イカロドプシン複合体結晶及びその製造方法
【課題】高い分解能でのＸ線構造解析が可能であり、Ｇタンパク質とロドプシンとの相互作用の解明に有用なイカロドプシン複合体結晶及びその製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のイカロドプシン複合体結晶は、イカロドプシンとアルキルグルコシド及び微絨毛膜由来のリン脂質とが複合体を形成しているイカロドプシン複合体結晶であって、上記イカロドプシンは、Ｎ末端側から順に、膜貫通ヘリックスであるヘリックス１〜７と、細胞質側に露出したヘリックスであるヘリックス８及び９を有し、上記アルキルグルコシドが、上記ヘリックス２、３、４及び７に挟まれた細胞質側のタンパク質表面の窪みにトラップされている。
【解決手段】本発明のイカロドプシン複合体結晶は、イカロドプシンとアルキルグルコシド及び微絨毛膜由来のリン脂質とが複合体を形成しているイカロドプシン複合体結晶であって、上記イカロドプシンは、Ｎ末端側から順に、膜貫通ヘリックスであるヘリックス１〜７と、細胞質側に露出したヘリックスであるヘリックス８及び９を有し、上記アルキルグルコシドが、上記ヘリックス２、３、４及び７に挟まれた細胞質側のタンパク質表面の窪みにトラップされている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イカロドプシンとアルキルグルコシド及びリン脂質とが複合体を形成しているイカロドプシン複合体結晶であって、
上記イカロドプシンは、Ｎ末端側から順に、膜貫通ヘリックスであるヘリックス１〜７と、細胞質側に露出したヘリックスであるヘリックス８及び９を有し、
上記アルキルグルコシドが、上記ヘリックス２、３、４及び７に挟まれた細胞質側のタンパク質表面の窪みにトラップされているイカロドプシン複合体結晶。
【請求項２】
分解能２．５ÅのＸ線結晶構造解析により、以下の（１）〜（６）のいずれかを解析することができる請求項１記載のイカロドプシン複合体結晶。
（１）上記ヘリックス５及び６が膜面から細胞質側へ２０Å以上露出している。
（２）上記膜貫通ヘリックス間にキャビティが存在し、且つ該キャビティ内に水分子が存在する。
（３）上記ヘリックス８と上記へリックス９の間に形成される３１０ヘリックスはＣｙｓ３３７を有し、且つ該Ｃｙｓ３３７に微絨毛膜由来の脂質成分のパルミトイル基が共有結合している。
（４）膜間２量体構造とともに、膜面内の２量体構造も認められる。
（５）膜面内２量体内のタンパク質間の隙間にリン脂質が結合している。
（６）上記イカロドプシンはＧｌｕ１８０を有し、且つ上記イカロドプシン中のレチナールのプロトン化シッフ塩基と上記Ｇｌｕ１８０との距離が４Å以上離れている。
【請求項３】
上記ヘリックス１〜９のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、以下の領域のアミノ酸配列である請求項１又は２記載のイカロドプシン複合体結晶。
ヘリックス１；３１番目〜６１番目
ヘリックス２；６９番目〜８７番目
ヘリックス３；１０５番目〜１３６番目
ヘリックス４；１４８番目〜１７２番目
ヘリックス５；１９５番目〜２３８番目
ヘリックス６；２４６番目〜２８６番目
ヘリックス７；２９４番目〜３１８番目
ヘリックス８；３２０番目〜３２９番目
ヘリックス９；３４１番目〜３５１番目
【請求項４】
上記イカロドプシンは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端側にある７５〜９０残基分が除去されたアミノ酸配列である請求項１乃至３のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項５】
空間群がＰ６２であり、格子定数がａ＝ｂ＝１２２．５〜１２３．０Å、ｃ＝１５８．６〜１５９．０Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である請求項１乃至４のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項６】
表１に示す原子座標によって表される立体構造を有する請求項１乃至５のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項７】
アルキルグルコシド及び亜鉛イオン存在下、イカロドプシンを含む試料から精製されたイカロドプシンを結晶化して得られる請求項１乃至６のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶の製造方法であって、
アルキルグルコシド及び亜鉛イオン存在下、イカロドプシンを含む試料からイカロドプシンを精製し、イカロドプシン溶液を調製する工程と、
上記イカロドプシン溶液にメルカプトエタノール及び硫酸アンモニウムを含有する結晶化剤を添加し、イカロドプシンを結晶化する結晶化工程と、を含み
上記アルキルグルコシドの量と上記イカロドプシンの量の重量比は、（１．５〜５）：１であり、上記メルカプトエタノールの濃度は３〜２０ｍＭであるイカロドプシン複合体結晶の製造方法。
【請求項９】
上記結晶化工程の期間は、上記イカロドプシン溶液に上記結晶化剤を添加してから３月以上である請求項８記載のイカロドプシン複合体結晶の製造方法。
【請求項１】
イカロドプシンとアルキルグルコシド及びリン脂質とが複合体を形成しているイカロドプシン複合体結晶であって、
上記イカロドプシンは、Ｎ末端側から順に、膜貫通ヘリックスであるヘリックス１〜７と、細胞質側に露出したヘリックスであるヘリックス８及び９を有し、
上記アルキルグルコシドが、上記ヘリックス２、３、４及び７に挟まれた細胞質側のタンパク質表面の窪みにトラップされているイカロドプシン複合体結晶。
【請求項２】
分解能２．５ÅのＸ線結晶構造解析により、以下の（１）〜（６）のいずれかを解析することができる請求項１記載のイカロドプシン複合体結晶。
（１）上記ヘリックス５及び６が膜面から細胞質側へ２０Å以上露出している。
（２）上記膜貫通ヘリックス間にキャビティが存在し、且つ該キャビティ内に水分子が存在する。
（３）上記ヘリックス８と上記へリックス９の間に形成される３１０ヘリックスはＣｙｓ３３７を有し、且つ該Ｃｙｓ３３７に微絨毛膜由来の脂質成分のパルミトイル基が共有結合している。
（４）膜間２量体構造とともに、膜面内の２量体構造も認められる。
（５）膜面内２量体内のタンパク質間の隙間にリン脂質が結合している。
（６）上記イカロドプシンはＧｌｕ１８０を有し、且つ上記イカロドプシン中のレチナールのプロトン化シッフ塩基と上記Ｇｌｕ１８０との距離が４Å以上離れている。
【請求項３】
上記ヘリックス１〜９のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、以下の領域のアミノ酸配列である請求項１又は２記載のイカロドプシン複合体結晶。
ヘリックス１；３１番目〜６１番目
ヘリックス２；６９番目〜８７番目
ヘリックス３；１０５番目〜１３６番目
ヘリックス４；１４８番目〜１７２番目
ヘリックス５；１９５番目〜２３８番目
ヘリックス６；２４６番目〜２８６番目
ヘリックス７；２９４番目〜３１８番目
ヘリックス８；３２０番目〜３２９番目
ヘリックス９；３４１番目〜３５１番目
【請求項４】
上記イカロドプシンは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端側にある７５〜９０残基分が除去されたアミノ酸配列である請求項１乃至３のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項５】
空間群がＰ６２であり、格子定数がａ＝ｂ＝１２２．５〜１２３．０Å、ｃ＝１５８．６〜１５９．０Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である請求項１乃至４のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項６】
表１に示す原子座標によって表される立体構造を有する請求項１乃至５のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項７】
アルキルグルコシド及び亜鉛イオン存在下、イカロドプシンを含む試料から精製されたイカロドプシンを結晶化して得られる請求項１乃至６のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載のイカロドプシン複合体結晶の製造方法であって、
アルキルグルコシド及び亜鉛イオン存在下、イカロドプシンを含む試料からイカロドプシンを精製し、イカロドプシン溶液を調製する工程と、
上記イカロドプシン溶液にメルカプトエタノール及び硫酸アンモニウムを含有する結晶化剤を添加し、イカロドプシンを結晶化する結晶化工程と、を含み
上記アルキルグルコシドの量と上記イカロドプシンの量の重量比は、（１．５〜５）：１であり、上記メルカプトエタノールの濃度は３〜２０ｍＭであるイカロドプシン複合体結晶の製造方法。
【請求項９】
上記結晶化工程の期間は、上記イカロドプシン溶液に上記結晶化剤を添加してから３月以上である請求項８記載のイカロドプシン複合体結晶の製造方法。
【図１】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００９−２１５１９３（Ｐ２００９−２１５１９３Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５８８６４（Ｐ２００８−５８８６４）
【出願日】平成２０年３月９日（２００８．３．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物に発表 発行者名：日本学術振興会産学協力研究委員会 回折構造生物学第１６９委員会 刊行物名：「ＩＳＤＳＢ２００７ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｂｏｏｋｌｅｔ」 発行年月日：平成１９年９月１０日刊行物に発表 発行者名：日本生物物理学会 刊行物名：「生物物理」 Ｖｏｌ．４７ ２００７年１０月増刊号 発行年月日：平成１９年１１月２０日刊行物に発表 発行者名：日本結晶学会 刊行物名：「日本結晶学会２００７年度年会 講演要旨集」 発行年月日：平成１９年１２月１日
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月９日（２００８．３．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物に発表 発行者名：日本学術振興会産学協力研究委員会 回折構造生物学第１６９委員会 刊行物名：「ＩＳＤＳＢ２００７ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｂｏｏｋｌｅｔ」 発行年月日：平成１９年９月１０日刊行物に発表 発行者名：日本生物物理学会 刊行物名：「生物物理」 Ｖｏｌ．４７ ２００７年１０月増刊号 発行年月日：平成１９年１１月２０日刊行物に発表 発行者名：日本結晶学会 刊行物名：「日本結晶学会２００７年度年会 講演要旨集」 発行年月日：平成１９年１２月１日
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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