アンモニア生産方法
【課題】高コストであり、大量の二酸化炭素を排出し、地球温暖化の一因となっているハーバーボッシュ法によるアンモニアの工業的大量生産法や多大なエネルギーを必要とし、コストの面から実用化が難しく、効率が悪い窒素固定能を有する細菌を用いたアンモニア生産法に換わるアンモニア生産方法の提供。
【解決手段】炭素源が低濃度である培地中で培養した場合、野生株でも大量のアンモニアを蓄積する単生系の窒素固定土壌細菌を見出し、当該土壌細菌を利用して商業的にアンモニアを生産する。
【解決手段】炭素源が低濃度である培地中で培養した場合、野生株でも大量のアンモニアを蓄積する単生系の窒素固定土壌細菌を見出し、当該土壌細菌を利用して商業的にアンモニアを生産する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、窒素固定細菌を用いて生物学的に窒素固定を行い、アンモニアを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より農作物の生産には大量の窒素肥料を利用しており、穀物に関しては単位面積当たりの生産量と窒素肥料の量とが比例するというデータもある。そして、近年の経済発展に伴う食料需要の増大及び人口増加に対応するため、窒素肥料の使用料は急増している。そして今日の農業で用いられる窒素肥料の多くはハーバーボッシュ法により工業的に大量に生産されている。特に今後はバイオ燃料の原料としての農作物の生産も加わり、更なる窒素肥料の需要が予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、鉄触媒を用いて窒素分子及び水素分子からアンモニアを合成するハーバーボッシュ法には、窒素分子の分離、水素分子の調整、窒素−水素混合ガスの高温高圧下での反応など、エネルギー消費の大きい工程を含むため、高コストであった。また、大量の化石燃料の燃焼により二酸化炭素を排出し、地球温暖化の一因となっている。これらの問題は、化石燃料の供給不安定、価格の変動、地球温暖化による異常気象などの地球規模の問題と直結するものである。
【０００４】
そこで、近年窒素固定細菌を利用し生物学的にアンモニアを生産する方法が注目されている。この方法によれば、化石燃料を消費せず、また自然エネルギーを利用するため環境への負荷を抑えることができる。
【０００５】
主な窒素固定細菌としては、共生系の根粒菌やらん藻などがある。窒素固定細菌は大気中の窒素分子をアンモニアへと変換する。その際、窒素固定酵素ニトロゲナーゼを必要とし、この酵素の発現を制御することにより、アンモニアの合成を調整している。ここで、アンモニア合成には大量のエネルギーを消費し、またアンモニアは窒素固定細菌自身にとって有毒であるため、自己防衛として必要以上に合成しないように制御している。そのためアンモニア存在下においてはニトロゲナーゼの発現は抑制され、従って大量のアンモニアを生産することはできない。
【０００６】
そこで、ニトロゲナーゼ発現調節遺伝子のうち、発現を制御する制御遺伝子の機能を停止させた変異株を用いた研究が進められている。
【０００７】
しかしながら、依然として窒素固定には多大なエネルギーを要するため、エネルギー源として大量の有機物を供給する必要があり、コストの面から実用化は難しい。
【０００８】
また、AzotobacterやClostridiumなどの単生系の土壌細菌も窒素固定能を有するが、エネルギー取得が困難である為、効率が悪い。また自らの必要分のみ生産し、菌体外分泌までは至らず、死んで分解されて初めて窒素循環に寄与すると考えられている。従って、商業的なアンモニア生産には利用できない。
【特許文献１】特開２００２−２５３２８３
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決する為に鋭意研究を進める過程で、炭素源が低濃度である培地中で培養した場合、野生株でも大量のアンモニアを蓄積する単生系の土壌細菌を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）窒素固定細菌によるアンモニア生産方法であって、窒素固定細菌の培養に用いる培地中の炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下にすることを特徴とするアンモニア生産方法に関する。
【００１１】
また本発明は、（２）炭素源としてグルコース、フルクトース、スクロース、マルトースのいずれか一以上を用いることを特徴とする（１）のアンモニア生産方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（３）窒素固定菌が単生系の土壌細菌であることを特徴とする（１）又は（２）のアンモニア生産方法に関する。更には当該単生系の土壌細菌が、Azotobacter beijerinckii又はAzotobacter vinelandii、Lysobacter属、Agrobacterium属のいずれか一以上であることを特徴とする（３）のアンモニア生産方法に関する。
【００１３】
また本発明は、（５）窒素固定菌が、Azotobacter beijerinckii Ｃ４株、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株、Lysobacter sp. Ｅ４株、Lysobacter sp.Ｇ６株、Agrobacterium sp. Ｔ１株のいずれか一以上であることを特徴とする（４）のアンモニア生産方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（６）（１）アンモニア生産方法に用いるAzotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）、Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）、Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）、Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、単生系の土壌細菌野生株を用いて、環境への負荷が小さく簡便かつ効率よくアンモニアを生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本件発明の実施の形態について、添付図面を用いて説明する。なお、本件発明は、これら実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
【００１７】
本発明は、窒素固定細菌によるアンモニア生産において、培地中の炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下にすることを特徴とするアンモニア生産方法について説明する。
【００１８】
本発明に係る窒素固定菌は、窒素固定能を有するものであればよく、土壌系、海洋系など特に限定しない。また、共生系及び単生系のどちらでもよい。好ましくは土壌細菌である。採取や培養等の取扱いが比較的容易であるからである。さらに好ましくは単生系土壌細菌である。
【００１９】
かかる単生系の土壌細菌としては、Azotobacter beijerinckii又はAzotobacter vinelandii、又は、Lysobacter sp.、Agrobacterium sp.が好ましい。なお、Azotobacter beijerinckiiは従来より単生系の窒素固定細菌としてよく知られており、Azotobacter beijerinckiiのトランスポゾン変異株においてはアンモニアの生産、蓄積について報告されているが、野生株においてはこれまで報告がない。Azotobacter vinelandii及びAgrobacterium sp.は窒素固定の報告はあるが、Lysobacter sp.の窒素固定についてはこれまで報告がない。また、Azotobacter vinelandii、Agrobacterium sp.及びLysobacter sp.はアンモニアの生産、蓄積についてはこれまで報告はない。
【００２０】
Azotobacter beijerinckiiとしては特にAzotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）を好適に用いることができる。Lysobacter属としては特に、Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）、Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）を好適に用いることができる。Agrobacterium sp.としては特に、Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）を好適に用いることができる。
【００２１】
なお、これらの窒素固定細菌は全て独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託済であり、上記括弧内の記号はその寄託番号である。また、ＮＩＴＥ Ｐ−５４２、ＮＩＴＥ Ｐ−５４３、ＮＩＴＥ Ｐ−５４４、ＮＩＴＥ Ｐ−５４５は、平成２０年４月２日付けで受託されている。また、ＮＩＴＥ Ｐ−６０５は平成２０年７月１日付けで受託されている。以下にこれら窒素固定細菌の性質を示す。
【００２２】
<Azotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）>
【００２３】
（ａ）０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００２４】
（ｂ）生理学的性質
グラム染色性：陰性、好気性、資化性；グルコース：＋、フルクトース：＋、ガラクトース：＋、マンノース：＋、スクロース：＋、Ｃｉｔｒａｔｅ：＋、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００２５】
<Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）>
【００２６】
（ａ）（ｉ）５．０（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径４ｍｍ、形：円形、色：ベージュ、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：４日間
【００２７】
（ｉｉ）０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径２ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００２８】
（ｃ）生理学的性質
グラム染色性：陰性、好気性、資化性；グルコース：＋、フルクトース：＋、ガラクトース：＋、マンノース：＋、スクロース：＋、マンニトール：＋、Ｃｉｔｒａｔｅ：＋、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００２９】
<Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）>
【００３０】
（ａ）０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００３１】
（ｂ）生理学的性質
好気性、生育範囲：pH６以下、温度４０℃以下、資化性；グルコース：＋、マンニトール：＋、フルクトース：＋、ガラクトース：−、マンノース：＋、スクロース：＋、マルトース：＋、ラクトース：−、Ｃｉｔｒａｔｅ：−、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００３２】
<Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）>
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００３３】
（ｂ）生理学的性質
グラム染色性：陽性、好気性、資化性；グルコース：＋、マンニトール：＋
【００３４】
<Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）>
【００３５】
（ａ）０．３（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：ベージュ、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００３６】
（ｂ）生理学的性質
グラム染色性：陰性、好気性、資化性；グルコース：＋、フルクトース：＋、スクロース：＋、マルトース：＋、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００３７】
本発明に係る窒素固定細菌の培養の条件は、炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下とすること以外は、アンモニアの生産に適するならば特に限定しない。炭素源としては、糖類、有機酸等、特に限定しないが、好ましくは糖類である。より好ましくはグルコース、フルクトース、スクロース、マルトースである。１種類の炭素源のみを用いてもよく、2種類以上の炭素源を用いてもよい。なお、炭素源濃度は０．５（ｗｔ／ｖ）％以下の範囲で、窒素固定細菌や炭素源、及びその他の条件に基づいて適宜決定すればよい。また、培地組成、pH、培養密度、培養温度、培養時間等、種々の条件を設定しアンモニア生産能を制御することができる。
<実施形態１：効果>
【００３８】
本発明によれば、単生系の野生株からアンモニアを生産することができる。また、環境への負荷を抑え、簡便かつ効率よく大量のアンモニア生産が可能である。
【実施例１】
【００３９】
１． 窒素固定細菌の単離
【００４０】
（１）集積培養
畑土壌より採取した土壌サンプル０．１ｇを無窒素最小培地（ＮＦＭＭ）（表１）２００ｍｌを用いて集積培養する。炭素源としては、セルロース２ｇを用いる（Ｃ−ＮＦＭＭ）。
【００４１】
［表１］
３０℃、１２０ｒｐｍで１から２週間回転振とう培養し（一次集積）、この一次集積液２ｍｌを新しい２００ｍｌのＣ−ＮＦＭＭに植え継ぎ、同様に培養した（二次集積）。その後二次集積液を０．８％ＮａＣｌで希釈し、Ｃ−ＮＦＭＭ重層平板に１００μｌずつ塗布し、３０℃で培養した。
【００４２】
（２）平板培地
土壌サンプルをそれぞれ１５ｍｌプラスチックチューブを用いて滅菌水に懸濁させ（約１０ｖ／ｖ％）、土壌が沈殿するまで静置する。その後上清を採取し、１０−１希釈液とし、これを滅菌水で希釈し、１０−２希釈液を作成する。当該希釈液をＣ−ＮＦＭＭ平板に１００μｌずつ塗布し、３０℃で培養する。
【００４３】
（３）菌株の単離
（１）及び（２）の集積培養、平板培養でＣ−ＮＦＭＭ重層平板に生育したコロニーを新しいＣ−ＮＦＭＭ重層平板培地に描線、培養する。生育したコロニーを再度０．８％ＮａＣｌで希釈し、Ｃ−ＮＦＭＭ重層平板に塗布し、培養する。このうち生育のよいコロニーを０．８％ＮａＣｌで希釈し、ブイヨン平板培地（表２）に塗布する。ブイヨン平板培地に生育したシングルコロニーを再度希釈してＣ−ＮＦＭＭ平板培地に塗布する。この操作をコロニーが単一になるまで繰り返し行う。
【００４４】
［表２］
【００４５】
（４）クリアゾーン形成の確認
（１）乃至（３）より単離した菌株を０．８％ＮａＣｌで適宜希釈し、Ｃ−ＮＦＭＭ重層平板培地に塗布する。これを３０℃で２週間以上静置培養し、クリアゾーンの形成を確認する。
２．アンモニアの検出
【００４６】
（１）培地のpH変化
前記１．より単離した菌株を、pH指示薬としてＢＴＢ（Ｂｒｏｍｏ−ｔｈｙｍｏｌｂｌｕｅ）を加えた０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコースＮＦＭＭ培地（Ｇ−ＮＦＭＭ）に画線し、３０℃で３日間静置培養し、培地のpH変化を確認した。その結果、複数の菌株で培地が青くなり、pHの上昇が見られた。
【００４７】
（２）アンモニアの検出
（１）にてpHの上昇が見られた菌株を５ｍｌのＧ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で３日間振とう培養した。その後、培養液１ｍｌを使い捨て試験管に入れ、アンモニア検出キットを用いてアンモニア生産の確認をした。その結果、アンモニアが検出された。
３． 窒素固定細菌の同定
【００４８】
（１）Ｔｏｔａｌ ＤＮＡの抽出
前記２．よりアンモニア生産が確認された菌株をグルコースＮＦＭＭ培地（Ｇ−ＮＦＭＭ）で培養する。培養した菌体を１．５ｍｌ容マイクロチューブに移し、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集金する。集金した菌体を０．８％ＮａＣｌに懸濁させ、同様に遠心分離し、上清を取り除く。これに５６７μｌのＴＥバッファを加えて撹拌し、３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた後、ローテーターで５分転倒混和する。３７℃で１時間静置した後、１１０μｌの５ＭＮａＣｌをを加え、ローテーターで５分転倒混和する。これに８０μｌのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、ローテーターで５分転倒混和する。６５℃で２０分静置し、室温に戻した後８００μｌのクロロホルムを加え、ローテーターで２０分転倒混和する。これを、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）し、上清を新しい２ｍｌ容マイクロチューブに移し、８００μｌ／クロロホルムを加え、ローテーターで２０分転倒混和する。その後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）し、予め４８０μｌのイソプロパノールを入れたマイクロチューブに上清を加え、ローテーターで５分転倒混和する。これを再度遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）し、上清を取り除く。４００μｌの７０％エタノールを加え沈殿をリンスし、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間、ＲＴ）した後、上清を完全に取り除く。ＲｎａｓｅＡｓｏｌｕｔｉｏｎを加えたＴＥバッファ１０μｌに沈殿を溶解させた後、３７℃で１時間反応させる。用いた試薬の組成を下記表３に示す。
【００４９】
［表３］
【００５０】
（２）１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅
（１）より抽出したＣ４株（下記（３）にてAzotobacter beijerinckii Ｃ４株と同定）Ｔｏｔａｌ ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ここで、配列番号１（Primer 10F）及び配列番号２（Primer 1500R）のプライマーを使用した。
ＰＣＲ反応は表４に記載の反応液で次の条件で行った。９４℃で１分間処理した後、９４℃、３０秒間→６０℃、３０秒間→７２℃、２分間を１サイクルとし、３５サイクル行った。その後、４℃に冷却する。
［表４］
【００５１】
（３）塩基配列解析
上記（２）で増幅した１６Ｓ ｒＤＮＡを精製後、ダイターミネーター法により塩基配列解析を行った。塩基配列の決定にはＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、マニュアルに従って行った。
【００５２】
ＰＣＲ反応を表５に記載の反応液で次の条件で行った。９６℃で３０秒間処理した後、９６℃で１０秒間→５０℃で５秒間→６０℃で２分間を１サイクルとし、２５サイクル行った後、４℃に冷却した。ここで、配列番号１乃至１２のプライマーを使用した。
［表５］
【００５３】
ＰＣＲで増幅後、１．５ｍｌマイクロチューブに反応液を移し、２μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃと５０μｌの１００％エタノールを加えて撹拌し、室温で１５分間静置した。その後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間、２２℃）し、上清を取り除いた。これを２５０μｌの７０％エタノールでリンスし、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間、２２℃）し、上清を取り除いた。その後、アスピレータを用いて１０分間真空乾燥させ、１５μｌのＴＳＲを加えて軽く３回ｖｏｒｔｅｘし、フラッシングした。その後、９５℃で２分間加熱し、氷上で急冷した。これを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。キャプラリーは３１０Ｃａｐｏｌｌａｒｙ（Ｌｔ＝４７ｃｍ、ｉ．ｄ．＝５０μｍ）、泳動ポリマーはＰＯＰ６、バッファは１ｘＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ＥＤＴＡを用いた。
【００５４】
各菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴにて相同性検索し、属種を決定した。これを表６に示す。
［表６］
【００５５】
なお、Azotobacter beijerinckiiは典型的な窒素固定細菌であるが、野生株がアンモニアを蓄積するという報告はこれまでなされていない。また、Lysobacter sp.、Agrobacterium sp.については窒素固定能についても報告がなされていない。そこで、本発明者らはアンモニアの蓄積が培養条件に影響を受けるのではないかと予測し、これらの菌株によるアンモニアの蓄積に良好な培養条件を検討した。
４． アンモニア蓄積の培養条件
【００５６】
（１）Azotobacter beijerinckii基準株及びAzotobacter vinelandii基準株のアンモニア生産
Azotobacter beijerinckii基準株（ＩＡＭ１２６８３Ｔ）及びAzotobacter vinelandii基準株（ＩＭＡ１５００４Ｔ）を用いてアンモニア蓄積の培養条件を検討した。なお、該基準株は共に独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）にて取得可能である。
【００５７】
（ａ）炭素源の検討
ＢＴＢ試薬を添加した０．５（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ平板培地にて、Azotobacter beijerinckii及びAzotobacter vinelandiiの基準株を３０℃で２から３日間静置培養した。培養後、コロニーを採取し、Azotobacter beijerinckii基準株については０．５（ｗｔ／ｖ）％の種々の炭素源（グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、Ｃｉｔｒａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を加えたＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振とう培養した。同様に、Azotobacter vinelandii基準株については０．２５（ｗｔ／ｖ）％の種々の炭素源を加えたＮＦＭＭ液体培地にて培養した。振とう培養０時間後から４８時間後におけるＯＤ６００及び培地中のアンモニア量を測定した。図１（ａ）にAzotobacter beijerinckiiの結果を、（ｂ）にAzotobacter vinelandiiの結果を示す。図１より、双方の基準株とも有機酸ではアンモニアは検出されなかったが、全ての糖でアンモニアが検出された。特に、Azotobacter beijerinckii基準株については、炭素源としてグルコースとフルクトースを添加した場合に大量のアンモニアの蓄積がみられ、Azotobacter vinelandiiの基準株については炭素源としてフルクトースを添加した場合に大量のアンモニアの蓄積が見られた。
【００５８】
（ｂ）炭素源濃度の検討
ＢＴＢ試薬を添加した０．５（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ平板培地にて、Azotobacter beijerinckii及びAzotobacter vinelandiiの基準株を３０℃で２から３日間静置培養した。培養後、コロニーを採取し、Azotobacter beijerinckii基準株についてはグルコース、Azotobacter vinelandii基準株についてはフルクトースをそれぞれ種々の濃度で添加したＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振とう培養した。
【００５９】
ｉ．Azotobacter beijerinckii基準株
グルコース濃度をそれぞれ０．１（ｗｔ／ｖ）％、０．２５（ｗｔ／ｖ）％、０．５（ｗｔ／ｖ）％、０．７（ｗｔ／ｖ）％、１．０（ｗｔ／ｖ）％、２．０（ｗｔ／ｖ）％としたＧ−ＮＦＭＭ液体培地にて培養し、培養４８時間後におけるＯＤ６００及びpH、培地中のアンモニア量を測定した。その結果を図２に示す。図２より、増殖に最も良好な濃度は１．００（ｗｔ／ｖ）％であったが、アンモニアの蓄積に最も良好な濃度は０．５（ｗｔ／ｖ）％であった。そこで、グルコース濃度０．５（ｗｔ／ｖ）％のＧ−ＮＦＭＭ液体培地で培養し、経時的にアンモニアの蓄積量を測定した結果を下記（ｃ）及び図４に示す。
【００６０】
ｉｉ．Azotobacter vinelandii基準株
フルクトース濃度をそれぞれ０．０５（ｗｔ／ｖ）％、０．１（ｗｔ／ｖ）％、０．２５（ｗｔ／ｖ）％、０．５（ｗｔ／ｖ）％、０．７（ｗｔ／ｖ）％、１．０（ｗｔ／ｖ）％としたＦ−ＮＧＭＭ液体培地にて培養し、培養４８時間後におけるＯＤ６００及びpH、培地中のアンモニア量を測定した。その結果を図３に示す。図３より、増殖に最も良好な濃度は１．００（ｗｔ／ｖ）％であったが、アンモニアの蓄積に最も良好な濃度は０．２５（ｗｔ／ｖ）％であった。そこで、フルクトース濃度０．２５（ｗｔ／ｖ）％のＦ−ＮＦＭＭ液体培地で培養し、経時的にアンモニアの蓄積量を測定した結果を図５に示す。
【００６１】
（ｃ）アンモニア蓄積の経時変化
【００６２】
Azotobacter beijerinckii基準株
図４（ａ）にAzotobacter beijerinckii基準株のグルコース濃度０．５（ｗｔ／ｖ）％のＧ−ＮＦＭＭ液体培地におけるＯＤ６００及びpH、培地中のアンモニア量の経時変化を、（ｂ）に培地中のアンモニア量と残糖量の経時変化を測定した結果を示す。図４（ａ）より、Azotobacter beijerinckii基準株が定常期に近づくとアンモニアの蓄積が開始することがわかる。これは、図５に示すようにAzotobacter vinelandii基準株についても同様であった。また、図４（ｂ）より、培地中のグルコースをほとんど消費してからアンモニアの蓄積が開始することがわかる。更に、アンモニアの生産には多量のエネルギーを必要とするにもかかわらず、培地中のグルコースがほぼ消費尽くされた後でもアンモニアの蓄積が続いていることがわかる。以上より、グルコースがアンモニア蓄積に何らかの抑制因子となっており、グルコースの中間代謝産物がアンモニア生産のエネルギーとなっていることが推察される。
【００６３】
（２）Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）のアンモニア生産
【００６４】
Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）についてアンモニア蓄積の培養条件を検討した。
【００６５】
（ａ）生育の確認
前培養として、５ｍｌの０．３（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。その後、２００ｍｌの０．３（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に２ｍｌの前培養液を加え、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養開始直後から２時間毎にＯＤ６００を測定した。その結果を図６に示す。図６より、培養６時間経過辺りから増殖が開始し、１４時間経過辺りで定常期に入ることが確認できた。
【００６６】
（ｂ）グルコース濃度（ｗｔ／ｖ）の検討
グルコース濃度をそれぞれ０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７％、１．０％、２．０％としたＧ−ＮＦＭＭ液体培地にて３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養後、ＯＤ６００を測定し、また培養液のpHを測定した。その後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図７に示す。図７より、０．５％濃度以下でアンモニアが確認され、０．３％濃度が最も良好であった。
【００６７】
（ｃ）培養時間の検討
前培養として、５ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。その後、２００ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に２ｍｌの前培養液を加え、３０℃、１７０ｒｐｍで２４０時間振とう培養した。当該培養開始直後から、１５時間後、２４時間後、その後は２４時間毎にアンモニア量を測定した。その結果を図８に示す。図８より、培養開始から１５時間後からアンモニアの蓄積が始まり、およそ１９２時間（８日間）後に定常期に達した。
【００６８】
（ｄ）培地pHの検討
pH５，６，７，８に調整した６ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。ＯＤ６００、pHを測定後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図９に示す。図９より、pH７が最も良好であった。pH８では菌の生育はより良好であるが、アンモニアの蓄積は減少した。また、pH６以下では生育が確認できなかった。
【００６９】
（ｅ）培養温度の検討
６ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、各温度（３０℃、４０℃、５０℃）２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。ＯＤ６００、pHを測定後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図１０に示す。図１０より、アンモニアの蓄積が確認できたのは３０℃のみであった。２０℃では生育は確認できたが、アンモニアの蓄積は確認できず、４０℃以上では生育、アンモニア蓄積ともに確認できなかった。
【００７０】
（ｆ）炭素源の検討
種々の炭素源（グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、Ｃｉｔｒａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を０．３％とする６ｍｌのＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。ＯＤ６００、pHを測定後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図１１に示す。図１１より、グルコースのほかにフルクトース、スクロース、マルトースでもアンモニア蓄積を確認できた。以上より、これまでLysobacter sp. 属の窒素固定能についての報告はないが、複数の糖培地にてアンモニア蓄積が見られることが分かった。
【００７１】
（ｇ）残糖量の確認
前培養として、５ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。その後、２００ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に２ｍｌの前培養液を加え、３０℃、１７０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養開始直後から３時間毎にＯＤ６００を測定した。また、グルコース測定キットを用いて培地中のグルコース量（残糖量）を測定した。その結果を図１２に示す。図１２より、残糖量がゼロになると菌の増殖は定常期に入り、アンモニアの蓄積が開始した。
５． 結論
以上より、窒素固定細菌の種々の培養条件を制御することにより、アンモニアの蓄積を制御できることを示している。特に培地中のアンモニア濃度がアンモニア蓄積に大きく影響していることが推察される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】Azotobacter beijerinckii基準株及びAzotobacter vinelandii基準株について、各炭素源を添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量
【図２】Azotobacter beijerinckii基準株について、種々の濃度でグルコースを添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量
【図３】Azotobacter vinelandii基準株について、種々の濃度でグルコースを添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量
【図４】Azotobacter beijerinckii基準株について、グルコース濃度が０．５％の培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量、pH、残糖量
【図５】Azotobacter vinelandii基準株について、フルクトース濃度が０．２５％の培地における培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図６】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における培養結果：ＯＤ６００
【図７】Lysobacter sp. Ｅ４株について、種々の濃度でグルコースを添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量、pH
【図８】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図９】Lysobacter sp. Ｅ４株について、種々のpH値に調整したグルコース濃度が０．３％の培地における培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図１０】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における種々の培養温度での培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図１１】Lysobacter sp. Ｅ４株について、各炭素源を添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量、pH
【図１２】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における種々の培養温度での培養結果：培地中のアンモニア量、残糖量、ＯＤ６００
【技術分野】
【０００１】
本発明は、窒素固定細菌を用いて生物学的に窒素固定を行い、アンモニアを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より農作物の生産には大量の窒素肥料を利用しており、穀物に関しては単位面積当たりの生産量と窒素肥料の量とが比例するというデータもある。そして、近年の経済発展に伴う食料需要の増大及び人口増加に対応するため、窒素肥料の使用料は急増している。そして今日の農業で用いられる窒素肥料の多くはハーバーボッシュ法により工業的に大量に生産されている。特に今後はバイオ燃料の原料としての農作物の生産も加わり、更なる窒素肥料の需要が予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、鉄触媒を用いて窒素分子及び水素分子からアンモニアを合成するハーバーボッシュ法には、窒素分子の分離、水素分子の調整、窒素−水素混合ガスの高温高圧下での反応など、エネルギー消費の大きい工程を含むため、高コストであった。また、大量の化石燃料の燃焼により二酸化炭素を排出し、地球温暖化の一因となっている。これらの問題は、化石燃料の供給不安定、価格の変動、地球温暖化による異常気象などの地球規模の問題と直結するものである。
【０００４】
そこで、近年窒素固定細菌を利用し生物学的にアンモニアを生産する方法が注目されている。この方法によれば、化石燃料を消費せず、また自然エネルギーを利用するため環境への負荷を抑えることができる。
【０００５】
主な窒素固定細菌としては、共生系の根粒菌やらん藻などがある。窒素固定細菌は大気中の窒素分子をアンモニアへと変換する。その際、窒素固定酵素ニトロゲナーゼを必要とし、この酵素の発現を制御することにより、アンモニアの合成を調整している。ここで、アンモニア合成には大量のエネルギーを消費し、またアンモニアは窒素固定細菌自身にとって有毒であるため、自己防衛として必要以上に合成しないように制御している。そのためアンモニア存在下においてはニトロゲナーゼの発現は抑制され、従って大量のアンモニアを生産することはできない。
【０００６】
そこで、ニトロゲナーゼ発現調節遺伝子のうち、発現を制御する制御遺伝子の機能を停止させた変異株を用いた研究が進められている。
【０００７】
しかしながら、依然として窒素固定には多大なエネルギーを要するため、エネルギー源として大量の有機物を供給する必要があり、コストの面から実用化は難しい。
【０００８】
また、AzotobacterやClostridiumなどの単生系の土壌細菌も窒素固定能を有するが、エネルギー取得が困難である為、効率が悪い。また自らの必要分のみ生産し、菌体外分泌までは至らず、死んで分解されて初めて窒素循環に寄与すると考えられている。従って、商業的なアンモニア生産には利用できない。
【特許文献１】特開２００２−２５３２８３
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決する為に鋭意研究を進める過程で、炭素源が低濃度である培地中で培養した場合、野生株でも大量のアンモニアを蓄積する単生系の土壌細菌を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）窒素固定細菌によるアンモニア生産方法であって、窒素固定細菌の培養に用いる培地中の炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下にすることを特徴とするアンモニア生産方法に関する。
【００１１】
また本発明は、（２）炭素源としてグルコース、フルクトース、スクロース、マルトースのいずれか一以上を用いることを特徴とする（１）のアンモニア生産方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（３）窒素固定菌が単生系の土壌細菌であることを特徴とする（１）又は（２）のアンモニア生産方法に関する。更には当該単生系の土壌細菌が、Azotobacter beijerinckii又はAzotobacter vinelandii、Lysobacter属、Agrobacterium属のいずれか一以上であることを特徴とする（３）のアンモニア生産方法に関する。
【００１３】
また本発明は、（５）窒素固定菌が、Azotobacter beijerinckii Ｃ４株、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株、Lysobacter sp. Ｅ４株、Lysobacter sp.Ｇ６株、Agrobacterium sp. Ｔ１株のいずれか一以上であることを特徴とする（４）のアンモニア生産方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（６）（１）アンモニア生産方法に用いるAzotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）、Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）、Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）、Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、単生系の土壌細菌野生株を用いて、環境への負荷が小さく簡便かつ効率よくアンモニアを生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本件発明の実施の形態について、添付図面を用いて説明する。なお、本件発明は、これら実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
【００１７】
本発明は、窒素固定細菌によるアンモニア生産において、培地中の炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下にすることを特徴とするアンモニア生産方法について説明する。
【００１８】
本発明に係る窒素固定菌は、窒素固定能を有するものであればよく、土壌系、海洋系など特に限定しない。また、共生系及び単生系のどちらでもよい。好ましくは土壌細菌である。採取や培養等の取扱いが比較的容易であるからである。さらに好ましくは単生系土壌細菌である。
【００１９】
かかる単生系の土壌細菌としては、Azotobacter beijerinckii又はAzotobacter vinelandii、又は、Lysobacter sp.、Agrobacterium sp.が好ましい。なお、Azotobacter beijerinckiiは従来より単生系の窒素固定細菌としてよく知られており、Azotobacter beijerinckiiのトランスポゾン変異株においてはアンモニアの生産、蓄積について報告されているが、野生株においてはこれまで報告がない。Azotobacter vinelandii及びAgrobacterium sp.は窒素固定の報告はあるが、Lysobacter sp.の窒素固定についてはこれまで報告がない。また、Azotobacter vinelandii、Agrobacterium sp.及びLysobacter sp.はアンモニアの生産、蓄積についてはこれまで報告はない。
【００２０】
Azotobacter beijerinckiiとしては特にAzotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）を好適に用いることができる。Lysobacter属としては特に、Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）、Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）を好適に用いることができる。Agrobacterium sp.としては特に、Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）を好適に用いることができる。
【００２１】
なお、これらの窒素固定細菌は全て独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託済であり、上記括弧内の記号はその寄託番号である。また、ＮＩＴＥ Ｐ−５４２、ＮＩＴＥ Ｐ−５４３、ＮＩＴＥ Ｐ−５４４、ＮＩＴＥ Ｐ−５４５は、平成２０年４月２日付けで受託されている。また、ＮＩＴＥ Ｐ−６０５は平成２０年７月１日付けで受託されている。以下にこれら窒素固定細菌の性質を示す。
【００２２】
<Azotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）>
【００２３】
（ａ）０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００２４】
（ｂ）生理学的性質
グラム染色性：陰性、好気性、資化性；グルコース：＋、フルクトース：＋、ガラクトース：＋、マンノース：＋、スクロース：＋、Ｃｉｔｒａｔｅ：＋、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００２５】
<Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）>
【００２６】
（ａ）（ｉ）５．０（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径４ｍｍ、形：円形、色：ベージュ、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：４日間
【００２７】
（ｉｉ）０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径２ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００２８】
（ｃ）生理学的性質
グラム染色性：陰性、好気性、資化性；グルコース：＋、フルクトース：＋、ガラクトース：＋、マンノース：＋、スクロース：＋、マンニトール：＋、Ｃｉｔｒａｔｅ：＋、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００２９】
<Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）>
【００３０】
（ａ）０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００３１】
（ｂ）生理学的性質
好気性、生育範囲：pH６以下、温度４０℃以下、資化性；グルコース：＋、マンニトール：＋、フルクトース：＋、ガラクトース：−、マンノース：＋、スクロース：＋、マルトース：＋、ラクトース：−、Ｃｉｔｒａｔｅ：−、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００３２】
<Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）>
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：黄色、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００３３】
（ｂ）生理学的性質
グラム染色性：陽性、好気性、資化性；グルコース：＋、マンニトール：＋
【００３４】
<Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）>
【００３５】
（ａ）０．３（ｗｔ／ｖ）％グルコース−ＮＦＭＭ培地におけるコロニーの形態
大きさ：直径１ｍｍ、形：円形、色：ベージュ、培地のpH：７．０、培養温度：３０℃、培養期間：２日間
【００３６】
（ｂ）生理学的性質
グラム染色性：陰性、好気性、資化性；グルコース：＋、フルクトース：＋、スクロース：＋、マルトース：＋、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ：＋
【００３７】
本発明に係る窒素固定細菌の培養の条件は、炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下とすること以外は、アンモニアの生産に適するならば特に限定しない。炭素源としては、糖類、有機酸等、特に限定しないが、好ましくは糖類である。より好ましくはグルコース、フルクトース、スクロース、マルトースである。１種類の炭素源のみを用いてもよく、2種類以上の炭素源を用いてもよい。なお、炭素源濃度は０．５（ｗｔ／ｖ）％以下の範囲で、窒素固定細菌や炭素源、及びその他の条件に基づいて適宜決定すればよい。また、培地組成、pH、培養密度、培養温度、培養時間等、種々の条件を設定しアンモニア生産能を制御することができる。
<実施形態１：効果>
【００３８】
本発明によれば、単生系の野生株からアンモニアを生産することができる。また、環境への負荷を抑え、簡便かつ効率よく大量のアンモニア生産が可能である。
【実施例１】
【００３９】
１． 窒素固定細菌の単離
【００４０】
（１）集積培養
畑土壌より採取した土壌サンプル０．１ｇを無窒素最小培地（ＮＦＭＭ）（表１）２００ｍｌを用いて集積培養する。炭素源としては、セルロース２ｇを用いる（Ｃ−ＮＦＭＭ）。
【００４１】
［表１］
３０℃、１２０ｒｐｍで１から２週間回転振とう培養し（一次集積）、この一次集積液２ｍｌを新しい２００ｍｌのＣ−ＮＦＭＭに植え継ぎ、同様に培養した（二次集積）。その後二次集積液を０．８％ＮａＣｌで希釈し、Ｃ−ＮＦＭＭ重層平板に１００μｌずつ塗布し、３０℃で培養した。
【００４２】
（２）平板培地
土壌サンプルをそれぞれ１５ｍｌプラスチックチューブを用いて滅菌水に懸濁させ（約１０ｖ／ｖ％）、土壌が沈殿するまで静置する。その後上清を採取し、１０−１希釈液とし、これを滅菌水で希釈し、１０−２希釈液を作成する。当該希釈液をＣ−ＮＦＭＭ平板に１００μｌずつ塗布し、３０℃で培養する。
【００４３】
（３）菌株の単離
（１）及び（２）の集積培養、平板培養でＣ−ＮＦＭＭ重層平板に生育したコロニーを新しいＣ−ＮＦＭＭ重層平板培地に描線、培養する。生育したコロニーを再度０．８％ＮａＣｌで希釈し、Ｃ−ＮＦＭＭ重層平板に塗布し、培養する。このうち生育のよいコロニーを０．８％ＮａＣｌで希釈し、ブイヨン平板培地（表２）に塗布する。ブイヨン平板培地に生育したシングルコロニーを再度希釈してＣ−ＮＦＭＭ平板培地に塗布する。この操作をコロニーが単一になるまで繰り返し行う。
【００４４】
［表２］
【００４５】
（４）クリアゾーン形成の確認
（１）乃至（３）より単離した菌株を０．８％ＮａＣｌで適宜希釈し、Ｃ−ＮＦＭＭ重層平板培地に塗布する。これを３０℃で２週間以上静置培養し、クリアゾーンの形成を確認する。
２．アンモニアの検出
【００４６】
（１）培地のpH変化
前記１．より単離した菌株を、pH指示薬としてＢＴＢ（Ｂｒｏｍｏ−ｔｈｙｍｏｌｂｌｕｅ）を加えた０．５（ｗｔ／ｖ）％グルコースＮＦＭＭ培地（Ｇ−ＮＦＭＭ）に画線し、３０℃で３日間静置培養し、培地のpH変化を確認した。その結果、複数の菌株で培地が青くなり、pHの上昇が見られた。
【００４７】
（２）アンモニアの検出
（１）にてpHの上昇が見られた菌株を５ｍｌのＧ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で３日間振とう培養した。その後、培養液１ｍｌを使い捨て試験管に入れ、アンモニア検出キットを用いてアンモニア生産の確認をした。その結果、アンモニアが検出された。
３． 窒素固定細菌の同定
【００４８】
（１）Ｔｏｔａｌ ＤＮＡの抽出
前記２．よりアンモニア生産が確認された菌株をグルコースＮＦＭＭ培地（Ｇ−ＮＦＭＭ）で培養する。培養した菌体を１．５ｍｌ容マイクロチューブに移し、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集金する。集金した菌体を０．８％ＮａＣｌに懸濁させ、同様に遠心分離し、上清を取り除く。これに５６７μｌのＴＥバッファを加えて撹拌し、３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた後、ローテーターで５分転倒混和する。３７℃で１時間静置した後、１１０μｌの５ＭＮａＣｌをを加え、ローテーターで５分転倒混和する。これに８０μｌのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、ローテーターで５分転倒混和する。６５℃で２０分静置し、室温に戻した後８００μｌのクロロホルムを加え、ローテーターで２０分転倒混和する。これを、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）し、上清を新しい２ｍｌ容マイクロチューブに移し、８００μｌ／クロロホルムを加え、ローテーターで２０分転倒混和する。その後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）し、予め４８０μｌのイソプロパノールを入れたマイクロチューブに上清を加え、ローテーターで５分転倒混和する。これを再度遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）し、上清を取り除く。４００μｌの７０％エタノールを加え沈殿をリンスし、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間、ＲＴ）した後、上清を完全に取り除く。ＲｎａｓｅＡｓｏｌｕｔｉｏｎを加えたＴＥバッファ１０μｌに沈殿を溶解させた後、３７℃で１時間反応させる。用いた試薬の組成を下記表３に示す。
【００４９】
［表３］
【００５０】
（２）１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅
（１）より抽出したＣ４株（下記（３）にてAzotobacter beijerinckii Ｃ４株と同定）Ｔｏｔａｌ ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ここで、配列番号１（Primer 10F）及び配列番号２（Primer 1500R）のプライマーを使用した。
ＰＣＲ反応は表４に記載の反応液で次の条件で行った。９４℃で１分間処理した後、９４℃、３０秒間→６０℃、３０秒間→７２℃、２分間を１サイクルとし、３５サイクル行った。その後、４℃に冷却する。
［表４］
【００５１】
（３）塩基配列解析
上記（２）で増幅した１６Ｓ ｒＤＮＡを精製後、ダイターミネーター法により塩基配列解析を行った。塩基配列の決定にはＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、マニュアルに従って行った。
【００５２】
ＰＣＲ反応を表５に記載の反応液で次の条件で行った。９６℃で３０秒間処理した後、９６℃で１０秒間→５０℃で５秒間→６０℃で２分間を１サイクルとし、２５サイクル行った後、４℃に冷却した。ここで、配列番号１乃至１２のプライマーを使用した。
［表５］
【００５３】
ＰＣＲで増幅後、１．５ｍｌマイクロチューブに反応液を移し、２μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃと５０μｌの１００％エタノールを加えて撹拌し、室温で１５分間静置した。その後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間、２２℃）し、上清を取り除いた。これを２５０μｌの７０％エタノールでリンスし、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間、２２℃）し、上清を取り除いた。その後、アスピレータを用いて１０分間真空乾燥させ、１５μｌのＴＳＲを加えて軽く３回ｖｏｒｔｅｘし、フラッシングした。その後、９５℃で２分間加熱し、氷上で急冷した。これを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。キャプラリーは３１０Ｃａｐｏｌｌａｒｙ（Ｌｔ＝４７ｃｍ、ｉ．ｄ．＝５０μｍ）、泳動ポリマーはＰＯＰ６、バッファは１ｘＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ＥＤＴＡを用いた。
【００５４】
各菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴにて相同性検索し、属種を決定した。これを表６に示す。
［表６］
【００５５】
なお、Azotobacter beijerinckiiは典型的な窒素固定細菌であるが、野生株がアンモニアを蓄積するという報告はこれまでなされていない。また、Lysobacter sp.、Agrobacterium sp.については窒素固定能についても報告がなされていない。そこで、本発明者らはアンモニアの蓄積が培養条件に影響を受けるのではないかと予測し、これらの菌株によるアンモニアの蓄積に良好な培養条件を検討した。
４． アンモニア蓄積の培養条件
【００５６】
（１）Azotobacter beijerinckii基準株及びAzotobacter vinelandii基準株のアンモニア生産
Azotobacter beijerinckii基準株（ＩＡＭ１２６８３Ｔ）及びAzotobacter vinelandii基準株（ＩＭＡ１５００４Ｔ）を用いてアンモニア蓄積の培養条件を検討した。なお、該基準株は共に独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）にて取得可能である。
【００５７】
（ａ）炭素源の検討
ＢＴＢ試薬を添加した０．５（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ平板培地にて、Azotobacter beijerinckii及びAzotobacter vinelandiiの基準株を３０℃で２から３日間静置培養した。培養後、コロニーを採取し、Azotobacter beijerinckii基準株については０．５（ｗｔ／ｖ）％の種々の炭素源（グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、Ｃｉｔｒａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を加えたＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振とう培養した。同様に、Azotobacter vinelandii基準株については０．２５（ｗｔ／ｖ）％の種々の炭素源を加えたＮＦＭＭ液体培地にて培養した。振とう培養０時間後から４８時間後におけるＯＤ６００及び培地中のアンモニア量を測定した。図１（ａ）にAzotobacter beijerinckiiの結果を、（ｂ）にAzotobacter vinelandiiの結果を示す。図１より、双方の基準株とも有機酸ではアンモニアは検出されなかったが、全ての糖でアンモニアが検出された。特に、Azotobacter beijerinckii基準株については、炭素源としてグルコースとフルクトースを添加した場合に大量のアンモニアの蓄積がみられ、Azotobacter vinelandiiの基準株については炭素源としてフルクトースを添加した場合に大量のアンモニアの蓄積が見られた。
【００５８】
（ｂ）炭素源濃度の検討
ＢＴＢ試薬を添加した０．５（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ平板培地にて、Azotobacter beijerinckii及びAzotobacter vinelandiiの基準株を３０℃で２から３日間静置培養した。培養後、コロニーを採取し、Azotobacter beijerinckii基準株についてはグルコース、Azotobacter vinelandii基準株についてはフルクトースをそれぞれ種々の濃度で添加したＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振とう培養した。
【００５９】
ｉ．Azotobacter beijerinckii基準株
グルコース濃度をそれぞれ０．１（ｗｔ／ｖ）％、０．２５（ｗｔ／ｖ）％、０．５（ｗｔ／ｖ）％、０．７（ｗｔ／ｖ）％、１．０（ｗｔ／ｖ）％、２．０（ｗｔ／ｖ）％としたＧ−ＮＦＭＭ液体培地にて培養し、培養４８時間後におけるＯＤ６００及びpH、培地中のアンモニア量を測定した。その結果を図２に示す。図２より、増殖に最も良好な濃度は１．００（ｗｔ／ｖ）％であったが、アンモニアの蓄積に最も良好な濃度は０．５（ｗｔ／ｖ）％であった。そこで、グルコース濃度０．５（ｗｔ／ｖ）％のＧ−ＮＦＭＭ液体培地で培養し、経時的にアンモニアの蓄積量を測定した結果を下記（ｃ）及び図４に示す。
【００６０】
ｉｉ．Azotobacter vinelandii基準株
フルクトース濃度をそれぞれ０．０５（ｗｔ／ｖ）％、０．１（ｗｔ／ｖ）％、０．２５（ｗｔ／ｖ）％、０．５（ｗｔ／ｖ）％、０．７（ｗｔ／ｖ）％、１．０（ｗｔ／ｖ）％としたＦ−ＮＧＭＭ液体培地にて培養し、培養４８時間後におけるＯＤ６００及びpH、培地中のアンモニア量を測定した。その結果を図３に示す。図３より、増殖に最も良好な濃度は１．００（ｗｔ／ｖ）％であったが、アンモニアの蓄積に最も良好な濃度は０．２５（ｗｔ／ｖ）％であった。そこで、フルクトース濃度０．２５（ｗｔ／ｖ）％のＦ−ＮＦＭＭ液体培地で培養し、経時的にアンモニアの蓄積量を測定した結果を図５に示す。
【００６１】
（ｃ）アンモニア蓄積の経時変化
【００６２】
Azotobacter beijerinckii基準株
図４（ａ）にAzotobacter beijerinckii基準株のグルコース濃度０．５（ｗｔ／ｖ）％のＧ−ＮＦＭＭ液体培地におけるＯＤ６００及びpH、培地中のアンモニア量の経時変化を、（ｂ）に培地中のアンモニア量と残糖量の経時変化を測定した結果を示す。図４（ａ）より、Azotobacter beijerinckii基準株が定常期に近づくとアンモニアの蓄積が開始することがわかる。これは、図５に示すようにAzotobacter vinelandii基準株についても同様であった。また、図４（ｂ）より、培地中のグルコースをほとんど消費してからアンモニアの蓄積が開始することがわかる。更に、アンモニアの生産には多量のエネルギーを必要とするにもかかわらず、培地中のグルコースがほぼ消費尽くされた後でもアンモニアの蓄積が続いていることがわかる。以上より、グルコースがアンモニア蓄積に何らかの抑制因子となっており、グルコースの中間代謝産物がアンモニア生産のエネルギーとなっていることが推察される。
【００６３】
（２）Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）のアンモニア生産
【００６４】
Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）についてアンモニア蓄積の培養条件を検討した。
【００６５】
（ａ）生育の確認
前培養として、５ｍｌの０．３（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。その後、２００ｍｌの０．３（ｗｔ／ｖ）％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に２ｍｌの前培養液を加え、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養開始直後から２時間毎にＯＤ６００を測定した。その結果を図６に示す。図６より、培養６時間経過辺りから増殖が開始し、１４時間経過辺りで定常期に入ることが確認できた。
【００６６】
（ｂ）グルコース濃度（ｗｔ／ｖ）の検討
グルコース濃度をそれぞれ０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７％、１．０％、２．０％としたＧ−ＮＦＭＭ液体培地にて３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養後、ＯＤ６００を測定し、また培養液のpHを測定した。その後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図７に示す。図７より、０．５％濃度以下でアンモニアが確認され、０．３％濃度が最も良好であった。
【００６７】
（ｃ）培養時間の検討
前培養として、５ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。その後、２００ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に２ｍｌの前培養液を加え、３０℃、１７０ｒｐｍで２４０時間振とう培養した。当該培養開始直後から、１５時間後、２４時間後、その後は２４時間毎にアンモニア量を測定した。その結果を図８に示す。図８より、培養開始から１５時間後からアンモニアの蓄積が始まり、およそ１９２時間（８日間）後に定常期に達した。
【００６８】
（ｄ）培地pHの検討
pH５，６，７，８に調整した６ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。ＯＤ６００、pHを測定後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図９に示す。図９より、pH７が最も良好であった。pH８では菌の生育はより良好であるが、アンモニアの蓄積は減少した。また、pH６以下では生育が確認できなかった。
【００６９】
（ｅ）培養温度の検討
６ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、各温度（３０℃、４０℃、５０℃）２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。ＯＤ６００、pHを測定後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図１０に示す。図１０より、アンモニアの蓄積が確認できたのは３０℃のみであった。２０℃では生育は確認できたが、アンモニアの蓄積は確認できず、４０℃以上では生育、アンモニア蓄積ともに確認できなかった。
【００７０】
（ｆ）炭素源の検討
種々の炭素源（グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、Ｃｉｔｒａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を０．３％とする６ｍｌのＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。ＯＤ６００、pHを測定後、培養液を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間、ＲＴ）により集菌し、上清をろ過してイオンクロマトグラフィーにてアンモニア量を測定した。その結果を図１１に示す。図１１より、グルコースのほかにフルクトース、スクロース、マルトースでもアンモニア蓄積を確認できた。以上より、これまでLysobacter sp. 属の窒素固定能についての報告はないが、複数の糖培地にてアンモニア蓄積が見られることが分かった。
【００７１】
（ｇ）残糖量の確認
前培養として、５ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。その後、２００ｍｌの０．３％Ｇ−ＮＦＭＭ液体培地に２ｍｌの前培養液を加え、３０℃、１７０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養開始直後から３時間毎にＯＤ６００を測定した。また、グルコース測定キットを用いて培地中のグルコース量（残糖量）を測定した。その結果を図１２に示す。図１２より、残糖量がゼロになると菌の増殖は定常期に入り、アンモニアの蓄積が開始した。
５． 結論
以上より、窒素固定細菌の種々の培養条件を制御することにより、アンモニアの蓄積を制御できることを示している。特に培地中のアンモニア濃度がアンモニア蓄積に大きく影響していることが推察される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】Azotobacter beijerinckii基準株及びAzotobacter vinelandii基準株について、各炭素源を添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量
【図２】Azotobacter beijerinckii基準株について、種々の濃度でグルコースを添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量
【図３】Azotobacter vinelandii基準株について、種々の濃度でグルコースを添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量
【図４】Azotobacter beijerinckii基準株について、グルコース濃度が０．５％の培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量、pH、残糖量
【図５】Azotobacter vinelandii基準株について、フルクトース濃度が０．２５％の培地における培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図６】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における培養結果：ＯＤ６００
【図７】Lysobacter sp. Ｅ４株について、種々の濃度でグルコースを添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量、pH
【図８】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図９】Lysobacter sp. Ｅ４株について、種々のpH値に調整したグルコース濃度が０．３％の培地における培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図１０】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における種々の培養温度での培養結果：培地中のアンモニア量、ＯＤ６００、pH
【図１１】Lysobacter sp. Ｅ４株について、各炭素源を添加した培地における培養結果：ＯＤ６００、培地中のアンモニア量、pH
【図１２】Lysobacter sp. Ｅ４株について、グルコース濃度が０．３％の培地における種々の培養温度での培養結果：培地中のアンモニア量、残糖量、ＯＤ６００
【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素固定細菌によるアンモニア生産方法であって、
窒素固定細菌の培養に用いる培地中の炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下にすることを特徴とするアンモニア生産方法。
【請求項２】
炭素源としてグルコース、フルクトース、スクロース、マルトースのいずれか一以上を用いる請求項１に記載のアンモニア生産方法。
【請求項３】
窒素固定細菌が単生系の土壌細菌であることを特徴とする請求項１又は２に記載のアンモニア生産方法。
【請求項４】
単生系の土壌細菌が、Azotobacter beijerinckii又はAzotobacter vinelandii、Lysobacter sp.、Agrobacterium sp.のいずれか一以上である請求項３に記載のアンモニア生産方法。
【請求項５】
窒素固定細菌が、Azotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）、Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）、Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）、Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）のいずれか一以上である請求項４に記載のアンモニア生産方法。
【請求項６】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるAzotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）。
【請求項７】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるAzotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）。
【請求項８】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるLysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）。
【請求項９】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるLysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）。
【請求項１０】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるAgrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）。
【請求項１】
窒素固定細菌によるアンモニア生産方法であって、
窒素固定細菌の培養に用いる培地中の炭素源濃度を０．５（ｗｔ／ｖ）％以下にすることを特徴とするアンモニア生産方法。
【請求項２】
炭素源としてグルコース、フルクトース、スクロース、マルトースのいずれか一以上を用いる請求項１に記載のアンモニア生産方法。
【請求項３】
窒素固定細菌が単生系の土壌細菌であることを特徴とする請求項１又は２に記載のアンモニア生産方法。
【請求項４】
単生系の土壌細菌が、Azotobacter beijerinckii又はAzotobacter vinelandii、Lysobacter sp.、Agrobacterium sp.のいずれか一以上である請求項３に記載のアンモニア生産方法。
【請求項５】
窒素固定細菌が、Azotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）、Azotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）、Lysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）、Lysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）、Agrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）のいずれか一以上である請求項４に記載のアンモニア生産方法。
【請求項６】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるAzotobacter beijerinckii Ｃ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４２）。
【請求項７】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるAzotobacter beijerinckii Ｇ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４３）。
【請求項８】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるLysobacter sp. Ｅ４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４４）。
【請求項９】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるLysobacter sp.Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−５４５）。
【請求項１０】
請求項１に記載のアンモニア生産方法に用いるAgrobacterium sp. Ｔ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−６０５）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−４６０２６（Ｐ２０１０−４６０２６Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１３８０７（Ｐ２００８−２１３８０７）
【出願日】平成２０年８月２２日（２００８．８．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 ： 社団法人日本農芸化学会 刊行物名 ： 大会講演要旨集 ２００８年度（平成２０年度）大会［名古屋］ 発行年月日 ： 平成２０年３月５日
【出願人】（５９９０１６４３１）学校法人 芝浦工業大学 (109)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２２日（２００８．８．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 ： 社団法人日本農芸化学会 刊行物名 ： 大会講演要旨集 ２００８年度（平成２０年度）大会［名古屋］ 発行年月日 ： 平成２０年３月５日
【出願人】（５９９０１６４３１）学校法人 芝浦工業大学 (109)
【Ｆターム（参考）】
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