ウィップル病の診断
【課題】ウィップル病のインビトロ血清学的診断のための方法を提供する。
【解決手段】前記方法により、ウィップル病の原因である細菌を単離し、培養において樹立し、患者の生物学的液体の血清と接触させる。本発明はまた、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの遺伝子ｒｐｏＢを増幅、配列決定、および検出するためのプローブおよびプライマーに有用なオリゴヌクレオチドに関する。
【解決手段】前記方法により、ウィップル病の原因である細菌を単離し、培養において樹立し、患者の生物学的液体の血清と接触させる。本発明はまた、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの遺伝子ｒｐｏＢを増幅、配列決定、および検出するためのプローブおよびプライマーに有用なオリゴヌクレオチドに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断の分野に関する。さらに正確には、本発明は、ウィップル病のインビトロ血清学的診断のための方法および該方法を実施するための装置に関する。さらに本発明は、ウィップル病の原因である細菌のインビトロ検出のためのキットに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用して検出および／または増幅し配列決定する技術の分野、ならびに細菌種Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの存在を検出する試験への前記プローブまたはプライマーの利用あるいは該細菌種の同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウィップル病は、様々な状態となって発症する病気である。最も典型的な状態は、体重減少につながる慢性下痢を伴う発熱であるが、この疾患はまた、慢性関節症状、痴呆を伴う脳症状を引き起こす恐れがあり、心臓症状（特に、陰性血液培養を伴う心内膜炎）も引き起こす恐れがある。
【０００４】
１９０７年に最初に述べられてから、ウィップル病は、腸間膜神経節を銀染色した後に非常に多くの微生物が観察されたため、「腸性脂肪異栄養症」に関連する細菌の存在を伴うことが理解されてきた（Ｗｈｉｐｐｌｅ，Ｂｕｌｌ．Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐ．１９０７；１８：３２８−３９１）。この細菌の非特異的ＰＡＳ陽性（ＰＡＳ＝過ヨウ素酸シッフ）特性の証明と、その後の電子顕微鏡による観察から、グラム陽性構造の細胞内細菌種が存在することが確認された（Ｃｈｅａｒｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９６１；４１：１２９−１３８）。ユニバーサルな分子ツールである１６Ｓ
ｒＲＮＡにより、この仮説が確かめられた。この新しい細菌種の系統分類学が特定され、腸吸収不良の概念を想起させるようにすると共にこの病気の発見者に敬意を払うために、この細菌に仮名称Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉが付けられた（Ｒｅｌｍａｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９２；３２７：２９３−３０１）。１人の患者の小腸（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ １９９１；３３８：４７４−４７５）、次いで、もう１人の患者の神経節（Ｗｉｌｓｏｎら，ＡＳＭ Ｎｅｗｓ １９９２；５８：３１８−３２１）の生検材料から増幅された７２１塩基のフラグメントを直接配列決定することにより、ウィップル病に関連する細菌種の新規性が確認された。Ｒｅｌｍａｎら（前掲）による、１人の試料の１３２１塩基（遺伝子の９０％に相当する）と、もう４人の患者の２８４塩基フラグメントの配列決定により、このウィップル病に関連する細菌は新種であることを確認し、放線菌門（すなわち、グラム陽性構造、グアノシン＋シトシン高含有量の細菌）における分類学的位置を特定することができた。この細菌は、ヒト病理学で周知の２種、すなわち、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＲｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａに比較的近い新しい分枝である。
【０００５】
ウィップル病は、現在、生検材料から得られたスメアを染色した後の顕微鏡観察により、またはユニバーサルな遺伝子ツールである１６Ｓ ｒＲＮＡ（Ｒｅｌｍａｎら，前掲）の増幅および配列決定により診断されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今まで、血清学試験の実施に適するように、ウィップル病の原因である細菌を単離および培養することは事実上不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
予想に反して、本出願人は、ウィップル病の原因である細菌を培養する方法を開発した。
請求項１−３５に記載された発明が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】電気泳動ゲルの写真である。Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質プロフィールを示す。
【図２】電気泳動ゲルの写真である。ウエスタンブロッティングにより得られたＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの抗原プロフィールを示す。レーン１＝免疫化マウスの血清、レーン２＝免疫化ウサギの血清、レーン３＝患者血清（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）、レーン４＝モノクローナル抗体１、レーン５＝モノクローナル抗体２、レーン６＝モノクローナル抗体３、レーン７＝モノクローナル抗体４。
【図３】電気泳動ゲルの写真である。ウィップル病に罹患している患者の血清を使用して、ＴＷＩＳＴ株、番号Ｉ−２２０２に対して行われ、ＩｇＭ検出したウエスタンブロットを示す。
【図４】電気泳動ゲルの写真である。臭化エチジウム染色した後の、プライマー配列番号１および２を使用したＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の増幅から生じた産物を視覚化したものを示す。レーン１＝Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ、レーン２＝Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓｃａｖｉａｒｕｍ、レーン３＝Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、レーン４＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、レーン５＝Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ、レーン６＝Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、レーン７＝Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、レーン８＝Ｈ2Ｏ、レーン９＝Ｈ2Ｏ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの単離と増殖を可能にする細胞培養物は、寿命が長くかつ増殖時間が長くならなければならないことを発見した。実際に、本発明者らは、前記細菌の倍化時間が非常に長い（１８日）ことを証明している。好ましくは、初代培養を、直接、不死化細胞上で行うべきである。
【００１０】
ヒト血液単球の初代培養に関して行われた初期研究（ＳＨＯＥＤＯＮら，“Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｃａｓｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １７６，ｎｕｍｂｅｒ ３，１９９７，６７２−６７７頁）を、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉが増殖するような培養において、この細菌を樹立するための基礎として使用することができなかった。なぜなら、これらの単球の平均寿命が、細菌の倍化時間の観点からすると不十分な３０日しかなかったからである。
【００１１】
さらに、細菌の増殖時間と比較して細胞があまりに急速に増殖する場合、細菌を培養することができない。なぜなら、希釈効果が生じ、感染細胞と非感染細胞とを分離することができなくなるからである。
【００１２】
１つの有利な実施態様では、本発明者らは不死化線維芽細胞を使用した。これらの線維芽細胞は培養皿の底に広がり、細胞マット全体をふさぐと増殖を止めるが、そのような条件下で数ヶ月間、生存することができる。
【００１３】
さらに正確には、以下の実施例１および２に詳細に記載する、細菌を単離および培養する方法は、ヒト線維芽細胞ＨＥＬ株に、ＭＥＭに溶かした粉砕心臓弁調製物を接種することを含む。最低２ヶ月間インキュベートした後に（培地を定期的に交換する）、ウィップル病の原因である細菌を単離し、培養において樹立した。「培養において樹立する」とい
う言い回しは、特に、細胞培養物上での連続的な継代培養により、細菌が再現可能に得られ、経時的に増殖する意味であると理解される。
【００１４】
従って、本発明は、抗原供給源として、このように単離および樹立された細菌に関する。本細菌は、ＣＮＣＭ（フランス、パリ）に番号Ｉ−２２０２および識別参照ＴＷＩＳＴ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅで寄託されている。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明による細菌の抗原に関する。さらに詳細には、本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動とウエスタンブロッティングとにより決定された、約１０，２０，３５，５０，６０，８０，１００，１２０，１５０，１７０および２００ｋＤの分子量を有するものから選択されるタンパク質である抗原に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、本発明による細菌または抗原に対する特異的抗体、さらに詳細には、動物起源のポリクローナル抗体（特に、マウスもしくはウサギ免疫グロブリン）またはモノクローナル抗体（特に、パスツール研究所のＣＮＣＭに、登録番号Ｉ−２４１１および識別参照ＴＷ １７Ｇ２で寄託されたハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体）に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、前記細菌を認識するヒト免疫グロブリン（好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡ）に特異的な抗体、より詳細には、動物免疫グロブリン（特に、抗ヒトヤギ免疫グロブリン）の検出に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、より詳細には、本発明による前記ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体と反応する２００ｋＤのタンパク質であることを特徴とする抗原に関する。
【００１９】
さらに、本発明は、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされる感染に関連する疾患のインビトロ診断のための方法における本発明による細菌、細菌の抗原、または特異的抗原の使用と、本発明による細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされる感染症の血清学的診断のための方法に関する。前記方法は、患者の血清または任意の他の生物学的液体を前記細菌と接触させ、免疫学的反応を検出することを含む。
【００２０】
より詳細には、本発明は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされる感染症のインビトロ血清学的診断のための方法に関する。ここで、本発明による細菌、本発明による細菌の抗原、または本発明による特異的抗体を、患者から採取し、ヒト血清、生物学的液体、またはスワブからなる試料と接触させる。
【００２１】
本発明による方法は、本質的に、本発明による細菌に特異的な抗体と前記細菌の抗原との免疫学的反応、または前記細菌を認識する本発明による免疫グロブリンに特異的な抗体と、前記細菌を認識するヒト免疫グロブリンとの免疫学的反応を検出することにあるステップを含む。
【００２２】
さらに、本発明は、ウィップル病のインビトロ血清学的診断のための方法に関する。前記方法は、患者の血清または任意の他の生物学的液体を、前記で定義された細菌と接触させることと、免疫学的反応を検出することを含む。
１つの実施態様では、本発明による診断方法は以下の工程から成る。
【００２３】
−本発明による細菌の溶液、特に０．５〜５μｌ、好ましくは１μｌの前記細菌を含む前記溶液を、固体支持体中に、または固体支持体上に付着させること
−試験血清または生物学的液体（好ましくは、希釈した試験血清または生物学的液体）を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−標識抗体（特に、前記細菌を認識するヒト免疫グロブリン（特に、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡタイプ）に特異的な抗ヒト動物免疫グロブリン）を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−インキュベーション期間を観察すること
−適宜、前記固体支持体を洗浄すること
−特に、前記細菌を認識するヒト抗体と前記抗ヒト免疫グロブリンとの免疫学的反応を実際に検出すること。
【００２４】
有利なことに、本発明の診断方法は、ＥＬＩＳＡタイプの酵素イムノアッセイまたは免疫蛍光アッセイを含む。より詳細には、本発明による方法は、以下の工程から成る。
−前記のように単離および樹立した細菌の溶液を、固体支持体中に、または固体支持体上に付着させること
−希釈した試験血清または生物学的液体を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−標識抗ヒト免疫グロブリンを、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−インキュベーション期間を観察すること
−適宜、前記固体支持体を洗浄すること
−免疫学的反応を実際に検出すること。
【００２５】
使用する固体支持体は、細胞懸濁液および細菌懸濁液の操作に適した任意の装置（特に、チューブ、ガラススライド、ｂｉｊｏｕｘチューブ、または堅いマイクロタイタープレート（ポリエチレン、ポリスチレン、塩化ビニル、またはニトロセルロースで作られ、マイクロウェルを有する））であってよい。ガラススライドが好ましい。
【００２６】
検出される抗体は、ウィップル病の原因である細菌に特異的な、特に、Ｇ、Ｍ、またはＡタイプの免疫グロブリンである。抗ヒト免疫グロブリンに使用される標識のタイプは、酵素標識、放射性標識、または蛍光標識である。最後のタイプの標識が好ましい。
【００２７】
「蛍光標識」という言い回しは、適切な蛍光剤（例えば、フルオレセインイソ（チオ）シアネート）と、ヒト抗体を認識する動物免疫グロブリンとの結合により、抗体が蛍光を発するようになっていることを意味する。
【００２８】
「放射性標識」という言い回しは、抗体が、その構造要素（例えば、構成チロシン残基）またはそれに固定されている適切なラジカルに、放射能をカウントすることにより分析することができる放射性同位体を有することを意味する。
【００２９】
「酵素標識」という言い回しは、抗体が、適切な薬剤と会合した場合にこの特異的抗体を定量的に測定することができる酵素と結合していることを意味する。
基質および試薬は、この酵素により引き起こされ、これらの基質を必要とする反応または反応順序の最終生成物が、次のうちのいずれか一方となるように選択される。
【００３０】
−着色基質または蛍光基質（試験試料を取り囲む液体培地に拡散し、それぞれ最終的な分光光度測定もしくは蛍光測定または目視評価（任意に、カラースケールと照らし合わせる）に供される）
−不溶性着色基質（試験試料に付着し、反射光度計による測定または目視評価（任意に、カラースケールと照らし合わせる）に供することができる）
蛍光を発するようになっている抗体を使用する場合、試験試料に関連する蛍光は、適切な装置により直接読み取る。
【００３１】
放射性プローブ（例えば、ヨウ素１２５）を使用する場合、試験試料に関連する放射能は、任意の適切な実施方法（例えば、細胞をアルカリ溶液（例えば、水酸化ナトリウム溶液）で可溶化し、吸収プラグを使用して放射能を含む溶液を回収した後に）によりガンマカウンターでカウントする。
【００３２】
特異的抗体に酵素を使用する場合、前記で説明したような、培地に溶ける着色生成物、不溶性着色生成物、または可溶性蛍光生成物を反応生成物として最終的に得ることができる、酵素基質と１または複数の補助試薬を含む溶液を添加することにより、着色生成物または蛍光生成物が出現する。次いで、このように処理した試料から生じる光シグナルを、それぞれの場合に適した装置（すなわち、それぞれ、透過光度計、反射光度計、または蛍光計）を使用して測定する。あるいは、得られた色を、目視により（任意に、着色溶液のスケールを使用して）評価することもできる。
【００３３】
アルカリホスファターゼを酵素として使用する場合、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａにより提案された方法により、この酵素を特異的抗体と結合させる。この酵素に好ましい基質は、最終測定が分光光度計によるものである場合、パラニトロフェニルリン酸、または測定が蛍光計によるものである場合、４−メチル−ウンベリフェリルリン酸、または不溶性着色反応生成物が得られる場合、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸である。同様に、β−ガラクトシダーゼを酵素として使用することができる。好ましい基質は、オルトニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドまたは４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドである。
【００３４】
特異的抗体をペルオキシダーゼと結合できることが好ましい。この場合、結合プロセスは、Ｍ．Ｂ．ＷＩＬＳＯＮおよびＰ．Ｋ．ＮＡＫＡＮＥ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｗ．Ｋｎａｐｐ，Ｋ．Ｋｏｌｕｂａｒ，Ｇ．Ｗｉｃｋｓ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９７８，２１５−２２４頁により記載されているものに基づいている。
【００３５】
特異的抗体と共役したペルオキシダーゼを明らかにするために使用する試薬には、過酸化水素（酵素基質）と適切な色原体（例えば、培地に溶ける着色最終生成物を得るためにはオルトフェニレンジアミンまたは２，２’−アジノビス−（３−エチルチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、不溶性最終反応生成物を得るためには３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、または４−クロロ−α−ナフトール、培地に溶ける蛍光反応生成物を得るためにはパラヒドロキシフェニルプロピオン酸）が含まれる。
【００３６】
本発明の別の実施態様は、アセチルコリンエステラーゼが結合している特異的抗体の使用である。
フランス特許第２５５０７９９号に記載に基づくプロセスによるか、または簡単に述べると、周知の技術により抗体フラグメントを調製し、適切なヘテロ二価性薬剤との反応により酵素を修飾し、最後に、結果として生じる生成物を結合させることを含むプロセスにより、アセチルコリンエステラーゼを抗体と結合させることが好ましい。この場合、免疫酵素結合体を構築する他の周知のプロセスも使用することができる。
【００３７】
アセチルコリンエステラーゼ結合体により認識される抗原に特異的に関連する酵素活性は、この場合に適した任意の変異体（例えば、Ｐｒａｄｅｌｌｅｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．１９８５，５７：１１７０−１１７３に記載の変異体）を使用して、酵素基質としてアセチルチオコリンと色原体としてエルマン試薬（５，５’−ジチオ−２−ニトロ安息香酸）を利用する周知の技術により明らかにされることが好ましい。
【００３８】
言及した色原体は、それ自体で、または水溶性の塩の形態で使用される。
本発明の血清学的診断の方法は、生物学および／または病理解剖学研究室での使用に適している。このために、本方法の実施のために提案された装置は固体支持体を備える。この固体支持体の上に、または固体支持体中に、前記で定義された細菌を含む溶液が付着されている。
【００３９】
別の特徴によれば、さらに、本発明は、ウィップル病の原因である細菌のインビトロ検出のためのキットに関する。このキットは、以下の成分を含む溶液を備えている。
−本発明による細菌または抗原を含む溶液、および／または
−本発明による少なくとも１つの抗体を含む溶液、および／または
−前記細菌を認識にするヒト免疫グロブリンに特異的な少なくとも１つの抗体。
【００４０】
さらに詳細には、前記キットは、以下のものを含む。
−陽性対照として、前記のように単離および樹立されたウィップル病の原因である細菌を含む溶液
−標識特異的抗体を含む溶液
−任意の洗浄溶液。
【００４１】
本発明のキットに使用される特異的抗体は、放射性プローブ、酵素、または蛍光剤で有利に標識される。
特異的抗体を酵素で標識する場合、前記キットはまた、酵素基質と、酵素活性を視覚化するための１または複数の試薬を含む。
【００４２】
特異的抗体を蛍光剤で標識する場合、フルオレセインイソ（チオ）シアネートを使用することが好ましい。
本発明の１つの好ましい実施態様では、使用される特異的抗体は、免疫グロブリン、特に、マウス免疫グロブリンである。
【００４３】
さらに、本発明は、本発明による細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのｒｐｏＢ遺伝子に関する。ｒｐｏＢ遺伝子の配列は、異なる属および種の多数の他の細菌の中でコンセンサスなプライマーを使用した酵素的増幅と直接的自動配列決定により決定した。
【００４４】
ｒｐｏＢ遺伝子は、細菌ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットの１つをコードし、細菌種Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの特異的検出を可能にする遺伝子マーカーを構成する。
【００４５】
さらに詳細には、本発明は、添付の配列表中のヌクレオチド配列である配列番号３を有することを特徴とするｒｐｏＢ遺伝子のフラグメントに関する。
従って、さらに本発明は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ種に特異的な核酸配列に関し、このヌクレオチド配列は、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子に由来し、特に、前記ｒｐｏＢ遺伝子のフラグメントに由来する。
【００４６】
Ｌａｚｃａｎｏら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．（１９８８）２７：３６５−３７６）によれば、ＲＮＡポリメラーゼは、その起源により２つのグループに分類される。一方は、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ウイルスＲＮＡポリメラーゼからなり、他方は、真核生物
または原核生物起源（古細菌および真正細菌）のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなる。真正細菌ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’により表される「コア酵素」またはαββ’σにより表される「ホロ酵素」と呼ばれる単純な、保存された多量体構造により特徴付けられる（ＹｕｒａおよびＩｓｈｉｈａｍａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１３：５９−９７）。
【００４７】
非常に多くの研究により、多量体酵素複合体内での、真正細菌ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットの機能的役割が証明されている。古細菌および真核細菌のＲＮＡポリメラーゼに関する限りでは、これらは、約１０または１１〜約３０のサブユニットになることができる、さらに複雑な構造を有する（Ｐｕｈｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：４５６９−４５７３）。
【００４８】
真正細菌におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの異なるαββ’σサブユニットをコードする遺伝子（すなわち、それぞれ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、およびｒｐｏＤ遺伝子）が、リボソームサブユニットの構成タンパク質またはゲノムの複製および修復に関与する酵素をコードする遺伝子を含む、それぞれ異なるグループに分類される（ＹｕｒａおよびＩｓｈｉｈａｍａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１３：５９−９７）。著者の中には、ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の核酸配列を使用して、生物界の中で異なる分枝および小分枝を分離することを可能にする系統樹を構築できることを証明したものもいる（Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（１９９２）２１：４０ｓ）。
【００４９】
本発明のこの特徴をさらに詳細に説明する前に、説明および特許請求の範囲で使用する様々な用語を以下で定義する。
「細菌から抽出した核酸」は、全核酸、ゲノムＤＮＡ，メッセンジャーＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写から得られたＤＮＡのいずれかを意味すると理解される。
【００５０】
「ヌクレオチドフラグメント」および「オリゴヌクレオチド」は、同義の２つの用語であり、厳しいストリンジェンシーの所定条件下で相補的なまたは実質的に相補的なヌクレオチドフラグメントと、天然核酸と同様にハイブリダイズすることができる天然（または、ことによると修飾された）核酸の情報配列により特徴付けられる、ヌクレオチド単位が連結したものを意味する。この連結は、構造が天然核酸とは異なるヌクレオチド単位を含んでもよい。ヌクレオチドフラグメント（またはオリゴヌクレオチド）は、例えば、１００ヌクレオチド単位までを含んでもよい。これは、一般に、少なくとも１０ヌクレオチド単位、特に、少なくとも１２ヌクレオチド単位を含み、天然核酸分子から、ならびに／あるいは遺伝子組換えおよび／または化学合成により得ることができる。
【００５１】
ヌクレオチド単位は単量体に由来する。前記単量体は、その構成要素が、糖と、リン酸基と、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、およびチミンから選択される窒素塩基である天然核酸ヌクレオチドでもよい。あるいは、前記単量体は、前記で列挙した３つの構成要素のうち少なくとも１つで修飾されているヌクレオチドである。一例として、塩基では、イノシン、５−メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、５−ジメチルアミノデオキシウリジンなどの修飾塩基またはハイブリダイゼーションが可能な他の任意の修飾塩基を使用して、あるいは糖では、例えば、少なくとも１つのデオキシリボースをポリアミドで置換することにより（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１４９７−１５００）、あるいはリン酸基では、例えば、特に、ジホスフェート、アルキルホスホネートおよびアリルホスホネート、ならびにホスホロチオエートから選択されるエステルで置換することにより、修飾を行うことができる。
【００５２】
「情報配列」は、その化学的性質と基準方向（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏ
ｎ）への順序が天然核酸の配列により与えられるものと類似する情報を構成する、任意の順序付けられた一連のヌクレオチド型単位を意味すると理解される。
【００５３】
「ハイブリダイゼーション」は、適切な条件下で、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチドフラグメントが安定かつ特異的な水素結合を介して互いに会合し、二本鎖を形成することができるプロセスを意味すると理解される。ハイブリダイゼーション条件は、「ストリンジェンシー」（すなわち、操作条件の厳しさ）により決定される。ストリンジェンシーが大きくなればなるほど、ハイブリダイゼーションは特異的になる。ストリンジェンシーは、特に、プローブ／標的二重鎖の塩基組成物の関数であり、２つの核酸間のミスマッチの程度によるものである。ストリンジェンシーはまた、ハイブリダイゼーション反応のパラメータ（例えば、ハイブリダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度およびタイプ、変性剤の性質および濃度、ならびに／またはハイブリダイゼーション温度）の関数であり得る。ハイブリダイゼーション反応を行わなければならない条件のストリンジェンシーは、特に、使用するプローブによって決まる。これらの事実の全てが周知であり、適切な条件を、その都度、日常的な実験により必要に応じて決定することができる。一般に、使用するプローブの長さに応じて、ハイブリダイゼーション反応の温度は、濃度が約０．８〜１Ｍの食塩水中で、約２０〜６５℃、特に、３５〜６５℃である。
【００５４】
「プローブ」は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド単位、特に、１２〜３５ヌクレオチド単位からなり、核酸（この場合では、メッセンジャーＲＮＡ（すなわち、転写産物）に含まれる、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写により得られるＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列を有する核酸）とハイブリダイゼーション複合体を形成する所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有するヌクレオチドフラグメントである。プローブを診断のために使用してもよく（特に、キャプチャープローブまたは検出プローブ）、治療のため使用してもよい。
【００５５】
「キャプチャープローブ」は、任意の適切な手段により（例えば、共有結合、吸着、または固体上への直接合成により）、固体支持体上に固定化されるか、または固定化することができる。支持体の例として、マイクロタイタープレートおよびＤＮＡチップが挙げられる。
【００５６】
「検出プローブ」は、例えば、放射性同位体、酵素（特に、発色基質、蛍光基質、発光基質に作用することができる酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはアルカルホスファターゼ））、発色団化学物質、発色化合物、蛍光化合物、または発光化合物、ヌクレオチド塩基アナログ、およびリガンド（例えば、ビオチン）から選択されるマーカーで標識することができる。
【００５７】
「種プローブ」は、細菌の種を同定するためのプローブである。
「属プローブ」は、細菌の属を同定するためのプローブである。
「プライマー」は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド単位からなり、例えば、ＰＣＲなどの増幅技術、配列決定プロセス、転写法などで酵素的重合を開始するための所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有するプローブである。
【００５８】
本発明の主題の１つは、添付の配列表中の配列番号４および配列番号５の配列の１つに含まれる少なくとも１２の連続的なヌクレオチド単位からなる配列を有するオリゴヌクレオチドならびにこれらのオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドから選択される１本鎖オリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）でもよく、「Ｔ」を「Ｕ」で置換したオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でもよい。
【００５９】
特に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、前記のように少なくとも１２単位、多くても５０単位を有する。さらに詳細には、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１２〜３５単位を有する。
【００６０】
好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号４および５の配列から選択される配列を有する。
イノシンは、他の任意の塩基と対合することができる。
【００６１】
配列番号４および５の配列は、当業者に周知な例えばＩｔａｋｕｒａ Ｋ．ら（（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３）による論文に記載されている技術を使用した化学合成により調製することができる。
【００６２】
本発明のオリゴヌクレオチドの第１の応用例は、細菌種Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ
ｗｈｉｐｐｅｌｉｉを生物学的試料中で検出するためのプローブとしての使用である。このプローブは、配列番号４および配列番号５の１つに含まれる少なくとも１２の連続したヌクレオチド単位からなるヌクレオチド配列とこれらの相補的配列を含む。本説明ではこれより、本発明のこのようなプローブを種プローブと呼ぶ。
【００６３】
本発明によるプローブは、周知の任意のハイブリダイゼーション技術（特に、「ＤＯＴ−ＢＬＯＴ」と呼ばれる技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、「ＳＯＵＴＨＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ」と呼ばれるＤＮＡ転写技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）９８：５０３）、「ＮＯＴＨＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ」と呼ばれるＲＮＡ転写技術、またはいわゆる「サンドイッチ」技術（Ｄｕｎｎ，Ａ．Ｒ．，Ｈａｓｓｅｌ，Ｊ．Ａ．（１９７７）Ｃｅｌｌ １２：２３））により、試料中に標的核酸が存在するか存在しないかを検出するための試験において診断目的に使用することができる。特に、「サンドイッチ」技術は、キャプチャープローブおよび／または検出プローブと共に使用される。これらのプローブは標的核酸の２つの異なる領域とハイブリダイズすることができ、これらのプローブの少なくとも一方（一般に、検出プローブ）が、種に特異的な標的領域とハイブリダイズすることができる。キャプチャープローブおよび検出プローブには、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列がなければならないことが理解されている。
【００６４】
検出しようとする核酸（標的）はＤＮＡでもＲＮＡでもよい（任意に、どちらか一方をＰＣＲにより増幅した後に得る）。二本鎖核酸型の標的を検出する場合、検出プロセスを行う前に二本鎖核酸を変性することが適切である。標的核酸は、周知の方法を使用して試験試料の核酸から抽出することにより得ることができる。二本鎖核酸を、化学的、物理的、または酵素的変性の周知の方法により、特に、８０℃以上の適切な温度まで加熱することにより変性することができる。
【００６５】
前記のハイブリダイゼーション技術、特に、「サンドイッチ」技術を行うために、キャプチャープローブと呼ぶ本発明のプローブを固体支持体に固定化し、検出プローブと呼ぶ本発明のもう１つのプローブをマーカーで標識する。
【００６６】
支持体およびマーカーの例は、前記で定義した通りである。
本発明のさらなる主題は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌が、少なくとも１つのこのような細菌の核酸を含むかまたは含む可能性がある試料中に存在するか、存在しないかを決定するプロセスである。前記プロセスは、前記試料を少なくとも１種類の本発明のプローブと接触させ、次いで、それ自体は周知の方法で、前記プローブと前記試料の核酸とのハイブリダイゼーション複合体が形成したか、または形成しなかったかを
決定することにあるステップを含む。
【００６７】
プローブと核酸とのハイブリダイゼーション複合体が形成したか、または形成しなかったかを検出する方法の例として、前記の技術、すなわち、「ＤＯＴ−ＢＬＯＴ」、「ＳＯＵＴＨＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ」、および「サンドイッチ」技術が挙げられる。
【００６８】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ種が存在するか、または存在しないかを決定する、このプロセスを行う特定の態様の１つでは、数種類の本発明のプローブを使用する。これらのプローブは、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのｒｐｏＢ遺伝子に対応する核酸の非重複領域とハイブリダイズできることが理解される。
【００６９】
有利なことには、ある１つの種類のプローブを固体支持体上に固定化し、別の種類のプローブをマーカーで標識する。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の応用例は、配列番号４および５の配列の１つに含まれる少なくとも１２ヌクレオチド単位からなる配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される１本鎖オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーとしての使用である。このプライマーは、それ自体は周知のプロセスにより、ポリメラーゼ存在下での核酸合成において（特に、ポリメラーゼの存在下で、このような合成を利用する増幅法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において）使用することができる。特に、本発明のプライマーを、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのメッセンジャーＲＮＡ配列の特異的逆転写に使用して、対応する相補的ＤＮＡ配列を得ることができる。このような逆転写はＲＴ−ＰＣＲ技術の第１段階を構成することができる。次の段階は、結果として生じる相補的ＤＮＡのＰＣＲによる増幅である。本発明のプライマーはまた、ポリメラーゼ連鎖反応により、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのｒｐｏＢ遺伝子の全ＤＮＡ配列を特異的に増幅するために使用することができる。
【００７０】
１つの特定の場合では、本発明のオリゴヌクレオチドを含むプライマーはまた、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｂ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３））のセンスまたはアンチセンス配列を含む。このようなプライマーは、転写ステップを伴う核酸増幅プロセス（例えば、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ技術（Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ Ｂ．ら，Ａｂｓｔｒａｃｔ ＭＡ １０９１，７ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＩＤＳ（１９９１）Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，Ｉｔａｌｙ））に使用することができる。
【００７１】
本発明のさらなる主題は、配列番号４および配列番号５の配列の１つに含まれる少なくとも１２の連続したヌクレオチド単位からなる配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される１本鎖オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーである。このプライマーは、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの任意の株のｒｐｏＢ遺伝子を、全てまたは部分的に配列決定するために使用することができる。特に、このヌクレオチドプライマーを、増幅核酸を配列決定するために使用することができる。それ自体は周知のプロセス（すなわち、ジデオキシヌクレオチドを使用した吸収重合（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ Ａ．Ｒ．（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４１）またはＤＮＡチップを使用した複数ハイブリダイゼーションによる配列決定から、ｒｐｏＢ遺伝子の全配列または部分配列が得られる。
【００７２】
プライマーとしての使用またはｒｐｏＢ遺伝子の配列決定には、配列番号４および配列番号５の配列を使用することが好ましい。
最後に、本発明の最後の主題は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの株により引き起こされる感染症を治療するための遺伝子治療プローブである。このプローブは、
前記で定義したようなオリゴヌクレオチドを含む。前記細菌のメッセンジャーＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができる、この遺伝子治療プローブは、翻訳および／または転写および／または複製の現象をブロックすることができる。
【００７３】
遺伝子治療法の原理は周知であり、特に、アンチセンス鎖に対応するプローブを使用することに基づいている。このプローブとセンス鎖とのハイブリッドの形成により、遺伝子情報の解読に関与するステップの少なくとも１つを混乱させることができる。従って、遺伝子治療プローブは、スピロヘータにより引き起こされる感染症と戦うための抗細菌薬として使用することができる。
【００７４】
本発明は、実施例に分けられた以下の説明により、さらに詳細に理解されるだろう。実施例は、本発明を実施するために行われた実験に関し、単に例として示される。
実施例１：細菌の初代単離
ＡＴＣＣから入手可能なヒト線維芽細胞ＨＥＬ株を接種したｂｉｊｏｕｘチューブでの遠心分離技術により、初代単離を行った。ＨＥＬ細胞を、１０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＬ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）上で培養した。直径１２ｍｍのキャリアスライドを備えるｂｉｊｏｕｘチューブ（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ−Ｆｅｌｔｈａｍ−Ｅｎｇｌａｎｄ，３．７ｍｌ）に、約５０，０００個の細胞を含む培地１ｍｌを接種し、５％ＣＯ2下、３７℃で３日間インキュベートして、コンフル
エント細胞マットを得た。
【００７５】
研究されている心臓弁をＭＥＭ中で粉砕し、この懸濁液を使用して３個のｂｉｊｏｕｘチューブに接種した。次いで、これらのチューブを、２２℃で１時間、７００ｇで遠心分離した。次いで、上清を取り出し、マットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、５％ＣＯ2下、３７℃で培地１ｍｌと共にインキュベートした
。培養物を、ｂｉｊｏｕｘチューブ中の上清１００μｌの細胞遠心分離とＧｉｍｅｎｅｚ染色によりモニターした。この手順を、１０、２０、および３０日後に繰り返した。３０日後に、ｂｉｊｏｕｘチューブ中の上清および細胞マットを収集し、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿中のコンフルエント細胞マット上に
継代培養し（培養皿Ｉ）、５％ＣＯ2下、３７℃でインキュベートした。それか
ら６週間、毎週（Ｄ７２）、細胞マットを、細胞変性効果を探すために倒立顕微鏡で調べ、培地を新鮮な培地と交換した。培地を交換する前に、上清２００μｌを使用して、細胞遠心分離とＧｉｍｅｎｅｚ染色を行った。
【００７６】
６５日目前では、細胞変性効果は検出されなかった。７２日目に、倒立顕微鏡で細胞マットを調べると、ＨＥＬ細胞内に小さな、黒っぽい、不ぞろいな封入体を検出することができた。培養皿Ｉの上清を細胞遠心分離し、Ｇｉｍｅｎｅｚ染色した後に、いくつかの微細なバチルスを検出した。バチルスの大部分は細胞内にあり、細胞内のバチルスは細胞外のバチルスより小さく見えた。それにもかかわらず、その大部分は、Ｇｉｍｅｎｅｚ染色により、あったとしても十分には染色されず、薄青色に見えた。グラム染色後にも、非常に多くのバチルスが検出された。その大部分はグラム陽性に見えたが、いくつかは部分的に紫色になっているだけであるか、グラム陰性に見えた。これらのバチルスは、Ｚｉｅｈｌ染色後、酸によって脱色された。ＰＡＳ染色後、ＰＡＳ陽性バチルスは、前の染色より非常に多く見えた。長く微細なバチルスの大部分を細胞外で観察することができた。ＨＥＬ細胞は、ＰＡＳ陽性凝集塊と、短く微細なＰＡＳ陽性バチルスで満たされているように見えた。
【００７７】
実施例２：単離物の増殖
全増殖手順を、１０％ウシ胎児血清と２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＭＥＭ培地で培養したＨＥＬ細胞上で行い、５％ＣＯ2下、３７℃でインキュベート
した。７５日目に、培養皿Ｉ中の上清３ｍｌを使用して、前記方法により１０個のｂｉｊｏｕｘチューブに接種し、上清２ｍｌを使用して、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿
中のコンフルエント細胞マットに接種した（培養皿Ａ）。培養
皿Ｉ中の細胞と上清の残りを収集して、１０ｍｌの懸濁液を得た。次いで、この懸濁液を、５つの２ｍｌアリコートに分けた。アリコートの１つを液体窒素で凍結した。別のアリコートを、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿中のコンフル
エント細胞マットに接種した（培養皿Ｂ）。別のアリコートの細胞を、液体窒素と温水（５５℃）を使用した４回の凍結融解サイクルにより溶解し、次いで、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿中のコンフルエント細胞マットに接種した（
培養皿Ｃ）。別のアリコートを、培地１５ｍｌを含むが、細胞マットが無い２５ｃｍ2培
養皿に接種した（培養皿Ｄ）。８５日目に、これら全ての培養皿および
ｂｉｊｏｕｘチューブ中の培地を、新鮮な培地と交換した。細胞を収集し、培地３０ｍｌを含む７５ｃｍ2培養皿に接種した（培養皿Ｄ２）。培地を交換する前
に、上清２００μｌを使用して細胞遠心分離とＰＡＳ染色を行い、血清学用の抗原として使用するために、上清の残りを凍結した。９５および１０５日目に、全ての培養皿およびｂｉｊｏｕｘチューブ中の培地を前記のように交換した。ＰＡＳ染色用の細胞スメアを調製するために、細胞マットの一部をかき集めた。染色により増殖効率を半定量的に評価した。ＰＡＳ陽性バチルスの存在を、以下の通りに（０、存在しない；＋、存在するが見つけにくい；＋＋、見つけ易いが、全視野には存在しない；＋＋＋、全視野で存在する）、倍率１０００倍で顕微鏡により評価した。これらの評価を盲検で行った。
【００７８】
単離物を継代培養の３０日後に見つけることができたので、増殖方法は全て有効であることが分かった（表１）。半定量的評価により、最も有効な手順がｂｉｊｏｕｘチューブ中での継代培養、上清の継代培養（培養皿Ａ）、および細胞の継代培養（培養皿Ｄ、Ｄ２）であることを観察することができた。
【００７９】
【表１】
【００８０】
実施例３：免疫蛍光法による検出
細胞内細菌を、１０５日目に免疫蛍光法によりｂｉｊｏｕｘチューブ中で直接検出した。アセトンで固定した後に、チューブをＰＢＳで２回洗浄した。３％脱脂粉乳を含むＰＢＳで１：５０に希釈した患者血清１００μｌを添加し、チューブを加湿チャンバー内で３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後に、０．２％エバンスブルーを添加したＰＢＳで１：２００に希釈したフルオレセインイソチオシアネート標識抗ヒトヤギ免疫グロブリン（Ｆｌｕｏｌｉｎｅ Ｈ，ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｃ，Ｆｒａｎｃｅ）１００μｌと共に、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後に、スライド（細胞は下方に向いている）を緩衝化グリセロール（ｐＨ８）中で固定し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡と、１００×（ＮＡ．１．４）液浸系対物レンズを備える共焦点顕微鏡（ＬＥＩＣＡ ＤＭＩＲＢＥ）を使用して倍率４００倍で調べた。
【００８１】
免疫蛍光法により調べると、ＰＡＳ染色および他の染色では細胞感染は過小評価されることが分かった。継代培養の３０日後、スライド上の細胞は全て細菌抗原で満たされている。共焦点顕微鏡による研究から細菌の細胞内位置が確かめられた。いくつかの細菌が、単離物中に、ＰＡＳ染色後に観察されるものに似た微細バチルスの形態で観察された。それにもかかわらず、免疫陽性物質の大部分はより大きな封入体と一致し、この封入体では細菌を個別化することができない。免疫陽性物質は細胞核で検出されない。
【００８２】
実施例４：電子顕微鏡
１０５日目に、培養皿Ｄ２から収集された細胞を含む溶液３００μｌを、電子顕微鏡による研究のために調製した。細胞を、０．１Ｍスクロースを含む０．１Ｍカコジル酸緩衝液に溶かした２．５％グルタルアルデヒド溶液で、４℃で１時間固定した。細胞を同じ緩衝液で一晩洗浄し、次いで、０．１Ｍカコジル酸緩衝液に溶かした四酸化オスミウムで、室温で１時間固定した。漸増濃度のエタノール溶液での連続洗浄により、脱水を行った。次いで、細胞を、Ｅｐｏｎ８１２のブロックに包埋した。次いで、ＬＫＢ Ｕｌｔｒａｔｏｍｅ ＩＩＩミクロトームを使用してブロックから薄切片を切り、その後、メタノールに溶かした飽和酢酸ウラニル溶液とクエン酸鉛水溶液で染色した後、Ｊｃｏｌ ＪＥＭ １２００
ＥＸ電子顕微鏡で調べた。
【００８３】
電子顕微鏡研究により、ＰＡＳ陽性封入体と免疫陽性物質は、無傷の細菌または分解している細菌と一致することが確かめられた。これらの細菌の細胞質膜は、電子密度が高い２つの層からなる。薄い細菌壁は、所定の位置で、３層の外観を示す外側偽膜で覆われている。分裂過程にある細菌が観察された。
【００８４】
実施例５：ウィップル病の原因である細菌に対するマウスポリクローナル抗体の作製 Ｂａｌｂ Ｃ系統のマウスの腹腔内に、ウィップル病の原因である１０4個の
細菌を含む上清０．５ｍｌを注射した。次いで、１、２、および３週間後に、このマウスに同じ上清０．５ｍｌを注射した。この最後の接種の１週間後に、このマウスから血を出した。免疫蛍光法を１回、免疫ペルオキシダーゼ法を１回行うことにより、血清を、一方では、ウィップル病の原因である細菌の培養物に対して、他方では、ウィップル病に罹患している患者の弁に対して試験した。明らかにする抗体は、フルオレセインまたは免疫ペルオキシダーゼで標識した抗マウス抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈにより供給）であった。
【００８５】
細菌を、細胞内で視覚化することができた。従って、さらに、本特許出願は、ウィップル病の原因である細菌を、生検材料および様々なスワブ（例えば、心臓弁、消化器生検材料、またはウィップル病の原因である細菌に感染していると思われる他の任意の器官の生検材料）中で直接検出することに関する。
【００８６】
実施例６：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ Ｔｗｉｓｔ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ株の産物に対するモノクローナル抗体の作製および使用、ならびに抗原の決定
装置と方法
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ株。ハイブリドーマを作製およびスクリーニングし、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の特異性を試験するために使用するＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの株は、番号Ｉ−２２０２でＣＮＣＭに寄託されたＴｗｉｓｔ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ株である。Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉを、前記の培養条件下で、ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＬ）上で培養した。７５日目に、感染細胞を１つのフラスコから採取し、４０００ｇで１０分間、遠心分離した。次いで、遠心分離残渣を、５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。この懸濁液０．５ｍｌを、それぞれのマウスに接種した。細菌をまたＲｅｎｏｇｒａｆｉｎ勾配下で精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、脱イオン水に、マイクロ免疫蛍光法（ＭＩＦ）の場合、ＰＢＳに再懸濁した。
【００８７】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の作製。ＰＢＳに溶かしたＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ＴＷＩＳＴ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ 番号Ｉ−２２０２の懸濁液０．５ｍｌを腹腔内注射することにより、６週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに７日間隔で３回接種した。３回注射の最後から１週間後に、静脈内追加抗原量の、ＰＢＳに溶かしたＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの懸濁液０．１ｍｌを、マウスに与えた。３日後に、免疫化マウスの脾臓を取り出し、５０％ポリエチレングリコール（分子量：１３００〜１６００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を使用して、脾細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させた（１０：１）。融合細胞を、２０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）とヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を添加したハイブリドーマ培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、５％ＣＯ2に
富む加湿雰囲気中、３７℃で培養した。
【００８８】
上清中の抗Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ抗体の存在をＭＩＦにより検出した。陽性ハイブリドーマを、腹水産生のために継代培養した。ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３マウス抗血清（Ｓｉｇｍａ）を含むＩｍｍｕｎｏ Ｔｙｐｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ）を使用して、Ｍａｂのアイソタイプを決定した。Ｍａｂの特異性をウエスタンブロッティングにより試験した。マウスに、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン；Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌを腹腔内注射した１週間後に、０．５ｍｌのＰＢＳに溶かした３×１０6個ハイブリドーマの懸濁液を腹腔内注射することにより、
腹水抗体を作製した。
【００８９】
マイクロ免疫蛍光法（ＭＩＦ）。ＭＩＦを使用して、ハイブリドーマをスクリーニングし、Ｍａｂの特異性を決定した。Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ培養物からなる抗原を、細く尖った棒（ｑｕｉｌｌ）を使用して２４ウェルスライド上に付着させた。メタノールを使用して室温で１０分間固定した後に、Ｍａｂを付着させ、加湿チャンバ内で３７℃で３０分間インキュベートした。その後、スライドをＰＢＳ、次いで、蒸留水で２×５分間洗浄し、風乾させ、次いで、０．２％エバンスブルーを含むＰＢＳで１／２００に希釈したフルオレセイン結合抗マウスＩｇＭヤギ抗体およびフルオレセイン結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｃ，Ｆｒａｎｃｅ）と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後に、スライドをＦｌｕｏｒｅｐ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して固定し、次いで、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ２０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、倍率４００×で読み取った。免疫化マウスの血清を陽性対照として使用し、健康なマウスの血清を陰性対照として使用した。
【００９０】
ウィップル病に罹患している患者の血清中の抗Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ抗体を検出するために、ＭＩＦを、Ｌａｂｔｅｃｈスライド（Ｒａｏｕｌｔ Ｄ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０００）上で行った。血清を、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、および１：８００まで希釈した。
【００９１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを、１２％ポリアクリルアミド分離ゲルおよび５％トランスファーゲルを使用することで改良されたＬａｅｍｍｌｉの方法で行った。緩衝液（０．０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸塩（ｐＨ８．０）、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー）中に４ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含むＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ懸濁液を、１００℃で５分間、加熱した。溶解した抗原を、電気泳動槽（Ｍｉｎｉ ＰｒｏｔｅｉｎＩＩ：Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｒｉｃｈ
ｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ）中で、８〜１０ｍＡの一定強度で３〜４時間のゲル電気泳動により分離した（泳動用緩衝液：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）。タンパク質サイズを、ペプチド量マーカー（Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ；Ｂｉｏ Ｒａｄ）との比較により決定した。このように分離された抗原を、ウエスタンブロッティング槽（Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ；Ｂｉｏ Ｒａｄ）中、５０Ｖの電流で、４℃で１時間、転写緩衝液（２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）を使用してニトロセルロース膜（０．４５μｍ孔）に移した。転写した後、非特異的結合部位をブロックするために、ニトロセルロース膜を５％脱脂粉乳溶液と一晩インキュベートした。その後、膜を３回、ＰＢＳで洗浄し、次いで、風乾させた。次いで、膜を、３％乳を添加したＰＢＳで１：４に希釈したハイブリドーマ上清または１：１００に希釈した患者血清と室温で１時間インキュベートし、次いで、前記のように洗浄した。その後、膜を、３％脱脂粉乳を添加したＰＢＳで１：５００に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（重鎖および軽鎖：ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｓｅａｒｃｈ）と室温で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。特異的抗体の存在を、基質４−クロロ−１−ナフトールを使用してペルオキシダーゼ活性の存在により明らかにした。
【００９２】
Ｍａｂに対する盲検法。モノクローナル抗体の特異性を、１９種類の細菌：１２種類のＢａｒｔｏｎｅｌｌａ（すなわち、５種類のＢ．ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｂ．ｖｉｎｓｏｎｉｉ Ｂａｋｅｒ、Ｂ．ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ、Ｂ．ｇｒａｈａｍｉｉ、Ｂ．ｄｏｓｈｉａｅ、およびＢ．ｔａｙｌｏｒｉｉ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｎｉｎｅ
Ｍｉｌｅと、本発明者らの研究室において診療試料から単離された様々な６種類の株（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＮＦ群、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｍａｙｅｒｉｉ）に対してＭＩＦにより盲検で評価した。ＰＢＳに懸濁し、ウェルを備えるスライドに付着させた後に、Ｍａｂと細菌との反応性を、１：１００に希釈した腹水を使用して前記のようにＭＩＦにより評価した。
【００９３】
患者。１５人の患者を試験した。８人の患者は、組織学および／または消化器生検材料のＰＣＲによるＴ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ増幅により診断された、消化系だけにあるウィップル病に罹患している。７人の患者は、弁生検材料のＰＣＲにより診断された、Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされた心内膜炎に罹患している。
【００９４】
マウスおよびウサギ。どの抗原が抗体反応により認識されるかを決定するために、５匹のマウスと１匹のウサギにＴ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ懸濁液を接種した。
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィール（図１）。Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのＳＤＳ−ＰＡＧＥから、７つの主要バンドが１０、２０、８０、１２０、１５０、１７０、および２００ｋＤａにあることがさらに詳細に分かった。
【００９５】
Ｍａｂの作製。４種類のハイブリドーマの上清をＭＩＦにより試験した。４種類のハイブリドーマが、Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉに特異的であることが分かった。１種類のハイブリドーマを、パスツール研究所のＣＮＣＭ（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，ＰＡＲＩＳ ７５７２４）に番号Ｉ−２４１１および識別参照ＴＷ １７Ｇ２で寄託した。
【００９６】
患者に対して行った血清学試験。１５人の患者のうち１３人（８６．７％）が陽性の血清学試験結果（ＩｇＭレベル＞１：１００）を示した。ウスタンブロッティングで観察さ
れた抗原プロフィールから、ＩｇＧに関する２００ｋＤａの主要バンドを含む、いくつかのバンドと反応性があることが分かった（図２）。１００、６０、５０、および３５ｋＤａのタンパク質に対する反応性を含む、いくつかのタンパク質プロフィールをＩｇＭについて同定した（図３）。
【００９７】
免疫化マウスおよび免疫化ウサギに対して行った血清学試験。免疫化マウスおよび免疫化ウサギは、陽性の血清学試験結果（ＩｇＭレベル＞１：１００）を示した。ウエスタンブロッティングで観察された抗原プロフィールから、マウスとウサギとで反応性が異なり、患者で観察されたものとは異なることが分かった。他方で、主要な反応性が２００ｋＤａのバンドで観察された。
【００９８】
Ｍａｂの特徴付け（図２）。４種類のＭａｂは、２００ｋＤａ抗原に特異的な反応性を示した。これは、患者、マウス、およびウサギのウエスタンブロットで既に証明されている。これらのＭａｂは全てＩｇＭとして同定された。認識される抗原は、プロテイナーゼＫの作用により破壊された。このことから、抗原はタンパク質であることが分かった。
【００９９】
Ｍａｂに対する盲検法。４種類のハイブリドーマの腹水は、Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのみと反応した。
実施例７：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の配列
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の配列を、コンセンサスプライマーを使用する酵素的増幅と直接自動配列決定により決定した。
【０１００】
使用したコンセンサスプライマーの配列は、以下の通りであった。
配列番号１＝５’−ＴＩＡ ＴＧＧ ＧＩＩ ＣＩＡ ＡＩＡ ＴＧＣ Ａ−３’
配列番号２＝５’−ＧＣＣ ＣＡＩ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＴＩ ＴＣＩ ＣＣ−３’（Ｉ＝イノシン）
であった。
【０１０１】
機械的溶解および化学的溶解（Ｆａｓｔ−Ｐｒｅｐ Ｂｉｏ １０１）により、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ Ｔｗｉｓｔ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ株ＣＮＣＭ Ｉ−２２０２から抽出したＤＮＡを、以下の実験条件：３５回の増幅サイクル（各サイクルが、９４℃３０秒のＤＮＡ変性、５０℃３０秒の初回プライマーハイブリダイゼーション（１サイクル当たり−０．１℃の勾配を含む）、次いで、７２℃６０秒の伸長からなる）に組み込んだ。
【０１０２】
配列番号１および配列番号２の配列を、以下の細菌の以下のアクセッション番号でＧｅｎｂａｎｋに寄託されたペプチド配列のアラインメントにより決定した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｌ４３５９３、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ，ＡＦ１７１０７０、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ，ＡＥ００１１４４、Ｂｕｃｈｎｅｒａ ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ，Ｚ１１９１３、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＥ００１５９３、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，ＡＥ００１３０４、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ，Ｕ８６６８８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｕ７６２２２、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｕ３２７３３、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｅ０００６２５、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ，ＡＦ０８７８１２、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ，Ｚ１４３１４、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ，Ｕ２４４９４、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｌ２７９８９、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ，Ｌ３８４０２、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ，Ｕ３９７１５、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｌａｅ，ＡＥ００００３０、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ，Ｚ５４３５３、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ，Ｘ１５８４９、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，ＡＦ０３４５３１、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ，Ｐ７７９４１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｘ０４６４２、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｃｉｔｒｉ，Ｕ２５８１５、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｕ９７００６２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．，Ｄ９０９０５、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｘ７２６９５、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ，ＡＥ００１２０５、およびＨｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ Ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓ ａｇｅｎｔ，ＡＦ２３７４１４。
【０１０３】
配列番号１および配列番号２を配列、これらの配列がＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにも存在すると仮定して、最も保存されている配列を選択することにより選択した。
【０１０４】
プライマー配列番号１および配列番号２を使用して得られた、配列番号３に対応する、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２４３０７２） ｒｐｏＢ遺伝子の部分配列は、以下の通りである。
ＢＡＳＥ １５７ａ １１７ｃ １７６ｇ １５０ｔ その他１２
実施例８：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の特異的検出
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉに特異的な以下の配列：
配列番号４：５’−ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＴＴ−３’
配列番号５：５’−ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＡＡ−３’
を、フラグメント配列番号３から選択した。
【０１０５】
選択した配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに列挙された前記２８種類の細菌のｒｐｏＢ遺伝子の既知配列と比較して、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉに特異的な配列である。
【０１０６】
実施例９：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の特異的増幅
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子を、３５回の増幅サイクル（各サイクルが、９４℃３０秒の変性段階、５２℃３０秒のプライマー配列番号４と配列番号５のハイブリダイゼーション段階、７２℃９０秒の伸長段階からなる）を使用するＰＣＲ技術により増幅した。増幅産物を、臭化エチジウム染色後に視覚化した（図４）。
【０１０７】
対照細菌（すなわち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓｃａｖｉａｒｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｅｒｄｉｍｉｌｉｓ、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）は検出されなかった。このことから、試験したプライマーの特異性が証明された。
【０１０８】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉとの遺伝子類似性のために、または予想される汚染菌としてＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ検出のために提出された臨床スワブに存在するために、以下のアクセッション番号でＧｅｎｂａｎｋに寄託された、これらの対照種のｒｐｏＢ配列：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ＡＴＣＣ２５２９１，ＡＦ０６０３３６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｕ１２２０５、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２，Ｕ７７４３６を選択した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断の分野に関する。さらに正確には、本発明は、ウィップル病のインビトロ血清学的診断のための方法および該方法を実施するための装置に関する。さらに本発明は、ウィップル病の原因である細菌のインビトロ検出のためのキットに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用して検出および／または増幅し配列決定する技術の分野、ならびに細菌種Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの存在を検出する試験への前記プローブまたはプライマーの利用あるいは該細菌種の同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウィップル病は、様々な状態となって発症する病気である。最も典型的な状態は、体重減少につながる慢性下痢を伴う発熱であるが、この疾患はまた、慢性関節症状、痴呆を伴う脳症状を引き起こす恐れがあり、心臓症状（特に、陰性血液培養を伴う心内膜炎）も引き起こす恐れがある。
【０００４】
１９０７年に最初に述べられてから、ウィップル病は、腸間膜神経節を銀染色した後に非常に多くの微生物が観察されたため、「腸性脂肪異栄養症」に関連する細菌の存在を伴うことが理解されてきた（Ｗｈｉｐｐｌｅ，Ｂｕｌｌ．Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐ．１９０７；１８：３２８−３９１）。この細菌の非特異的ＰＡＳ陽性（ＰＡＳ＝過ヨウ素酸シッフ）特性の証明と、その後の電子顕微鏡による観察から、グラム陽性構造の細胞内細菌種が存在することが確認された（Ｃｈｅａｒｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９６１；４１：１２９−１３８）。ユニバーサルな分子ツールである１６Ｓ
ｒＲＮＡにより、この仮説が確かめられた。この新しい細菌種の系統分類学が特定され、腸吸収不良の概念を想起させるようにすると共にこの病気の発見者に敬意を払うために、この細菌に仮名称Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉが付けられた（Ｒｅｌｍａｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９２；３２７：２９３−３０１）。１人の患者の小腸（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ １９９１；３３８：４７４−４７５）、次いで、もう１人の患者の神経節（Ｗｉｌｓｏｎら，ＡＳＭ Ｎｅｗｓ １９９２；５８：３１８−３２１）の生検材料から増幅された７２１塩基のフラグメントを直接配列決定することにより、ウィップル病に関連する細菌種の新規性が確認された。Ｒｅｌｍａｎら（前掲）による、１人の試料の１３２１塩基（遺伝子の９０％に相当する）と、もう４人の患者の２８４塩基フラグメントの配列決定により、このウィップル病に関連する細菌は新種であることを確認し、放線菌門（すなわち、グラム陽性構造、グアノシン＋シトシン高含有量の細菌）における分類学的位置を特定することができた。この細菌は、ヒト病理学で周知の２種、すなわち、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＲｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａに比較的近い新しい分枝である。
【０００５】
ウィップル病は、現在、生検材料から得られたスメアを染色した後の顕微鏡観察により、またはユニバーサルな遺伝子ツールである１６Ｓ ｒＲＮＡ（Ｒｅｌｍａｎら，前掲）の増幅および配列決定により診断されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今まで、血清学試験の実施に適するように、ウィップル病の原因である細菌を単離および培養することは事実上不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
予想に反して、本出願人は、ウィップル病の原因である細菌を培養する方法を開発した。
請求項１−３５に記載された発明が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】電気泳動ゲルの写真である。Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質プロフィールを示す。
【図２】電気泳動ゲルの写真である。ウエスタンブロッティングにより得られたＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの抗原プロフィールを示す。レーン１＝免疫化マウスの血清、レーン２＝免疫化ウサギの血清、レーン３＝患者血清（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）、レーン４＝モノクローナル抗体１、レーン５＝モノクローナル抗体２、レーン６＝モノクローナル抗体３、レーン７＝モノクローナル抗体４。
【図３】電気泳動ゲルの写真である。ウィップル病に罹患している患者の血清を使用して、ＴＷＩＳＴ株、番号Ｉ−２２０２に対して行われ、ＩｇＭ検出したウエスタンブロットを示す。
【図４】電気泳動ゲルの写真である。臭化エチジウム染色した後の、プライマー配列番号１および２を使用したＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の増幅から生じた産物を視覚化したものを示す。レーン１＝Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ、レーン２＝Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓｃａｖｉａｒｕｍ、レーン３＝Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、レーン４＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、レーン５＝Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ、レーン６＝Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、レーン７＝Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、レーン８＝Ｈ2Ｏ、レーン９＝Ｈ2Ｏ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの単離と増殖を可能にする細胞培養物は、寿命が長くかつ増殖時間が長くならなければならないことを発見した。実際に、本発明者らは、前記細菌の倍化時間が非常に長い（１８日）ことを証明している。好ましくは、初代培養を、直接、不死化細胞上で行うべきである。
【００１０】
ヒト血液単球の初代培養に関して行われた初期研究（ＳＨＯＥＤＯＮら，“Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｃａｓｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １７６，ｎｕｍｂｅｒ ３，１９９７，６７２−６７７頁）を、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉが増殖するような培養において、この細菌を樹立するための基礎として使用することができなかった。なぜなら、これらの単球の平均寿命が、細菌の倍化時間の観点からすると不十分な３０日しかなかったからである。
【００１１】
さらに、細菌の増殖時間と比較して細胞があまりに急速に増殖する場合、細菌を培養することができない。なぜなら、希釈効果が生じ、感染細胞と非感染細胞とを分離することができなくなるからである。
【００１２】
１つの有利な実施態様では、本発明者らは不死化線維芽細胞を使用した。これらの線維芽細胞は培養皿の底に広がり、細胞マット全体をふさぐと増殖を止めるが、そのような条件下で数ヶ月間、生存することができる。
【００１３】
さらに正確には、以下の実施例１および２に詳細に記載する、細菌を単離および培養する方法は、ヒト線維芽細胞ＨＥＬ株に、ＭＥＭに溶かした粉砕心臓弁調製物を接種することを含む。最低２ヶ月間インキュベートした後に（培地を定期的に交換する）、ウィップル病の原因である細菌を単離し、培養において樹立した。「培養において樹立する」とい
う言い回しは、特に、細胞培養物上での連続的な継代培養により、細菌が再現可能に得られ、経時的に増殖する意味であると理解される。
【００１４】
従って、本発明は、抗原供給源として、このように単離および樹立された細菌に関する。本細菌は、ＣＮＣＭ（フランス、パリ）に番号Ｉ−２２０２および識別参照ＴＷＩＳＴ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅで寄託されている。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明による細菌の抗原に関する。さらに詳細には、本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動とウエスタンブロッティングとにより決定された、約１０，２０，３５，５０，６０，８０，１００，１２０，１５０，１７０および２００ｋＤの分子量を有するものから選択されるタンパク質である抗原に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、本発明による細菌または抗原に対する特異的抗体、さらに詳細には、動物起源のポリクローナル抗体（特に、マウスもしくはウサギ免疫グロブリン）またはモノクローナル抗体（特に、パスツール研究所のＣＮＣＭに、登録番号Ｉ−２４１１および識別参照ＴＷ １７Ｇ２で寄託されたハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体）に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、前記細菌を認識するヒト免疫グロブリン（好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡ）に特異的な抗体、より詳細には、動物免疫グロブリン（特に、抗ヒトヤギ免疫グロブリン）の検出に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、より詳細には、本発明による前記ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体と反応する２００ｋＤのタンパク質であることを特徴とする抗原に関する。
【００１９】
さらに、本発明は、細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされる感染に関連する疾患のインビトロ診断のための方法における本発明による細菌、細菌の抗原、または特異的抗原の使用と、本発明による細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされる感染症の血清学的診断のための方法に関する。前記方法は、患者の血清または任意の他の生物学的液体を前記細菌と接触させ、免疫学的反応を検出することを含む。
【００２０】
より詳細には、本発明は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされる感染症のインビトロ血清学的診断のための方法に関する。ここで、本発明による細菌、本発明による細菌の抗原、または本発明による特異的抗体を、患者から採取し、ヒト血清、生物学的液体、またはスワブからなる試料と接触させる。
【００２１】
本発明による方法は、本質的に、本発明による細菌に特異的な抗体と前記細菌の抗原との免疫学的反応、または前記細菌を認識する本発明による免疫グロブリンに特異的な抗体と、前記細菌を認識するヒト免疫グロブリンとの免疫学的反応を検出することにあるステップを含む。
【００２２】
さらに、本発明は、ウィップル病のインビトロ血清学的診断のための方法に関する。前記方法は、患者の血清または任意の他の生物学的液体を、前記で定義された細菌と接触させることと、免疫学的反応を検出することを含む。
１つの実施態様では、本発明による診断方法は以下の工程から成る。
【００２３】
−本発明による細菌の溶液、特に０．５〜５μｌ、好ましくは１μｌの前記細菌を含む前記溶液を、固体支持体中に、または固体支持体上に付着させること
−試験血清または生物学的液体（好ましくは、希釈した試験血清または生物学的液体）を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−標識抗体（特に、前記細菌を認識するヒト免疫グロブリン（特に、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡタイプ）に特異的な抗ヒト動物免疫グロブリン）を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−インキュベーション期間を観察すること
−適宜、前記固体支持体を洗浄すること
−特に、前記細菌を認識するヒト抗体と前記抗ヒト免疫グロブリンとの免疫学的反応を実際に検出すること。
【００２４】
有利なことに、本発明の診断方法は、ＥＬＩＳＡタイプの酵素イムノアッセイまたは免疫蛍光アッセイを含む。より詳細には、本発明による方法は、以下の工程から成る。
−前記のように単離および樹立した細菌の溶液を、固体支持体中に、または固体支持体上に付着させること
−希釈した試験血清または生物学的液体を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−標識抗ヒト免疫グロブリンを、前記支持体中に、または前記支持体上に導入すること
−インキュベーション期間を観察すること
−適宜、前記固体支持体を洗浄すること
−免疫学的反応を実際に検出すること。
【００２５】
使用する固体支持体は、細胞懸濁液および細菌懸濁液の操作に適した任意の装置（特に、チューブ、ガラススライド、ｂｉｊｏｕｘチューブ、または堅いマイクロタイタープレート（ポリエチレン、ポリスチレン、塩化ビニル、またはニトロセルロースで作られ、マイクロウェルを有する））であってよい。ガラススライドが好ましい。
【００２６】
検出される抗体は、ウィップル病の原因である細菌に特異的な、特に、Ｇ、Ｍ、またはＡタイプの免疫グロブリンである。抗ヒト免疫グロブリンに使用される標識のタイプは、酵素標識、放射性標識、または蛍光標識である。最後のタイプの標識が好ましい。
【００２７】
「蛍光標識」という言い回しは、適切な蛍光剤（例えば、フルオレセインイソ（チオ）シアネート）と、ヒト抗体を認識する動物免疫グロブリンとの結合により、抗体が蛍光を発するようになっていることを意味する。
【００２８】
「放射性標識」という言い回しは、抗体が、その構造要素（例えば、構成チロシン残基）またはそれに固定されている適切なラジカルに、放射能をカウントすることにより分析することができる放射性同位体を有することを意味する。
【００２９】
「酵素標識」という言い回しは、抗体が、適切な薬剤と会合した場合にこの特異的抗体を定量的に測定することができる酵素と結合していることを意味する。
基質および試薬は、この酵素により引き起こされ、これらの基質を必要とする反応または反応順序の最終生成物が、次のうちのいずれか一方となるように選択される。
【００３０】
−着色基質または蛍光基質（試験試料を取り囲む液体培地に拡散し、それぞれ最終的な分光光度測定もしくは蛍光測定または目視評価（任意に、カラースケールと照らし合わせる）に供される）
−不溶性着色基質（試験試料に付着し、反射光度計による測定または目視評価（任意に、カラースケールと照らし合わせる）に供することができる）
蛍光を発するようになっている抗体を使用する場合、試験試料に関連する蛍光は、適切な装置により直接読み取る。
【００３１】
放射性プローブ（例えば、ヨウ素１２５）を使用する場合、試験試料に関連する放射能は、任意の適切な実施方法（例えば、細胞をアルカリ溶液（例えば、水酸化ナトリウム溶液）で可溶化し、吸収プラグを使用して放射能を含む溶液を回収した後に）によりガンマカウンターでカウントする。
【００３２】
特異的抗体に酵素を使用する場合、前記で説明したような、培地に溶ける着色生成物、不溶性着色生成物、または可溶性蛍光生成物を反応生成物として最終的に得ることができる、酵素基質と１または複数の補助試薬を含む溶液を添加することにより、着色生成物または蛍光生成物が出現する。次いで、このように処理した試料から生じる光シグナルを、それぞれの場合に適した装置（すなわち、それぞれ、透過光度計、反射光度計、または蛍光計）を使用して測定する。あるいは、得られた色を、目視により（任意に、着色溶液のスケールを使用して）評価することもできる。
【００３３】
アルカリホスファターゼを酵素として使用する場合、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａにより提案された方法により、この酵素を特異的抗体と結合させる。この酵素に好ましい基質は、最終測定が分光光度計によるものである場合、パラニトロフェニルリン酸、または測定が蛍光計によるものである場合、４−メチル−ウンベリフェリルリン酸、または不溶性着色反応生成物が得られる場合、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸である。同様に、β−ガラクトシダーゼを酵素として使用することができる。好ましい基質は、オルトニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドまたは４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドである。
【００３４】
特異的抗体をペルオキシダーゼと結合できることが好ましい。この場合、結合プロセスは、Ｍ．Ｂ．ＷＩＬＳＯＮおよびＰ．Ｋ．ＮＡＫＡＮＥ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｗ．Ｋｎａｐｐ，Ｋ．Ｋｏｌｕｂａｒ，Ｇ．Ｗｉｃｋｓ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９７８，２１５−２２４頁により記載されているものに基づいている。
【００３５】
特異的抗体と共役したペルオキシダーゼを明らかにするために使用する試薬には、過酸化水素（酵素基質）と適切な色原体（例えば、培地に溶ける着色最終生成物を得るためにはオルトフェニレンジアミンまたは２，２’−アジノビス−（３−エチルチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、不溶性最終反応生成物を得るためには３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、または４−クロロ−α−ナフトール、培地に溶ける蛍光反応生成物を得るためにはパラヒドロキシフェニルプロピオン酸）が含まれる。
【００３６】
本発明の別の実施態様は、アセチルコリンエステラーゼが結合している特異的抗体の使用である。
フランス特許第２５５０７９９号に記載に基づくプロセスによるか、または簡単に述べると、周知の技術により抗体フラグメントを調製し、適切なヘテロ二価性薬剤との反応により酵素を修飾し、最後に、結果として生じる生成物を結合させることを含むプロセスにより、アセチルコリンエステラーゼを抗体と結合させることが好ましい。この場合、免疫酵素結合体を構築する他の周知のプロセスも使用することができる。
【００３７】
アセチルコリンエステラーゼ結合体により認識される抗原に特異的に関連する酵素活性は、この場合に適した任意の変異体（例えば、Ｐｒａｄｅｌｌｅｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．１９８５，５７：１１７０−１１７３に記載の変異体）を使用して、酵素基質としてアセチルチオコリンと色原体としてエルマン試薬（５，５’−ジチオ−２−ニトロ安息香酸）を利用する周知の技術により明らかにされることが好ましい。
【００３８】
言及した色原体は、それ自体で、または水溶性の塩の形態で使用される。
本発明の血清学的診断の方法は、生物学および／または病理解剖学研究室での使用に適している。このために、本方法の実施のために提案された装置は固体支持体を備える。この固体支持体の上に、または固体支持体中に、前記で定義された細菌を含む溶液が付着されている。
【００３９】
別の特徴によれば、さらに、本発明は、ウィップル病の原因である細菌のインビトロ検出のためのキットに関する。このキットは、以下の成分を含む溶液を備えている。
−本発明による細菌または抗原を含む溶液、および／または
−本発明による少なくとも１つの抗体を含む溶液、および／または
−前記細菌を認識にするヒト免疫グロブリンに特異的な少なくとも１つの抗体。
【００４０】
さらに詳細には、前記キットは、以下のものを含む。
−陽性対照として、前記のように単離および樹立されたウィップル病の原因である細菌を含む溶液
−標識特異的抗体を含む溶液
−任意の洗浄溶液。
【００４１】
本発明のキットに使用される特異的抗体は、放射性プローブ、酵素、または蛍光剤で有利に標識される。
特異的抗体を酵素で標識する場合、前記キットはまた、酵素基質と、酵素活性を視覚化するための１または複数の試薬を含む。
【００４２】
特異的抗体を蛍光剤で標識する場合、フルオレセインイソ（チオ）シアネートを使用することが好ましい。
本発明の１つの好ましい実施態様では、使用される特異的抗体は、免疫グロブリン、特に、マウス免疫グロブリンである。
【００４３】
さらに、本発明は、本発明による細菌Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのｒｐｏＢ遺伝子に関する。ｒｐｏＢ遺伝子の配列は、異なる属および種の多数の他の細菌の中でコンセンサスなプライマーを使用した酵素的増幅と直接的自動配列決定により決定した。
【００４４】
ｒｐｏＢ遺伝子は、細菌ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットの１つをコードし、細菌種Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの特異的検出を可能にする遺伝子マーカーを構成する。
【００４５】
さらに詳細には、本発明は、添付の配列表中のヌクレオチド配列である配列番号３を有することを特徴とするｒｐｏＢ遺伝子のフラグメントに関する。
従って、さらに本発明は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ種に特異的な核酸配列に関し、このヌクレオチド配列は、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子に由来し、特に、前記ｒｐｏＢ遺伝子のフラグメントに由来する。
【００４６】
Ｌａｚｃａｎｏら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．（１９８８）２７：３６５−３７６）によれば、ＲＮＡポリメラーゼは、その起源により２つのグループに分類される。一方は、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ウイルスＲＮＡポリメラーゼからなり、他方は、真核生物
または原核生物起源（古細菌および真正細菌）のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなる。真正細菌ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’により表される「コア酵素」またはαββ’σにより表される「ホロ酵素」と呼ばれる単純な、保存された多量体構造により特徴付けられる（ＹｕｒａおよびＩｓｈｉｈａｍａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１３：５９−９７）。
【００４７】
非常に多くの研究により、多量体酵素複合体内での、真正細菌ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットの機能的役割が証明されている。古細菌および真核細菌のＲＮＡポリメラーゼに関する限りでは、これらは、約１０または１１〜約３０のサブユニットになることができる、さらに複雑な構造を有する（Ｐｕｈｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：４５６９−４５７３）。
【００４８】
真正細菌におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの異なるαββ’σサブユニットをコードする遺伝子（すなわち、それぞれ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、およびｒｐｏＤ遺伝子）が、リボソームサブユニットの構成タンパク質またはゲノムの複製および修復に関与する酵素をコードする遺伝子を含む、それぞれ異なるグループに分類される（ＹｕｒａおよびＩｓｈｉｈａｍａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１３：５９−９７）。著者の中には、ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の核酸配列を使用して、生物界の中で異なる分枝および小分枝を分離することを可能にする系統樹を構築できることを証明したものもいる（Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（１９９２）２１：４０ｓ）。
【００４９】
本発明のこの特徴をさらに詳細に説明する前に、説明および特許請求の範囲で使用する様々な用語を以下で定義する。
「細菌から抽出した核酸」は、全核酸、ゲノムＤＮＡ，メッセンジャーＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写から得られたＤＮＡのいずれかを意味すると理解される。
【００５０】
「ヌクレオチドフラグメント」および「オリゴヌクレオチド」は、同義の２つの用語であり、厳しいストリンジェンシーの所定条件下で相補的なまたは実質的に相補的なヌクレオチドフラグメントと、天然核酸と同様にハイブリダイズすることができる天然（または、ことによると修飾された）核酸の情報配列により特徴付けられる、ヌクレオチド単位が連結したものを意味する。この連結は、構造が天然核酸とは異なるヌクレオチド単位を含んでもよい。ヌクレオチドフラグメント（またはオリゴヌクレオチド）は、例えば、１００ヌクレオチド単位までを含んでもよい。これは、一般に、少なくとも１０ヌクレオチド単位、特に、少なくとも１２ヌクレオチド単位を含み、天然核酸分子から、ならびに／あるいは遺伝子組換えおよび／または化学合成により得ることができる。
【００５１】
ヌクレオチド単位は単量体に由来する。前記単量体は、その構成要素が、糖と、リン酸基と、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、およびチミンから選択される窒素塩基である天然核酸ヌクレオチドでもよい。あるいは、前記単量体は、前記で列挙した３つの構成要素のうち少なくとも１つで修飾されているヌクレオチドである。一例として、塩基では、イノシン、５−メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、５−ジメチルアミノデオキシウリジンなどの修飾塩基またはハイブリダイゼーションが可能な他の任意の修飾塩基を使用して、あるいは糖では、例えば、少なくとも１つのデオキシリボースをポリアミドで置換することにより（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１４９７−１５００）、あるいはリン酸基では、例えば、特に、ジホスフェート、アルキルホスホネートおよびアリルホスホネート、ならびにホスホロチオエートから選択されるエステルで置換することにより、修飾を行うことができる。
【００５２】
「情報配列」は、その化学的性質と基準方向（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏ
ｎ）への順序が天然核酸の配列により与えられるものと類似する情報を構成する、任意の順序付けられた一連のヌクレオチド型単位を意味すると理解される。
【００５３】
「ハイブリダイゼーション」は、適切な条件下で、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチドフラグメントが安定かつ特異的な水素結合を介して互いに会合し、二本鎖を形成することができるプロセスを意味すると理解される。ハイブリダイゼーション条件は、「ストリンジェンシー」（すなわち、操作条件の厳しさ）により決定される。ストリンジェンシーが大きくなればなるほど、ハイブリダイゼーションは特異的になる。ストリンジェンシーは、特に、プローブ／標的二重鎖の塩基組成物の関数であり、２つの核酸間のミスマッチの程度によるものである。ストリンジェンシーはまた、ハイブリダイゼーション反応のパラメータ（例えば、ハイブリダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度およびタイプ、変性剤の性質および濃度、ならびに／またはハイブリダイゼーション温度）の関数であり得る。ハイブリダイゼーション反応を行わなければならない条件のストリンジェンシーは、特に、使用するプローブによって決まる。これらの事実の全てが周知であり、適切な条件を、その都度、日常的な実験により必要に応じて決定することができる。一般に、使用するプローブの長さに応じて、ハイブリダイゼーション反応の温度は、濃度が約０．８〜１Ｍの食塩水中で、約２０〜６５℃、特に、３５〜６５℃である。
【００５４】
「プローブ」は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド単位、特に、１２〜３５ヌクレオチド単位からなり、核酸（この場合では、メッセンジャーＲＮＡ（すなわち、転写産物）に含まれる、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写により得られるＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列を有する核酸）とハイブリダイゼーション複合体を形成する所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有するヌクレオチドフラグメントである。プローブを診断のために使用してもよく（特に、キャプチャープローブまたは検出プローブ）、治療のため使用してもよい。
【００５５】
「キャプチャープローブ」は、任意の適切な手段により（例えば、共有結合、吸着、または固体上への直接合成により）、固体支持体上に固定化されるか、または固定化することができる。支持体の例として、マイクロタイタープレートおよびＤＮＡチップが挙げられる。
【００５６】
「検出プローブ」は、例えば、放射性同位体、酵素（特に、発色基質、蛍光基質、発光基質に作用することができる酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはアルカルホスファターゼ））、発色団化学物質、発色化合物、蛍光化合物、または発光化合物、ヌクレオチド塩基アナログ、およびリガンド（例えば、ビオチン）から選択されるマーカーで標識することができる。
【００５７】
「種プローブ」は、細菌の種を同定するためのプローブである。
「属プローブ」は、細菌の属を同定するためのプローブである。
「プライマー」は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド単位からなり、例えば、ＰＣＲなどの増幅技術、配列決定プロセス、転写法などで酵素的重合を開始するための所定の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有するプローブである。
【００５８】
本発明の主題の１つは、添付の配列表中の配列番号４および配列番号５の配列の１つに含まれる少なくとも１２の連続的なヌクレオチド単位からなる配列を有するオリゴヌクレオチドならびにこれらのオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドから選択される１本鎖オリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）でもよく、「Ｔ」を「Ｕ」で置換したオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でもよい。
【００５９】
特に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、前記のように少なくとも１２単位、多くても５０単位を有する。さらに詳細には、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１２〜３５単位を有する。
【００６０】
好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号４および５の配列から選択される配列を有する。
イノシンは、他の任意の塩基と対合することができる。
【００６１】
配列番号４および５の配列は、当業者に周知な例えばＩｔａｋｕｒａ Ｋ．ら（（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３）による論文に記載されている技術を使用した化学合成により調製することができる。
【００６２】
本発明のオリゴヌクレオチドの第１の応用例は、細菌種Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ
ｗｈｉｐｐｅｌｉｉを生物学的試料中で検出するためのプローブとしての使用である。このプローブは、配列番号４および配列番号５の１つに含まれる少なくとも１２の連続したヌクレオチド単位からなるヌクレオチド配列とこれらの相補的配列を含む。本説明ではこれより、本発明のこのようなプローブを種プローブと呼ぶ。
【００６３】
本発明によるプローブは、周知の任意のハイブリダイゼーション技術（特に、「ＤＯＴ−ＢＬＯＴ」と呼ばれる技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、「ＳＯＵＴＨＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ」と呼ばれるＤＮＡ転写技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）９８：５０３）、「ＮＯＴＨＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ」と呼ばれるＲＮＡ転写技術、またはいわゆる「サンドイッチ」技術（Ｄｕｎｎ，Ａ．Ｒ．，Ｈａｓｓｅｌ，Ｊ．Ａ．（１９７７）Ｃｅｌｌ １２：２３））により、試料中に標的核酸が存在するか存在しないかを検出するための試験において診断目的に使用することができる。特に、「サンドイッチ」技術は、キャプチャープローブおよび／または検出プローブと共に使用される。これらのプローブは標的核酸の２つの異なる領域とハイブリダイズすることができ、これらのプローブの少なくとも一方（一般に、検出プローブ）が、種に特異的な標的領域とハイブリダイズすることができる。キャプチャープローブおよび検出プローブには、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列がなければならないことが理解されている。
【００６４】
検出しようとする核酸（標的）はＤＮＡでもＲＮＡでもよい（任意に、どちらか一方をＰＣＲにより増幅した後に得る）。二本鎖核酸型の標的を検出する場合、検出プロセスを行う前に二本鎖核酸を変性することが適切である。標的核酸は、周知の方法を使用して試験試料の核酸から抽出することにより得ることができる。二本鎖核酸を、化学的、物理的、または酵素的変性の周知の方法により、特に、８０℃以上の適切な温度まで加熱することにより変性することができる。
【００６５】
前記のハイブリダイゼーション技術、特に、「サンドイッチ」技術を行うために、キャプチャープローブと呼ぶ本発明のプローブを固体支持体に固定化し、検出プローブと呼ぶ本発明のもう１つのプローブをマーカーで標識する。
【００６６】
支持体およびマーカーの例は、前記で定義した通りである。
本発明のさらなる主題は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌が、少なくとも１つのこのような細菌の核酸を含むかまたは含む可能性がある試料中に存在するか、存在しないかを決定するプロセスである。前記プロセスは、前記試料を少なくとも１種類の本発明のプローブと接触させ、次いで、それ自体は周知の方法で、前記プローブと前記試料の核酸とのハイブリダイゼーション複合体が形成したか、または形成しなかったかを
決定することにあるステップを含む。
【００６７】
プローブと核酸とのハイブリダイゼーション複合体が形成したか、または形成しなかったかを検出する方法の例として、前記の技術、すなわち、「ＤＯＴ−ＢＬＯＴ」、「ＳＯＵＴＨＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ」、および「サンドイッチ」技術が挙げられる。
【００６８】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ種が存在するか、または存在しないかを決定する、このプロセスを行う特定の態様の１つでは、数種類の本発明のプローブを使用する。これらのプローブは、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのｒｐｏＢ遺伝子に対応する核酸の非重複領域とハイブリダイズできることが理解される。
【００６９】
有利なことには、ある１つの種類のプローブを固体支持体上に固定化し、別の種類のプローブをマーカーで標識する。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の応用例は、配列番号４および５の配列の１つに含まれる少なくとも１２ヌクレオチド単位からなる配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される１本鎖オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーとしての使用である。このプライマーは、それ自体は周知のプロセスにより、ポリメラーゼ存在下での核酸合成において（特に、ポリメラーゼの存在下で、このような合成を利用する増幅法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において）使用することができる。特に、本発明のプライマーを、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのメッセンジャーＲＮＡ配列の特異的逆転写に使用して、対応する相補的ＤＮＡ配列を得ることができる。このような逆転写はＲＴ−ＰＣＲ技術の第１段階を構成することができる。次の段階は、結果として生じる相補的ＤＮＡのＰＣＲによる増幅である。本発明のプライマーはまた、ポリメラーゼ連鎖反応により、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのｒｐｏＢ遺伝子の全ＤＮＡ配列を特異的に増幅するために使用することができる。
【００７０】
１つの特定の場合では、本発明のオリゴヌクレオチドを含むプライマーはまた、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｂ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３））のセンスまたはアンチセンス配列を含む。このようなプライマーは、転写ステップを伴う核酸増幅プロセス（例えば、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ技術（Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ Ｂ．ら，Ａｂｓｔｒａｃｔ ＭＡ １０９１，７ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＩＤＳ（１９９１）Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，Ｉｔａｌｙ））に使用することができる。
【００７１】
本発明のさらなる主題は、配列番号４および配列番号５の配列の１つに含まれる少なくとも１２の連続したヌクレオチド単位からなる配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される１本鎖オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーである。このプライマーは、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの任意の株のｒｐｏＢ遺伝子を、全てまたは部分的に配列決定するために使用することができる。特に、このヌクレオチドプライマーを、増幅核酸を配列決定するために使用することができる。それ自体は周知のプロセス（すなわち、ジデオキシヌクレオチドを使用した吸収重合（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ Ａ．Ｒ．（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４１）またはＤＮＡチップを使用した複数ハイブリダイゼーションによる配列決定から、ｒｐｏＢ遺伝子の全配列または部分配列が得られる。
【００７２】
プライマーとしての使用またはｒｐｏＢ遺伝子の配列決定には、配列番号４および配列番号５の配列を使用することが好ましい。
最後に、本発明の最後の主題は、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの株により引き起こされる感染症を治療するための遺伝子治療プローブである。このプローブは、
前記で定義したようなオリゴヌクレオチドを含む。前記細菌のメッセンジャーＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができる、この遺伝子治療プローブは、翻訳および／または転写および／または複製の現象をブロックすることができる。
【００７３】
遺伝子治療法の原理は周知であり、特に、アンチセンス鎖に対応するプローブを使用することに基づいている。このプローブとセンス鎖とのハイブリッドの形成により、遺伝子情報の解読に関与するステップの少なくとも１つを混乱させることができる。従って、遺伝子治療プローブは、スピロヘータにより引き起こされる感染症と戦うための抗細菌薬として使用することができる。
【００７４】
本発明は、実施例に分けられた以下の説明により、さらに詳細に理解されるだろう。実施例は、本発明を実施するために行われた実験に関し、単に例として示される。
実施例１：細菌の初代単離
ＡＴＣＣから入手可能なヒト線維芽細胞ＨＥＬ株を接種したｂｉｊｏｕｘチューブでの遠心分離技術により、初代単離を行った。ＨＥＬ細胞を、１０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＬ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）上で培養した。直径１２ｍｍのキャリアスライドを備えるｂｉｊｏｕｘチューブ（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ−Ｆｅｌｔｈａｍ−Ｅｎｇｌａｎｄ，３．７ｍｌ）に、約５０，０００個の細胞を含む培地１ｍｌを接種し、５％ＣＯ2下、３７℃で３日間インキュベートして、コンフル
エント細胞マットを得た。
【００７５】
研究されている心臓弁をＭＥＭ中で粉砕し、この懸濁液を使用して３個のｂｉｊｏｕｘチューブに接種した。次いで、これらのチューブを、２２℃で１時間、７００ｇで遠心分離した。次いで、上清を取り出し、マットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、５％ＣＯ2下、３７℃で培地１ｍｌと共にインキュベートした
。培養物を、ｂｉｊｏｕｘチューブ中の上清１００μｌの細胞遠心分離とＧｉｍｅｎｅｚ染色によりモニターした。この手順を、１０、２０、および３０日後に繰り返した。３０日後に、ｂｉｊｏｕｘチューブ中の上清および細胞マットを収集し、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿中のコンフルエント細胞マット上に
継代培養し（培養皿Ｉ）、５％ＣＯ2下、３７℃でインキュベートした。それか
ら６週間、毎週（Ｄ７２）、細胞マットを、細胞変性効果を探すために倒立顕微鏡で調べ、培地を新鮮な培地と交換した。培地を交換する前に、上清２００μｌを使用して、細胞遠心分離とＧｉｍｅｎｅｚ染色を行った。
【００７６】
６５日目前では、細胞変性効果は検出されなかった。７２日目に、倒立顕微鏡で細胞マットを調べると、ＨＥＬ細胞内に小さな、黒っぽい、不ぞろいな封入体を検出することができた。培養皿Ｉの上清を細胞遠心分離し、Ｇｉｍｅｎｅｚ染色した後に、いくつかの微細なバチルスを検出した。バチルスの大部分は細胞内にあり、細胞内のバチルスは細胞外のバチルスより小さく見えた。それにもかかわらず、その大部分は、Ｇｉｍｅｎｅｚ染色により、あったとしても十分には染色されず、薄青色に見えた。グラム染色後にも、非常に多くのバチルスが検出された。その大部分はグラム陽性に見えたが、いくつかは部分的に紫色になっているだけであるか、グラム陰性に見えた。これらのバチルスは、Ｚｉｅｈｌ染色後、酸によって脱色された。ＰＡＳ染色後、ＰＡＳ陽性バチルスは、前の染色より非常に多く見えた。長く微細なバチルスの大部分を細胞外で観察することができた。ＨＥＬ細胞は、ＰＡＳ陽性凝集塊と、短く微細なＰＡＳ陽性バチルスで満たされているように見えた。
【００７７】
実施例２：単離物の増殖
全増殖手順を、１０％ウシ胎児血清と２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＭＥＭ培地で培養したＨＥＬ細胞上で行い、５％ＣＯ2下、３７℃でインキュベート
した。７５日目に、培養皿Ｉ中の上清３ｍｌを使用して、前記方法により１０個のｂｉｊｏｕｘチューブに接種し、上清２ｍｌを使用して、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿
中のコンフルエント細胞マットに接種した（培養皿Ａ）。培養
皿Ｉ中の細胞と上清の残りを収集して、１０ｍｌの懸濁液を得た。次いで、この懸濁液を、５つの２ｍｌアリコートに分けた。アリコートの１つを液体窒素で凍結した。別のアリコートを、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿中のコンフル
エント細胞マットに接種した（培養皿Ｂ）。別のアリコートの細胞を、液体窒素と温水（５５℃）を使用した４回の凍結融解サイクルにより溶解し、次いで、培地１５ｍｌを含む２５ｃｍ2培養皿中のコンフルエント細胞マットに接種した（
培養皿Ｃ）。別のアリコートを、培地１５ｍｌを含むが、細胞マットが無い２５ｃｍ2培
養皿に接種した（培養皿Ｄ）。８５日目に、これら全ての培養皿および
ｂｉｊｏｕｘチューブ中の培地を、新鮮な培地と交換した。細胞を収集し、培地３０ｍｌを含む７５ｃｍ2培養皿に接種した（培養皿Ｄ２）。培地を交換する前
に、上清２００μｌを使用して細胞遠心分離とＰＡＳ染色を行い、血清学用の抗原として使用するために、上清の残りを凍結した。９５および１０５日目に、全ての培養皿およびｂｉｊｏｕｘチューブ中の培地を前記のように交換した。ＰＡＳ染色用の細胞スメアを調製するために、細胞マットの一部をかき集めた。染色により増殖効率を半定量的に評価した。ＰＡＳ陽性バチルスの存在を、以下の通りに（０、存在しない；＋、存在するが見つけにくい；＋＋、見つけ易いが、全視野には存在しない；＋＋＋、全視野で存在する）、倍率１０００倍で顕微鏡により評価した。これらの評価を盲検で行った。
【００７８】
単離物を継代培養の３０日後に見つけることができたので、増殖方法は全て有効であることが分かった（表１）。半定量的評価により、最も有効な手順がｂｉｊｏｕｘチューブ中での継代培養、上清の継代培養（培養皿Ａ）、および細胞の継代培養（培養皿Ｄ、Ｄ２）であることを観察することができた。
【００７９】
【表１】
【００８０】
実施例３：免疫蛍光法による検出
細胞内細菌を、１０５日目に免疫蛍光法によりｂｉｊｏｕｘチューブ中で直接検出した。アセトンで固定した後に、チューブをＰＢＳで２回洗浄した。３％脱脂粉乳を含むＰＢＳで１：５０に希釈した患者血清１００μｌを添加し、チューブを加湿チャンバー内で３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後に、０．２％エバンスブルーを添加したＰＢＳで１：２００に希釈したフルオレセインイソチオシアネート標識抗ヒトヤギ免疫グロブリン（Ｆｌｕｏｌｉｎｅ Ｈ，ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｃ，Ｆｒａｎｃｅ）１００μｌと共に、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後に、スライド（細胞は下方に向いている）を緩衝化グリセロール（ｐＨ８）中で固定し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡と、１００×（ＮＡ．１．４）液浸系対物レンズを備える共焦点顕微鏡（ＬＥＩＣＡ ＤＭＩＲＢＥ）を使用して倍率４００倍で調べた。
【００８１】
免疫蛍光法により調べると、ＰＡＳ染色および他の染色では細胞感染は過小評価されることが分かった。継代培養の３０日後、スライド上の細胞は全て細菌抗原で満たされている。共焦点顕微鏡による研究から細菌の細胞内位置が確かめられた。いくつかの細菌が、単離物中に、ＰＡＳ染色後に観察されるものに似た微細バチルスの形態で観察された。それにもかかわらず、免疫陽性物質の大部分はより大きな封入体と一致し、この封入体では細菌を個別化することができない。免疫陽性物質は細胞核で検出されない。
【００８２】
実施例４：電子顕微鏡
１０５日目に、培養皿Ｄ２から収集された細胞を含む溶液３００μｌを、電子顕微鏡による研究のために調製した。細胞を、０．１Ｍスクロースを含む０．１Ｍカコジル酸緩衝液に溶かした２．５％グルタルアルデヒド溶液で、４℃で１時間固定した。細胞を同じ緩衝液で一晩洗浄し、次いで、０．１Ｍカコジル酸緩衝液に溶かした四酸化オスミウムで、室温で１時間固定した。漸増濃度のエタノール溶液での連続洗浄により、脱水を行った。次いで、細胞を、Ｅｐｏｎ８１２のブロックに包埋した。次いで、ＬＫＢ Ｕｌｔｒａｔｏｍｅ ＩＩＩミクロトームを使用してブロックから薄切片を切り、その後、メタノールに溶かした飽和酢酸ウラニル溶液とクエン酸鉛水溶液で染色した後、Ｊｃｏｌ ＪＥＭ １２００
ＥＸ電子顕微鏡で調べた。
【００８３】
電子顕微鏡研究により、ＰＡＳ陽性封入体と免疫陽性物質は、無傷の細菌または分解している細菌と一致することが確かめられた。これらの細菌の細胞質膜は、電子密度が高い２つの層からなる。薄い細菌壁は、所定の位置で、３層の外観を示す外側偽膜で覆われている。分裂過程にある細菌が観察された。
【００８４】
実施例５：ウィップル病の原因である細菌に対するマウスポリクローナル抗体の作製 Ｂａｌｂ Ｃ系統のマウスの腹腔内に、ウィップル病の原因である１０4個の
細菌を含む上清０．５ｍｌを注射した。次いで、１、２、および３週間後に、このマウスに同じ上清０．５ｍｌを注射した。この最後の接種の１週間後に、このマウスから血を出した。免疫蛍光法を１回、免疫ペルオキシダーゼ法を１回行うことにより、血清を、一方では、ウィップル病の原因である細菌の培養物に対して、他方では、ウィップル病に罹患している患者の弁に対して試験した。明らかにする抗体は、フルオレセインまたは免疫ペルオキシダーゼで標識した抗マウス抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈにより供給）であった。
【００８５】
細菌を、細胞内で視覚化することができた。従って、さらに、本特許出願は、ウィップル病の原因である細菌を、生検材料および様々なスワブ（例えば、心臓弁、消化器生検材料、またはウィップル病の原因である細菌に感染していると思われる他の任意の器官の生検材料）中で直接検出することに関する。
【００８６】
実施例６：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ Ｔｗｉｓｔ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ株の産物に対するモノクローナル抗体の作製および使用、ならびに抗原の決定
装置と方法
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ株。ハイブリドーマを作製およびスクリーニングし、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の特異性を試験するために使用するＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの株は、番号Ｉ−２２０２でＣＮＣＭに寄託されたＴｗｉｓｔ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ株である。Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉを、前記の培養条件下で、ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＬ）上で培養した。７５日目に、感染細胞を１つのフラスコから採取し、４０００ｇで１０分間、遠心分離した。次いで、遠心分離残渣を、５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。この懸濁液０．５ｍｌを、それぞれのマウスに接種した。細菌をまたＲｅｎｏｇｒａｆｉｎ勾配下で精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、脱イオン水に、マイクロ免疫蛍光法（ＭＩＦ）の場合、ＰＢＳに再懸濁した。
【００８７】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の作製。ＰＢＳに溶かしたＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ＴＷＩＳＴ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ 番号Ｉ−２２０２の懸濁液０．５ｍｌを腹腔内注射することにより、６週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに７日間隔で３回接種した。３回注射の最後から１週間後に、静脈内追加抗原量の、ＰＢＳに溶かしたＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉの懸濁液０．１ｍｌを、マウスに与えた。３日後に、免疫化マウスの脾臓を取り出し、５０％ポリエチレングリコール（分子量：１３００〜１６００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を使用して、脾細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させた（１０：１）。融合細胞を、２０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）とヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を添加したハイブリドーマ培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、５％ＣＯ2に
富む加湿雰囲気中、３７℃で培養した。
【００８８】
上清中の抗Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ抗体の存在をＭＩＦにより検出した。陽性ハイブリドーマを、腹水産生のために継代培養した。ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３マウス抗血清（Ｓｉｇｍａ）を含むＩｍｍｕｎｏ Ｔｙｐｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ）を使用して、Ｍａｂのアイソタイプを決定した。Ｍａｂの特異性をウエスタンブロッティングにより試験した。マウスに、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン；Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌを腹腔内注射した１週間後に、０．５ｍｌのＰＢＳに溶かした３×１０6個ハイブリドーマの懸濁液を腹腔内注射することにより、
腹水抗体を作製した。
【００８９】
マイクロ免疫蛍光法（ＭＩＦ）。ＭＩＦを使用して、ハイブリドーマをスクリーニングし、Ｍａｂの特異性を決定した。Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ培養物からなる抗原を、細く尖った棒（ｑｕｉｌｌ）を使用して２４ウェルスライド上に付着させた。メタノールを使用して室温で１０分間固定した後に、Ｍａｂを付着させ、加湿チャンバ内で３７℃で３０分間インキュベートした。その後、スライドをＰＢＳ、次いで、蒸留水で２×５分間洗浄し、風乾させ、次いで、０．２％エバンスブルーを含むＰＢＳで１／２００に希釈したフルオレセイン結合抗マウスＩｇＭヤギ抗体およびフルオレセイン結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｃ，Ｆｒａｎｃｅ）と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後に、スライドをＦｌｕｏｒｅｐ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して固定し、次いで、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ２０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、倍率４００×で読み取った。免疫化マウスの血清を陽性対照として使用し、健康なマウスの血清を陰性対照として使用した。
【００９０】
ウィップル病に罹患している患者の血清中の抗Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ抗体を検出するために、ＭＩＦを、Ｌａｂｔｅｃｈスライド（Ｒａｏｕｌｔ Ｄ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０００）上で行った。血清を、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、および１：８００まで希釈した。
【００９１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを、１２％ポリアクリルアミド分離ゲルおよび５％トランスファーゲルを使用することで改良されたＬａｅｍｍｌｉの方法で行った。緩衝液（０．０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸塩（ｐＨ８．０）、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー）中に４ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含むＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ懸濁液を、１００℃で５分間、加熱した。溶解した抗原を、電気泳動槽（Ｍｉｎｉ ＰｒｏｔｅｉｎＩＩ：Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｒｉｃｈ
ｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ）中で、８〜１０ｍＡの一定強度で３〜４時間のゲル電気泳動により分離した（泳動用緩衝液：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）。タンパク質サイズを、ペプチド量マーカー（Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ；Ｂｉｏ Ｒａｄ）との比較により決定した。このように分離された抗原を、ウエスタンブロッティング槽（Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ；Ｂｉｏ Ｒａｄ）中、５０Ｖの電流で、４℃で１時間、転写緩衝液（２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）を使用してニトロセルロース膜（０．４５μｍ孔）に移した。転写した後、非特異的結合部位をブロックするために、ニトロセルロース膜を５％脱脂粉乳溶液と一晩インキュベートした。その後、膜を３回、ＰＢＳで洗浄し、次いで、風乾させた。次いで、膜を、３％乳を添加したＰＢＳで１：４に希釈したハイブリドーマ上清または１：１００に希釈した患者血清と室温で１時間インキュベートし、次いで、前記のように洗浄した。その後、膜を、３％脱脂粉乳を添加したＰＢＳで１：５００に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（重鎖および軽鎖：ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｓｅａｒｃｈ）と室温で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。特異的抗体の存在を、基質４−クロロ−１−ナフトールを使用してペルオキシダーゼ活性の存在により明らかにした。
【００９２】
Ｍａｂに対する盲検法。モノクローナル抗体の特異性を、１９種類の細菌：１２種類のＢａｒｔｏｎｅｌｌａ（すなわち、５種類のＢ．ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｂ．ｖｉｎｓｏｎｉｉ Ｂａｋｅｒ、Ｂ．ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ、Ｂ．ｇｒａｈａｍｉｉ、Ｂ．ｄｏｓｈｉａｅ、およびＢ．ｔａｙｌｏｒｉｉ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｎｉｎｅ
Ｍｉｌｅと、本発明者らの研究室において診療試料から単離された様々な６種類の株（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＮＦ群、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｍａｙｅｒｉｉ）に対してＭＩＦにより盲検で評価した。ＰＢＳに懸濁し、ウェルを備えるスライドに付着させた後に、Ｍａｂと細菌との反応性を、１：１００に希釈した腹水を使用して前記のようにＭＩＦにより評価した。
【００９３】
患者。１５人の患者を試験した。８人の患者は、組織学および／または消化器生検材料のＰＣＲによるＴ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ増幅により診断された、消化系だけにあるウィップル病に罹患している。７人の患者は、弁生検材料のＰＣＲにより診断された、Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにより引き起こされた心内膜炎に罹患している。
【００９４】
マウスおよびウサギ。どの抗原が抗体反応により認識されるかを決定するために、５匹のマウスと１匹のウサギにＴ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ懸濁液を接種した。
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィール（図１）。Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのＳＤＳ−ＰＡＧＥから、７つの主要バンドが１０、２０、８０、１２０、１５０、１７０、および２００ｋＤａにあることがさらに詳細に分かった。
【００９５】
Ｍａｂの作製。４種類のハイブリドーマの上清をＭＩＦにより試験した。４種類のハイブリドーマが、Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉに特異的であることが分かった。１種類のハイブリドーマを、パスツール研究所のＣＮＣＭ（２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，ＰＡＲＩＳ ７５７２４）に番号Ｉ−２４１１および識別参照ＴＷ １７Ｇ２で寄託した。
【００９６】
患者に対して行った血清学試験。１５人の患者のうち１３人（８６．７％）が陽性の血清学試験結果（ＩｇＭレベル＞１：１００）を示した。ウスタンブロッティングで観察さ
れた抗原プロフィールから、ＩｇＧに関する２００ｋＤａの主要バンドを含む、いくつかのバンドと反応性があることが分かった（図２）。１００、６０、５０、および３５ｋＤａのタンパク質に対する反応性を含む、いくつかのタンパク質プロフィールをＩｇＭについて同定した（図３）。
【００９７】
免疫化マウスおよび免疫化ウサギに対して行った血清学試験。免疫化マウスおよび免疫化ウサギは、陽性の血清学試験結果（ＩｇＭレベル＞１：１００）を示した。ウエスタンブロッティングで観察された抗原プロフィールから、マウスとウサギとで反応性が異なり、患者で観察されたものとは異なることが分かった。他方で、主要な反応性が２００ｋＤａのバンドで観察された。
【００９８】
Ｍａｂの特徴付け（図２）。４種類のＭａｂは、２００ｋＤａ抗原に特異的な反応性を示した。これは、患者、マウス、およびウサギのウエスタンブロットで既に証明されている。これらのＭａｂは全てＩｇＭとして同定された。認識される抗原は、プロテイナーゼＫの作用により破壊された。このことから、抗原はタンパク質であることが分かった。
【００９９】
Ｍａｂに対する盲検法。４種類のハイブリドーマの腹水は、Ｔ．ｗｈｉｐｐｅｌｉｉのみと反応した。
実施例７：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の配列
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の配列を、コンセンサスプライマーを使用する酵素的増幅と直接自動配列決定により決定した。
【０１００】
使用したコンセンサスプライマーの配列は、以下の通りであった。
配列番号１＝５’−ＴＩＡ ＴＧＧ ＧＩＩ ＣＩＡ ＡＩＡ ＴＧＣ Ａ−３’
配列番号２＝５’−ＧＣＣ ＣＡＩ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＴＩ ＴＣＩ ＣＣ−３’（Ｉ＝イノシン）
であった。
【０１０１】
機械的溶解および化学的溶解（Ｆａｓｔ−Ｐｒｅｐ Ｂｉｏ １０１）により、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ Ｔｗｉｓｔ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ株ＣＮＣＭ Ｉ−２２０２から抽出したＤＮＡを、以下の実験条件：３５回の増幅サイクル（各サイクルが、９４℃３０秒のＤＮＡ変性、５０℃３０秒の初回プライマーハイブリダイゼーション（１サイクル当たり−０．１℃の勾配を含む）、次いで、７２℃６０秒の伸長からなる）に組み込んだ。
【０１０２】
配列番号１および配列番号２の配列を、以下の細菌の以下のアクセッション番号でＧｅｎｂａｎｋに寄託されたペプチド配列のアラインメントにより決定した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｌ４３５９３、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ，ＡＦ１７１０７０、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ，ＡＥ００１１４４、Ｂｕｃｈｎｅｒａ ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ，Ｚ１１９１３、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＥ００１５９３、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，ＡＥ００１３０４、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ，Ｕ８６６８８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｕ７６２２２、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｕ３２７３３、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｅ０００６２５、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ，ＡＦ０８７８１２、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ，Ｚ１４３１４、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ，Ｕ２４４９４、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｌ２７９８９、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ，Ｌ３８４０２、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ，Ｕ３９７１５、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｌａｅ，ＡＥ００００３０、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ，Ｚ５４３５３、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ，Ｘ１５８４９、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，ＡＦ０３４５３１、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ，Ｐ７７９４１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｘ０４６４２、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｃｉｔｒｉ，Ｕ２５８１５、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｕ９７００６２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．，Ｄ９０９０５、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｘ７２６９５、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ，ＡＥ００１２０５、およびＨｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ Ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓ ａｇｅｎｔ，ＡＦ２３７４１４。
【０１０３】
配列番号１および配列番号２を配列、これらの配列がＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉにも存在すると仮定して、最も保存されている配列を選択することにより選択した。
【０１０４】
プライマー配列番号１および配列番号２を使用して得られた、配列番号３に対応する、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２４３０７２） ｒｐｏＢ遺伝子の部分配列は、以下の通りである。
ＢＡＳＥ １５７ａ １１７ｃ １７６ｇ １５０ｔ その他１２
実施例８：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の特異的検出
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉに特異的な以下の配列：
配列番号４：５’−ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＴＴ−３’
配列番号５：５’−ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＡＡ−３’
を、フラグメント配列番号３から選択した。
【０１０５】
選択した配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに列挙された前記２８種類の細菌のｒｐｏＢ遺伝子の既知配列と比較して、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉに特異的な配列である。
【０１０６】
実施例９：Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子の特異的増幅
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ ｒｐｏＢ遺伝子を、３５回の増幅サイクル（各サイクルが、９４℃３０秒の変性段階、５２℃３０秒のプライマー配列番号４と配列番号５のハイブリダイゼーション段階、７２℃９０秒の伸長段階からなる）を使用するＰＣＲ技術により増幅した。増幅産物を、臭化エチジウム染色後に視覚化した（図４）。
【０１０７】
対照細菌（すなわち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓｃａｖｉａｒｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｅｒｄｉｍｉｌｉｓ、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）は検出されなかった。このことから、試験したプライマーの特異性が証明された。
【０１０８】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉとの遺伝子類似性のために、または予想される汚染菌としてＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ検出のために提出された臨床スワブに存在するために、以下のアクセッション番号でＧｅｎｂａｎｋに寄託された、これらの対照種のｒｐｏＢ配列：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ＡＴＣＣ２５２９１，ＡＦ０６０３３６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｕ１２２０５、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２，Ｕ７７４３６を選択した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌が再現可能に得られると共に経時的に増殖するように、単離され、かつ培養において樹立された、ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌に対する特異的抗体。
【請求項３】
動物起源のポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌により引き起こされる感染に関連する病気のインビトロ診断のための、請求項１に記載の細菌の使用方法。
【請求項６】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌により引き起こされる感染に関連する病気のインビトロ診断のための、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の抗体の使用方法。
【請求項７】
ウィップル病のインビトロ血清学的診断方法であって、本質的に、請求項１に記載の細菌を認識するヒト免疫グロブリンに特異的な抗体と、請求項１に記載の細菌を認識する前記ヒト免疫グロブリンとの免疫学的反応を検出する工程から成る方法。
【請求項８】
請求項１に記載の細菌を含む溶液を、固体支持体中に、または固体支持体上に付着させるステップと、
試験血清または生物学的液体を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入するステップと、
前記細菌を認識するヒト免疫グロブリンに特異的な標識抗体の溶液を、前記固体支持体中に、または前記固体支持体上に導入するステップと、
インキュベーション期間を観察するステップと、
前記固体支持体を洗浄するステップと、
免疫学的反応を検出するステップとを含む、請求項７に記載の血清学的診断方法。
【請求項９】
本質的に、以下の成分：
請求項１に記載の細菌を含む溶液、
請求項２〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体を含む溶液、および
請求項１に記載の細菌を認識するヒト免疫グロブリンに特異的な少なくとも１つの抗体を含む溶液
のうちの少なくともいずれか１つを含む、請求項６乃至８のいずれか一項に記載の方法によるウィップル病のインビトロ検出のためのキット。
【請求項１０】
少なくとも１つの標識特異的抗体を含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
培地と、ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌とを含む培養物であって、細菌が、該培地において再現可能かつ経時的に増殖するように、単離され、かつ培地の細胞中で培養において樹立された、ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌である、培養物。
【請求項１２】
前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である請求項１１に記載の培養物。
【請求項１３】
前記細菌がパスツール研究所のＣＮＣＭに番号Ｉ−２２０２で寄託されていることを特徴とする請求項１１に記載の培養物。
【請求項１４】
前記細胞の分裂時間が前記細菌の倍化時間よりも長い請求項１１に記載の培養物。
【請求項１５】
前記細胞が少なくとも７２日目間増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出される請求項１１に記載の培養物。
【請求項１６】
ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌を培養する方法であって、
細菌が、培地中において再現可能かつ経時的に増殖するように、細菌を単離し、かつ培地の細胞中で培養において樹立させる工程からなる方法。
【請求項１７】
前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌がパスツール研究所のＣＮＣＭに番号Ｉ−２２０２で寄託されていることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞の分裂時間が前記細菌の倍化時間よりも長い請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞を培地中少なくとも７２日間維持する工程をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が少なくとも７２日目間増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出される請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の細菌を培養する方法であって、培地中において再現可能かつ経時的に増殖するように、請求項１に記載の細菌を単離し、かつ樹立させる工程からなり、前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である方法。
【請求項２３】
請求項１１に記載の培養物を得る方法であって、前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である方法。
【請求項２４】
培地とＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉウィップル病の原因である細菌とを含む培養物であって、
前記細菌は再現可能、かつ少なくとも７２日目間培地中で増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出される培養物。
【請求項２５】
前記細胞の分裂時間が前記細菌の倍化時間よりも長い請求項２４に記載の培養物。
【請求項２６】
前記細菌が、前記培地中での連続的な継代培養により、細菌が再現可能に得られ、かつ経時的に増殖する請求項２４に記載の培養物。
【請求項２７】
前記細菌は、細胞の分裂時間が細菌の倍化時間よりも長い細胞中に存在し、該細胞は前記培地中に存在する請求項２４に記載の培養物。
【請求項２８】
培地とＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉウィップル病の原因である細菌とを含む培養物であって、
前記細菌は単離され、かつ前記培地中の細胞内で樹立され、
細胞の希釈効果が生じるように細菌の増殖に比べて細胞が早く増殖できないように細胞が選択される培養物。
【請求項２９】
ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌を培養する方法であって、
細菌が、培地中において再現可能かつ少なくとも７２日目間経時的に増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出されるように、細菌を単離し、かつ培地の細胞中で培養において樹立させる工程からなる方法。
【請求項３０】
前記細菌の倍化時間は１８日であり、前記細菌は１８日よりも長い分裂時間を有する細胞中に存在し、該細胞は培地中に存在する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌は培地中の細胞内に存在する請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞の分裂時間は前記細菌の倍化時間よりも長い請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記倍化時間は１８日である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は繊維芽細胞である請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記樹立させる工程は、前記培地中での連続的な継代培養により、細菌を樹立させることを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
細菌が再現可能に得られると共に経時的に増殖するように、単離され、かつ培養において樹立された、ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌に対する特異的抗体。
【請求項３】
動物起源のポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌により引き起こされる感染に関連する病気のインビトロ診断のための、請求項１に記載の細菌の使用方法。
【請求項６】
Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌により引き起こされる感染に関連する病気のインビトロ診断のための、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の抗体の使用方法。
【請求項７】
ウィップル病のインビトロ血清学的診断方法であって、本質的に、請求項１に記載の細菌を認識するヒト免疫グロブリンに特異的な抗体と、請求項１に記載の細菌を認識する前記ヒト免疫グロブリンとの免疫学的反応を検出する工程から成る方法。
【請求項８】
請求項１に記載の細菌を含む溶液を、固体支持体中に、または固体支持体上に付着させるステップと、
試験血清または生物学的液体を、前記支持体中に、または前記支持体上に導入するステップと、
前記細菌を認識するヒト免疫グロブリンに特異的な標識抗体の溶液を、前記固体支持体中に、または前記固体支持体上に導入するステップと、
インキュベーション期間を観察するステップと、
前記固体支持体を洗浄するステップと、
免疫学的反応を検出するステップとを含む、請求項７に記載の血清学的診断方法。
【請求項９】
本質的に、以下の成分：
請求項１に記載の細菌を含む溶液、
請求項２〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体を含む溶液、および
請求項１に記載の細菌を認識するヒト免疫グロブリンに特異的な少なくとも１つの抗体を含む溶液
のうちの少なくともいずれか１つを含む、請求項６乃至８のいずれか一項に記載の方法によるウィップル病のインビトロ検出のためのキット。
【請求項１０】
少なくとも１つの標識特異的抗体を含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
培地と、ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌とを含む培養物であって、細菌が、該培地において再現可能かつ経時的に増殖するように、単離され、かつ培地の細胞中で培養において樹立された、ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌である、培養物。
【請求項１２】
前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である請求項１１に記載の培養物。
【請求項１３】
前記細菌がパスツール研究所のＣＮＣＭに番号Ｉ−２２０２で寄託されていることを特徴とする請求項１１に記載の培養物。
【請求項１４】
前記細胞の分裂時間が前記細菌の倍化時間よりも長い請求項１１に記載の培養物。
【請求項１５】
前記細胞が少なくとも７２日目間増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出される請求項１１に記載の培養物。
【請求項１６】
ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌を培養する方法であって、
細菌が、培地中において再現可能かつ経時的に増殖するように、細菌を単離し、かつ培地の細胞中で培養において樹立させる工程からなる方法。
【請求項１７】
前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌がパスツール研究所のＣＮＣＭに番号Ｉ−２２０２で寄託されていることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞の分裂時間が前記細菌の倍化時間よりも長い請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞を培地中少なくとも７２日間維持する工程をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が少なくとも７２日目間増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出される請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の細菌を培養する方法であって、培地中において再現可能かつ経時的に増殖するように、請求項１に記載の細菌を単離し、かつ樹立させる工程からなり、前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である方法。
【請求項２３】
請求項１１に記載の培養物を得る方法であって、前記培地がＭＥＭを主成分とする培地であり、前記細胞がヒト線維芽細胞である方法。
【請求項２４】
培地とＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉウィップル病の原因である細菌とを含む培養物であって、
前記細菌は再現可能、かつ少なくとも７２日目間培地中で増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出される培養物。
【請求項２５】
前記細胞の分裂時間が前記細菌の倍化時間よりも長い請求項２４に記載の培養物。
【請求項２６】
前記細菌が、前記培地中での連続的な継代培養により、細菌が再現可能に得られ、かつ経時的に増殖する請求項２４に記載の培養物。
【請求項２７】
前記細菌は、細胞の分裂時間が細菌の倍化時間よりも長い細胞中に存在し、該細胞は前記培地中に存在する請求項２４に記載の培養物。
【請求項２８】
培地とＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉウィップル病の原因である細菌とを含む培養物であって、
前記細菌は単離され、かつ前記培地中の細胞内で樹立され、
細胞の希釈効果が生じるように細菌の増殖に比べて細胞が早く増殖できないように細胞が選択される培養物。
【請求項２９】
ウィップル病の原因であるＴｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ細菌を培養する方法であって、
細菌が、培地中において再現可能かつ少なくとも７２日目間経時的に増殖可能であり、これが倒立顕微鏡で検出されるように、細菌を単離し、かつ培地の細胞中で培養において樹立させる工程からなる方法。
【請求項３０】
前記細菌の倍化時間は１８日であり、前記細菌は１８日よりも長い分裂時間を有する細胞中に存在し、該細胞は培地中に存在する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌は培地中の細胞内に存在する請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞の分裂時間は前記細菌の倍化時間よりも長い請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記倍化時間は１８日である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は繊維芽細胞である請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記樹立させる工程は、前記培地中での連続的な継代培養により、細菌を樹立させることを含む請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１６０８０９（Ｐ２０１１−１６０８０９Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１１７９２（Ｐ２０１１−１１１７９２）
【出願日】平成２３年５月１８日（２０１１．５．１８）
【分割の表示】特願２０００−６０８７２１（Ｐ２０００−６０８７２１）の分割
【原出願日】平成１２年３月２４日（２０００．３．２４）
【出願人】（５０４３９４４５６）
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＴＩＳＶＡＬＯＲ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１８日（２０１１．５．１８）
【分割の表示】特願２０００−６０８７２１（Ｐ２０００−６０８７２１）の分割
【原出願日】平成１２年３月２４日（２０００．３．２４）
【出願人】（５０４３９４４５６）
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＴＩＳＶＡＬＯＲ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ
【Ｆターム（参考）】
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