カダベリンの製造方法
【課題】
本発明の課題は、発酵法によるカダベリンの製造方法において、カダベリンの生産性を高めることにある。
【解決手段】
カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することによりカダベリンを製造する方法であって、酸素移動係数（Ｋｌａ）を１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲で培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
本発明の課題は、発酵法によるカダベリンの製造方法において、カダベリンの生産性を高めることにある。
【解決手段】
カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することによりカダベリンを製造する方法であって、酸素移動係数（Ｋｌａ）を１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲で培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の培養によるカダベリンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カダベリンは石油非依存型のポリマー原料として期待されている。カダベリンの製造方法として微生物を利用した発酵法が知られており、具体的には、カダベリン生産能を有するエシェリヒア（Escherichia）属細菌の発酵によるカダベリンの製造方法（特許文献１、２参照。）、カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌による連続発酵による製造方法（特許文献３参照。）が知られている。
【０００３】
発酵法によるカダベリンの製造方法においてカダベリンの前駆物質となるＬ−リジンの生産性は酸素供給量に制限されることが知られているため（非特許文献２参照。）、従来のカダベリンの発酵生産では、Ｌ−リジンの供給量を増加させることを目的として好気条件下で行われてきた。しかしながら、従来の発酵法によるカダベリンの製造方法におけるカダベリンの生産性は高くはなく、カダベリンの生産性を高める技術が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２２３７７０号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／０９２７２０
【特許文献３】特開２００８−１０４４５３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】P. F. Stanbury, A. Whitaker著 石崎文彬訳 発酵工学の基礎 実験室から工場まで、学会出版センター、１６９〜１９０頁、１９８８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、すなわち、発酵法によるカダベリンの製造方法において、カダベリンの生産性を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行った結果、微好気条件下でカダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養した場合に、好気条件下と比べてカダベリン収率が有意に増加することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３）で構成される。
【０００９】
（１）カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することによりカダベリンを製造する方法であって、酸素移動係数（Ｋｌａ）を１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲で培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
【００１０】
（２）前記細菌がＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性を有することを特徴とする、（１）に記載のカダベリンの製造方法。
【００１１】
（３）前記細菌が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８６にカダベリン生産能を付与した細菌である、（１）または（２）に記載のカダベリンの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来の方法に比較してより効率の高いカダベリンの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1はエシェリヒア・コリＭ１２４／ｐＫＳ１２株のカダベリン発酵試験におけるＫｌａとカダベリンモル収率を表わすグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明では、カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を使用することを特徴とする。本発明におけるエシェリヒア属細菌とは、微生物学の分野における当業者に知られた分類に従ってエシェリヒア属に分類される細菌を意味する。エシェリヒア属細菌の代表的な菌株の例として、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。
【００１５】
エシェリヒア属細菌にカダベリン生産能を付与する方法に制限はないが、好ましくは、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの活性を増強する方法であり、より好ましくは少なくともリジン脱炭酸酵素の活性を増強する方法である。
【００１６】
リジン脱炭酸酵素の活性を増強する方法に制限はない。具体的には、例えば、リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられるが、好ましくは、リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させた宿主を使用する。
【００１７】
リジン脱炭酸酵素量を増加させる手段としては、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子の転写調節領域の改良、該遺伝子のコピー数の増加、該遺伝子からタンパク質への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００１８】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良く、例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００１９】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、ｐＢＲ３２２やｐＵＣ１９等のプラスミド、ファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（Berg, D. E. and Berg. C. M., Bio/Technol., vol.1, P.417 (1983)）やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
【００２０】
遺伝子からタンパク質への翻訳効率を上昇させる方法としては、ＳＤ配列（Shine, J. and Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342-1346(1974)）を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５号公報）などが挙げられる。
【００２１】
リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによりリジン脱炭酸酵素活性を増強させる場合のリジン脱炭酸酵素遺伝子の取得方法としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法などが用いられる。なお、本発明において、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
【００２２】
リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子は、宿主によって発現され、リジン脱炭酸酵素としての活性が保持されるならば特に制限はなく、微生物、動物、植物または昆虫由来のものが使用できるが、微生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が好ましい。
【００２３】
微生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子としては、細菌由来のものが好ましく、具体的には、エシェリヒア・コリ、バシラス・ハロドゥランス（Bacillus halodurans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、セレノモナス・ルミナンチウム（Selenomonas ruminantium）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomyces pilosus）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Eubacterium acidaminophilum）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ナイセリア・メニンギチデス（Neisseria meningitidis）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）またはピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）などの由来の遺伝子が知られており、これらが好ましく用いられる。より好ましくはエシェリヒア属細菌由来の遺伝子（ｃａｄＡ、ｌｄｃＣ）が用いられる。さらに好ましくはエシェリヒア・コリ由来のｃａｄＡが用いられる。
【００２４】
作製される発現ベクターについては、特に制限はない。宿主内で複製可能な１種類の発現ベクターに、１種類のリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み発現させても良い。また、１種類の発現ベクターに、２種類以上のリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み、同一のプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下に発現させても良い。さらに、異なる複製起点を持ち異なるプロモーターを有する発現ベクターを２種類以上使用し、それぞれに異なるリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み異なるプロモーターの制御下で、それぞれを発現させても良い。
【００２５】
発現ベクターの導入方法としては特に制限はないが、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００２６】
本発明で使用されるエシェリヒア属細菌は、カダベリン生産能を阻害するような菌株でなければ特に制限はなく、野生株であっても、薬剤に対する耐性や栄養要求性などの性質を有する変異株であってもよいが、好ましくは、カダベリンの前駆体であるリジンの生産能が向上した変異株であり、より好ましくはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性を有する変異株（ＡＥＣ耐性株）である。
【００２７】
ＡＥＣ耐性株は、ＡＥＣを含む合成培地で生育可能な変異株をスクリーニングすることで取得できる。変異を導入する方法としては特に制限はなく、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frita, H.J., Methods in Enzymology,vol.154,P.350(1987)）リコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton Press(1989）)、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法を用いることができるが、好ましくはＮＴＧで処理する方法を用いる。
【００２８】
本発明におけるカダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌の培養方法について説明する。培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地が使用可能であり、カダベリンが産生される限り特に制限はない。
【００２９】
炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類などを１〜１５％、窒素源として酢酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．１〜４．０％、有機微量成分としてはピリドキサルリン酸やビオチンなどの被要求性物質が０．００００００１〜０．１％、それぞれ適当量含有する培地が用いられる。
【００３０】
これらの他に、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄などが微量物質として必要に応じて添加される。さらにチアミン、ナイアシンなどの要求ビタミン、またはこれらを含有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天然物を適当量含有した培地を用いることもできる。
【００３１】
培養にあたっての培養温度、ｐＨは上記菌株が生育する条件でよく、例えば、１５〜４５℃、特に２０〜４０℃とするのが好ましい。また、ｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、ｐＨ４〜９、特にｐＨ５〜８に調節することが好ましい。
【００３２】
また、培地に消泡剤などを添加することによって、培養条件の安定化を図ることが好ましい。
【００３３】
本発明における培養の酸素条件は、酸素移動容量係数Ｋｌａ（ｈｒ−１）（以下、単にＫｌａと略す。）が１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下であることを特徴とする。本酸素条件でカダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することにより、カダベリンの生産性が顕著に向上する。
【００３４】
Ｋｌａとは、通気攪拌時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（１）で定義される。（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
ｄＣ／ｄｔ＝Ｋｌａ×（Ｃ＊−Ｃ）・・・（１）。
【００３５】
ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｋｌａ：酸素移動容量係数（ｈｒ−１）である。上記式（１）より、下記式（２）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、Ｋｌａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊−Ｃ）＝−Ｋｌａ×ｔ・・・（２）。
【００３６】
また、本発明におけるＫｌａは気体置換法（ダイナミック法）により測定される数値である。気体置換法（ダイナミック法）とは、溶存酸素濃度電極を差し込んだ通気攪拌培養装置に水あるいは使用する培地を入れ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換して該液体の酸素濃度を低下させ、次に窒素ガスを圧縮空気に切り替え、所定の通気速度、攪拌速度および温度下での溶存酸素の上昇過程を測定することによりＫｌａを計算する方法である。
【００３７】
Ｋｌａは通気条件と攪拌条件とを組み合わせて通気攪拌培養することで適宜設定できる。Ｋｌａは本発明で規定される範囲においては通気条件が一定の場合は攪拌条件に、攪拌条件が一定の場合は通気条件に比例することが知られており、本発明で特定されるＫｌａの範囲は、例えば、攪拌条件が８００ｒｐｍの場合には、通気条件を０．０５〜０．５ｖｖｍの範囲内で調節することにより設定することができる。また、通気条件が０．２ｖｖｍの場合は、攪拌条件を１００〜１０００ｒｐｍまで変化させることで設定することができる。
【００３８】
培養液中に生成したカダベリンは、そのまま単離精製することなく利用することもできるし、菌体を遠心分離などで除去した後、常法により単離精製し利用することもできる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。
【００４０】
（参考例１）ｃａｄＡ遺伝子のクローニング
エシェリヒア属細菌のリジン脱炭酸酵素をコードするｃａｄＡ遺伝子の塩基配列は既に報告されており（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＣ＿００００９１、第４３６１１４８番目〜第４３６３２９５番目）、ＯＲＦは２１４８塩基対よりなり、７１６アミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていることがわかっている。ｃａｄＡ遺伝子の配列を配列表の配列番号１に示す。この遺伝子のＳＤ配列とＯＲＦのみを含む領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、クローニングした。
【００４１】
エシェリヒア・コリＫ−１２株由来のＷ３１１０株の全ゲノムＤＮＡを“AquaPure Genomic DNA Kit”（バイオラッド社）を用いて調製し、配列番号２，３に示す配列を有する２種のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｃａｄＡを増幅した。得られたＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化した後、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位に挿入したプラスミドとしてｐＨＳ７を得た。
【００４２】
次に、ｃａｄＡ遺伝子を構成的に発現させるためにエシェリヒア属細菌のｇａｐＡ遺伝子のプロモーター配列（Ｐｇａｐ、配列番号４）をサブクローニングした。５００ｂｐからなるＰｇａｐを、配列番号５，６に示す配列を有する２種のプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅した。得られたＤＮＡをＨｉｎｃＩＩで消化した後、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ株式会社）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入したプラスミドとしてｐＫＳ７を得た。その後、ｐＫＳ７をＨｉｎｄＩＩＩで消化してＰｇａｐを切り出し、ｐＨＳ７のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入したプラスミドとしてｐＫＳ１２を得た。
【００４３】
（参考例２）ＡＥＣ耐性株のスクリーニング
エシェリヒア・コリＷ３１１０株をＬＢ培地にて３７℃で一晩前培養し、培養液５０μｌをＬＢ培地５ｍｌに添加して１．５時間培養した。培養後、集菌して以下のトリス‐マレイン酸緩衝液で２回洗浄したのち、１００μｇ／ｍｌのＮＴＧ溶液中で３７℃、３０分間振とうさせながらインキュベートした。再びトリス‐マレイン酸緩衝液で２回洗浄したのち、ＬＢ培地にて３０℃で一晩培養した。その培養液に等量の２５％グリセロールを添加してグリセロールストックを作製した。
【００４４】
（トリス‐マレイン酸緩衝液）
トリス ６．１ｇ／ｌ
マレイン酸 ５．８ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム七水和物 ０．１ｇ／ｌ
硫酸アンモニウム １．０ｇ／ｌ
クエン酸ナトリウム ０．５ｇ／ｌ
硫酸鉄七水和物 ０．２５ｍｇ／ｌ
塩化カルシウム二水和物 ５．０ｍｇ／ｌ
水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整。
【００４５】
作製したグリセロールストックを、ＡＥＣを５０ｍＭ含むＭ９最小平板培地に塗布して３７℃でインキュベートした。出現したコロニーを分離し、ＡＥＣ耐性株を取得した。得られたＡＥＣ耐性株をＭ１２４と名づけた。なお、Ｍ１２４株は独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８６として寄託されている。
【００４６】
（参考例３）リジン脱炭酸酵素遺伝子発現ベクターｐＫＳ１２の導入
参考例１で作製したｃａｄＡ遺伝子発現ベクターｐＫＳ１２を、参考例２で得られたエシェリヒア・コリＭ１２４株に導入した。導入後、組換え株の選択は抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換体をＭ１２４／ｐＫＳ１２株と名づけた。
【００４７】
（参考例４）リジン脱炭酸酵素活性測定
参考例３で作製したＭ１２４／ｐＫＳ１２株のリジン脱炭酸酵素活性を測定した。また、陰性コントロールとしてＭ１２４／ｐＵＣ１９株のリジン脱炭酸酵素活性を測定した。試験は以下のように行った。
【００４８】
まず５ｍＬのＭＳ培地に菌体を一白金耳植菌し、３７℃で一晩培養し、前々培養とした。次に１０ｍＬのＭＳ培地に前々培養液を１％植え継ぎ、３７℃で２４時間培養し、前培養とした。
【００４９】
（ＭＳ培地組成）
グルコース ４０ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム七水和物 １ｇ／ｌ
硫酸アンモニウム １６ｇ／ｌ
リン酸二水素カリウム １ｇ／ｌ
硫酸鉄七水和物 ０．０１ｇ／ｌ
硫酸マンガン五水和物 ０．０１ｇ／ｌ
イーストエクストラクト（ＢＤ社）２ｇ／ｌ
アンピシリン ５０ｍｇ／ｌ
１２１℃で２０分オートクレーブ（グルコース、硫酸マグネシウム七水和物は別滅菌）。
【００５０】
前培養液を集菌し、リン酸バッファー（ｐＨ６）で２度洗浄したのち、ＯＤ６００が等しくなるようにリン酸バッファーに懸濁した。次に、予め調整しておいた２ｍＬ反応液（５０ｍＭ Ｌ−リジン、０．０５ｍＭ ピリドキサル５’−リン酸、リン酸バッファー（ｐＨ６））に得られた菌体１００μｌを加え、３７℃、２４時間反応させたのち、上清を２，４−ジニトロフルオロベンゼンと３７℃で１時間反応させた。その反応溶液をＨＰＬＣ（検出波長３６０ｎｍ）にて分析し、Ｌ−リジンおよびカダベリン濃度を測定した。結果は表１に示す通りであり、陰性コントロールであるＭ１２４／ｐＵＣ１９株は、ほとんどＬ−リジンをカダベリンに変換できなかったのに対し、Ｍ１２４／ｐＫＳ１２株は顕著なカダベリンの変換活性が認められ、リジン脱炭酸酵素の活性が増強されていることが明らかとなった。
【００５１】
【表１】
【００５２】
（参考例５）Ｋｌａ測定
通気攪拌式の培養装置（ＡＢＬＥ社製、ジャー容量２Ｌ）に溶存酸素電極（メトラートレド製）を挿入して各通気攪拌条件に対する溶存酸素濃度を測定し、窒素ガスを用いるダイナミック法によりＫｌａを求めた。まず、カダベリン発酵試験に採用する条件と同一の通気攪拌条件および温度条件下で水１Ｌを攪拌しながら窒素ガスを十分に水中に吹き込んで、電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行い、窒素ガスから空気に通気ガスを変更して培養装置の運転を開始し、溶存酸素濃度の経時変化を測定してＫｌａを求めた。得られた各通気攪拌条件に対するＫｌａを表２に示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（実施例１）カダベリン発酵試験
参考例５の各種の通気攪拌条件において、バッチ発酵試験にてＭ１２４／ｐＫＳ１２株のカダベリン生産能を評価した。発酵試験は表２に示すＫｌａ条件下で実施した。Ｍ１２４／ｐＫＳ１２株を以下のＭＳ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前々培養した。次に、予め１２１℃、２０分間で蒸気滅菌した５００ｍｌ容三角フラスコに入れたＭＳ培地５０ｍｌで前々培養液を１００倍希釈し、３７℃で２４時間振とうして前培養した。次に、中和剤として３０ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含むＭＳ培地１０００ｍｌに前培養液全量を植菌し、３７℃で３６時間培養した。
【００５５】
培養終了後、菌体を除去した培養上清を２，４−ジニトロフルオロベンゼンと３７℃、１時間反応させ、その反応溶液をＨＰＬＣ（検出波長 ３６０ｎｍ）によりカダベリン濃度を測定した。
【００５６】
Ｋｌａを横軸に、カダベリンモル収率を縦軸にしてプロットした結果を図１に示す。その結果、Ｍ１２４／ｐＫＳ１２株は、１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲内においてカダベリン生産性が顕著に向上した。
【００５７】
（比較例１）フラスコ培養でのＫｌａ測定
特開２００２−２２３７７０号公報の実施例にはカダベリン生産能を有するエシェリヒア・コリの培地充填率９０％でのフラスコ培養によるカダベリンの製造方法が開示されている。特開２００２−２２３７７０号公報の実施例における通気条件に該当するＫｌａの範囲を、窒素ガスを用いるダイナミック法により求めた。溶存酸素濃度の測定にはＦｉｂｏｘ３−ＡＯＴ（ＰｒｅＳｅｎｓ社）を用いた。また、振とう機はＢＲ−３０００ＬＦ（ＴＡＩＴＥＣ社）を用いた。まず、溶存酸素電極を取り付けた通気攪拌式の培養装置（ＡＢＬＥ社製、ジャー容量２Ｌ）に水を投入し、攪拌しながら窒素ガスを十分に吹き込み、水中の溶存酸素濃度を０．０５ｐｐｍ以下とし、その水を、溶存酸素濃度測定用センサーを取り付けた５００ｍＬ容フラスコに４５０ｍＬを静かに注ぎ、シリコ栓をはめて、所定の振とう速度で振とうを開始し、溶存酸素濃度の経時変化をモニターした。測定した溶存酸素濃度よりＫｌａを求めた。振とう速度は、振とう機の可動範囲である２５から２５０ｒｐｍまで変化させた。その結果、得られた各振とう速度に対応するＫｌａは表３に示す通りであり、いずれも１８ｈ−１を下回っていたため、特開２００２−２２３７７０号公報の実施例における通気条件は、本発明でのＫｌａの範囲外となることが明らかとなった。
【００５８】
【表３】
【受託番号】
【００５９】
ＮＩＴＥ Ｐ−６８６
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の培養によるカダベリンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カダベリンは石油非依存型のポリマー原料として期待されている。カダベリンの製造方法として微生物を利用した発酵法が知られており、具体的には、カダベリン生産能を有するエシェリヒア（Escherichia）属細菌の発酵によるカダベリンの製造方法（特許文献１、２参照。）、カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌による連続発酵による製造方法（特許文献３参照。）が知られている。
【０００３】
発酵法によるカダベリンの製造方法においてカダベリンの前駆物質となるＬ−リジンの生産性は酸素供給量に制限されることが知られているため（非特許文献２参照。）、従来のカダベリンの発酵生産では、Ｌ−リジンの供給量を増加させることを目的として好気条件下で行われてきた。しかしながら、従来の発酵法によるカダベリンの製造方法におけるカダベリンの生産性は高くはなく、カダベリンの生産性を高める技術が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２２３７７０号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／０９２７２０
【特許文献３】特開２００８−１０４４５３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】P. F. Stanbury, A. Whitaker著 石崎文彬訳 発酵工学の基礎 実験室から工場まで、学会出版センター、１６９〜１９０頁、１９８８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、すなわち、発酵法によるカダベリンの製造方法において、カダベリンの生産性を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行った結果、微好気条件下でカダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養した場合に、好気条件下と比べてカダベリン収率が有意に増加することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３）で構成される。
【０００９】
（１）カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することによりカダベリンを製造する方法であって、酸素移動係数（Ｋｌａ）を１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲で培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
【００１０】
（２）前記細菌がＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性を有することを特徴とする、（１）に記載のカダベリンの製造方法。
【００１１】
（３）前記細菌が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８６にカダベリン生産能を付与した細菌である、（１）または（２）に記載のカダベリンの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来の方法に比較してより効率の高いカダベリンの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1はエシェリヒア・コリＭ１２４／ｐＫＳ１２株のカダベリン発酵試験におけるＫｌａとカダベリンモル収率を表わすグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明では、カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を使用することを特徴とする。本発明におけるエシェリヒア属細菌とは、微生物学の分野における当業者に知られた分類に従ってエシェリヒア属に分類される細菌を意味する。エシェリヒア属細菌の代表的な菌株の例として、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。
【００１５】
エシェリヒア属細菌にカダベリン生産能を付与する方法に制限はないが、好ましくは、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの活性を増強する方法であり、より好ましくは少なくともリジン脱炭酸酵素の活性を増強する方法である。
【００１６】
リジン脱炭酸酵素の活性を増強する方法に制限はない。具体的には、例えば、リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられるが、好ましくは、リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させた宿主を使用する。
【００１７】
リジン脱炭酸酵素量を増加させる手段としては、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子の転写調節領域の改良、該遺伝子のコピー数の増加、該遺伝子からタンパク質への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００１８】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良く、例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００１９】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、ｐＢＲ３２２やｐＵＣ１９等のプラスミド、ファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（Berg, D. E. and Berg. C. M., Bio/Technol., vol.1, P.417 (1983)）やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
【００２０】
遺伝子からタンパク質への翻訳効率を上昇させる方法としては、ＳＤ配列（Shine, J. and Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342-1346(1974)）を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５号公報）などが挙げられる。
【００２１】
リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによりリジン脱炭酸酵素活性を増強させる場合のリジン脱炭酸酵素遺伝子の取得方法としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法などが用いられる。なお、本発明において、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
【００２２】
リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子は、宿主によって発現され、リジン脱炭酸酵素としての活性が保持されるならば特に制限はなく、微生物、動物、植物または昆虫由来のものが使用できるが、微生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が好ましい。
【００２３】
微生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子としては、細菌由来のものが好ましく、具体的には、エシェリヒア・コリ、バシラス・ハロドゥランス（Bacillus halodurans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、セレノモナス・ルミナンチウム（Selenomonas ruminantium）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomyces pilosus）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Eubacterium acidaminophilum）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ナイセリア・メニンギチデス（Neisseria meningitidis）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）またはピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）などの由来の遺伝子が知られており、これらが好ましく用いられる。より好ましくはエシェリヒア属細菌由来の遺伝子（ｃａｄＡ、ｌｄｃＣ）が用いられる。さらに好ましくはエシェリヒア・コリ由来のｃａｄＡが用いられる。
【００２４】
作製される発現ベクターについては、特に制限はない。宿主内で複製可能な１種類の発現ベクターに、１種類のリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み発現させても良い。また、１種類の発現ベクターに、２種類以上のリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み、同一のプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下に発現させても良い。さらに、異なる複製起点を持ち異なるプロモーターを有する発現ベクターを２種類以上使用し、それぞれに異なるリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み異なるプロモーターの制御下で、それぞれを発現させても良い。
【００２５】
発現ベクターの導入方法としては特に制限はないが、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００２６】
本発明で使用されるエシェリヒア属細菌は、カダベリン生産能を阻害するような菌株でなければ特に制限はなく、野生株であっても、薬剤に対する耐性や栄養要求性などの性質を有する変異株であってもよいが、好ましくは、カダベリンの前駆体であるリジンの生産能が向上した変異株であり、より好ましくはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性を有する変異株（ＡＥＣ耐性株）である。
【００２７】
ＡＥＣ耐性株は、ＡＥＣを含む合成培地で生育可能な変異株をスクリーニングすることで取得できる。変異を導入する方法としては特に制限はなく、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frita, H.J., Methods in Enzymology,vol.154,P.350(1987)）リコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton Press(1989）)、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法を用いることができるが、好ましくはＮＴＧで処理する方法を用いる。
【００２８】
本発明におけるカダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌の培養方法について説明する。培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地が使用可能であり、カダベリンが産生される限り特に制限はない。
【００２９】
炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類などを１〜１５％、窒素源として酢酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．１〜４．０％、有機微量成分としてはピリドキサルリン酸やビオチンなどの被要求性物質が０．００００００１〜０．１％、それぞれ適当量含有する培地が用いられる。
【００３０】
これらの他に、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄などが微量物質として必要に応じて添加される。さらにチアミン、ナイアシンなどの要求ビタミン、またはこれらを含有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天然物を適当量含有した培地を用いることもできる。
【００３１】
培養にあたっての培養温度、ｐＨは上記菌株が生育する条件でよく、例えば、１５〜４５℃、特に２０〜４０℃とするのが好ましい。また、ｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、ｐＨ４〜９、特にｐＨ５〜８に調節することが好ましい。
【００３２】
また、培地に消泡剤などを添加することによって、培養条件の安定化を図ることが好ましい。
【００３３】
本発明における培養の酸素条件は、酸素移動容量係数Ｋｌａ（ｈｒ−１）（以下、単にＫｌａと略す。）が１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下であることを特徴とする。本酸素条件でカダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することにより、カダベリンの生産性が顕著に向上する。
【００３４】
Ｋｌａとは、通気攪拌時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（１）で定義される。（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
ｄＣ／ｄｔ＝Ｋｌａ×（Ｃ＊−Ｃ）・・・（１）。
【００３５】
ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｋｌａ：酸素移動容量係数（ｈｒ−１）である。上記式（１）より、下記式（２）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、Ｋｌａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊−Ｃ）＝−Ｋｌａ×ｔ・・・（２）。
【００３６】
また、本発明におけるＫｌａは気体置換法（ダイナミック法）により測定される数値である。気体置換法（ダイナミック法）とは、溶存酸素濃度電極を差し込んだ通気攪拌培養装置に水あるいは使用する培地を入れ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換して該液体の酸素濃度を低下させ、次に窒素ガスを圧縮空気に切り替え、所定の通気速度、攪拌速度および温度下での溶存酸素の上昇過程を測定することによりＫｌａを計算する方法である。
【００３７】
Ｋｌａは通気条件と攪拌条件とを組み合わせて通気攪拌培養することで適宜設定できる。Ｋｌａは本発明で規定される範囲においては通気条件が一定の場合は攪拌条件に、攪拌条件が一定の場合は通気条件に比例することが知られており、本発明で特定されるＫｌａの範囲は、例えば、攪拌条件が８００ｒｐｍの場合には、通気条件を０．０５〜０．５ｖｖｍの範囲内で調節することにより設定することができる。また、通気条件が０．２ｖｖｍの場合は、攪拌条件を１００〜１０００ｒｐｍまで変化させることで設定することができる。
【００３８】
培養液中に生成したカダベリンは、そのまま単離精製することなく利用することもできるし、菌体を遠心分離などで除去した後、常法により単離精製し利用することもできる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。
【００４０】
（参考例１）ｃａｄＡ遺伝子のクローニング
エシェリヒア属細菌のリジン脱炭酸酵素をコードするｃａｄＡ遺伝子の塩基配列は既に報告されており（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＣ＿００００９１、第４３６１１４８番目〜第４３６３２９５番目）、ＯＲＦは２１４８塩基対よりなり、７１６アミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていることがわかっている。ｃａｄＡ遺伝子の配列を配列表の配列番号１に示す。この遺伝子のＳＤ配列とＯＲＦのみを含む領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、クローニングした。
【００４１】
エシェリヒア・コリＫ−１２株由来のＷ３１１０株の全ゲノムＤＮＡを“AquaPure Genomic DNA Kit”（バイオラッド社）を用いて調製し、配列番号２，３に示す配列を有する２種のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｃａｄＡを増幅した。得られたＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化した後、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位に挿入したプラスミドとしてｐＨＳ７を得た。
【００４２】
次に、ｃａｄＡ遺伝子を構成的に発現させるためにエシェリヒア属細菌のｇａｐＡ遺伝子のプロモーター配列（Ｐｇａｐ、配列番号４）をサブクローニングした。５００ｂｐからなるＰｇａｐを、配列番号５，６に示す配列を有する２種のプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅した。得られたＤＮＡをＨｉｎｃＩＩで消化した後、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ株式会社）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入したプラスミドとしてｐＫＳ７を得た。その後、ｐＫＳ７をＨｉｎｄＩＩＩで消化してＰｇａｐを切り出し、ｐＨＳ７のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入したプラスミドとしてｐＫＳ１２を得た。
【００４３】
（参考例２）ＡＥＣ耐性株のスクリーニング
エシェリヒア・コリＷ３１１０株をＬＢ培地にて３７℃で一晩前培養し、培養液５０μｌをＬＢ培地５ｍｌに添加して１．５時間培養した。培養後、集菌して以下のトリス‐マレイン酸緩衝液で２回洗浄したのち、１００μｇ／ｍｌのＮＴＧ溶液中で３７℃、３０分間振とうさせながらインキュベートした。再びトリス‐マレイン酸緩衝液で２回洗浄したのち、ＬＢ培地にて３０℃で一晩培養した。その培養液に等量の２５％グリセロールを添加してグリセロールストックを作製した。
【００４４】
（トリス‐マレイン酸緩衝液）
トリス ６．１ｇ／ｌ
マレイン酸 ５．８ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム七水和物 ０．１ｇ／ｌ
硫酸アンモニウム １．０ｇ／ｌ
クエン酸ナトリウム ０．５ｇ／ｌ
硫酸鉄七水和物 ０．２５ｍｇ／ｌ
塩化カルシウム二水和物 ５．０ｍｇ／ｌ
水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整。
【００４５】
作製したグリセロールストックを、ＡＥＣを５０ｍＭ含むＭ９最小平板培地に塗布して３７℃でインキュベートした。出現したコロニーを分離し、ＡＥＣ耐性株を取得した。得られたＡＥＣ耐性株をＭ１２４と名づけた。なお、Ｍ１２４株は独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８６として寄託されている。
【００４６】
（参考例３）リジン脱炭酸酵素遺伝子発現ベクターｐＫＳ１２の導入
参考例１で作製したｃａｄＡ遺伝子発現ベクターｐＫＳ１２を、参考例２で得られたエシェリヒア・コリＭ１２４株に導入した。導入後、組換え株の選択は抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換体をＭ１２４／ｐＫＳ１２株と名づけた。
【００４７】
（参考例４）リジン脱炭酸酵素活性測定
参考例３で作製したＭ１２４／ｐＫＳ１２株のリジン脱炭酸酵素活性を測定した。また、陰性コントロールとしてＭ１２４／ｐＵＣ１９株のリジン脱炭酸酵素活性を測定した。試験は以下のように行った。
【００４８】
まず５ｍＬのＭＳ培地に菌体を一白金耳植菌し、３７℃で一晩培養し、前々培養とした。次に１０ｍＬのＭＳ培地に前々培養液を１％植え継ぎ、３７℃で２４時間培養し、前培養とした。
【００４９】
（ＭＳ培地組成）
グルコース ４０ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム七水和物 １ｇ／ｌ
硫酸アンモニウム １６ｇ／ｌ
リン酸二水素カリウム １ｇ／ｌ
硫酸鉄七水和物 ０．０１ｇ／ｌ
硫酸マンガン五水和物 ０．０１ｇ／ｌ
イーストエクストラクト（ＢＤ社）２ｇ／ｌ
アンピシリン ５０ｍｇ／ｌ
１２１℃で２０分オートクレーブ（グルコース、硫酸マグネシウム七水和物は別滅菌）。
【００５０】
前培養液を集菌し、リン酸バッファー（ｐＨ６）で２度洗浄したのち、ＯＤ６００が等しくなるようにリン酸バッファーに懸濁した。次に、予め調整しておいた２ｍＬ反応液（５０ｍＭ Ｌ−リジン、０．０５ｍＭ ピリドキサル５’−リン酸、リン酸バッファー（ｐＨ６））に得られた菌体１００μｌを加え、３７℃、２４時間反応させたのち、上清を２，４−ジニトロフルオロベンゼンと３７℃で１時間反応させた。その反応溶液をＨＰＬＣ（検出波長３６０ｎｍ）にて分析し、Ｌ−リジンおよびカダベリン濃度を測定した。結果は表１に示す通りであり、陰性コントロールであるＭ１２４／ｐＵＣ１９株は、ほとんどＬ−リジンをカダベリンに変換できなかったのに対し、Ｍ１２４／ｐＫＳ１２株は顕著なカダベリンの変換活性が認められ、リジン脱炭酸酵素の活性が増強されていることが明らかとなった。
【００５１】
【表１】
【００５２】
（参考例５）Ｋｌａ測定
通気攪拌式の培養装置（ＡＢＬＥ社製、ジャー容量２Ｌ）に溶存酸素電極（メトラートレド製）を挿入して各通気攪拌条件に対する溶存酸素濃度を測定し、窒素ガスを用いるダイナミック法によりＫｌａを求めた。まず、カダベリン発酵試験に採用する条件と同一の通気攪拌条件および温度条件下で水１Ｌを攪拌しながら窒素ガスを十分に水中に吹き込んで、電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行い、窒素ガスから空気に通気ガスを変更して培養装置の運転を開始し、溶存酸素濃度の経時変化を測定してＫｌａを求めた。得られた各通気攪拌条件に対するＫｌａを表２に示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（実施例１）カダベリン発酵試験
参考例５の各種の通気攪拌条件において、バッチ発酵試験にてＭ１２４／ｐＫＳ１２株のカダベリン生産能を評価した。発酵試験は表２に示すＫｌａ条件下で実施した。Ｍ１２４／ｐＫＳ１２株を以下のＭＳ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前々培養した。次に、予め１２１℃、２０分間で蒸気滅菌した５００ｍｌ容三角フラスコに入れたＭＳ培地５０ｍｌで前々培養液を１００倍希釈し、３７℃で２４時間振とうして前培養した。次に、中和剤として３０ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含むＭＳ培地１０００ｍｌに前培養液全量を植菌し、３７℃で３６時間培養した。
【００５５】
培養終了後、菌体を除去した培養上清を２，４−ジニトロフルオロベンゼンと３７℃、１時間反応させ、その反応溶液をＨＰＬＣ（検出波長 ３６０ｎｍ）によりカダベリン濃度を測定した。
【００５６】
Ｋｌａを横軸に、カダベリンモル収率を縦軸にしてプロットした結果を図１に示す。その結果、Ｍ１２４／ｐＫＳ１２株は、１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲内においてカダベリン生産性が顕著に向上した。
【００５７】
（比較例１）フラスコ培養でのＫｌａ測定
特開２００２−２２３７７０号公報の実施例にはカダベリン生産能を有するエシェリヒア・コリの培地充填率９０％でのフラスコ培養によるカダベリンの製造方法が開示されている。特開２００２−２２３７７０号公報の実施例における通気条件に該当するＫｌａの範囲を、窒素ガスを用いるダイナミック法により求めた。溶存酸素濃度の測定にはＦｉｂｏｘ３−ＡＯＴ（ＰｒｅＳｅｎｓ社）を用いた。また、振とう機はＢＲ−３０００ＬＦ（ＴＡＩＴＥＣ社）を用いた。まず、溶存酸素電極を取り付けた通気攪拌式の培養装置（ＡＢＬＥ社製、ジャー容量２Ｌ）に水を投入し、攪拌しながら窒素ガスを十分に吹き込み、水中の溶存酸素濃度を０．０５ｐｐｍ以下とし、その水を、溶存酸素濃度測定用センサーを取り付けた５００ｍＬ容フラスコに４５０ｍＬを静かに注ぎ、シリコ栓をはめて、所定の振とう速度で振とうを開始し、溶存酸素濃度の経時変化をモニターした。測定した溶存酸素濃度よりＫｌａを求めた。振とう速度は、振とう機の可動範囲である２５から２５０ｒｐｍまで変化させた。その結果、得られた各振とう速度に対応するＫｌａは表３に示す通りであり、いずれも１８ｈ−１を下回っていたため、特開２００２−２２３７７０号公報の実施例における通気条件は、本発明でのＫｌａの範囲外となることが明らかとなった。
【００５８】
【表３】
【受託番号】
【００５９】
ＮＩＴＥ Ｐ−６８６
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することによりカダベリンを製造する方法であって、酸素移動係数（Ｋｌａ）を１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲で培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
【請求項２】
前記細菌がＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性を有することを特徴とする、請求項１に記載のカダベリンの製造方法。
【請求項３】
前記細菌が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８６にカダベリン生産能を付与した細菌である、請求項１または２に記載のカダベリンの製造方法。
【請求項１】
カダベリン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培養することによりカダベリンを製造する方法であって、酸素移動係数（Ｋｌａ）を１８ｈ−１以上６０ｈ−１以下の範囲で培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
【請求項２】
前記細菌がＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性を有することを特徴とする、請求項１に記載のカダベリンの製造方法。
【請求項３】
前記細菌が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８６にカダベリン生産能を付与した細菌である、請求項１または２に記載のカダベリンの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−６５６２９（Ｐ２０１２−６５６２９Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１５２９２（Ｐ２０１０−２１５２９２）
【出願日】平成２２年９月２７日（２０１０．９．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２７日（２０１０．９．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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