エシェリキア・コリによる異種タンパク質の発酵的製造方法
【課題】Ｅ．コリ菌株による異種タンパク質の発酵的製造方法であって、該タンパク質が発酵培地中に分泌される製造方法を提供する。
【解決手段】Ｅ．コリ菌株を発酵培地中で培養するにあたり、該Ｅ．コリ菌株が、異種タンパク質をコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されて含み、かつ該Ｅ．コリ菌株が、前記異種タンパク質を発酵培地中に分泌する方法において、該Ｅ．コリ菌株が、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性を有することを特徴とする方法によって解決される。
【解決手段】Ｅ．コリ菌株を発酵培地中で培養するにあたり、該Ｅ．コリ菌株が、異種タンパク質をコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されて含み、かつ該Ｅ．コリ菌株が、前記異種タンパク質を発酵培地中に分泌する方法において、該Ｅ．コリ菌株が、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性を有することを特徴とする方法によって解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性を有するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株による異種タンパク質の発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質製薬学（医薬タンパク質／バイオロジクス）に関する市場は、近年になって大きく成長している。特に重要なタンパク質医薬品は、真核性タンパク質、とりわけ哺乳動物タンパク質及びヒトのタンパク質である。重要な医薬品タンパク質（製剤学的に有効なタンパク質）の例は、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン及びペプチドホルモン並びに抗体及び抗体フラグメントである。医薬品タンパク質に関して今なお非常に高い生産コストに基づき、絶え間なく、より効率的であり、そのためより低コストで医薬品タンパク質を製造するための方法及び系が模索されている。
【０００３】
一般に、組み換えタンパク質は、哺乳動物細胞培養か、微生物の系のいずれかで製造される。微生物の系は、哺乳動物細胞培養に対して、こうして組み換えタンパク質がより短時間でかつより低コストで製造できるという利点を有する。従って、組み換えタンパク質の生産のためには、とりわけ細菌が適している。その非常に十分に調査された遺伝学と生理学、短い世代時間及び取り扱いの容易さに基づき、グラム陰性の腸内細菌であるエシェリキア・コリ（Ｅ．コリ）は、目下、組み換えタンパク質の生産のために最も頻繁に用いられる生物である。Ｅ．コリにおける組み換えタンパク質のための生産方法であって、標的タンパク質が高収率かつ正確なフォールディングで発酵培地中に直接分泌される方法が特に好ましい。
【０００４】
文献には、発酵培地中への組み換えタンパク質の分泌が達成される一連のＥ．コリ菌株とＥ．コリ菌株を用いた方法が開示されている。ここで、例えばＵＳ２００８２５４５１１号には、褐色リポタンパク質（Ｌｐｐ）に関する遺伝子に突然変異を有し、かつ過剰産生された異種タンパク質を培地中に排出する種々のＥ．コリ菌株が記載されている。
【０００５】
細胞がアミノ酸もしくはエネルギー源の欠乏状況に陥る条件下で代謝を調節及び連係するために、Ｅ．コリは、"緊縮制御"と呼ばれる機構を有する。その際に、アラーモングアノシン四リン酸（ｐｐＧｐｐ）及びグアノシン五リン酸（ｐｐｐＧｐｐ）（以下に一般に（ｐ）ｐｐＧｐｐとまとめる）は、調節性シグナル分子として、とりわけ、細胞内の（ｐ）ｐｐＧｐｐ濃度を高めることによって、安定なＲＮＡ類（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の合成に歯止めがかかり、幾つかのアミノ酸生合成遺伝子の発現が強化されることによって、重要な役割を担う（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）。Ｅ．コリは、（ｐ）ｐｐＧｐｐをＡＴＰ及びＧＤＰから（ｐｐＧｐｐ）もしくはＡＴＰ及びＧＴＰから（ｐｐｐＧｐｐ）合成するための２種類の酵素を有する：ｒｅｌＡ遺伝子によってコードされる（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩ（ＰＳＩ）は、細胞がアミノ酸欠乏に晒されている場合に、緊縮制御の範囲で（ｐ）ｐｐＧｐｐ合成を担う。しかしながら、細胞の増殖が、一次炭素源の消耗に基づき減速されると、その（ｐ）ｐｐＧＰＰ合成は、主に、ｓｐｏＴ遺伝子によってコードされる（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ（ＰＳＩＩ）によって行われる。ＰＳＩとの違いにおいて、ｓｐｏＴ遺伝子産物は、（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼ活性の他に、さらにまた（ｐ）ｐｐＧｐｐ−３′−ピロホスホヒドロラーゼ活性を有し、かつそれにより細胞の（ｐ）ｐｐＧｐｐ−濃度を、また能動的にこの化合物の分解によって制御することができる（Ｇｅｎｔｒｙ ｕｎｄ Ｃａｓｈｅｌ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９，１３７３−８４）。ＰＳＩＩ酵素の２つの異なる触媒活性に関する活性中心は、確かに同一ではないものの、該タンパク質のＮ末端領域に狭い空間的近隣で位置していることが示された。
【０００６】
本発明の範囲においては、名称"ＰＳＩＩ−活性"とは、一方で（ｐ）ｐｐＧｐｐ−合成を触媒でき、かつ他方で（ｐ）ｐｐＧｐｐ−加水分解をも触媒できる酵素の活性を表すべきである。
【０００７】
Ｅ．コリのｒｅｌＡ−突然変異体とｓｐｏＴ−突然変異体のいずれも公知である（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）。
【０００８】
挿入エレメントＩＳ２がｒｅｌＡ−遺伝子配列中に組み込まれているｒｅｌＡ１突然変異（ｒｅｌＡ：：ＩＳ２）を有する菌株は、さらに低いＰＳＩ−残留活性を示し、それに対してｒｅｌＡ−欠失突然変異体（ΔｒｅｌＡ）は、もはやＰＳＩ−活性を有さない（Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，２１１４６−５２）。緊縮制御の機構がインタクトなｒｅｌＡ−野生型菌株（"緊縮な"表現型）との違いにおいて、低減された又は失われたＰＳＩ−活性を有するｒｅｌＡ−突然変異体は、アミノ酸欠乏状況に陥った場合に、いわゆる"緩和された（ｒｅｌａｘｉｅｒｔｅｎ）"表現型を示す。このことは、とりわけ、その細胞が、基底濃度を越えて（ｐ）ｐｐＧｐｐを蓄積しえず、かつ安定なＲＮＡ分子の合成が停止されずに、そのまま進行するという形で現れる。その基底濃度とは、文献（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）から知られている、無制限の増殖条件下での対数増殖細胞についての（ｐ）ｐｐＧｐｐに関する濃度範囲（１０〜３０ピコモル／Ａ450）を表すべきである。Ｇｉｔｔｅｒ他（１９９５，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３，８９−９２）から、ｒｅｌＡ−突然変異体のＥ．コリ ＣＰ７９が、ｒｅｌＡ−野生型菌株のＣＰ７８と比較して、人工的に誘発されたアミノ酸欠乏条件下で、ペリプラズム中に分泌されるタンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ又はインターフェロンα１を培養培地中に増大排出することは公知である。
【０００９】
ｓｐｏＴ遺伝子中に突然変異を有する菌株は、ＰＳＩＩ−活性を害する程度に応じて、特徴的な（ｐ）ｐｐＧｐｐ−代謝の欠損を示す。とりわけ、ｉ）より低い増殖速度と結びついた、正常な（平衡した）増殖の間での高められた基底ｐｐＧｐｐ濃度と、ｉｉ）緊縮応答の間のより高く誘導されたｐｐＧｐｐ濃度と、ｉｉｉ）緊縮応答が終わった後のより低いｐｐＧｐｐ転化率とを示す。
【００１０】
Ｅ．コリのｓｐｏＴ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）は、配列番号２の配列を有するｓｐｏＴタンパク質をコードしている。該ｓｐｏＴ遺伝子は、５つの遺伝子ｇｍｋ−ｒｐｏＺ−ｓｐｏＴ−ｓｐｏＵ−ｒｅｃＧを含むオペロンの部分として発現される。該オペロンの発現と、ｓｐｏＴ発現もまた、一方で、ｇｍｋ遺伝子の上流にあるＰ１−プロモーターと、他方で、ｇｍｋ遺伝子のＣ末端をコードする領域中に位置するＰ２−プロモーターとによって調節される（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）。ｓｐｏＴ１−突然変異（配列番号３）を有する菌株の場合に、そのｓｐｏＴ−タンパク質は、アスパラギン酸残基８４の後ろでグルタミン及びアスパラギン酸の２つのアミノ酸の挿入と、位置２５５にヒスチジン−チロシン置換とを有する（Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，２５９７−６０６）。更に、一連のｓｐｏＴ−挿入突然変異体もしくはｓｐｏＴ−欠失突然変異体も記載された（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，５９８０−９０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ２００８２５４５１１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６
【非特許文献２】Ｇｅｎｔｒｙ ｕｎｄ Ｃａｓｈｅｌ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９，１３７３−８４
【非特許文献３】Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，２１１４６−５２
【非特許文献４】Ｇｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３，８９−９２
【非特許文献５】Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，２５９７−６０６
【非特許文献６】Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，５９８０−９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、Ｅ．コリ菌株による異種タンパク質の発酵的製造方法であって、該タンパク質が発酵培地中に分泌される製造方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題は、Ｅ．コリ菌株を発酵培地中で培養するにあたり、該Ｅ．コリ菌株が、異種タンパク質をコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されて含み、かつ該Ｅ．コリ菌株が、前記異種タンパク質を発酵培地中に分泌する方法において、該Ｅ．コリ菌株が、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性を有することを特徴とする方法によって解決される。
【００１５】
Ｅ．コリ菌株の減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性とは、該Ｅ．コリ菌株が、ＰＳＩＩ−活性の改変前のＥ．コリ菌株（以下で、出発菌株と呼ぶ）の最大で５０％の、好ましくは最大で２０％の（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性（ＰＳＩＩ−活性）を有することを表すべきである。特に好ましくは、菌株の減衰されたＰＳＩＩ−活性とは、この菌株中のＰＳＩＩ−活性の欠乏を表すべきである。
【００１６】
菌株のＰＳＩＩ−酵素のシンセターゼ活性及びヒドロラーゼ活性の測定方法は、当業者に公知である（Ｍｅｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，１４０１−１４１１）。
【００１７】
微生物菌株中でのＰＳＩＩ−活性の減衰のための方法は、技術水準において公知である。ＰＳＩＩ−活性は、例えば、ｓｐｏＴ−遺伝子の読み枠中に、該酵素の活性の低下をもたらす突然変異（単独もしくは複数のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失）を導入することによって減衰させることができる。更に、細胞のＰＳＩＩ−活性は、ｓｐｏＴ−遺伝子の発現を、発現調節に必要な少なくとも１つのエレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位）を、単独もしくは複数のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失によって突然変異させることで低減させることによって減衰させることもできる。その塩基配列においてｓｐｏＴ−野生型遺伝子の配列と突然変異に基づき異なる係るＤＮＡ配列は、以下で、ｓｐｏＴ−アレルとも呼称する。また、ｓｐｏＴ−遺伝子又はその調節領域の染色体からの完全な欠失によっても、ＰＳＩＩ−活性の減衰が可能である。
【００１８】
当業者には、ｓｐｏＴ−アレルの作成方法は公知である。ｓｐｏＴ−遺伝子のアレルは、例えばｓｐｏＴ−野生型遺伝子のＤＮＡを出発材料として用いて、非特異的もしくは標的突然変異誘発によって製造することができる。ｓｐｏＴ−遺伝子又はｓｐｏＴ−遺伝子のプロモーター領域内での非特異的突然変異は、例えばニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸などの化学薬剤によって、及び／又は物理的方法によって、及び／又は一定の条件下で行われるＰＣＲ反応によって引き起こすことができる。ＤＮＡ断片内の特異的部位での突然変異の導入方法は、公知である。ここで、例えばｓｐｏＴ−遺伝子及びそのプロモーター領域を含むＤＮＡ断片中の１もしくは複数の塩基の交換は、プライマーとして好適なオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって行うことができる。更に、ｓｐｏＴ−遺伝子全体もしくは新たなｓｐｏＴ−アレルは、遺伝子合成によって製造することができる。
【００１９】
ｓｐｏＴ−アレルは、一般にまず、インビトロで作成され、引き続き細胞の染色体中に導入され、それにより本来存在するｓｐｏＴ−野生型遺伝子が置き換えられ、こうしてその菌株のｓｐｏＴ−突然変異体が作成される。ｓｐｏＴ−アレルは、公知の標準的方法によって、宿主細胞の染色体中に、ｓｐｏＴ−野生型遺伝子／プロモーターの代わりに導入することができる。それは、例えばＬｉｎｋ他（１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−３７）によって記載された、ある遺伝子への相同組み換えの機構による染色体性突然変異の導入方法によって行うことができる。ｓｐｏＴ−遺伝子全体もしくはその一部の染色体的欠失の導入は、例えばλ−Ｒｅｄレコンビナーゼ系を用いて、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−５）によって記載される方法に従って可能である。ｓｐｏＴ−アレルは、また、Ｐ１−ファージによる形質導入又は接合によって、ｓｐｏＴ−突然変異を有する菌株からｓｐｏＴ−野生型菌株へと移すことができ、その際、ｓｐｏＴ−野生型遺伝子は、染色体内で相応のｓｐｏＴ−アレルと置き換えられる。記載されたｓｐｏＴ−突然変異を有するＥ．コリ菌株の他に、当業者には、任意のＥ．コリ菌株のｓｐｏＴ−突然変異の作成方法も知られている。
【００２０】
好ましいｓｐｏＴ−突然変異は、ｓｐｏＴ１−突然変異であるか、又は好ましいものとして定義された減衰されたＰＳＩＩ−活性をもたらすｓｐｏＴ−突然変異である。ＰＳＩＩ−活性の完全な損失をもたらす突然変異が特に好ましい。
【００２１】
好ましくは、本発明による方法で使用されるＥ．コリ菌株は、減衰されたＰＳＩＩ−活性の他に、緩和された表現型をもたらすｒｅｌＡ−遺伝子内の突然変異を有する。
【００２２】
好ましいｒｅｌＡ−突然変異は、例えばｒｅｌＡ１−突然変異であるか、又はＰＳＩ−活性の完全な損失をもたらすｒｅｌＡ−突然変異である。
【００２３】
同様に好ましくは、本発明による方法で使用されるＥ．コリ菌株は、減衰されたＰＳＩＩ−活性の他に、"漏出"突然変異を有する。"漏出突然変異"とは、細胞外膜もしくは細胞壁の構造エレメントのための、ｏｍｐ−遺伝子、ｔｏｌ−遺伝子、ｅｘｃＤ−遺伝子、ｅｘｃＣ−遺伝子、ｌｐｐ−遺伝子、ｐａｌ−遺伝子、ｅｎｖ−遺伝子及びｌｋｙ−遺伝子の群から選択される遺伝子中の突然変異であって、該細胞がペリプラズム性タンパク質の培地中への増大放出をもたらす突然変異を表すべきである（Ｓｈｏｋｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（２００３），６５４−６６４）。ｌｐｐ−遺伝子における"漏出"突然変異が好ましく、ｌｐｐ１−突然変異、ｌｐｐ３−突然変異及びｌｐｐ−欠失突然変異の群から選択される突然変異が特に有利である。ｌｐｐ１−突然変異は、位置７７でのシステイン残基に対するアルギニン残基の交換をもたらすｌｐｐ−遺伝子内での突然変異であり、ｌｐｐ３−突然変異は、位置１４でのアスパラギン酸残基に対するグリシン残基の交換をもたらすｌｐｐ−遺伝子内での突然変異である。これらの突然変異は、ＵＳ２００８２５４５１１号に詳細に記載されている。ｌｐｐ−欠失突然変異は、好ましくは、ｌｐｐ−遺伝子自体又はｌｐｐ−遺伝子のプロモーター領域における少なくとも１つのヌクレオチドの欠失であって、該細胞がペリプラズム性タンパク質に関しての高められた漏出を有することがもたらされる欠失である。
【００２４】
高められた漏出とは、本発明の範囲においては、細胞の発酵により、同じ条件下で、Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の発酵の場合よりも高められた濃度のペリプラズム性タンパク質、例えばアルカリ性ホスファターゼが栄養培地中に存在することを表すべきである。
【００２５】
減衰されたＰＳＩＩ−活性の他に、緩和された表現型と"漏出"突然変異のいずれも有するＥ．コリ菌株が特に好ましく、その際、ここでも、それぞれ挙げられる好ましい実施形態が特に好ましい。
【００２６】
異種タンパク質とは、本発明の範囲においては、Ｅ．コリＫ１２菌株のプロテオーム、すなわち全体の天然のタンパク質一式に属さないタンパク質を表すべきである。Ｅ．コリＫ１２菌株中に本来存在する全てのタンパク質は、Ｅ．コリＫ１２の公知のゲノム配列から導き出すことができる（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３）。Ｅ．コリ中で産生される異種タンパク質は、その都度の異種タンパク質について天然条件下で同種宿主細胞において特徴的であるか又は同種宿主細胞から得られるものよりも、５０％より高い、好ましくは７０％より高い、特に好ましくは９０％より高い比活性もしくは作用（機能）を有する。
【００２７】
好ましくは、異種タンパク質は、真核性タンパク質であり、特に好ましくは、１もしくは複数のジスルフィド結合を有するか又はその機能的な形態で二量体もしくは多量体として存在するタンパク質であり、すなわち該タンパク質は、四次構造を有し、かつ複数の同一の（相同の）もしくは非同一の（非相同の）サブユニットから構成されている。
【００２８】
最も重要な異種タンパク質クラスには、抗体及びそのフラグメント、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン、リポカリン、アンチカリン、酵素、結合タンパク質及び分子骨格（ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄ）及びそれらから誘導されるタンパク質が該当する。前記のタンパク質クラスのための例は、とりわけ重鎖抗体及びそのフラグメント（例えばナノボディ）、単鎖抗体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、白血病阻害因子、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子、形質転換増殖因子、肝細胞増殖因子、骨形成因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来細胞栄養因子、血管新生阻害因子、組織性プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固因子、トリプシン阻害因子、エラスターゼ阻害因子、補体成分、低酸素症誘導性ストレスタンパク質、癌原遺伝子産物、転写因子、ウイルス構成タンパク質、プロインスリン、プロウロキナーゼ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ニューロトロフィン、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド−ジスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、リポコルチン、レプチン、血清アルブミン、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ、ＣＮＴＦ及びシクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼである。分子骨格由来タンパク質のための例は、とりわけエビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）（ＣＴＬＡ−４由来）、アフィボディ（Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡから）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｅ）（ヒトＡドメインファミリー由来）、トランスボディ（Ｔｒａｎｓｂｏｄｉｅｓ）（トランスフェリン由来）、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリン繰り返しタンパク質由来）、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）（フィブロネクチンＩＩＩ由来）、ペプチドアプタマー（チオレドキシン由来）、ミクロボディ（Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ）（ミクロプロテイン由来）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｅ）（ユビキチン由来）、α−クリスタリン、カリブドトキシン、テトラネクチン、ＲＡＳ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、タンパク質阻害因子のクニッツ型ドメインである。
【００２９】
複数のタンパク質サブユニットからなる特に重要なタンパク質クラスは、抗体である。抗体は、研究において、診断において、かつ治療剤として広範囲で使用されるので、特に効率的かつ工業的規模で可能な製造方法が必要とされる。
【００３０】
また、機能的なＦａｂ−抗体フラグメント及び全長抗体は、本発明による方法によって細胞外で製造することができる。好ましい全長抗体は、その際、ＩｇＧ−クラス及びＩｇＭ−クラス、特にＩｇＧ−クラスの抗体である。
【００３１】
機能的なＦａｂ−抗体フラグメントの製造に際して、細胞は、ドメインＶL及びＣLを含む軽鎖（ＬＣ）の相応のフラグメントと、ドメインＶH及びＣＨ１を含む重鎖（ＨＣ）を、同時に合成し、次いでペリプラズム中に、最終的には培養培地中に分泌せねばならない。細胞質の外側で、次いで両方の鎖の機能的なＦａｂ−フラグメントへの会合が行われる。
【００３２】
Ｆａｂ−フラグメントの製造と同様に、該細胞は、全長抗体の軽鎖と重鎖を同時に合成し、次いでペリプラズム中に、最終的には培養培地中に分泌せねばならない。細胞質の外側で、次いで両方の鎖の機能的な全長抗体への会合が行われる。
【００３３】
細胞質からペリプラズム中へのタンパク質の分泌のためには、産生されるべきタンパク質の遺伝子の５′−末端が、タンパク質排出のためのシグナル配列の３′−末端と読み枠内で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）結合することが必要である。そのためには、原則的に、Ｅ．コリ中で標的タンパク質の移動をＳｅｃ−装置を用いて可能にするあらゆるシグナル配列の遺伝子が適している。種々のシグナル配列が、先行技術において記載されている。ここで、例えば以下の遺伝子のシグナル配列：ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、ＳｔＩＩなどが記載されている（Ｃｈｏｉ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（２００４），６２５−６３５）。
【００３４】
本発明によれば、Ｅ．コリのｐｈｏＡ−遺伝子もしくはｏｍｐＡ−遺伝子のシグナル配列又はクレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列又は前記のシグナル配列から誘導されるＵＳ２００８０７６１５７号に開示される配列が好ましい。ＥＰ０４４８０９３号に開示される、配列番号４の配列を有するクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列並びにＵＳ２００８０７６１５７号に開示される、前記シグナル配列から誘導される配列番号５を有する配列が特に好ましい。
【００３５】
シグナル配列と組み換え標的タンパク質の遺伝子とからの読み枠内融合（ｉｎ ｆｒａｍｅ−Ｆｕｓｉｏｎ）を含むＤＮＡ−分子の製造は、当業者に公知の方法に従って行われる。ここで、標的タンパク質の遺伝子は、まず、ＰＣＲによってプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して増幅され、引き続き通常の分子生物学的技術によって、シグナルペプチドの配列を含み、かつ標的タンパク質の遺伝子と同様に作成されたＤＮＡ−分子と、読み枠内融合を生ずるように、すなわちシグナル配列と標的タンパク質の遺伝子を含む連続的な読み枠を生ずるように結合させることができる。選択的に、上述の両方の機能的断片を含む全ＤＮＡ−分子は、遺伝子合成によっても製造することができる。これらのシグナル配列−組み換え遺伝子−融合物は、次いで、ベクター中に、例えばプラスミド中に導入して、それを宿主細胞中に形質転換によって導入できるか、又は公知の方法に従って直接的に宿主細胞の染色体中に組み込むことができる。好ましくは、該シグナル配列−組み換え遺伝子−融合物は、プラスミド中に導入され、そして宿主細胞はこのプラスミドで形質転換される。
【００３６】
複数の異なるサブユニットからなるタンパク質を細胞質からペリプラズム中に分泌させるために、全ての産生されるべきサブユニットの遺伝子（標的遺伝子）を、タンパク質排出のためのシグナル配列とそれぞれ機能的に結合させる必要がある。その際、種々のサブユニットの遺伝子を異なるシグナル配列と結合させるか又は同じシグナル配列と結合させることができる。異なるシグナル配列との結合が好ましく、一方のサブユニットのＥ．コリのｐｈｏＡ−遺伝子もしくはｏｍｐＡ−遺伝子のシグナル配列との結合及び他方のサブユニットのクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１由来の配列番号４の配列（ＥＰ０４４８０９３号）を有するシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列又は該配列から誘導される配列、例えば配列番号５の配列（ＵＳ２００８０７６１５７号）との結合が特に好ましい。
【００３７】
個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子−融合物は、次いで、ベクター中に、例えばプラスミド中に導入し、又は公知の方法に従って直接的に宿主細胞の染色体中に組み込むことができる。その際、個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子−融合物は、別々であるが、互いに和合性のプラスミドにクローニングし、又は該融合物を、１つのプラスミドにクローニングすることができる。その際、遺伝子−融合物は、１つのオペロンにまとめることができ、又は該融合物は、それぞれ別々のシストロンで発現させることもできる。本願では、１つのオペロンにまとめることが好ましい。同様に、両方の遺伝子構築物を１つのオペロンにまとめることができ、又はそれぞれ別々のシストロンで宿主細胞の染色体中に組み込むことができる。また、本願では、１つのオペロンにまとめることが好ましい。
【００３８】
好ましくは、シグナル配列と分泌されるべきタンパク質をコードする組み換え遺伝子とからなるＤＮＡ−発現構築物（シグナル配列−標的遺伝子−融合物）に、Ｅ．コリにおいて機能的な発現シグナルが設けられる（プロモーター、転写開始、翻訳開始、リボソーム結合部位、ターミネーター）。
【００３９】
プロモーターとしては、当業者に公知のあらゆるプロモーター、例えば、一方で、ｌａｃ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、λＰＬ、ａｒａ−プロモーターもしくはｔｅｔ−プロモーター又はそれらから誘導される配列が適している。他方で、また、例えばＧＡＰＤＨ−プロモーターなどの構成的プロモーターの使用によって持続的な発現を行うこともできる。しかし、産生されるべき組み換えタンパク質の遺伝子と通常どおり結合されたプロモーターも使用することができる。
【００４０】
産生されるべきタンパク質のための前記の発現構築物（プロモーター−シグナル配列−組み換え遺伝子）は、その後に、当業者に公知の方法（例えば形質転換）を使用して、減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する細胞中に導入される。
【００４１】
それは、例えばベクター上で、例えばプラスミド上で、例えばｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３もしくはｐＥＴなどの公知の発現ベクターの誘導体上で行われる。プラスミドのための選択マーカーとして適しているのは、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。
【００４２】
従って、本発明によれば、好ましくは、組み換え遺伝子が、Ｅ．コリ中で活性なシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合され、更に好ましくはＥ．コリ中で機能的な発現シグナル、好ましくはプロモーター、転写開始、翻訳開始、リボソーム結合部位及びターミネーターが設けられているＥ．コリ菌株が使用される。その際、上述の発現シグナルが好ましい。
【００４３】
シグナル配列と分泌されるべきタンパク質をコードする組み換え遺伝子からなるＤＮＡ−発現構築物を含み、機能的発現シグナルと結合された減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する細胞の培養（発酵）は、通常の当業者に公知の発酵法によりバイオリアクター（発酵器）中で行われる。
【００４４】
発酵は、好ましくは、通常のバイオリアクター、例えば撹拌槽、バブルカラム−発酵器又はエアリフト−発酵器中で行われる。撹拌槽−発酵器が特に好ましい。
【００４５】
発酵に際して、タンパク質−産生菌株の細胞を液体培地中で１６〜１５０時間の期間にわたり培養し、その際、例えば培養の栄養素供給、酸素分圧、ｐＨ値及び温度が持続的に調整され、正確に制御される。培養の期間は、好ましくは２４〜７２時間である。
【００４６】
発酵培地としては、原則的に、あらゆる通常の当業者に公知の、微生物の培養用の培地が該当する。
【００４７】
その際、複合培地又は最少塩培地であって、定義された割合の複合成分、例えばペプトン、トリプトン、酵母エキス、糖蜜又はコーンスティープリカーなどの複合成分が添加された培地を用いることができる。医薬品タンパク質の製造のために好ましいのは、化学的に定義された塩培地、従って完全培地に対して正確に定義された基質組成を有する培地である。
【００４８】
本発明による方法において、減衰されたＰＳＩＩ−活性並びに異種タンパク質をコードする遺伝子を有し、読み枠内でＥ．コリ内で機能的なシグナルペプチドをコードするシグナル配列と結合されているＥ．コリ菌株は、ＰＳＩＩ−野生型活性を有する菌株に匹敵する短い発酵時間で匹敵する高い細胞密度まで増殖し、その際、異種タンパク質を塩培地中に分泌する。
【００４９】
発酵のための一次炭素源としては、原則的に、該細胞によって使用可能なあらゆる糖、糖アルコール又は有機酸もしくはそれらの塩を使用することができる。その際、好ましくはグルコース、ラクトース又はグリセリンが使用される。グルコース及びラクトースが特に好ましい。また、複数の種々の炭素源の組み合わせた供給も可能である。該炭素源は、その際、発酵の開始時に全てが発酵培地中に初充填されてよく、又は開始時には炭素源が全く初充填されていないかもしくは一部のみしか初充填されておらず、炭素源を発酵の経過にわたり供給することもできる。その際、炭素源の一部が初充填し、そして一部を供給する実施態様が特に好ましい。特に好ましくは、炭素源は、１０〜３０ｇ／ｌの濃度で初充填され、その濃度が５ｇ／ｌ未満に下降したら供給を開始し、５ｇ／ｌ未満の濃度が維持されるようにする。
【００５０】
培養中の酸素分圧（ｐＯ2）は、好ましくは１０〜７０％飽和度である。好ましくは、ｐＯ2は、３０〜６０％飽和度であり、特に好ましくは、ｐＯ2は、４５〜５５％飽和度である。
【００５１】
培養のｐＨ値は、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８である。好ましくは、ｐＨ値は、６．５〜７．５の間に調整され、特に好ましくは、培養のｐＨは、６．８〜７．２に維持される。
【００５２】
培養の温度は、好ましくは１５〜４５℃である。温度範囲２０〜４０℃が好ましく、温度範囲２５〜３５℃が特に好ましい、３０℃が殊に好ましい。
【００５３】
分泌されたタンパク質の粗生成物からの精製は、通常の当業者に公知の精製方法によって行うことができ、それらは先行技術において知られている。通常は、第一工程において、遠心分離又は濾過などの分離法によって、細胞を分泌された標的タンパク質から分離する。該標的タンパク質を、次いで、例えば限外濾過によって濃縮し、次いで沈殿、クロマトグラフィー又は限外濾過などの標準的方法によって更に精製することができる。この場合に、アフィニティークロマトグラフィーなどの方法であって、既に正確に折り畳まれたタンパク質の本来のコンフォメーションが利用できる方法が特に好ましい。
【００５４】
以下の実施例を用いて、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００５５】
全体の使用される分子生物学的方法及び微生物学的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、ＤＮＡの制限酵素、クレノウ断片及びリガーゼによる改変、Ｐ１−形質導入などは、当業者に公知の、文献に記載される、又はその都度の製造元に推奨される様式及び方法で実施した。
【００５６】
実施例１： Ｅ．コリ野生型菌株からの染色体性ｒｅｌＡ−欠失突然変異体の作成（比較例）
本発明にとって最も近い先行技術は、ｒｅｌＡ−突然変異に基づき低減されたＰＳＩ−活性を有し、かつｒｅｌＡ−野生型菌株と比較してペリプラズム中に分泌されるタンパク質が培養培地中に増大排出されるＥ．コリ菌株であり、例えば該菌株は、Ｇｉｔｔｅｒ他（１９９５，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３，８９−９２）によって記載されている。前記の先行技術に対して減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株の利点を明らかにするために、ｒｅｌＡ−突然変異体を作成した。
【００５７】
そのために、Ｅ．コリ野生型菌株Ｗ３１１０（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号２７３２５）を、λ−Ｒｅｄ−レコンビナーゼを用いてＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−５）の方法に従って突然変異させた。まず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってプライマーとしてオリゴヌクレオチドｒｅｌＡｍｕｔ−ｆｗ（配列番号６）及びｒｅｌＡｍｕｔ−ｒｅｖ（配列番号７）を使用し、かつ鋳型としてプラスミドｐＫＤ３（大腸菌遺伝子保存センター（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＳＣ））を使用して、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含み、かつｒｅｌＡ−遺伝子の５′−領域もしくは３′−領域のそれぞれ５０塩基対によってフランキングされている直鎖ＤＮＡ断片を作成した。菌株Ｗ３１１０を、まずプラスミドｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ番号７７３９）で形質転換した。こうして得られた、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの指示により製造された菌株Ｗ３１１０ ｐＫＤ４６のコンピテント細胞を、ＰＣＲによって上述のように作成された直鎖ＤＮＡ断片で形質転換した。Ｗ３１１０の染色体中のｒｅｌＡ−遺伝子の位置でのクロラムフェニコール耐性カセットの組み込みについての選択は、２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ−アガープレート上で行った。こうして、ｒｅｌＡ−遺伝子のコーディング領域の９５％が除去され、かつクロラムフェニコール耐性カセットによって置き換えられた細胞が得られた。組み込みが染色体の正しい位置で行われたことは、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｒｅｌＡ−ｆｗ（配列番号８）及びｒｅｌＡ−ｒｅｖ（配列番号９）を使用し、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡを使用して確認した。それらの細胞を、プラスミドｐＫＤ４６によって記載された手順（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）に従ってキュアリングし、こうして作成された菌株をＷ３１１０ｒｅｌＡ：：ｃａｔと呼称した。菌株Ｗ３１１０ｒｅｌＡ：：ｃａｔの染色体からのクロラムフェニコール耐性カセットの除去は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法に従って、ＦＬＰ−レコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＣＰ２０（ＣＧＳＣ番号７６２９）を用いて行った。最後に、前記の手順によって得られたクロラムフェニコール感受性のＷ３１１０のｒｅｌＡ−欠失突然変異体を、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡと呼称した。
【００５８】
実施例２： Ｅ．コリΔｒｅｌＡ−菌株からの染色体性ｓｐｏＴ−欠失突然変異体の作成
Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡからのｓｐｏＴ−欠失突然変異体の作成は、原則的に、実施例１に記載した菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡの作成と同様に行った。クロラムフェニコール耐性遺伝子を含み、ｓｐｏＴ−遺伝子の５′−領域もしくは３′−領域のそれぞれ５０塩基対によってフランキングされている直鎖ＤＮＡ断片の作成のために、プライマーとしてオリゴヌクレオチドｓｐｏＴｍｕｔ−ｆｗ（配列番号１０）及びｓｐｏＴｍｕｔ−ｒｅｖ（配列番号１１）と、鋳型としてプラスミドｐＫＤ３を使用した。菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＫＤ４６を、直鎖ＤＮＡ断片で形質転換した。Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡの染色体中のｓｐｏＴ−遺伝子とクロラムフェニコール耐性カセットとの効果的な交換は、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｓｐｏＴ−ｆｗ（配列番号１２）及びｓｐｏＴ−ｒｅｖ（配列番号１３）を使用して、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡを使用して確認した。実施例１に記載される手順による染色体からのクロラムフェニコール耐性カセットの除去によって、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴが得られた。
【００５９】
実施例３： 種々のＥ．コリ菌株における染色体性ｓｐｏＴ１−突然変異の導入
Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡのΔｓｐｏＴ−突然変異体の代わりに、ｓｐｏＴ１−アレル（配列番号３；Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，２５９７−６０６）を有するＷ３１１０ΔｒｅｌＡの突然変異体を作成した。このために、ｓｐｏＴ１−アレルを、菌株Ｋ１０（Ｈｆｒ ＰＯ２Ａ ｔｏｎＡ２２ ｏｍｐＦ６２６ ｒｅｌＡ１ ｐｉｔ−１０ ｓｐｏＴ１ Ｔ２（Ｒ）；ＣＧＳＣ番号４２３４）から、ファージＰ１を使用した形質導入によって菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡへと移動させた。このために、まず、クロラムフェニコール耐性カセットを、Ｋ１０の染色体中に、遺伝子ｒｅｃＧとｇｌｔＳとの間でｓｐｏＴ−遺伝子の約２９００塩基対を超えて組み込んだ（ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔ）。その際、原則的に実施例１に記載されるように行った。クロラムフェニコール耐性カセットを含み、ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳの遺伝子間領域の５０塩基対によってそれぞれフランキングされている直鎖ＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって、プライマーとしてオリゴヌクレオチドｒｅｃＧ−ｃａｔｆｗ（配列番号１４）及びｇｌｔＳ−ｃａｔｒｅｖ（配列番号１５）を使用し、かつ鋳型としてプラスミドｐＫＤ３を使用して作成し、引き続き該菌株Ｋ１０／ｐＫＤ４６中に形質転換した。こうして、染色体中に遺伝子ｒｅｃＧとｇｌｔＳとの間で耐性カセットが組み込まれているクロラムフェニコール耐性クローンが得られた（Ｋ１０ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔ）。組み込みが染色体の正しい位置で行われたことは、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｒｅｃＧ−ｆｗ（配列番号１６）及びｇｌｔＳ−ｒｅｖ（配列番号１７）を使用し、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡを使用して確認した。菌株Ｋ１０ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔから、先行技術に従ってＰ１−溶解産物を作成し、次いでそれを菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡに感染させた。こうして、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡのクロラムフェニコール耐性形質導入物を得た。形質導入過程では、ほぼ１００％の理論的同時形質導入率で、耐性カセットの他にも、染色体上で狭い空間的近隣に局在されるｓｐｏＴ１−アレルが、Ｋ１０ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔからＷ３１１０ΔｒｅｌＡへと移動されるべきであった。実際にそのような場合であることは、ｓｐｏＴ−遺伝子のＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドｓｐｏＴ−ｆｗ（配列番号１２）及びｓｐｏＴ−ｒｅｖ（配列番号１３）を使用し、かつ鋳型として該菌株の染色体ＤＮＡを用いて増幅させ、引き続きＰＣＲ産物の配列決定により確認した。実施例１に記載される手順による菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔの染色体からの耐性カセットの除去によって、最終的に、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１が得られた。
【００６０】
同様の方法によって、ｓｐｏＴ１−アレルを、更にまたＥ．コリ野生型菌株Ｗ３１１０に導入した。得られた菌株を、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１と呼称した。
【００６１】
実施例４： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有するＥ．コリ菌株中へのｌｐｐ−"漏出"突然変異の導入
ｌｐｐ３−突然変異の導入：
菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴもしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１の染色体におけるｌｐｐ野生型遺伝子とｌｐｐ３−アレルとの交換は、相同組み換えによって実施した。菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３もしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３の作成のために、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例３に記載されるのと同じように行った。こうして得られた菌株を、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３もしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３と呼称した。
【００６２】
ｌｐｐ−欠失突然変異の導入：
菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴもしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１の染色体中へのｌｐｐ−欠失の導入は、λ−Ｒｅｄ−レコンビナーゼ−系を用いて、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．．９７：６６４０−５）によって、かつＵＳ２００８２５４５１１号の実施例１と同様に実施した。こうして得られた菌株を、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐもしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐと呼称した。
【００６３】
実施例５： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの発酵的産生
１０ｌ−規模でのクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１からのシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）の産生のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３をＣａＣｌ2法によってプラスミドｐＣＧＴを用いて形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００６４】
該プラスミドｐＣＧＴは、アンピシリンに対する耐性に関する遺伝子の他に、とりわけ、本来のＣＧＴアーゼ−シグナル配列を含むＣＧＴアーゼの構造遺伝子をも含む。ＣＧＴアーゼ−遺伝子の発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＣＧＴは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例４に記載されている。
【００６５】
ＣＧＴアーゼ−産生は、１０Ｌの撹拌槽発酵器中で、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＣＧＴ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＣＧＴを用いて行った。
【００６６】
発酵培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；０．１５ｇ／ｌのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ；０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ3クエン酸塩×２Ｈ2Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ3ＢＯ3；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ1；３ｇ／ｌのフィトン；１．５ｇ／ｌの酵母エキス；１０ｇ／ｌのグルコース；１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）６ｌで充填した発酵器に、１：１０の比率で、一晩同じ培地で培養した前培養を植えた。発酵の間に、温度３０℃に調整し、そしてｐＨ値を、ＮＨ4ＯＨもしくはＨ3ＰＯ4の計量供給によって７．０の値で一定に保持した。グルコースを、発酵にわたって計量供給して、発酵培地中の最大グルコース濃度を＜１０ｇ／ｌにするように努めた。発現の誘導は、対数増殖期の終わりに０．１ｍＭまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって行った。
【００６７】
７２時間の発酵後に、サンプルを取り出し、細胞を遠心分離によって発酵培地から分離し、発酵上清中のＣＧＴアーゼ含有率を以下の活性テストによって測定した：
テストバッファー： ５ｍＭのトリスＨＣｌバッファー ＞ｐＨ６．５、５ｍＭのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ
基質： テストバッファー（ｐＨ６．５）中の１０％のＮｏｒｅｄｕｘ溶液
テストバッチ： １ｍｌの基質溶液＋１ｍｌの遠心分離され、場合により希釈された培養上清（５分、１２０００ｒｐｍ）＋３ｍｌのメタノール
反応温度： ４０℃
【００６８】
酵素テスト：
・ 溶液を予熱する（約５分、４０℃で）
・ 酵素溶液を基質溶液に添加する；迅速に混合する（渦ミキサ（Ｗｈｉｒｌ−Ｍｉｘｅｒ））
・ ４０℃で３分間インキュベートする
・ 酵素反応をメタノールの添加によって停止させる；迅速に混合する（渦ミキサ）
・ バッチを氷上で冷却する（約５分間）
・ 遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）をし、そして澄明な上清をピペットで取り出す
・ 生じたＣＤをＨＰＬＣによって分析する
酵素活性： Ａ＝Ｇ*Ｖ１*Ｖ２／（ｔ*ＭＧ）（ユニット／ｍｌ）
Ａ＝活性
Ｇ＝ＣＤの含有率（ｍｇ／ｌ）＝テストバッチ： 単位表面×１０4／標準溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）／単位表面
Ｖ１＝テストバッチにおける希釈係数（前記のように実施した場合：Ｖ１＝５）
Ｖ２＝テストで使用する前の培養上清の希釈係数；非希釈の場合：Ｖ２＝１
ｔ＝反応時間（分）
ＭＧ＝分子量（ｇ／モル）（ＣＤ＝９７３ｇ／モル）
１ユニット＝１モルの産物／分
【００６９】
こうして測定されたＣＧＴアーゼ活性から、発酵上清中に存在するＣＧＴアーゼの量を計算することができる。その際、１５０Ｕ／ｍｌのＣＧＴアーゼ活性は、約１ｇ／ｌのＣＧＴアーゼタンパク質に相当する。
【００７０】
第１表は、それぞれ達成されたシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率を示している。
【００７１】
第１表： ７２時間の発酵後の発酵上清中でのシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率
【表１】
【００７２】
実施例６： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるヒルジン誘導体の発酵的産生
この実施例においては、Ｎ末端アミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体の発酵的製造を記載する。ヒルジン誘導体の産生のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、まず、それぞれプラスミドｐＣＭＴ２０３でＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００７３】
プラスミドｐＣＭＴ２０３は、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけＣＧＴアーゼ−シグナル配列の３′−末端で読み枠内で融合されているヒルジン誘導体の構造遺伝子をも有する。ＣＧＴアーゼ−シグナル配列−ヒルジン−融合物の発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＣＭＴ２０３は、ＥＰ０４４８０９３号に記載されている。
【００７４】
ヒルジン誘導体の１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＣＭＴ２０３及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＣＭＴ２０３を用いて行った。７２時間の発酵後に、サンプルを取り出し、引き続き細胞を遠心分離によって発酵培地から分離し、そして発酵上清中のヒルジン含有率を、Ｃｈａｎｇ（１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１０８３９−４３）に記載されるトロンビン−不活性化テストによって測定した。その際、１６０００のアンチトロンビン（ＡＴ）ユニット／ｍｌのヒルジン活性は、約１ｇ／ｌのヒルジン−タンパク質に相当する。
【００７５】
第２表は、それぞれ達成された発酵上清中でのヒルジン収率を示している。
【００７６】
第２表： ７２時間の発酵後の発酵上清中のヒルジン収率（ＡＴ−Ｕ／ｍｌ及びｇ／ｌ）
【表２】
【００７７】
実施例７： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるインターフェロンα２ｂの発酵的産生
インターフェロンα２ｂの製造のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＩＦＮでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００７８】
プラスミドｐＩＦＮは、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけＣＧＴアーゼ−シグナル配列の３′−末端で読み枠内で融合されているインターフェロンα２ｂの構造遺伝子をも有する。ＣＧＴアーゼ−シグナル配列−インターフェロンα２ｂ−融合物の発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＩＦＮは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例６に記載されている。
【００７９】
インターフェロンα２ｂの１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＩＦＮ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＩＦＮを用いて行った。７２時間の発酵後に、サンプルを取り出し、引き続き、細胞を遠心分離によって発酵培地から分離し、発酵上清中のインターフェロンα２ｂ含有率を測定した。
【００８０】
このために、発酵上清中のタンパク質を電気泳動によりＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離させ、そしてイムノブロットにおける抗インターフェロン特異抗体による検出によって以下のように定量化した：
１μｌの上清を、サンプルバッファーと混合した（２×Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−サンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ２６７６）：０．１２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、０．００５％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー、５％のβ−メルカプトエタノール）。更に、定義された量のインターフェロンα２ｂを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性を、１００℃に５分間加熱し、氷上で２分間冷却することにより行い、そして遠心分離した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０３４１）中で、１×ＭＥＳ含有ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０００２）を用いて分離させた（電気泳動パラメータ： ２００Ｖで４０分間）。
【００８１】
イムノブロットによる検出と定量化を、以下の方法に従って実施した：
湿式ブロッティング法での転写：
モジュール： Ａｍｅｒｓｈａｍ： Ｈｏｅｆｅｒ ＴＥ ２２ Ｍｉｎｉ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ、コード番号：８０−６２０４−２６
メンブレン： ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，ＢＡ８５，硝酸セルロース（Ｅ），０．４５μｍの細孔サイズ）
Ｗｈａｔｍａｎフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品（スポンジ）で転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ３６７５）に気泡なく染み込ませた。
積層の構成： 黒い格子、カソードとの接続、各３ｍｍ厚を有する２つのスポンジ、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ＮＣメンブレン、Ｗｈａｔｍａｎ、６ｍｍ厚を有する１つのスポンジ、白い格子、アノードとの接続
転写条件： Ｉ＝２００ｍＡの一定の電流、Ｕ＝無制限、運転時間６０分
【００８２】
プレハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で３０分間振り動かす。
【００８３】
一次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋０．１５μｇ／ｍｌ（→３．７５μｇ）の抗ヒトＩＦＮ抗体（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号：５００−Ｐ３２Ａ）中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で９０分間又は一晩振り動かす。
【００８４】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００８５】
二次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋２５μｌ（１：１０００）のヤギ抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号４０５０−０５）中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で６０分間振り動かす。
【００８６】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００８７】
化学発光による検出
Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号２０１５２００）を準備する： Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔルミノール／エンハンサー溶液とＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ安定ペルオキシド溶液とを１：１の比率で混合する： ニトロセルロースメンブレン当たり３ｍｌ。
【００８８】
ブロットを室温でＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質と一緒に５分間インキュベートし、過剰の水気を切り、メンブレンをラップフィルムで覆って、直ちにＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｘ−ＯＭＡＴ）を載せ、２分間暴露し、現像し、そして固定する。シグナルが弱い場合に、暴露をより長時間にわたり繰り返す。
【００８９】
バッファー
プレハイブリダイゼーションバッファー： １×ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳
１０×ＰＢＳ： １００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．５、０．５％のＴｒｉｔｏｎ １００
１×ＰＢＳ： １０×ＰＢＳを完全脱塩水で１：１０希釈したもの
【００９０】
定量化
定量的評価は、Ｂｉｏｒａｄ社製のＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでイムノブロットをスキャンすることによって、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフト（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、施与されたスタンダードと比較することによって実施した。
【００９１】
第３表において、こうして測定された発酵上清中のインターフェロンα２ｂの収率を示す。
【００９２】
第３表： ７２時間の発酵後の発酵上清中でのインターフェロンα２ｂの収率
【表３】
【００９３】
実施例８： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるＦａｂ−抗体フラグメントの発酵的産生
本実施例は、十分に特徴付けられている抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＦａｂ−フラグメントの産生を記載する。
【００９４】
抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの製造のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００９５】
プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍは、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけＦａｂ−フラグメントのＨＣ及びＬＣについての構造遺伝子をもオペロンの形で含む。その際、ＨＣは、ｏｍｐＡ−シグナル配列（ｏｍｐＡSS）の３′−末端に読み枠内で融合されており、かつＬＣは、ＣＧＴアーゼ−シグナル配列（ＣＧＴSS）の３′−末端に読み枠内で融合されている。ｏｍｐＡSS−ＨＣ−ＣＧＴSS−ＬＣ−オペロンの発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例７に記載されている。
【００９６】
抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍを用いて行った。７２時間の発酵の後に、サンプルを取り出し、引き続き該細胞を遠心分離によって発酵培地から分離した。
【００９７】
発酵上清からの抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの精製は、Ｓｋｅｒｒａ（１９９４，Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）に記載されるアフィニティークロマトグラフィーによって実施した。
【００９８】
精製された抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの定量化並びに活性の測定は、抗原としてリゾチームを用いたＥＬＩＳＡテスト（Ｓｋｅｒｒａ，１９９４，Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）によって実施した。
【００９９】
第４表において、それぞれ２０ｍｌの発酵上清から７２時間の発酵後に単離することができた機能的な抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの収率を列記する。
【０１００】
第４表： ７２時間の発酵後の発酵上清中での抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの収率
【表４】
【０１０１】
実施例９： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模における全長抗体の発酵的産生
本実施例は、抗組織因子（αＴＦ）ＩｇＧ１−抗体の産生を記載している。
【０１０２】
抗αＴＦ抗体の製造のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【０１０３】
プラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦは、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけ抗αＴＦ抗体のＨＣ及びＬＣについての構造遺伝子をもオペロンの形で含む。その際、ＨＣは、ｏｍｐＡ−シグナル配列（ｏｍｐＡSS）の３′−末端に読み枠内で融合されており、かつＬＣは、ＣＧＴアーゼ−シグナル配列（ＣＧＴSS）の３′−末端に読み枠内で融合されている。ｏｍｐＡSS−ＨＣ−ＣＧＴSS−ＬＣ−オペロンの発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例８に記載されている。
【０１０４】
抗αＴＦ抗体の１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦを用いて行った。７２時間の発酵の後に、サンプルを取り出し、引き続き該細胞を遠心分離によって発酵培地から分離した。
【０１０５】
発酵培地中に分泌された抗αＴＦ抗体の定量化を、ＥＬＩＳＡテストでの活性測定によって、抗原（コーティング）として可溶性の組織因子を用い、かつ二次抗体としてペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ′）2−フラグメントを用いて、Ｓｉｍｍｏｎｓ他（２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３−４７）に記載されるようにして実施した。
【０１０６】
第５表において、こうして測定された、機能的な抗αＴＦ抗体の収率を列記する。
【０１０７】
第５表： ７２時間の発酵後の発酵上清中での抗αＴＦ抗体の収率
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性を有するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株による異種タンパク質の発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質製薬学（医薬タンパク質／バイオロジクス）に関する市場は、近年になって大きく成長している。特に重要なタンパク質医薬品は、真核性タンパク質、とりわけ哺乳動物タンパク質及びヒトのタンパク質である。重要な医薬品タンパク質（製剤学的に有効なタンパク質）の例は、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン及びペプチドホルモン並びに抗体及び抗体フラグメントである。医薬品タンパク質に関して今なお非常に高い生産コストに基づき、絶え間なく、より効率的であり、そのためより低コストで医薬品タンパク質を製造するための方法及び系が模索されている。
【０００３】
一般に、組み換えタンパク質は、哺乳動物細胞培養か、微生物の系のいずれかで製造される。微生物の系は、哺乳動物細胞培養に対して、こうして組み換えタンパク質がより短時間でかつより低コストで製造できるという利点を有する。従って、組み換えタンパク質の生産のためには、とりわけ細菌が適している。その非常に十分に調査された遺伝学と生理学、短い世代時間及び取り扱いの容易さに基づき、グラム陰性の腸内細菌であるエシェリキア・コリ（Ｅ．コリ）は、目下、組み換えタンパク質の生産のために最も頻繁に用いられる生物である。Ｅ．コリにおける組み換えタンパク質のための生産方法であって、標的タンパク質が高収率かつ正確なフォールディングで発酵培地中に直接分泌される方法が特に好ましい。
【０００４】
文献には、発酵培地中への組み換えタンパク質の分泌が達成される一連のＥ．コリ菌株とＥ．コリ菌株を用いた方法が開示されている。ここで、例えばＵＳ２００８２５４５１１号には、褐色リポタンパク質（Ｌｐｐ）に関する遺伝子に突然変異を有し、かつ過剰産生された異種タンパク質を培地中に排出する種々のＥ．コリ菌株が記載されている。
【０００５】
細胞がアミノ酸もしくはエネルギー源の欠乏状況に陥る条件下で代謝を調節及び連係するために、Ｅ．コリは、"緊縮制御"と呼ばれる機構を有する。その際に、アラーモングアノシン四リン酸（ｐｐＧｐｐ）及びグアノシン五リン酸（ｐｐｐＧｐｐ）（以下に一般に（ｐ）ｐｐＧｐｐとまとめる）は、調節性シグナル分子として、とりわけ、細胞内の（ｐ）ｐｐＧｐｐ濃度を高めることによって、安定なＲＮＡ類（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の合成に歯止めがかかり、幾つかのアミノ酸生合成遺伝子の発現が強化されることによって、重要な役割を担う（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）。Ｅ．コリは、（ｐ）ｐｐＧｐｐをＡＴＰ及びＧＤＰから（ｐｐＧｐｐ）もしくはＡＴＰ及びＧＴＰから（ｐｐｐＧｐｐ）合成するための２種類の酵素を有する：ｒｅｌＡ遺伝子によってコードされる（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩ（ＰＳＩ）は、細胞がアミノ酸欠乏に晒されている場合に、緊縮制御の範囲で（ｐ）ｐｐＧｐｐ合成を担う。しかしながら、細胞の増殖が、一次炭素源の消耗に基づき減速されると、その（ｐ）ｐｐＧＰＰ合成は、主に、ｓｐｏＴ遺伝子によってコードされる（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ（ＰＳＩＩ）によって行われる。ＰＳＩとの違いにおいて、ｓｐｏＴ遺伝子産物は、（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼ活性の他に、さらにまた（ｐ）ｐｐＧｐｐ−３′−ピロホスホヒドロラーゼ活性を有し、かつそれにより細胞の（ｐ）ｐｐＧｐｐ−濃度を、また能動的にこの化合物の分解によって制御することができる（Ｇｅｎｔｒｙ ｕｎｄ Ｃａｓｈｅｌ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９，１３７３−８４）。ＰＳＩＩ酵素の２つの異なる触媒活性に関する活性中心は、確かに同一ではないものの、該タンパク質のＮ末端領域に狭い空間的近隣で位置していることが示された。
【０００６】
本発明の範囲においては、名称"ＰＳＩＩ−活性"とは、一方で（ｐ）ｐｐＧｐｐ−合成を触媒でき、かつ他方で（ｐ）ｐｐＧｐｐ−加水分解をも触媒できる酵素の活性を表すべきである。
【０００７】
Ｅ．コリのｒｅｌＡ−突然変異体とｓｐｏＴ−突然変異体のいずれも公知である（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）。
【０００８】
挿入エレメントＩＳ２がｒｅｌＡ−遺伝子配列中に組み込まれているｒｅｌＡ１突然変異（ｒｅｌＡ：：ＩＳ２）を有する菌株は、さらに低いＰＳＩ−残留活性を示し、それに対してｒｅｌＡ−欠失突然変異体（ΔｒｅｌＡ）は、もはやＰＳＩ−活性を有さない（Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，２１１４６−５２）。緊縮制御の機構がインタクトなｒｅｌＡ−野生型菌株（"緊縮な"表現型）との違いにおいて、低減された又は失われたＰＳＩ−活性を有するｒｅｌＡ−突然変異体は、アミノ酸欠乏状況に陥った場合に、いわゆる"緩和された（ｒｅｌａｘｉｅｒｔｅｎ）"表現型を示す。このことは、とりわけ、その細胞が、基底濃度を越えて（ｐ）ｐｐＧｐｐを蓄積しえず、かつ安定なＲＮＡ分子の合成が停止されずに、そのまま進行するという形で現れる。その基底濃度とは、文献（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）から知られている、無制限の増殖条件下での対数増殖細胞についての（ｐ）ｐｐＧｐｐに関する濃度範囲（１０〜３０ピコモル／Ａ450）を表すべきである。Ｇｉｔｔｅｒ他（１９９５，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３，８９−９２）から、ｒｅｌＡ−突然変異体のＥ．コリ ＣＰ７９が、ｒｅｌＡ−野生型菌株のＣＰ７８と比較して、人工的に誘発されたアミノ酸欠乏条件下で、ペリプラズム中に分泌されるタンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ又はインターフェロンα１を培養培地中に増大排出することは公知である。
【０００９】
ｓｐｏＴ遺伝子中に突然変異を有する菌株は、ＰＳＩＩ−活性を害する程度に応じて、特徴的な（ｐ）ｐｐＧｐｐ−代謝の欠損を示す。とりわけ、ｉ）より低い増殖速度と結びついた、正常な（平衡した）増殖の間での高められた基底ｐｐＧｐｐ濃度と、ｉｉ）緊縮応答の間のより高く誘導されたｐｐＧｐｐ濃度と、ｉｉｉ）緊縮応答が終わった後のより低いｐｐＧｐｐ転化率とを示す。
【００１０】
Ｅ．コリのｓｐｏＴ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）は、配列番号２の配列を有するｓｐｏＴタンパク質をコードしている。該ｓｐｏＴ遺伝子は、５つの遺伝子ｇｍｋ−ｒｐｏＺ−ｓｐｏＴ−ｓｐｏＵ−ｒｅｃＧを含むオペロンの部分として発現される。該オペロンの発現と、ｓｐｏＴ発現もまた、一方で、ｇｍｋ遺伝子の上流にあるＰ１−プロモーターと、他方で、ｇｍｋ遺伝子のＣ末端をコードする領域中に位置するＰ２−プロモーターとによって調節される（Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６）。ｓｐｏＴ１−突然変異（配列番号３）を有する菌株の場合に、そのｓｐｏＴ−タンパク質は、アスパラギン酸残基８４の後ろでグルタミン及びアスパラギン酸の２つのアミノ酸の挿入と、位置２５５にヒスチジン−チロシン置換とを有する（Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，２５９７−６０６）。更に、一連のｓｐｏＴ−挿入突然変異体もしくはｓｐｏＴ−欠失突然変異体も記載された（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，５９８０−９０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ２００８２５４５１１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃａｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１４５８−１４９６
【非特許文献２】Ｇｅｎｔｒｙ ｕｎｄ Ｃａｓｈｅｌ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９，１３７３−８４
【非特許文献３】Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，２１１４６−５２
【非特許文献４】Ｇｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３，８９−９２
【非特許文献５】Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，２５９７−６０６
【非特許文献６】Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，５９８０−９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、Ｅ．コリ菌株による異種タンパク質の発酵的製造方法であって、該タンパク質が発酵培地中に分泌される製造方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題は、Ｅ．コリ菌株を発酵培地中で培養するにあたり、該Ｅ．コリ菌株が、異種タンパク質をコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されて含み、かつ該Ｅ．コリ菌株が、前記異種タンパク質を発酵培地中に分泌する方法において、該Ｅ．コリ菌株が、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性を有することを特徴とする方法によって解決される。
【００１５】
Ｅ．コリ菌株の減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性とは、該Ｅ．コリ菌株が、ＰＳＩＩ−活性の改変前のＥ．コリ菌株（以下で、出発菌株と呼ぶ）の最大で５０％の、好ましくは最大で２０％の（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性（ＰＳＩＩ−活性）を有することを表すべきである。特に好ましくは、菌株の減衰されたＰＳＩＩ−活性とは、この菌株中のＰＳＩＩ−活性の欠乏を表すべきである。
【００１６】
菌株のＰＳＩＩ−酵素のシンセターゼ活性及びヒドロラーゼ活性の測定方法は、当業者に公知である（Ｍｅｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，１４０１−１４１１）。
【００１７】
微生物菌株中でのＰＳＩＩ−活性の減衰のための方法は、技術水準において公知である。ＰＳＩＩ−活性は、例えば、ｓｐｏＴ−遺伝子の読み枠中に、該酵素の活性の低下をもたらす突然変異（単独もしくは複数のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失）を導入することによって減衰させることができる。更に、細胞のＰＳＩＩ−活性は、ｓｐｏＴ−遺伝子の発現を、発現調節に必要な少なくとも１つのエレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位）を、単独もしくは複数のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失によって突然変異させることで低減させることによって減衰させることもできる。その塩基配列においてｓｐｏＴ−野生型遺伝子の配列と突然変異に基づき異なる係るＤＮＡ配列は、以下で、ｓｐｏＴ−アレルとも呼称する。また、ｓｐｏＴ−遺伝子又はその調節領域の染色体からの完全な欠失によっても、ＰＳＩＩ−活性の減衰が可能である。
【００１８】
当業者には、ｓｐｏＴ−アレルの作成方法は公知である。ｓｐｏＴ−遺伝子のアレルは、例えばｓｐｏＴ−野生型遺伝子のＤＮＡを出発材料として用いて、非特異的もしくは標的突然変異誘発によって製造することができる。ｓｐｏＴ−遺伝子又はｓｐｏＴ−遺伝子のプロモーター領域内での非特異的突然変異は、例えばニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸などの化学薬剤によって、及び／又は物理的方法によって、及び／又は一定の条件下で行われるＰＣＲ反応によって引き起こすことができる。ＤＮＡ断片内の特異的部位での突然変異の導入方法は、公知である。ここで、例えばｓｐｏＴ−遺伝子及びそのプロモーター領域を含むＤＮＡ断片中の１もしくは複数の塩基の交換は、プライマーとして好適なオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって行うことができる。更に、ｓｐｏＴ−遺伝子全体もしくは新たなｓｐｏＴ−アレルは、遺伝子合成によって製造することができる。
【００１９】
ｓｐｏＴ−アレルは、一般にまず、インビトロで作成され、引き続き細胞の染色体中に導入され、それにより本来存在するｓｐｏＴ−野生型遺伝子が置き換えられ、こうしてその菌株のｓｐｏＴ−突然変異体が作成される。ｓｐｏＴ−アレルは、公知の標準的方法によって、宿主細胞の染色体中に、ｓｐｏＴ−野生型遺伝子／プロモーターの代わりに導入することができる。それは、例えばＬｉｎｋ他（１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６２２８−３７）によって記載された、ある遺伝子への相同組み換えの機構による染色体性突然変異の導入方法によって行うことができる。ｓｐｏＴ−遺伝子全体もしくはその一部の染色体的欠失の導入は、例えばλ−Ｒｅｄレコンビナーゼ系を用いて、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−５）によって記載される方法に従って可能である。ｓｐｏＴ−アレルは、また、Ｐ１−ファージによる形質導入又は接合によって、ｓｐｏＴ−突然変異を有する菌株からｓｐｏＴ−野生型菌株へと移すことができ、その際、ｓｐｏＴ−野生型遺伝子は、染色体内で相応のｓｐｏＴ−アレルと置き換えられる。記載されたｓｐｏＴ−突然変異を有するＥ．コリ菌株の他に、当業者には、任意のＥ．コリ菌株のｓｐｏＴ−突然変異の作成方法も知られている。
【００２０】
好ましいｓｐｏＴ−突然変異は、ｓｐｏＴ１−突然変異であるか、又は好ましいものとして定義された減衰されたＰＳＩＩ−活性をもたらすｓｐｏＴ−突然変異である。ＰＳＩＩ−活性の完全な損失をもたらす突然変異が特に好ましい。
【００２１】
好ましくは、本発明による方法で使用されるＥ．コリ菌株は、減衰されたＰＳＩＩ−活性の他に、緩和された表現型をもたらすｒｅｌＡ−遺伝子内の突然変異を有する。
【００２２】
好ましいｒｅｌＡ−突然変異は、例えばｒｅｌＡ１−突然変異であるか、又はＰＳＩ−活性の完全な損失をもたらすｒｅｌＡ−突然変異である。
【００２３】
同様に好ましくは、本発明による方法で使用されるＥ．コリ菌株は、減衰されたＰＳＩＩ−活性の他に、"漏出"突然変異を有する。"漏出突然変異"とは、細胞外膜もしくは細胞壁の構造エレメントのための、ｏｍｐ−遺伝子、ｔｏｌ−遺伝子、ｅｘｃＤ−遺伝子、ｅｘｃＣ−遺伝子、ｌｐｐ−遺伝子、ｐａｌ−遺伝子、ｅｎｖ−遺伝子及びｌｋｙ−遺伝子の群から選択される遺伝子中の突然変異であって、該細胞がペリプラズム性タンパク質の培地中への増大放出をもたらす突然変異を表すべきである（Ｓｈｏｋｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（２００３），６５４−６６４）。ｌｐｐ−遺伝子における"漏出"突然変異が好ましく、ｌｐｐ１−突然変異、ｌｐｐ３−突然変異及びｌｐｐ−欠失突然変異の群から選択される突然変異が特に有利である。ｌｐｐ１−突然変異は、位置７７でのシステイン残基に対するアルギニン残基の交換をもたらすｌｐｐ−遺伝子内での突然変異であり、ｌｐｐ３−突然変異は、位置１４でのアスパラギン酸残基に対するグリシン残基の交換をもたらすｌｐｐ−遺伝子内での突然変異である。これらの突然変異は、ＵＳ２００８２５４５１１号に詳細に記載されている。ｌｐｐ−欠失突然変異は、好ましくは、ｌｐｐ−遺伝子自体又はｌｐｐ−遺伝子のプロモーター領域における少なくとも１つのヌクレオチドの欠失であって、該細胞がペリプラズム性タンパク質に関しての高められた漏出を有することがもたらされる欠失である。
【００２４】
高められた漏出とは、本発明の範囲においては、細胞の発酵により、同じ条件下で、Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の発酵の場合よりも高められた濃度のペリプラズム性タンパク質、例えばアルカリ性ホスファターゼが栄養培地中に存在することを表すべきである。
【００２５】
減衰されたＰＳＩＩ−活性の他に、緩和された表現型と"漏出"突然変異のいずれも有するＥ．コリ菌株が特に好ましく、その際、ここでも、それぞれ挙げられる好ましい実施形態が特に好ましい。
【００２６】
異種タンパク質とは、本発明の範囲においては、Ｅ．コリＫ１２菌株のプロテオーム、すなわち全体の天然のタンパク質一式に属さないタンパク質を表すべきである。Ｅ．コリＫ１２菌株中に本来存在する全てのタンパク質は、Ｅ．コリＫ１２の公知のゲノム配列から導き出すことができる（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３）。Ｅ．コリ中で産生される異種タンパク質は、その都度の異種タンパク質について天然条件下で同種宿主細胞において特徴的であるか又は同種宿主細胞から得られるものよりも、５０％より高い、好ましくは７０％より高い、特に好ましくは９０％より高い比活性もしくは作用（機能）を有する。
【００２７】
好ましくは、異種タンパク質は、真核性タンパク質であり、特に好ましくは、１もしくは複数のジスルフィド結合を有するか又はその機能的な形態で二量体もしくは多量体として存在するタンパク質であり、すなわち該タンパク質は、四次構造を有し、かつ複数の同一の（相同の）もしくは非同一の（非相同の）サブユニットから構成されている。
【００２８】
最も重要な異種タンパク質クラスには、抗体及びそのフラグメント、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン、リポカリン、アンチカリン、酵素、結合タンパク質及び分子骨格（ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄ）及びそれらから誘導されるタンパク質が該当する。前記のタンパク質クラスのための例は、とりわけ重鎖抗体及びそのフラグメント（例えばナノボディ）、単鎖抗体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、白血病阻害因子、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子、形質転換増殖因子、肝細胞増殖因子、骨形成因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来細胞栄養因子、血管新生阻害因子、組織性プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固因子、トリプシン阻害因子、エラスターゼ阻害因子、補体成分、低酸素症誘導性ストレスタンパク質、癌原遺伝子産物、転写因子、ウイルス構成タンパク質、プロインスリン、プロウロキナーゼ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ニューロトロフィン、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド−ジスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、リポコルチン、レプチン、血清アルブミン、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ、ＣＮＴＦ及びシクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼである。分子骨格由来タンパク質のための例は、とりわけエビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）（ＣＴＬＡ−４由来）、アフィボディ（Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡから）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｅ）（ヒトＡドメインファミリー由来）、トランスボディ（Ｔｒａｎｓｂｏｄｉｅｓ）（トランスフェリン由来）、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリン繰り返しタンパク質由来）、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）（フィブロネクチンＩＩＩ由来）、ペプチドアプタマー（チオレドキシン由来）、ミクロボディ（Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ）（ミクロプロテイン由来）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｅ）（ユビキチン由来）、α−クリスタリン、カリブドトキシン、テトラネクチン、ＲＡＳ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、タンパク質阻害因子のクニッツ型ドメインである。
【００２９】
複数のタンパク質サブユニットからなる特に重要なタンパク質クラスは、抗体である。抗体は、研究において、診断において、かつ治療剤として広範囲で使用されるので、特に効率的かつ工業的規模で可能な製造方法が必要とされる。
【００３０】
また、機能的なＦａｂ−抗体フラグメント及び全長抗体は、本発明による方法によって細胞外で製造することができる。好ましい全長抗体は、その際、ＩｇＧ−クラス及びＩｇＭ−クラス、特にＩｇＧ−クラスの抗体である。
【００３１】
機能的なＦａｂ−抗体フラグメントの製造に際して、細胞は、ドメインＶL及びＣLを含む軽鎖（ＬＣ）の相応のフラグメントと、ドメインＶH及びＣＨ１を含む重鎖（ＨＣ）を、同時に合成し、次いでペリプラズム中に、最終的には培養培地中に分泌せねばならない。細胞質の外側で、次いで両方の鎖の機能的なＦａｂ−フラグメントへの会合が行われる。
【００３２】
Ｆａｂ−フラグメントの製造と同様に、該細胞は、全長抗体の軽鎖と重鎖を同時に合成し、次いでペリプラズム中に、最終的には培養培地中に分泌せねばならない。細胞質の外側で、次いで両方の鎖の機能的な全長抗体への会合が行われる。
【００３３】
細胞質からペリプラズム中へのタンパク質の分泌のためには、産生されるべきタンパク質の遺伝子の５′−末端が、タンパク質排出のためのシグナル配列の３′−末端と読み枠内で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）結合することが必要である。そのためには、原則的に、Ｅ．コリ中で標的タンパク質の移動をＳｅｃ−装置を用いて可能にするあらゆるシグナル配列の遺伝子が適している。種々のシグナル配列が、先行技術において記載されている。ここで、例えば以下の遺伝子のシグナル配列：ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、ＳｔＩＩなどが記載されている（Ｃｈｏｉ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（２００４），６２５−６３５）。
【００３４】
本発明によれば、Ｅ．コリのｐｈｏＡ−遺伝子もしくはｏｍｐＡ−遺伝子のシグナル配列又はクレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列又は前記のシグナル配列から誘導されるＵＳ２００８０７６１５７号に開示される配列が好ましい。ＥＰ０４４８０９３号に開示される、配列番号４の配列を有するクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列並びにＵＳ２００８０７６１５７号に開示される、前記シグナル配列から誘導される配列番号５を有する配列が特に好ましい。
【００３５】
シグナル配列と組み換え標的タンパク質の遺伝子とからの読み枠内融合（ｉｎ ｆｒａｍｅ−Ｆｕｓｉｏｎ）を含むＤＮＡ−分子の製造は、当業者に公知の方法に従って行われる。ここで、標的タンパク質の遺伝子は、まず、ＰＣＲによってプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して増幅され、引き続き通常の分子生物学的技術によって、シグナルペプチドの配列を含み、かつ標的タンパク質の遺伝子と同様に作成されたＤＮＡ−分子と、読み枠内融合を生ずるように、すなわちシグナル配列と標的タンパク質の遺伝子を含む連続的な読み枠を生ずるように結合させることができる。選択的に、上述の両方の機能的断片を含む全ＤＮＡ−分子は、遺伝子合成によっても製造することができる。これらのシグナル配列−組み換え遺伝子−融合物は、次いで、ベクター中に、例えばプラスミド中に導入して、それを宿主細胞中に形質転換によって導入できるか、又は公知の方法に従って直接的に宿主細胞の染色体中に組み込むことができる。好ましくは、該シグナル配列−組み換え遺伝子−融合物は、プラスミド中に導入され、そして宿主細胞はこのプラスミドで形質転換される。
【００３６】
複数の異なるサブユニットからなるタンパク質を細胞質からペリプラズム中に分泌させるために、全ての産生されるべきサブユニットの遺伝子（標的遺伝子）を、タンパク質排出のためのシグナル配列とそれぞれ機能的に結合させる必要がある。その際、種々のサブユニットの遺伝子を異なるシグナル配列と結合させるか又は同じシグナル配列と結合させることができる。異なるシグナル配列との結合が好ましく、一方のサブユニットのＥ．コリのｐｈｏＡ−遺伝子もしくはｏｍｐＡ−遺伝子のシグナル配列との結合及び他方のサブユニットのクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１由来の配列番号４の配列（ＥＰ０４４８０９３号）を有するシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列又は該配列から誘導される配列、例えば配列番号５の配列（ＵＳ２００８０７６１５７号）との結合が特に好ましい。
【００３７】
個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子−融合物は、次いで、ベクター中に、例えばプラスミド中に導入し、又は公知の方法に従って直接的に宿主細胞の染色体中に組み込むことができる。その際、個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子−融合物は、別々であるが、互いに和合性のプラスミドにクローニングし、又は該融合物を、１つのプラスミドにクローニングすることができる。その際、遺伝子−融合物は、１つのオペロンにまとめることができ、又は該融合物は、それぞれ別々のシストロンで発現させることもできる。本願では、１つのオペロンにまとめることが好ましい。同様に、両方の遺伝子構築物を１つのオペロンにまとめることができ、又はそれぞれ別々のシストロンで宿主細胞の染色体中に組み込むことができる。また、本願では、１つのオペロンにまとめることが好ましい。
【００３８】
好ましくは、シグナル配列と分泌されるべきタンパク質をコードする組み換え遺伝子とからなるＤＮＡ−発現構築物（シグナル配列−標的遺伝子−融合物）に、Ｅ．コリにおいて機能的な発現シグナルが設けられる（プロモーター、転写開始、翻訳開始、リボソーム結合部位、ターミネーター）。
【００３９】
プロモーターとしては、当業者に公知のあらゆるプロモーター、例えば、一方で、ｌａｃ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、λＰＬ、ａｒａ−プロモーターもしくはｔｅｔ−プロモーター又はそれらから誘導される配列が適している。他方で、また、例えばＧＡＰＤＨ−プロモーターなどの構成的プロモーターの使用によって持続的な発現を行うこともできる。しかし、産生されるべき組み換えタンパク質の遺伝子と通常どおり結合されたプロモーターも使用することができる。
【００４０】
産生されるべきタンパク質のための前記の発現構築物（プロモーター−シグナル配列−組み換え遺伝子）は、その後に、当業者に公知の方法（例えば形質転換）を使用して、減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する細胞中に導入される。
【００４１】
それは、例えばベクター上で、例えばプラスミド上で、例えばｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３もしくはｐＥＴなどの公知の発現ベクターの誘導体上で行われる。プラスミドのための選択マーカーとして適しているのは、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。
【００４２】
従って、本発明によれば、好ましくは、組み換え遺伝子が、Ｅ．コリ中で活性なシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合され、更に好ましくはＥ．コリ中で機能的な発現シグナル、好ましくはプロモーター、転写開始、翻訳開始、リボソーム結合部位及びターミネーターが設けられているＥ．コリ菌株が使用される。その際、上述の発現シグナルが好ましい。
【００４３】
シグナル配列と分泌されるべきタンパク質をコードする組み換え遺伝子からなるＤＮＡ−発現構築物を含み、機能的発現シグナルと結合された減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する細胞の培養（発酵）は、通常の当業者に公知の発酵法によりバイオリアクター（発酵器）中で行われる。
【００４４】
発酵は、好ましくは、通常のバイオリアクター、例えば撹拌槽、バブルカラム−発酵器又はエアリフト−発酵器中で行われる。撹拌槽−発酵器が特に好ましい。
【００４５】
発酵に際して、タンパク質−産生菌株の細胞を液体培地中で１６〜１５０時間の期間にわたり培養し、その際、例えば培養の栄養素供給、酸素分圧、ｐＨ値及び温度が持続的に調整され、正確に制御される。培養の期間は、好ましくは２４〜７２時間である。
【００４６】
発酵培地としては、原則的に、あらゆる通常の当業者に公知の、微生物の培養用の培地が該当する。
【００４７】
その際、複合培地又は最少塩培地であって、定義された割合の複合成分、例えばペプトン、トリプトン、酵母エキス、糖蜜又はコーンスティープリカーなどの複合成分が添加された培地を用いることができる。医薬品タンパク質の製造のために好ましいのは、化学的に定義された塩培地、従って完全培地に対して正確に定義された基質組成を有する培地である。
【００４８】
本発明による方法において、減衰されたＰＳＩＩ−活性並びに異種タンパク質をコードする遺伝子を有し、読み枠内でＥ．コリ内で機能的なシグナルペプチドをコードするシグナル配列と結合されているＥ．コリ菌株は、ＰＳＩＩ−野生型活性を有する菌株に匹敵する短い発酵時間で匹敵する高い細胞密度まで増殖し、その際、異種タンパク質を塩培地中に分泌する。
【００４９】
発酵のための一次炭素源としては、原則的に、該細胞によって使用可能なあらゆる糖、糖アルコール又は有機酸もしくはそれらの塩を使用することができる。その際、好ましくはグルコース、ラクトース又はグリセリンが使用される。グルコース及びラクトースが特に好ましい。また、複数の種々の炭素源の組み合わせた供給も可能である。該炭素源は、その際、発酵の開始時に全てが発酵培地中に初充填されてよく、又は開始時には炭素源が全く初充填されていないかもしくは一部のみしか初充填されておらず、炭素源を発酵の経過にわたり供給することもできる。その際、炭素源の一部が初充填し、そして一部を供給する実施態様が特に好ましい。特に好ましくは、炭素源は、１０〜３０ｇ／ｌの濃度で初充填され、その濃度が５ｇ／ｌ未満に下降したら供給を開始し、５ｇ／ｌ未満の濃度が維持されるようにする。
【００５０】
培養中の酸素分圧（ｐＯ2）は、好ましくは１０〜７０％飽和度である。好ましくは、ｐＯ2は、３０〜６０％飽和度であり、特に好ましくは、ｐＯ2は、４５〜５５％飽和度である。
【００５１】
培養のｐＨ値は、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８である。好ましくは、ｐＨ値は、６．５〜７．５の間に調整され、特に好ましくは、培養のｐＨは、６．８〜７．２に維持される。
【００５２】
培養の温度は、好ましくは１５〜４５℃である。温度範囲２０〜４０℃が好ましく、温度範囲２５〜３５℃が特に好ましい、３０℃が殊に好ましい。
【００５３】
分泌されたタンパク質の粗生成物からの精製は、通常の当業者に公知の精製方法によって行うことができ、それらは先行技術において知られている。通常は、第一工程において、遠心分離又は濾過などの分離法によって、細胞を分泌された標的タンパク質から分離する。該標的タンパク質を、次いで、例えば限外濾過によって濃縮し、次いで沈殿、クロマトグラフィー又は限外濾過などの標準的方法によって更に精製することができる。この場合に、アフィニティークロマトグラフィーなどの方法であって、既に正確に折り畳まれたタンパク質の本来のコンフォメーションが利用できる方法が特に好ましい。
【００５４】
以下の実施例を用いて、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００５５】
全体の使用される分子生物学的方法及び微生物学的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、ＤＮＡの制限酵素、クレノウ断片及びリガーゼによる改変、Ｐ１−形質導入などは、当業者に公知の、文献に記載される、又はその都度の製造元に推奨される様式及び方法で実施した。
【００５６】
実施例１： Ｅ．コリ野生型菌株からの染色体性ｒｅｌＡ−欠失突然変異体の作成（比較例）
本発明にとって最も近い先行技術は、ｒｅｌＡ−突然変異に基づき低減されたＰＳＩ−活性を有し、かつｒｅｌＡ−野生型菌株と比較してペリプラズム中に分泌されるタンパク質が培養培地中に増大排出されるＥ．コリ菌株であり、例えば該菌株は、Ｇｉｔｔｅｒ他（１９９５，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３，８９−９２）によって記載されている。前記の先行技術に対して減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株の利点を明らかにするために、ｒｅｌＡ−突然変異体を作成した。
【００５７】
そのために、Ｅ．コリ野生型菌株Ｗ３１１０（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号２７３２５）を、λ−Ｒｅｄ−レコンビナーゼを用いてＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−５）の方法に従って突然変異させた。まず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってプライマーとしてオリゴヌクレオチドｒｅｌＡｍｕｔ−ｆｗ（配列番号６）及びｒｅｌＡｍｕｔ−ｒｅｖ（配列番号７）を使用し、かつ鋳型としてプラスミドｐＫＤ３（大腸菌遺伝子保存センター（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＳＣ））を使用して、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含み、かつｒｅｌＡ−遺伝子の５′−領域もしくは３′−領域のそれぞれ５０塩基対によってフランキングされている直鎖ＤＮＡ断片を作成した。菌株Ｗ３１１０を、まずプラスミドｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ番号７７３９）で形質転換した。こうして得られた、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの指示により製造された菌株Ｗ３１１０ ｐＫＤ４６のコンピテント細胞を、ＰＣＲによって上述のように作成された直鎖ＤＮＡ断片で形質転換した。Ｗ３１１０の染色体中のｒｅｌＡ−遺伝子の位置でのクロラムフェニコール耐性カセットの組み込みについての選択は、２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ−アガープレート上で行った。こうして、ｒｅｌＡ−遺伝子のコーディング領域の９５％が除去され、かつクロラムフェニコール耐性カセットによって置き換えられた細胞が得られた。組み込みが染色体の正しい位置で行われたことは、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｒｅｌＡ−ｆｗ（配列番号８）及びｒｅｌＡ−ｒｅｖ（配列番号９）を使用し、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡを使用して確認した。それらの細胞を、プラスミドｐＫＤ４６によって記載された手順（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）に従ってキュアリングし、こうして作成された菌株をＷ３１１０ｒｅｌＡ：：ｃａｔと呼称した。菌株Ｗ３１１０ｒｅｌＡ：：ｃａｔの染色体からのクロラムフェニコール耐性カセットの除去は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法に従って、ＦＬＰ−レコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＣＰ２０（ＣＧＳＣ番号７６２９）を用いて行った。最後に、前記の手順によって得られたクロラムフェニコール感受性のＷ３１１０のｒｅｌＡ−欠失突然変異体を、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡと呼称した。
【００５８】
実施例２： Ｅ．コリΔｒｅｌＡ−菌株からの染色体性ｓｐｏＴ−欠失突然変異体の作成
Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡからのｓｐｏＴ−欠失突然変異体の作成は、原則的に、実施例１に記載した菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡの作成と同様に行った。クロラムフェニコール耐性遺伝子を含み、ｓｐｏＴ−遺伝子の５′−領域もしくは３′−領域のそれぞれ５０塩基対によってフランキングされている直鎖ＤＮＡ断片の作成のために、プライマーとしてオリゴヌクレオチドｓｐｏＴｍｕｔ−ｆｗ（配列番号１０）及びｓｐｏＴｍｕｔ−ｒｅｖ（配列番号１１）と、鋳型としてプラスミドｐＫＤ３を使用した。菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＫＤ４６を、直鎖ＤＮＡ断片で形質転換した。Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡの染色体中のｓｐｏＴ−遺伝子とクロラムフェニコール耐性カセットとの効果的な交換は、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｓｐｏＴ−ｆｗ（配列番号１２）及びｓｐｏＴ−ｒｅｖ（配列番号１３）を使用して、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡを使用して確認した。実施例１に記載される手順による染色体からのクロラムフェニコール耐性カセットの除去によって、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴが得られた。
【００５９】
実施例３： 種々のＥ．コリ菌株における染色体性ｓｐｏＴ１−突然変異の導入
Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡのΔｓｐｏＴ−突然変異体の代わりに、ｓｐｏＴ１−アレル（配列番号３；Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，２５９７−６０６）を有するＷ３１１０ΔｒｅｌＡの突然変異体を作成した。このために、ｓｐｏＴ１−アレルを、菌株Ｋ１０（Ｈｆｒ ＰＯ２Ａ ｔｏｎＡ２２ ｏｍｐＦ６２６ ｒｅｌＡ１ ｐｉｔ−１０ ｓｐｏＴ１ Ｔ２（Ｒ）；ＣＧＳＣ番号４２３４）から、ファージＰ１を使用した形質導入によって菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡへと移動させた。このために、まず、クロラムフェニコール耐性カセットを、Ｋ１０の染色体中に、遺伝子ｒｅｃＧとｇｌｔＳとの間でｓｐｏＴ−遺伝子の約２９００塩基対を超えて組み込んだ（ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔ）。その際、原則的に実施例１に記載されるように行った。クロラムフェニコール耐性カセットを含み、ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳの遺伝子間領域の５０塩基対によってそれぞれフランキングされている直鎖ＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって、プライマーとしてオリゴヌクレオチドｒｅｃＧ−ｃａｔｆｗ（配列番号１４）及びｇｌｔＳ−ｃａｔｒｅｖ（配列番号１５）を使用し、かつ鋳型としてプラスミドｐＫＤ３を使用して作成し、引き続き該菌株Ｋ１０／ｐＫＤ４６中に形質転換した。こうして、染色体中に遺伝子ｒｅｃＧとｇｌｔＳとの間で耐性カセットが組み込まれているクロラムフェニコール耐性クローンが得られた（Ｋ１０ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔ）。組み込みが染色体の正しい位置で行われたことは、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｒｅｃＧ−ｆｗ（配列番号１６）及びｇｌｔＳ−ｒｅｖ（配列番号１７）を使用し、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡを使用して確認した。菌株Ｋ１０ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔから、先行技術に従ってＰ１−溶解産物を作成し、次いでそれを菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡに感染させた。こうして、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡのクロラムフェニコール耐性形質導入物を得た。形質導入過程では、ほぼ１００％の理論的同時形質導入率で、耐性カセットの他にも、染色体上で狭い空間的近隣に局在されるｓｐｏＴ１−アレルが、Ｋ１０ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔからＷ３１１０ΔｒｅｌＡへと移動されるべきであった。実際にそのような場合であることは、ｓｐｏＴ−遺伝子のＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドｓｐｏＴ−ｆｗ（配列番号１２）及びｓｐｏＴ−ｒｅｖ（配列番号１３）を使用し、かつ鋳型として該菌株の染色体ＤＮＡを用いて増幅させ、引き続きＰＣＲ産物の配列決定により確認した。実施例１に記載される手順による菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｒｅｃＧ−ｇｌｔＳ：：ｃａｔの染色体からの耐性カセットの除去によって、最終的に、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１が得られた。
【００６０】
同様の方法によって、ｓｐｏＴ１−アレルを、更にまたＥ．コリ野生型菌株Ｗ３１１０に導入した。得られた菌株を、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１と呼称した。
【００６１】
実施例４： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有するＥ．コリ菌株中へのｌｐｐ−"漏出"突然変異の導入
ｌｐｐ３−突然変異の導入：
菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴもしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１の染色体におけるｌｐｐ野生型遺伝子とｌｐｐ３−アレルとの交換は、相同組み換えによって実施した。菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３もしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３の作成のために、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例３に記載されるのと同じように行った。こうして得られた菌株を、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３もしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３と呼称した。
【００６２】
ｌｐｐ−欠失突然変異の導入：
菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴもしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１の染色体中へのｌｐｐ−欠失の導入は、λ−Ｒｅｄ−レコンビナーゼ−系を用いて、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．．９７：６６４０−５）によって、かつＵＳ２００８２５４５１１号の実施例１と同様に実施した。こうして得られた菌株を、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐもしくはＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐと呼称した。
【００６３】
実施例５： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼの発酵的産生
１０ｌ−規模でのクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１からのシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）の産生のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３をＣａＣｌ2法によってプラスミドｐＣＧＴを用いて形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００６４】
該プラスミドｐＣＧＴは、アンピシリンに対する耐性に関する遺伝子の他に、とりわけ、本来のＣＧＴアーゼ−シグナル配列を含むＣＧＴアーゼの構造遺伝子をも含む。ＣＧＴアーゼ−遺伝子の発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＣＧＴは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例４に記載されている。
【００６５】
ＣＧＴアーゼ−産生は、１０Ｌの撹拌槽発酵器中で、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＣＧＴ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＣＧＴを用いて行った。
【００６６】
発酵培地ＦＭ４（１．５ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；５ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；０．１５ｇ／ｌのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ；０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ3クエン酸塩×２Ｈ2Ｏ；０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ3ＢＯ3；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ）；５ｍｇ／ｌのビタミンＢ1；３ｇ／ｌのフィトン；１．５ｇ／ｌの酵母エキス；１０ｇ／ｌのグルコース；１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）６ｌで充填した発酵器に、１：１０の比率で、一晩同じ培地で培養した前培養を植えた。発酵の間に、温度３０℃に調整し、そしてｐＨ値を、ＮＨ4ＯＨもしくはＨ3ＰＯ4の計量供給によって７．０の値で一定に保持した。グルコースを、発酵にわたって計量供給して、発酵培地中の最大グルコース濃度を＜１０ｇ／ｌにするように努めた。発現の誘導は、対数増殖期の終わりに０．１ｍＭまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって行った。
【００６７】
７２時間の発酵後に、サンプルを取り出し、細胞を遠心分離によって発酵培地から分離し、発酵上清中のＣＧＴアーゼ含有率を以下の活性テストによって測定した：
テストバッファー： ５ｍＭのトリスＨＣｌバッファー ＞ｐＨ６．５、５ｍＭのＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ
基質： テストバッファー（ｐＨ６．５）中の１０％のＮｏｒｅｄｕｘ溶液
テストバッチ： １ｍｌの基質溶液＋１ｍｌの遠心分離され、場合により希釈された培養上清（５分、１２０００ｒｐｍ）＋３ｍｌのメタノール
反応温度： ４０℃
【００６８】
酵素テスト：
・ 溶液を予熱する（約５分、４０℃で）
・ 酵素溶液を基質溶液に添加する；迅速に混合する（渦ミキサ（Ｗｈｉｒｌ−Ｍｉｘｅｒ））
・ ４０℃で３分間インキュベートする
・ 酵素反応をメタノールの添加によって停止させる；迅速に混合する（渦ミキサ）
・ バッチを氷上で冷却する（約５分間）
・ 遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）をし、そして澄明な上清をピペットで取り出す
・ 生じたＣＤをＨＰＬＣによって分析する
酵素活性： Ａ＝Ｇ*Ｖ１*Ｖ２／（ｔ*ＭＧ）（ユニット／ｍｌ）
Ａ＝活性
Ｇ＝ＣＤの含有率（ｍｇ／ｌ）＝テストバッチ： 単位表面×１０4／標準溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）／単位表面
Ｖ１＝テストバッチにおける希釈係数（前記のように実施した場合：Ｖ１＝５）
Ｖ２＝テストで使用する前の培養上清の希釈係数；非希釈の場合：Ｖ２＝１
ｔ＝反応時間（分）
ＭＧ＝分子量（ｇ／モル）（ＣＤ＝９７３ｇ／モル）
１ユニット＝１モルの産物／分
【００６９】
こうして測定されたＣＧＴアーゼ活性から、発酵上清中に存在するＣＧＴアーゼの量を計算することができる。その際、１５０Ｕ／ｍｌのＣＧＴアーゼ活性は、約１ｇ／ｌのＣＧＴアーゼタンパク質に相当する。
【００７０】
第１表は、それぞれ達成されたシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率を示している。
【００７１】
第１表： ７２時間の発酵後の発酵上清中でのシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率
【表１】
【００７２】
実施例６： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるヒルジン誘導体の発酵的産生
この実施例においては、Ｎ末端アミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体の発酵的製造を記載する。ヒルジン誘導体の産生のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、まず、それぞれプラスミドｐＣＭＴ２０３でＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００７３】
プラスミドｐＣＭＴ２０３は、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけＣＧＴアーゼ−シグナル配列の３′−末端で読み枠内で融合されているヒルジン誘導体の構造遺伝子をも有する。ＣＧＴアーゼ−シグナル配列−ヒルジン−融合物の発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＣＭＴ２０３は、ＥＰ０４４８０９３号に記載されている。
【００７４】
ヒルジン誘導体の１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＣＭＴ２０３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＣＭＴ２０３及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＣＭＴ２０３を用いて行った。７２時間の発酵後に、サンプルを取り出し、引き続き細胞を遠心分離によって発酵培地から分離し、そして発酵上清中のヒルジン含有率を、Ｃｈａｎｇ（１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１０８３９−４３）に記載されるトロンビン−不活性化テストによって測定した。その際、１６０００のアンチトロンビン（ＡＴ）ユニット／ｍｌのヒルジン活性は、約１ｇ／ｌのヒルジン−タンパク質に相当する。
【００７５】
第２表は、それぞれ達成された発酵上清中でのヒルジン収率を示している。
【００７６】
第２表： ７２時間の発酵後の発酵上清中のヒルジン収率（ＡＴ−Ｕ／ｍｌ及びｇ／ｌ）
【表２】
【００７７】
実施例７： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるインターフェロンα２ｂの発酵的産生
インターフェロンα２ｂの製造のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＩＦＮでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００７８】
プラスミドｐＩＦＮは、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけＣＧＴアーゼ−シグナル配列の３′−末端で読み枠内で融合されているインターフェロンα２ｂの構造遺伝子をも有する。ＣＧＴアーゼ−シグナル配列−インターフェロンα２ｂ−融合物の発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＩＦＮは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例６に記載されている。
【００７９】
インターフェロンα２ｂの１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＩＦＮ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＩＦＮ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＩＦＮを用いて行った。７２時間の発酵後に、サンプルを取り出し、引き続き、細胞を遠心分離によって発酵培地から分離し、発酵上清中のインターフェロンα２ｂ含有率を測定した。
【００８０】
このために、発酵上清中のタンパク質を電気泳動によりＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離させ、そしてイムノブロットにおける抗インターフェロン特異抗体による検出によって以下のように定量化した：
１μｌの上清を、サンプルバッファーと混合した（２×Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−サンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ２６７６）：０．１２５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、０．００５％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー、５％のβ−メルカプトエタノール）。更に、定義された量のインターフェロンα２ｂを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性を、１００℃に５分間加熱し、氷上で２分間冷却することにより行い、そして遠心分離した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０３４１）中で、１×ＭＥＳ含有ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＮＰ０００２）を用いて分離させた（電気泳動パラメータ： ２００Ｖで４０分間）。
【００８１】
イムノブロットによる検出と定量化を、以下の方法に従って実施した：
湿式ブロッティング法での転写：
モジュール： Ａｍｅｒｓｈａｍ： Ｈｏｅｆｅｒ ＴＥ ２２ Ｍｉｎｉ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ、コード番号：８０−６２０４−２６
メンブレン： ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，ＢＡ８５，硝酸セルロース（Ｅ），０．４５μｍの細孔サイズ）
Ｗｈａｔｍａｎフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品（スポンジ）で転写バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号ＬＣ３６７５）に気泡なく染み込ませた。
積層の構成： 黒い格子、カソードとの接続、各３ｍｍ厚を有する２つのスポンジ、Ｗｈａｔｍａｎペーパー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ＮＣメンブレン、Ｗｈａｔｍａｎ、６ｍｍ厚を有する１つのスポンジ、白い格子、アノードとの接続
転写条件： Ｉ＝２００ｍＡの一定の電流、Ｕ＝無制限、運転時間６０分
【００８２】
プレハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で３０分間振り動かす。
【００８３】
一次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋０．１５μｇ／ｍｌ（→３．７５μｇ）の抗ヒトＩＦＮ抗体（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号：５００−Ｐ３２Ａ）中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で９０分間又は一晩振り動かす。
【００８４】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００８５】
二次抗体のハイブリダイゼーション
２５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファー＋２５μｌ（１：１０００）のヤギ抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｚｏｌを経由した カタログ番号４０５０−０５）中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で６０分間振り動かす。
【００８６】
洗浄
１×ＰＢＳと一緒に室温で１０秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
１×ＰＢＳと一緒に室温で１５分間２回振り動かし、バッファーを捨てる。
【００８７】
化学発光による検出
Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号２０１５２００）を準備する： Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔルミノール／エンハンサー溶液とＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ安定ペルオキシド溶液とを１：１の比率で混合する： ニトロセルロースメンブレン当たり３ｍｌ。
【００８８】
ブロットを室温でＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質と一緒に５分間インキュベートし、過剰の水気を切り、メンブレンをラップフィルムで覆って、直ちにＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｘ−ＯＭＡＴ）を載せ、２分間暴露し、現像し、そして固定する。シグナルが弱い場合に、暴露をより長時間にわたり繰り返す。
【００８９】
バッファー
プレハイブリダイゼーションバッファー： １×ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳
１０×ＰＢＳ： １００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．５、０．５％のＴｒｉｔｏｎ １００
１×ＰＢＳ： １０×ＰＢＳを完全脱塩水で１：１０希釈したもの
【００９０】
定量化
定量的評価は、Ｂｉｏｒａｄ社製のＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでイムノブロットをスキャンすることによって、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフト（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、施与されたスタンダードと比較することによって実施した。
【００９１】
第３表において、こうして測定された発酵上清中のインターフェロンα２ｂの収率を示す。
【００９２】
第３表： ７２時間の発酵後の発酵上清中でのインターフェロンα２ｂの収率
【表３】
【００９３】
実施例８： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模におけるＦａｂ−抗体フラグメントの発酵的産生
本実施例は、十分に特徴付けられている抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＦａｂ−フラグメントの産生を記載する。
【００９４】
抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの製造のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−ＬｙｓｏｚｙｍでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【００９５】
プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍは、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけＦａｂ−フラグメントのＨＣ及びＬＣについての構造遺伝子をもオペロンの形で含む。その際、ＨＣは、ｏｍｐＡ−シグナル配列（ｏｍｐＡSS）の３′−末端に読み枠内で融合されており、かつＬＣは、ＣＧＴアーゼ−シグナル配列（ＣＧＴSS）の３′−末端に読み枠内で融合されている。ｏｍｐＡSS−ＨＣ−ＣＧＴSS−ＬＣ−オペロンの発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例７に記載されている。
【００９６】
抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＦａｂ−Ａｎｔｉ−Ｌｙｓｏｚｙｍを用いて行った。７２時間の発酵の後に、サンプルを取り出し、引き続き該細胞を遠心分離によって発酵培地から分離した。
【００９７】
発酵上清からの抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの精製は、Ｓｋｅｒｒａ（１９９４，Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）に記載されるアフィニティークロマトグラフィーによって実施した。
【００９８】
精製された抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの定量化並びに活性の測定は、抗原としてリゾチームを用いたＥＬＩＳＡテスト（Ｓｋｅｒｒａ，１９９４，Ｇｅｎｅ １４１，７９−８４）によって実施した。
【００９９】
第４表において、それぞれ２０ｍｌの発酵上清から７２時間の発酵後に単離することができた機能的な抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの収率を列記する。
【０１００】
第４表： ７２時間の発酵後の発酵上清中での抗リゾチーム−Ｆａｂ−フラグメントの収率
【表４】
【０１０１】
実施例９： 減衰されたＰＳＩＩ−活性を有する菌株での１０ｌ規模における全長抗体の発酵的産生
本実施例は、抗組織因子（αＴＦ）ＩｇＧ１−抗体の産生を記載している。
【０１０２】
抗αＴＦ抗体の製造のために、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３を、それぞれプラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦでＣａＣｌ2法によって形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）によって行った。
【０１０３】
プラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦは、アンピシリンに対する耐性のための遺伝子の他に、とりわけ抗αＴＦ抗体のＨＣ及びＬＣについての構造遺伝子をもオペロンの形で含む。その際、ＨＣは、ｏｍｐＡ−シグナル配列（ｏｍｐＡSS）の３′−末端に読み枠内で融合されており、かつＬＣは、ＣＧＴアーゼ−シグナル配列（ＣＧＴSS）の３′−末端に読み枠内で融合されている。ｏｍｐＡSS−ＨＣ−ＣＧＴSS−ＬＣ−オペロンの発現は、ｔａｃ−プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦは、ＵＳ２００８２５４５１１号の実施例８に記載されている。
【０１０４】
抗αＴＦ抗体の１０ｌ規模での産生は、実施例５に記載される方法と同様にして、菌株Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ｓｐｏＴ１／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴΔｌｐｐ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡΔｓｐｏＴｌｐｐ３／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ、Ｗ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１Δｌｐｐ／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦ及びＷ３１１０ΔｒｅｌＡｓｐｏＴ１ｌｐｐ３／ｐＡＫ−Ａｎｔｉ−ＴＦを用いて行った。７２時間の発酵の後に、サンプルを取り出し、引き続き該細胞を遠心分離によって発酵培地から分離した。
【０１０５】
発酵培地中に分泌された抗αＴＦ抗体の定量化を、ＥＬＩＳＡテストでの活性測定によって、抗原（コーティング）として可溶性の組織因子を用い、かつ二次抗体としてペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ′）2−フラグメントを用いて、Ｓｉｍｍｏｎｓ他（２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３−４７）に記載されるようにして実施した。
【０１０６】
第５表において、こうして測定された、機能的な抗αＴＦ抗体の収率を列記する。
【０１０７】
第５表： ７２時間の発酵後の発酵上清中での抗αＴＦ抗体の収率
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ．コリ菌株を発酵培地中で培養することで、異種タンパク質を製造する方法であって、該Ｅ．コリ菌株が、異種タンパク質をコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されて含み、かつ該Ｅ．コリ菌株が、前記異種タンパク質を発酵培地中に分泌し、該異種タンパク質が発酵培地から分離される、異種タンパク質の製造方法において、前記Ｅ．コリ菌株が、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性（ＰＳＩＩ−活性）を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｅ．コリ菌株が、そのＰＳＩＩ−活性の改変前の菌株のＰＳＩＩ−活性の最大で５０％、好ましくは最大で２０％を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｅ．コリ菌株が、ｓｐｏＴ１−突然変異もしくは減衰されたＰＳＩＩ−活性に導くｓｐｏＴ−突然変異を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｅ．コリ菌株が、ＰＳＩＩ−活性の完全な損失をもたらすｓｐｏＴ−突然変異を有することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｅ．コリ菌株が、付加的に、緩和された表現型に導くｒｅｌＡ−遺伝子中の突然変異を有することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｒｅｌＡ−突然変異が、ＰＳＩ−活性の完全な損失をもたらすことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｅ．コリ菌株が、ｏｍｐ−遺伝子、ｔｏｌ−遺伝子、ｅｘｃＤ−遺伝子、ｅｘｃＣ−遺伝子、ｌｐｐ−遺伝子、ｐａｌ−遺伝子、ｅｎｖ−遺伝子及びｌｅａｋｙ−遺伝子の群から選択される遺伝子中に"漏出"突然変異を有することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
"漏出"突然変異が、ｌｐｐ−遺伝子中の突然変異、特に有利にはｌｐｐ１−突然変異、ｌｐｐ３−突然変異及びｌｐｐ−欠失突然変異の群から選択される突然変異であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
異種タンパク質が、真核性タンパク質であることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
シグナル配列が、Ｅ．コリのｐｈｏＡ−遺伝子もしくはｏｍｐＡ−遺伝子のシグナル配列又はクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列又は前記のシグナル配列から誘導される配列番号５の配列であることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
Ｅ．コリ菌株を発酵培地中で培養することで、異種タンパク質を製造する方法であって、該Ｅ．コリ菌株が、異種タンパク質をコードする遺伝子を、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されて含み、かつ該Ｅ．コリ菌株が、前記異種タンパク質を発酵培地中に分泌し、該異種タンパク質が発酵培地から分離される、異種タンパク質の製造方法において、前記Ｅ．コリ菌株が、減衰された（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンセターゼＩＩ活性（ＰＳＩＩ−活性）を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｅ．コリ菌株が、そのＰＳＩＩ−活性の改変前の菌株のＰＳＩＩ−活性の最大で５０％、好ましくは最大で２０％を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｅ．コリ菌株が、ｓｐｏＴ１−突然変異もしくは減衰されたＰＳＩＩ−活性に導くｓｐｏＴ−突然変異を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｅ．コリ菌株が、ＰＳＩＩ−活性の完全な損失をもたらすｓｐｏＴ−突然変異を有することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｅ．コリ菌株が、付加的に、緩和された表現型に導くｒｅｌＡ−遺伝子中の突然変異を有することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｒｅｌＡ−突然変異が、ＰＳＩ−活性の完全な損失をもたらすことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｅ．コリ菌株が、ｏｍｐ−遺伝子、ｔｏｌ−遺伝子、ｅｘｃＤ−遺伝子、ｅｘｃＣ−遺伝子、ｌｐｐ−遺伝子、ｐａｌ−遺伝子、ｅｎｖ−遺伝子及びｌｅａｋｙ−遺伝子の群から選択される遺伝子中に"漏出"突然変異を有することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
"漏出"突然変異が、ｌｐｐ−遺伝子中の突然変異、特に有利にはｌｐｐ１−突然変異、ｌｐｐ３−突然変異及びｌｐｐ−欠失突然変異の群から選択される突然変異であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
異種タンパク質が、真核性タンパク質であることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
シグナル配列が、Ｅ．コリのｐｈｏＡ−遺伝子もしくはｏｍｐＡ−遺伝子のシグナル配列又はクレブシエラ・ニューモニアＭ５ａ１由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）のためのシグナル配列又は前記のシグナル配列から誘導される配列番号５の配列であることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【公開番号】特開２０１０−１４２２２７（Ｐ２０１０−１４２２２７Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８６００７（Ｐ２００９−２８６００７）
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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