インターフェロン−βの精製方法
本発明は、親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法であって、親和性クロマトグラフィ工程が、平衡化された親和性クロマトグラフィカラムにインターフェロン−β含有培養液を加えて吸着させた後、平衡用緩衝溶液で洗浄する段階と、３０〜６０重量％のプロピレングリコールを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ａ、および１０〜３０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｂでカラムを洗浄する段階と、４０〜６０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の緩衝溶液でヒトインターフェロン−βを含有する画分を溶出させる段階とを含む、ヒトインターフェロン−βの精製方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む、組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは、広義において、宿主の反応性を媒介する細胞外メッセンジャーであり、相対的に小さなサイズで細胞外に分泌され、進化的に保存されている蛋白質グループである。ウイルス、二重鎖ＲＮＡ、各種微生物、そしてＴＮＦやＩＬ１のようなサイトカイン類によりインターフェロンを生産する細胞がインターフェロンを生産して外部に分泌すれば、分泌されたインターフェロンは、周辺にインターフェロン受容体を有した細胞の表面に結合し、その細胞の内部での連鎖的な信号伝達作用により、宿主に反応性と恒常性とを維持させるように、多様な蛋白質の合成を誘導する。従って、インターフェロンは、生体内で抗ウイルス性、抗分化性、免疫信号伝達の蛋白質として作用し、また、癌細胞に対して直接的に抗分化効果を示すことにより、治療剤としての関心が非常に高い（Ｐｏｓｔｋａ Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｚｏｏｎ Ｋ．Ｃ．（１９８７） Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｏｎｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：ｐｐ．７２７−７７７）。
【０００３】
インターフェロンは、螺旋形の生理活性物質に分類され、物理化学的、機能的特徴によって１型と２型の二種に分類される。１型インターフェロンには、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−τ、インターフェロン−εがあり（Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｃ．ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ Ｈ．（１９８６） Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：ｐｐ．２５１−３００）、２型インターフェロンには、インターフェロン−γが存在する。それらのうち、１型インターフェロンに属するインターフェロン−βは、種特異的な特性を示す蛋白質であり、主に生産される位置によって繊維芽細胞インターフェロン（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）とも呼ばれ、生物学的特性によってｐＨ２安定性インターフェロン（ｐＨ２−ｓｔａｂｌｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）とも呼ばれる。また、インターフェロン−βは、同じ１型グループに分類されるインターフェロン−αと細胞表面の同じ受容体に結合し、細胞内での一連の信号伝達体系により、抗ウイルス性因子の転写を誘導する。
【０００４】
インターフェロン−βは、ほぼ２０％の糖を含有した分子量２０ｋＤａほどの糖蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であり、１６６個のアミノ酸から構成された単一鎖の蛋白質である。１個のＮ−グリコシレーション（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部位は、生物学的活性や抗原性に関与するというよりは、物理化学的機能でもって物質自体の安定性や溶解性を高めるという役割を果たすことが公知である（Ｋａｒｐｕｓａｓ Ｍ．，Ｗｈｙｔｔｙ Ａ．，Ｒｕｎｋｅｌ Ｌ．，ａｎｄ Ｈｏｃｈｍａｎ Ｐ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ＣＭＬＳ，５４：ｐｐ．１２０３−１２１６ １９９８）。
【０００５】
遺伝子組換え技術が発展するにつれ、ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列が報告され、大腸菌にクローニングされて発現され（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｇｅｎｅ １０：ｐｐ．１１−１５，１９８０）、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞でのインターフェロン−βの発現も報告されている（米国特許第４，９６６，８４３号、米国特許第５，３７６，５６７号および米国特許第５，７９５，７７９号）。
【０００６】
最近、インターフェロン−βは、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）という商品名で、遺伝子組換え方法で製造されて販売されており、適応症としては、多発性硬化症を有した患者の症状悪化と緩和との反復される時期を遅らせ、痛みを和らげるのに効果的であることが公知である。また、組換えインターフェロン−βは、主に、多発性硬化症の治療剤として広く利用されているだけではなく、ヒト免疫反応の非特異的調節、ウイルス感染に対する免疫反応並びに癌細胞の抗分化にも効果を表している。
【０００７】
既知のＣＨＯ細胞で発現された組換えインターフェロン−βの精製方法としては、親和性クロマトグラフィ（米国特許第４，２７８，６６１号、米国特許第４，２８９，６８９号、米国特許第４，５４１，９５２号、米国特許第４，８０８，５２３号など）、金属キレートクロマトグラフィ（米国特許第４，２５７，９３８号、米国特許第４，３５９，３８９号、米国特許第４，５４１，９５２号、米国特許第５，２４４，６５５号など）、ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）クロマトグラフィ（米国特許第４，３５９，３８９号、米国特許第５，０６６，７８６号、米国特許第５，２４４，６５５号など）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）クロマトグラフィ（米国特許第４，２８９，６８９号、米国特許第４，６５８，０１７号など）によって一次精製を行い、陽イオン交換クロマトグラフィおよび逆相クロマトグラフィ方法と組み合わせ、３段階から５段階の工程で精製する方法が知られている。
【０００８】
前記従来の精製方法において、金属キレートクロマトグラフィ法を利用する場合には、精製工程に重金属が利用されるので、環境汚染問題が引き起こされることがあり、ＣＰＧおよびコンカナバリンＡクロマトグラフィは、精製特異性が落ちるという問題点がある。すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞培養液は多くの糖鎖蛋白質を含んでいるが、糖鎖が結合した蛋白質と選択的に結合するコンカナバリンＡクロマトグラフィでは特異性が落ちてしまい、ＣＰＧカラムでは、蛋白質と結合した後、サイズの違いによって分離できるが、インターフェロン−βに対する分離効率と純度面とでは、むしろ親和性クロマトグラフィ（例えば、ブルーセファロースカラムクロマトグラフィ）より低い。
【０００９】
また、親和性クロマトグラフィを利用した従来の精製方法は、単クローン抗体を使用し、かつ／または色素樹脂を利用し、エチレングリコールで洗浄および溶出させてクロマトグラフィ工程を行う。しかし、単クローン抗体を用いた親和性クロマトグラフィでは、グリコシレーションされていないインターフェロンの除去工程を別途に行わねばならないので、大量生産に適用し難く、特に、洗浄および溶出のときに使用するエチレングリコールは、生体に対する毒性が非常に強く、実際の生産に適用するのに、多くの限界を抱える。
【００１０】
一方、米国特許第４，４８３，８４９号は、前記親和性クロマトグラフィ工程で有毒性のエチレングリコールの代わりに、プロピレングリコールを使用してインターフェロンを精製および安定化させる方法を開示している。米国特許第４，４８３，８４９号の製造方法は、平衡化されたＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅのような色素親和性カラムにインターフェロンを含む培養液を適用し、１．０ＭのＮａＣｌ／ＰＯ４緩衝溶液および４０％のプロピレングリコールを含有する１．０ＭのＮａＣｌ／ＰＯ４緩衝溶液で洗浄し、５０％のプロピレングリコールでインターフェロンを溶出させる。しかし、米国特許第４，４８３，８４９号の製造方法は、カラム洗浄および溶出の工程に関するが、得られる最終生成物に不純物ピークが依然として存在することにより、純度が低下してしまうという問題点がある。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、無毒性のプロピレングリコールを利用し、改善された親和性クロマトグラフィ法を介してインターフェロン−βの一次精製産物を高い純度で回収する、陽イオン交換クロマトグラフィ工程などを含むインターフェロン−βの精製方法を提供する。
【００１２】
従って、本発明は、親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法において、特定緩衝溶液を使用した洗浄工程および溶出工程を含むヒトインターフェロン−βの精製方法を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は、親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法において、前記親和性クロマトグラフィ工程が、平衡化された親和性クロマトグラフィカラムにインターフェロン−β含有培養液を加えて吸着させた後、平衡用緩衝溶液で洗浄する段階と、３０〜６０重量％のプロピレングリコールを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ａ、および１０〜３０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｂでカラムを洗浄する段階と、４０〜６０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の緩衝溶液でヒトインターフェロン−βを含有する画分を溶出させる段階とを含む、ヒトインターフェロン−βの精製方法を提供する。
【００１４】
本発明の精製方法で、試料として使われる組換えヒトインターフェロン−β含有培養液としては、非制限的な例としてインターフェロン−βを生成する細胞および菌株を使用できる。例えば、Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．８，ｐｐ．３５９−３７７，１９８０；Ｓｔｒａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃａｎｔｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．Ｅｘｐ．Ｆｅｎｎ．４４，ｐｐ．２６５−２７３，１９６６；Ｗｈｅｅｌｏｃｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４９，ｐｐ．３１０−３１１，１９６５のような公知の方法によって得られた培養液を使用できる。好ましくは、組換えヒトインターフェロン−βを生成するＣＨＯ細胞の無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）培養物を使用できる。
【００１５】
本発明の精製方法で、親和性クロマトグラフィ工程に使われる親和性カラムとしては、一般的な色素親和性（ｄｙｅ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）カラムを使用でき、例えば、ブルーセファロース６（Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６，Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）をカラム（例えば、ＸＫ−５０カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に充填したもの、またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）などを使用できる。前記親和性カラムの平衡用緩衝溶液としては、ＥＤＴＡを添加したリン酸ナトリウム緩衝溶液（約ｐＨ７．２）の緩衝溶液を使用でき、一般的な方法として、例えば、１５〜３０ｃｍ／ｈｒほどの線速度で３カラム体積（ＣＶ）ほどで流して平衡させる。
【００１６】
本発明の精製方法で、親和性クロマトグラフィ工程は、平衡化された親和性クロマトグラフィカラムにインターフェロン−β含有培養液を加えて吸着させた後、平衡用緩衝溶液で非特異的に結合された蛋白質を洗浄する段階を含む。
【００１７】
また、親和性クロマトグラフィ工程は、多段階の洗浄段階、すなわち、３０〜６０重量％のプロピレングリコールを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ａ、および１０〜３０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｂでカラムを洗浄する段階を含む。また、前記洗浄段階は、１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｃで洗浄する段階をさらに含むことが好ましい。前記各洗浄段階は、２〜４のＣＶの緩衝溶液を使用して行われることが好ましい。
【００１８】
本発明の精製方法において、前記洗浄段階で、各洗浄用緩衝液は、順序と関係なく適用可能である。すなわち、洗浄用緩衝液Ａで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ｂで洗浄するか、または洗浄用緩衝液Ｂで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ａで洗浄でき、また、洗浄用緩衝液Ａで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ｃで洗浄した後、洗浄用緩衝液Ｂで洗浄するか、または洗浄用緩衝液Ｂで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ｃで洗浄した後、洗浄用緩衝液Ａで洗浄することも可能である。前記洗浄過程で、洗浄用緩衝液Ａにより疏水性の高い不純蛋白質が効果的に除去され、洗浄用緩衝液Ｃにより親水性不純物が除去され、さらに洗浄用緩衝液Ｂにより不純蛋白質が除去される。
【００１９】
また、インターフェロン−βの回収は、４０〜６０重量％、さらに好ましくは、５０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の緩衝溶液でヒトインターフェロン−βを含有する画分を溶出させることによって行われうる。
【００２０】
好ましくは、前記各洗浄および溶出の段階で使われる緩衝溶液としては、リン酸ナトリウム緩衝溶液、またはリン酸カリウム緩衝溶液を使用できる。
【００２１】
米国特許第４，４８３，８４９号で開示されている方法が、段階的なプロピレングリコール濃度勾配によって洗浄および溶出させる工程を採用するのに対し、本発明の精製方法は、５０％ほどのプロピレングリコールを洗浄工程で使用することにより、従来の製造方法で現れる不純物ピークを効果的に除去できる。
【００２２】
本発明の精製方法は、前記のような親和性クロマトグラフィを行った後、陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行う。また、本発明の精製方法は、分子量カットオフ値１０，０００の限外濾過膜を利用し、前記親和性クロマトグラフィ工程から回収された溶液をダイアフィルトレーションした後、陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行うことが好ましい。前記ダイアフィルトレーション工程を介し、相対的に高い塩濃度のインターフェロン−βを適切なレベルに調節できる。
【００２３】
前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程は、ダイアフィルトレーションから得られた試料をカラムに加えた後、ｐＨ５〜７でＮａＣｌを使用した濃度勾配でヒトインターフェロン−βを含む画分を溶出させることによって行うことができる。具体的には、平衡用緩衝液のリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５〜７）からＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５〜７）の直線濃度勾配でインターフェロン−βを含む画分を溶出させることができる。
【００２４】
前記陽イオン交換クロマトグラフィカラムとしては、ＣＭ−セファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）カラム（ＸＫ−５０、１５０ｍｌ ＣＶ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）のようなカラムを使用でき、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して平衡させる。陽イオン交換クロマトグラフィにおいては、ダイアフィルトレーションで得られた試料を、平衡化されたカラムに適当な流速で流し、ＮａＣｌ含有リン酸ナトリウム緩衝溶液の直線濃度勾配により溶出する（約１２ＣＶ）。その結果、糖鎖の結合していないインターフェロン−βが除去され、糖鎖の結合したインターフェロン−βを選別的に得ることができる。
【００２５】
前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行ったインターフェロン−βを含んだ画分は、追加の緩衝溶液交換工程を行うことができる。緩衝液交換工程は、ゲル濾過、または濃縮およびダイアフィルトレーションなどで行うことができる。
【００２６】
例えば、ゲル濾過工程を行う場合、陽イオン交換クロマトグラフィ工程で分離回収した溶液を、例えば、２００〜１，０００μｇ／ｍｌほどに濃縮し、１０〜５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ３．５〜５．５）で透析した後、１０〜５０ｍＭ、好ましくは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ３．５〜５．５）で平衡させたゲル濾過クロマトグラフィカラム（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にローディングする。その後、適当な流速で１０〜５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜５．５）緩衝溶液を流して目的蛋白質の溶液を交換し、重合体を分離除去できる。
【００２７】
本発明の全体工程を段階別のフローチャートで表せば、図１の通りである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１．親和性クロマトグラフィ
ブルーセファロース６（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）をＸＫ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に３５０ｍｌ充填し、親和性クロマトグラフィカラムとして使用した。１ｍＭのＥＤＴＡが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液を十分に流してカラムを平衡させた後、インターフェロン−βを含んでいるＣＨＯ細胞無血清培養液２５Ｌを５〜１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、さらに平衡用緩衝溶液を約３ＣＶ流してカラムを洗浄した。
【００３０】
５０％のプロピレングリコールが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して不純蛋白質を除去した後、平衡用緩衝溶液を３ＣＶほど流した。さらに、２ＭのＮａＣｌが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して不純蛋白質を除去した。最後に、２ＭのＮａＣｌと２０％のプロピレングリコールとが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して不純蛋白質を除去した。
【００３１】
溶出用緩衝溶液（２ＭのＮａＣｌおよび５０％のプロピレングリコールの含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流してインターフェロン−βを含有した溶液を回収した。回収した溶出液の純度をＣ４高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析クロマトグラフィを介して測定した結果は、図２であり、図２から確認することができるように、インターフェロン−βの純度は、約８５％以上である。
【００３２】
対照として、前記過程で、５０％のプロピレングリコールが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）で洗浄する工程を除外し、同じ方法で親和性クロマトグラフィを行い、得られた溶出液の純度をＣ４ ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィを介して測定した結果は、図３の通りである。図３から確認することができるように、前記洗浄工程を行っていない場合、純度が大きく低下するということが分かる。
【００３３】
実施例２．陽イオン交換クロマトグラフィ
実施例１で得たインターフェロン−βを含有した溶液を限外濾過システム（分子量カットオフ値１０，０００）を利用してダイアフィルトレーションを行った後、試料をＣＭ−セファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）カラム（ＸＫ−５０、１５０ｍｌ ＣＶ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して吸着させた後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．７）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流した。インターフェロン−βの溶出は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．７）から４００ｍＭのＮａＣｌの含まれた５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．７）を直線濃度勾配で１２ＣＶほどの間流し、糖鎖の結合したインターフェロン−β画分を回収した。
【００３４】
実施例３．ゲル−濾過クロマトグラフィ
実施例２で回収されたインターフェロン−β溶液を、２００μｇ／ｍｌに濃縮し、画分に含まれたエタノールを２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．０）で５００倍以上交換した後、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．０）であらかじめ平衡させたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラム（１７００ｍｌ、ＸＫ−５０／１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に適用してインターフェロン−βを含んだ溶液を得た。
【００３５】
実施例４．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法による分析
実施例１、実施例２および実施例３で回収した溶液をＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ５４，内径４．６ｍｍ×長さ２５ｃｍ、粒子大５μｍ、細孔大３００Å）カラムに１ｍｌ／ｍｉｎの流速で注入した後、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む３０％のアセトニトリルから０．１％のトリフルオロ酢酸を含む８０％のアセトニトリルまで、２０倍カラム体積の０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルを直線濃度勾配条件で流し、示されたクロマトグラムのパターンを分析した。
【００３６】
ゲル濾過クロマトグラフィ後の分析結果は、図４である。図４から確認することができるように、本発明により、インターフェロン−βを純粋に精製できるということが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の精製方法は、無毒性のプロピレングリコールを利用し、改善された親和性クロマトグラフィ法を介してインターフェロン−βを９９％以上の高い純度に精製できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の精製方法の段階別のフローチャートである。
【図２】本発明の精製方法で、親和性クロマトグラフィ工程で溶出されたインターフェロン−βのＣ４逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析クロマトグラムである。
【図３】５０％のプロピレングリコール洗浄段階のない工程で溶出したインターフェロン−βのＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析クロマトグラムである。
【図４】ゲル濾過後のＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析クロマトグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む、組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは、広義において、宿主の反応性を媒介する細胞外メッセンジャーであり、相対的に小さなサイズで細胞外に分泌され、進化的に保存されている蛋白質グループである。ウイルス、二重鎖ＲＮＡ、各種微生物、そしてＴＮＦやＩＬ１のようなサイトカイン類によりインターフェロンを生産する細胞がインターフェロンを生産して外部に分泌すれば、分泌されたインターフェロンは、周辺にインターフェロン受容体を有した細胞の表面に結合し、その細胞の内部での連鎖的な信号伝達作用により、宿主に反応性と恒常性とを維持させるように、多様な蛋白質の合成を誘導する。従って、インターフェロンは、生体内で抗ウイルス性、抗分化性、免疫信号伝達の蛋白質として作用し、また、癌細胞に対して直接的に抗分化効果を示すことにより、治療剤としての関心が非常に高い（Ｐｏｓｔｋａ Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｚｏｏｎ Ｋ．Ｃ．（１９８７） Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｏｎｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：ｐｐ．７２７−７７７）。
【０００３】
インターフェロンは、螺旋形の生理活性物質に分類され、物理化学的、機能的特徴によって１型と２型の二種に分類される。１型インターフェロンには、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−τ、インターフェロン−εがあり（Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｃ．ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ Ｈ．（１９８６） Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：ｐｐ．２５１−３００）、２型インターフェロンには、インターフェロン−γが存在する。それらのうち、１型インターフェロンに属するインターフェロン−βは、種特異的な特性を示す蛋白質であり、主に生産される位置によって繊維芽細胞インターフェロン（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）とも呼ばれ、生物学的特性によってｐＨ２安定性インターフェロン（ｐＨ２−ｓｔａｂｌｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）とも呼ばれる。また、インターフェロン−βは、同じ１型グループに分類されるインターフェロン−αと細胞表面の同じ受容体に結合し、細胞内での一連の信号伝達体系により、抗ウイルス性因子の転写を誘導する。
【０００４】
インターフェロン−βは、ほぼ２０％の糖を含有した分子量２０ｋＤａほどの糖蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であり、１６６個のアミノ酸から構成された単一鎖の蛋白質である。１個のＮ−グリコシレーション（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部位は、生物学的活性や抗原性に関与するというよりは、物理化学的機能でもって物質自体の安定性や溶解性を高めるという役割を果たすことが公知である（Ｋａｒｐｕｓａｓ Ｍ．，Ｗｈｙｔｔｙ Ａ．，Ｒｕｎｋｅｌ Ｌ．，ａｎｄ Ｈｏｃｈｍａｎ Ｐ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ＣＭＬＳ，５４：ｐｐ．１２０３−１２１６ １９９８）。
【０００５】
遺伝子組換え技術が発展するにつれ、ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列が報告され、大腸菌にクローニングされて発現され（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｇｅｎｅ １０：ｐｐ．１１−１５，１９８０）、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞でのインターフェロン−βの発現も報告されている（米国特許第４，９６６，８４３号、米国特許第５，３７６，５６７号および米国特許第５，７９５，７７９号）。
【０００６】
最近、インターフェロン−βは、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）という商品名で、遺伝子組換え方法で製造されて販売されており、適応症としては、多発性硬化症を有した患者の症状悪化と緩和との反復される時期を遅らせ、痛みを和らげるのに効果的であることが公知である。また、組換えインターフェロン−βは、主に、多発性硬化症の治療剤として広く利用されているだけではなく、ヒト免疫反応の非特異的調節、ウイルス感染に対する免疫反応並びに癌細胞の抗分化にも効果を表している。
【０００７】
既知のＣＨＯ細胞で発現された組換えインターフェロン−βの精製方法としては、親和性クロマトグラフィ（米国特許第４，２７８，６６１号、米国特許第４，２８９，６８９号、米国特許第４，５４１，９５２号、米国特許第４，８０８，５２３号など）、金属キレートクロマトグラフィ（米国特許第４，２５７，９３８号、米国特許第４，３５９，３８９号、米国特許第４，５４１，９５２号、米国特許第５，２４４，６５５号など）、ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）クロマトグラフィ（米国特許第４，３５９，３８９号、米国特許第５，０６６，７８６号、米国特許第５，２４４，６５５号など）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）クロマトグラフィ（米国特許第４，２８９，６８９号、米国特許第４，６５８，０１７号など）によって一次精製を行い、陽イオン交換クロマトグラフィおよび逆相クロマトグラフィ方法と組み合わせ、３段階から５段階の工程で精製する方法が知られている。
【０００８】
前記従来の精製方法において、金属キレートクロマトグラフィ法を利用する場合には、精製工程に重金属が利用されるので、環境汚染問題が引き起こされることがあり、ＣＰＧおよびコンカナバリンＡクロマトグラフィは、精製特異性が落ちるという問題点がある。すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞培養液は多くの糖鎖蛋白質を含んでいるが、糖鎖が結合した蛋白質と選択的に結合するコンカナバリンＡクロマトグラフィでは特異性が落ちてしまい、ＣＰＧカラムでは、蛋白質と結合した後、サイズの違いによって分離できるが、インターフェロン−βに対する分離効率と純度面とでは、むしろ親和性クロマトグラフィ（例えば、ブルーセファロースカラムクロマトグラフィ）より低い。
【０００９】
また、親和性クロマトグラフィを利用した従来の精製方法は、単クローン抗体を使用し、かつ／または色素樹脂を利用し、エチレングリコールで洗浄および溶出させてクロマトグラフィ工程を行う。しかし、単クローン抗体を用いた親和性クロマトグラフィでは、グリコシレーションされていないインターフェロンの除去工程を別途に行わねばならないので、大量生産に適用し難く、特に、洗浄および溶出のときに使用するエチレングリコールは、生体に対する毒性が非常に強く、実際の生産に適用するのに、多くの限界を抱える。
【００１０】
一方、米国特許第４，４８３，８４９号は、前記親和性クロマトグラフィ工程で有毒性のエチレングリコールの代わりに、プロピレングリコールを使用してインターフェロンを精製および安定化させる方法を開示している。米国特許第４，４８３，８４９号の製造方法は、平衡化されたＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅのような色素親和性カラムにインターフェロンを含む培養液を適用し、１．０ＭのＮａＣｌ／ＰＯ４緩衝溶液および４０％のプロピレングリコールを含有する１．０ＭのＮａＣｌ／ＰＯ４緩衝溶液で洗浄し、５０％のプロピレングリコールでインターフェロンを溶出させる。しかし、米国特許第４，４８３，８４９号の製造方法は、カラム洗浄および溶出の工程に関するが、得られる最終生成物に不純物ピークが依然として存在することにより、純度が低下してしまうという問題点がある。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、無毒性のプロピレングリコールを利用し、改善された親和性クロマトグラフィ法を介してインターフェロン−βの一次精製産物を高い純度で回収する、陽イオン交換クロマトグラフィ工程などを含むインターフェロン−βの精製方法を提供する。
【００１２】
従って、本発明は、親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法において、特定緩衝溶液を使用した洗浄工程および溶出工程を含むヒトインターフェロン−βの精製方法を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は、親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法において、前記親和性クロマトグラフィ工程が、平衡化された親和性クロマトグラフィカラムにインターフェロン−β含有培養液を加えて吸着させた後、平衡用緩衝溶液で洗浄する段階と、３０〜６０重量％のプロピレングリコールを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ａ、および１０〜３０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｂでカラムを洗浄する段階と、４０〜６０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の緩衝溶液でヒトインターフェロン−βを含有する画分を溶出させる段階とを含む、ヒトインターフェロン−βの精製方法を提供する。
【００１４】
本発明の精製方法で、試料として使われる組換えヒトインターフェロン−β含有培養液としては、非制限的な例としてインターフェロン−βを生成する細胞および菌株を使用できる。例えば、Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．８，ｐｐ．３５９−３７７，１９８０；Ｓｔｒａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｃａｎｔｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．Ｅｘｐ．Ｆｅｎｎ．４４，ｐｐ．２６５−２７３，１９６６；Ｗｈｅｅｌｏｃｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４９，ｐｐ．３１０−３１１，１９６５のような公知の方法によって得られた培養液を使用できる。好ましくは、組換えヒトインターフェロン−βを生成するＣＨＯ細胞の無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）培養物を使用できる。
【００１５】
本発明の精製方法で、親和性クロマトグラフィ工程に使われる親和性カラムとしては、一般的な色素親和性（ｄｙｅ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）カラムを使用でき、例えば、ブルーセファロース６（Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６，Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）をカラム（例えば、ＸＫ−５０カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に充填したもの、またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）などを使用できる。前記親和性カラムの平衡用緩衝溶液としては、ＥＤＴＡを添加したリン酸ナトリウム緩衝溶液（約ｐＨ７．２）の緩衝溶液を使用でき、一般的な方法として、例えば、１５〜３０ｃｍ／ｈｒほどの線速度で３カラム体積（ＣＶ）ほどで流して平衡させる。
【００１６】
本発明の精製方法で、親和性クロマトグラフィ工程は、平衡化された親和性クロマトグラフィカラムにインターフェロン−β含有培養液を加えて吸着させた後、平衡用緩衝溶液で非特異的に結合された蛋白質を洗浄する段階を含む。
【００１７】
また、親和性クロマトグラフィ工程は、多段階の洗浄段階、すなわち、３０〜６０重量％のプロピレングリコールを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ａ、および１０〜３０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｂでカラムを洗浄する段階を含む。また、前記洗浄段階は、１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｃで洗浄する段階をさらに含むことが好ましい。前記各洗浄段階は、２〜４のＣＶの緩衝溶液を使用して行われることが好ましい。
【００１８】
本発明の精製方法において、前記洗浄段階で、各洗浄用緩衝液は、順序と関係なく適用可能である。すなわち、洗浄用緩衝液Ａで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ｂで洗浄するか、または洗浄用緩衝液Ｂで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ａで洗浄でき、また、洗浄用緩衝液Ａで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ｃで洗浄した後、洗浄用緩衝液Ｂで洗浄するか、または洗浄用緩衝液Ｂで洗浄した後で洗浄用緩衝液Ｃで洗浄した後、洗浄用緩衝液Ａで洗浄することも可能である。前記洗浄過程で、洗浄用緩衝液Ａにより疏水性の高い不純蛋白質が効果的に除去され、洗浄用緩衝液Ｃにより親水性不純物が除去され、さらに洗浄用緩衝液Ｂにより不純蛋白質が除去される。
【００１９】
また、インターフェロン−βの回収は、４０〜６０重量％、さらに好ましくは、５０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の緩衝溶液でヒトインターフェロン−βを含有する画分を溶出させることによって行われうる。
【００２０】
好ましくは、前記各洗浄および溶出の段階で使われる緩衝溶液としては、リン酸ナトリウム緩衝溶液、またはリン酸カリウム緩衝溶液を使用できる。
【００２１】
米国特許第４，４８３，８４９号で開示されている方法が、段階的なプロピレングリコール濃度勾配によって洗浄および溶出させる工程を採用するのに対し、本発明の精製方法は、５０％ほどのプロピレングリコールを洗浄工程で使用することにより、従来の製造方法で現れる不純物ピークを効果的に除去できる。
【００２２】
本発明の精製方法は、前記のような親和性クロマトグラフィを行った後、陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行う。また、本発明の精製方法は、分子量カットオフ値１０，０００の限外濾過膜を利用し、前記親和性クロマトグラフィ工程から回収された溶液をダイアフィルトレーションした後、陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行うことが好ましい。前記ダイアフィルトレーション工程を介し、相対的に高い塩濃度のインターフェロン−βを適切なレベルに調節できる。
【００２３】
前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程は、ダイアフィルトレーションから得られた試料をカラムに加えた後、ｐＨ５〜７でＮａＣｌを使用した濃度勾配でヒトインターフェロン−βを含む画分を溶出させることによって行うことができる。具体的には、平衡用緩衝液のリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５〜７）からＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５〜７）の直線濃度勾配でインターフェロン−βを含む画分を溶出させることができる。
【００２４】
前記陽イオン交換クロマトグラフィカラムとしては、ＣＭ−セファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）カラム（ＸＫ−５０、１５０ｍｌ ＣＶ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）のようなカラムを使用でき、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して平衡させる。陽イオン交換クロマトグラフィにおいては、ダイアフィルトレーションで得られた試料を、平衡化されたカラムに適当な流速で流し、ＮａＣｌ含有リン酸ナトリウム緩衝溶液の直線濃度勾配により溶出する（約１２ＣＶ）。その結果、糖鎖の結合していないインターフェロン−βが除去され、糖鎖の結合したインターフェロン−βを選別的に得ることができる。
【００２５】
前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行ったインターフェロン−βを含んだ画分は、追加の緩衝溶液交換工程を行うことができる。緩衝液交換工程は、ゲル濾過、または濃縮およびダイアフィルトレーションなどで行うことができる。
【００２６】
例えば、ゲル濾過工程を行う場合、陽イオン交換クロマトグラフィ工程で分離回収した溶液を、例えば、２００〜１，０００μｇ／ｍｌほどに濃縮し、１０〜５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ３．５〜５．５）で透析した後、１０〜５０ｍＭ、好ましくは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ３．５〜５．５）で平衡させたゲル濾過クロマトグラフィカラム（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にローディングする。その後、適当な流速で１０〜５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜５．５）緩衝溶液を流して目的蛋白質の溶液を交換し、重合体を分離除去できる。
【００２７】
本発明の全体工程を段階別のフローチャートで表せば、図１の通りである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１．親和性クロマトグラフィ
ブルーセファロース６（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）をＸＫ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に３５０ｍｌ充填し、親和性クロマトグラフィカラムとして使用した。１ｍＭのＥＤＴＡが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液を十分に流してカラムを平衡させた後、インターフェロン−βを含んでいるＣＨＯ細胞無血清培養液２５Ｌを５〜１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、さらに平衡用緩衝溶液を約３ＣＶ流してカラムを洗浄した。
【００３０】
５０％のプロピレングリコールが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して不純蛋白質を除去した後、平衡用緩衝溶液を３ＣＶほど流した。さらに、２ＭのＮａＣｌが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して不純蛋白質を除去した。最後に、２ＭのＮａＣｌと２０％のプロピレングリコールとが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流して不純蛋白質を除去した。
【００３１】
溶出用緩衝溶液（２ＭのＮａＣｌおよび５０％のプロピレングリコールの含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ７．２）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流してインターフェロン−βを含有した溶液を回収した。回収した溶出液の純度をＣ４高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析クロマトグラフィを介して測定した結果は、図２であり、図２から確認することができるように、インターフェロン−βの純度は、約８５％以上である。
【００３２】
対照として、前記過程で、５０％のプロピレングリコールが含まれた２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）で洗浄する工程を除外し、同じ方法で親和性クロマトグラフィを行い、得られた溶出液の純度をＣ４ ＨＰＬＣ分析クロマトグラフィを介して測定した結果は、図３の通りである。図３から確認することができるように、前記洗浄工程を行っていない場合、純度が大きく低下するということが分かる。
【００３３】
実施例２．陽イオン交換クロマトグラフィ
実施例１で得たインターフェロン−βを含有した溶液を限外濾過システム（分子量カットオフ値１０，０００）を利用してダイアフィルトレーションを行った後、試料をＣＭ−セファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）カラム（ＸＫ−５０、１５０ｍｌ ＣＶ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して吸着させた後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．７）を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で３ＣＶほど流した。インターフェロン−βの溶出は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．７）から４００ｍＭのＮａＣｌの含まれた５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．７）を直線濃度勾配で１２ＣＶほどの間流し、糖鎖の結合したインターフェロン−β画分を回収した。
【００３４】
実施例３．ゲル−濾過クロマトグラフィ
実施例２で回収されたインターフェロン−β溶液を、２００μｇ／ｍｌに濃縮し、画分に含まれたエタノールを２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．０）で５００倍以上交換した後、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．０）であらかじめ平衡させたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラム（１７００ｍｌ、ＸＫ−５０／１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）に適用してインターフェロン−βを含んだ溶液を得た。
【００３５】
実施例４．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法による分析
実施例１、実施例２および実施例３で回収した溶液をＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ５４，内径４．６ｍｍ×長さ２５ｃｍ、粒子大５μｍ、細孔大３００Å）カラムに１ｍｌ／ｍｉｎの流速で注入した後、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む３０％のアセトニトリルから０．１％のトリフルオロ酢酸を含む８０％のアセトニトリルまで、２０倍カラム体積の０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルを直線濃度勾配条件で流し、示されたクロマトグラムのパターンを分析した。
【００３６】
ゲル濾過クロマトグラフィ後の分析結果は、図４である。図４から確認することができるように、本発明により、インターフェロン−βを純粋に精製できるということが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の精製方法は、無毒性のプロピレングリコールを利用し、改善された親和性クロマトグラフィ法を介してインターフェロン−βを９９％以上の高い純度に精製できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の精製方法の段階別のフローチャートである。
【図２】本発明の精製方法で、親和性クロマトグラフィ工程で溶出されたインターフェロン−βのＣ４逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析クロマトグラムである。
【図３】５０％のプロピレングリコール洗浄段階のない工程で溶出したインターフェロン−βのＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析クロマトグラムである。
【図４】ゲル濾過後のＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析クロマトグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法であって、
前記親和性クロマトグラフィ工程が、
平衡化された親和性クロマトグラフィカラムにインターフェロン−β含有培養液を加えて吸着させた後、平衡用緩衝溶液で洗浄する段階と、
３０〜６０重量％のプロピレングリコールを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ａ、および１０〜３０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｂでカラムを洗浄する段階と、
４０〜６０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の緩衝溶液でヒトインターフェロン−βを含有する画分を溶出させる段階とを含む、ヒトインターフェロン−βの精製方法。
【請求項２】
前記洗浄段階が、１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｃで洗浄する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記洗浄段階および溶出段階で使用される各緩衝溶液が、リン酸ナトリウム緩衝溶液またはリン酸カリウム緩衝溶液である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
分子量カットオフ値１０，０００の限外濾過膜を利用し、前記親和性クロマトグラフィ工程から回収された溶液をダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）した後、前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行う、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程において、ダイアフィルトレーションから得られた試料をカラムに加えた後、ｐＨ５〜７でＮａＣｌの濃度勾配でヒトインターフェロン−βを含む画分を溶出させる、請求項４記載の方法。
【請求項１】
親和性クロマトグラフィ工程および陽イオン交換クロマトグラフィ工程を含む組換えヒトインターフェロン−β含有培養液からのヒトインターフェロン−βの精製方法であって、
前記親和性クロマトグラフィ工程が、
平衡化された親和性クロマトグラフィカラムにインターフェロン−β含有培養液を加えて吸着させた後、平衡用緩衝溶液で洗浄する段階と、
３０〜６０重量％のプロピレングリコールを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ａ、および１０〜３０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｂでカラムを洗浄する段階と、
４０〜６０重量％のプロピレングリコールおよび１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の緩衝溶液でヒトインターフェロン−βを含有する画分を溶出させる段階とを含む、ヒトインターフェロン−βの精製方法。
【請求項２】
前記洗浄段階が、１〜２ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５〜７．５の洗浄用緩衝液Ｃで洗浄する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記洗浄段階および溶出段階で使用される各緩衝溶液が、リン酸ナトリウム緩衝溶液またはリン酸カリウム緩衝溶液である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
分子量カットオフ値１０，０００の限外濾過膜を利用し、前記親和性クロマトグラフィ工程から回収された溶液をダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）した後、前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行う、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記陽イオン交換クロマトグラフィ工程において、ダイアフィルトレーションから得られた試料をカラムに加えた後、ｐＨ５〜７でＮａＣｌの濃度勾配でヒトインターフェロン−βを含む画分を溶出させる、請求項４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５３０４４８（Ｐ２００７−５３０４４８Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４２５０６（Ｐ２００６−５４２５０６）
【出願日】平成１６年１２月４日（２００４．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００３１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４２８９
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０５１９６２００）シージェー コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月４日（２００４．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００３１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４２８９
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０５１９６２００）シージェー コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]