アポトーシスを調節するためのβアドレナリン作動性受容体リガンド誘導体
本発明は、特にアポトーシスを抑制し、アポトーシス関連疾患および障害を治療および／または予防するためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニスト誘導体の新規な治療的使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にアポトーシスを調節するためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニスト誘導体の新規な治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−２−アドレナリン作動性受容体（ＡＤＲＢ２）アゴニストが、早期陣痛を治療する子宮収縮抑制薬として久しく用いられてきたが、限られた効果および毒性により、もはや第１選択薬として推奨されていない。オキシトシンアンタゴニストおよびカルシウムチャネル遮断薬は、有害影響の低いプロフィールを有する最近開発された薬物であり、それ故に、妊婦を含めた、高血圧を治療するために開発されたカルシウムチャネル遮断薬が子宮収縮抑制薬として認可されていなくても、これらはより広く用いられている（Ｋｉｍ他、Ｂｊｏｇ １１３ Ｓｕｐｐｌ ３：１１３−１１５頁、２００６年）。ＡＤＲＢ３は、自発性収縮に対する抑制作用を有する、ヒトの子宮筋層に存在し、優勢なＡＤＲＢであることが近年示されている（Ｂａｒｄｏｕ他、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３０：１９６０−１９６６頁、２０００年；Ｄｅｎｎｅｄｙ他、Ｂｊｏｇ １０８：６０５−６０９頁、２００１年；Ｒｏｕｇｅｔ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９０：１６４４−１６５０頁、２００５年）。
【０００３】
アポトーシスは、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）の主なタイプの１つであり、特徴的な細胞形態をもたらし死に至る組織化された一続きの生化学的事象が関与している。アポトーシスに関する研究は、実質的に１９９０年代の初めから増加している。生物学的現象としての重要性に加えて、不完全なアポトーシスプロセスは、多数の疾患に関与しているとされてきた。不完全な抗アポトーシスエフェクターにより制御の効かない細胞増殖を招く恐れがあるため、癌はアポトーシス調節の決定的な役割の主な例である。
【０００４】
Ｓｏｌａｒｙ他、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．９、１２９３−１３０５頁、１９９６年による総説では、癌；ウイルス感染症；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、自己免疫性糖尿病、炎症性腸症候群、１型糖尿病などの自己免疫疾患；劇症肝炎、慢性甲状腺炎を含めたＣＴＬ媒介自己免疫疾患などのｆａｓ媒介疾患；ＡＩＤＳ；骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、慢性好中球減少症、重症β−サラセミアなどの血液病；アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳変性症、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症などの神経変性障害；および多発性嚢胞腎疾患、毒性肝疾患、心筋梗塞、心筋発作、粥腫、関節炎、骨粗鬆症および加齢などの虚血傷害を含めた他の様々な疾患におけるアポトーシスの役割が確認されている。
【０００５】
アポトーシスはまた、子宮細胞の代謝回転および妊娠初期に主として関与している。げっ歯類の胚周囲の子宮上皮が、胚盤胞の存在に応答してアポトーシスを起こすことが十分に立証されている（Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年；Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年；およびＷｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年）。Ｊｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年では、着床に応答して子宮上皮および脱落膜における２つの異なるアポトーシスの経路が提案された。より最近には、Ｑｉａｎ Ｚｈａｎｇ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（５）、２２１５−２２２７頁、２００６年で、発情周期および妊娠初期の間の子宮細胞の代謝回転におけるアポトーシスおよび増殖が研究された。これらの結果により、子宮細胞のアポトーシスおよび増殖のパターンが、性周期および妊娠に関連した子宮の変化を維持する上で重要な役割を果たす、非常に規則正しい細胞特異的な現象であることが示されている。特に、これらは、カスパーゼ−３に媒介された細胞のアポトーシスが、ハムスターおよびマウスにおける着床過程を開始する上で重要な役割を果たし得ることを示している。
【０００６】
妊娠の分野におけるアポトーシスについての興味深い最初の話題は、胎盤の疾患である。実際、絨毛状の栄養膜のアポトーシスは、胎盤に関連する通常の妊娠疾患、すなわち、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）および子癇前症の両方においてアップレギュレートされる（Ｓｍｉｔｈ ＳＣ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９７年；１７７：１３９５−４０１頁；Ａｌｌａｉｒｅ Ａ Ｄ他、Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２０００年；９６：２７１−６頁；Ｅｒｅｌ ＣＴ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ ２００１年；７３：２２９−３５頁；Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｎ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００２年；１８６：１５８−６６頁）。アポトーシス核は、対照の胎盤と比較して、胎児の成長が制限された胎盤でより豊富であることが最近示されているため（Ｍａｄａｚｌｉ Ｒ他、Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ ２００６年；２６：５−１０頁）、アポトーシスを抑制することはＩＵＧＲまたは子癇前症を治療するまたは予防するための有望な手法とみなすことができる。
【０００７】
自発性早期陣痛は、解明されていても解明されていなくても、早産の最大の原因の１つであり、早産は、米国における最も多い乳児死亡の原因である（Ｃａｌｌａｇｈａｎ他、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１８、１５６６−１５７３頁、２００６年）。自発性早期陣痛の多くの場合は解明されていないが、かなりの割合が生殖管感染症または絨毛膜羊膜炎に関連づけられる（Ｅｄｗａｒｄｓ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３２、２８７−２９６頁、２００５年）。
【０００８】
Ｃｈａｒｐｉｇｎｙ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、６８、２２８９−２２９６頁、２００３年では、アポトーシスに関連する遺伝子は、分娩中にアップレギュレートされることが示された。
【０００９】
アポトーシス細胞死は、２つの選択的な収束経路、すなわち、細胞表面死受容体によって媒介される外因性経路、およびミトコンドリアによって媒介される内因性経路によって開始することができる（Ｄａｎｉａ他、Ｃｅｌｌ １１６：２０５−２１９頁、２００４年）。両経路において、細胞基質を切断するシステインアスパルチル特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）が活性化され、エフェクターであるカスパーゼ−３の活性化は、アポトーシス細胞死の実行に重要である。ｂｃｌ２ファミリーメンバーは、アポトーシスの調節において中心的な役割を果たしている。多領域のアポトーシス促進タンパク質ＢａｘおよびＢａｋは、これらのタンパク質が二重に欠損した細胞が、いくつかの異なる本来の死への刺激に対して抵抗性であるため、一緒になってアポトーシス細胞死に必要な出入り口を構成している（Ｄａｎｉａｌ他、Ｃｅｌｌ １１６：２０５−２１９頁、２００４年）したがって、ＢＡＸ、Ｂｃｌ−２および切断カスパーゼ−３は、アポトーシスを評価するために広く用いられている。
【００１０】
国際公開第０２／４４１３９号は、アミン上にシクロヘキシル（アルキル）基を有するいくつかのプロパノールアミンが、ＡＤＲＢ３に対して有力なアゴニスト活性を有することを開示している。この文献によると、これらの化合物を、例えば、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）などの炎症性腸疾患などの胃腸疾患の治療において、腸動力のモジュレーターとして、脂肪分解剤、抗肥満薬、抗糖尿病薬、向精神薬、緑内障治療薬、瘢痕形成薬および抗うつ薬として、子宮収縮抑制薬として、早産を予防または遅延するための陣痛抑制薬として、ならびに月経困難症の治療および／または予防に適応とすることができると示唆されている。さらに、これらの化合物は、例えば、うつ病などある種の中枢神経系疾患の治療、また尿失禁などある種の泌尿器系疾患の治療に用いることができる。
【００１１】
それにもかかわらず、アポトーシスを予防および／または抑制するためのこれらの化合物の使用は、開示も示唆もされていない。より一般的には、ＡＤＲＢ３とアポトーシスの間の関係は、今までのところ証明されていないまたは示唆されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０２／４４１３９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｉｍ他、Ｂｊｏｇ １１３ Ｓｕｐｐｌ ３：１１３−１１５頁、２００６年
【非特許文献２】Ｂａｒｄｏｕ他、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３０：１９６０−１９６６頁、２０００年
【非特許文献３】Ｄｅｎｎｅｄｙ他、Ｂｊｏｇ １０８：６０５−６０９頁、２００１年
【非特許文献４】Ｒｏｕｇｅｔ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９０：１６４４−１６５０頁、２００５年
【非特許文献５】Ｓｏｌａｒｙ他、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．９、１２９３−１３０５頁、１９９６年
【非特許文献６】Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年
【非特許文献７】Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年
【非特許文献８】Ｗｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年
【非特許文献９】Ｊｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年
【非特許文献１０】Ｑｉａｎ Ｚｈａｎｇ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（５）、２２１５−２２２７頁、２００６年
【非特許文献１１】Ｓｍｉｔｈ ＳＣ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９７年；１７７：１３９５−４０１頁
【非特許文献１２】Ａｌｌａｉｒｅ Ａ Ｄ他、Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２０００年；９６：２７１−６頁
【非特許文献１３】Ｅｒｅｌ ＣＴ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ ２００１年；７３：２２９−３５頁
【非特許文献１４】Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｎ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００２年；１８６：１５８−６６頁
【非特許文献１５】Ｍａｄａｚｌｉ Ｒ他、Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ ２００６年；２６：５−１０頁
【非特許文献１６】Ｃａｌｌａｇｈａｎ他、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１８、１５６６−１５７３頁、２００６年
【非特許文献１７】Ｅｄｗａｒｄｓ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３２、２８７−２９６頁、２００５年
【非特許文献１８】Ｃｈａｒｐｉｇｎｙ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、６８、２２８９−２２９６頁、２００３年
【非特許文献１９】Ｄａｎｉａｌ他、Ｃｅｌｌ １１６：２０５−２１９頁、２００４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、アポトーシスおよびそのモジュレーターを制御する新規な生物学的標的を同定する必要がある。
【００１５】
本発明者らは、現在、本発明の一目的である、ＡＤＲＢ３が、特に妊娠関連組織、すなわち子宮、胎盤および卵膜中のアポトーシス経路を制御する上で決定的な役割を演じていることを見出している。その上、驚くべきことに、国際公開第０２／４４１３９号において開示された化合物が、強力なアポトーシス抑制薬であることも発見している。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１の目的によれば、本発明は、雌性哺乳動物患者における妊娠関連組織のアポトーシスを予防するための医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００１７】
他の目的によれば、本発明は、妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、子宮のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、性周期障害、受胎障害および妊娠障害から選択された、妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００１８】
他の目的によれば、本発明は、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者における妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者における早期陣痛を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者における（生殖管感染症が絨毛膜羊膜炎である。）早期陣痛を予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００１９】
他の目的によれば、本発明は、妊婦における妊娠関連組織アポトーシスを予防および／または抑制するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２０】
他の目的によれば、本発明は、主に早期陣痛および早産の結果となる、生殖管感染症に罹患している女性における子宮のアポトーシスを予防する医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２１】
他の目的によれば、本発明は、早産期前期破水の女性における卵膜のアポトーシスを予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２２】
他の目的によれば、本発明は、子宮内発育遅延または子癇前症が合併した妊娠女性における胎盤のアポトーシスを予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２３】
他の目的によれば、前記β−３アドレナリン作動性受容体アゴニストは、式（Ｉ）の化合物、
【００２４】
【化１】
［式（Ｉ）において、
Ａは式（ａ）または（ｂ）の基である。］
【００２５】
【化２】
［式中、
Ｒは、水素もしくはハロゲン原子、−Ｓ（Ｏ）ｚ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＮＨＳＯ２フェニル基を表し、前記フェニルは、ハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ１は、水素原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＣＯ−フェニル基を表し、前記フェニルは、ハロゲン原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ２は、水素原子、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＳＯ２フェニル基であり；
Ｘは、５−８個の原子を有する環を完成し、前記環は、飽和または不飽和であり、１または２個の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、１または２個のカルボニル基を有していてもよく；
ｎ、ｍおよびｚは、独立に０、１または２であり；
Ｒ３は、水素もしくはハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯＮＲ４Ｒ５、−ＣＯＯＨ、または４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イルもしくは４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イル基を表し；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子、フェニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基またはフェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を表す；または
Ｒ４およびＲ５は、これらが結合されている窒素原子と共に、合計で５から７個の原子を有する環を形成してもよい。］
およびこの塩から選択される。
【００２６】
本説明において、「（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」および「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル」という用語は、飽和の直鎖または分枝鎖を含む、Ｃ１−Ｃ４炭化水素およびＣ１−Ｃ６炭化水素から形成された一価基を指す。
【００２７】
本説明において、「ハロゲン」という用語は、塩素、臭素、ヨウ素およびフッ素から選択された原子を指す。
【００２８】
より具体的には、化合物は、ｎおよびｍがそれぞれ０である化合物である。
【００２９】
より具体的には、化合物は、Ｒ１が水素原子である化合物である。
【００３０】
より具体的には、化合物は、Ｒが−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基またはＮＨＳＯ２フェニル基から選択される化合物である。
【００３１】
より具体的には、化合物は、Ｒ３が、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたは−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたはＣＯＮＲ４Ｒ５である化合物である。
【００３２】
より具体的には、化合物は、Ｒ３がベンゼンの４位にある化合物である。
【００３３】
より具体的には、化合物は、ｚが２である化合物である。
【００３４】
より具体的には、化合物は、Ｘがメチレン、エチレンまたはプロピレンである化合物である。
【００３５】
より具体的には、化合物は、Ｘがカルボニル、−ＣＯ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｃ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）２−ＣＯ−基、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで一置換されたもしくは二置換されたメチレンまたは−ＣＯＣＨ２−基である。
【００３６】
より具体的には、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基および−ＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基は、それぞれ、ベンジルスルホニルアミノおよびベンジルスルホニルである。
【００３７】
結合される窒素原子を有するＲ４およびＲ５が、５−７個の原子を有する環を形成するとき、環は、より具体的にはピペリジンおよびピロリジンである。
【００３８】
以下の化合物は特に有利である。
【００３９】
本明細書において化合物Ａと呼ばれるエチル−４−｛トランス−４−［（（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−｛４−ヒドロキシ−３［（メチルスルホニル）−アミノ］フェノキシ｝プロピル）アミノ］シクロヘキシル｝ベンゾアート塩酸塩；これは上記で開示した、Ａが式（ａ）の基である式（Ｉ）の化合物［Ｒは−ＮＨＳＯ２メチルであり、Ｒ１はＯＨ、ｎ＝ｍ＝０であり、Ｒ３は−ＣＯＯエチルである。］である。
【００４０】
本発明による式（Ｉ）の化合物の塩は、ヒドロクロラート（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒａｔｅ）、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、二水素リン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩など、医薬として許容される無機酸もしくは有機酸との付加塩およびピクリン酸塩もしくはシュウ酸塩などの式（Ｉ）の化合物の適当な分離もしくは結晶化を可能にする付加塩または、例えば、カンファースルホン酸およびマンデル酸または置換されたマンデル酸などの光学活性酸との付加塩を含む。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物が遊離のカルボキシル基を有するとき、これらの塩はまた、無機塩基との塩、好ましくはナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属との塩または有機塩基との塩を含む。
【００４２】
式（Ｉ）の化合物の光学的に純粋な立体異性体および任意の割合での不斉炭素原子によるその異性体の混合物もまた、本発明の一部である。
【００４３】
より具体的には、式（Ｉ）の化合物は、ＯＨ基を有するプロパノールアミンの炭素の立体配置が（Ｓ）である化合物である。
【００４４】
式（Ｉ）の化合物は、（星印がついた）シクロヘキシル環の１位および４位の置換基の相対位置に応じて、「シス」または「トランス」幾何異性体の形態とすることができる。任意の割合でのこれらの純粋な異性体およびそれらの混合物は、本発明の一部である。
【００４５】
任意の割合での上記の光学立体異性体および幾何立体異性体の混合物もまた、本発明の一部である。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物の調製方法は、国際公開第０２／４４１３９号に開示されている。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物は、性周期障害、受胎障害および妊娠障害などの関連する妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害、ならびに早産期前期破水、ならびに早期陣痛、特に生殖管感染症が引き金となった早期陣痛を、その予防および治療を必要とする女性の患者において予防および／または治療するのに適した医薬品の調製に有用である。かかる患者は、日常分析によって容易に同定することができる。
【００４８】
本明細書で用いられる「雌性哺乳動物患者」という表現は、特に女性を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる「性周期障害」という表現は、Ｑｉａｎ Ｚｈａｎｇ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（５）、２２１５−２２２７頁、２００６年により示唆されたように、女性の月経周期の障害を意味し、特に、損傷を受けた子宮のアポトーシスを伴う障害を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる「受胎障害」という表現は、Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年；Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年；Ｗｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年およびＪｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年で開示された、着床などの女性の受胎能の障害を意味し、特に損傷を受けた子宮のアポトーシスを伴う障害を意味する。
【００５１】
本明細書で用いられる「妊娠障害」という表現は、Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年；Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年；Ｗｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年およびＪｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年で開示された、妊娠初期などの雌性哺乳動物における妊娠の障害を意味し、特に損傷を受けた子宮のアポトーシスを伴う障害を意味する。
【００５２】
本発明の使用に対して、有効量の式（Ｉ）の化合物または有効量の医薬として許容されるその塩は、このような治療を必要とする哺乳動物に投与される。
【００５３】
上記の式（Ｉ）の化合物および医薬として許容されるその塩は、治療しようとする哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．０１から２０ｍｇを１日量として、好ましくは、０．１から１０ｍｇ／ｋｇを１日量として用いることができる。ヒトにおいて、治療しようとする個体の年齢、治療の種類、予防薬または治療薬、および障害の重篤度に応じて、用量は、好ましくは１日０．５ｍｇから１５００ｍｇまで変わり、具体的には２．５から５００ｍｇまで変わり得る。式（Ｉ）の化合物は一般に、有効成分０．１から５００ｍｇ、好ましくは０．５から１００ｍｇを投与単位として、１日１回から５回投与される。
【００５４】
前記投与単位は、好ましくは、有効成分が製剤添加物と混合される医薬組成物中に配合される。
【００５５】
したがって、その態様の他のものによれば、本発明は、有効成分として、上記の式（Ｉ）の化合物または医薬として許容されるその塩を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所、経皮または直腸投与のための本発明の医薬組成物において、上記の式（Ｉ）および医薬として許容されるその塩の有効成分は、単位投与形態で、通常の医薬用担体と混合して、前述の障害を治療するために動物およびヒトに投与することができる。適当な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、散剤、顆粒剤および経口液剤または経口懸濁剤などの経口形態、舌下および口腔投与形態、皮下、筋肉内または静脈内投与形態、局所投与形態および直腸投与形態を含む。
【００５７】
錠剤の形態の固体組成物を調製するとき、主な有効成分を、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴムなどの医薬用ビヒクルと混合する。錠剤は、スクロースまたは他の適当な物質でコーティングすることができるまたは錠剤は、それらが活性を持続するまたは遅らせるように処理することができ、連続的な方式で所定の量の有効成分を放出するよう処理することができる。
【００５８】
ゲルカプセルの調製は、有効成分を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟ゲルカプセルまたは硬ゲルカプセル中に注ぐことによって得られる。
【００５９】
シロップ剤またはエリキシル剤の形態の調製は、有効成分を甘味剤、好ましくはカロリーが無い甘味剤、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベンと共に含むことができ、フレーバーエンハンサーおよび適当な着色料もまた共に含むことができる。
【００６０】
水分散性散剤または水分散性顆粒剤は、ポリビニルピロリドンなどの、分散剤もしくは湿潤剤または懸濁化剤と混合し、甘味剤またはフレーバー矯正剤とも混合した有効成分を含むことができる。
【００６１】
局所投与について、有効成分を、クリーム剤または軟膏剤を調製するために賦形剤に混ぜ入れるまたは例えば洗眼剤の形態で、眼内投与用のビヒクルに溶かす。
【００６２】
直腸投与について、例えば、カカオ脂やポリエチレングリコールなど、直腸温で融解する結合剤で調製された坐剤を利用する。
【００６３】
非経口投与について、例えば、プロピレングリコールまたはブチレングリコールなど、薬理学的に適合性のある分散剤および／または湿潤剤を含む、水性懸濁剤、食塩水または注射用無菌液を用いる。
【００６４】
有効成分は、マイクロカプセルの形態で、場合によって１つまたは複数の担体または添加剤と配合することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】切断カスパーゼ−３タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を表す図である。ＣＴＲＬ＝対照；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間；ＣＡ＝絨毛膜羊膜炎。実験を、異なる３名の絨毛膜羊膜炎の女性から得られた子宮筋層試料（ＣＡ群）および無併発性妊娠でＬＰＳで刺激されたまたは刺激されていない異なる５名の女性から帝王切開術で得られた５つの子宮筋層（それぞれＬＰＳ群およびＣＴＲＬ群）において実施した。＊Ｐ＜０．０５対対照。
【図２】切断カスパーゼ−３タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を示す図である。対照＝時間が一致した実験；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間、ＴＮＦα−ａｂ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ＋ＴＮＦα−ａｂ０．６μｇ／ｍｌ、４８時間。実験を、異なる３名の女性から選択的帝王切開術で得られた３つの子宮筋層において実施した。＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ。
【図３】切断カスパーゼ−３タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を示す図である。対照＝時間が一致した実験；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間。化合物Ａ（１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ）を、ＬＰＳ刺激の前に２０分間加えた。実験を、異なる５名の女性から選択的帝王切開術で得られた５つの子宮筋層において実施した。＃Ｐ＜０．０５対対照、＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ。
【図４】ＢＡＸおよびＢｃｌ−２タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を示す図である。対照＝時間が一致した実験；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間。化合物Ａ（１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ）を、ＬＰＳ刺激の前に２０分間加えた。実験を、異なる７名の女性から選択的帝王切開術で得られた７つの子宮筋層において実施した。＃Ｐ＜０．０５対対照、＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ、＊＊Ｐ＜０．０１対ＬＰＳ。
【図５】ＩＬ−６およびＩＬ−８の濃度に対する化合物Ａの効果を示す図である。結果（平均値±標準誤差、ｐｇ／ｍｌで）は、異なる５名の女性から選択的帝王切開術で得られた子宮筋層に繰り返して実施した５回の実験から得られている。＃Ｐ＜０．０５対対照、＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ、＊＊Ｐ＜０．０１対ＬＰＳ。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００６７】
薬物および溶液
リポ多糖類（ＬＰＳ）（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０５５：Ｂ５、参照：Ｌ２８８０）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、蒸留水に溶かした。化合物Ａは、Ｓａｎｏｆｉ−Ｍｉｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ Ｓ．ｐ．Ａからの寄贈品であった。化合物Ａを、１ｍＭ溶液に対して３０％無水エタノール、２％ジメチルスルホキシドおよび蒸留水の混合物中に溶かし、その後、蒸留水で希釈した。最終の最高浴濃度は、エタノールが０．３％であり、ＤＭＳＯが０．０２％であった。
【００６８】
生体試料
子宮筋層生検試料は、次に概説する異なる４通りの臨床状態の妊娠中の女性から得られた。ｉ）分娩後に子宮摘出を受けた確立された絨毛膜羊膜炎の女性１名；ｉｉ）分娩後の出血のため分娩後に子宮摘出を受けた絨毛膜羊膜炎のない女性１名；ｉｉｉ）選択的帝王切開術を受けた確立された絨毛膜羊膜炎の女性３名；ｉｖ）他の理由（児頭骨盤不均衡）で選択的帝王切開術を受けた絨毛膜羊膜炎のない女性１０名。帝王切開術を受けた女性には、その手順を、妊娠３８−４０週の間の妊娠期間に、分娩開始の前にすべて実施した。臨床上の絨毛膜羊膜炎は、子宮圧痛および／または膿性のもしくは悪臭のある羊水が、次の分娩前体温３７．８℃以上、母体頻拍（拍動数１２０／分以上）、母体の１ｍｍ３あたり１８，０００細胞以上の白血球増加、または胎児頻拍（拍動数１６０／分以上）のうちいずれか２つと共に存在するものとして古典的に定義され（Ｒｅｄｌｉｎｅ ＲＷ他、Ｐｌａｃｅｎｔａ ２００５年；２６ Ｓｕｐｐｌ Ａ：Ｓ１１４−１１７頁）、本試験に含まれるすべての場合において、妥当性が検証された基準を用いて１人の病理学者により胎盤の陽性培養または胎盤の組織学的評価によって確認された（Ｒｅｄｌｉｎｅ ＲＷ他、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｄｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ２００３年；６：４３５−４４８頁）。したがって、この試験の残りにおいて、絨毛膜羊膜炎は、確立された絨毛膜羊膜炎を意味する。
【００６９】
子宮筋層の細片を、前述のように子宮筋線維の大部分が反対の胎盤部位で縦方向となる、すぐの漿膜下部位から切除した（Ｒｏｕｇｅｔ Ｃ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００５年；９０：１６４４−１６５０頁、Ｌｅｒｏｙ ＭＪ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９８９年；３８：９−１５頁）。この試験は、「生物医学研究における人の保護のための諮問委員会（Ｃｏｍｉｔｅ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｆ ｄｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ ｐｏｕｒ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｅ）」（ＣＣＰＰＲＢ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって認可されており、インフォームドコンセントは、すべてのドナーから得られた。
【００７０】
確立された絨毛膜羊膜炎の女性または分娩後の出血を伴う女性から得られた組織は、後述のように、新鮮な組織を用いてウェスタンブロット実験を実施したまたは組織学的評価およびヘキスト染色のためパラフィンに包埋した。
【００７１】
無併発性妊娠から得られた子宮筋層生検試料を、絨毛膜羊膜炎の影響を模倣するＬＰＳ実験モデルを開発するために用いた。
【００７２】
Ｅ．コリＬＰＳによる子宮筋層生検試料の刺激
無併発性妊娠の女性から得られた子宮筋層生検試料を、無菌のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に直ちに移し、無菌のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。生検試料を小型の細片に切り、抗生物質を使用せず、それぞれをＤＭＥＭ培養培地２ｍｌを含む２４穴プレートに入れた。次いで、サイトカインレベルを基底値に戻させるために、細片をＣＯ２５％で３７℃で４８時間インキュベートした（Ｆｏｒｔｕｎａｔｏ ＳＪ他、Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４年；３２：１８４−１８７頁）。
【００７３】
ＬＰＳ（エシェリキア・コリ０５５：Ｂ５）で絨毛膜羊膜炎の女性から得られた子宮筋層試料の知見を再現するために、子宮筋層細片を、異なる３種のＬＰＳ濃度（５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）で異なる３通りの時間（８時間、２４時間、４８時間）でインキュベートした。
【００７４】
第２の実験において、子宮筋層組織中のＬＰＳ誘導アポトーシスにおけるＴＮＦの役割を評価するために、細片を、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌで抗ＴＮＦ抗体（０．６μｇ／ｍｌ）を含んでまたは含まずに４８時間インキュベートした（ヒトＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ、使用した抗体の濃度を、製造業者の推奨に基づいて選択した。）。
【００７５】
ＡＤＲＢ３刺激のＬＰＳ誘導アポトーシスを妨害する能力を評価することを目標とした第３の実験において、化合物Ａの存在下または非存在下で、子宮筋層細片をＬＰＳ１０μｇ／ｍｌで４８時間インキュベートし、選択的なＡＤＲＢ３アゴニスト（Ｃｒｏｃｉ Ｔ他、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２００７年；３２１：１１１８−１１２６頁）（０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭ）をＬＰＳ刺激を開始する直前に加えた。時間が一致した対照実験を、化合物Ａの溶媒、すなわち、最終浴濃度として、０．３％エタノールおよび０．０２％ＤＭＳＯを含有する蒸留水、刺激されていない子宮筋層試料およびＬＰＳにより刺激された子宮筋層試料を用いて実施した。
【００７６】
刺激期間の終わりに、上清試料および組織を速やかに液体窒素で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【００７７】
ウェスタンブロット分析
急速凍結した子宮筋層組織は、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘを用いてホモジナイズ緩衝液［１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ロイペプチン４０ｍｇ／ｍｌ−１、２ｍＭペファブロック］中でホモジナイズした。４℃で１５分間５００×ｇで最初の遠心を行った後、上清の全タンパク質含有量を、ブラッドフォード法により標準としてＢＳＡで決定した。試料（レーンごとにタンパク質４０μｇ）を、２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ他、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７０年；４７：６９−８５頁）中で溶かし（体積／体積）、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の前に５分間煮沸した。タンパク質を、ニトロセルロースメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。非特異的な抗体結合を遮断するため、メンブランを、トリス緩衝食塩水／Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．８）中の１０％脱脂粉乳粉末で室温で１時間インキュベートした。遮断されたメンブランを、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、ブロットを、１：２００希釈の一次切断カスパーゼ−３抗体（ＡＳＰ１７５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）または１：５００希釈の一次ＢＡＸポリクローナル抗体（ｓｃ−４９３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）または１：５００希釈の一次ＢＣＬ２ポリクローナル抗体（ｓｃ−７３８２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳＴ中の１％脱脂粉乳粉末で４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗ウサギＩｇＧ（ＮＡ ９３４、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）もしくは抗マウスＩｇＧ（ＮＡ ９３１、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）の全抗体を用いて１：１００００希釈で室温で４５分間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで５回洗浄した。免疫反応性タンパク質を、化学発光（ＥＣＬ（商標）検出試薬、ＲＰＮ２１０５、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）およびＸ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＵＳＡ）への照射によって検出した。バンドの強度を、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．６２プログラムを用いてデンシトメトリーで分析し、タンパク質ローディング対照として用いたグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対するモノクローナル抗体で得られたバンドの強度によって標準化した。結果は、任意密度単位（Ａ．Ｄ．Ｕ）の平均値±標準誤差として表される。
【００７８】
免疫組織化学分析
子宮筋層細片を、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、次いで、パラフィンに包埋し、５マイクロメートル厚の切片に切った。子宮筋層切片の脱パラフィン、および再水和後、抗原回復を、圧力鍋を用いてｐＨ６の温かいクエン酸緩衝液中で１０分スライドをインキュベートすることによって行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で遮断した後、スライドを、一次抗切断カスパーゼ−３ＩｇＧ（１：１００）のどちらかでインキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後、ビオチン化抗ウサギ（１：６００）免疫グロブリンと共にそれぞれ１時間インキュベートした。新たに洗浄した後、スライドをペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（１：８００）中で３０分間インキュベートし、次いで、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）溶液と共に、明らかに目に見える色を発色するまでインキュベートした。その反応は、再蒸留水での広範な洗浄によって停止した。続いて、その標本をヘマトキシリンで対比染色した。組織学的な変化を、染色の全体的な強度の変動によって評価した。負の制御を一次抗体を取り除くことによって実施した。
【００７９】
ヘキスト染色
アポトーシス細胞および壊死細胞を区別するために、染色質凝縮状態を、核のヘキスト−３３３４２での染色によって評価した。子宮筋層試料のパラフィン包埋した切片を前述の通り再水和させた。次いで、スライドをヘキスト−３３３４２（２μｇ／ｍｌ）で２分間インキュベートした。これらのスライドを蒸留水ですすぎ、Ａｑｕａｔｅｘ（Ｃ）でマウントした。染色した核を、切り替え式の蛍光顕微鏡で×１００の倍率で、３５０ｎｍの励起光を用いて可視化した。
【００８０】
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってトリゾール溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、異なる５名の女性から得られた５つの子宮筋層組織から調製した。ＲＮＡの完全性を、アガロースゲルの臭化エチジウム染色分析によっておよび光学密度（ＯＤ）の吸収比ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ≧１．８によって検証した。全ＲＮＡ１マイクログラムを、製造業者の説明書に従って、Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共にオリゴ（ｄＴ）を用いて逆転写させた。リアルタイム定量ＰＣＲ分析を、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱリアルタイム検出システム機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ活性化試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を用いて、最終体積２５μｌとして、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの両方で２００ｎＭと共に逆転写された全ＲＮＡ２５ｎｇを用いて実施した。ＰＣＲ産物を、単一の増幅産物の予想したサイズが実際得られたことを保証するために臭化エチジウム染色されたアガロースゲルでも分析した。
【００８１】
それぞれの反応を２回繰り返して行い、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）をそれぞれの実験で用いて、ｃＤＮＡ量の変動を制御した。制御によって倍の変動として表されたいかなる所与の遺伝子の相対定量も、製造業者のプロトコルに従って所与の遺伝子のサイクル閾（Ｃｔ）値間の差を決定した後、式２−Δ（ΔＣｔＡ−ΔＣｔＢ）［式中、ΔＣｔＡは対象となる遺伝子のΔＣｔであり；ΔＣｔＢはＧＡＰＤＨのΔＣｔであり、ΔＣｔ＝実験群のＣｔ−対照群のＣｔである。］を用いて算出した。ＰＣＲを特異的プライマー：ＧＡＰＤＨ（順方向、５’ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ３’および逆方向、５’ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣ−ＡＴＧＡＧ３’）およびカスパーゼ−３（順方向、５’ＡＧＡＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＴＴＧＡＧ３’および逆方向、５’ＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧ３’）を用いて実施した。
【００８２】
サイトカイン濃度測定
サイトカイン測定値を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ；Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）によって決定した。５つの子宮筋層細片の上清を、標識された結合ビーズおよび検出試薬と共に暗所で室温で３時間インキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でそれぞれのＣＢＡ分析ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＢｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社のソフトウェアを用いることによって分析した。定量用のサイトカイン標準液（ｐｇ／ｍＬ）ならびにブランクを、試料と同じ方式で処理した。それぞれの実験を、結果の再現性を保証するために繰り返して実施した。
【００８３】
結果の統計分析
群間の差を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定し、それに続いてダンの多重比較検定によって決定した。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔバージョン３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて実施した。Ｐ＜０．０５のとき、すべての差を有意とみなした。
【００８４】
選択的ＡＤＲＢ３アゴニストである化合物Ａのアポトーシスおよび炎症に対する効果
切断カスパーゼ−３抗体を用いた、異なる４名の確立された絨毛膜羊膜炎の女性から得られた４つの子宮筋層組織試料の免疫染色は、分娩後の出血を伴う女性から得られた１つの対照組織（Ｓｈｅｉｎｅｒ Ｅ他、Ｊ Ｍａｔｅｒｎ Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ ２００５年；１８：１４９−１５４頁）（データ未掲載）においても、選択的帝王切開術で得られた３つの組織（データ未掲載）においても観察されなかった強い染色（データ未掲載）を示した。この染色は、特に子宮筋層の細胞中にあった。最適条件（すなわち、ＬＰＳ刺激の８時間、２４時間、４８時間の時間経過および５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの用量反応の実験後に決定された、１０μｇ／ｍｌ、４８時間）におけるＬＰＳ刺激はまた、特に子宮筋層の細胞中にあった強い切断カスパーゼ−３染色を伴った（データ未掲載）。
【００８５】
絨毛膜羊膜炎の女性（ｎ＝４）、分娩後の出血を伴う女性（ｎ＝１）またはＬＰＳで刺激された選択的帝王切開術を用いた女性（ｎ＝４）もしくはＬＰＳで刺激されていない選択的帝王切開術を用いた女性（ｎ＝４）から得られた子宮筋層切片のヘキスト−３３３４２染色は、絨毛膜羊膜炎およびＬＰＳ刺激（データ未掲載）が両方とも、分娩後の出血または帝王切開術（データ未掲載）と比較して、アポトーシスの開始を示す凝縮した染色質を有する細胞の割合の増加を伴うことを示した。
【００８６】
同じ３名の絨毛膜羊膜炎の女性から得られたまたは帝王切開術およびＬＰＳで刺激されたもしくは刺激されていない（対照）５名から得られた妊娠時の子宮筋層から調製されたメンブランのウェスタンブロットは、切断カスパーゼ−３に対応する１７−ｋＤａバンドおよび１９−ｋＤａバンド（データ未掲載）を示した。
【００８７】
濃度測定の免疫ブロット分析は、切断カスパーゼ−３タンパク質が、絨毛膜羊膜炎およびＬＰＳ刺激後のどちらの場合においても、対照として用いたＬＰＳ刺激のない選択的帝王切開術と比較して、著しく過剰発現したことを示した（任意密度単位、ＡＤＵで表され、絨毛膜羊膜炎、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌおよび対照群がそれぞれ９２１±３９、９４１．６±１３４、対４５２±５０．６であった。Ｐ＜０．０５）（図１）。ＬＰＳ刺激によって誘導された切断カスパーゼ−３の過剰発現は、絨毛膜羊膜炎のインビトロＬＰＳ誘導モデルの外部バリデーションを提供する、絨毛膜羊膜炎の女性の妊娠時の子宮筋層から調製されたメンブランで実施したウェスタンブロット実験において観察されたもの（図１）と同程度であった。
【００８８】
切断カスパーゼ−３のこの過剰発現は、ＴＮＦ−α受容体を選択的ＴＮＦ−α抗体で遮断することにより強く拮抗され、ヒトの出産間近の子宮筋層におけるＬＰＳ誘導アポトーシスに、ＴＮＦ−αシグナル伝達経路が関与することが示唆される（図２、ＡＮＯＶＡ Ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【００８９】
本発明者らの炎症モデルにより、上清のサイトカイン産生の測定によって妥当性を検証した。本発明者らの実験条件では、ＬＰＳ刺激は、４８時間のときに、ＩＬ６（平均値±標準誤差、ｐｇ／ｍｌで、それぞれ対照群およびＬＰＳ群が２８８６０±５２５７対６１８６０±１２１９０；異なる５名の女性による実験ｎ＝１０、Ｐ＜０．０５）およびＩＬ８（ｐｇ／ｍｌで、対照群およびＬＰＳ群がそれぞれ８８５５±１４８６対１６０８０±２８３４；異なる５名の女性による実験ｎ＝１０、Ｐ＜０．０５）の有意な増加を伴ったが、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１０、ＩＬ１２ＢまたはＴＮＦ濃度の有意な増加を伴わなかった。
【００９０】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、時間が一致した対照に比べて、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌを用いた４８時間のインキュベーションが、転写レベルの２．３６±０．２２倍の増加を伴ったことを示したため、切断カスパーゼ−３タンパク質のこの過剰発現はまた、転写レベルで観察された（異なる３名の女性から得られた子宮筋層組織で実施した実験ｎ＝３）。
【００９１】
カスパーゼ−３ｍＲＮＡ発現に対するこの弱い効果は、本発明者らの実験条件、すなわち、ＬＰＳを用いた４８時間のインキュベーションによって説明することができる。実際、探索的分析において、本発明者らは、カスパーゼ−３ｍＲＮＡ発現の経時的傾向（３時間、６時間、１２時間、４８時間、７２時間）を評価し、ｍＲＮＡ発現のピークが約３時間の刺激で起こることを見出した（対照と比較して、３時間で８．６倍、６時間で６．１倍、１６時間で２．３倍、４８時間で２．１倍、７２時間で１．２倍の増加）。
【００９２】
別の実験において、ウェスタンブロット実験では、選択的ＡＤＲＢ３アゴニストである化合物Ａが、濃度依存的な様式で切断カスパーゼ−３発現のＬＰＳ誘導変化に著しく拮抗することができることを明らかにした（図３、ＡＮＯＶＡ Ｐ＜０．００１）。さらに、本発明者らは、ＢＡＸタンパク質の増加およびＢＣＬ２タンパク質の減少によって発現される、ミトコンドリア経路のＬＰＳ誘導活性のアポトーシスがそれぞれ、濃度依存的な様式で拮抗されることを観察した（図４、ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１）。化合物Ａ自体は、ＬＰＳで刺激されていない組織において、切断カスパーゼ−３、ＢＡＸおよびＢＣＬ２の発現に影響を与えなかった（データ未掲載）。最高濃度の化合物Ａの溶媒、すなわち、０．３％エタノールおよび０．０２％ＤＭＳＯを含む蒸留水は、ＬＰＳで刺激されていないまたは刺激された組織において、切断カスパーゼ−３、ＢＡＸおよびＢＣＬ２発現に影響を与えなかった（データ未掲載）。
【００９３】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＡＤＲＢ３処理がカスパーゼ−３転写物濃度の減少を伴うことを示したため、化合物Ａのカスパーゼ−３の過剰発現に対する効果を少なくとも部分的に転写レベルで説明した。（対照と比較して、ＧＡＰＤＨに標準化された、ＬＰＳ単独が２．０８±０．６３倍、１０−７Ｍ化合物Ａを含むＬＰＳが１．１７±０．８１倍、１０−６Ｍ化合物Ａを含むＬＰＳが０．８４±０．５３倍、１０−５Ｍ化合物Ａを含むＬＰＳが０．９３±０．４１倍の増加、ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。
【００９４】
最後に、効果がＩＬ８に対してのみ静的に有意であっても、化合物Ａは、ＩＬ６およびＩＬ８を濃度依存的な様式で減少させた（ＡＮＯＶＡ Ｐ＝０．０１；図５）。化合物Ａは、ＬＰＳで刺激されていない組織におけるＩＬ６およびＩＬ８の放出に対して影響を与えなかった（データ未掲載）。ＴＮＦは、４８時間でフローサイトメトリー技法の検出の低いレベル下となった。
【００９５】
全体的に見て、これらの結果から、化合物Ａがヒトの出産間近の子宮筋層におけるＬＰＳ誘導アポトーシスとサイトカイン産生を逆転させることが実証される。
【００９６】
本発明による医薬組成物
代表的な例として、錠剤の形態の、本発明による化合物の単位剤形は、以下の成分を含むことができる。
【００９７】
化合物Ａ ５０．０ｍｇ
マンニトール ２２３．７５ｍｇ
クロスカルメロースナトリウム ６．０ｍｇ
コーンスターチ １５．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ２．２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ３．０ｍｇ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にアポトーシスを調節するためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニスト誘導体の新規な治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−２−アドレナリン作動性受容体（ＡＤＲＢ２）アゴニストが、早期陣痛を治療する子宮収縮抑制薬として久しく用いられてきたが、限られた効果および毒性により、もはや第１選択薬として推奨されていない。オキシトシンアンタゴニストおよびカルシウムチャネル遮断薬は、有害影響の低いプロフィールを有する最近開発された薬物であり、それ故に、妊婦を含めた、高血圧を治療するために開発されたカルシウムチャネル遮断薬が子宮収縮抑制薬として認可されていなくても、これらはより広く用いられている（Ｋｉｍ他、Ｂｊｏｇ １１３ Ｓｕｐｐｌ ３：１１３−１１５頁、２００６年）。ＡＤＲＢ３は、自発性収縮に対する抑制作用を有する、ヒトの子宮筋層に存在し、優勢なＡＤＲＢであることが近年示されている（Ｂａｒｄｏｕ他、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３０：１９６０−１９６６頁、２０００年；Ｄｅｎｎｅｄｙ他、Ｂｊｏｇ １０８：６０５−６０９頁、２００１年；Ｒｏｕｇｅｔ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９０：１６４４−１６５０頁、２００５年）。
【０００３】
アポトーシスは、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）の主なタイプの１つであり、特徴的な細胞形態をもたらし死に至る組織化された一続きの生化学的事象が関与している。アポトーシスに関する研究は、実質的に１９９０年代の初めから増加している。生物学的現象としての重要性に加えて、不完全なアポトーシスプロセスは、多数の疾患に関与しているとされてきた。不完全な抗アポトーシスエフェクターにより制御の効かない細胞増殖を招く恐れがあるため、癌はアポトーシス調節の決定的な役割の主な例である。
【０００４】
Ｓｏｌａｒｙ他、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．９、１２９３−１３０５頁、１９９６年による総説では、癌；ウイルス感染症；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、自己免疫性糖尿病、炎症性腸症候群、１型糖尿病などの自己免疫疾患；劇症肝炎、慢性甲状腺炎を含めたＣＴＬ媒介自己免疫疾患などのｆａｓ媒介疾患；ＡＩＤＳ；骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、慢性好中球減少症、重症β−サラセミアなどの血液病；アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳変性症、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症などの神経変性障害；および多発性嚢胞腎疾患、毒性肝疾患、心筋梗塞、心筋発作、粥腫、関節炎、骨粗鬆症および加齢などの虚血傷害を含めた他の様々な疾患におけるアポトーシスの役割が確認されている。
【０００５】
アポトーシスはまた、子宮細胞の代謝回転および妊娠初期に主として関与している。げっ歯類の胚周囲の子宮上皮が、胚盤胞の存在に応答してアポトーシスを起こすことが十分に立証されている（Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年；Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年；およびＷｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年）。Ｊｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年では、着床に応答して子宮上皮および脱落膜における２つの異なるアポトーシスの経路が提案された。より最近には、Ｑｉａｎ Ｚｈａｎｇ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（５）、２２１５−２２２７頁、２００６年で、発情周期および妊娠初期の間の子宮細胞の代謝回転におけるアポトーシスおよび増殖が研究された。これらの結果により、子宮細胞のアポトーシスおよび増殖のパターンが、性周期および妊娠に関連した子宮の変化を維持する上で重要な役割を果たす、非常に規則正しい細胞特異的な現象であることが示されている。特に、これらは、カスパーゼ−３に媒介された細胞のアポトーシスが、ハムスターおよびマウスにおける着床過程を開始する上で重要な役割を果たし得ることを示している。
【０００６】
妊娠の分野におけるアポトーシスについての興味深い最初の話題は、胎盤の疾患である。実際、絨毛状の栄養膜のアポトーシスは、胎盤に関連する通常の妊娠疾患、すなわち、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）および子癇前症の両方においてアップレギュレートされる（Ｓｍｉｔｈ ＳＣ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９７年；１７７：１３９５−４０１頁；Ａｌｌａｉｒｅ Ａ Ｄ他、Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２０００年；９６：２７１−６頁；Ｅｒｅｌ ＣＴ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ ２００１年；７３：２２９−３５頁；Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｎ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００２年；１８６：１５８−６６頁）。アポトーシス核は、対照の胎盤と比較して、胎児の成長が制限された胎盤でより豊富であることが最近示されているため（Ｍａｄａｚｌｉ Ｒ他、Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ ２００６年；２６：５−１０頁）、アポトーシスを抑制することはＩＵＧＲまたは子癇前症を治療するまたは予防するための有望な手法とみなすことができる。
【０００７】
自発性早期陣痛は、解明されていても解明されていなくても、早産の最大の原因の１つであり、早産は、米国における最も多い乳児死亡の原因である（Ｃａｌｌａｇｈａｎ他、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１８、１５６６−１５７３頁、２００６年）。自発性早期陣痛の多くの場合は解明されていないが、かなりの割合が生殖管感染症または絨毛膜羊膜炎に関連づけられる（Ｅｄｗａｒｄｓ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３２、２８７−２９６頁、２００５年）。
【０００８】
Ｃｈａｒｐｉｇｎｙ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、６８、２２８９−２２９６頁、２００３年では、アポトーシスに関連する遺伝子は、分娩中にアップレギュレートされることが示された。
【０００９】
アポトーシス細胞死は、２つの選択的な収束経路、すなわち、細胞表面死受容体によって媒介される外因性経路、およびミトコンドリアによって媒介される内因性経路によって開始することができる（Ｄａｎｉａ他、Ｃｅｌｌ １１６：２０５−２１９頁、２００４年）。両経路において、細胞基質を切断するシステインアスパルチル特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）が活性化され、エフェクターであるカスパーゼ−３の活性化は、アポトーシス細胞死の実行に重要である。ｂｃｌ２ファミリーメンバーは、アポトーシスの調節において中心的な役割を果たしている。多領域のアポトーシス促進タンパク質ＢａｘおよびＢａｋは、これらのタンパク質が二重に欠損した細胞が、いくつかの異なる本来の死への刺激に対して抵抗性であるため、一緒になってアポトーシス細胞死に必要な出入り口を構成している（Ｄａｎｉａｌ他、Ｃｅｌｌ １１６：２０５−２１９頁、２００４年）したがって、ＢＡＸ、Ｂｃｌ−２および切断カスパーゼ−３は、アポトーシスを評価するために広く用いられている。
【００１０】
国際公開第０２／４４１３９号は、アミン上にシクロヘキシル（アルキル）基を有するいくつかのプロパノールアミンが、ＡＤＲＢ３に対して有力なアゴニスト活性を有することを開示している。この文献によると、これらの化合物を、例えば、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）などの炎症性腸疾患などの胃腸疾患の治療において、腸動力のモジュレーターとして、脂肪分解剤、抗肥満薬、抗糖尿病薬、向精神薬、緑内障治療薬、瘢痕形成薬および抗うつ薬として、子宮収縮抑制薬として、早産を予防または遅延するための陣痛抑制薬として、ならびに月経困難症の治療および／または予防に適応とすることができると示唆されている。さらに、これらの化合物は、例えば、うつ病などある種の中枢神経系疾患の治療、また尿失禁などある種の泌尿器系疾患の治療に用いることができる。
【００１１】
それにもかかわらず、アポトーシスを予防および／または抑制するためのこれらの化合物の使用は、開示も示唆もされていない。より一般的には、ＡＤＲＢ３とアポトーシスの間の関係は、今までのところ証明されていないまたは示唆されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０２／４４１３９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｉｍ他、Ｂｊｏｇ １１３ Ｓｕｐｐｌ ３：１１３−１１５頁、２００６年
【非特許文献２】Ｂａｒｄｏｕ他、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３０：１９６０−１９６６頁、２０００年
【非特許文献３】Ｄｅｎｎｅｄｙ他、Ｂｊｏｇ １０８：６０５−６０９頁、２００１年
【非特許文献４】Ｒｏｕｇｅｔ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９０：１６４４−１６５０頁、２００５年
【非特許文献５】Ｓｏｌａｒｙ他、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．９、１２９３−１３０５頁、１９９６年
【非特許文献６】Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年
【非特許文献７】Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年
【非特許文献８】Ｗｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年
【非特許文献９】Ｊｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年
【非特許文献１０】Ｑｉａｎ Ｚｈａｎｇ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（５）、２２１５−２２２７頁、２００６年
【非特許文献１１】Ｓｍｉｔｈ ＳＣ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９７年；１７７：１３９５−４０１頁
【非特許文献１２】Ａｌｌａｉｒｅ Ａ Ｄ他、Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２０００年；９６：２７１−６頁
【非特許文献１３】Ｅｒｅｌ ＣＴ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ ２００１年；７３：２２９−３５頁
【非特許文献１４】Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｎ他、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００２年；１８６：１５８−６６頁
【非特許文献１５】Ｍａｄａｚｌｉ Ｒ他、Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ ２００６年；２６：５−１０頁
【非特許文献１６】Ｃａｌｌａｇｈａｎ他、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１８、１５６６−１５７３頁、２００６年
【非特許文献１７】Ｅｄｗａｒｄｓ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３２、２８７−２９６頁、２００５年
【非特許文献１８】Ｃｈａｒｐｉｇｎｙ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、６８、２２８９−２２９６頁、２００３年
【非特許文献１９】Ｄａｎｉａｌ他、Ｃｅｌｌ １１６：２０５−２１９頁、２００４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、アポトーシスおよびそのモジュレーターを制御する新規な生物学的標的を同定する必要がある。
【００１５】
本発明者らは、現在、本発明の一目的である、ＡＤＲＢ３が、特に妊娠関連組織、すなわち子宮、胎盤および卵膜中のアポトーシス経路を制御する上で決定的な役割を演じていることを見出している。その上、驚くべきことに、国際公開第０２／４４１３９号において開示された化合物が、強力なアポトーシス抑制薬であることも発見している。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１の目的によれば、本発明は、雌性哺乳動物患者における妊娠関連組織のアポトーシスを予防するための医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００１７】
他の目的によれば、本発明は、妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、子宮のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、性周期障害、受胎障害および妊娠障害から選択された、妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００１８】
他の目的によれば、本発明は、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者における妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者における早期陣痛を予防および／または治療するのに適した医薬品；より具体的には、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者における（生殖管感染症が絨毛膜羊膜炎である。）早期陣痛を予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００１９】
他の目的によれば、本発明は、妊婦における妊娠関連組織アポトーシスを予防および／または抑制するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２０】
他の目的によれば、本発明は、主に早期陣痛および早産の結果となる、生殖管感染症に罹患している女性における子宮のアポトーシスを予防する医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２１】
他の目的によれば、本発明は、早産期前期破水の女性における卵膜のアポトーシスを予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２２】
他の目的によれば、本発明は、子宮内発育遅延または子癇前症が合併した妊娠女性における胎盤のアポトーシスを予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用に関する。
【００２３】
他の目的によれば、前記β−３アドレナリン作動性受容体アゴニストは、式（Ｉ）の化合物、
【００２４】
【化１】
［式（Ｉ）において、
Ａは式（ａ）または（ｂ）の基である。］
【００２５】
【化２】
［式中、
Ｒは、水素もしくはハロゲン原子、−Ｓ（Ｏ）ｚ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＮＨＳＯ２フェニル基を表し、前記フェニルは、ハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ１は、水素原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＣＯ−フェニル基を表し、前記フェニルは、ハロゲン原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ２は、水素原子、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＳＯ２フェニル基であり；
Ｘは、５−８個の原子を有する環を完成し、前記環は、飽和または不飽和であり、１または２個の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、１または２個のカルボニル基を有していてもよく；
ｎ、ｍおよびｚは、独立に０、１または２であり；
Ｒ３は、水素もしくはハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯＮＲ４Ｒ５、−ＣＯＯＨ、または４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イルもしくは４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イル基を表し；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子、フェニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基またはフェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を表す；または
Ｒ４およびＲ５は、これらが結合されている窒素原子と共に、合計で５から７個の原子を有する環を形成してもよい。］
およびこの塩から選択される。
【００２６】
本説明において、「（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」および「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル」という用語は、飽和の直鎖または分枝鎖を含む、Ｃ１−Ｃ４炭化水素およびＣ１−Ｃ６炭化水素から形成された一価基を指す。
【００２７】
本説明において、「ハロゲン」という用語は、塩素、臭素、ヨウ素およびフッ素から選択された原子を指す。
【００２８】
より具体的には、化合物は、ｎおよびｍがそれぞれ０である化合物である。
【００２９】
より具体的には、化合物は、Ｒ１が水素原子である化合物である。
【００３０】
より具体的には、化合物は、Ｒが−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基またはＮＨＳＯ２フェニル基から選択される化合物である。
【００３１】
より具体的には、化合物は、Ｒ３が、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたは−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたはＣＯＮＲ４Ｒ５である化合物である。
【００３２】
より具体的には、化合物は、Ｒ３がベンゼンの４位にある化合物である。
【００３３】
より具体的には、化合物は、ｚが２である化合物である。
【００３４】
より具体的には、化合物は、Ｘがメチレン、エチレンまたはプロピレンである化合物である。
【００３５】
より具体的には、化合物は、Ｘがカルボニル、−ＣＯ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｃ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）２−ＣＯ−基、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで一置換されたもしくは二置換されたメチレンまたは−ＣＯＣＨ２−基である。
【００３６】
より具体的には、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基および−ＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基は、それぞれ、ベンジルスルホニルアミノおよびベンジルスルホニルである。
【００３７】
結合される窒素原子を有するＲ４およびＲ５が、５−７個の原子を有する環を形成するとき、環は、より具体的にはピペリジンおよびピロリジンである。
【００３８】
以下の化合物は特に有利である。
【００３９】
本明細書において化合物Ａと呼ばれるエチル−４−｛トランス−４−［（（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−｛４−ヒドロキシ−３［（メチルスルホニル）−アミノ］フェノキシ｝プロピル）アミノ］シクロヘキシル｝ベンゾアート塩酸塩；これは上記で開示した、Ａが式（ａ）の基である式（Ｉ）の化合物［Ｒは−ＮＨＳＯ２メチルであり、Ｒ１はＯＨ、ｎ＝ｍ＝０であり、Ｒ３は−ＣＯＯエチルである。］である。
【００４０】
本発明による式（Ｉ）の化合物の塩は、ヒドロクロラート（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒａｔｅ）、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、二水素リン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩など、医薬として許容される無機酸もしくは有機酸との付加塩およびピクリン酸塩もしくはシュウ酸塩などの式（Ｉ）の化合物の適当な分離もしくは結晶化を可能にする付加塩または、例えば、カンファースルホン酸およびマンデル酸または置換されたマンデル酸などの光学活性酸との付加塩を含む。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物が遊離のカルボキシル基を有するとき、これらの塩はまた、無機塩基との塩、好ましくはナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属との塩または有機塩基との塩を含む。
【００４２】
式（Ｉ）の化合物の光学的に純粋な立体異性体および任意の割合での不斉炭素原子によるその異性体の混合物もまた、本発明の一部である。
【００４３】
より具体的には、式（Ｉ）の化合物は、ＯＨ基を有するプロパノールアミンの炭素の立体配置が（Ｓ）である化合物である。
【００４４】
式（Ｉ）の化合物は、（星印がついた）シクロヘキシル環の１位および４位の置換基の相対位置に応じて、「シス」または「トランス」幾何異性体の形態とすることができる。任意の割合でのこれらの純粋な異性体およびそれらの混合物は、本発明の一部である。
【００４５】
任意の割合での上記の光学立体異性体および幾何立体異性体の混合物もまた、本発明の一部である。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物の調製方法は、国際公開第０２／４４１３９号に開示されている。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物は、性周期障害、受胎障害および妊娠障害などの関連する妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害、ならびに早産期前期破水、ならびに早期陣痛、特に生殖管感染症が引き金となった早期陣痛を、その予防および治療を必要とする女性の患者において予防および／または治療するのに適した医薬品の調製に有用である。かかる患者は、日常分析によって容易に同定することができる。
【００４８】
本明細書で用いられる「雌性哺乳動物患者」という表現は、特に女性を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる「性周期障害」という表現は、Ｑｉａｎ Ｚｈａｎｇ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（５）、２２１５−２２２７頁、２００６年により示唆されたように、女性の月経周期の障害を意味し、特に、損傷を受けた子宮のアポトーシスを伴う障害を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる「受胎障害」という表現は、Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年；Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年；Ｗｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年およびＪｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年で開示された、着床などの女性の受胎能の障害を意味し、特に損傷を受けた子宮のアポトーシスを伴う障害を意味する。
【００５１】
本明細書で用いられる「妊娠障害」という表現は、Ｓｃｈｌａｆｋｅ他、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２１２：４７−５６頁、１９８５年；Ｐａｒｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６：２１１−２２５頁、１９８７年；Ｗｅｌｓｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９２：２１５−２３１頁、１９９１年およびＪｏｓｗｉｇ他、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １：４４頁、２００３年で開示された、妊娠初期などの雌性哺乳動物における妊娠の障害を意味し、特に損傷を受けた子宮のアポトーシスを伴う障害を意味する。
【００５２】
本発明の使用に対して、有効量の式（Ｉ）の化合物または有効量の医薬として許容されるその塩は、このような治療を必要とする哺乳動物に投与される。
【００５３】
上記の式（Ｉ）の化合物および医薬として許容されるその塩は、治療しようとする哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．０１から２０ｍｇを１日量として、好ましくは、０．１から１０ｍｇ／ｋｇを１日量として用いることができる。ヒトにおいて、治療しようとする個体の年齢、治療の種類、予防薬または治療薬、および障害の重篤度に応じて、用量は、好ましくは１日０．５ｍｇから１５００ｍｇまで変わり、具体的には２．５から５００ｍｇまで変わり得る。式（Ｉ）の化合物は一般に、有効成分０．１から５００ｍｇ、好ましくは０．５から１００ｍｇを投与単位として、１日１回から５回投与される。
【００５４】
前記投与単位は、好ましくは、有効成分が製剤添加物と混合される医薬組成物中に配合される。
【００５５】
したがって、その態様の他のものによれば、本発明は、有効成分として、上記の式（Ｉ）の化合物または医薬として許容されるその塩を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所、経皮または直腸投与のための本発明の医薬組成物において、上記の式（Ｉ）および医薬として許容されるその塩の有効成分は、単位投与形態で、通常の医薬用担体と混合して、前述の障害を治療するために動物およびヒトに投与することができる。適当な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、散剤、顆粒剤および経口液剤または経口懸濁剤などの経口形態、舌下および口腔投与形態、皮下、筋肉内または静脈内投与形態、局所投与形態および直腸投与形態を含む。
【００５７】
錠剤の形態の固体組成物を調製するとき、主な有効成分を、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴムなどの医薬用ビヒクルと混合する。錠剤は、スクロースまたは他の適当な物質でコーティングすることができるまたは錠剤は、それらが活性を持続するまたは遅らせるように処理することができ、連続的な方式で所定の量の有効成分を放出するよう処理することができる。
【００５８】
ゲルカプセルの調製は、有効成分を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟ゲルカプセルまたは硬ゲルカプセル中に注ぐことによって得られる。
【００５９】
シロップ剤またはエリキシル剤の形態の調製は、有効成分を甘味剤、好ましくはカロリーが無い甘味剤、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベンと共に含むことができ、フレーバーエンハンサーおよび適当な着色料もまた共に含むことができる。
【００６０】
水分散性散剤または水分散性顆粒剤は、ポリビニルピロリドンなどの、分散剤もしくは湿潤剤または懸濁化剤と混合し、甘味剤またはフレーバー矯正剤とも混合した有効成分を含むことができる。
【００６１】
局所投与について、有効成分を、クリーム剤または軟膏剤を調製するために賦形剤に混ぜ入れるまたは例えば洗眼剤の形態で、眼内投与用のビヒクルに溶かす。
【００６２】
直腸投与について、例えば、カカオ脂やポリエチレングリコールなど、直腸温で融解する結合剤で調製された坐剤を利用する。
【００６３】
非経口投与について、例えば、プロピレングリコールまたはブチレングリコールなど、薬理学的に適合性のある分散剤および／または湿潤剤を含む、水性懸濁剤、食塩水または注射用無菌液を用いる。
【００６４】
有効成分は、マイクロカプセルの形態で、場合によって１つまたは複数の担体または添加剤と配合することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】切断カスパーゼ−３タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を表す図である。ＣＴＲＬ＝対照；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間；ＣＡ＝絨毛膜羊膜炎。実験を、異なる３名の絨毛膜羊膜炎の女性から得られた子宮筋層試料（ＣＡ群）および無併発性妊娠でＬＰＳで刺激されたまたは刺激されていない異なる５名の女性から帝王切開術で得られた５つの子宮筋層（それぞれＬＰＳ群およびＣＴＲＬ群）において実施した。＊Ｐ＜０．０５対対照。
【図２】切断カスパーゼ−３タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を示す図である。対照＝時間が一致した実験；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間、ＴＮＦα−ａｂ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ＋ＴＮＦα−ａｂ０．６μｇ／ｍｌ、４８時間。実験を、異なる３名の女性から選択的帝王切開術で得られた３つの子宮筋層において実施した。＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ。
【図３】切断カスパーゼ−３タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を示す図である。対照＝時間が一致した実験；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間。化合物Ａ（１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ）を、ＬＰＳ刺激の前に２０分間加えた。実験を、異なる５名の女性から選択的帝王切開術で得られた５つの子宮筋層において実施した。＃Ｐ＜０．０５対対照、＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ。
【図４】ＢＡＸおよびＢｃｌ−２タンパク質の発現を示す半定量化によるウェスタンブロット分析を示す図である。対照＝時間が一致した実験；ＬＰＳ＝ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌ、４８時間。化合物Ａ（１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ）を、ＬＰＳ刺激の前に２０分間加えた。実験を、異なる７名の女性から選択的帝王切開術で得られた７つの子宮筋層において実施した。＃Ｐ＜０．０５対対照、＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ、＊＊Ｐ＜０．０１対ＬＰＳ。
【図５】ＩＬ−６およびＩＬ−８の濃度に対する化合物Ａの効果を示す図である。結果（平均値±標準誤差、ｐｇ／ｍｌで）は、異なる５名の女性から選択的帝王切開術で得られた子宮筋層に繰り返して実施した５回の実験から得られている。＃Ｐ＜０．０５対対照、＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳ、＊＊Ｐ＜０．０１対ＬＰＳ。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００６７】
薬物および溶液
リポ多糖類（ＬＰＳ）（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０５５：Ｂ５、参照：Ｌ２８８０）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、蒸留水に溶かした。化合物Ａは、Ｓａｎｏｆｉ−Ｍｉｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ Ｓ．ｐ．Ａからの寄贈品であった。化合物Ａを、１ｍＭ溶液に対して３０％無水エタノール、２％ジメチルスルホキシドおよび蒸留水の混合物中に溶かし、その後、蒸留水で希釈した。最終の最高浴濃度は、エタノールが０．３％であり、ＤＭＳＯが０．０２％であった。
【００６８】
生体試料
子宮筋層生検試料は、次に概説する異なる４通りの臨床状態の妊娠中の女性から得られた。ｉ）分娩後に子宮摘出を受けた確立された絨毛膜羊膜炎の女性１名；ｉｉ）分娩後の出血のため分娩後に子宮摘出を受けた絨毛膜羊膜炎のない女性１名；ｉｉｉ）選択的帝王切開術を受けた確立された絨毛膜羊膜炎の女性３名；ｉｖ）他の理由（児頭骨盤不均衡）で選択的帝王切開術を受けた絨毛膜羊膜炎のない女性１０名。帝王切開術を受けた女性には、その手順を、妊娠３８−４０週の間の妊娠期間に、分娩開始の前にすべて実施した。臨床上の絨毛膜羊膜炎は、子宮圧痛および／または膿性のもしくは悪臭のある羊水が、次の分娩前体温３７．８℃以上、母体頻拍（拍動数１２０／分以上）、母体の１ｍｍ３あたり１８，０００細胞以上の白血球増加、または胎児頻拍（拍動数１６０／分以上）のうちいずれか２つと共に存在するものとして古典的に定義され（Ｒｅｄｌｉｎｅ ＲＷ他、Ｐｌａｃｅｎｔａ ２００５年；２６ Ｓｕｐｐｌ Ａ：Ｓ１１４−１１７頁）、本試験に含まれるすべての場合において、妥当性が検証された基準を用いて１人の病理学者により胎盤の陽性培養または胎盤の組織学的評価によって確認された（Ｒｅｄｌｉｎｅ ＲＷ他、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｄｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ２００３年；６：４３５−４４８頁）。したがって、この試験の残りにおいて、絨毛膜羊膜炎は、確立された絨毛膜羊膜炎を意味する。
【００６９】
子宮筋層の細片を、前述のように子宮筋線維の大部分が反対の胎盤部位で縦方向となる、すぐの漿膜下部位から切除した（Ｒｏｕｇｅｔ Ｃ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００５年；９０：１６４４−１６５０頁、Ｌｅｒｏｙ ＭＪ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９８９年；３８：９−１５頁）。この試験は、「生物医学研究における人の保護のための諮問委員会（Ｃｏｍｉｔｅ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｆ ｄｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ ｐｏｕｒ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｅ）」（ＣＣＰＰＲＢ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって認可されており、インフォームドコンセントは、すべてのドナーから得られた。
【００７０】
確立された絨毛膜羊膜炎の女性または分娩後の出血を伴う女性から得られた組織は、後述のように、新鮮な組織を用いてウェスタンブロット実験を実施したまたは組織学的評価およびヘキスト染色のためパラフィンに包埋した。
【００７１】
無併発性妊娠から得られた子宮筋層生検試料を、絨毛膜羊膜炎の影響を模倣するＬＰＳ実験モデルを開発するために用いた。
【００７２】
Ｅ．コリＬＰＳによる子宮筋層生検試料の刺激
無併発性妊娠の女性から得られた子宮筋層生検試料を、無菌のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に直ちに移し、無菌のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。生検試料を小型の細片に切り、抗生物質を使用せず、それぞれをＤＭＥＭ培養培地２ｍｌを含む２４穴プレートに入れた。次いで、サイトカインレベルを基底値に戻させるために、細片をＣＯ２５％で３７℃で４８時間インキュベートした（Ｆｏｒｔｕｎａｔｏ ＳＪ他、Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４年；３２：１８４−１８７頁）。
【００７３】
ＬＰＳ（エシェリキア・コリ０５５：Ｂ５）で絨毛膜羊膜炎の女性から得られた子宮筋層試料の知見を再現するために、子宮筋層細片を、異なる３種のＬＰＳ濃度（５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）で異なる３通りの時間（８時間、２４時間、４８時間）でインキュベートした。
【００７４】
第２の実験において、子宮筋層組織中のＬＰＳ誘導アポトーシスにおけるＴＮＦの役割を評価するために、細片を、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌで抗ＴＮＦ抗体（０．６μｇ／ｍｌ）を含んでまたは含まずに４８時間インキュベートした（ヒトＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ、使用した抗体の濃度を、製造業者の推奨に基づいて選択した。）。
【００７５】
ＡＤＲＢ３刺激のＬＰＳ誘導アポトーシスを妨害する能力を評価することを目標とした第３の実験において、化合物Ａの存在下または非存在下で、子宮筋層細片をＬＰＳ１０μｇ／ｍｌで４８時間インキュベートし、選択的なＡＤＲＢ３アゴニスト（Ｃｒｏｃｉ Ｔ他、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２００７年；３２１：１１１８−１１２６頁）（０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭ）をＬＰＳ刺激を開始する直前に加えた。時間が一致した対照実験を、化合物Ａの溶媒、すなわち、最終浴濃度として、０．３％エタノールおよび０．０２％ＤＭＳＯを含有する蒸留水、刺激されていない子宮筋層試料およびＬＰＳにより刺激された子宮筋層試料を用いて実施した。
【００７６】
刺激期間の終わりに、上清試料および組織を速やかに液体窒素で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【００７７】
ウェスタンブロット分析
急速凍結した子宮筋層組織は、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘを用いてホモジナイズ緩衝液［１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ロイペプチン４０ｍｇ／ｍｌ−１、２ｍＭペファブロック］中でホモジナイズした。４℃で１５分間５００×ｇで最初の遠心を行った後、上清の全タンパク質含有量を、ブラッドフォード法により標準としてＢＳＡで決定した。試料（レーンごとにタンパク質４０μｇ）を、２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ他、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７０年；４７：６９−８５頁）中で溶かし（体積／体積）、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の前に５分間煮沸した。タンパク質を、ニトロセルロースメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。非特異的な抗体結合を遮断するため、メンブランを、トリス緩衝食塩水／Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．８）中の１０％脱脂粉乳粉末で室温で１時間インキュベートした。遮断されたメンブランを、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、ブロットを、１：２００希釈の一次切断カスパーゼ−３抗体（ＡＳＰ１７５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）または１：５００希釈の一次ＢＡＸポリクローナル抗体（ｓｃ−４９３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）または１：５００希釈の一次ＢＣＬ２ポリクローナル抗体（ｓｃ−７３８２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳＴ中の１％脱脂粉乳粉末で４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗ウサギＩｇＧ（ＮＡ ９３４、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）もしくは抗マウスＩｇＧ（ＮＡ ９３１、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）の全抗体を用いて１：１００００希釈で室温で４５分間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで５回洗浄した。免疫反応性タンパク質を、化学発光（ＥＣＬ（商標）検出試薬、ＲＰＮ２１０５、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）およびＸ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＵＳＡ）への照射によって検出した。バンドの強度を、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．６２プログラムを用いてデンシトメトリーで分析し、タンパク質ローディング対照として用いたグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対するモノクローナル抗体で得られたバンドの強度によって標準化した。結果は、任意密度単位（Ａ．Ｄ．Ｕ）の平均値±標準誤差として表される。
【００７８】
免疫組織化学分析
子宮筋層細片を、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、次いで、パラフィンに包埋し、５マイクロメートル厚の切片に切った。子宮筋層切片の脱パラフィン、および再水和後、抗原回復を、圧力鍋を用いてｐＨ６の温かいクエン酸緩衝液中で１０分スライドをインキュベートすることによって行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で遮断した後、スライドを、一次抗切断カスパーゼ−３ＩｇＧ（１：１００）のどちらかでインキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後、ビオチン化抗ウサギ（１：６００）免疫グロブリンと共にそれぞれ１時間インキュベートした。新たに洗浄した後、スライドをペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（１：８００）中で３０分間インキュベートし、次いで、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）溶液と共に、明らかに目に見える色を発色するまでインキュベートした。その反応は、再蒸留水での広範な洗浄によって停止した。続いて、その標本をヘマトキシリンで対比染色した。組織学的な変化を、染色の全体的な強度の変動によって評価した。負の制御を一次抗体を取り除くことによって実施した。
【００７９】
ヘキスト染色
アポトーシス細胞および壊死細胞を区別するために、染色質凝縮状態を、核のヘキスト−３３３４２での染色によって評価した。子宮筋層試料のパラフィン包埋した切片を前述の通り再水和させた。次いで、スライドをヘキスト−３３３４２（２μｇ／ｍｌ）で２分間インキュベートした。これらのスライドを蒸留水ですすぎ、Ａｑｕａｔｅｘ（Ｃ）でマウントした。染色した核を、切り替え式の蛍光顕微鏡で×１００の倍率で、３５０ｎｍの励起光を用いて可視化した。
【００８０】
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってトリゾール溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、異なる５名の女性から得られた５つの子宮筋層組織から調製した。ＲＮＡの完全性を、アガロースゲルの臭化エチジウム染色分析によっておよび光学密度（ＯＤ）の吸収比ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ≧１．８によって検証した。全ＲＮＡ１マイクログラムを、製造業者の説明書に従って、Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共にオリゴ（ｄＴ）を用いて逆転写させた。リアルタイム定量ＰＣＲ分析を、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱリアルタイム検出システム機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ活性化試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を用いて、最終体積２５μｌとして、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの両方で２００ｎＭと共に逆転写された全ＲＮＡ２５ｎｇを用いて実施した。ＰＣＲ産物を、単一の増幅産物の予想したサイズが実際得られたことを保証するために臭化エチジウム染色されたアガロースゲルでも分析した。
【００８１】
それぞれの反応を２回繰り返して行い、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）をそれぞれの実験で用いて、ｃＤＮＡ量の変動を制御した。制御によって倍の変動として表されたいかなる所与の遺伝子の相対定量も、製造業者のプロトコルに従って所与の遺伝子のサイクル閾（Ｃｔ）値間の差を決定した後、式２−Δ（ΔＣｔＡ−ΔＣｔＢ）［式中、ΔＣｔＡは対象となる遺伝子のΔＣｔであり；ΔＣｔＢはＧＡＰＤＨのΔＣｔであり、ΔＣｔ＝実験群のＣｔ−対照群のＣｔである。］を用いて算出した。ＰＣＲを特異的プライマー：ＧＡＰＤＨ（順方向、５’ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ３’および逆方向、５’ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣ−ＡＴＧＡＧ３’）およびカスパーゼ−３（順方向、５’ＡＧＡＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＴＴＧＡＧ３’および逆方向、５’ＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧ３’）を用いて実施した。
【００８２】
サイトカイン濃度測定
サイトカイン測定値を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ；Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）によって決定した。５つの子宮筋層細片の上清を、標識された結合ビーズおよび検出試薬と共に暗所で室温で３時間インキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でそれぞれのＣＢＡ分析ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＢｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社のソフトウェアを用いることによって分析した。定量用のサイトカイン標準液（ｐｇ／ｍＬ）ならびにブランクを、試料と同じ方式で処理した。それぞれの実験を、結果の再現性を保証するために繰り返して実施した。
【００８３】
結果の統計分析
群間の差を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定し、それに続いてダンの多重比較検定によって決定した。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔバージョン３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて実施した。Ｐ＜０．０５のとき、すべての差を有意とみなした。
【００８４】
選択的ＡＤＲＢ３アゴニストである化合物Ａのアポトーシスおよび炎症に対する効果
切断カスパーゼ−３抗体を用いた、異なる４名の確立された絨毛膜羊膜炎の女性から得られた４つの子宮筋層組織試料の免疫染色は、分娩後の出血を伴う女性から得られた１つの対照組織（Ｓｈｅｉｎｅｒ Ｅ他、Ｊ Ｍａｔｅｒｎ Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ ２００５年；１８：１４９−１５４頁）（データ未掲載）においても、選択的帝王切開術で得られた３つの組織（データ未掲載）においても観察されなかった強い染色（データ未掲載）を示した。この染色は、特に子宮筋層の細胞中にあった。最適条件（すなわち、ＬＰＳ刺激の８時間、２４時間、４８時間の時間経過および５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの用量反応の実験後に決定された、１０μｇ／ｍｌ、４８時間）におけるＬＰＳ刺激はまた、特に子宮筋層の細胞中にあった強い切断カスパーゼ−３染色を伴った（データ未掲載）。
【００８５】
絨毛膜羊膜炎の女性（ｎ＝４）、分娩後の出血を伴う女性（ｎ＝１）またはＬＰＳで刺激された選択的帝王切開術を用いた女性（ｎ＝４）もしくはＬＰＳで刺激されていない選択的帝王切開術を用いた女性（ｎ＝４）から得られた子宮筋層切片のヘキスト−３３３４２染色は、絨毛膜羊膜炎およびＬＰＳ刺激（データ未掲載）が両方とも、分娩後の出血または帝王切開術（データ未掲載）と比較して、アポトーシスの開始を示す凝縮した染色質を有する細胞の割合の増加を伴うことを示した。
【００８６】
同じ３名の絨毛膜羊膜炎の女性から得られたまたは帝王切開術およびＬＰＳで刺激されたもしくは刺激されていない（対照）５名から得られた妊娠時の子宮筋層から調製されたメンブランのウェスタンブロットは、切断カスパーゼ−３に対応する１７−ｋＤａバンドおよび１９−ｋＤａバンド（データ未掲載）を示した。
【００８７】
濃度測定の免疫ブロット分析は、切断カスパーゼ−３タンパク質が、絨毛膜羊膜炎およびＬＰＳ刺激後のどちらの場合においても、対照として用いたＬＰＳ刺激のない選択的帝王切開術と比較して、著しく過剰発現したことを示した（任意密度単位、ＡＤＵで表され、絨毛膜羊膜炎、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌおよび対照群がそれぞれ９２１±３９、９４１．６±１３４、対４５２±５０．６であった。Ｐ＜０．０５）（図１）。ＬＰＳ刺激によって誘導された切断カスパーゼ−３の過剰発現は、絨毛膜羊膜炎のインビトロＬＰＳ誘導モデルの外部バリデーションを提供する、絨毛膜羊膜炎の女性の妊娠時の子宮筋層から調製されたメンブランで実施したウェスタンブロット実験において観察されたもの（図１）と同程度であった。
【００８８】
切断カスパーゼ−３のこの過剰発現は、ＴＮＦ−α受容体を選択的ＴＮＦ−α抗体で遮断することにより強く拮抗され、ヒトの出産間近の子宮筋層におけるＬＰＳ誘導アポトーシスに、ＴＮＦ−αシグナル伝達経路が関与することが示唆される（図２、ＡＮＯＶＡ Ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【００８９】
本発明者らの炎症モデルにより、上清のサイトカイン産生の測定によって妥当性を検証した。本発明者らの実験条件では、ＬＰＳ刺激は、４８時間のときに、ＩＬ６（平均値±標準誤差、ｐｇ／ｍｌで、それぞれ対照群およびＬＰＳ群が２８８６０±５２５７対６１８６０±１２１９０；異なる５名の女性による実験ｎ＝１０、Ｐ＜０．０５）およびＩＬ８（ｐｇ／ｍｌで、対照群およびＬＰＳ群がそれぞれ８８５５±１４８６対１６０８０±２８３４；異なる５名の女性による実験ｎ＝１０、Ｐ＜０．０５）の有意な増加を伴ったが、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１０、ＩＬ１２ＢまたはＴＮＦ濃度の有意な増加を伴わなかった。
【００９０】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、時間が一致した対照に比べて、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌを用いた４８時間のインキュベーションが、転写レベルの２．３６±０．２２倍の増加を伴ったことを示したため、切断カスパーゼ−３タンパク質のこの過剰発現はまた、転写レベルで観察された（異なる３名の女性から得られた子宮筋層組織で実施した実験ｎ＝３）。
【００９１】
カスパーゼ−３ｍＲＮＡ発現に対するこの弱い効果は、本発明者らの実験条件、すなわち、ＬＰＳを用いた４８時間のインキュベーションによって説明することができる。実際、探索的分析において、本発明者らは、カスパーゼ−３ｍＲＮＡ発現の経時的傾向（３時間、６時間、１２時間、４８時間、７２時間）を評価し、ｍＲＮＡ発現のピークが約３時間の刺激で起こることを見出した（対照と比較して、３時間で８．６倍、６時間で６．１倍、１６時間で２．３倍、４８時間で２．１倍、７２時間で１．２倍の増加）。
【００９２】
別の実験において、ウェスタンブロット実験では、選択的ＡＤＲＢ３アゴニストである化合物Ａが、濃度依存的な様式で切断カスパーゼ−３発現のＬＰＳ誘導変化に著しく拮抗することができることを明らかにした（図３、ＡＮＯＶＡ Ｐ＜０．００１）。さらに、本発明者らは、ＢＡＸタンパク質の増加およびＢＣＬ２タンパク質の減少によって発現される、ミトコンドリア経路のＬＰＳ誘導活性のアポトーシスがそれぞれ、濃度依存的な様式で拮抗されることを観察した（図４、ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１）。化合物Ａ自体は、ＬＰＳで刺激されていない組織において、切断カスパーゼ−３、ＢＡＸおよびＢＣＬ２の発現に影響を与えなかった（データ未掲載）。最高濃度の化合物Ａの溶媒、すなわち、０．３％エタノールおよび０．０２％ＤＭＳＯを含む蒸留水は、ＬＰＳで刺激されていないまたは刺激された組織において、切断カスパーゼ−３、ＢＡＸおよびＢＣＬ２発現に影響を与えなかった（データ未掲載）。
【００９３】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＡＤＲＢ３処理がカスパーゼ−３転写物濃度の減少を伴うことを示したため、化合物Ａのカスパーゼ−３の過剰発現に対する効果を少なくとも部分的に転写レベルで説明した。（対照と比較して、ＧＡＰＤＨに標準化された、ＬＰＳ単独が２．０８±０．６３倍、１０−７Ｍ化合物Ａを含むＬＰＳが１．１７±０．８１倍、１０−６Ｍ化合物Ａを含むＬＰＳが０．８４±０．５３倍、１０−５Ｍ化合物Ａを含むＬＰＳが０．９３±０．４１倍の増加、ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。
【００９４】
最後に、効果がＩＬ８に対してのみ静的に有意であっても、化合物Ａは、ＩＬ６およびＩＬ８を濃度依存的な様式で減少させた（ＡＮＯＶＡ Ｐ＝０．０１；図５）。化合物Ａは、ＬＰＳで刺激されていない組織におけるＩＬ６およびＩＬ８の放出に対して影響を与えなかった（データ未掲載）。ＴＮＦは、４８時間でフローサイトメトリー技法の検出の低いレベル下となった。
【００９５】
全体的に見て、これらの結果から、化合物Ａがヒトの出産間近の子宮筋層におけるＬＰＳ誘導アポトーシスとサイトカイン産生を逆転させることが実証される。
【００９６】
本発明による医薬組成物
代表的な例として、錠剤の形態の、本発明による化合物の単位剤形は、以下の成分を含むことができる。
【００９７】
化合物Ａ ５０．０ｍｇ
マンニトール ２２３．７５ｍｇ
クロスカルメロースナトリウム ６．０ｍｇ
コーンスターチ １５．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ２．２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ３．０ｍｇ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
雌性哺乳動物患者における妊娠関連組織のアポトーシスを予防する医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用。
【請求項２】
妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害が、子宮アポトーシス関連疾患および／または障害である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害が、性周期障害、受胎障害および妊娠障害から選択される、請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
前記医薬品が、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者において妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適している、請求項２から４の一項に記載の使用。
【請求項６】
前記医薬品が、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者において早期陣痛を予防および／または治療するのに適している、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記生殖管感染症が、絨毛膜羊膜炎である、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
妊婦における妊娠関連組織のアポトーシスを予防および／または抑制するのに適した医薬品の調製のための、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記医薬品が、子宮内発育遅延または子癇前症を予防および／または治療するのに適している、請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬品が、早産期前期破水を予防および／または治療するのに適している、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
前記アゴニストが、式（Ｉ）の化合物
【化１】
［式（Ｉ）において、
Ａは式（ａ）または（ｂ）の基であり、
【化２】
式中、
Ｒは、水素もしくはハロゲン原子、−Ｓ（Ｏ）ｚ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＮＨＳＯ２フェニル基を表し、（前記フェニルは、ハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ１は、水素原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＣＯ−フェニル基を表し、前記フェニルは、ハロゲン原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ２は、水素原子、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＳＯ２フェニル基であり；
Ｘは、５−８個の原子を有する環を完成し、前記環は、飽和または不飽和であり、１または２個の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、１または２個のカルボニル基を有していてもよく；
ｎ、ｍおよびｚは、独立に０、１または２であり；
Ｒ３は、水素もしくはハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯＮＲ４Ｒ５、−ＣＯＯＨ、または４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イルもしくは４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イル基を表し；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子、フェニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基またはフェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を表す；または
Ｒ４およびＲ５は、これらが結合されている窒素原子と共に、合計で５から７個の原子を有する環を形成してもよい。］ならびにこれらの立体異性体および混合物、これらの医薬として許容される塩である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
式（Ｉ）において、ｎおよびｍがそれぞれ０である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
式（Ｉ）において、Ｒが、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＮＨＳＯ２フェニル基から選択される、請求項１１から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
式（Ｉ）において、Ｒ３が、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたは−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたはＣＯＮＲ４Ｒ５である、請求項１１から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
式（Ｉ）において、Ｒ３がベンゼンの４位にある、請求項１１から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
式（Ｉ）において、ｚが２である、請求項１１から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
式（Ｉ）において、Ｘがメチレン、エチレンまたはプロピレンである、請求項１１から１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
式（Ｉ）において、Ｘがカルボニル、−ＣＯ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｃ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）２−ＣＯ−基、（（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで一置換もしくは二置換された）メチレン基または−ＣＯＣＨ２−基である、請求項１１から１８のいずれかに記載の使用。
【請求項１】
雌性哺乳動物患者における妊娠関連組織のアポトーシスを予防する医薬品の調製のためのβ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用。
【請求項２】
妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適した医薬品の調製のための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害が、子宮アポトーシス関連疾患および／または障害である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害が、性周期障害、受胎障害および妊娠障害から選択される、請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
前記医薬品が、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者において妊娠関連組織のアポトーシスに関係する疾患および／または障害を予防および／または治療するのに適している、請求項２から４の一項に記載の使用。
【請求項６】
前記医薬品が、生殖管感染症に罹患している雌性哺乳動物患者において早期陣痛を予防および／または治療するのに適している、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記生殖管感染症が、絨毛膜羊膜炎である、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
妊婦における妊娠関連組織のアポトーシスを予防および／または抑制するのに適した医薬品の調製のための、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記医薬品が、子宮内発育遅延または子癇前症を予防および／または治療するのに適している、請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬品が、早産期前期破水を予防および／または治療するのに適している、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
前記アゴニストが、式（Ｉ）の化合物
【化１】
［式（Ｉ）において、
Ａは式（ａ）または（ｂ）の基であり、
【化２】
式中、
Ｒは、水素もしくはハロゲン原子、−Ｓ（Ｏ）ｚ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＮＨＳＯ２フェニル基を表し、（前記フェニルは、ハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ１は、水素原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＣＯ−フェニル基を表し、前記フェニルは、ハロゲン原子または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で場合によっては置換されており；
Ｒ２は、水素原子、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＳＯ２フェニル基であり；
Ｘは、５−８個の原子を有する環を完成し、前記環は、飽和または不飽和であり、１または２個の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、１または２個のカルボニル基を有していてもよく；
ｎ、ｍおよびｚは、独立に０、１または２であり；
Ｒ３は、水素もしくはハロゲン原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯＮＲ４Ｒ５、−ＣＯＯＨ、または４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イルもしくは４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾル−２−イル基を表し；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子、フェニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基またはフェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を表す；または
Ｒ４およびＲ５は、これらが結合されている窒素原子と共に、合計で５から７個の原子を有する環を形成してもよい。］ならびにこれらの立体異性体および混合物、これらの医薬として許容される塩である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
式（Ｉ）において、ｎおよびｍがそれぞれ０である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
式（Ｉ）において、Ｒが、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−ＮＨＳＯ２フェニル−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または−ＮＨＳＯ２フェニル基から選択される、請求項１１から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
式（Ｉ）において、Ｒ３が、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたは−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたはＣＯＮＲ４Ｒ５である、請求項１１から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
式（Ｉ）において、Ｒ３がベンゼンの４位にある、請求項１１から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
式（Ｉ）において、ｚが２である、請求項１１から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
式（Ｉ）において、Ｘがメチレン、エチレンまたはプロピレンである、請求項１１から１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
式（Ｉ）において、Ｘがカルボニル、−ＣＯ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｃ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）２−ＣＯ−基、（（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで一置換もしくは二置換された）メチレン基または−ＣＯＣＨ２−基である、請求項１１から１８のいずれかに記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３２３４２（Ｐ２０１０−５３２３４２Ａ）
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４１９１（Ｐ２０１０−５１４１９１）
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００２７５２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９６０７
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ−アベンテイス (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００２７５２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９６０７
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ−アベンテイス (433)
【Ｆターム（参考）】
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