ウイルスを含む組成物、およびウイルス調製物を濃縮するための方法
【課題】生きた組換えウイルスが治療用導入遺伝子を保有する場合にそれらを安定に保存し得る処方物を開発および調製すること、ならびに−８０℃よりも上の温度で長期間、ウイルス調製物を安定化し得る処方物、約７〜約８．５の範囲のｐＨを長期の間維持し得るウイルス含有組成物、および比較的高濃度のウイルスを厳しい条件下で安定化させる処方物を開発すること。
【解決手段】約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む、組成物。
【解決手段】約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、有意に改善された安定性を有する、ウイルスを含む組成物に、特にウイルスベクターを含む組成物に関する。本発明の組成物は、保存の間にウイルスの安定性を維持するのに有用であり、そして本発明のウイルス含有組成物は、治療的用途（例えば、遺伝子治療）に特に有用である。ウイルス調製物を濃縮および精製するための新規な方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
（ＩＩ．背景）
ウイルスは、治療的用途（例えば、ワクチン接種および遺伝子治療）のためにますます重要になってきた。そして、容易に保存および輸送され得るが、なお十分な安全性および効力を保持する、安定なウイルス含有組成物を開発および調製する必要がある。特に、遺伝子治療におけるウイルスベクターの広範囲な使用を考慮すると、生きた組換えウイルスが治療用導入遺伝子を保有する場合にそれらを安定に保存し得る処方物を開発および調製することが重要である。
【０００３】
さらに、−８０℃よりも上の温度で長期間、ウイルス調製物を安定化し得る処方物についての重要な必要が存在する。ウイルス含有組成物は、通常、−８０℃での保存を必要とし、そして標準的な冷蔵温度（例えば、２℃〜８℃、またはそれより高温）で実質的な期間の間、保存できない。この制限は、保存に対してだけでなく、処理、分配、および広範な臨床的用途に対してもまた深刻な障害を表す。
【０００４】
冷蔵温度に供されているにもかかわらず、そして凍結／融解、特に大規模での産生、取り扱い、または分配に関連して起こり得る緩慢な速度の凍結／融解のような苛酷な条件に曝されているにもかかわらず、約７〜約８．５の範囲のｐＨを長期の間維持し得るウイルス含有組成物を開発する必要性もまた存在する。ｐＨの維持は、ウイルス調製物に関して重要である。なぜなら、７．０未満のｐＨおよび８．５を超えるｐＨでは、生きたウイルス粒子は、物理的および生物学的な不安定性に起因して傷付きやすく、生存能力を失うからである。
【０００５】
さらなる問題は、ウイルス濃度の増加に関連する。特に、高いウイルス濃度は、ウイルスの不安定性に有意に寄与する。しかし、ウイルスおよびウイルスベクターの濃度がますます高くなることが、治療的用途のために必要とされる。それゆえ、比較的高濃度のウイルスを、特に上記で言及した厳しい条件下で安定化させる処方物を開発する重要な必要性が存在する。そしてさらに、既存のウイルス調製物を濃縮して安定な調製物をより高い濃度レベルで達成する新規な方法を開発する具体的な必要性が存在する。より高いウイルス濃度に関連した不安定性の問題は、既存のウイルス調製物を濃縮しようと試みる場合、有意に悪化する。このことは部分的に、既存のウイルス調製物の濃度を増加させる努力の間に生じるさらなる機械的剪断力に起因する。ウイルスの安定性を実質的に損なわずにウイルス調製物を濃縮する方法を見出すことができれば、任意の所望の濃度での臨床的投薬量が容易に調製され得（たとえ、より低い濃度を有する材料から出発した場合であっても）、そして重要なことには、ウイルスを濃縮する能力は、種々の処理工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）の間で有意により高い処理量を可能にすることにより、精製プロセスの間の問題のあるネックおよび他の規模拡大の問題を排除し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、上記の目的を達成するための材料および方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１） 約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む、組成物。
（項目２） 上記ウイルスが組換えウイルスである、項目１に記載の組成物。
（項目３） 上記ポリヒドロキシ炭化水素がグリセロールである、項目１に記載の組成物。
（項目４） 二糖をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目５） 上記組成物が、約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のトロメタミンを含む緩衝液系を含む、項目１に記載の組成物。
（項目６） 約０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度の二価金属塩をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目７） 水を含む希釈剤をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目８） 上記ウイルスが、約１×１０9〜１×１０13粒子／ｍＬの濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目９） 上記ウイルスが、アデノウイルスである、項目１に記載の組成物。
（項目１０） 上記組換えウイルスが、野生型ｐ５３遺伝子を含む、項目２に記載の組成物。
（項目１１） 上記組換えウイルスが、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３である、項目１０に記載の組成物。
（項目１２） 上記ウイルスがアデノウイルスであり；上記ポリヒドロキシ炭化水素がグリセロールであり；上記緩衝液系が、２０℃〜２７℃の範囲の温度で約７．３〜約７．９の範囲のｐＨを維持し；そして上記組成物が二糖をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１３） 上記アデノウイルスがＡ／Ｃ／Ｎ／５３であり；上記二糖がスクロースであり；上記緩衝液系が一塩基性リン酸ナトリウム二水和物およびトロメタミンを含み；そして上記組成物が二価金属塩および水をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１４） ウイルス調製物を濃縮するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ポリヒドロキシ炭化水素を、約２０％以上の最終ポリヒドロキシ炭化水素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程；および
（ｂ）該ウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、該ウイルスの濃度を、該ウイルスを維持しながら、フィルターを介して希釈剤が該ウイルス調製物から除去されるように該調製物に圧力をかけることにより増加させる、工程、
を包含する、方法。
（項目１５） 上記濾過プロセスが限外濾過を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６） 上記濾過プロセスが接線流濾過を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７） ウイルス調製物を精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）該ウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで、ウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウイルス調製産物として溶出される、工程；
（ｂ）該調製物中のポリヒドロキシ炭化水素の濃度が約２５％以上のレベルに達するように、工程（ａ）のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加する工程；および
（ｃ）該ウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤が該ウイルス調製物から除去されるように該調製物に圧力をかけることによって、工程（ｂ）のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の濃縮されたウイルス調製産物を１以上のさらなる処理工程に供する工程、
を包含する、方法。
（項目１８） 上記ウイルスが組換えウイルスである、項目１４に記載の方法。
（項目１９） 上記ウイルスが遺伝子治療で使用するための治療用導入遺伝子を保有する組換えウイルスである、項目１４に記載の方法。
（項目２０） さらなる処理工程がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２１） 上記工程（ｃ）のプロセスが、接線流濾過を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２２） 上記工程（ｃ）のプロセスが、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ濾過系を含む装置を用いて実施される、項目２１に記載の方法。
（項目２３） 項目１４に記載の方法により濃縮された、ウイルス調製物。
（項目２４） 項目１７に記載の方法により精製された、ウイルス調製物。
（項目２５） ウイルス調製物を濃縮するための方法であって、以下の工程：
（ａ）３５％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第１層を含む組成物を遠心分離する工程であって、該第１層が、５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第２層に重層され、該第２層が、ウイルスを含む第３層に重層される、工程；ならびに
（ｂ）該ウイルスを該第１層から回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２６） 上記組成物の貯蔵の間の微粒子形成の防止のために、該組成物をさらなる攪拌処理工程に供し、続いて微細濾過に供する、項目１に記載の組成物。
（項目２７） 上記組成物の貯蔵の間の微粒子形成の防止のために、該組成物を１以上の凍結／融解サイクルに供し、続いて攪拌に供し、次いで微細濾過に供する、項目１に記載の組成物。
（項目２８） 約０．６〜１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度の一価の金属塩をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
【０００８】
（ＩＩＩ．発明の要旨）
本発明は、約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む安定な組成物を提供することにより、上記の必要性を満たす。
【０００９】
広範囲の所望の濃度の臨床的投薬量を容易に選択および調製することを可能にする、既存のウイルス調製物を濃縮する新規な方法もまた提供される。ウイルス調製物を濃縮する好ましい方法は、以下の工程を含む：
（ａ）ポリヒドロキシ炭化水素を、約２０％以上の最終ポリヒドロキシ炭化水素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程；および
（ｂ）このウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、このウイルスの濃度が、このウイルスを維持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることにより増加する、工程。
【００１０】
本明細書中では、以下の工程を含む、ウイルス調製物を濃縮するための方法もまた提供される：
（ａ）３５％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第１層を含む組成物を遠心分離する工程であって、この第１層が、５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第２層に重層され、この第２層が、ウイルスを含む第３層に重層される、工程；ならびに
（ｂ）このウイルスをこの第１層から回収する工程。
【００１１】
さらに、本発明者らは、本発明者らの、ウイルス濃度を増加させる新規な方法が、さらなる処理を増強する（例えば、処理工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）の間に有意により高い処理量を可能にすることにより、続いての精製の間に問題のなるネックを低減または排除することによる）というさらなる利点を有することを見出した。従って、好ましい実施態様では、本発明に従ってウイルス調製物を濃縮する方法は、続く精製工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）をさらに含む。このことについて、本発明の方法は、サイズ排除クロマトグラフィーの工程がイオン交換クロマトグラフィーに続いて行われ、そしてウイルス調製物が（本発明に従って）イオン交換クロマトグラフィーの後だがサイズ排除クロマトグラフィーの前に濃縮される場合に特に有用である。陰イオン交換クロマトグラフィーから得られたウイルス画分は、例えば、代表的に、高レベルの塩、およびおそらく濃縮手順の間にウイルス安定性をさらに損なう他の不純物を含む。従って、特に好ましい実施態様では、本発明は、以下の工程を含むウイルス調製物を精製する方法を提供する：
（ａ）このウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで、このウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウイルス調製産物として溶出される、工程；
（ｂ）この調製物中のポリヒドロキシ炭化水素の最終濃度が約２５％以上に達するように、工程（ａ）のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加する工程；および
（ｃ）このウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることによって、工程（ｂ）のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の濃縮されたウイルス調製産物を１以上のさらなる処理工程に供する工程。
【００１２】
本発明はまた、上記の方法によって濃縮および／または精製されたウイルス調製物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（ＩＶ．詳細な説明）
上記のように、本出願は、新規なウイルス含有組成物、ならびにウイルス含有組成物を濃縮および精製する新規な方法を開示する。
【００１４】
組成物に関して、本発明者らは、増強された安定性でウイルス調製物を保存し得る新規な緩衝化された処方物を開発した。特に、この処方物は、ウイルス調製物を−８０℃よりもずっと高い温度で安定化し得る。なおさらに重要なことには、本発明の組成物は、代表的な冷蔵温度で（例えば、２℃〜８℃以上で）でかなりの期間、好ましくは数ヶ月以上の間安定である。これは、重要な利点である。なぜなら、上記のように、臨床的必要性を満たすために、ウイルス調製物を保存および輸送の間に−８０℃で凍結して保存することは非実用的であるからである。
【００１５】
本発明の組成物の１つの重要な特徴は、ポリヒドロキシ炭化水素の添加である。本明細書中で使用される場合、ポリヒドロキシ炭化水素とは、２個以上（好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個）の水酸基で置換された、分枝状、直鎖状、または環式の化合物を意味する。本発明に使用するためのポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは２〜７個の炭素原子を有する、ポリヒドロキシ置換アルキル化合物（分枝状または非分枝状）であり、そして例えば、グリセロール、ソルビトール、およびポリプロパノールを含み得る。グリセロールは、特に好ましい。以下に提供されるデータにより示されるように、本発明者らは、グリセロールが、標準的な冷蔵条件下でさえ、驚くほど高レベルの安定性を長期の間可能にすることを見出した。
【００１６】
本発明の組成物について有効量のポリヒドロキシ炭化水素は、特にウイルスが遺伝子治療において使用される導入遺伝子を含む場合、さらなる使用のためのウイルスの有効性に有害な効果を及ぼさずに、本発明の処方物中のウイルスを、安定化し得る量である。ポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの最終濃度で存在する。より狭い範囲は、８０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬであり得る。１種より多くのポリヒドロキシ炭化水素を用いて、本発明の組成物中での所望の合計量のポリヒドロキシ炭化水素を達成し得る。
【００１７】
本発明の組成物中のポリヒドロキシ炭化水素は、必要に応じて、アルデヒド基を含み得る。特に、ポリヒドロキシ炭化水素は、二糖（例えば、スクロース）であり得る。さらに、たとえ、組成物のために選択されたポリヒドロキシ炭化水素がアルデヒド基を含まなくとも、組成物はさらに二糖（例えば、スクロース）を安定剤および張度調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ−ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として含み得る。本発明の組成物がすでに適切なポリヒドロキシ炭化水素（例えば、グリセロール）を含み、そして二糖がさらなる安定剤または張度調節剤として好ましい実施態様において用いられる場合、この二糖は、好ましくは、５ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬの範囲で、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬで存在し、そして好ましくはこの二糖はスクロースである。
【００１８】
薬学的に受容可能な二価金属塩安定剤（例えば、マグネシウム塩、亜鉛塩、およびカルシウム塩）は、本発明の組成物の好ましい実施態様において用いられる。好ましくは、この塩は、塩化物塩またはマグネシウム塩であり、マグネシウム塩が特に好ましい。この塩（例えば、マグネシウム塩）は、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの量で、より好ましくは約０．４ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【００１９】
薬学的に受容可能な一価の金属塩安定剤（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、およびセシウム塩）は、本発明の好ましい実施態様において、必要に応じて安定剤として含まれ得る。好ましくは、この塩は、０．６ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌの量、より好ましくは約５．８ｍｇ／ｍｌの量で存在する塩化ナトリウムである。
【００２０】
組成物を安定化することに加えて、塩化ナトリウムは、発酵の副産物の出現の速度および程度を抑制し得、おそらくタンパク質の凝集に起因して、抗原性の可能性が低減し得る、より薬学的に優れた提示をもたらす。塩化ナトリウムの添加は、処方物のｐＨに影響を与えない。
【００２１】
本発明の組成物は、たとえ、厳しい条件（例えば、冷蔵および凍結／融解）に供された場合でさえ、約７〜約８．５の範囲のｐＨを長期間維持し得る。さらに、この組成物は、たとえ、より大規模での産生、分配、および取り扱いに関連して生じ得る、比較的遅い速度の凍結／融解に供された場合でさえ、安定なままであり得、そして必要とされるｐＨ範囲を維持し得る。上記のように、ｐＨの維持はウイルス調製物にとって重要である。なぜなら、７．０未満のｐＨおよび８．５を超えるｐＨでは、生きたウイルス粒子が不安定になり得、そして分解し得るからである。ウイルスの特定の組成物は、ウイルスを安定化および保存することを難しくする。
【００２２】
厳しい条件下でのｐＨ維持を達成するために、本発明は、好ましくは、−８０℃と２７℃との間での保存にかかわらず、そして凍結／融解条件に供されるにもかかわらず、約７．０〜約８．５の範囲の最適ｐＨを維持し得る緩衝液系を含む。ｐＨは温度に非常に依存し変化し得るので、本発明のｐＨ範囲は、より詳細には、特定の温度範囲に関して以下に説明される。例えば、冷蔵温度（例えば、約２℃〜８℃）では、好ましいｐＨ範囲は約７．７〜約８．３、より好ましくは約７．９〜約８．２である。室温（例えば、約２０℃〜２７℃、好ましくは２２℃〜２５℃）では、好ましいｐＨ範囲は約７．３〜約８．２、より好ましくは約７．４〜約７．９である。
【００２３】
本発明の好ましい緩衝液系は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および約０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のトロメタミンを含む（トロメタミンはまた、ＴＲＩＳまたはＳｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能な「Ｔｒｉｚｍａ」としても知られる）。しかし、他の緩衝液系が用いられ得る。例えば、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物は、酸性形態のｔｒｉｓ緩衝液と併用される場合に用いられ得る。特に好ましい実施態様では、この緩衝液系は、約１．７ｍｇ／ｍＬの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および約１．７ｍｇ／ｍＬの濃度のトロメタミンを含み、そして２５℃で約７．３〜約７．９の最適ｐＨ範囲で処方物を維持する能力を有する。
【００２４】
本発明の処方物は、上記の厳しい条件（例えば、冷蔵温度および凍結／融解処理）で高濃度のウイルスを安定化する能力を有するというさらなる利点を有する。特に、本発明の処方物は、１×１０13粒子／ｍＬまでの濃度でウイルスの安定性を維持し得る。本発明において使用するための好ましいウイルス濃度範囲は、１×１０9粒子／ｍＬ〜１×１０13粒子／ｍＬ、より好ましくは１×１０12粒子／ｍＬまで、例えば、１×１０9（または１×１０10）〜１×１０12の量である。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「希釈剤」は、溶媒（例えば、水、好ましくは滅菌水）、または溶媒と他の成分（例えば、さらなる溶媒、さらなる安定剤、さらなる緩衝液、および／または処方物の安全性、効力、および安定性に有害な影響を及ぼさない他の物質）との混合物を含み得る。希釈剤、安定剤、緩衝液などに関して、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１５版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに対して参照がなされ得る。
【００２６】
界面活性剤、好ましくは非イオン性洗剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤｅｌａｗａｒｅからのＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ４０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ６０、もしくはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、またはＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．からのＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、およびＴｗｅｅｎ ８０のようなポリオキシエチレンソルビタン）が、必要に応じて、本発明の組成物中に含まれ得る。好ましくは、この非イオン性洗剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルであり、そしてこのポリオキシエチレン脂肪酸エステルは、好ましくはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０であり、これは、本発明の組成物中で安定剤として作用し得る。非イオン性洗剤の濃度は、好ましくは０．０３ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬの範囲；より好ましくは０．１５ｍｇ／ｍＬである。
【００２７】
本発明の組成物はさらに、１以上の「送達増強剤」を含み得る。「送達増強剤」とは、治療用遺伝子（例えば、腫瘍抑制遺伝子）の癌性組織または癌性器官への送達を増強する任意の薬剤をいう。このような送達増強剤の例としては、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、アルコール、グリコール、界面活性剤、胆汁酸塩、ヘパリンアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高張性塩溶液、およびアセテートが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
洗剤（この用語が本明細書中で用いられる場合）は、陰イオン性洗剤、陽イオン性洗剤、双性イオン性洗剤、および非イオン性洗剤を含み得る。例示的な洗剤としては、タウロコレート、デオキシコレート、タウロデオキシコレート、セチルピリジウム、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４洗剤、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオル］−１−プロパンスルホネート水和物、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ−１００洗剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）−Ｆ６８洗剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０洗剤、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
送達増強剤の使用は、１９９７年７月８日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／８８９，３３５号、および国際出願公開第ＷＯ ９７／２５０７２号（１９９７年７月１７日）、および１９９８年７月８日出願の米国特許出願第０９／１１２，０７４号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ ９８／１４２４１号に詳細に記載される。さらに、形質導入効率を増加させるためのウイルスベクターに関連したカルパインインヒビターの使用は、１９９８年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／１７２，６８５号および同第６０／１０４３２１号に記載される。
【００３０】
広範なウイルスが、本発明の組成物において用いられ得る。このウイルスとしては、アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルスなど（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３を参照のこと）を含むがこれらに限定されない；アデノウイルスが特に好ましい。このウイルスは、好ましくは、組換えウイルスであるが、臨床的単離体、弱毒化ワクチン株などを含み得る。従って、例えば、本発明の組成物中で用いられ得る例示的な組換えアデノウイルスは、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３であり、これは、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９５／１１９８４号に開示される。
【００３１】
本発明の処方物は、組換えウイルス（例えば、生きた組換えアデノウイルス（または「ウイルスベクター」）を、遺伝子治療における治療的用途のために安定化するために特に充分に適切である。例えば、本発明において用いられるウイルスは、腫瘍抑制遺伝子（例えば、野生型ｐ５３遺伝子またはＲｂ遺伝子（例えば、ｐ１１０RBまたはｐ５６RB）を含み得、そしてウイルスベクター中に挿入された導入遺伝子（例えば、野生型ｐ５３）とともに、本発明の組成物は、癌の処置のための薬学的組成物として用いられ得る。
【００３２】
このことについて、本発明の処方物は、生きたウイルス（特に導入遺伝子（例えば、ｐ５３）をコードするヌクレオチド配列が挿入されたウイルスベクター）の生存力を維持する著しい能力を有する。この特徴は、ウイルスが標的細胞に感染する能力を維持することを可能にし、その結果、挿入された導入遺伝子によりコードされるその治療用タンパク質が適切に産生される。
【００３３】
ｐ５３およびその使用に特に関連して、ｐ５３遺伝子の変異が、ヒトの癌における最も普通の遺伝的変化である（Ｂａｒｔｅｋ（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：１６９９−１７０３、Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：４９−５３）ことが留意される。内因性野生型ｐ５３タンパク質を欠く哺乳動物癌細胞への野生型ｐ５３の導入は、これらの細胞の新生物性表現型を抑制する（例えば、米国特許第５，５３２，２２０号を参照のこと）。
【００３４】
以下の実施例では、このウイルスは、野生型ｐ５３遺伝子を含有する生きた組換えアデノウイルスである。これらの実施例において使用される特定のウイルスベクター構築物を、本明細書中で「Ａ／Ｃ／Ｎ／５３」という。Ａ／Ｃ／Ｎ／５３（「ＡＣＮ５３」とも言われる）は、１９９４年１０月２５日出願の同時係属中の出願米国特許出願第０８／３２８，６７３号、およびＷＯ ９５／１１９８４（１９９５年５月４日）（特に本明細書中に参考として援用される）に記載される、特に好ましいウイルスベクター構築物である。
【００３５】
Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含む本発明の好ましい実施態様のための代表的な処方を以下に示す：
【００３６】
【数１】
４つの特に好ましい実施態様を以下に示す（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０は、実施例１および実施例２において存在するが、実施例３および４においては存在しない）。
【００３７】
【数２】
以下の成分：一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、トロメタミン、塩化マグネシウム六水和物、スクロース、およびグリセロールは全て、例えば、ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＩＮＣ．，７ Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １０５３２から入手され得る。Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０は、例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌａｗａｒｅ，１９８９７から入手可能である。
【００３８】
本発明の組成物は、ゲル濾過カラムにおいて所望の濃度の成分（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０を除く）と合わせることにより、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムにおけるウイルスの精製の間に調製され得る（ゲル濾過法に関しては、例えば、以下の第Ｖ節を参照し得る）。次いで、ウイルスの濃度を希釈することが所望される場合、またはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０を組み込むことが所望される場合、希釈剤が標準的な技術によって調製され得る。例示的な例を以下に示す。
【００３９】
一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、トロメタミン、スクロース、塩化マグネシウム六水和物、およびグリセロールを、攪拌機を備えたステンレス鋼容器中の約７５％のバッチ容量の注射用水に室温にて充填し、そして溶解する。得られた希釈剤のバッチを、注射用水を用いて最終容量に合わせる。ｐＨをチェックする。懸濁液中のＡ／Ｃ／Ｎ／５３（導入遺伝子として野生型ｐ５３を有するアデノウイルス）薬物物質の必要容量および必要容量の希釈剤を算出し、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３注射剤を作製する。最終的なＡ／Ｃ／Ｎ／５３注射剤がＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含む場合、希釈剤中に１０％過剰のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含む貯蔵溶液を調製する。算出された量の懸濁液中のＡ／Ｃ／Ｎ／５３薬物物質および希釈剤をステンレス鋼容器に充填し、そして混合する。必要な場合は、総Ａ／Ｃ／Ｎ／５３注射剤バッチ容量の１０％に基づいて、希釈剤の全てを添加する前にＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０溶液を充填する。この懸濁液を滅菌フィルター（０．２２μｍまたは等価物）を通して無菌的に濾過する。濾過後に、このフィルターの完全性を試験する。滅菌した懸濁液を、適切な容量のバイアルに収集し、そして充填する。バイアルに栓をつけ、そして密閉する。
【００４０】
実施例１、２、３、および４についての安定性データを、それぞれ以下の表１、２、３、および４に示す。
【００４１】
以下の表では、抗増殖アッセイは、産物が癌細胞を抑制する能力を測定するために用いられるバイオアッセイであり、そして一般に、Ｗｉｌｌｓら，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，５：１０７９−１０８８により用いられた手順に基づく。列挙された数は活性を示し、一方、コントロールは活性を有さない。
【００４２】
「プラークアッセイ」は、希釈の関数としてウイルスプラークの数を評価することによって培養物中のウイルス粒子を測定し、そして一般的に、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＰｒｅｖｅｃ，Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第７巻：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ ＮＪ）１０９−１２８頁（１９９１）に記載される手順に基づく；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｓｍｉｌｅｙ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，およびＮａｉｒｎ，Ｒ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第３６巻，５９−７４頁（１９７７）もまた参照のこと。
【００４３】
「ＦＡＣＳ」アッセイは、ウイルスが細胞に感染する能力を示し、そしてこれらの測定は一般に、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１１８６５（１９９８年１月１５日に公開されたＷＯ ９８／０１５８２）に記載される方法に基づく。次の右側の欄では、「濃度」という見出しの下で表された数は、ウイルス粒子の総数の濃度を表す。最後に、「粒子／ＦＡＣＳ比」という見出しの下の数は、感染性ウイルス粒子の数と比較した場合のウイルス粒子の総数の比を表し、これにより、ウイルス調製物の相対的な能力を示す。
【００４４】
「ＵＶ」の見出しの下のデータは、光散乱の指標として、波長Ａ320／Ａ260についてのＵＶ吸収の比によって示されたウイルス粒子の凝集を示す。基本的に、３２０ナノメーターの波長での吸光度は、光散乱の量を測定し、一方、２６０ナノメートルの波長での吸光度は、ＤＮＡの量と相関する。
【００４５】
「条件」の下で表の第２欄に列挙した温度は、貯蔵温度を表す。生理学的アッセイは、３７℃にて行われ、そして最後の欄におけるｐＨは、室温、約２５℃にて測定される。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
（実施例５）
実施例５についての処方：Ａ／Ｃ／Ｎ／５３（７．５×１０11粒子／ｍＬ）、トロメタミン（ＴＲＩＳ）（１．７ｍｇ／ｍＬ）、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（１．７ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（２０ｍｇ／ｍＬ）、塩化マグネシウム六水和物（０．４ｍｇ／ｍＬ）、グリセロール（１００ｍｇ／ｍＬ）、塩化ナトリウム（５．８ｍｇ／ｍＬ）、最終容量＝１０ｍＬ。
【００５０】
【表５】
いくつかの場合では、４℃での貯蔵の間に処方物中で微粒子が形成されるのが観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる微粒子の分析は、この微粒子が、微量の不純物（すなわち、さらなるタンパク質およびいくらかの未成熟ウイルス粒子）から構成され、従って、これらの微粒子は処方物の生存力に影響を及ぼさないことを示唆する。それにもかかわらず、処方物をさらに明澄化するための（起こり得る微粒子形成を防止するための）好ましい実施態様では、必要に応じて微細濾過の工程を行って、ウイルス粒子はほとんど失わずに、任意の潜在的な微粒子を除去し得る（微細濾過を実施する場合、濾過容量あたりで十分な微細濾過膜表面積が、微粒子を除去しながらもウイルスの損失は回避するために重要であることに留意すべきである）。
【００５１】
さらに、好ましい実施態様では、本発明者らは、攪拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、攪拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））が、微粒子形成を加速し得、それゆえ、明澄化プロセスにおける必要に応じたさらなる工程であることを見出した。従って、穏やかな攪拌（例えば、一晩、１０℃、磁性攪拌子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｂａｒ）を用いて）に続いての微細濾過は微粒子を除去し、その結果、再度攪拌してもそれ以上微粒子が再形成されないことが示された。
【００５２】
凍結／融解のサイクルが再攪拌の間に微粒子形成を促進し得ることもまた見出された。従って、別の好ましい手順では、１回以上の凍結／融解サイクルが必要に応じて実施され得、冷蔵温度（例えば、４℃）でのウイルス最終産物の貯蔵の間の微粒子形成を防止するために、続いて攪拌、次いで微細濾過が実施され得る。
【００５３】
（ウイルス含有組成物を濃縮および精製する方法）
本出願はまた、接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（本明細書以下では時々、「ＴＦＦ」という）を用いて既存のウイルス調製物を安定に濃縮する新規な方法を開示し、広範囲の所望の濃度で臨床的投薬量を容易に選択および調製することを可能にする。ウイルス調製物を濃縮する新規な方法は以下の工程を含む：
（ａ）ポリヒドロキシ炭化水素を、約２０％以上の最終ポリヒドロキシ炭化水素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程；および
（ｂ）このウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、このウイルスの濃度が、このウイルスを維持しながら、フィルターを介してこの希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることにより増加する、工程。
【００５４】
本発明の方法は、以下を含むがこれらに限定されない広範囲のウイルスに受け入れられる：アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルスなど；アデノウイルスが特に好ましい。このウイルスは、好ましくは、組換えウイルスであるが、臨床的単離体、弱毒化ワクチン株などを含み得る。本発明は、遺伝子治療における使用のための異種導入遺伝子を保有する組換えウイルスを濃縮するために特に有用である。このようなウイルスは、潜在的に不安定化にする力（例えば、ウイルス調製物を濃縮する方法に伴うさらなる機械的剪断力）に対して特に傷付きやすい。本発明の方法によって濃縮され得る例示的な組換えアデノウイルスは、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３であり、これは、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９５／１１９８４号に開示される。
【００５５】
本発明の方法に従ってウイルスを濃縮するために用いられる濾過プロセスは、任意の濾過プロセス（例えば、限外濾過）を含み得、ここで、ウイルスの濃度は、希釈剤がウイルス調製物から除去されるが、ウイルスがこのフィルターを通過できず、それゆえ、濃縮された形態でウイルス調製物中に残存するような様式で、希釈剤をフィルターに通すことによって、増加し得る。限外濾過は、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌ．ＺｅｍａｎおよびＡ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋａｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６）に詳細に記載される。特に好ましい濾過プロセスは、例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」と題されたＭＩＬＬＥＰＯＲＥカタログの１７７−２０２頁（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，１９９５／９６）に記載されるような、接線流濾過（「ＴＦＦ」）である。好ましいＴＦＦ装置は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，８０ Ａｓｈｂｙ Ｒｄ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（インターネットアドレス：ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）からのＰｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ濾過系またはＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ濾過系のいずれかを含み、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ系が特に好ましい。好ましい実施態様では、本発明の方法は、約２℃〜２７℃の範囲の温度で実施される。
【００５６】
他の濃縮プロセスは、本発明に従ってウイルス調製物を濃縮するために用いられ得る。例えば、ポリヒドロキシ炭化水素の使用は、遠心分離によってウイルス調製物を濃縮するために有利に用いられ得る。従って、本発明はまた、以下の工程を含む、ウイルス調製物を濃縮するための方法を提供する：
（ａ）３５％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第１層を含む組成物を遠心分離する工程であって、この第１層が、５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第２層に重層され、この第２層が、ウイルスを含む第３層に重層される、工程；ならびに
（ｂ）このウイルスをこの第１層から回収する工程。
【００５７】
例として、アデノウイルス調製物を、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機のスウィングバケットローターを用いる低速遠心分離によって３，２００ｇで濃縮し得る。このことを達成するために、このウイルス調製物は、複数の５ｍｌチューブに入れられ得る。各チューブは、チューブの底の第１層において６．２５容量％の７０％グリセロールを含有し、この層に２．５容量％の２０％グリセロールが重層され、このウイルス調製物が頂部に置かれ得る。次いで、この調製物は、３，２００ｇにて４℃で約１６時間遠心分離されて、濃縮されたウイルスがグリセロール層中にペレット化され、次いで新たに濃縮されたウイルス調製物は続いて第１層から回収される。上記の手順によって濃縮されたウイルスは、良好な光散乱特性を有しており、適切な感染特性を有していた。
【００５８】
本発明の方法において用いられるポリヒドロキシ炭化水素に関して、「ポリヒドロキシ炭化水素」とは、２個以上（好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個）の水酸基で置換された、分枝状、直鎖状、または環式の化合物を意味し、そして有効量のポリヒドロキシ炭化水素は、本発明の処方物中のウイルスを、潜在的に不安定化する力（例えば、濃縮プロセスの間に生じる機械的剪断力）に対して安定化するのに充分な量である。好ましくは、本発明のウイルス濃縮方法におけるポリヒドロキシ炭化水素は、２０％、より好ましくは２５％の最少濃度で存在する。本発明に使用するためのポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは、ポリヒドロキシ置換アルキル化合物（分枝状または非分枝状）（好ましくは２〜７個の炭素原子を有する）であり、そしてグリセロール、ソルビトール、およびポリプロパノールを含み得る。グリセロールが、特に好ましい。
【００５９】
本発明者らの新規な、ウイルス濃度を増加させる方法は、例えば、種々の処理工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）の間で有意に高い処理量を可能にすることにより、問題のあるネックを排除することによって処理を増強するというさらなる利点を有する。従って、好ましい実施態様では、本発明に従ってウイルス調製物を濃縮する方法を、ウイルスを精製する方法に適用し得、ここでサイズ排除クロマトグラフィー工程（例えば、ゲル濾過）が、陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて実施される。この実施態様では、速度制限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の前にウイルスを濃縮するために必要となる機械的剪断力に由来するウイルス安定性に対するさらなるおそれだけでなく、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から溶出されたウイルス調製物が代表的に、ウイルス安定性をさらに損なう高レベルの塩および他の不純物を含むという事実に起因するウイルス安定性に対するさらなるおそれもまた存在する。従って、特に好ましい実施態様では、本発明は、以下の工程を含む、ウイルス調製物を精製する方法を提供する：
（ａ）このウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで、このウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウイルス調製産物として溶出される、工程；
（ｂ）この調製物中の該ポリヒドロキシ炭化水素の最終濃度が約２５％以上に達するように、工程（ａ）のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加する工程；および
（ｃ）このウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることによって、工程（ｂ）のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の濃縮されたウイルス調製産物を１以上のさらなる処理工程に供する工程。
【００６０】
陰イオン交換クロマトグラフィーに関連して上記に記載した好ましい実施態様では、最少レベルのグリセロールは、（本発明の濃縮方法の一般的な適用における２０％という最少濃度ではなく）２５％である。なぜなら、この特定の適用は、陰イオン交換カラムから溶出された産物における高い塩濃度によって与えられる、安定性に対するさらなるおそれを考慮に入れればならないからである。２５％グリセロール（好ましくは、３０％）の添加は、例えば、４℃にて１０日間を超える、塩含有ＤＥＡＥプールの安定性を生じる；それゆえ、続いてのウイルス濃縮および／またはゲル濾過の工程は、１０日間にわたりかなりの融通性を伴って、別の日に実施され得る。認識されるように、２５％以上のより高い濃度のポリヒドロキシ炭化水素の使用もまた、本発明の方法において用いられ得、ここで、このウイルス調製物は、他の処理条件に起因して高い塩含量を含む。
【実施例】
【００６１】
（Ｖ．本発明の方法の実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を例示する；本発明の範囲は、それによって限定されるとは解釈されるべきでない。
【００６２】
（簡潔な概要）濃縮されたバッチは、発酵回収物に由来する、凍結された粗ウイルス材料を用いて開始する。１つの実施態様では、アデノウイルス産物を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって最初に精製する。次いで、この調製物をサイズ排除カラムにロードする前に、陰イオン交換プールを、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールの存在下で接線流濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し得る。あるいは、別の実施態様では、ＴＦＦ濃縮工程を、２０％（ｖ／ｖ）以上（好ましくは、２５％）のグリセロールの存在下で、サイズ排除クロマトグラフィー後に実施し得る。
【００６３】
（ＴＦＦの前の陰イオン交換クロマトグラフィーによる出発材料の調製）
好ましい実施態様では、アデノウイルス陰イオン交換プールを、濃縮のために以下の通りに調製する。発酵工程および回収工程由来の凍結したウイルス材料を、融解し、そして０．４５μｍ親水性膜を通して濾過する。濾液の塩濃度を、４Ｍ塩化ナトリウムを添加することにより調整する。次いで、この供給溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、２６０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース（緩衝液Ａ）で予め平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラムに適用する。アデノウイルスは、この陰イオン交換樹脂に結合し、一方、媒体の大部分および宿主細胞の不純物はカラムを通過して、結局、電荷を消費する。このカラムを最初に４容量の緩衝液Ａで洗浄し、続いて８ベッド容量の９４％緩衝液Ａおよび６％緩衝液Ｂ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、６００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース））という第２のイソクラティク（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）洗浄液で洗浄してさらなる不純物を除去する。このウイルスを、３０ベッド容量の、６％〜１００％の緩衝液Ｂの線形勾配を用いてカラムから溶出させる。Ａ280によって決定した場合の溶出プロフィールのアデノウイルスピークを回収する。次いで、グリセロールを、さらなる処理のために３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度でＤＥＡＥプールに添加する。
【００６４】
（接線流濾過を用いてのＤＥＡＥプールの濃縮）
ＤＥＡＥプール（上記の説明に従って調製される）を、１００万分子量カットオフのＢｉｏｍａｘ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＴＦＦユニット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて１０倍〜２０倍濃縮する。このプロセスを、２〜１０℃または室温（２５℃）のいずれかで実施する。以下の濾過パラメーターをこの手順において用いる：平均入口圧＝１４ｐｓｉ；平均透過圧＝ｏ
ｐｓｉ；平均流速＝１３リットル／時間平方メートル。アデノウイルスの最終濃度は、約１．０〜２．０×１０13粒子／ｍｌに達する。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ−ＨＰＬＣおよびＵＶ吸光度（Ａ260）分析に基づくと、濃縮工程の回収率は、有意な凝集を伴わずに、＞８０％である（Ａ320／Ａ260による光散乱アッセイ）。
【００６５】
（サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）による緩衝液交換）
濃縮されたアデノウイルス調製物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０％グリセロール（緩衝液Ｃ）または１１ｍＭリン酸ナトリウム、１４ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０％グリセロール（ｐＨ ７．８）（緩衝液Ｄ）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００サイズ排除カラムに適用する。このカラムを、平衡化緩衝液で溶出させる。Ａ280によって決定した場合の溶出プロフィールのアデノウイルスピークを回収し、そしてプールする。濃縮されたアデノウイルス調製物を、０．２μｍの親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して２〜１０℃にて濾過し、そして−８０℃またはより高い温度（例えば、２〜１０℃）にて貯蔵し得る。
【００６６】
（接線流濾過を用いてのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００プールの濃縮）
上記で議論したように、本発明の好ましい実施態様は、陰イオン交換クロマトグラフィー後だがゲル濾過前にウイルスを濃縮する工程を含む。しかし、別の実施態様では、ウイルス調製物を濃縮する開示された方法はまた、（たとえウイルス濃縮工程が、陰イオン交換工程とゲル濾過工程との間で用いられない場合であっても）ゲル濾過工程の後に用いられ得る。この場合、濾過パラメーターは、ポリヒドロキシ炭化水素（例えば、グリセロール）が２０％（ｖ／ｖ）程度の低い最終濃度でＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００プールに添加され得ること以外は、ＤＥＡＥプールの濃縮のための濾過パラメーターと同じである。なぜなら、このＤＥＡＥプールにおいて高い塩濃度を扱う必要性がもうないからである。このことについて、ポリヒドロキシ炭化水素の添加がゲル濾過後まで延期される場合、このＤＥＡＥプールは（その高い塩濃度によるこのＤＥＡＥプールの傷付き易さに起因して）すぐにゲル濾過カラムに適用されるべきであることに留意すべきである。従って、（本発明に従って）ポリヒドロキシ炭化水素をこのＤＥＡＥプールに添加することのさらなる利点が、陰イオン交換クロマトグラフィーと続く処理との間の期間の時間間隔の選択肢および貯蔵の選択肢に関して増加した融通性であることが理解され得る。
【００６７】
ウイルス調製物を濃縮する方法を、種々の精製方法に関連して適用し得る。精製方法についてのさらなる情報に関しては、例えば、Ｈｕｙｇｈｅら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，第６巻，１４０３−１４１６頁（１９９５）および米国特許出願第０８／９８９，２２７号（特に本明細書中に参考として援用される）を参照し得る。
【００６８】
（ＶＩ．接線流濾過を用いてウイルス調製物を濃縮する方法についての安定性データ）
以下の実験データによって示されるように、本発明の方法は、ウイルスを濃縮する機械的剪断力にもかからわず、そしてＤＥＡＥプール中での高い塩レベルのような厳しい条件にもかかわらず、大いに増強されたウイルス安定性を可能にする。従って、本発明の方法は、とりわけ、以下を可能にする：（１）任意の所望の濃度での臨床投薬量の容易な調製（たとえ、より低い濃度を有する材料で始めた場合でさえも）、（２）処理の増強（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの間の有意に多い処理量を可能にすることによる）、および（３）２〜１０℃で１０日間を超える塩含有ＤＥＡＥプールの安定性（これにより、ウイルス濃縮および／またはゲル濾過という続きの工程が、１０日間の期間にわたるかなりの融通性を伴って別の日に実施されることを可能にする）。
【００６９】
（Ａ．ＤＥＡＥクロマトグラフィーに続くウイルスの濃縮）
以下の３つの実施例では、安定な濃度のアデノウイルスを、（本発明の方法に従って）３０％グリセロール中のＤＥＡＥプールを濃縮することにより調製した。次いで、この調製物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲル濾過クロマトグラフィーによるさらなる精製に供して、試験するための最終処方物を得た。
【００７０】
【表６】
（Ｂ．ゲル濾過に続いてのウイルスの濃縮）
（実施例Ｓ−１）
以下の実施例では、ウイルス調製物を、ゲル濾過に続いて２０％グリセロール中で濃縮した。
【００７１】
【表７】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が、参考として援用されると具体的に、そして個々に示された場合と同じ程度に、その全体が参考として援用される。
【００７２】
本発明の改変および変更は、当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実施態様は、例示のためにのみ提供され、そして本発明は、それによって制限されると解釈されるべきでない。
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、有意に改善された安定性を有する、ウイルスを含む組成物に、特にウイルスベクターを含む組成物に関する。本発明の組成物は、保存の間にウイルスの安定性を維持するのに有用であり、そして本発明のウイルス含有組成物は、治療的用途（例えば、遺伝子治療）に特に有用である。ウイルス調製物を濃縮および精製するための新規な方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
（ＩＩ．背景）
ウイルスは、治療的用途（例えば、ワクチン接種および遺伝子治療）のためにますます重要になってきた。そして、容易に保存および輸送され得るが、なお十分な安全性および効力を保持する、安定なウイルス含有組成物を開発および調製する必要がある。特に、遺伝子治療におけるウイルスベクターの広範囲な使用を考慮すると、生きた組換えウイルスが治療用導入遺伝子を保有する場合にそれらを安定に保存し得る処方物を開発および調製することが重要である。
【０００３】
さらに、−８０℃よりも上の温度で長期間、ウイルス調製物を安定化し得る処方物についての重要な必要が存在する。ウイルス含有組成物は、通常、−８０℃での保存を必要とし、そして標準的な冷蔵温度（例えば、２℃〜８℃、またはそれより高温）で実質的な期間の間、保存できない。この制限は、保存に対してだけでなく、処理、分配、および広範な臨床的用途に対してもまた深刻な障害を表す。
【０００４】
冷蔵温度に供されているにもかかわらず、そして凍結／融解、特に大規模での産生、取り扱い、または分配に関連して起こり得る緩慢な速度の凍結／融解のような苛酷な条件に曝されているにもかかわらず、約７〜約８．５の範囲のｐＨを長期の間維持し得るウイルス含有組成物を開発する必要性もまた存在する。ｐＨの維持は、ウイルス調製物に関して重要である。なぜなら、７．０未満のｐＨおよび８．５を超えるｐＨでは、生きたウイルス粒子は、物理的および生物学的な不安定性に起因して傷付きやすく、生存能力を失うからである。
【０００５】
さらなる問題は、ウイルス濃度の増加に関連する。特に、高いウイルス濃度は、ウイルスの不安定性に有意に寄与する。しかし、ウイルスおよびウイルスベクターの濃度がますます高くなることが、治療的用途のために必要とされる。それゆえ、比較的高濃度のウイルスを、特に上記で言及した厳しい条件下で安定化させる処方物を開発する重要な必要性が存在する。そしてさらに、既存のウイルス調製物を濃縮して安定な調製物をより高い濃度レベルで達成する新規な方法を開発する具体的な必要性が存在する。より高いウイルス濃度に関連した不安定性の問題は、既存のウイルス調製物を濃縮しようと試みる場合、有意に悪化する。このことは部分的に、既存のウイルス調製物の濃度を増加させる努力の間に生じるさらなる機械的剪断力に起因する。ウイルスの安定性を実質的に損なわずにウイルス調製物を濃縮する方法を見出すことができれば、任意の所望の濃度での臨床的投薬量が容易に調製され得（たとえ、より低い濃度を有する材料から出発した場合であっても）、そして重要なことには、ウイルスを濃縮する能力は、種々の処理工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）の間で有意により高い処理量を可能にすることにより、精製プロセスの間の問題のあるネックおよび他の規模拡大の問題を排除し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、上記の目的を達成するための材料および方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１） 約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む、組成物。
（項目２） 上記ウイルスが組換えウイルスである、項目１に記載の組成物。
（項目３） 上記ポリヒドロキシ炭化水素がグリセロールである、項目１に記載の組成物。
（項目４） 二糖をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目５） 上記組成物が、約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のトロメタミンを含む緩衝液系を含む、項目１に記載の組成物。
（項目６） 約０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度の二価金属塩をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目７） 水を含む希釈剤をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目８） 上記ウイルスが、約１×１０9〜１×１０13粒子／ｍＬの濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目９） 上記ウイルスが、アデノウイルスである、項目１に記載の組成物。
（項目１０） 上記組換えウイルスが、野生型ｐ５３遺伝子を含む、項目２に記載の組成物。
（項目１１） 上記組換えウイルスが、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３である、項目１０に記載の組成物。
（項目１２） 上記ウイルスがアデノウイルスであり；上記ポリヒドロキシ炭化水素がグリセロールであり；上記緩衝液系が、２０℃〜２７℃の範囲の温度で約７．３〜約７．９の範囲のｐＨを維持し；そして上記組成物が二糖をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１３） 上記アデノウイルスがＡ／Ｃ／Ｎ／５３であり；上記二糖がスクロースであり；上記緩衝液系が一塩基性リン酸ナトリウム二水和物およびトロメタミンを含み；そして上記組成物が二価金属塩および水をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１４） ウイルス調製物を濃縮するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ポリヒドロキシ炭化水素を、約２０％以上の最終ポリヒドロキシ炭化水素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程；および
（ｂ）該ウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、該ウイルスの濃度を、該ウイルスを維持しながら、フィルターを介して希釈剤が該ウイルス調製物から除去されるように該調製物に圧力をかけることにより増加させる、工程、
を包含する、方法。
（項目１５） 上記濾過プロセスが限外濾過を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６） 上記濾過プロセスが接線流濾過を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７） ウイルス調製物を精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）該ウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで、ウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウイルス調製産物として溶出される、工程；
（ｂ）該調製物中のポリヒドロキシ炭化水素の濃度が約２５％以上のレベルに達するように、工程（ａ）のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加する工程；および
（ｃ）該ウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤が該ウイルス調製物から除去されるように該調製物に圧力をかけることによって、工程（ｂ）のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の濃縮されたウイルス調製産物を１以上のさらなる処理工程に供する工程、
を包含する、方法。
（項目１８） 上記ウイルスが組換えウイルスである、項目１４に記載の方法。
（項目１９） 上記ウイルスが遺伝子治療で使用するための治療用導入遺伝子を保有する組換えウイルスである、項目１４に記載の方法。
（項目２０） さらなる処理工程がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２１） 上記工程（ｃ）のプロセスが、接線流濾過を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２２） 上記工程（ｃ）のプロセスが、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ濾過系を含む装置を用いて実施される、項目２１に記載の方法。
（項目２３） 項目１４に記載の方法により濃縮された、ウイルス調製物。
（項目２４） 項目１７に記載の方法により精製された、ウイルス調製物。
（項目２５） ウイルス調製物を濃縮するための方法であって、以下の工程：
（ａ）３５％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第１層を含む組成物を遠心分離する工程であって、該第１層が、５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第２層に重層され、該第２層が、ウイルスを含む第３層に重層される、工程；ならびに
（ｂ）該ウイルスを該第１層から回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２６） 上記組成物の貯蔵の間の微粒子形成の防止のために、該組成物をさらなる攪拌処理工程に供し、続いて微細濾過に供する、項目１に記載の組成物。
（項目２７） 上記組成物の貯蔵の間の微粒子形成の防止のために、該組成物を１以上の凍結／融解サイクルに供し、続いて攪拌に供し、次いで微細濾過に供する、項目１に記載の組成物。
（項目２８） 約０．６〜１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度の一価の金属塩をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
【０００８】
（ＩＩＩ．発明の要旨）
本発明は、約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む安定な組成物を提供することにより、上記の必要性を満たす。
【０００９】
広範囲の所望の濃度の臨床的投薬量を容易に選択および調製することを可能にする、既存のウイルス調製物を濃縮する新規な方法もまた提供される。ウイルス調製物を濃縮する好ましい方法は、以下の工程を含む：
（ａ）ポリヒドロキシ炭化水素を、約２０％以上の最終ポリヒドロキシ炭化水素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程；および
（ｂ）このウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、このウイルスの濃度が、このウイルスを維持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることにより増加する、工程。
【００１０】
本明細書中では、以下の工程を含む、ウイルス調製物を濃縮するための方法もまた提供される：
（ａ）３５％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第１層を含む組成物を遠心分離する工程であって、この第１層が、５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第２層に重層され、この第２層が、ウイルスを含む第３層に重層される、工程；ならびに
（ｂ）このウイルスをこの第１層から回収する工程。
【００１１】
さらに、本発明者らは、本発明者らの、ウイルス濃度を増加させる新規な方法が、さらなる処理を増強する（例えば、処理工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）の間に有意により高い処理量を可能にすることにより、続いての精製の間に問題のなるネックを低減または排除することによる）というさらなる利点を有することを見出した。従って、好ましい実施態様では、本発明に従ってウイルス調製物を濃縮する方法は、続く精製工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）をさらに含む。このことについて、本発明の方法は、サイズ排除クロマトグラフィーの工程がイオン交換クロマトグラフィーに続いて行われ、そしてウイルス調製物が（本発明に従って）イオン交換クロマトグラフィーの後だがサイズ排除クロマトグラフィーの前に濃縮される場合に特に有用である。陰イオン交換クロマトグラフィーから得られたウイルス画分は、例えば、代表的に、高レベルの塩、およびおそらく濃縮手順の間にウイルス安定性をさらに損なう他の不純物を含む。従って、特に好ましい実施態様では、本発明は、以下の工程を含むウイルス調製物を精製する方法を提供する：
（ａ）このウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで、このウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウイルス調製産物として溶出される、工程；
（ｂ）この調製物中のポリヒドロキシ炭化水素の最終濃度が約２５％以上に達するように、工程（ａ）のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加する工程；および
（ｃ）このウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることによって、工程（ｂ）のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の濃縮されたウイルス調製産物を１以上のさらなる処理工程に供する工程。
【００１２】
本発明はまた、上記の方法によって濃縮および／または精製されたウイルス調製物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（ＩＶ．詳細な説明）
上記のように、本出願は、新規なウイルス含有組成物、ならびにウイルス含有組成物を濃縮および精製する新規な方法を開示する。
【００１４】
組成物に関して、本発明者らは、増強された安定性でウイルス調製物を保存し得る新規な緩衝化された処方物を開発した。特に、この処方物は、ウイルス調製物を−８０℃よりもずっと高い温度で安定化し得る。なおさらに重要なことには、本発明の組成物は、代表的な冷蔵温度で（例えば、２℃〜８℃以上で）でかなりの期間、好ましくは数ヶ月以上の間安定である。これは、重要な利点である。なぜなら、上記のように、臨床的必要性を満たすために、ウイルス調製物を保存および輸送の間に−８０℃で凍結して保存することは非実用的であるからである。
【００１５】
本発明の組成物の１つの重要な特徴は、ポリヒドロキシ炭化水素の添加である。本明細書中で使用される場合、ポリヒドロキシ炭化水素とは、２個以上（好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個）の水酸基で置換された、分枝状、直鎖状、または環式の化合物を意味する。本発明に使用するためのポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは２〜７個の炭素原子を有する、ポリヒドロキシ置換アルキル化合物（分枝状または非分枝状）であり、そして例えば、グリセロール、ソルビトール、およびポリプロパノールを含み得る。グリセロールは、特に好ましい。以下に提供されるデータにより示されるように、本発明者らは、グリセロールが、標準的な冷蔵条件下でさえ、驚くほど高レベルの安定性を長期の間可能にすることを見出した。
【００１６】
本発明の組成物について有効量のポリヒドロキシ炭化水素は、特にウイルスが遺伝子治療において使用される導入遺伝子を含む場合、さらなる使用のためのウイルスの有効性に有害な効果を及ぼさずに、本発明の処方物中のウイルスを、安定化し得る量である。ポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの最終濃度で存在する。より狭い範囲は、８０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬであり得る。１種より多くのポリヒドロキシ炭化水素を用いて、本発明の組成物中での所望の合計量のポリヒドロキシ炭化水素を達成し得る。
【００１７】
本発明の組成物中のポリヒドロキシ炭化水素は、必要に応じて、アルデヒド基を含み得る。特に、ポリヒドロキシ炭化水素は、二糖（例えば、スクロース）であり得る。さらに、たとえ、組成物のために選択されたポリヒドロキシ炭化水素がアルデヒド基を含まなくとも、組成物はさらに二糖（例えば、スクロース）を安定剤および張度調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ−ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として含み得る。本発明の組成物がすでに適切なポリヒドロキシ炭化水素（例えば、グリセロール）を含み、そして二糖がさらなる安定剤または張度調節剤として好ましい実施態様において用いられる場合、この二糖は、好ましくは、５ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬの範囲で、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬで存在し、そして好ましくはこの二糖はスクロースである。
【００１８】
薬学的に受容可能な二価金属塩安定剤（例えば、マグネシウム塩、亜鉛塩、およびカルシウム塩）は、本発明の組成物の好ましい実施態様において用いられる。好ましくは、この塩は、塩化物塩またはマグネシウム塩であり、マグネシウム塩が特に好ましい。この塩（例えば、マグネシウム塩）は、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの量で、より好ましくは約０．４ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【００１９】
薬学的に受容可能な一価の金属塩安定剤（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、およびセシウム塩）は、本発明の好ましい実施態様において、必要に応じて安定剤として含まれ得る。好ましくは、この塩は、０．６ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌの量、より好ましくは約５．８ｍｇ／ｍｌの量で存在する塩化ナトリウムである。
【００２０】
組成物を安定化することに加えて、塩化ナトリウムは、発酵の副産物の出現の速度および程度を抑制し得、おそらくタンパク質の凝集に起因して、抗原性の可能性が低減し得る、より薬学的に優れた提示をもたらす。塩化ナトリウムの添加は、処方物のｐＨに影響を与えない。
【００２１】
本発明の組成物は、たとえ、厳しい条件（例えば、冷蔵および凍結／融解）に供された場合でさえ、約７〜約８．５の範囲のｐＨを長期間維持し得る。さらに、この組成物は、たとえ、より大規模での産生、分配、および取り扱いに関連して生じ得る、比較的遅い速度の凍結／融解に供された場合でさえ、安定なままであり得、そして必要とされるｐＨ範囲を維持し得る。上記のように、ｐＨの維持はウイルス調製物にとって重要である。なぜなら、７．０未満のｐＨおよび８．５を超えるｐＨでは、生きたウイルス粒子が不安定になり得、そして分解し得るからである。ウイルスの特定の組成物は、ウイルスを安定化および保存することを難しくする。
【００２２】
厳しい条件下でのｐＨ維持を達成するために、本発明は、好ましくは、−８０℃と２７℃との間での保存にかかわらず、そして凍結／融解条件に供されるにもかかわらず、約７．０〜約８．５の範囲の最適ｐＨを維持し得る緩衝液系を含む。ｐＨは温度に非常に依存し変化し得るので、本発明のｐＨ範囲は、より詳細には、特定の温度範囲に関して以下に説明される。例えば、冷蔵温度（例えば、約２℃〜８℃）では、好ましいｐＨ範囲は約７．７〜約８．３、より好ましくは約７．９〜約８．２である。室温（例えば、約２０℃〜２７℃、好ましくは２２℃〜２５℃）では、好ましいｐＨ範囲は約７．３〜約８．２、より好ましくは約７．４〜約７．９である。
【００２３】
本発明の好ましい緩衝液系は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および約０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のトロメタミンを含む（トロメタミンはまた、ＴＲＩＳまたはＳｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能な「Ｔｒｉｚｍａ」としても知られる）。しかし、他の緩衝液系が用いられ得る。例えば、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物は、酸性形態のｔｒｉｓ緩衝液と併用される場合に用いられ得る。特に好ましい実施態様では、この緩衝液系は、約１．７ｍｇ／ｍＬの濃度の一塩基性リン酸ナトリウム二水和物および約１．７ｍｇ／ｍＬの濃度のトロメタミンを含み、そして２５℃で約７．３〜約７．９の最適ｐＨ範囲で処方物を維持する能力を有する。
【００２４】
本発明の処方物は、上記の厳しい条件（例えば、冷蔵温度および凍結／融解処理）で高濃度のウイルスを安定化する能力を有するというさらなる利点を有する。特に、本発明の処方物は、１×１０13粒子／ｍＬまでの濃度でウイルスの安定性を維持し得る。本発明において使用するための好ましいウイルス濃度範囲は、１×１０9粒子／ｍＬ〜１×１０13粒子／ｍＬ、より好ましくは１×１０12粒子／ｍＬまで、例えば、１×１０9（または１×１０10）〜１×１０12の量である。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「希釈剤」は、溶媒（例えば、水、好ましくは滅菌水）、または溶媒と他の成分（例えば、さらなる溶媒、さらなる安定剤、さらなる緩衝液、および／または処方物の安全性、効力、および安定性に有害な影響を及ぼさない他の物質）との混合物を含み得る。希釈剤、安定剤、緩衝液などに関して、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１５版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに対して参照がなされ得る。
【００２６】
界面活性剤、好ましくは非イオン性洗剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤｅｌａｗａｒｅからのＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ４０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ６０、もしくはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、またはＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．からのＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、およびＴｗｅｅｎ ８０のようなポリオキシエチレンソルビタン）が、必要に応じて、本発明の組成物中に含まれ得る。好ましくは、この非イオン性洗剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルであり、そしてこのポリオキシエチレン脂肪酸エステルは、好ましくはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０であり、これは、本発明の組成物中で安定剤として作用し得る。非イオン性洗剤の濃度は、好ましくは０．０３ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬの範囲；より好ましくは０．１５ｍｇ／ｍＬである。
【００２７】
本発明の組成物はさらに、１以上の「送達増強剤」を含み得る。「送達増強剤」とは、治療用遺伝子（例えば、腫瘍抑制遺伝子）の癌性組織または癌性器官への送達を増強する任意の薬剤をいう。このような送達増強剤の例としては、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、アルコール、グリコール、界面活性剤、胆汁酸塩、ヘパリンアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高張性塩溶液、およびアセテートが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
洗剤（この用語が本明細書中で用いられる場合）は、陰イオン性洗剤、陽イオン性洗剤、双性イオン性洗剤、および非イオン性洗剤を含み得る。例示的な洗剤としては、タウロコレート、デオキシコレート、タウロデオキシコレート、セチルピリジウム、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４洗剤、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオル］−１−プロパンスルホネート水和物、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ−１００洗剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）−Ｆ６８洗剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０洗剤、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
送達増強剤の使用は、１９９７年７月８日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／８８９，３３５号、および国際出願公開第ＷＯ ９７／２５０７２号（１９９７年７月１７日）、および１９９８年７月８日出願の米国特許出願第０９／１１２，０７４号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ ９８／１４２４１号に詳細に記載される。さらに、形質導入効率を増加させるためのウイルスベクターに関連したカルパインインヒビターの使用は、１９９８年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／１７２，６８５号および同第６０／１０４３２１号に記載される。
【００３０】
広範なウイルスが、本発明の組成物において用いられ得る。このウイルスとしては、アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルスなど（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３を参照のこと）を含むがこれらに限定されない；アデノウイルスが特に好ましい。このウイルスは、好ましくは、組換えウイルスであるが、臨床的単離体、弱毒化ワクチン株などを含み得る。従って、例えば、本発明の組成物中で用いられ得る例示的な組換えアデノウイルスは、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３であり、これは、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９５／１１９８４号に開示される。
【００３１】
本発明の処方物は、組換えウイルス（例えば、生きた組換えアデノウイルス（または「ウイルスベクター」）を、遺伝子治療における治療的用途のために安定化するために特に充分に適切である。例えば、本発明において用いられるウイルスは、腫瘍抑制遺伝子（例えば、野生型ｐ５３遺伝子またはＲｂ遺伝子（例えば、ｐ１１０RBまたはｐ５６RB）を含み得、そしてウイルスベクター中に挿入された導入遺伝子（例えば、野生型ｐ５３）とともに、本発明の組成物は、癌の処置のための薬学的組成物として用いられ得る。
【００３２】
このことについて、本発明の処方物は、生きたウイルス（特に導入遺伝子（例えば、ｐ５３）をコードするヌクレオチド配列が挿入されたウイルスベクター）の生存力を維持する著しい能力を有する。この特徴は、ウイルスが標的細胞に感染する能力を維持することを可能にし、その結果、挿入された導入遺伝子によりコードされるその治療用タンパク質が適切に産生される。
【００３３】
ｐ５３およびその使用に特に関連して、ｐ５３遺伝子の変異が、ヒトの癌における最も普通の遺伝的変化である（Ｂａｒｔｅｋ（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：１６９９−１７０３、Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：４９−５３）ことが留意される。内因性野生型ｐ５３タンパク質を欠く哺乳動物癌細胞への野生型ｐ５３の導入は、これらの細胞の新生物性表現型を抑制する（例えば、米国特許第５，５３２，２２０号を参照のこと）。
【００３４】
以下の実施例では、このウイルスは、野生型ｐ５３遺伝子を含有する生きた組換えアデノウイルスである。これらの実施例において使用される特定のウイルスベクター構築物を、本明細書中で「Ａ／Ｃ／Ｎ／５３」という。Ａ／Ｃ／Ｎ／５３（「ＡＣＮ５３」とも言われる）は、１９９４年１０月２５日出願の同時係属中の出願米国特許出願第０８／３２８，６７３号、およびＷＯ ９５／１１９８４（１９９５年５月４日）（特に本明細書中に参考として援用される）に記載される、特に好ましいウイルスベクター構築物である。
【００３５】
Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含む本発明の好ましい実施態様のための代表的な処方を以下に示す：
【００３６】
【数１】
４つの特に好ましい実施態様を以下に示す（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０は、実施例１および実施例２において存在するが、実施例３および４においては存在しない）。
【００３７】
【数２】
以下の成分：一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、トロメタミン、塩化マグネシウム六水和物、スクロース、およびグリセロールは全て、例えば、ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＩＮＣ．，７ Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １０５３２から入手され得る。Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０は、例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌａｗａｒｅ，１９８９７から入手可能である。
【００３８】
本発明の組成物は、ゲル濾過カラムにおいて所望の濃度の成分（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０を除く）と合わせることにより、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムにおけるウイルスの精製の間に調製され得る（ゲル濾過法に関しては、例えば、以下の第Ｖ節を参照し得る）。次いで、ウイルスの濃度を希釈することが所望される場合、またはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０を組み込むことが所望される場合、希釈剤が標準的な技術によって調製され得る。例示的な例を以下に示す。
【００３９】
一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、トロメタミン、スクロース、塩化マグネシウム六水和物、およびグリセロールを、攪拌機を備えたステンレス鋼容器中の約７５％のバッチ容量の注射用水に室温にて充填し、そして溶解する。得られた希釈剤のバッチを、注射用水を用いて最終容量に合わせる。ｐＨをチェックする。懸濁液中のＡ／Ｃ／Ｎ／５３（導入遺伝子として野生型ｐ５３を有するアデノウイルス）薬物物質の必要容量および必要容量の希釈剤を算出し、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３注射剤を作製する。最終的なＡ／Ｃ／Ｎ／５３注射剤がＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含む場合、希釈剤中に１０％過剰のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含む貯蔵溶液を調製する。算出された量の懸濁液中のＡ／Ｃ／Ｎ／５３薬物物質および希釈剤をステンレス鋼容器に充填し、そして混合する。必要な場合は、総Ａ／Ｃ／Ｎ／５３注射剤バッチ容量の１０％に基づいて、希釈剤の全てを添加する前にＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０溶液を充填する。この懸濁液を滅菌フィルター（０．２２μｍまたは等価物）を通して無菌的に濾過する。濾過後に、このフィルターの完全性を試験する。滅菌した懸濁液を、適切な容量のバイアルに収集し、そして充填する。バイアルに栓をつけ、そして密閉する。
【００４０】
実施例１、２、３、および４についての安定性データを、それぞれ以下の表１、２、３、および４に示す。
【００４１】
以下の表では、抗増殖アッセイは、産物が癌細胞を抑制する能力を測定するために用いられるバイオアッセイであり、そして一般に、Ｗｉｌｌｓら，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，５：１０７９−１０８８により用いられた手順に基づく。列挙された数は活性を示し、一方、コントロールは活性を有さない。
【００４２】
「プラークアッセイ」は、希釈の関数としてウイルスプラークの数を評価することによって培養物中のウイルス粒子を測定し、そして一般的に、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＰｒｅｖｅｃ，Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第７巻：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ ＮＪ）１０９−１２８頁（１９９１）に記載される手順に基づく；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｓｍｉｌｅｙ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，およびＮａｉｒｎ，Ｒ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第３６巻，５９−７４頁（１９７７）もまた参照のこと。
【００４３】
「ＦＡＣＳ」アッセイは、ウイルスが細胞に感染する能力を示し、そしてこれらの測定は一般に、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１１８６５（１９９８年１月１５日に公開されたＷＯ ９８／０１５８２）に記載される方法に基づく。次の右側の欄では、「濃度」という見出しの下で表された数は、ウイルス粒子の総数の濃度を表す。最後に、「粒子／ＦＡＣＳ比」という見出しの下の数は、感染性ウイルス粒子の数と比較した場合のウイルス粒子の総数の比を表し、これにより、ウイルス調製物の相対的な能力を示す。
【００４４】
「ＵＶ」の見出しの下のデータは、光散乱の指標として、波長Ａ320／Ａ260についてのＵＶ吸収の比によって示されたウイルス粒子の凝集を示す。基本的に、３２０ナノメーターの波長での吸光度は、光散乱の量を測定し、一方、２６０ナノメートルの波長での吸光度は、ＤＮＡの量と相関する。
【００４５】
「条件」の下で表の第２欄に列挙した温度は、貯蔵温度を表す。生理学的アッセイは、３７℃にて行われ、そして最後の欄におけるｐＨは、室温、約２５℃にて測定される。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
（実施例５）
実施例５についての処方：Ａ／Ｃ／Ｎ／５３（７．５×１０11粒子／ｍＬ）、トロメタミン（ＴＲＩＳ）（１．７ｍｇ／ｍＬ）、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（１．７ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（２０ｍｇ／ｍＬ）、塩化マグネシウム六水和物（０．４ｍｇ／ｍＬ）、グリセロール（１００ｍｇ／ｍＬ）、塩化ナトリウム（５．８ｍｇ／ｍＬ）、最終容量＝１０ｍＬ。
【００５０】
【表５】
いくつかの場合では、４℃での貯蔵の間に処方物中で微粒子が形成されるのが観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる微粒子の分析は、この微粒子が、微量の不純物（すなわち、さらなるタンパク質およびいくらかの未成熟ウイルス粒子）から構成され、従って、これらの微粒子は処方物の生存力に影響を及ぼさないことを示唆する。それにもかかわらず、処方物をさらに明澄化するための（起こり得る微粒子形成を防止するための）好ましい実施態様では、必要に応じて微細濾過の工程を行って、ウイルス粒子はほとんど失わずに、任意の潜在的な微粒子を除去し得る（微細濾過を実施する場合、濾過容量あたりで十分な微細濾過膜表面積が、微粒子を除去しながらもウイルスの損失は回避するために重要であることに留意すべきである）。
【００５１】
さらに、好ましい実施態様では、本発明者らは、攪拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、攪拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））が、微粒子形成を加速し得、それゆえ、明澄化プロセスにおける必要に応じたさらなる工程であることを見出した。従って、穏やかな攪拌（例えば、一晩、１０℃、磁性攪拌子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｂａｒ）を用いて）に続いての微細濾過は微粒子を除去し、その結果、再度攪拌してもそれ以上微粒子が再形成されないことが示された。
【００５２】
凍結／融解のサイクルが再攪拌の間に微粒子形成を促進し得ることもまた見出された。従って、別の好ましい手順では、１回以上の凍結／融解サイクルが必要に応じて実施され得、冷蔵温度（例えば、４℃）でのウイルス最終産物の貯蔵の間の微粒子形成を防止するために、続いて攪拌、次いで微細濾過が実施され得る。
【００５３】
（ウイルス含有組成物を濃縮および精製する方法）
本出願はまた、接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（本明細書以下では時々、「ＴＦＦ」という）を用いて既存のウイルス調製物を安定に濃縮する新規な方法を開示し、広範囲の所望の濃度で臨床的投薬量を容易に選択および調製することを可能にする。ウイルス調製物を濃縮する新規な方法は以下の工程を含む：
（ａ）ポリヒドロキシ炭化水素を、約２０％以上の最終ポリヒドロキシ炭化水素濃度になるまでウイルス調製物に添加する工程；および
（ｂ）このウイルス調製物を濾過プロセスに供する工程であって、ここで、このウイルスの濃度が、このウイルスを維持しながら、フィルターを介してこの希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることにより増加する、工程。
【００５４】
本発明の方法は、以下を含むがこれらに限定されない広範囲のウイルスに受け入れられる：アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルスなど；アデノウイルスが特に好ましい。このウイルスは、好ましくは、組換えウイルスであるが、臨床的単離体、弱毒化ワクチン株などを含み得る。本発明は、遺伝子治療における使用のための異種導入遺伝子を保有する組換えウイルスを濃縮するために特に有用である。このようなウイルスは、潜在的に不安定化にする力（例えば、ウイルス調製物を濃縮する方法に伴うさらなる機械的剪断力）に対して特に傷付きやすい。本発明の方法によって濃縮され得る例示的な組換えアデノウイルスは、Ａ／Ｃ／Ｎ／５３であり、これは、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９５／１１９８４号に開示される。
【００５５】
本発明の方法に従ってウイルスを濃縮するために用いられる濾過プロセスは、任意の濾過プロセス（例えば、限外濾過）を含み得、ここで、ウイルスの濃度は、希釈剤がウイルス調製物から除去されるが、ウイルスがこのフィルターを通過できず、それゆえ、濃縮された形態でウイルス調製物中に残存するような様式で、希釈剤をフィルターに通すことによって、増加し得る。限外濾過は、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌ．ＺｅｍａｎおよびＡ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋａｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６）に詳細に記載される。特に好ましい濾過プロセスは、例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」と題されたＭＩＬＬＥＰＯＲＥカタログの１７７−２０２頁（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，１９９５／９６）に記載されるような、接線流濾過（「ＴＦＦ」）である。好ましいＴＦＦ装置は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，８０ Ａｓｈｂｙ Ｒｄ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（インターネットアドレス：ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）からのＰｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ濾過系またはＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ濾過系のいずれかを含み、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ系が特に好ましい。好ましい実施態様では、本発明の方法は、約２℃〜２７℃の範囲の温度で実施される。
【００５６】
他の濃縮プロセスは、本発明に従ってウイルス調製物を濃縮するために用いられ得る。例えば、ポリヒドロキシ炭化水素の使用は、遠心分離によってウイルス調製物を濃縮するために有利に用いられ得る。従って、本発明はまた、以下の工程を含む、ウイルス調製物を濃縮するための方法を提供する：
（ａ）３５％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第１層を含む組成物を遠心分離する工程であって、この第１層が、５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の濃度のポリヒドロキシ炭化水素を含む第２層に重層され、この第２層が、ウイルスを含む第３層に重層される、工程；ならびに
（ｂ）このウイルスをこの第１層から回収する工程。
【００５７】
例として、アデノウイルス調製物を、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機のスウィングバケットローターを用いる低速遠心分離によって３，２００ｇで濃縮し得る。このことを達成するために、このウイルス調製物は、複数の５ｍｌチューブに入れられ得る。各チューブは、チューブの底の第１層において６．２５容量％の７０％グリセロールを含有し、この層に２．５容量％の２０％グリセロールが重層され、このウイルス調製物が頂部に置かれ得る。次いで、この調製物は、３，２００ｇにて４℃で約１６時間遠心分離されて、濃縮されたウイルスがグリセロール層中にペレット化され、次いで新たに濃縮されたウイルス調製物は続いて第１層から回収される。上記の手順によって濃縮されたウイルスは、良好な光散乱特性を有しており、適切な感染特性を有していた。
【００５８】
本発明の方法において用いられるポリヒドロキシ炭化水素に関して、「ポリヒドロキシ炭化水素」とは、２個以上（好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個）の水酸基で置換された、分枝状、直鎖状、または環式の化合物を意味し、そして有効量のポリヒドロキシ炭化水素は、本発明の処方物中のウイルスを、潜在的に不安定化する力（例えば、濃縮プロセスの間に生じる機械的剪断力）に対して安定化するのに充分な量である。好ましくは、本発明のウイルス濃縮方法におけるポリヒドロキシ炭化水素は、２０％、より好ましくは２５％の最少濃度で存在する。本発明に使用するためのポリヒドロキシ炭化水素は、好ましくは、ポリヒドロキシ置換アルキル化合物（分枝状または非分枝状）（好ましくは２〜７個の炭素原子を有する）であり、そしてグリセロール、ソルビトール、およびポリプロパノールを含み得る。グリセロールが、特に好ましい。
【００５９】
本発明者らの新規な、ウイルス濃度を増加させる方法は、例えば、種々の処理工程（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）の間で有意に高い処理量を可能にすることにより、問題のあるネックを排除することによって処理を増強するというさらなる利点を有する。従って、好ましい実施態様では、本発明に従ってウイルス調製物を濃縮する方法を、ウイルスを精製する方法に適用し得、ここでサイズ排除クロマトグラフィー工程（例えば、ゲル濾過）が、陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて実施される。この実施態様では、速度制限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の前にウイルスを濃縮するために必要となる機械的剪断力に由来するウイルス安定性に対するさらなるおそれだけでなく、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から溶出されたウイルス調製物が代表的に、ウイルス安定性をさらに損なう高レベルの塩および他の不純物を含むという事実に起因するウイルス安定性に対するさらなるおそれもまた存在する。従って、特に好ましい実施態様では、本発明は、以下の工程を含む、ウイルス調製物を精製する方法を提供する：
（ａ）このウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで、このウイルスが、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からウイルス調製産物として溶出される、工程；
（ｂ）この調製物中の該ポリヒドロキシ炭化水素の最終濃度が約２５％以上に達するように、工程（ａ）のウイルス調製産物にポリヒドロキシ炭化水素を添加する工程；および
（ｃ）このウイルスを保持しながら、フィルターを介して希釈剤がこのウイルス調製物から除去されるようにこの調製物に圧力をかけることによって、工程（ｂ）のウイルス調製産物中のウイルスの濃度を増加させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の濃縮されたウイルス調製産物を１以上のさらなる処理工程に供する工程。
【００６０】
陰イオン交換クロマトグラフィーに関連して上記に記載した好ましい実施態様では、最少レベルのグリセロールは、（本発明の濃縮方法の一般的な適用における２０％という最少濃度ではなく）２５％である。なぜなら、この特定の適用は、陰イオン交換カラムから溶出された産物における高い塩濃度によって与えられる、安定性に対するさらなるおそれを考慮に入れればならないからである。２５％グリセロール（好ましくは、３０％）の添加は、例えば、４℃にて１０日間を超える、塩含有ＤＥＡＥプールの安定性を生じる；それゆえ、続いてのウイルス濃縮および／またはゲル濾過の工程は、１０日間にわたりかなりの融通性を伴って、別の日に実施され得る。認識されるように、２５％以上のより高い濃度のポリヒドロキシ炭化水素の使用もまた、本発明の方法において用いられ得、ここで、このウイルス調製物は、他の処理条件に起因して高い塩含量を含む。
【実施例】
【００６１】
（Ｖ．本発明の方法の実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を例示する；本発明の範囲は、それによって限定されるとは解釈されるべきでない。
【００６２】
（簡潔な概要）濃縮されたバッチは、発酵回収物に由来する、凍結された粗ウイルス材料を用いて開始する。１つの実施態様では、アデノウイルス産物を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって最初に精製する。次いで、この調製物をサイズ排除カラムにロードする前に、陰イオン交換プールを、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールの存在下で接線流濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し得る。あるいは、別の実施態様では、ＴＦＦ濃縮工程を、２０％（ｖ／ｖ）以上（好ましくは、２５％）のグリセロールの存在下で、サイズ排除クロマトグラフィー後に実施し得る。
【００６３】
（ＴＦＦの前の陰イオン交換クロマトグラフィーによる出発材料の調製）
好ましい実施態様では、アデノウイルス陰イオン交換プールを、濃縮のために以下の通りに調製する。発酵工程および回収工程由来の凍結したウイルス材料を、融解し、そして０．４５μｍ親水性膜を通して濾過する。濾液の塩濃度を、４Ｍ塩化ナトリウムを添加することにより調整する。次いで、この供給溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、２６０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース（緩衝液Ａ）で予め平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラムに適用する。アデノウイルスは、この陰イオン交換樹脂に結合し、一方、媒体の大部分および宿主細胞の不純物はカラムを通過して、結局、電荷を消費する。このカラムを最初に４容量の緩衝液Ａで洗浄し、続いて８ベッド容量の９４％緩衝液Ａおよび６％緩衝液Ｂ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、６００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース））という第２のイソクラティク（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）洗浄液で洗浄してさらなる不純物を除去する。このウイルスを、３０ベッド容量の、６％〜１００％の緩衝液Ｂの線形勾配を用いてカラムから溶出させる。Ａ280によって決定した場合の溶出プロフィールのアデノウイルスピークを回収する。次いで、グリセロールを、さらなる処理のために３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度でＤＥＡＥプールに添加する。
【００６４】
（接線流濾過を用いてのＤＥＡＥプールの濃縮）
ＤＥＡＥプール（上記の説明に従って調製される）を、１００万分子量カットオフのＢｉｏｍａｘ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＴＦＦユニット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて１０倍〜２０倍濃縮する。このプロセスを、２〜１０℃または室温（２５℃）のいずれかで実施する。以下の濾過パラメーターをこの手順において用いる：平均入口圧＝１４ｐｓｉ；平均透過圧＝ｏ
ｐｓｉ；平均流速＝１３リットル／時間平方メートル。アデノウイルスの最終濃度は、約１．０〜２．０×１０13粒子／ｍｌに達する。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ−ＨＰＬＣおよびＵＶ吸光度（Ａ260）分析に基づくと、濃縮工程の回収率は、有意な凝集を伴わずに、＞８０％である（Ａ320／Ａ260による光散乱アッセイ）。
【００６５】
（サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）による緩衝液交換）
濃縮されたアデノウイルス調製物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０％グリセロール（緩衝液Ｃ）または１１ｍＭリン酸ナトリウム、１４ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０％グリセロール（ｐＨ ７．８）（緩衝液Ｄ）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００サイズ排除カラムに適用する。このカラムを、平衡化緩衝液で溶出させる。Ａ280によって決定した場合の溶出プロフィールのアデノウイルスピークを回収し、そしてプールする。濃縮されたアデノウイルス調製物を、０．２μｍの親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して２〜１０℃にて濾過し、そして−８０℃またはより高い温度（例えば、２〜１０℃）にて貯蔵し得る。
【００６６】
（接線流濾過を用いてのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００プールの濃縮）
上記で議論したように、本発明の好ましい実施態様は、陰イオン交換クロマトグラフィー後だがゲル濾過前にウイルスを濃縮する工程を含む。しかし、別の実施態様では、ウイルス調製物を濃縮する開示された方法はまた、（たとえウイルス濃縮工程が、陰イオン交換工程とゲル濾過工程との間で用いられない場合であっても）ゲル濾過工程の後に用いられ得る。この場合、濾過パラメーターは、ポリヒドロキシ炭化水素（例えば、グリセロール）が２０％（ｖ／ｖ）程度の低い最終濃度でＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００プールに添加され得ること以外は、ＤＥＡＥプールの濃縮のための濾過パラメーターと同じである。なぜなら、このＤＥＡＥプールにおいて高い塩濃度を扱う必要性がもうないからである。このことについて、ポリヒドロキシ炭化水素の添加がゲル濾過後まで延期される場合、このＤＥＡＥプールは（その高い塩濃度によるこのＤＥＡＥプールの傷付き易さに起因して）すぐにゲル濾過カラムに適用されるべきであることに留意すべきである。従って、（本発明に従って）ポリヒドロキシ炭化水素をこのＤＥＡＥプールに添加することのさらなる利点が、陰イオン交換クロマトグラフィーと続く処理との間の期間の時間間隔の選択肢および貯蔵の選択肢に関して増加した融通性であることが理解され得る。
【００６７】
ウイルス調製物を濃縮する方法を、種々の精製方法に関連して適用し得る。精製方法についてのさらなる情報に関しては、例えば、Ｈｕｙｇｈｅら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，第６巻，１４０３−１４１６頁（１９９５）および米国特許出願第０８／９８９，２２７号（特に本明細書中に参考として援用される）を参照し得る。
【００６８】
（ＶＩ．接線流濾過を用いてウイルス調製物を濃縮する方法についての安定性データ）
以下の実験データによって示されるように、本発明の方法は、ウイルスを濃縮する機械的剪断力にもかからわず、そしてＤＥＡＥプール中での高い塩レベルのような厳しい条件にもかかわらず、大いに増強されたウイルス安定性を可能にする。従って、本発明の方法は、とりわけ、以下を可能にする：（１）任意の所望の濃度での臨床投薬量の容易な調製（たとえ、より低い濃度を有する材料で始めた場合でさえも）、（２）処理の増強（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの間の有意に多い処理量を可能にすることによる）、および（３）２〜１０℃で１０日間を超える塩含有ＤＥＡＥプールの安定性（これにより、ウイルス濃縮および／またはゲル濾過という続きの工程が、１０日間の期間にわたるかなりの融通性を伴って別の日に実施されることを可能にする）。
【００６９】
（Ａ．ＤＥＡＥクロマトグラフィーに続くウイルスの濃縮）
以下の３つの実施例では、安定な濃度のアデノウイルスを、（本発明の方法に従って）３０％グリセロール中のＤＥＡＥプールを濃縮することにより調製した。次いで、この調製物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲル濾過クロマトグラフィーによるさらなる精製に供して、試験するための最終処方物を得た。
【００７０】
【表６】
（Ｂ．ゲル濾過に続いてのウイルスの濃縮）
（実施例Ｓ−１）
以下の実施例では、ウイルス調製物を、ゲル濾過に続いて２０％グリセロール中で濃縮した。
【００７１】
【表７】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が、参考として援用されると具体的に、そして個々に示された場合と同じ程度に、その全体が参考として援用される。
【００７２】
本発明の改変および変更は、当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実施態様は、例示のためにのみ提供され、そして本発明は、それによって制限されると解釈されるべきでない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む、組成物。
【請求項１】
約２℃〜２７℃の範囲の温度で約７〜約８．５の範囲のｐＨを維持するように緩衝化されたポリヒドロキシ炭化水素を含む処方物中にウイルスを含む、組成物。
【公開番号】特開２００６−１６６９２５（Ｐ２００６−１６６９２５Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０３３６（Ｐ２００６−３０３３６）
【出願日】平成１８年２月７日（２００６．２．７）
【分割の表示】特願２０００−５３１５９６（Ｐ２０００−５３１５９６）の分割
【原出願日】平成１１年２月１２日（１９９９．２．１２）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月７日（２００６．２．７）
【分割の表示】特願２０００−５３１５９６（Ｐ２０００−５３１５９６）の分割
【原出願日】平成１１年２月１２日（１９９９．２．１２）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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