アルミニウムアジュバントに即座に吸着されるインフルエンザワクチン
アジュバントインフルエンザワクチンの抗原成分およびアジュバント成分は、製造の間に混合されないが、例えば、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分；および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を備えるキットとして、使用時に即時混合するために別個の成分として提供される。本発明は、上記抗原の上記アジュバントへの吸着は、実質的に即座に生じ、かつワクチン接種の間に直面する条件下で不可逆的であることが見出されている（本明細書中の例を参照のこと）が故に、有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（政府の利益）
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓからの米国政府契約ＨＨＳＮ２６６２００４０００３２Ｃによる支援によって、本発明は、全体または一部が行われた。したがって、米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのアジュバントワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）の分野にある。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
水中油型エマルションアジュバントを含むＣｈｉｒｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ製のＦＬＵＡＤＴＭ製品を除いて、現在、インフルエンザワクチンは、一般的使用においてアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）されない。これらのワクチンは、参考文献１の第１７章および第１８章においてさらに詳細に記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。
【０００５】
より最近、アルミニウム塩アジュバントを含めることが、インフルエンザワクチンについて提案されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献１）。さらなる混合工程を必要とし、それによって製造全体を減速させることに加え、これらの塩を含むことは、種々の懸案事項に関連する。例えば、それらの不溶性は、吸着された抗原は懸濁から沈殿することを意味するので、バルクワクチンからの個々の用量の調製はさらなる配慮を必要とする。さらに、上記塩に対する抗原の結合は、最終的なワクチンの品質管理を難しくする。特に、インフルエンザワクチンに関するいくつかの力価試験は、結合されていない抗原を必要とするインビトロイムノアッセイに基づく（すなわち、アジュバントへの吸着は、これらの試験を使用することができないことを意味する）。
【特許文献１】米国特許第６，３７２，２２３号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ００／１５２５１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ０１／２２９９２号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｅｈｍｅら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、２００４年、第１０３巻（１−２）、ｐ．１６３〜１７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらなるアジュバントインフルエンザワクチンおよび改良されたアジュバントインフルエンザワクチン（流行中における使用および大流行の間の使用の両方のため）、ならびにそれらの調製のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明にしたがって、アジュバントインフルエンザワクチンの抗原成分および上記アジュバント成分は、製造の間に混合されないが、使用時に即時混合するために別個の成分として提供される。本発明は、上記抗原の上記アジュバントへの吸着は、実質的に即座に生じ、かつワクチン接種の間に直面する条件下で不可逆的であることが見出されている（本明細書中の例を参照のこと）が故に、有効である。したがって、本発明は、製造の間に混合を行うことによって生じる種々の懸案事項を回避する。
【０００８】
したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分；および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分；を備えるキットを提供する。成分（ｉ）は、アルミニウム塩アジュバントを含まず、そして成分（ｉｉ）は、インフルエンザウイルス抗原を含まない。
【０００９】
本発明はまた、同時の分離した使用または連続的な使用のための、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と、（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を提供する。
【００１０】
本発明はまた、インフルエンザウイルス抗原とアルミニウム塩アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、その組成物は、使用時点においてその抗原とそのアジュバントとを即時混合することによって調製された。
【００１１】
本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分を調製する工程；（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を調製する工程；および（ｉｉｉ）その抗原成分とそのアジュバント成分とをキット中に組み合わせる工程を包含する、インフルエンザワクチンを調製するための方法を提供する。その方法はまた、（ｉｖ）患者に対する投与のために上記抗原成分および上記アジュバント成分を混合する工程を提供し得るが、工程（ｉｖ）は、代表的に、製造業者よりもむしろ、使用時に医療専門家によって行われ得る。
【００１２】
本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と、アルミニウム塩を含むアジュバント成分とを備えるキットの成分を混合する工程；および（ｉｉ）上記混合された成分を患者に投与する工程を包含する、インフルエンザワクチンを調製および投与するための方法を提供する。この方法は、代表的に、上記アジュバント成分を振盪して、任意の沈殿したアルミニウム塩を分散させること；上記抗原成分を上記アジュバント成分に無菌的に添加すること；上記混合された成分を反転するか、または穏やかに振盪すること；上記混合された成分を注射器中に引くこと；および上記混合された成分を上記患者に投与することを包含する。患者に対する投与は、代表的に、上記混合後２４時間未満（例えば≦１８時間、≦１２時間、≦６時間、≦３時間、≦２時間、≦１時間、≦３０分間、≦２０分間、≦１０分間、≦５分間、≦２分間、≦１分間など）で行われる。
【００１３】
（キット）
本発明のキットは、以下の２つの成分を備える：抗原を含む成分およびアジュバントを含む成分。これらの２つの成分は、患者に対する投与のためのワクチンを調製することを決定するまで、キット中で別個に保持され、そのワクチンの調製を決定した時点で、それらの成分は、上記抗原が上記アジュバントに吸着されるワクチンを得るために混合される。
【００１４】
したがって、上記２つの成分は、上記キット内で、互いから物理的に分離した形態であり、そしてこの分離は、種々の手段で達成され得る。例えば、上記２つの成分は、２つの分離したバイアルなどの容器中にあり得る。次いで、上記２つのバイアルの成分は、例えば、一方のバイアルの成分を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに添加すること、または両方のバイアルの成分を別々に取り出し、そしてそれらを第３の容器中で混合することによって混合され得る。
【００１５】
好ましい構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分のうちの一方は、注射器中にあり、そして他方は、バイアルなどの容器中にある。予め充填された注射器（例えば、針を有する）が、その成分を混合のための第２の容器中に挿入するために使用され得、次いでその混合物は、その注射器中に引かれ得る。次いで、その注射器の混合された成分は、代表的に、新規の滅菌針を通して患者に投与され得る。したがって、予め充填された注射器中に１つの成分を包装することは、患者への投与のために別個の注射器を使用する必要性を排除する。
【００１６】
別の好ましい構成において、上記２つのキット成分は、同じ注射器（例えば、二重室注射器（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ）（例えば、参考文献６〜１３などに開示されるもの））において、一緒であるが分離して保持される。その注射器が、作動される場合（例えば、患者に対する投与の間）、その２つの室の成分は、混合される。この構成は、使用時における別個の混合工程に対する必要性を回避する。その２つの室の成分は、一般に、両方とも水性形態である。
【００１７】
いくつかの構成において、上記成分のうちの一方（代表的に、アジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥された形態）であり、他方の成分は、水性形態である。上記２つの成分は、上記乾燥成分を再活性化し、そして患者に対する投与のための水性組成物を得るために混合され得る。他のあまり好ましくない構成において、両方の成分は、乾燥形態である。凍結乾燥された成分は、代表的に、注射器よりもむしろバイアル内におかれる。乾燥された成分は、安定剤（例えば、乳糖、ショ糖またはマンニトール、およびそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物）など）を含み得る。
【００１８】
１つの好ましい構成は、予め充填された注射器中の水性アジュバント成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を使用する。
【００１９】
両方の成分が、水性である場合、それらは、例えば、１：５（過剰な容量の水性抗原）と５：１（過剰な容量の水性アジュバント）との間の種々の容量比で混合され得る。１：２と２：１との間の比が、好ましい（例えば、約１：１）。
【００２０】
キットに適した容器としては、バイアルおよび使い捨て可能な注射器が挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【００２１】
成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【００２２】
インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。容器は、半用量の容量を示して小児に対する半用量の送達を容易にするために、標識され得る（例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示す標識を有し得る）。
【００２３】
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【００２４】
成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有し得る。針が接続されない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。そのような針は、シースで覆う（ｓｈｅａｔｈｅ）ことができる。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで市販されるものである。
【００２５】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製のよりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【００２６】
上記キットは、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【００２７】
上記キットは、好ましくは、２℃と８℃との間にて保存される。それは、凍結されるべきではない。
【００２８】
（インフルエンザウイルス抗原）
上記キット成分のうちの１つは、インフルエンザウイルス抗原を含む。これらの抗原は、代表的に、インフルエンザビリオンから調製されるが、その代わりとして、赤血球凝集素などの抗原が、組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用した昆虫細胞株）において発現され、そして精製された形態で使用され得る［１４、１５］。しかし、一般に、抗原は、ビリオン由来である。
【００２９】
上記抗原は、生ウイルスの形態、またはより好ましくは、不活化ウイルスの形態をとり得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の因子の１種以上の有効量による処理が挙げられる：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活化のためのさらなる化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）または任意のその組合せによる処理が挙げられる。ウイルス不活化の他の方法は、当該分野において公知である（例えば、第二級エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはγ線照射など）。ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品は、全ビリオン不活化ワクチンである。
【００３０】
不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、そして通常は、ノイラミニダーゼをまた含む）を含み得る。
【００３１】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、必要に応じた希釈後に、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製され得る。
【００３２】
スプリットウイルスは、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献１６〜２１などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリストイルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。したがって、分解プロセスは、ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するため）、回収されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＥＤＰＯ４吸着などの吸着方法を使用する）、非ビリオン材料からの全ビリオン分離、密度勾配遠視分離工程（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分解剤を含むショ糖勾配を使用する）において分解剤を使用したビリオンの分解、および所望されない物質を除去するためのその後の濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）は、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）である。
【００３３】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原の赤血球凝集素、および代表的には、ノイラミニダーゼをまた含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、サブユニットワクチンである。
【００３４】
ＨＡおよびＮＡ以外のインフルエンザタンパク質はまた、天然のタンパク質のフラグメントを含むインフルエンザ抗原として使用され得る。その組合せもまた、使用され得る。
【００３５】
インフルエンザ抗原はまた、ビロソームの形態で提供され得る［２２］。
【００３６】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。これらの３つの可能性は、特に、生ウイルスに適合する。
【００３７】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、ワクチンは、代表的に、２種のＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のＢ型インフルエンザ株を含み、そして三価ワクチンが、代表的である。本発明はまた、（特に、Ａ型インフルエンザウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用し得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、ＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。
【００３８】
本発明のアジュバント添加組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株における赤血球凝集素と比較して新規の赤血球凝集素（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でない赤血球凝集素（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において先に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して流行性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［２３］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。
【００３９】
上記組成物に通常含まれ得る他の株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［２４］および／またはザナミビルに対して抵抗性）の株であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［２５］。
【００４０】
本発明の組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスおよび／またはＢ型インフルエンザウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収された後に混合され、そして抗原が、調製される。したがって、本発明の方法は、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。２種のＡ型インフルエンザウイルス株および１種のＢ型インフルエンザウイルス株由来の抗原を含む三価ワクチンが、好ましいが、一価ワクチンもまた、（例えば、流行株に対して）有用である。
【００４１】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、２６〜３０］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［３１〜３３］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。
【００４２】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［３４］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのＡ型インフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのＡ型インフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献３４の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。
【００４３】
上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［３５］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００４４】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［３６、３７］。
【００４５】
したがって、ウイルス（特に、Ａ型インフルエンザウイルス）は、特に、そのウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。
【００４６】
上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、ＳＰＦ卵または細胞培養のいずれかにおいて増殖され得る。インフルエンザウイルス増殖についての現在の標準的な方法は、有胚の鶏卵を使用し、そのウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、さらに最近、ウイルスは、動物細胞培養において増殖され、そして速さおよび患者のアレルギーの理由に起因して、この増殖方法が、好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、１種以上のアミノ酸がウイルスと一緒に卵の尿膜の流体中に導入され得る［１８］。
【００４７】
細胞基質は、代表的に、哺乳動物細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞株である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞株の使用は、ワクチンが、ニワトリＤＮＡを含まず、そして卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）を含まないことができ、それによってアレルゲン性を減少させることを意味する。
【００４８】
インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［３８〜４１］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［４２〜４４］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［４５］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［４６］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［４７］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。あまり好ましくない哺乳動物細胞株の代替物として、ウイルスは、アヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））などに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば、参考文献４８５０］において増殖され得る。例としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［５２］を含む鳥類胚性幹細胞［４８、５１］が挙げられる。
【００４９】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献３８は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献５３は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献５４は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献５５は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。
【００５０】
ウイルスが哺乳動物細胞株において増殖された場合、上記キット中の抗原成分は、有益に、卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。
【００５１】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、増殖のための培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［５６］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。
【００５２】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、上記抗原成分は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献５７および５８に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［５９］。
【００５３】
０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。
【００５４】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることが、好ましい。
【００５５】
細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）における増殖について、ウイルスは、懸濁物における細胞［３８、６０、６１］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。代替物として、マイクロキャリア培養（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）が、使用され得る。
【００５６】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質の排除によって生じるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る培養を意味すると理解される。そのような培養物において増殖する細胞は、培養物自体のタンパク質を天然に含む。
【００５７】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で増殖される［６２］。
【００５８】
培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。
【００５９】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［６３、６４］）を有する場合に使用されている［４、５］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。これらのより低い用量は、本発明のようにアジュバントがワクチン中に存在する場合、最も有用である。
【００６０】
生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含量よりもむしろ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、そして１株あたり１０６と１０８との間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が、代表的である。
【００６１】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。なぜならば、これらの決定因子は、そうでなければウイルスが卵において増殖されることを妨げ得るからである。
【００６２】
本発明のキットの抗原成分は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトオキシノール（例えば、オクトオキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトオキシノール−１０、α−コハク酸水素トコフェロールおよびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００６３】
不活化されている非全細胞ワクチン（例えば、ウイルス成分ワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置するさらなるＴ細胞エピトープからの利益を受けるために、マトリックスタンパク質を含み得る。したがって、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は、Ｍ１および／またはＭ２マトリックスタンパク質をさらに含み得る。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ２マトリックスタンパク質またはＭ１タンパク質のフラグメントを含むことが、好ましい。核タンパク質もまた、存在し得る。
【００６４】
（アジュバント）
インフルエンザワクチンにおいて使用されているアジュバントとしては、キトサン［６５］、水中油型エマルション（例えば、ＭＦ５９［６６］）、水／油／水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルション［６７］、アルミニウム塩［２、５］、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ ７９０９［６８］）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素［６９、８７］およびその解毒された変異体［７０〜７１］、モノホスホリルリピドＡ［７２］およびその３−ｏ−脱アセチル化誘導体［７３］、百日咳毒素変異体［７４］、ムラミルジペプチド［７５］などが挙げられる。
【００６５】
しかし、本発明に従って、上記アジュバント成分は、アルミニウム塩に基づく。これらの塩は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知であるアジュバントを含む。これらの名前は、慣習的であるが、便宜上のみに使用され、いずれも存在している実際の化合物の正確な説明でもない［例えば、参考文献７６の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントを使用し得る。
【００６６】
「水酸化アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献７６の第９章］）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、回折バンドの半価幅（ＷＨＨ）に反映され、結晶性の低い粒子は、同様の微結晶サイズに起因して、より大きい線幅拡大を示す。ＷＨＨが増大する場合、表面積は、増大し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、抗原吸着についてのより大きい能力を有することが見出されている。繊維状の形態学（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに関して代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐIは、代表的に、約１１である（すなわち、そのアジュバント自体は、生理学的ｐＨにて正の表面電荷を有する）。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間の吸着力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００６７】
「リン酸アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、それはまた、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウムサルフェート）を含む。それらのアジュバントは、沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、上記塩におけるヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３と１．２との間のＰＯ４／Ａ１モル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱される場合）は、構造的なヒドロキシルの存在を示す［参照番号７６の第９章］。
【００６８】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａ１３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは、０．８と１．２との間、そしてより好ましくは、０．９５±０．１である。上記リン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩については一般に非晶質である。代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌ３＋モル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムを有し、１ｍｌあたり０．６ｍｇのＡｌ３＋で含む。上記リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような板状の形態学）である。その粒子の代表的な直径は、任意の抗原吸着の後において０．５μｍ〜２０μｍ（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７ｍｇ〜１．５ｍｇの間のタンパク質を吸着する能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００６９】
リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって上記塩を調製するために使用される反応条件および濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度（より多いリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）を変化させること、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）などの緩衝液を添加することによって変えられる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０との間、より好ましくは５．０と６．５との間（例えば、約５．７）のＰＺＣを有する。
【００７０】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液）を含み得るが、これは、常に必要であるとは限らない。上記懸濁物は、好ましくは、無菌であり、かつ発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離型の水性リン酸イオンを含み得る。上記懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【００７１】
本発明の１つの実施形態において、上記アジュバント成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含む［４］。この場合において、水酸化アルミニウムよりも多いリン酸アルミニウム（例えば、少なくとも２：１（例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１など）の重量比）が、存在し得る。
【００７２】
患者に対する投与のための組成物におけるＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間である。０．８５ｍｇ／用量未満の最大量が、好ましい。
【００７３】
１種以上のアルミニウム塩アジュバントを含むことに加えて、上記アジュバント成分は、１種以上のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤を含み得る。そのようなさらなる成分としては、いかが挙げられるが、これらに限定されない：３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）；および／または水中油型エマルション。３ｄ−ＭＰＬはまた、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡと称される。この名前は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されることを示す。それは、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースのない（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する。３Ｄ−ＭＰＬの調製は、最初は参考文献７７に記載され、そしてその産物は、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、商標名ＭＰＬＴＭの下で製造および販売されている。さらなる詳細は、参考文献７８〜８１に見出され得る。
【００７４】
最終的に、本発明の代替的な実施形態において、カルシウム塩が、アルミニウム塩の代わりに使用される。これらの実施形態において、上記アジュバント成分は、代表的に、リン酸カルシウム塩を含む。
【００７５】
（薬学的組成物）
上記キットの上記抗原成分および上記アジュバント成分は、それらの混合の産物である場合、両方とも薬学的に受容可能である。その混合された産物は、上記抗原およびアジュバントに加えて成分を含み得、そしてこれらは、上記抗原成分および／または上記アジュバント成分および／または必要に応じた第３の成分から生じ得る。
【００７６】
したがって、最終混合物は、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する。そのようなキャリアおよび賦形剤の徹底的な考察は、参考文献８２において入手可能である。
【００７７】
上記最終混合物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［１７、８３］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【００７８】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００７９】
上記組成物は、クエン酸イオンを含み得る。
【００８０】
投与のための組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［８４］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【００８１】
投与のための組成物は、１つ以上の緩衝液を含有し得る。代表的な緩衝液としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液。緩衝液は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【００８２】
投与のための組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、または６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【００８３】
個々のキット成分（容器を含む）は、好ましくは、無菌である。
【００８４】
キット成分は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。
【００８５】
キット成分は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００８６】
上記キット成分は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。したがって、例えば、１０用量のための抗原が、１つの容器中に含まれ得、１０用量のためのアジュバントが、第２の容器中に含まれ得る。上記２つの成分は、外科手術において使用日の朝に混合されて、その日の間における一連の患者に対する投与のための１０用量を提供し得る。各用量は、投与のために新しい注射器中に引かれる。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。
【００８７】
（処置およびワクチンの投与の方法）
混合後において、本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
【００８８】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【００８９】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分の使用を提供し、その医薬は、分離した成分として上記抗原とアジュバントとを含む。
【００９０】
これらの方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体価は防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価（ｔｉｔｒｅ）は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［８５］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。
【００９１】
本発明の組成物は、種々の手段で投与され得る。最も好ましい免疫感作経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［８６〜８８］、経口［８９］、皮内［９０，９１］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［９２］などが挙げられる。
【００９２】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物（例えば、リン酸オセルタミビル）−以下を参照のこと）を摂取している患者、卵アレルギーを有する者および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。
【００９３】
本発明によって産生されるワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターによる同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンまたは髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。
【００９４】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である）である。
【００９５】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫感作スケジュールおよび／または追加免疫感作スケジュールにおいて使用され得る。１つより多い用量（代表的に、２用量）の投与は、特に、免疫学的にナイーブな患者において有用である（例えば、以前にインフルエンザワクチンを受容したことがない者のためか、または新規のＨＡサブタイプに対してワクチン接種するため（流行の発生において））。複数回用量は、代表的に、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔を空けて投与される。
【００９６】
本発明の組成物およびキットが、アルミニウムベースのアジュバントを含む場合、成分の沈殿が保存の間に生じ得る。したがって、上記組成物は、患者への投与の前に振盪されなければならない。振盪された組成物は、不透明な白色の懸濁物である。
【００９７】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００９８】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【００９９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１００】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１０１】
抗原がアジュバントに「吸着される」と記載される場合、少なくとも５０重量％（例えば、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％またはそれ以上）の抗原が吸着されることが好ましい。
【０１０２】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。
【０１０３】
細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
【実施例】
【０１０４】
（本発明を実施するための様式）
インフルエンザウイルスワクチンにアジュバント添加するためのアルミニウム塩の使用に関連する上記の懸案事項に起因して、アジュバント成分および抗原成分が使用時まで別々に保持されるが、抗原吸着が依然として行われ得るワクチンが調製され得るか否かを調査することを、決定した。このアプローチの可能性を決定するために、インフルエンザウイルス由来の精製された表面抗原を、水酸化アルミニウム懸濁物と混合した。混合の直後、そのアルミニウム塩を、卓上遠心分離によって沈殿させ、その上清中に残存するタンパク質の量（すなわち、吸着されていないタンパク質の量）を、測定した。
【０１０５】
（現在のＡ型インフルエンザウイルス株）
赤血球凝集素を、インフルエンザウイルスＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａｎ（Ｈ１Ｎ１）またはインフルエンザウイルスＡ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）から精製し、そして希釈して、１ｍｌあたり７５μｇのＨＡを得た。水酸化アルミニウムアジュバントを、４．２５ｍｇ／ｍｌ（１ｍｌあたり約１．５ｍｇのＡｌ＋＋＋）にて調製した。１ｍｌのアジュバント懸濁物を、１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中の４ｍｌの抗原溶液に添加し、そしてその混合物を、反転し、そして室温でインキュベートした。サンプルを、時間０にて採取し、次いで５分、１０分、２０分、３０分、６０分、９０分および１２０分にて採取した。コントロールは、抗原単独（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７））またはアジュバント単独（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７））であった。サンプルを、４０００ｒｐｍにて直ちに遠心分離して、吸着された材料を分析のために沈殿させた。タンパク質含量を、ＢｉｏＲａｄＴＭタンパク質アッセイおよび未変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０１０６】
上記２つの株についての吸着研究の結果は、以下の通りであり、抗原のみのコントロールのタンパク質含量である１００％に対して正規化された。
【０１０７】
【表１】
したがって、高い程度の吸着が、非常に迅速に生じる。種々の時点における違いは、有意ではなかった。その結果を確かめるために、ＳＹＰＲＯルビー色色素（ｒｕｂｙ ｄｙｅ）染色を、上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離において使用した。タンパク質バンドは、アジュバントコントロール、０分、５分、１０分、２０分または３０分のサンプルにおいて見ることができなかった。したがって、任意のタンパク質の存在は、１〜２ｎｇのタンパク質を検出するために十分に感受性であるこの方法による検出の限界を下回った。
【０１０８】
結果は、上記抗原の少なくとも９７％が上記アジュバントに迅速に吸着したことを示した。驚くべきことに、吸着は、本質的に即座に生じ、上記アジュバントに予め吸着することなくアジュバントインフルエンザワクチンが分配されることを可能にする。したがって、アジュバントワクチンは、より迅速に調製され得、このことは、流行性の状況において最も有用である。これらの結果は、Ａ型インフルエンザウイルスの２つの異なる株によって達成され、そして同じ効果が他の株および不溶性アルミニウム塩に基づく他のアジュバントによって見られることは、十分に予期される。
【０１０９】
（流行性インフルエンザＡ株）
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ ｘ Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザウイルス２：６リアソータントの精製された表面抗原の処方物を、調製した。ＳＲＩＤによって測定したところ、赤血球凝集素含量を、１ｍＬあたり４１μｇのＨＡであると推定した。３０ｍＬのＡ／Ｈ５Ｎ１を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心分離フィルターデバイスを使用して、約１５ｍＬまで濃縮した。元のＡ／Ｈ５Ｎ１および濃縮したＡ／Ｈ５Ｎ１の両方の総タンパク質含量を、０〜５０μｇ／ｍＬのγグロブリン検量線を用いてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって決定した。この結果を使用して、総タンパク質に対するＨＡの割合を、算出した。次いでこの値を使用して、Ａ／Ｈ５Ｎ１の溶液１ｍＬあたり６０μｇのＨＡに必要とされる最終容量を算出した。
【０１１０】
０．７ｍＬの２ｍｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバントを、１．５ｍＬ微量遠心チューブにおける、０．７ｍＬの、ＭＢＰ １ｍＬあたり６０μｇのＨＡに添加した。その溶液を、反転によって混合し、そして室温（約２０℃）でインキュベートした。２連のサンプルを、５分、１０分、３０分、２時間、８時間、および２４時間にて採取した。コントロールは、ＨＡ ０．７ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７）を０．７ｍＬの、ＭＢＰ １ｍＬあたり６０μｇのＨＡに添加したもの、および０．７ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７）を０．７ｍＬの２ｍｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムに添加したものであった。サンプルを、１３０００ｒｐｍで１分間にわたって室温にて遠心分離して、懸濁した水酸化アルミニウムを取り出し、そして上清を、標識した７ｍＬ滅菌ビジョウ（ｂｉｊｏｕ）中にデカントした。結果を、上に記載したように、ＢｉｏＲａｄＴＭタンパク質アッセイ、およびＳＹＰＲＯ色素を用いた未変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてその結果は、以下の通りであった。
【０１１１】
【表２】
Ａ／Ｈ５Ｎ１処方物についての結果は、等量のＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ調製物およびＡ／Ｗｙｏｍｉｎｇ調製物を使用して行った実験に匹敵した。非常に低いレベルのタンパク質が、全てのサンプルについての上清において、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを使用して検出され、このことは、ほぼ全てのタンパク質が水酸化アルミニウムペレットに結合したままであったことを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後のそれらのサンプルの感受性ＳＹＰＲＯルビー色色素染色は、アジュバントコントロールにも６つの時間サンプルのいずれにおいてもタンパク質バンドを示さなかった。したがって任意のタンパク質の存在は、この方法による検出の限界を下回った。任意の上記時点におけるタンパク質濃度の間において、有意差は存在しなかった。水酸化アルミニウムコントロールおよび時間サンプルについての全てのサンプル吸光度、およびその後のタンパク質濃度の推定は、５〜５０μｇ／ｍＬの検量線の下限を下回った。
【０１１２】
したがって、そのデータは、Ａ／Ｈ５ＴＭ１タンパク質が上記アルミニウム塩アジュバントに即座に吸着され、かつ少なくとも２４時間にわたって安定して結合したままであることを示す。
【０１１３】
（ヒト臨床データ）
参考文献９３において報告される通り、非盲検の無作為化非対照第１相臨床試験における３００人のボランティアは、６種の不活化された一価スプリットインフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）ワクチン処方物（水酸化アルミニウムアジュバントを伴うかまたは水酸化アルミニウムアジュバントを伴わない、３種の異なる用量のＨＡ（７．５μｇ、１５μｇまたは３０μｇを含む）のうちの１種を受容した。個体は、２回のワクチン接種を受け、そして血液サンプルを、赤血球凝集抑制およびマイクロ中和によって分析した。
【０１１４】
上記ワクチンを、ＶＡＸＩＧＲＩＰＴＭ大流行間期ワクチン（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ）に対して使用される使用許可された製造プロセスを使用して有胚の鶏卵において産生した［９４］。ワクチン株は、ＮＩＢＳＣによって調製されたインフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４／ＮＩＢＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）参照株であった。この株は、高度に病原性の鳥類株インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４由来の改変された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、ならびにインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の他のウイルスタンパク質を含む。その赤血球凝集素を、改変して、切断部位における複数個の塩基性アミノ酸の配列（ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を除去した。
【０１１５】
０．５ｍｌ注射器（２３ゲージ、１インチの針）に、上記スプリットワクチンを、アジュバントを含まないリン酸緩衝化生理食塩溶液中の７．５μｇ、１５μｇ、または３０μｇのレベルの赤血球凝集素にて充填した。アジュバント添加していないワクチン接種のために、これらの注射器を、患者に直接使用した。しかし、アジュバント添加したワクチン接種のために、注射器の内容物を、水酸化アルミニウムアジュバントを含む注射器の内容物であるような滅菌バイアルに注入した。この混合を、ベッドサイドで使用直前に行い、そして混合の１０秒後に、その内容物を、上記抗原／アジュバント懸濁物を均質化するために穏やかに回転させながら、新しい注射器（２３ゲージ、１インチの針）中に引き、そして患者に対して筋肉内（三角筋）に注射した。注射容量は、アジュバント添加した３０μｇ処方物（１ｍＩ容量）を除いて、０．５ｍｌであった。ワクチンの最終的なアジュバント含量は、６００μｇであった。抗原とアジュバントとを混合する予備的研究は、全３種の抗原用量について同様の吸光係数を示した。
【０１１６】
各々の参加者は、２１日間の間隔（０日目および２１日目）を空けて２回の筋肉内注射を受けた。血液サンプルを、０日目、２１日目および４２日目に採取した。
【０１１７】
全６種の処方物は、０日目と４２日目との間における深刻な有害事象の報告、重篤な注射部位の疼痛、および３８℃より高い口腔温度を伴う熱性のエピソードを伴わずに良好に許容された。
【０１１８】
全ての処方物は、免疫応答を誘導し、その免疫応答は、１用量のみの後に幾人かの個体において検出可能な応答を有した。赤血球凝集素抑制に関して、各群の６％と３４％との間は、２１日目において３２以上の力価を有し、４２日目においてその割合は２８〜６７％まで増加した。中和抗体応答は、赤血球凝集素抑制の様式と同様の様式に従った。アジュバント添加した３０μｇ処方物は、最も大きい応答（２回のワクチン接種後に６７％の赤血球凝集素−抑制セロコンバージョン率）を誘導した。特に、アジュバント添加した３０μｇ Ｈ５Ｎ１ワクチンによる２用量レジメンは、季節性インフルエンザワクチンの交付についての欧州規制基準（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）と一致する免疫応答を示した。
【０１１９】
本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。
【０１２０】
（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））
【０１２１】
【化１】
【０１２２】
【化２】
【０１２３】
【化３】
【技術分野】
【０００１】
明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（政府の利益）
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓからの米国政府契約ＨＨＳＮ２６６２００４０００３２Ｃによる支援によって、本発明は、全体または一部が行われた。したがって、米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのアジュバントワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）の分野にある。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
水中油型エマルションアジュバントを含むＣｈｉｒｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ製のＦＬＵＡＤＴＭ製品を除いて、現在、インフルエンザワクチンは、一般的使用においてアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）されない。これらのワクチンは、参考文献１の第１７章および第１８章においてさらに詳細に記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。
【０００５】
より最近、アルミニウム塩アジュバントを含めることが、インフルエンザワクチンについて提案されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献１）。さらなる混合工程を必要とし、それによって製造全体を減速させることに加え、これらの塩を含むことは、種々の懸案事項に関連する。例えば、それらの不溶性は、吸着された抗原は懸濁から沈殿することを意味するので、バルクワクチンからの個々の用量の調製はさらなる配慮を必要とする。さらに、上記塩に対する抗原の結合は、最終的なワクチンの品質管理を難しくする。特に、インフルエンザワクチンに関するいくつかの力価試験は、結合されていない抗原を必要とするインビトロイムノアッセイに基づく（すなわち、アジュバントへの吸着は、これらの試験を使用することができないことを意味する）。
【特許文献１】米国特許第６，３７２，２２３号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ００／１５２５１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ０１／２２９９２号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｅｈｍｅら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、２００４年、第１０３巻（１−２）、ｐ．１６３〜１７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらなるアジュバントインフルエンザワクチンおよび改良されたアジュバントインフルエンザワクチン（流行中における使用および大流行の間の使用の両方のため）、ならびにそれらの調製のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明にしたがって、アジュバントインフルエンザワクチンの抗原成分および上記アジュバント成分は、製造の間に混合されないが、使用時に即時混合するために別個の成分として提供される。本発明は、上記抗原の上記アジュバントへの吸着は、実質的に即座に生じ、かつワクチン接種の間に直面する条件下で不可逆的であることが見出されている（本明細書中の例を参照のこと）が故に、有効である。したがって、本発明は、製造の間に混合を行うことによって生じる種々の懸案事項を回避する。
【０００８】
したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分；および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分；を備えるキットを提供する。成分（ｉ）は、アルミニウム塩アジュバントを含まず、そして成分（ｉｉ）は、インフルエンザウイルス抗原を含まない。
【０００９】
本発明はまた、同時の分離した使用または連続的な使用のための、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と、（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を提供する。
【００１０】
本発明はまた、インフルエンザウイルス抗原とアルミニウム塩アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、その組成物は、使用時点においてその抗原とそのアジュバントとを即時混合することによって調製された。
【００１１】
本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分を調製する工程；（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を調製する工程；および（ｉｉｉ）その抗原成分とそのアジュバント成分とをキット中に組み合わせる工程を包含する、インフルエンザワクチンを調製するための方法を提供する。その方法はまた、（ｉｖ）患者に対する投与のために上記抗原成分および上記アジュバント成分を混合する工程を提供し得るが、工程（ｉｖ）は、代表的に、製造業者よりもむしろ、使用時に医療専門家によって行われ得る。
【００１２】
本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と、アルミニウム塩を含むアジュバント成分とを備えるキットの成分を混合する工程；および（ｉｉ）上記混合された成分を患者に投与する工程を包含する、インフルエンザワクチンを調製および投与するための方法を提供する。この方法は、代表的に、上記アジュバント成分を振盪して、任意の沈殿したアルミニウム塩を分散させること；上記抗原成分を上記アジュバント成分に無菌的に添加すること；上記混合された成分を反転するか、または穏やかに振盪すること；上記混合された成分を注射器中に引くこと；および上記混合された成分を上記患者に投与することを包含する。患者に対する投与は、代表的に、上記混合後２４時間未満（例えば≦１８時間、≦１２時間、≦６時間、≦３時間、≦２時間、≦１時間、≦３０分間、≦２０分間、≦１０分間、≦５分間、≦２分間、≦１分間など）で行われる。
【００１３】
（キット）
本発明のキットは、以下の２つの成分を備える：抗原を含む成分およびアジュバントを含む成分。これらの２つの成分は、患者に対する投与のためのワクチンを調製することを決定するまで、キット中で別個に保持され、そのワクチンの調製を決定した時点で、それらの成分は、上記抗原が上記アジュバントに吸着されるワクチンを得るために混合される。
【００１４】
したがって、上記２つの成分は、上記キット内で、互いから物理的に分離した形態であり、そしてこの分離は、種々の手段で達成され得る。例えば、上記２つの成分は、２つの分離したバイアルなどの容器中にあり得る。次いで、上記２つのバイアルの成分は、例えば、一方のバイアルの成分を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに添加すること、または両方のバイアルの成分を別々に取り出し、そしてそれらを第３の容器中で混合することによって混合され得る。
【００１５】
好ましい構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分のうちの一方は、注射器中にあり、そして他方は、バイアルなどの容器中にある。予め充填された注射器（例えば、針を有する）が、その成分を混合のための第２の容器中に挿入するために使用され得、次いでその混合物は、その注射器中に引かれ得る。次いで、その注射器の混合された成分は、代表的に、新規の滅菌針を通して患者に投与され得る。したがって、予め充填された注射器中に１つの成分を包装することは、患者への投与のために別個の注射器を使用する必要性を排除する。
【００１６】
別の好ましい構成において、上記２つのキット成分は、同じ注射器（例えば、二重室注射器（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ）（例えば、参考文献６〜１３などに開示されるもの））において、一緒であるが分離して保持される。その注射器が、作動される場合（例えば、患者に対する投与の間）、その２つの室の成分は、混合される。この構成は、使用時における別個の混合工程に対する必要性を回避する。その２つの室の成分は、一般に、両方とも水性形態である。
【００１７】
いくつかの構成において、上記成分のうちの一方（代表的に、アジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥された形態）であり、他方の成分は、水性形態である。上記２つの成分は、上記乾燥成分を再活性化し、そして患者に対する投与のための水性組成物を得るために混合され得る。他のあまり好ましくない構成において、両方の成分は、乾燥形態である。凍結乾燥された成分は、代表的に、注射器よりもむしろバイアル内におかれる。乾燥された成分は、安定剤（例えば、乳糖、ショ糖またはマンニトール、およびそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物）など）を含み得る。
【００１８】
１つの好ましい構成は、予め充填された注射器中の水性アジュバント成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を使用する。
【００１９】
両方の成分が、水性である場合、それらは、例えば、１：５（過剰な容量の水性抗原）と５：１（過剰な容量の水性アジュバント）との間の種々の容量比で混合され得る。１：２と２：１との間の比が、好ましい（例えば、約１：１）。
【００２０】
キットに適した容器としては、バイアルおよび使い捨て可能な注射器が挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【００２１】
成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【００２２】
インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。容器は、半用量の容量を示して小児に対する半用量の送達を容易にするために、標識され得る（例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示す標識を有し得る）。
【００２３】
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【００２４】
成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有し得る。針が接続されない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。そのような針は、シースで覆う（ｓｈｅａｔｈｅ）ことができる。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで市販されるものである。
【００２５】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製のよりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【００２６】
上記キットは、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【００２７】
上記キットは、好ましくは、２℃と８℃との間にて保存される。それは、凍結されるべきではない。
【００２８】
（インフルエンザウイルス抗原）
上記キット成分のうちの１つは、インフルエンザウイルス抗原を含む。これらの抗原は、代表的に、インフルエンザビリオンから調製されるが、その代わりとして、赤血球凝集素などの抗原が、組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用した昆虫細胞株）において発現され、そして精製された形態で使用され得る［１４、１５］。しかし、一般に、抗原は、ビリオン由来である。
【００２９】
上記抗原は、生ウイルスの形態、またはより好ましくは、不活化ウイルスの形態をとり得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の因子の１種以上の有効量による処理が挙げられる：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活化のためのさらなる化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）または任意のその組合せによる処理が挙げられる。ウイルス不活化の他の方法は、当該分野において公知である（例えば、第二級エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはγ線照射など）。ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品は、全ビリオン不活化ワクチンである。
【００３０】
不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、そして通常は、ノイラミニダーゼをまた含む）を含み得る。
【００３１】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、必要に応じた希釈後に、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製され得る。
【００３２】
スプリットウイルスは、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献１６〜２１などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリストイルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。したがって、分解プロセスは、ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するため）、回収されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＥＤＰＯ４吸着などの吸着方法を使用する）、非ビリオン材料からの全ビリオン分離、密度勾配遠視分離工程（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分解剤を含むショ糖勾配を使用する）において分解剤を使用したビリオンの分解、および所望されない物質を除去するためのその後の濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）は、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）である。
【００３３】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原の赤血球凝集素、および代表的には、ノイラミニダーゼをまた含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、サブユニットワクチンである。
【００３４】
ＨＡおよびＮＡ以外のインフルエンザタンパク質はまた、天然のタンパク質のフラグメントを含むインフルエンザ抗原として使用され得る。その組合せもまた、使用され得る。
【００３５】
インフルエンザ抗原はまた、ビロソームの形態で提供され得る［２２］。
【００３６】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。これらの３つの可能性は、特に、生ウイルスに適合する。
【００３７】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、ワクチンは、代表的に、２種のＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のＢ型インフルエンザ株を含み、そして三価ワクチンが、代表的である。本発明はまた、（特に、Ａ型インフルエンザウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用し得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、ＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。
【００３８】
本発明のアジュバント添加組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株における赤血球凝集素と比較して新規の赤血球凝集素（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でない赤血球凝集素（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において先に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して流行性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［２３］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。
【００３９】
上記組成物に通常含まれ得る他の株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［２４］および／またはザナミビルに対して抵抗性）の株であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［２５］。
【００４０】
本発明の組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスおよび／またはＢ型インフルエンザウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収された後に混合され、そして抗原が、調製される。したがって、本発明の方法は、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。２種のＡ型インフルエンザウイルス株および１種のＢ型インフルエンザウイルス株由来の抗原を含む三価ワクチンが、好ましいが、一価ワクチンもまた、（例えば、流行株に対して）有用である。
【００４１】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、２６〜３０］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［３１〜３３］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。
【００４２】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［３４］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのＡ型インフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのＡ型インフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献３４の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。
【００４３】
上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［３５］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００４４】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［３６、３７］。
【００４５】
したがって、ウイルス（特に、Ａ型インフルエンザウイルス）は、特に、そのウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。
【００４６】
上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、ＳＰＦ卵または細胞培養のいずれかにおいて増殖され得る。インフルエンザウイルス増殖についての現在の標準的な方法は、有胚の鶏卵を使用し、そのウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、さらに最近、ウイルスは、動物細胞培養において増殖され、そして速さおよび患者のアレルギーの理由に起因して、この増殖方法が、好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、１種以上のアミノ酸がウイルスと一緒に卵の尿膜の流体中に導入され得る［１８］。
【００４７】
細胞基質は、代表的に、哺乳動物細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞株である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞株の使用は、ワクチンが、ニワトリＤＮＡを含まず、そして卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）を含まないことができ、それによってアレルゲン性を減少させることを意味する。
【００４８】
インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［３８〜４１］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［４２〜４４］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［４５］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［４６］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［４７］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。あまり好ましくない哺乳動物細胞株の代替物として、ウイルスは、アヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））などに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば、参考文献４８５０］において増殖され得る。例としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［５２］を含む鳥類胚性幹細胞［４８、５１］が挙げられる。
【００４９】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献３８は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献５３は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献５４は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献５５は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。
【００５０】
ウイルスが哺乳動物細胞株において増殖された場合、上記キット中の抗原成分は、有益に、卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。
【００５１】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、増殖のための培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［５６］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。
【００５２】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、上記抗原成分は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献５７および５８に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［５９］。
【００５３】
０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。
【００５４】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることが、好ましい。
【００５５】
細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）における増殖について、ウイルスは、懸濁物における細胞［３８、６０、６１］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。代替物として、マイクロキャリア培養（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）が、使用され得る。
【００５６】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質の排除によって生じるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る培養を意味すると理解される。そのような培養物において増殖する細胞は、培養物自体のタンパク質を天然に含む。
【００５７】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で増殖される［６２］。
【００５８】
培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。
【００５９】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［６３、６４］）を有する場合に使用されている［４、５］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。これらのより低い用量は、本発明のようにアジュバントがワクチン中に存在する場合、最も有用である。
【００６０】
生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含量よりもむしろ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、そして１株あたり１０６と１０８との間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が、代表的である。
【００６１】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。なぜならば、これらの決定因子は、そうでなければウイルスが卵において増殖されることを妨げ得るからである。
【００６２】
本発明のキットの抗原成分は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトオキシノール（例えば、オクトオキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトオキシノール−１０、α−コハク酸水素トコフェロールおよびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００６３】
不活化されている非全細胞ワクチン（例えば、ウイルス成分ワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置するさらなるＴ細胞エピトープからの利益を受けるために、マトリックスタンパク質を含み得る。したがって、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は、Ｍ１および／またはＭ２マトリックスタンパク質をさらに含み得る。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ２マトリックスタンパク質またはＭ１タンパク質のフラグメントを含むことが、好ましい。核タンパク質もまた、存在し得る。
【００６４】
（アジュバント）
インフルエンザワクチンにおいて使用されているアジュバントとしては、キトサン［６５］、水中油型エマルション（例えば、ＭＦ５９［６６］）、水／油／水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルション［６７］、アルミニウム塩［２、５］、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ ７９０９［６８］）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素［６９、８７］およびその解毒された変異体［７０〜７１］、モノホスホリルリピドＡ［７２］およびその３−ｏ−脱アセチル化誘導体［７３］、百日咳毒素変異体［７４］、ムラミルジペプチド［７５］などが挙げられる。
【００６５】
しかし、本発明に従って、上記アジュバント成分は、アルミニウム塩に基づく。これらの塩は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知であるアジュバントを含む。これらの名前は、慣習的であるが、便宜上のみに使用され、いずれも存在している実際の化合物の正確な説明でもない［例えば、参考文献７６の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントを使用し得る。
【００６６】
「水酸化アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献７６の第９章］）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、回折バンドの半価幅（ＷＨＨ）に反映され、結晶性の低い粒子は、同様の微結晶サイズに起因して、より大きい線幅拡大を示す。ＷＨＨが増大する場合、表面積は、増大し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、抗原吸着についてのより大きい能力を有することが見出されている。繊維状の形態学（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに関して代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐIは、代表的に、約１１である（すなわち、そのアジュバント自体は、生理学的ｐＨにて正の表面電荷を有する）。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間の吸着力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００６７】
「リン酸アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、それはまた、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウムサルフェート）を含む。それらのアジュバントは、沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、上記塩におけるヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３と１．２との間のＰＯ４／Ａ１モル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱される場合）は、構造的なヒドロキシルの存在を示す［参照番号７６の第９章］。
【００６８】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａ１３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは、０．８と１．２との間、そしてより好ましくは、０．９５±０．１である。上記リン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩については一般に非晶質である。代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌ３＋モル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムを有し、１ｍｌあたり０．６ｍｇのＡｌ３＋で含む。上記リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような板状の形態学）である。その粒子の代表的な直径は、任意の抗原吸着の後において０．５μｍ〜２０μｍ（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７ｍｇ〜１．５ｍｇの間のタンパク質を吸着する能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００６９】
リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって上記塩を調製するために使用される反応条件および濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度（より多いリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）を変化させること、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）などの緩衝液を添加することによって変えられる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０との間、より好ましくは５．０と６．５との間（例えば、約５．７）のＰＺＣを有する。
【００７０】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液）を含み得るが、これは、常に必要であるとは限らない。上記懸濁物は、好ましくは、無菌であり、かつ発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離型の水性リン酸イオンを含み得る。上記懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【００７１】
本発明の１つの実施形態において、上記アジュバント成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含む［４］。この場合において、水酸化アルミニウムよりも多いリン酸アルミニウム（例えば、少なくとも２：１（例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１など）の重量比）が、存在し得る。
【００７２】
患者に対する投与のための組成物におけるＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間である。０．８５ｍｇ／用量未満の最大量が、好ましい。
【００７３】
１種以上のアルミニウム塩アジュバントを含むことに加えて、上記アジュバント成分は、１種以上のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤を含み得る。そのようなさらなる成分としては、いかが挙げられるが、これらに限定されない：３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）；および／または水中油型エマルション。３ｄ−ＭＰＬはまた、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡと称される。この名前は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されることを示す。それは、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースのない（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する。３Ｄ−ＭＰＬの調製は、最初は参考文献７７に記載され、そしてその産物は、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、商標名ＭＰＬＴＭの下で製造および販売されている。さらなる詳細は、参考文献７８〜８１に見出され得る。
【００７４】
最終的に、本発明の代替的な実施形態において、カルシウム塩が、アルミニウム塩の代わりに使用される。これらの実施形態において、上記アジュバント成分は、代表的に、リン酸カルシウム塩を含む。
【００７５】
（薬学的組成物）
上記キットの上記抗原成分および上記アジュバント成分は、それらの混合の産物である場合、両方とも薬学的に受容可能である。その混合された産物は、上記抗原およびアジュバントに加えて成分を含み得、そしてこれらは、上記抗原成分および／または上記アジュバント成分および／または必要に応じた第３の成分から生じ得る。
【００７６】
したがって、最終混合物は、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する。そのようなキャリアおよび賦形剤の徹底的な考察は、参考文献８２において入手可能である。
【００７７】
上記最終混合物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［１７、８３］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【００７８】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００７９】
上記組成物は、クエン酸イオンを含み得る。
【００８０】
投与のための組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［８４］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【００８１】
投与のための組成物は、１つ以上の緩衝液を含有し得る。代表的な緩衝液としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液。緩衝液は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【００８２】
投与のための組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、または６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【００８３】
個々のキット成分（容器を含む）は、好ましくは、無菌である。
【００８４】
キット成分は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。
【００８５】
キット成分は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００８６】
上記キット成分は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。したがって、例えば、１０用量のための抗原が、１つの容器中に含まれ得、１０用量のためのアジュバントが、第２の容器中に含まれ得る。上記２つの成分は、外科手術において使用日の朝に混合されて、その日の間における一連の患者に対する投与のための１０用量を提供し得る。各用量は、投与のために新しい注射器中に引かれる。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。
【００８７】
（処置およびワクチンの投与の方法）
混合後において、本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
【００８８】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【００８９】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分の使用を提供し、その医薬は、分離した成分として上記抗原とアジュバントとを含む。
【００９０】
これらの方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体価は防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価（ｔｉｔｒｅ）は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［８５］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。
【００９１】
本発明の組成物は、種々の手段で投与され得る。最も好ましい免疫感作経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［８６〜８８］、経口［８９］、皮内［９０，９１］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［９２］などが挙げられる。
【００９２】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物（例えば、リン酸オセルタミビル）−以下を参照のこと）を摂取している患者、卵アレルギーを有する者および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。
【００９３】
本発明によって産生されるワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターによる同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンまたは髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。
【００９４】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である）である。
【００９５】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫感作スケジュールおよび／または追加免疫感作スケジュールにおいて使用され得る。１つより多い用量（代表的に、２用量）の投与は、特に、免疫学的にナイーブな患者において有用である（例えば、以前にインフルエンザワクチンを受容したことがない者のためか、または新規のＨＡサブタイプに対してワクチン接種するため（流行の発生において））。複数回用量は、代表的に、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔を空けて投与される。
【００９６】
本発明の組成物およびキットが、アルミニウムベースのアジュバントを含む場合、成分の沈殿が保存の間に生じ得る。したがって、上記組成物は、患者への投与の前に振盪されなければならない。振盪された組成物は、不透明な白色の懸濁物である。
【００９７】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００９８】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【００９９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１００】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１０１】
抗原がアジュバントに「吸着される」と記載される場合、少なくとも５０重量％（例えば、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％またはそれ以上）の抗原が吸着されることが好ましい。
【０１０２】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。
【０１０３】
細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
【実施例】
【０１０４】
（本発明を実施するための様式）
インフルエンザウイルスワクチンにアジュバント添加するためのアルミニウム塩の使用に関連する上記の懸案事項に起因して、アジュバント成分および抗原成分が使用時まで別々に保持されるが、抗原吸着が依然として行われ得るワクチンが調製され得るか否かを調査することを、決定した。このアプローチの可能性を決定するために、インフルエンザウイルス由来の精製された表面抗原を、水酸化アルミニウム懸濁物と混合した。混合の直後、そのアルミニウム塩を、卓上遠心分離によって沈殿させ、その上清中に残存するタンパク質の量（すなわち、吸着されていないタンパク質の量）を、測定した。
【０１０５】
（現在のＡ型インフルエンザウイルス株）
赤血球凝集素を、インフルエンザウイルスＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａｎ（Ｈ１Ｎ１）またはインフルエンザウイルスＡ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）から精製し、そして希釈して、１ｍｌあたり７５μｇのＨＡを得た。水酸化アルミニウムアジュバントを、４．２５ｍｇ／ｍｌ（１ｍｌあたり約１．５ｍｇのＡｌ＋＋＋）にて調製した。１ｍｌのアジュバント懸濁物を、１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中の４ｍｌの抗原溶液に添加し、そしてその混合物を、反転し、そして室温でインキュベートした。サンプルを、時間０にて採取し、次いで５分、１０分、２０分、３０分、６０分、９０分および１２０分にて採取した。コントロールは、抗原単独（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７））またはアジュバント単独（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７））であった。サンプルを、４０００ｒｐｍにて直ちに遠心分離して、吸着された材料を分析のために沈殿させた。タンパク質含量を、ＢｉｏＲａｄＴＭタンパク質アッセイおよび未変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０１０６】
上記２つの株についての吸着研究の結果は、以下の通りであり、抗原のみのコントロールのタンパク質含量である１００％に対して正規化された。
【０１０７】
【表１】
したがって、高い程度の吸着が、非常に迅速に生じる。種々の時点における違いは、有意ではなかった。その結果を確かめるために、ＳＹＰＲＯルビー色色素（ｒｕｂｙ ｄｙｅ）染色を、上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離において使用した。タンパク質バンドは、アジュバントコントロール、０分、５分、１０分、２０分または３０分のサンプルにおいて見ることができなかった。したがって、任意のタンパク質の存在は、１〜２ｎｇのタンパク質を検出するために十分に感受性であるこの方法による検出の限界を下回った。
【０１０８】
結果は、上記抗原の少なくとも９７％が上記アジュバントに迅速に吸着したことを示した。驚くべきことに、吸着は、本質的に即座に生じ、上記アジュバントに予め吸着することなくアジュバントインフルエンザワクチンが分配されることを可能にする。したがって、アジュバントワクチンは、より迅速に調製され得、このことは、流行性の状況において最も有用である。これらの結果は、Ａ型インフルエンザウイルスの２つの異なる株によって達成され、そして同じ効果が他の株および不溶性アルミニウム塩に基づく他のアジュバントによって見られることは、十分に予期される。
【０１０９】
（流行性インフルエンザＡ株）
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ ｘ Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザウイルス２：６リアソータントの精製された表面抗原の処方物を、調製した。ＳＲＩＤによって測定したところ、赤血球凝集素含量を、１ｍＬあたり４１μｇのＨＡであると推定した。３０ｍＬのＡ／Ｈ５Ｎ１を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心分離フィルターデバイスを使用して、約１５ｍＬまで濃縮した。元のＡ／Ｈ５Ｎ１および濃縮したＡ／Ｈ５Ｎ１の両方の総タンパク質含量を、０〜５０μｇ／ｍＬのγグロブリン検量線を用いてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって決定した。この結果を使用して、総タンパク質に対するＨＡの割合を、算出した。次いでこの値を使用して、Ａ／Ｈ５Ｎ１の溶液１ｍＬあたり６０μｇのＨＡに必要とされる最終容量を算出した。
【０１１０】
０．７ｍＬの２ｍｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムアジュバントを、１．５ｍＬ微量遠心チューブにおける、０．７ｍＬの、ＭＢＰ １ｍＬあたり６０μｇのＨＡに添加した。その溶液を、反転によって混合し、そして室温（約２０℃）でインキュベートした。２連のサンプルを、５分、１０分、３０分、２時間、８時間、および２４時間にて採取した。コントロールは、ＨＡ ０．７ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７）を０．７ｍＬの、ＭＢＰ １ｍＬあたり６０μｇのＨＡに添加したもの、および０．７ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．７）を０．７ｍＬの２ｍｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムに添加したものであった。サンプルを、１３０００ｒｐｍで１分間にわたって室温にて遠心分離して、懸濁した水酸化アルミニウムを取り出し、そして上清を、標識した７ｍＬ滅菌ビジョウ（ｂｉｊｏｕ）中にデカントした。結果を、上に記載したように、ＢｉｏＲａｄＴＭタンパク質アッセイ、およびＳＹＰＲＯ色素を用いた未変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてその結果は、以下の通りであった。
【０１１１】
【表２】
Ａ／Ｈ５Ｎ１処方物についての結果は、等量のＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ調製物およびＡ／Ｗｙｏｍｉｎｇ調製物を使用して行った実験に匹敵した。非常に低いレベルのタンパク質が、全てのサンプルについての上清において、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを使用して検出され、このことは、ほぼ全てのタンパク質が水酸化アルミニウムペレットに結合したままであったことを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後のそれらのサンプルの感受性ＳＹＰＲＯルビー色色素染色は、アジュバントコントロールにも６つの時間サンプルのいずれにおいてもタンパク質バンドを示さなかった。したがって任意のタンパク質の存在は、この方法による検出の限界を下回った。任意の上記時点におけるタンパク質濃度の間において、有意差は存在しなかった。水酸化アルミニウムコントロールおよび時間サンプルについての全てのサンプル吸光度、およびその後のタンパク質濃度の推定は、５〜５０μｇ／ｍＬの検量線の下限を下回った。
【０１１２】
したがって、そのデータは、Ａ／Ｈ５ＴＭ１タンパク質が上記アルミニウム塩アジュバントに即座に吸着され、かつ少なくとも２４時間にわたって安定して結合したままであることを示す。
【０１１３】
（ヒト臨床データ）
参考文献９３において報告される通り、非盲検の無作為化非対照第１相臨床試験における３００人のボランティアは、６種の不活化された一価スプリットインフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）ワクチン処方物（水酸化アルミニウムアジュバントを伴うかまたは水酸化アルミニウムアジュバントを伴わない、３種の異なる用量のＨＡ（７．５μｇ、１５μｇまたは３０μｇを含む）のうちの１種を受容した。個体は、２回のワクチン接種を受け、そして血液サンプルを、赤血球凝集抑制およびマイクロ中和によって分析した。
【０１１４】
上記ワクチンを、ＶＡＸＩＧＲＩＰＴＭ大流行間期ワクチン（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ）に対して使用される使用許可された製造プロセスを使用して有胚の鶏卵において産生した［９４］。ワクチン株は、ＮＩＢＳＣによって調製されたインフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４／ＮＩＢＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）参照株であった。この株は、高度に病原性の鳥類株インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４由来の改変された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、ならびにインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の他のウイルスタンパク質を含む。その赤血球凝集素を、改変して、切断部位における複数個の塩基性アミノ酸の配列（ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を除去した。
【０１１５】
０．５ｍｌ注射器（２３ゲージ、１インチの針）に、上記スプリットワクチンを、アジュバントを含まないリン酸緩衝化生理食塩溶液中の７．５μｇ、１５μｇ、または３０μｇのレベルの赤血球凝集素にて充填した。アジュバント添加していないワクチン接種のために、これらの注射器を、患者に直接使用した。しかし、アジュバント添加したワクチン接種のために、注射器の内容物を、水酸化アルミニウムアジュバントを含む注射器の内容物であるような滅菌バイアルに注入した。この混合を、ベッドサイドで使用直前に行い、そして混合の１０秒後に、その内容物を、上記抗原／アジュバント懸濁物を均質化するために穏やかに回転させながら、新しい注射器（２３ゲージ、１インチの針）中に引き、そして患者に対して筋肉内（三角筋）に注射した。注射容量は、アジュバント添加した３０μｇ処方物（１ｍＩ容量）を除いて、０．５ｍｌであった。ワクチンの最終的なアジュバント含量は、６００μｇであった。抗原とアジュバントとを混合する予備的研究は、全３種の抗原用量について同様の吸光係数を示した。
【０１１６】
各々の参加者は、２１日間の間隔（０日目および２１日目）を空けて２回の筋肉内注射を受けた。血液サンプルを、０日目、２１日目および４２日目に採取した。
【０１１７】
全６種の処方物は、０日目と４２日目との間における深刻な有害事象の報告、重篤な注射部位の疼痛、および３８℃より高い口腔温度を伴う熱性のエピソードを伴わずに良好に許容された。
【０１１８】
全ての処方物は、免疫応答を誘導し、その免疫応答は、１用量のみの後に幾人かの個体において検出可能な応答を有した。赤血球凝集素抑制に関して、各群の６％と３４％との間は、２１日目において３２以上の力価を有し、４２日目においてその割合は２８〜６７％まで増加した。中和抗体応答は、赤血球凝集素抑制の様式と同様の様式に従った。アジュバント添加した３０μｇ処方物は、最も大きい応答（２回のワクチン接種後に６７％の赤血球凝集素−抑制セロコンバージョン率）を誘導した。特に、アジュバント添加した３０μｇ Ｈ５Ｎ１ワクチンによる２用量レジメンは、季節性インフルエンザワクチンの交付についての欧州規制基準（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）と一致する免疫応答を示した。
【０１１９】
本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。
【０１２０】
（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））
【０１２１】
【化１】
【０１２２】
【化２】
【０１２３】
【化３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分；および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を備える、キット。
【請求項２】
前記成分の一方または両方は、バイアル中にある、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記成分の一方または両方は、注射器中にある、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記成分の一方は、注射器中にあり、そして他方の成分は、バイアル中にある、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記抗原成分は、注射器中にある、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記インフルエンザウイルス抗原は、不活化ウイルスである、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルス抗原は、全ウイルス抗原、スプリットウイルス抗原、または精製された表面抗原を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ由来である、請求項１〜７のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
前記インフルエンザウイルス抗原は、卵において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
前記インフルエンザウイルス抗原は、細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
前記インフルエンザウイルス抗原成分は、オボアルブミン、オボムコイドおよびニワトリＤＮＡを含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
前記インフルエンザウイルス抗原成分は、前記細胞培養物の宿主由来の１０ｎｇ未満の細胞ＤＮＡを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルス抗原成分は、該成分中に１ウイルス株あたり０．１μｇと５０μｇとの間の赤血球凝集素を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
前記アジュバント成分は、水酸化アルミニウムアジュバントを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
前記アジュバント成分は、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
同時の分離した使用または連続的な使用のための、インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と、アルミニウム塩を含むアジュバント成分。
【請求項１７】
インフルエンザウイルス抗原とアルミニウム塩アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該組成物は、使用時点において該抗原と該アジュバントとを即時混合することによって調製された、免疫原性組成物。
【請求項１８】
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分を調製する工程；（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を調製する工程；および（ｉｉｉ）該抗原成分と該アジュバント成分とをキット中に組み合わせる工程；を包含する、インフルエンザワクチンを調製するための方法。
【請求項１９】
（ｉ）請求項１に記載のキットの成分を混合する工程；および（ｉｉ）該混合された成分を患者に投与する工程を包含する、インフルエンザワクチンを調製および投与するための方法。
【請求項２０】
インフルエンザワクチンを調製および投与するための方法であって、（ａ）（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分とを合わせる工程；および（ｂ）工程（ａ）を行った１２時間以内に該ワクチンを患者に投与する工程；を包含する、方法。
【請求項２１】
医療において使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分の使用であって、該医薬は、該抗原および該アジュバントを分離した成分として含む、使用。
【請求項１】
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分；および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を備える、キット。
【請求項２】
前記成分の一方または両方は、バイアル中にある、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記成分の一方または両方は、注射器中にある、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記成分の一方は、注射器中にあり、そして他方の成分は、バイアル中にある、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記抗原成分は、注射器中にある、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記インフルエンザウイルス抗原は、不活化ウイルスである、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルス抗原は、全ウイルス抗原、スプリットウイルス抗原、または精製された表面抗原を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ由来である、請求項１〜７のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
前記インフルエンザウイルス抗原は、卵において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
前記インフルエンザウイルス抗原は、細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
前記インフルエンザウイルス抗原成分は、オボアルブミン、オボムコイドおよびニワトリＤＮＡを含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
前記インフルエンザウイルス抗原成分は、前記細胞培養物の宿主由来の１０ｎｇ未満の細胞ＤＮＡを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルス抗原成分は、該成分中に１ウイルス株あたり０．１μｇと５０μｇとの間の赤血球凝集素を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
前記アジュバント成分は、水酸化アルミニウムアジュバントを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
前記アジュバント成分は、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
同時の分離した使用または連続的な使用のための、インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と、アルミニウム塩を含むアジュバント成分。
【請求項１７】
インフルエンザウイルス抗原とアルミニウム塩アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該組成物は、使用時点において該抗原と該アジュバントとを即時混合することによって調製された、免疫原性組成物。
【請求項１８】
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分を調製する工程；（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分を調製する工程；および（ｉｉｉ）該抗原成分と該アジュバント成分とをキット中に組み合わせる工程；を包含する、インフルエンザワクチンを調製するための方法。
【請求項１９】
（ｉ）請求項１に記載のキットの成分を混合する工程；および（ｉｉ）該混合された成分を患者に投与する工程を包含する、インフルエンザワクチンを調製および投与するための方法。
【請求項２０】
インフルエンザワクチンを調製および投与するための方法であって、（ａ）（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む抗原成分と（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分とを合わせる工程；および（ｂ）工程（ａ）を行った１２時間以内に該ワクチンを患者に投与する工程；を包含する、方法。
【請求項２１】
医療において使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）アルミニウム塩を含むアジュバント成分の使用であって、該医薬は、該抗原および該アジュバントを分離した成分として含む、使用。
【公表番号】特表２００９−５１４８４３（Ｐ２００９−５１４８４３Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８４２２（Ｐ２００８−５３８４２２）
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５２０６０
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５２０６０
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
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