び二量体に関して同等な高い動的結合容量が得られた一方、単量体は最高の相対容量（ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンド）を有することが見出された。一般に、リガンドのｚ単位数が少ないほど高い相対容量が得られることが見出される。我々のデータはまた、溶出ｐＨがリガンド密度に依存することを確認している。さらに、単位リガンドプロトタイプ上で精製した試料は他のプロトタイプに比べて高いｐＨで溶出するが、これは低いｐＨで凝集しやすい免疫グロブリンにとって有利である。平均時間では、宿主細胞タンパク質のクリアランスは単量体、二量体及び四量体に関してほぼ同等である。
【００４４】
本発明ではまた、意外にも、免疫グロブリンドメインを含む融合タンパク質のような大きい単量体に対しては、単量体及び二量体に関する動的結合容量が四量体に比べて高いことも見出された。さらに、単量体に関して最高の相対容量（即ち、ｍｇタンパク質／ｍｇリガンドとして表した容量）が得られた。我々の研究では、単量体及び二量体における増加した動的結合容量は主としてリガンド密度の効果ではなく、恐らくは（比較的バルキーな融合タンパク質に対する）立体障害の減少及び／又は急速な動力学によって引き起こされる結合部位の利用度の向上によることが示されている。
【００４５】
言うまでもないが、「免疫グロブリン含有タンパク質」という用語は、抗体の結合性が実質的に維持される限り、抗体及び抗体部分を含む融合タンパク質並びに抗体フラグメント及び変異抗体を包含する。抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗体は哺乳動物種（例えば、ヒト）由来のＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭである。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、アフィニティー分離用のマトリックスであって、免疫グロブリン結合タンパク質を含む単量体又は二量体リガンドが固体担体に結合してなるマトリックスに関する。好ましくは、タンパク質の１以上のアスパラギン残基がグルタミン以外のアミノ酸に変異している。本発明のマトリックスは、四量体リガンドを含むマトリックスと比較した場合、増加した結合容量を示す。変異タンパク質リガンドは好ましくはＦｃフラグメント結合タンパク質であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ（好ましくはＩｇＧ）の選択的結合のために使用できる。
【００４７】
本発明のマトリックスは、上述したいずれかの実施形態に係る変異タンパク質をリガンドとして含むことができる。最も好ましい実施形態では、固体担体上に存在するリガンドは上述の単量体を含む。
【００４８】
本発明のマトリックスの固体担体は、任意適宜の公知タイプのものであり得る。通常のアフィニティー分離マトリックスは多くは有機質のものであり、使用する水性媒体に親水性表面が露出されたポリマー、即ちその外面に（及び存在する場合には内面にも）ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ2或いはＮ置換型）、アミノ（−ＮＨ2或いは置換型）、オリゴ又はポリエチレンオキシ基が露出されたポリマーを基材としている。一実施形態では、ポリマーは例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロースなどの多糖類系のものであり、有利には適当な多孔性及び剛性を与えるために例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、１，２，３−トリハロ置換低級炭化水素で架橋されたものであり得る。最も好ましい実施形態では、固体担体は多孔性アガロースビーズである。本発明で使用される担体は逆懸濁ゲル化（Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎ： Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４））のような標準的方法に従って容易に製造できる。別法として、ベースマトリックスはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のような市販品である。ラージスケール分離のために特に有利な実施形態では、担体は、その剛性が増大し、したがってマトリックスが高い流速に対して一層適するように改変される。
【００４９】
別法として、固体担体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの合成ポリマーを基材としている。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼン系マトリックスのように疎水性ポリマーの場合には、上述のような親水基が周囲の水性液体に露出されるようにマトリックスの表面を親水化処理することが多い。かかるポリマーは標準的方法に従って容易に製造されるが、例えば“Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ．Ａｒｓｈａｄｙ： Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ'Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０−７５ （１９８８））を参照されたい。別法として、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のような市販品が使用される。
【００５０】
別の代替法では、本発明の固体担体は、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機質の担体を含む。
【００５１】
さらに別の実施形態では、固体担体は表面、チップ、毛管又はフィルターのような別の形態を取る。
【００５２】
本発明のマトリックスの形状に関しては、一実施形態では、マトリックスは多孔性モノリスの形態である。別の実施形態では、マトリックスはビーズ又は粒子形態であり、多孔性でも非多孔性でもよい。ビーズ又は粒子形態のマトリックスは充填ベッドとして使用することもできるし、或いは懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には膨張ベッドとして知られるもの及び純然たる懸濁物が包含され、そこでは粒子又はビーズが自由に運動できる。モノリス、充填ベッド及び膨張ベッドの場合、分離手順は一般に濃度勾配による通常のクロマトグラフィーに従う。純然たる懸濁物の場合には、回分法が使用される。
【００５３】
リガンドは、例えばリガンド中に存在するアミノ基及び／又はカルボキシ基を利用した通常のカップリング技法で担体に結合できる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などがよく知られたカップリング試薬である。担体とリガンドとの間には、スペーサーとして知られる分子を導入することができ、これはリガンドの利用可能性を向上させ、担体へのリガンドの化学的カップリングを容易にする。別法として、リガンドは物理的吸着又は生物特異的吸着のような非共有結合によって担体に結合することもできる。
【００５４】
有利な実施形態では、本発明のリガンドはチオエステル結合で担体に結合されている。かかるカップリングの実施方法は当技術分野で公知であり、標準的な技法及び機器を用いて当業者が容易に実施できる。有利な実施形態では、最初に、後にカップリングで使用するための末端システイン残基をリガンドに設ける。適切な精製段階も当業者が容易に実施できる。
【００５５】
本発明の若干の実施形態では、吸着段階のための条件は常用されている任意のものであってよく、標的抗体の性質（例えば、そのｐＩ）に応じて適当に改変することができる。任意の洗浄段階は、ＰＢＳ緩衝液のような常用緩衝液を用いて実施できる。
【００５６】
溶出は、任意の常用緩衝液を用いて実施できる。有利な実施形態では、抗体の回収は、単量体リガンド系の場合に４．０〜４．４、好ましくは４．２〜４．４の範囲内のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される。同様な実施形態では、抗体の回収は、二量体リガンド系の場合に３．８〜４．２、好ましくは３．９〜４．０の範囲内のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される。このように、これらの実施形態の利点は、標的抗体が溶出に際してプロテインＡ系リガンドと共に通常使用されるｐＨ値より概して高いｐＨ値に暴露されることである。これは、大抵の抗体に関し、低いｐＨによって引き起こされる変性のリスクの低下、凝集体の減少及び標的の収量の増加をもたらすであろう。
【００５７】
本発明の方法は、例えば治療用又は診断用の抗体の精製プロトコルの第１段階として、標的抗体を捕捉するために有用である。一実施形態では、７５％以上の抗体が回収される。有利な実施形態では、８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の抗体が、二量体リガンド系に関しては３．８〜４．２及び単量体リガンド系に関しては４．０〜４．４の範囲内のｐＨを有する溶離剤を用いて回収される。本発明の方法に続いて、他のクロマトグラフィー段階のような１以上の追加段階を実施することができる。かくして、特定の実施形態では、約９８％を超える抗体が回収される。
【００５８】
ＳｐＡ又はプロテインＺリガンドに関して前述した通り、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、これらの変異リガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐えることができる（米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号）。向上した安定性は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の初期親和性が長期にわたって本質的に保持されることを意味する。したがって、その結合容量はアルカリ性環境中では親分子の結合容量よりゆっくりと減少する。かかる環境はアルカリ性と定義することができ、ｐＨ値の上昇した環境を意味する。例えば、約１０超から約１３又は１４までのｐＨ値（即ち、１０〜１３又は１０〜１４のｐＨ値）であり、これは一般にアルカリ性条件と表される。別法として、かかる条件はＮａＯＨ濃度で定義することもでき、その濃度は約１．０Ｍ以下（例えば、０．７Ｍ、特に約０．５Ｍ）、したがって０．７〜１．０Ｍの範囲内であり得る。
【００５９】
このように、免疫グロブリンに対する親和性（即ち、本発明のリガンドの結合性）、したがってマトリックスの容量は、アルカリ剤での処理によって本質的に経時的な変化を示さない。通常、アフィニティー分離マトリックスのクリーニング・イン・プレイス処理に使用されるアルカリ剤はＮａＯＨであり、その濃度は０．７５Ｍ以下（例えば、０．５Ｍ）である。したがって、０．５Ｍ ＮａＯＨで７．５時間処理した後の結合容量の低下は約７０％未満、好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは約３０％未満（例えば約２８％）である。
【００６０】
本発明の変異タンパク質の向上した化学的安定性は、当業者であれば、例えば濃度０．５ＭのＮａＯＨでの日常処理によって容易に確認できる。これに関しては、上記と同様、「向上した」安定性とは初期安定性が親分子で達成されるものよりも長期間保持されることを意味すると理解すべきである。
【００６１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の単量体リガンド、二量体リガンド又はマトリックスを使用してＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを単離する方法に関する。かくして本発明は、上述の単量体リガンド、二量体リガンド又はマトリックスへの吸着によって１種以上の標的化合物を液体から分離するクロマトグラフィープロセスを包含する。所望の生成物は分離された化合物又は液体のいずれであり得る。かくして本発明のこの態様は、広く用いられている公知の分離技法であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。簡単に述べれば、最初の工程では、標的化合物（好ましくは上述の抗体）を含む溶液を、標的化合物が分離マトリックス上に存在するリガンドに吸着するような条件下で、前記マトリックスに流す。かかる条件は、例えばｐＨ及び／又は塩濃度（即ち、溶液中のイオン強度）によって制御される。マトリックスの容量を超えないように注意すべきであり、換言すれば、流速は満足すべき吸着が起こるように十分遅くすべきである。この段階では、溶液の他の成分は原則として妨害されずに通過する。任意には、保持された物質及び／又は緩く結合した物質を除去するため、次いでマトリックスが例えば水溶液で洗浄される。本発明のマトリックスは、溶剤、塩又は洗浄剤或いはこれらの混合物を用いる中間洗浄段階と共に使用するのが最も有利である。次の段階では、溶離剤といわれる第２の溶液を、標的化合物の脱着（即ち、遊離）が起こる条件下でマトリックスに流す。かかる条件は、通常はｐＨ、塩濃度（即ち、イオン強度）、疎水性などの変化でもたらされる。勾配溶出及び段階的溶出のような様々な溶出法が知られている。溶出はまた、マトリックス上の所望抗体に置き換わる競合物質を含む第２の溶液で達成することもできる。アフィニティークロマトグラフィーの原理に関する総説としては、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．２０００．Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７： １−６を参照されたい。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によって説明する。これらの実施例は例示を目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の技術的範囲を限定するものと解すべきでない。本明細書で引用したすべての参考文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００６３】
実施例１
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインＡの単量体、二量体及び四量体、即ちＳｕＲｅリガンドドメイン（以下、それぞれｚ１、ｚ２及びｚ４と名付ける）を固定化したアガロース系媒体プロトタイプの性能を以下の方法で比較することであった。
−ＣＨＯ細胞培養で発現された２種のモノクローナル抗体に対する動的結合容量の測定。
−各種のリガンドを用いて得られた溶出ｐＨの比較。
−１０％漏出点における動的結合容量の７０％の試料ロード量での宿主細胞タンパク質のクリアランスの測定。
【００６４】
１．実験
１．１ 媒体プロトタイプ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ：Ｌｏｔ ３１２２５７（リガンド密度５．６ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ１：Ｕ１９７５０９５（リガンド密度１．６４ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ２：Ｕ１９７５０９８（リガンド密度３．４６ｍｇ／ｍｌ）。
【００６５】
１．２ 化学薬品及び試料
ＰＢＳ緩衝液、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ。
ＮａＯＨ、Ｍｅｒｃｋ社、１．０６６４９．１０００。
クエン酸三ナトリウム無水物、Ｍｅｒｃｋ社、１．０６４４８．１０００。
ＭＡｂ１、宿主細胞清澄化供給液（ＨＣＣＦ）、１．１ｍｇ ＭＡｂ／ｍｌ。
ＭＡｂ２、宿主細胞清澄化供給液、１．８ｍｇ ＭＡｂ／ｍｌ。
【００６６】
１．３ システム
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００、ＡＬ Ｅ１００。
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０、ＨＨ Ｅ１０Ｓ。
分光光度計、ＵｌｔｒｏＳｐｅｃ ３０００ ｐｒｏ。
【００６７】
２．方法
２．１ 前端分析
ＭＡｂ（ＭＡｂ１及びＭＡｂ２）を含む２種の宿主細胞清澄化供給液に関して前端分析を実施した。
【００６８】
次の６つのブロックからなる予めプログラムしたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用した。
１．５ＣＶにわたりＰＢＳ緩衝液で平衡化を行う。
２．ＭＡｂの約８０％漏出点まで供給液をロードする。
３．１０ＣＶにわたりＰＢＳ緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
４．６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．０）から６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）までの２０ＣＶ勾配中で溶出する。
５．０．３ｍｌ／分の０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて１５分間ＣＩＰを行う。
６．ＰＢＳで再平衡化を行う。
【００６９】
２９５ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて漏出量を測定した。前端分析に先立ち、カラムをバイパスさせて供給液を注入することで、供給液中のＭＡｂ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び他の成分に対応する最大吸光度値を求めた。（カラムに結合しない供給液中の成分に対応する）初期試料適用時の「プラトー通過量」をＵＶ曲線から差し引き、得られた吸光度値を用いることで、式１に従って５％、１０％及び８０％漏出点での動的結合容量を算出した。
【００７０】
式１：ＱBX%＝（Ｖx%−Ｖ0）Ｃ0／Ｖc
式中、Ｖx%＝ｘ％漏出点での適用試料体積、Ｃo＝試料濃度（ｍｇ／ｍｌ）、Ｖc＝幾何学的総容積（ｍｌ）、Ｖo＝ボイド容積。
【００７１】
２．２ ＨＣＰクリアランス
ＱB10%値の７０％の最終ロード量まで試料を適用した。非結合物質を洗浄除去した後、６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．５）で溶出を行った。溶出画分をプールし、１／１０容の０．２Ｍリン酸ナトリウム、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ８．０）で希釈した。次いで、Ｇｙｒｏｓ法を用いて試料のＨＣＰ含有量を分析した。上澄み液の吸光度を２８０ｎｍで測定した。ランベルト−ベールの法則（式２）を用いてＭＡｂ濃度を算出した。次いで、ｎｇ／ｍｌ単位のＨＣＰ濃度をｍｇ／ｍｌ単位のＭＡｂ濃度で割ることでｐｐｍ単位のＨＣＰ濃度を求めた。
【００７２】
式２：Ａ＝Ｃ・ｌ・ε
式中、Ｃ＝タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）、Ａ＝２８０ｎｍでの吸光度、ｌ＝光路長（ｃｍ）＝１、ε＝吸光係数（ｍｇ・ｍＬ-1・ｃｍ-1）＝１．７。
【００７３】
式３に従って収率を算出した。
【００７４】
式３：収率（％）＝１００・（Ｖpool・Ｃpool）／（Ｖin・Ｃ0）
式中、Ｖpool＝プールした画分の体積、Ｃpool＝プール中のＭＡｂ濃度、Ｖin＝カラム上にロードした試料の体積、Ｃ0＝試料濃度（ｍｇ／ｍｌ）。
【００７５】
２．３ 分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる純度の測定
マニュアルに従った標準的方法により、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出緩衝液はＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＳＩＧＭＡ社）であり、試料体積は２５μｌであった。ＭＡｂの純度はクロマトグラムの積分によって求めた。
【００７６】
３．結果及び考察
３．１ 前端分析
３．１．１ ＭＡｂ１
５％、１０％及び８０％漏出点に関して動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表１ａに示す。５％及び１０％漏出点でのＤＢＣはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ｚ４）及びｚ２に関しては同等であったが、ｚ１に関する値は低かった。しかし、表１ｂに示される通り、ｚ単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量（即ち、ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンドとして表した容量）が得られた（即ち、ｚ１＞ｚ２＞ｚ４）。
【００７７】
ＱB10%／ＱB80%の比較を動力学の尺度として使用した（高い値ほど速い動力学を表す）。結果は、ｚ１又はｚ２に比べ、ｚ４に関してやや遅い動力学が得られたことを示している。
【００７８】
ｐＨ勾配中での溶出では、ｚ４及びｚ２に関してはほぼ同じようｐＨ（ｐＨ３．６〜３．７）が得られたのに対し、ｚ１からはやや高いｐＨ（ｐＨ４．０）でＭＡｂが溶出した。
【００７９】
また、１〜２．４分の様々な滞留時間でもＤＢＣを測定した。予想された通り、ＤＢＣは滞留時間が短いほど（即ち、流速が大きいほど）減少する。しかし、ＤＢＣの減少はｚ４に比べてｚ２で少なく、ｚ１ではさらなる改善が得られる（表１ａ）。したがって、ＤＢＣの減少を最小にするには単量体リガンドが好ましい。
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
３．１．２ ＭＡｂ２
２．４分の滞留時間で前端分析を実施し、５％、１０％及び８０％漏出点に関して動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表２ａに示す。ＭＡｂ１と同じく、５％及び１０％漏出点でのＤＢＣはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ｚ４）及びｚ２に関しては同等であったが、ｚ１に関しては低い値が得られた。上記の通り、ｚ単位が少ないリガンドほど高い相対容量が得られた（即ち、ｚ１＞ｚ２＞ｚ４）。ＱB10%／ＱB80%を比較すれば、ｚ単位が少ないリガンドほど速い動力学が得られることがわかる（即ち、ｚ４＜ｚ２＜ｚ１）。
【００８２】
ｐＨ勾配中での溶出では、ｚ２に比べてｚ１で僅かに高い溶出ｐＨが得られた（ｚ４に関しては実験誤差のために値が得られなかった）。
【００８３】
【表３】
【００８４】
【表４】
３．２ ＨＣＰクリアランス
ＱB10%値の７０％の最終ロード量まで試料を適用し、溶出プールをＨＣＰ含有量について分析し、またＳｕｐｅｒｄｅｘ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。ＭＡｂ１及びＭＡｂ２の精製に関して得られた結果を表３に示す。ＨＣＰのクリアランスはｚ１、ｚ２及びｚ４に関してほぼ同等であった。しかし、ＨＣＰの相対低減率（即ち、Ｃstart material／Ｃpool）及び％収率はＭＡｂ２よりもＭＡｂ１について高かった。
【００８５】
両ＭＡｂに関する溶出プールは、分析用サイズ排除クロマトグラフィーで測定して４．４〜６．８％の二量体／凝集体を含んでいた。様々なリガンドに関しては、明確な傾向を認めることはできなかった。ｚ２媒体からより高いｐＨ（即ち、３．５の代わりに３．７５のｐＨ）でＭＡｂ２を溶出したところ、低い収率と共に、ＨＣＰ及び二量体／凝集体のやや高い低減率が得られた。
【００８６】
【表５】
４．結論
ｚ４及びｚ２に関しては最も高い動的結合容量が得られた。最も低いリガンド密度（１．６４ｍｇ／ｍｌ）を有するｚ１に関しては、最も低い容量が得られた。しかし、ｚ単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量（ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンド）が得られた。
【００８７】
ｚ単位が少ないリガンドを結合したアガロース系媒体プロトタイプに関しては、滞留時間が減少するほど速い動力学及び少ない動的結合容量減少が得られた。したがって、短い滞留時間における容量減少はｚ１で最も少なかった。
【００８８】
両ＭＡｂに関する溶出ｐＨは、ｚ１でやや高かった。高い溶出ｐＨは、低いｐＨで凝集しやすいＭＡｂにとって有利である得る。
【００８９】
ＨＣＰのクリアランスはｚ１、ｚ２及びｚ４に関してほぼ同等であった。
【００９０】
実施例２
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインＡの様々なバージョン、即ちＺドメインの単量体、二量体及び四量体（以下、それぞれＺ１、Ｚ２及びＺ４と名付ける）を結合したアガロース系媒体プロトタイプの性能を以下の方法で比較することであった。
−「ＭＡｂ３」に対する動的結合容量の測定。
−１０％漏出点における動的結合容量の７０％の試料ロード量での宿主細胞タンパク質のクリアランスの測定。
【００９１】
１．実験
１．１ クロマトグラフィー媒体及びフィルター
ＨＦＡ３５ Ｚ４：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｂａｔｃｈ １０００７５８９（リガンド密度５．９ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ１：Ｕ１９７５０９５（リガンド密度１．６４ｍｇ／ｍｌ）。
ＨＦＡ３５ Ｚ２：Ｕ１９７５０９８（リガンド密度３．４６ｍｇ／ｍｌ）。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、２８−９０６５−６３。
【００９２】
１．２ 化学薬品
ＰＢＳ緩衝液、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ。
ＮａＣｌ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６４０４．１０００。
ＮａＯＨ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６６４９．１０００。
クエン酸、ＭＥＲＣＫ社、１．００２４４．０５００。
アセトン、ＭＥＲＣＫ社、１．０００１４．２５１１。
原料デキストラン、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ロット番号なし）。
ＥＬＩＳＡ用試料の希釈のための保存溶液：０．２Ｍリン酸ナトリウム，１％ＢＳＡ，０．５％Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ８）。
宿主細胞清澄化供給液（ＨＣＣＦ）中のＭＡｂ３［ＶＨ３］、３ｍｇ／ｍｌ（吸光係数１．４）。
【００９３】
１．３ システム
実施例１参照。
【００９４】
２．方法
２．１ 前端分析
ＭＡｂ３に関して前端分析を実施した。次の６つのブロックからなる予めプログラムしたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用した。
１．５ＣＶにわたりＰＢＳ緩衝液で平衡化を行う。
２．ＭＡｂの＞１０％漏出点まで供給液をロードする。
３．１０ＣＶにわたり平衡化緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
４．６ＣＶにわたり６０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．５）で溶出する。
５．０．３ｍｌ／分の０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて１５分間ＣＩＰを行う。
６．平衡化緩衝液で再平衡化を行う。
本質的に実施例１に記載したようにして、２９５ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて漏出量を測定した。式１に従って１０％漏出点での動的結合容量を算出した。
【００９５】
２．２ ＨＣＰクリアランス
ＱB10%値の７０％の最終ロード量まで試料を適用した。非結合物質を洗浄除去した後、０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ３．３）で溶出を行った。溶出画分をプールし、１／１０容の保存溶液で希釈した。次いで、２．３記載の分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって試料のＨＣＰ含有量及び凝集体含有量を分析した。上澄み液の吸光度を２８０ｎｍで測定した。ランベルト−ベールの法則（式２）を用いてＭＡｂ濃度を算出した（ε＝吸光係数（ｍｇ・ｍＬ-1・ｃｍ-1）＝１．４）。次いで、ｎｇ／ｍｌ単位のＨＣＰ濃度をｍｇ／ｍｌ単位のＭＡｂ濃度で割ることでｐｐｍ単位のＨＣＰを求めた。
【００９６】
式３に従って抗体収率を算出した。
【００９７】
２．３ 分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる純度の測定
実施例１参照。
【００９８】
３．結果及び考察
３．１ 前端分析
１０％漏出点において、様々な滞留時間（１分、２．４分及び６分）での動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表４及び図１に示す。最も高いＤＢＣはＺ４（即ち、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）に関して得られ、次いでＺ２であった。最も低いＤＢＣはＺ１に関して得られた。しかし、表５に示される通り、ｚ単位が少ないリガンドに関して最も高い相対容量（即ち、ｍｇ ＭＡｂ／ｍｇリガンド）が得られた（Ｚ１＞Ｚ２＞Ｚ４）。この結果は、実施例１で得られた以前の結果に一致している。
【００９９】
【表６】
【０１００】
【表７】
３．２ ＨＣＰクリアランス、収率及び純度
２．４分の滞留時間において、１０％漏出点でのＤＢＣの７０％の最終ロード量まで試料を適用し、溶出プールをＨＣＰ含有量について分析し、またＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。結果を表６に示す。ＨＣＰのクリアランス、収率並びに高分子量及び低分子量物質のレベルは、Ｚ１、Ｚ２及びＺ４に関してほぼ同等であった。
【０１０１】
対照実験として、出発原料及びＨＦＡ３５ Ｚ１からの通過画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。通過液プール中にＭＡｂはほとんど検出できなかった。
【０１０２】
【表８】
実施例３
Ｆｃ結合タンパク質は、２種のタンパク質を化合させることで製造される組換えＤＮＡ薬物（融合タンパク質）である。それはヒトの可溶性ＴＮＦαレセプターをヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ1）のＦｃ成分に結合する。それは１５０ｋＤａの分子量を有する大きい分子であり、ＴＮＦαに結合して、ヒト及び他の動物における過度の炎症を伴う疾患（強直性脊椎炎、若年性間接リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ及び潜在的には過剰のＴＮＦαによって媒介されるその他各種の疾患のような自己免疫疾患を含む）でのそれの役割を減少させる。この治療学的ポテンシャルは、ＴＮＦαが多くの有機系において炎症応答の「マスターレギュレーター」であることに基づいている。
【０１０３】
この研究の目的は、アルカリ安定化プロテインＡの様々なバージョン、即ちＺドメインの単量体、二量体及び四量体（以下、それぞれＺ１、Ｚ２及びＺ４と名付ける）を結合したＨＦＡ３５系媒体プロトタイプの性能を、清澄化ＣＨＯ細胞培養物上澄み液に発現されたＦｃ融合タンパク質に対する動的結合容量を測定することで比較することであった。
【０１０４】
１．実験
１．１ クロマトグラフィー媒体及びフィルター
ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ロット１００２１３４６。
プレフィルター：５μｍポリプロピレンフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＡＮ５００４７００。
他の媒体に関しては、実施例２を参照されたい。
【０１０５】
１．２ 化学薬品
ＴＲＩＳ、ＭＥＲＣＫ社、１．０８３８２．１０００。
ＰＢＳ緩衝液、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ。
ＮａＣｌ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６４０４．１０００。
ＮａＯＨ、ＭＥＲＣＫ社、１．０６６４９．１０００。
ＮａＮ3、ＭＥＲＣＫ社、Ｋ２８０６７８８。
ＨＣｌ、ＭＥＲＣＫ社、１．０９９７３．００１。
酢酸、ＭＥＲＣＫ社、１．０００６３．２５１１。
アセトン、ＭＥＲＣＫ社、１．０００１４．２５１１。
原料デキストラン、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ロット番号なし）。
ＣＨＯ細胞培養物上澄み液由来のＦｃ融合タンパク質を含む供給液。この供給液は、０．４８ｍｇ／ｍｌのＦｃ融合タンパク質１を含んでいた。
精製Ｆｃ融合タンパク質。
ＭＡｂ３。
【０１０６】
１．３ システム
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００、ＡＬ Ｅ１００。
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００、ＡＬ Ｌ１００。
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０、ＬＫ−Ｅ １０ＸＴ。
【０１０７】
２．方法
２．１ 試料の前処理
ＣＨＯ細胞培養物上澄み液を５μｍプレフィルターで濾過した。ＮａＮ3を０．０５％（ｗ／ｖ）の最終濃度に添加した。試料を冷蔵庫内に約６℃で貯蔵した。
【０１０８】
２．２ 前端分析
Ｆｃ融合タンパク質供給液に関して前端分析を実施した。次の６つのブロックからなる予めプログラムしたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用した。
１．５ＣＶにわたり２５ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化を行う。
２．融合タンパク質の＞１０％漏出点まで供給液をロードする。（低供給液濃度（０．４８ｍｇ Ｔ２／ｍｌ）のため、漏出量をＵＶ信号でモニターできたことに注意されたい。１．３ｍｌ画分を集め、下記のようにして分析した。）
３．１０ＣＶにわたり平衡化緩衝液で非結合物質を洗浄除去する。
４．６ＣＶにわたり０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３．６）で溶出する。
５．０．４ｍｌ／分の０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて１５分間ＣＩＰを行う。
試料ロード時に、上記と同じ緩衝液を使用しながらＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上で選択された画分を分析した。溶出ピークを積分し、ｍＡＵ×ｍｌ単位のピーク面積を出発原料に関するピーク面積と比較した。１０％漏出点で適用された体積（Ｖ10%）を、出発原料のピーク面積の１０％を有する画分から画定した。次いで、式１に従って動的結合容量（ＱB10%）を算出した。
【０１０９】
２．３ サイズ排除クロマトグラフィー
実施例１と同様にして分析用サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【０１１０】
各試料の保持体積（ＶR）はピーク頂点で求めた。ボイド容積（Ｖ0）は約５％の原料デキストランを用いて求め、総液体体積（Ｖt）はＰＢＳ緩衝液中５％アセトンを用いて求めた。
【０１１１】
分配係数（ＫD）は、所定の溶質種の拡散のために利用可能な固定相の分率を表す（Ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ Ｊ−ＣＪａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｌ Ｒｙｄｅｎ，ＶＨＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９．，Ｃｈ．３．）中のＬａｒｓ Ｈａｇｅｌ，Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）。次の式４に従ってＫDを算出した。
【０１１２】
ＫD＝（ＶR−Ｖ0）／Ｖｐ＝（ＶR−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）
式中、Ｖｐ＝細孔容積（＝Ｖt−Ｖ0）。
【０１１３】
３．結果及び考察
１０％漏出点において、２種の滞留時間（即ち、２．４分及び６分）でのＦｃ融合タンパク質に対する動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表７に示す。ＭＡｂについての以前の結果とは対照的に、Ｆｃ融合タンパク質に対するＤＢＣはＺ４に比べてＺ１及びＺ２に関して高い。
【０１１４】
【表９】
Ｚ１はＺ４より低いリガンド密度（それぞれ１．６５ｍｇ／ｍｌ及び５．９ｍｇ／ｍｌ）を有するものの、Ｚ１に関するＤＢＣは特に短い滞留時間で高い。また、Ｚ２（リガンド密度３．４６ｍｇ／ｍｌ）は、特に長い滞留時間でＺ４より高いＤＢＣを有する。最も高い相対容量（即ち、ｍｇ Ｆｃ融合タンパク質／ｍｇリガンドとして表した容量）は、Ｚ１に関して得られた（表８）。
【０１１５】
【表１０】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ上での分析用サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｆｃ融合タンパク質がＭＡｂ３より早く溶出することを示した（図２）。Ｆｃ融合タンパク質及びＭＡｂ３に関する分配係数（ＫD）は、それぞれ０．２８及び０．４３と計算された。このように、分子量の差は小さいものの、Ｆｃ融合タンパク質はＭＡｂより遙かにバルキーな分子（即ち、大きい溶質半径を有する分子）として挙動する。
【０１１６】
実施例４
この研究の目的は、アガロース系マトリックス上の様々なｚリガンドで精製された数種のモノクローナル抗体の溶出ｐＨを検討することであった。溶出は直線的なｐＨ勾配中で実施した。溶出ｐＨはピーク最大値で測定した。単量体リガンドプロトタイプで精製した試料は、他のプロトタイプに比べて僅かに高いｐＨで溶出した。結果はまた、溶出ｐＨがリガンド密度に依存することも示した。ポリクローナルＩｇＧに関して、高い試料ロード量も検討した。高い試料ロード量が溶出ｐＨに影響を及ぼす徴候は見られなかった。
【０１１７】
溶出条件は各ＭＡｂのさらなる最適化のために有利となり得る。ＭＡｂは中性ｐＨで捕捉され、酸性ｐＨで溶出される。ＭＡｂを上昇したｐＨで溶出させることができるならば、これは低いｐＨで凝集しやすいＭＡｂにとっての利点となり得る。高い溶出ｐＨは凝集体を防止し、一層高い回収率を与える。
【０１１８】
本実施例では、我々はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅリガンドドメインの様々なアルカリ安定化ｚリガンド上にある数種の免疫グロブリン分子の溶出ｐＨを検討した。我々はまた、様々なｚリガンド上にある高ロード量のポリクローナルＩｇＧの効果も検討した。
【０１１９】
１．実験
１．１ 材料／調査ユニット
１．１．１ カラム
様々なＺリガンドを有するアガロース系媒体：
アガロース系媒体 Ｚ１：Ｕ１９７５０７７（１．９８ｍｇ／ｍｌ）。
アガロース系媒体 Ｚ２：Ｕ１９７５０９８（３．４６ｍｇ／ｍｌ）。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｚ４）、ロット：３１２２５７（５．６ｍｇ／ｍｌ）。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｚ４）、ロット：３０６９２８（５．６ｍｇ／ｍｌ）。
【０１２０】
結合容量
【０１２１】
【表１１】
１．１．２ 緩衝液
１０ｍＭ リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ＳＩＧＭＡ社、Ｐ４４１７−１００Ｔａｂ）。
６０ｍＭ クエン酸Ｎａ ｐＨ６（クエン酸Ｎａ Ｍ．２９４．１ｇ／ｍｏｌ）、ＨＣｌでｐＨ調整。
６０ｍＭ クエン酸Ｎａ ｐＨ３（クエン酸Ｎａ Ｍ．２９４．１ｇ／ｍｏｌ）、ＨＣｌでｐＨ調整。
０．３Ｍ ＮａＯＨ。
【０１２２】
１．１．３ 試料
すべての試料は純粋画分であった。緩衝液交換のためにはＰＤ−１０カラムを使用した。
ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社、ｇａｍｍａｎｏｒｍ）。
Ｍａｂ１。
Ｍａｂ２。
Ｆｃ融合タンパク質、ロット：１５１０。
ＩｇＧを含むＣＨＯ細胞上澄み液。
ＭＡｂ４（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ上で精製）。
ＭＡｂ３。
０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ媒体の試料をロードした。
【０１２３】
１．２ 方法
ＵＮＩＣＯＲＮ法
平衡化： ５ＣＶ。
試料体積： １ｍｌ（低ロード量）。
非結合試料の洗浄除去： ５ＣＶ。
溶出（勾配ｐＨ６〜ｐＨ３）： ２０ＣＶ。
再平衡化： ５ＣＶ。
滞留時間： ２．４分。
溶出は直線的なｐＨ勾配中で実施した。溶出ｐＨはピーク最大値で測定した。
【０１２４】
１．３ 装置
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０、ＴＦ＿Ｅ１０。
分光光度計、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｘｔｒａｍａｘ ＰＬＵＳ。
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｓｅｖｅｎ Ｅａｓｙ。
【０１２５】
２．結果
様々なｚリガンドプロトタイプ（即ち、様々なリガンド密度を有する単量体（Ｚ１）、二量体（Ｚ２）及びＳｕＲｅ（ｚ４））上で７種のＭＡｂ及びＦｃ結合タンパク質を精製した。プロトタイプＳｕＲｅ（１．３７ｍｇ／ｍｌ）上で溶出させたＦｃ融合タンパク質及びＭａｂ１のｐＨ値は、このカラム上での他の試料と異なっている。その説明は、これら２種の試料が適用前に凍結／解凍されたことにあるのかもしれない。
【０１２６】
ＭＡＢ３及びＭａｂ４試料は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ媒体（ｒプロテインＡ）上で精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ上でのＭＡＢ３の溶出ｐＨは、予想された通り、他のｚプロトタイプ上より低かった。ＭＡＢ３はＶＨ３部分を含んでいて、Ｆｃ部分及びＶＨ３部分は共にＭａｂＳｅｌｅｃｔ媒体に結合し、溶出のためには一層低いｐＨが必要とされる。
【０１２７】
結果は、リガンド密度に対する溶出ｐＨの依存性を示している。試料を単量体リガンドプロトタイプ上で精製した場合、それは他のプロトタイプに比べて僅かに高いｐＨで溶出した（図３）。
【０１２８】
図３は、各種のｚプロトタイプ上に適用した様々なＭＡｂ及びＦｃ融合タンパク質（低ロード量）の溶出ｐＨを示している。結果は、溶出ｐＨがリガンド密度に依存することを示している。単量体リガンドプロトタイプ上で精製した試料は、他のプロトタイプに比べて僅かに高いｐＨで溶出した。ポリクローナルＩｇＧに関して、高い試料ロード量も検討した。高い試料ロード量が溶出ｐＨに影響を及ぼす徴候は見られなかった。
【０１２９】
単量体リガンドプロトタイプからＭＡｂを溶出させるために一層高い溶出ｐＨが必要とされるので、これは溶出段階中の凝集を回避するために有利である。この特性及び他の特性により、単量体はアフィニティークロマトグラフィー用の良好なリガンドとなる。
【０１３０】
上記の実施例は本発明の特定の態様を例示ものであり、いかなる点でもその技術的範囲を限定することはなく、そのように解すべきでない。上記に示した本発明の教示の恩恵を受ける当業者は、それに対して多数の修正を行うことができる。これらの修正は、添付の特許請求の範囲に示す本発明の技術的範囲内に包含されると解すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、
（ｂ）前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び
（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階
を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺの単量体或いはその機能的変異体から本質的になることを改良点とする方法。
【請求項２】
１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、
（ｂ）前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び
（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階
を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺの二量体或いはその機能的変異体から本質的になることを改良点とする方法。
【請求項３】
リガンドが、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性を有する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
リガンドが免疫グロブリンのＦｃ部分に対して親和性を有するが、免疫グロブリンのＦａｂ部分に対する親和性を欠いている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドの１以上のグリシンがアラニンで置換されている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
２９位のグリシン残基がアラニンで変えられている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
リガンドがプロテインＺであり、そのアルカリ安定性が１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項８】
プロテインＺのアルカリ安定性が、少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項７記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリン含有タンパク質の回収が、３．８〜４．２のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の免疫グロブリン含有タンパク質が、３．８〜４．２のｐＨを有する溶離剤を用いて回収される、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
免疫グロブリン含有タンパク質の回収が、４．０〜４．４のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の免疫グロブリン含有タンパク質が、４．０〜４．４のｐＨを有する溶離剤を用いて回収される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリン含有タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項１４】
免疫グロブリン含有タンパク質がポリクローナル抗体である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項１５】
免疫グロブリン含有タンパク質が別のタンパク質と融合した免疫グロブリンを含む融合タンパク質である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項１】
１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、
（ｂ）前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び
（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階
を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺの単量体或いはその機能的変異体から本質的になることを改良点とする方法。
【請求項２】
１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、
（ｂ）前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び
（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階
を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＢ又はプロテインＺの二量体或いはその機能的変異体から本質的になることを改良点とする方法。
【請求項３】
リガンドが、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性を有する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
リガンドが免疫グロブリンのＦｃ部分に対して親和性を有するが、免疫グロブリンのＦａｂ部分に対する親和性を欠いている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドの１以上のグリシンがアラニンで置換されている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
２９位のグリシン残基がアラニンで変えられている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
リガンドがプロテインＺであり、そのアルカリ安定性が１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項８】
プロテインＺのアルカリ安定性が、少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項７記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリン含有タンパク質の回収が、３．８〜４．２のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の免疫グロブリン含有タンパク質が、３．８〜４．２のｐＨを有する溶離剤を用いて回収される、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
免疫グロブリン含有タンパク質の回収が、４．０〜４．４のｐＨを有する溶離剤を添加することで達成される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の免疫グロブリン含有タンパク質が、４．０〜４．４のｐＨを有する溶離剤を用いて回収される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリン含有タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項１４】
免疫グロブリン含有タンパク質がポリクローナル抗体である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項１５】
免疫グロブリン含有タンパク質が別のタンパク質と融合した免疫グロブリンを含む融合タンパク質である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５１５１６０（Ｐ２０１２−５１５１６０Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４５３２３（Ｐ２０１１−５４５３２３）
【出願日】平成２２年１月１１日（２０１０．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５００１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８００６５
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１１日（２０１０．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５００１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８００６５
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
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