カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩を用いたヒアルロン酸の精製方法
本発明は、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩を用いたヒアルロン酸の精製方法に関し、詳しくは、ヒアルロン酸を含む抽出物または培養液を、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理することにより、脂質、核酸、およびタンパク質を効果的に除去することを特徴とするヒアルロン酸の精製方法に関するものである。本発明によれば、付加的な工程を減らせるとともに、有毒な有機物質の使用を避けることによって、より効果的にヒアルロン酸を精製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩を用いたヒアルロン酸の精製方法に関し、詳しくは、ヒアルロン酸を含む抽出物または培養液をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理することによって、前記抽出物または前記培養液から脂質、核酸、およびタンパク質を効果的に除去してヒアルロン酸を精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、生体内に存在するグリコサミノグリカンの一種である酸性ムコ多糖類であり、１，０００Ｄａ〜１０ｋＤａの分子量を持つＤ−グルコン酸とＮ−アセチルグルコースアミンの繰り返し分子構造を有し、非常に高い粘性と弾性を有する。
【０００３】
ヒアルロン酸は、身体のあらゆる部位に存在し、身体の各部位で様々な特性を示す。保水能力に優れ、良好な粘性と弾性を有し、体の動きを円滑にする潤滑作用、生理活性物質の移動を管理し、細胞との特異な相互作用によって細胞の分化および成長を誘導する媒体、細胞外基質ではコラーゲン、エラスチン、硫酸コンドロイチン等の組織を支えるタンパク質と糖タンパク質などの支持体としての機能を有する生体高分子である。上記で示したような特性により、ヒアルロン酸は、加齢による退行性関節炎の治療および痛み緩和治療剤として用いられ、また、眼科手術補助材および眼球乾燥症薬物の主成分として用いられ、さらにまた、シワおよび陥没した皮膚組織の補完などの成形補足材料として用いられている。
【０００４】
現在、医療分野で、特に眼科用として用いられるヒアルロン酸は、一般に、乾燥重量ベースで製品中９０％以上が定量的に含まれており、その平均分子量は１．９×１０6ｇ／モル〜３．９×１０6ｇ／モルであり、平均重合度（ｎ）は４，７００〜９，６００である。現在、関節炎注射剤の用途として、種々の分子量分布を有する製品が市販されている。医療用ヒアルロン酸は、注射剤用薬品に用いられるので、タンパク質や他の酸性ムコ多糖類（例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸等）の混入が許されない程度の精製度が求められるなど、安全性の規制が非常に厳しい。
【０００５】
下記表１に、韓国食品医薬品局告示による医療用（眼科用）ヒアルロン酸の基準を示す。
【０００６】
【表１】
【０００７】
医療用ヒアルロン酸は、動物組織から抽出するか、微生物の発酵培養液から回収する方法によって得ることができ、動物組織から抽出したヒアルロン酸は、微生物培養液から回収したヒアルロン酸よりも優れた効果を有していることが知られている（Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 13, 183-192, (1999)）。さらに、動物組織、特に雄鶏とさかから、ヒアルロン酸を分離および精製する方法が多数知られている。
【０００８】
特許文献１（米国特許第４，１４１，９７３号）には、クロロホルムを用いて数回抽出を行うことにより、雄鶏とさかからヒアルロン酸を分離および精製する方法が開示されている。
【０００９】
特許文献２（ヨーロッパ特許第０１２３８５７２号）には、限外ろ過膜を用いて、雄鶏とさかから分子量の大きさによって低分子のヒアルロン酸を分離および精製する方法が開示されている。
【００１０】
特許文献３（国際特許ＷＯ９２００８６１号）には、雄鶏とさかからの抽出物をタンパク質分解酵素で処理し、処理結果物を第４級アンモニウム塩に転換し、有機溶媒を用いてアンモニウム塩を除去し、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ）を用いて分画を得た後、塩化セチルピリジウムで処理してヒアルロン酸分画を沈殿させ、水溶性有機溶媒をヒアルロン酸分画に添加してヒアルロン酸を沈殿させることにより、ヒアルロン酸を得る方法が開示されている。
【００１１】
さらに、特許文献４（大韓民国公開特許第１９８７−０００８９０４号）には、雄鶏とさかからの抽出物をタンパク質分解酵素で処理し、ブタノール等の有機溶媒を用いて脂質およびタンパク質を除去し、塩化セチルピリジウムにより殺菌と沈殿を同時に行って分画を得て、そこに水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸を沈殿させることを含むヒアルロン酸の製造方法が開示されている。
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号
【特許文献２】ヨーロッパ特許第０１２３８５７２号
【特許文献３】国際特許ＷＯ９２００８６１号
【特許文献４】大韓民国公開特許第１９８７−０００８９０４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、上記に記載の従来の方法は、工程が複雑で大量生産規模にそれを適用する問題、収率が低いことの問題、有機溶媒を使用することによる水処理にかかるコストや精製コストが莫大となる問題、長時間の多工程のプロセスでヒアルロン酸の自己分解が発生し得る問題がある。また、これらの方法は、医療用の製品の生産には許されない毒性有機溶媒を使用しているという、もう一つの重要な問題を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するためのものである。従って、本発明の目的は、有毒な有機物質の使用を排除し、従来のヒアルロン酸精製プロセスに対して精製工程数を減らすことによって、より効果的にヒアルロン酸を精製する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明は、（１）ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理して得られるか、または微生物由来のヒアルロン酸を含有する培養液から得られるヒアルロン酸粗抽出物を、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩と処理する工程、（２）前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることによってヒアルロン酸を精製する工程を有するヒアルロン酸の精製方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るヒアルロン酸精製方法は、ヒアルロン酸含有抽出液または培養液からヒアルロン酸を高純度かつ速かに精製することができ、タンパク質、核酸、脂質等を非常に効率的に除去することができる。さらに本発明は、従来の有機溶媒を用いた精製方法の問題を克服し、工程を単純化して大量生産に適した工程の設計を可能とし、また高収率を保証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法において、前記工程（１）で得られるヒアルロン酸粗抽出物は、ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理して得られるか、またはヒアルロン酸を生産できる微生物から生産されたヒアルロン酸を含有する培養液から得られる。前記ヒアルロン酸含有天然物とは、本発明に従って精製ヒアルロン酸を提供できるものであれば特に限定されず、雄鶏とさかが主に用いられる。処理条件に関しては、タンパク質分解酵素での処理が可能な条件であれば特に制限されず、公知のタンパク質分解酵素処理方法を使用すればよい。ヒアルロン酸を生産できる微生物としては、公知のヒアルロン酸生産用微生物が使用可能であり、公知方法を用いて得られたヒアルロン酸含有微生物培養液であれば、本発明の精製方法に特に制限なく使用できる。
【００１７】
以下、本発明の好ましい一具体例により、ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理してヒアルロン酸粗抽出物を得る工程について、さらに詳しく説明する。
【００１８】
本発明の好ましい一具体例によれば、ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理してヒアルロン酸粗抽出物を得るためには、まず、ヒアルロン酸含有天然物として雄鶏とさかを細かく粉砕し、エタノールで洗浄する。次に、粉砕および洗浄された雄鶏とさかに適量の蒸留水を加え、タンパク質分解酵素の存在下で撹拌した後、３０℃〜６０℃の温度で３時間〜７２時間放置する。放置の結果、層分離が起こるので、脂質が含まれる上層は捨て、下層の抽出液だけを採取してろ過する。ろ過により得られた抽出液は３０℃〜６０℃の温度に加熱し、その後タンパク質分解酵素を添加して３時間〜２４時間、再び処理する。二次処理後、生成抽出液をろ過してヒアルロン酸抽出液を得る。このヒアルロン酸抽出液は、さらに処理することなく、工程（１）でヒアルロン酸粗抽出物として用いてもよい。しかし、塩化ナトリウムの濃度が０．３Ｍ〜１Ｍになるように定量した塩化ナトリウムを得られたヒアルロン酸抽出液に添加し、９５％エタノール中でヒアルロン酸を沈殿させた後、この溶液をろ過して得られたヒアルロン酸沈殿物を凍結乾燥または真空乾燥することによって得られるヒアルロン酸粉末を、ヒアルロン酸粗抽出物として用いることが好ましい。このようにして得られるヒアルロン酸粉末は、蒸留水に溶解して適正濃度のヒアルロン酸水溶液に調製され、使用される。
【００１９】
本発明のヒアルロン酸の精製方法によると、工程（１）では、ヒアルロン酸粗抽出物をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理することによって、粗抽出物から脂質、核酸、およびタンパク質が除去される。特に、工程（１）では、４℃〜９０℃の温度範囲で、ヒアルロン酸粗抽出物をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理することが好ましい。
【００２０】
前記工程（１）において、有用なカルシウム塩は、Ｃａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2、およびＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏよりなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよく、有用なリン酸塩は、Ｈ3ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、Ｈ4Ｐ2Ｏ7、ＮａＨ2ＰＯ4、およびＫＨ2ＰＯ4よりなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよいが、これらの有用な塩は前記で挙げられた化合物に限られない。前記カルシウム塩化合物の前記リン酸塩化合物に対するモル比を表すＣａ／Ｐモル比は、ヒアルロン酸の精製効率の点から、０．５〜３．０であることが好ましい。
【００２１】
また、前記工程（１）において用いられるリン酸カルシウム塩は、下記の表２で示される化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよい。
【００２２】
【表２】
【００２３】
前記工程（１）では、ヒアルロン酸粗抽出物を水溶液の形態で処理し、また、リン酸塩およびカルシウム塩、またはリン酸カルシウム塩を、水溶液の形態でヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合することが好ましい。
【００２４】
ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、上述の塩の水溶液と処理する場合、ｐＨは５〜１４、好ましくは８〜１０の条件で行われる。処理の際、ｐＨが５未満であれば不純物の沈殿が効果的に行われず、結果的に、ヒアルロン酸の精製が不十分になる。ヒアルロン酸粗抽出物水溶液は、混合と同時にまたは混合後に、ｐＨ５〜１４の条件で処理される。「混合と同時に」とは、カルシウム塩水溶液およびリン酸塩水溶液、またはリン酸カルシウム塩水溶液のｐＨを５〜１４に予め調整した後、ｐＨ調整されたこれらの水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを混合することによって、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液が、これらの水溶液と混合されると同時にｐＨ５〜１４の条件下に置かれることを意味する。「混合後に」とは、カルシウム塩水溶液およびリン酸塩水溶液、またはリン酸カルシウム塩水溶液と、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを混合した後、その混合水溶液のｐＨを５〜１４に調整することによって、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液がこれらの水溶液と混合された後に、ｐＨ５〜１４の条件下に置かれることを意味する。
【００２５】
上記において、ｐＨを５〜１４の範囲に調整するのに、塩基性化合物を用いてもよい。塩基性化合物としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つを使用することが好ましいが、塩基性化合物は前記例示した化合物に制限されるものではない。
【００２６】
ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、上述の塩の水溶液と処理する場合、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物を含む酸性水溶液を用いてもよい。酸性水溶液としては、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨよりなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性化合物を用いて調製された酸性水溶液を使用することが好ましいが、有用な無機酸や有機酸は前記例示した物質に制限されるものではない。
【００２７】
工程（１）において、リン酸塩、カルシウム塩、およびリン酸カルシウム塩の各水溶液の濃度、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と塩の水溶液との混合比および混合順序、ｐＨ調整のための塩基性化合物の濃度、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物を含む酸性水溶液の濃度等は、それぞれのケースの具体的な処理プロセスに応じて、変化してもよい。従って、以下に、好ましい具体例を通じて、前記工程（１）の処理方法をさらに詳しく説明する。
【００２８】
前記工程（１）の処理方法の好ましい具体例によれば、ヒアルロン酸粗抽出物を処理する方法は、カルシウム塩およびリン酸塩をそれぞれ使用する方法と、リン酸カルシウム塩を使用する方法の２種類に大きく分けられる。
【００２９】
カルシウム塩およびリン酸塩をそれぞれ使用する方法では、まず、Ｃａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2、ＣａＳＯ4・２Ｈ２Ｏ等を使用して、カルシウムイオンを含有しリン酸イオンを含有しない水溶液（第１水溶液）を調製し、Ｈ3ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、Ｈ4Ｐ2Ｏ7、ＮａＨ2ＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4等を使用して、リン酸イオンを含有しカルシウムイオンを含有しない水溶液（第２水溶液）をそれぞれ調製する。第１水溶液のカルシウムイオン濃度および第２水溶液のリン酸イオン濃度は、０．００１Ｍ〜１０Ｍが適当であり、０．０１Ｍ〜２Ｍが好ましい。第１水溶液および第２水溶液は、カルシウム塩のリン酸塩に対するＣａ／Ｐモル比が、好ましくは０．５〜３．０、より好ましくは１．０〜２．０となるように使用される。
【００３０】
上記のように調製された第１水溶液および第２水溶液を用いてヒアルロン酸粗抽出物を処理する方法は、以下に示す方法のように、その処理順序は様々あってよい。
【００３１】
第１の方法では、０．０５％〜１％の濃度のヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、前記第１水溶液に、第１水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる混合溶液が得られる量を添加し、約１０分〜３時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌して十分に混合する。続いて、第１水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液に、前記第２水溶液を、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０になる混合比を有する混合溶液が得られる量で加える。このようにして調製された第１水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液に、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性化合物の水溶液を、ｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０となる量で添加し、約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３２】
第２の方法では、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、前記第２水溶液に、第２水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる混合溶液が得られる量を添加し、約１０分〜３時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌して十分に混合する。続いて、第２水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液に、前記第１水溶液を、濃度に応じて多少差があるが、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０になる混合比を有する混合溶液が得られる量で加える。このようにして調製された第１水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液に、前記塩基性化合物の水溶液を、ｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となる量で添加し、約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３３】
第３の方法では、前記第１水溶液と前記第２水溶液のそれぞれに、前記塩基性化合物水溶液を添加し、ｐＨがいずれも５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となるように調整する。ｐＨが調整された前記第１水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを、第１水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で混合し、続いて、そこに前記第２水溶液を、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量で加える。または、ｐＨが調整された第２水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを、第２水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で混合し、続いて、そこに前記第１水溶液を、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量で加える。このようにして調製された第１水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液を、約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３４】
別の代替方法としては、第１水溶液と第２水溶液に、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液をそれぞれ添加した後、前記塩基性化合物水溶液によりｐＨをともに５〜１４、好ましくは８〜１０となるように調整し、第１水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液の前記混合水溶液と、第２水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液の前記混合水溶液とを混合してもよい。
【００３５】
第４の方法では、Ｃａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となるように前記第１水溶液と前記第２水溶液とを混合した水溶液に、前記塩基性化合物水溶液を添加しｐＨを５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となるように調整し、１０分〜２４時間撹拌する。このようにして得られた第１水溶液と第２水溶液との混合水溶液に、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、第１水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で混合し、これを約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３６】
カルシウム塩およびリン酸塩をそれぞれ使用する方法では、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物の酸性水溶液として、下記のものが使用されてもよい。
【００３７】
無機酸、有機酸、またはそれらの混合物の酸性水溶液を使用する方法のうち第１の方法では、酸性水溶液は、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨよりなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、濃度が０．００１Ｍ〜１０Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜２Ｍとなるように調製され、カルシウムイオンはそこに添加される。酸性水溶液中のカルシウムイオン濃度は、０．００１Ｍ〜１０Ｍが適切であり、０．０１Ｍ〜２Ｍが好ましい。カルシウムイオンの添加は、上記のように調製された第１水溶液を添加するか、または第１水溶液を調製するためのカルシウム塩を直接酸性水溶液に溶解させることによって行われてもよい。
【００３８】
このようにして調製されたカルシウムイオン含有酸性水溶液を、カルシウムイオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合し、約１０分〜５時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌する。このようにして調製されたカルシウムイオン含有酸性水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第２水溶液を、Ｃａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量でさらに混合し、十分に撹拌する。または、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を第２水溶液と混合した後、これを前記カルシウムイオン含有酸性水溶液と混合することも可能である。
【００３９】
上記のように調製されたカルシウムイオン含有酸性水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液のｐＨを、前記塩基性化合物水溶液によりｐＨ５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲に調整し、３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００４０】
または、カルシウムイオン含有酸性水溶液を第２水溶液と混合する前に、前記塩基性化合物水溶液を用いて、各溶液のｐＨを５〜１４の範囲に予め調整してもよい。さらに別の代案として、カルシウムイオン含有酸性水溶液と第２水溶液とを混合し、塩基性化合物水溶液によりｐＨを５〜１４の範囲に調整した後、そのｐＨ調整された混合水溶液にヒアルロン酸粗抽出物水溶液を加えることも可能である。
【００４１】
無機酸、有機酸、またはそれらの混合物の酸性水溶液を使用する方法のうち第２の方法では、リン酸イオンを、上記のように調製された酸性水溶液に添加する。酸性水溶液中のリン酸イオン濃度は、０．００１Ｍ〜１０Ｍが適切であり、０．０１Ｍ〜２Ｍが好ましい。リン酸イオンの添加は、上記のように調製された第２水溶液を添加するか、または第２水溶液を調製するためのリン酸塩を直接酸性水溶液に溶解させることによって行われてもよい。
【００４２】
このようにして調製されたリン酸イオン含有酸性水溶液を、リン酸イオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合し、約１０分〜５時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌する。このようにして調製されたリン酸イオン含有酸性水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第１水溶液を、Ｃａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量でさらに混合し、十分に撹拌する。または、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を第１水溶液と混合した後、これを前記リン酸イオン含有酸性水溶液と混合することも可能である。
【００４３】
上記のように調製されたリン酸イオン含有酸性水溶液、第１水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液のｐＨを、前記塩基性化合物水溶液によりｐＨ５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲に調整し、３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００４４】
または、リン酸イオン含有酸性水溶液を第１水溶液と混合する前に、前記塩基性化合物水溶液を用いて、各溶液のｐＨを５〜１４の範囲に予め調整してもよい。さらに別の代案として、リン酸イオン含有酸性水溶液と第１水溶液とを混合し、塩基性化合物水溶液によりｐＨを５〜１４の範囲に調整した後、そのｐＨ調整された混合水溶液にヒアルロン酸粗抽出物水溶液を加えることも可能である。
【００４５】
次に、リン酸カルシウム塩を用いて処理する具体的な方法を下記に示す。
【００４６】
リン酸カルシウム塩を用いる第１の方法では、表２に示されるリン酸カルシウム化合物の１つ以上を前記酸性水溶液に溶解する。酸性水溶液の濃度は０．０１Ｍ〜１０Ｍが適切であり、０．１Ｍ〜２Ｍが好ましい。
【００４７】
このようにして調製されたカルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液を、カルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．１〜２０、好ましくは０．５〜２となるように、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合し、得られた溶液を１０分〜３時間、好ましくは３０分〜１時間、十分に撹拌する。十分に撹拌した後、撹拌を続けながら前記塩基性化合物水溶液をｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲になるように添加し、得られた溶液をさらに３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌して沈殿物を形成させる。
【００４８】
リン酸カルシウム塩を用いる第２の方法では、カルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液に前記塩基性化合物水溶液を、ｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となるように添加した後、得られた溶液を前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と、カルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．１〜２０、好ましくは０．５〜２となるように混合し、３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００４９】
本発明のヒアルロン酸の精製方法の前記工程（２）では、前記工程（１）で得られた沈殿物を含有する水溶液をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させて、精製されたヒアルロン酸を得る。ろ過方法は特に限定されず、ろ過は澄明な溶液が得られるまで繰り返される。遠心分離機を用いて遠心分離を行った後、澄明な溶液が得られるまでろ過を繰り返すことも可能である。澄明な溶液中に潜在的に存在するイオンを除去するためには、限外ろ過（ＵＦ）または透析を行うことが好ましい。
【００５０】
工程（１）で得られた沈殿物含有水溶液は塩基性水溶液であるため、続く工程（２）では、ヒアルロン酸を効果的に沈殿させるために、水溶液を酸性〜弱塩基性にすることが好ましい。従って、ろ過を繰り返して得られた澄明な溶液に、例えば前記の酸性水溶液を加えて、ｐＨが酸性〜弱塩基性となるように調整する。
【００５１】
ろ液からヒアルロン酸を沈殿させるために、水と比べてヒアルロン酸の溶解度が顕著に低い溶媒を用いてもよく、例えばエタノールが好適である。また、沈殿時に、共通イオン効果によってヒアルロン酸が効果的に沈殿するように、水溶性中性塩を添加してもよい。
【００５２】
以下では、好ましい具体例を通じて前記工程（２）をさらに詳しく説明する。
【００５３】
前記工程（２）の好ましい具体例としては、前記工程（１）で得られた沈殿物含有水溶液を遠心分離した後に、ろ過して、澄明な溶液を得る。前記澄明な溶液に前記酸性水溶液を加え、ｐＨを２〜１０の範囲、好ましくは４．０〜７．０の範囲に調整し、得られた溶液を限外ろ過（ＵＦ）または透析する。限外ろ過または透析により得られた溶液に、ＮａＣｌを、０．３Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．５Ｍ〜１Ｍの濃度になるように定量して溶解する。得られた溶液に、９５％エタノールを体積比で１〜２倍程度添加することにより、ヒアルロン酸を沈殿させる。沈殿したヒアルロン酸をろ過した後、ろ過されたヒアルロン酸を９５％エタノールで洗浄し、さらに、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物と混合してｐＨを１〜５の範囲に調整された７０％〜９０％エタノールと３０分〜５時間、好ましくは３０分〜１時間ゆっくり撹拌することによって洗浄する。撹拌が完了した後、沈殿物をろ過および収集した後、凍結乾燥または減圧乾燥を行うことによって、精製されたヒアルロン酸が得られる。
【００５４】
本発明のヒアルロン酸の精製方法は、さらなる高純度のヒアルロン酸を得るために、前記工程（２）で得られたヒアルロン酸を、前記工程（１）のカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理し、処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることを含む追加の精製工程を、前記工程（２）の後に１回以上さらに有していてもよい。即ち、工程（２）で得られたヒアルロン酸に対しさらに追加の精製工程を１回以上繰り返し、追加の精製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥または減圧乾燥することにより、より高純度に精製されたヒアルロン酸を得ることができる。
【００５５】
本発明のヒアルロン酸の精製方法は、雄鶏とさか以外の天然物および微生物由来のヒアルロン酸の精製にも適用可能であり、また、タンパク質、核酸、または脂質の精製にも適用可能である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。また、以下の実施例のように雄鶏とさかからヒアルロン酸を抽出する場合には、ヒアルロン酸の収率は、使われる雄鶏とさかの大きさに応じて大きく異なる。
【００５７】
［実施例１］
前処理工程：ヒアルロン酸含有天然物である雄鶏とさかを、タンパク質分解酵素で処理して、ヒアルロン酸粗抽出物を得る工程
下記式により算出された平均面積が約５ｃｍ2の雄鶏とさか１ｋｇを、５０℃で解凍し、粉砕した。
平均面積＝（横平均×縦平均）÷２
粉砕した雄鶏とさかを７０％エタノールで洗浄した後、再粉砕した。再粉砕した雄鶏とさかを９５％エタノールで数回洗浄した。洗浄後、５０℃に保持した蒸留水３０００ｍＬに粉砕した雄鶏とさかを加え、タンパク質分解酵素を添加した後、２４時間反応させた。処理後、分離した脂質含有上層を捨て、下層を採取してろ過した。ろ過した下層を３７℃に加熱し、続いてタンパク質分解酵素を加え、二次処理として１２時間反応させた。二次処理後、澄明な溶液が得られるまでろ過し、その結果、ヒアルロン酸抽出液が得られた。この抽出液に、ＮａＣｌを、０．５Ｍ濃度になるように定量して加え、９５％エタノール中でヒアルロン酸を沈殿させた。沈殿したヒアルロン酸をろ過して分離し、凍結乾燥または減圧乾燥を実施して、白色粉末のヒアルロン酸粗抽出物を得た。
【００５８】
（１）ヒアルロン酸粗抽出物粉末をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理する工程
前記前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末１ｇを、蒸留水１０００ｍＬに溶解して、０．１％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を調製した。Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液を０．１６７Ｍの濃度となるように調製し、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液を０．１Ｍの濃度となるように調製し、０．１％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、０．１６７ＭのＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液５００ｍＬを添加して、混合した。十分に混合された水溶液に、０．１Ｍの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液を、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液の添加量と同量の５００ｍＬ添加して、混合した。０．１％ヒアルロン酸粗抽出物、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4の混合水溶液を撹拌しながら、ＮａＯＨを添加してｐＨが１０になるように調整した。ｐＨ調整した後、混合水溶液を３時間撹拌した。
【００５９】
（２）前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ヒアルロン酸を沈殿させて、精製する工程
前記工程（１）で得られた混合水溶液を、澄明な溶液になるまで遠心分離した後、ろ過した。得られた澄明な溶液に、ＨＣｌを加えてｐＨが５になるように調整し、限外ろ過または透析を行って再度澄明な溶液を得た。ここにＮａＣｌを０．５Ｍ濃度になるように溶解した後、９５％エタノール中でヒアルロン酸を沈殿させた。沈殿したヒアルロン酸をろ過により分離し、ｐＨが４に調整された７０％エタノールに加え、３０分間ゆっくり撹拌した後、処理結果物をろ過し、凍結乾燥または減圧乾燥して、一次精製したヒアルロン酸を得た。
【００６０】
一次精製したヒアルロン酸を蒸留水に再溶解し、前記(１)および(２)の工程をもう１回繰り返し、二次精製したヒアルロン酸を得た。
【００６１】
［実施例２］
工程（１）において、０．１％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、０．１Ｍの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液を２５０ｍＬ添加して十分に混合した後、そこに０．１６７ＭのＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液を、０．１Ｍの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液の添加量と同量加えたことを除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
【００６２】
［実施例３］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．８５ＭのＣａ（ＯＨ）2水溶液と０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液をそれぞれ調製した。調製したＣａ（ＯＨ）2およびＨ3ＰＯ4水溶液に、ＮＨ4ＯＨ水溶液をそれぞれ加え、ｐＨが１１となるように調整した。０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、ｐＨ調整されたＣａ（ＯＨ）2水溶液を３００ｍＬ添加して混合した後、０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液を、Ｃａ（ＯＨ）2水溶液の添加量と同量の３００ｍＬをさらに加え、混合した。０．２％ヒアルロン酸粗抽出物、Ｃａ（ＯＨ）2、およびＨ3ＰＯ4の混合水溶液を、１時間撹拌した。
【００６３】
［実施例４］
工程（１）において、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、ｐＨ調整された０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液を５００ｍＬ添加して混合した後、そこに０．８７５ＭのＣａ（ＯＨ）２水溶液を、０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液の添加量と同量添加したことを除いては、実施例３と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
【００６４】
［実施例５］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．３ＭのＨＣｌ水溶液に、ＣａＣＯ3を１７ｍＭの濃度となるように溶解し、カルシウムイオン含有ＨＣｌ水溶液を調製した。１０ｍＭのＨ3ＰＯ4水溶液と１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液をそれぞれ調製した。０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、調製したカルシウムイオン含有ＨＣｌ水溶液を１０００ｍＬ添加して混合した後、得られた溶液に、１０ｍＭのＨ3ＰＯ4水溶液と１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液をそれぞれ１０００ｍＬ添加して、混合した。十分に混合した後、ＮＨ4ＯＨを添加して、ｐＨが１０となるように調整した。ｐＨを調整した後、得られた溶液を３時間撹拌した。
【００６５】
［実施例６］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．２ＭのＨＣｌ水溶液を調製し、そこにリン酸カルシウム化合物としてオクタカルシウムホスフェート２ｇを加え、溶解した。このようにして調製されたリン酸カルシウム−ＨＣｌ水溶液１０００ｍＬに、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを加えて、十分に混合するように撹拌しながら、そこにＮａＯＨをさらに添加してｐＨが９になるように調整した。ｐＨを調整した後、得られた溶液を３時間撹拌した。
【００６６】
［実施例７］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．３％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．２ＭのＨＣｌおよび１ＭのＣＨ3ＣＯＯＨ水溶液をそれぞれ調製し、０．２Ｍ ＨＣｌ:１Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＨの体積混合比が１：４となる量でＨＣｌ水溶液とＣＨ3ＣＯＯＨ水溶液とを混合し、有機酸−無機酸混合酸性水溶液を調製した。得られた混合酸性水溶液に、リン酸カルシウム化合物としてジカルシウムホスフェート無水物（ＤＣＰＡ）４ｇを加えて溶解した。０．３％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、調製したリン酸カルシウム含有酸性水溶液１０００ｍＬを加えて、十分に混合されるように撹拌しながら、そこにＮＨ4ＯＨを加えてｐＨが１０になるように調整した。ｐＨを調整した後、得られた溶液を１時間撹拌した。
【００６７】
［実施例８］
ヒアルロン酸粗抽出物水溶液として微生物から得られたヒアルロン酸含有培養液を用いたことを除いては、実施例１の工程（１）および工程（２）と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
【００６８】
下記の表３および表４は、本発明の実施例１〜８によって精製されたヒアルロン酸の、韓国食品医薬品局（ＫＦＤＡ）告示ヒアルロン酸（眼科用）試験方法、およびその分析結果をそれぞれ示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明に係るヒアルロン酸精製方法は、ヒアルロン酸含有抽出液または培養液からヒアルロン酸を高純度かつ速かに精製することができ、タンパク質、核酸、脂質等を非常に効率的に除去することができる。さらに本発明は、従来の有機溶媒を用いた精製方法の問題を克服し、工程を単純化して大量生産に適した工程の設計を可能とし、また高収率を保証する。本発明に係る精製方法によって精製されたヒアルロン酸は、９０％以上の高純度を示し、医療用に適している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩を用いたヒアルロン酸の精製方法に関し、詳しくは、ヒアルロン酸を含む抽出物または培養液をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理することによって、前記抽出物または前記培養液から脂質、核酸、およびタンパク質を効果的に除去してヒアルロン酸を精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、生体内に存在するグリコサミノグリカンの一種である酸性ムコ多糖類であり、１，０００Ｄａ〜１０ｋＤａの分子量を持つＤ−グルコン酸とＮ−アセチルグルコースアミンの繰り返し分子構造を有し、非常に高い粘性と弾性を有する。
【０００３】
ヒアルロン酸は、身体のあらゆる部位に存在し、身体の各部位で様々な特性を示す。保水能力に優れ、良好な粘性と弾性を有し、体の動きを円滑にする潤滑作用、生理活性物質の移動を管理し、細胞との特異な相互作用によって細胞の分化および成長を誘導する媒体、細胞外基質ではコラーゲン、エラスチン、硫酸コンドロイチン等の組織を支えるタンパク質と糖タンパク質などの支持体としての機能を有する生体高分子である。上記で示したような特性により、ヒアルロン酸は、加齢による退行性関節炎の治療および痛み緩和治療剤として用いられ、また、眼科手術補助材および眼球乾燥症薬物の主成分として用いられ、さらにまた、シワおよび陥没した皮膚組織の補完などの成形補足材料として用いられている。
【０００４】
現在、医療分野で、特に眼科用として用いられるヒアルロン酸は、一般に、乾燥重量ベースで製品中９０％以上が定量的に含まれており、その平均分子量は１．９×１０6ｇ／モル〜３．９×１０6ｇ／モルであり、平均重合度（ｎ）は４，７００〜９，６００である。現在、関節炎注射剤の用途として、種々の分子量分布を有する製品が市販されている。医療用ヒアルロン酸は、注射剤用薬品に用いられるので、タンパク質や他の酸性ムコ多糖類（例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸等）の混入が許されない程度の精製度が求められるなど、安全性の規制が非常に厳しい。
【０００５】
下記表１に、韓国食品医薬品局告示による医療用（眼科用）ヒアルロン酸の基準を示す。
【０００６】
【表１】
【０００７】
医療用ヒアルロン酸は、動物組織から抽出するか、微生物の発酵培養液から回収する方法によって得ることができ、動物組織から抽出したヒアルロン酸は、微生物培養液から回収したヒアルロン酸よりも優れた効果を有していることが知られている（Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 13, 183-192, (1999)）。さらに、動物組織、特に雄鶏とさかから、ヒアルロン酸を分離および精製する方法が多数知られている。
【０００８】
特許文献１（米国特許第４，１４１，９７３号）には、クロロホルムを用いて数回抽出を行うことにより、雄鶏とさかからヒアルロン酸を分離および精製する方法が開示されている。
【０００９】
特許文献２（ヨーロッパ特許第０１２３８５７２号）には、限外ろ過膜を用いて、雄鶏とさかから分子量の大きさによって低分子のヒアルロン酸を分離および精製する方法が開示されている。
【００１０】
特許文献３（国際特許ＷＯ９２００８６１号）には、雄鶏とさかからの抽出物をタンパク質分解酵素で処理し、処理結果物を第４級アンモニウム塩に転換し、有機溶媒を用いてアンモニウム塩を除去し、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ）を用いて分画を得た後、塩化セチルピリジウムで処理してヒアルロン酸分画を沈殿させ、水溶性有機溶媒をヒアルロン酸分画に添加してヒアルロン酸を沈殿させることにより、ヒアルロン酸を得る方法が開示されている。
【００１１】
さらに、特許文献４（大韓民国公開特許第１９８７−０００８９０４号）には、雄鶏とさかからの抽出物をタンパク質分解酵素で処理し、ブタノール等の有機溶媒を用いて脂質およびタンパク質を除去し、塩化セチルピリジウムにより殺菌と沈殿を同時に行って分画を得て、そこに水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸を沈殿させることを含むヒアルロン酸の製造方法が開示されている。
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号
【特許文献２】ヨーロッパ特許第０１２３８５７２号
【特許文献３】国際特許ＷＯ９２００８６１号
【特許文献４】大韓民国公開特許第１９８７−０００８９０４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、上記に記載の従来の方法は、工程が複雑で大量生産規模にそれを適用する問題、収率が低いことの問題、有機溶媒を使用することによる水処理にかかるコストや精製コストが莫大となる問題、長時間の多工程のプロセスでヒアルロン酸の自己分解が発生し得る問題がある。また、これらの方法は、医療用の製品の生産には許されない毒性有機溶媒を使用しているという、もう一つの重要な問題を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するためのものである。従って、本発明の目的は、有毒な有機物質の使用を排除し、従来のヒアルロン酸精製プロセスに対して精製工程数を減らすことによって、より効果的にヒアルロン酸を精製する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明は、（１）ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理して得られるか、または微生物由来のヒアルロン酸を含有する培養液から得られるヒアルロン酸粗抽出物を、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩と処理する工程、（２）前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることによってヒアルロン酸を精製する工程を有するヒアルロン酸の精製方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るヒアルロン酸精製方法は、ヒアルロン酸含有抽出液または培養液からヒアルロン酸を高純度かつ速かに精製することができ、タンパク質、核酸、脂質等を非常に効率的に除去することができる。さらに本発明は、従来の有機溶媒を用いた精製方法の問題を克服し、工程を単純化して大量生産に適した工程の設計を可能とし、また高収率を保証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法において、前記工程（１）で得られるヒアルロン酸粗抽出物は、ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理して得られるか、またはヒアルロン酸を生産できる微生物から生産されたヒアルロン酸を含有する培養液から得られる。前記ヒアルロン酸含有天然物とは、本発明に従って精製ヒアルロン酸を提供できるものであれば特に限定されず、雄鶏とさかが主に用いられる。処理条件に関しては、タンパク質分解酵素での処理が可能な条件であれば特に制限されず、公知のタンパク質分解酵素処理方法を使用すればよい。ヒアルロン酸を生産できる微生物としては、公知のヒアルロン酸生産用微生物が使用可能であり、公知方法を用いて得られたヒアルロン酸含有微生物培養液であれば、本発明の精製方法に特に制限なく使用できる。
【００１７】
以下、本発明の好ましい一具体例により、ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理してヒアルロン酸粗抽出物を得る工程について、さらに詳しく説明する。
【００１８】
本発明の好ましい一具体例によれば、ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理してヒアルロン酸粗抽出物を得るためには、まず、ヒアルロン酸含有天然物として雄鶏とさかを細かく粉砕し、エタノールで洗浄する。次に、粉砕および洗浄された雄鶏とさかに適量の蒸留水を加え、タンパク質分解酵素の存在下で撹拌した後、３０℃〜６０℃の温度で３時間〜７２時間放置する。放置の結果、層分離が起こるので、脂質が含まれる上層は捨て、下層の抽出液だけを採取してろ過する。ろ過により得られた抽出液は３０℃〜６０℃の温度に加熱し、その後タンパク質分解酵素を添加して３時間〜２４時間、再び処理する。二次処理後、生成抽出液をろ過してヒアルロン酸抽出液を得る。このヒアルロン酸抽出液は、さらに処理することなく、工程（１）でヒアルロン酸粗抽出物として用いてもよい。しかし、塩化ナトリウムの濃度が０．３Ｍ〜１Ｍになるように定量した塩化ナトリウムを得られたヒアルロン酸抽出液に添加し、９５％エタノール中でヒアルロン酸を沈殿させた後、この溶液をろ過して得られたヒアルロン酸沈殿物を凍結乾燥または真空乾燥することによって得られるヒアルロン酸粉末を、ヒアルロン酸粗抽出物として用いることが好ましい。このようにして得られるヒアルロン酸粉末は、蒸留水に溶解して適正濃度のヒアルロン酸水溶液に調製され、使用される。
【００１９】
本発明のヒアルロン酸の精製方法によると、工程（１）では、ヒアルロン酸粗抽出物をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理することによって、粗抽出物から脂質、核酸、およびタンパク質が除去される。特に、工程（１）では、４℃〜９０℃の温度範囲で、ヒアルロン酸粗抽出物をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理することが好ましい。
【００２０】
前記工程（１）において、有用なカルシウム塩は、Ｃａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2、およびＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏよりなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよく、有用なリン酸塩は、Ｈ3ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、Ｈ4Ｐ2Ｏ7、ＮａＨ2ＰＯ4、およびＫＨ2ＰＯ4よりなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよいが、これらの有用な塩は前記で挙げられた化合物に限られない。前記カルシウム塩化合物の前記リン酸塩化合物に対するモル比を表すＣａ／Ｐモル比は、ヒアルロン酸の精製効率の点から、０．５〜３．０であることが好ましい。
【００２１】
また、前記工程（１）において用いられるリン酸カルシウム塩は、下記の表２で示される化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよい。
【００２２】
【表２】
【００２３】
前記工程（１）では、ヒアルロン酸粗抽出物を水溶液の形態で処理し、また、リン酸塩およびカルシウム塩、またはリン酸カルシウム塩を、水溶液の形態でヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合することが好ましい。
【００２４】
ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、上述の塩の水溶液と処理する場合、ｐＨは５〜１４、好ましくは８〜１０の条件で行われる。処理の際、ｐＨが５未満であれば不純物の沈殿が効果的に行われず、結果的に、ヒアルロン酸の精製が不十分になる。ヒアルロン酸粗抽出物水溶液は、混合と同時にまたは混合後に、ｐＨ５〜１４の条件で処理される。「混合と同時に」とは、カルシウム塩水溶液およびリン酸塩水溶液、またはリン酸カルシウム塩水溶液のｐＨを５〜１４に予め調整した後、ｐＨ調整されたこれらの水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを混合することによって、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液が、これらの水溶液と混合されると同時にｐＨ５〜１４の条件下に置かれることを意味する。「混合後に」とは、カルシウム塩水溶液およびリン酸塩水溶液、またはリン酸カルシウム塩水溶液と、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを混合した後、その混合水溶液のｐＨを５〜１４に調整することによって、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液がこれらの水溶液と混合された後に、ｐＨ５〜１４の条件下に置かれることを意味する。
【００２５】
上記において、ｐＨを５〜１４の範囲に調整するのに、塩基性化合物を用いてもよい。塩基性化合物としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つを使用することが好ましいが、塩基性化合物は前記例示した化合物に制限されるものではない。
【００２６】
ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、上述の塩の水溶液と処理する場合、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物を含む酸性水溶液を用いてもよい。酸性水溶液としては、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨよりなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性化合物を用いて調製された酸性水溶液を使用することが好ましいが、有用な無機酸や有機酸は前記例示した物質に制限されるものではない。
【００２７】
工程（１）において、リン酸塩、カルシウム塩、およびリン酸カルシウム塩の各水溶液の濃度、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と塩の水溶液との混合比および混合順序、ｐＨ調整のための塩基性化合物の濃度、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物を含む酸性水溶液の濃度等は、それぞれのケースの具体的な処理プロセスに応じて、変化してもよい。従って、以下に、好ましい具体例を通じて、前記工程（１）の処理方法をさらに詳しく説明する。
【００２８】
前記工程（１）の処理方法の好ましい具体例によれば、ヒアルロン酸粗抽出物を処理する方法は、カルシウム塩およびリン酸塩をそれぞれ使用する方法と、リン酸カルシウム塩を使用する方法の２種類に大きく分けられる。
【００２９】
カルシウム塩およびリン酸塩をそれぞれ使用する方法では、まず、Ｃａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2、ＣａＳＯ4・２Ｈ２Ｏ等を使用して、カルシウムイオンを含有しリン酸イオンを含有しない水溶液（第１水溶液）を調製し、Ｈ3ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、Ｈ4Ｐ2Ｏ7、ＮａＨ2ＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4等を使用して、リン酸イオンを含有しカルシウムイオンを含有しない水溶液（第２水溶液）をそれぞれ調製する。第１水溶液のカルシウムイオン濃度および第２水溶液のリン酸イオン濃度は、０．００１Ｍ〜１０Ｍが適当であり、０．０１Ｍ〜２Ｍが好ましい。第１水溶液および第２水溶液は、カルシウム塩のリン酸塩に対するＣａ／Ｐモル比が、好ましくは０．５〜３．０、より好ましくは１．０〜２．０となるように使用される。
【００３０】
上記のように調製された第１水溶液および第２水溶液を用いてヒアルロン酸粗抽出物を処理する方法は、以下に示す方法のように、その処理順序は様々あってよい。
【００３１】
第１の方法では、０．０５％〜１％の濃度のヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、前記第１水溶液に、第１水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる混合溶液が得られる量を添加し、約１０分〜３時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌して十分に混合する。続いて、第１水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液に、前記第２水溶液を、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０になる混合比を有する混合溶液が得られる量で加える。このようにして調製された第１水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液に、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性化合物の水溶液を、ｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０となる量で添加し、約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３２】
第２の方法では、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、前記第２水溶液に、第２水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる混合溶液が得られる量を添加し、約１０分〜３時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌して十分に混合する。続いて、第２水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液に、前記第１水溶液を、濃度に応じて多少差があるが、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０になる混合比を有する混合溶液が得られる量で加える。このようにして調製された第１水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液に、前記塩基性化合物の水溶液を、ｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となる量で添加し、約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３３】
第３の方法では、前記第１水溶液と前記第２水溶液のそれぞれに、前記塩基性化合物水溶液を添加し、ｐＨがいずれも５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となるように調整する。ｐＨが調整された前記第１水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを、第１水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で混合し、続いて、そこに前記第２水溶液を、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量で加える。または、ｐＨが調整された第２水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液とを、第２水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で混合し、続いて、そこに前記第１水溶液を、第１水溶液と第２水溶液のＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量で加える。このようにして調製された第１水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液を、約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３４】
別の代替方法としては、第１水溶液と第２水溶液に、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液をそれぞれ添加した後、前記塩基性化合物水溶液によりｐＨをともに５〜１４、好ましくは８〜１０となるように調整し、第１水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液の前記混合水溶液と、第２水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液の前記混合水溶液とを混合してもよい。
【００３５】
第４の方法では、Ｃａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となるように前記第１水溶液と前記第２水溶液とを混合した水溶液に、前記塩基性化合物水溶液を添加しｐＨを５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となるように調整し、１０分〜２４時間撹拌する。このようにして得られた第１水溶液と第２水溶液との混合水溶液に、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、第１水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で混合し、これを約３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００３６】
カルシウム塩およびリン酸塩をそれぞれ使用する方法では、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物の酸性水溶液として、下記のものが使用されてもよい。
【００３７】
無機酸、有機酸、またはそれらの混合物の酸性水溶液を使用する方法のうち第１の方法では、酸性水溶液は、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨよりなる群から選ばれる少なくとも１つを用いて、濃度が０．００１Ｍ〜１０Ｍ、好ましくは０．０１Ｍ〜２Ｍとなるように調製され、カルシウムイオンはそこに添加される。酸性水溶液中のカルシウムイオン濃度は、０．００１Ｍ〜１０Ｍが適切であり、０．０１Ｍ〜２Ｍが好ましい。カルシウムイオンの添加は、上記のように調製された第１水溶液を添加するか、または第１水溶液を調製するためのカルシウム塩を直接酸性水溶液に溶解させることによって行われてもよい。
【００３８】
このようにして調製されたカルシウムイオン含有酸性水溶液を、カルシウムイオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合し、約１０分〜５時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌する。このようにして調製されたカルシウムイオン含有酸性水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第２水溶液を、Ｃａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量でさらに混合し、十分に撹拌する。または、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を第２水溶液と混合した後、これを前記カルシウムイオン含有酸性水溶液と混合することも可能である。
【００３９】
上記のように調製されたカルシウムイオン含有酸性水溶液、第２水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液のｐＨを、前記塩基性化合物水溶液によりｐＨ５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲に調整し、３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００４０】
または、カルシウムイオン含有酸性水溶液を第２水溶液と混合する前に、前記塩基性化合物水溶液を用いて、各溶液のｐＨを５〜１４の範囲に予め調整してもよい。さらに別の代案として、カルシウムイオン含有酸性水溶液と第２水溶液とを混合し、塩基性化合物水溶液によりｐＨを５〜１４の範囲に調整した後、そのｐＨ調整された混合水溶液にヒアルロン酸粗抽出物水溶液を加えることも可能である。
【００４１】
無機酸、有機酸、またはそれらの混合物の酸性水溶液を使用する方法のうち第２の方法では、リン酸イオンを、上記のように調製された酸性水溶液に添加する。酸性水溶液中のリン酸イオン濃度は、０．００１Ｍ〜１０Ｍが適切であり、０．０１Ｍ〜２Ｍが好ましい。リン酸イオンの添加は、上記のように調製された第２水溶液を添加するか、または第２水溶液を調製するためのリン酸塩を直接酸性水溶液に溶解させることによって行われてもよい。
【００４２】
このようにして調製されたリン酸イオン含有酸性水溶液を、リン酸イオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．００１〜１００、好ましくは０．１〜２となる量で、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合し、約１０分〜５時間、好ましくは３０分〜１時間撹拌する。このようにして調製されたリン酸イオン含有酸性水溶液とヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第１水溶液を、Ｃａ／Ｐモル比が０．５〜３．０となる量でさらに混合し、十分に撹拌する。または、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を第１水溶液と混合した後、これを前記リン酸イオン含有酸性水溶液と混合することも可能である。
【００４３】
上記のように調製されたリン酸イオン含有酸性水溶液、第１水溶液、およびヒアルロン酸粗抽出物水溶液の混合水溶液のｐＨを、前記塩基性化合物水溶液によりｐＨ５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲に調整し、３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００４４】
または、リン酸イオン含有酸性水溶液を第１水溶液と混合する前に、前記塩基性化合物水溶液を用いて、各溶液のｐＨを５〜１４の範囲に予め調整してもよい。さらに別の代案として、リン酸イオン含有酸性水溶液と第１水溶液とを混合し、塩基性化合物水溶液によりｐＨを５〜１４の範囲に調整した後、そのｐＨ調整された混合水溶液にヒアルロン酸粗抽出物水溶液を加えることも可能である。
【００４５】
次に、リン酸カルシウム塩を用いて処理する具体的な方法を下記に示す。
【００４６】
リン酸カルシウム塩を用いる第１の方法では、表２に示されるリン酸カルシウム化合物の１つ以上を前記酸性水溶液に溶解する。酸性水溶液の濃度は０．０１Ｍ〜１０Ｍが適切であり、０．１Ｍ〜２Ｍが好ましい。
【００４７】
このようにして調製されたカルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液を、カルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．１〜２０、好ましくは０．５〜２となるように、ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合し、得られた溶液を１０分〜３時間、好ましくは３０分〜１時間、十分に撹拌する。十分に撹拌した後、撹拌を続けながら前記塩基性化合物水溶液をｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲になるように添加し、得られた溶液をさらに３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌して沈殿物を形成させる。
【００４８】
リン酸カルシウム塩を用いる第２の方法では、カルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液に前記塩基性化合物水溶液を、ｐＨが５〜１４の範囲、好ましくは８〜１０の範囲となるように添加した後、得られた溶液を前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と、カルシウムイオン−リン酸イオン含有酸性水溶液／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液の体積混合比が０．１〜２０、好ましくは０．５〜２となるように混合し、３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜３時間撹拌する。
【００４９】
本発明のヒアルロン酸の精製方法の前記工程（２）では、前記工程（１）で得られた沈殿物を含有する水溶液をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させて、精製されたヒアルロン酸を得る。ろ過方法は特に限定されず、ろ過は澄明な溶液が得られるまで繰り返される。遠心分離機を用いて遠心分離を行った後、澄明な溶液が得られるまでろ過を繰り返すことも可能である。澄明な溶液中に潜在的に存在するイオンを除去するためには、限外ろ過（ＵＦ）または透析を行うことが好ましい。
【００５０】
工程（１）で得られた沈殿物含有水溶液は塩基性水溶液であるため、続く工程（２）では、ヒアルロン酸を効果的に沈殿させるために、水溶液を酸性〜弱塩基性にすることが好ましい。従って、ろ過を繰り返して得られた澄明な溶液に、例えば前記の酸性水溶液を加えて、ｐＨが酸性〜弱塩基性となるように調整する。
【００５１】
ろ液からヒアルロン酸を沈殿させるために、水と比べてヒアルロン酸の溶解度が顕著に低い溶媒を用いてもよく、例えばエタノールが好適である。また、沈殿時に、共通イオン効果によってヒアルロン酸が効果的に沈殿するように、水溶性中性塩を添加してもよい。
【００５２】
以下では、好ましい具体例を通じて前記工程（２）をさらに詳しく説明する。
【００５３】
前記工程（２）の好ましい具体例としては、前記工程（１）で得られた沈殿物含有水溶液を遠心分離した後に、ろ過して、澄明な溶液を得る。前記澄明な溶液に前記酸性水溶液を加え、ｐＨを２〜１０の範囲、好ましくは４．０〜７．０の範囲に調整し、得られた溶液を限外ろ過（ＵＦ）または透析する。限外ろ過または透析により得られた溶液に、ＮａＣｌを、０．３Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．５Ｍ〜１Ｍの濃度になるように定量して溶解する。得られた溶液に、９５％エタノールを体積比で１〜２倍程度添加することにより、ヒアルロン酸を沈殿させる。沈殿したヒアルロン酸をろ過した後、ろ過されたヒアルロン酸を９５％エタノールで洗浄し、さらに、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物と混合してｐＨを１〜５の範囲に調整された７０％〜９０％エタノールと３０分〜５時間、好ましくは３０分〜１時間ゆっくり撹拌することによって洗浄する。撹拌が完了した後、沈殿物をろ過および収集した後、凍結乾燥または減圧乾燥を行うことによって、精製されたヒアルロン酸が得られる。
【００５４】
本発明のヒアルロン酸の精製方法は、さらなる高純度のヒアルロン酸を得るために、前記工程（２）で得られたヒアルロン酸を、前記工程（１）のカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理し、処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることを含む追加の精製工程を、前記工程（２）の後に１回以上さらに有していてもよい。即ち、工程（２）で得られたヒアルロン酸に対しさらに追加の精製工程を１回以上繰り返し、追加の精製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥または減圧乾燥することにより、より高純度に精製されたヒアルロン酸を得ることができる。
【００５５】
本発明のヒアルロン酸の精製方法は、雄鶏とさか以外の天然物および微生物由来のヒアルロン酸の精製にも適用可能であり、また、タンパク質、核酸、または脂質の精製にも適用可能である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。また、以下の実施例のように雄鶏とさかからヒアルロン酸を抽出する場合には、ヒアルロン酸の収率は、使われる雄鶏とさかの大きさに応じて大きく異なる。
【００５７】
［実施例１］
前処理工程：ヒアルロン酸含有天然物である雄鶏とさかを、タンパク質分解酵素で処理して、ヒアルロン酸粗抽出物を得る工程
下記式により算出された平均面積が約５ｃｍ2の雄鶏とさか１ｋｇを、５０℃で解凍し、粉砕した。
平均面積＝（横平均×縦平均）÷２
粉砕した雄鶏とさかを７０％エタノールで洗浄した後、再粉砕した。再粉砕した雄鶏とさかを９５％エタノールで数回洗浄した。洗浄後、５０℃に保持した蒸留水３０００ｍＬに粉砕した雄鶏とさかを加え、タンパク質分解酵素を添加した後、２４時間反応させた。処理後、分離した脂質含有上層を捨て、下層を採取してろ過した。ろ過した下層を３７℃に加熱し、続いてタンパク質分解酵素を加え、二次処理として１２時間反応させた。二次処理後、澄明な溶液が得られるまでろ過し、その結果、ヒアルロン酸抽出液が得られた。この抽出液に、ＮａＣｌを、０．５Ｍ濃度になるように定量して加え、９５％エタノール中でヒアルロン酸を沈殿させた。沈殿したヒアルロン酸をろ過して分離し、凍結乾燥または減圧乾燥を実施して、白色粉末のヒアルロン酸粗抽出物を得た。
【００５８】
（１）ヒアルロン酸粗抽出物粉末をカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理する工程
前記前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末１ｇを、蒸留水１０００ｍＬに溶解して、０．１％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を調製した。Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液を０．１６７Ｍの濃度となるように調製し、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液を０．１Ｍの濃度となるように調製し、０．１％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、０．１６７ＭのＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液５００ｍＬを添加して、混合した。十分に混合された水溶液に、０．１Ｍの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液を、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液の添加量と同量の５００ｍＬ添加して、混合した。０．１％ヒアルロン酸粗抽出物、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4の混合水溶液を撹拌しながら、ＮａＯＨを添加してｐＨが１０になるように調整した。ｐＨ調整した後、混合水溶液を３時間撹拌した。
【００５９】
（２）前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ヒアルロン酸を沈殿させて、精製する工程
前記工程（１）で得られた混合水溶液を、澄明な溶液になるまで遠心分離した後、ろ過した。得られた澄明な溶液に、ＨＣｌを加えてｐＨが５になるように調整し、限外ろ過または透析を行って再度澄明な溶液を得た。ここにＮａＣｌを０．５Ｍ濃度になるように溶解した後、９５％エタノール中でヒアルロン酸を沈殿させた。沈殿したヒアルロン酸をろ過により分離し、ｐＨが４に調整された７０％エタノールに加え、３０分間ゆっくり撹拌した後、処理結果物をろ過し、凍結乾燥または減圧乾燥して、一次精製したヒアルロン酸を得た。
【００６０】
一次精製したヒアルロン酸を蒸留水に再溶解し、前記(１)および(２)の工程をもう１回繰り返し、二次精製したヒアルロン酸を得た。
【００６１】
［実施例２］
工程（１）において、０．１％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、０．１Ｍの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液を２５０ｍＬ添加して十分に混合した後、そこに０．１６７ＭのＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ水溶液を、０．１Ｍの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液の添加量と同量加えたことを除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
【００６２】
［実施例３］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．８５ＭのＣａ（ＯＨ）2水溶液と０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液をそれぞれ調製した。調製したＣａ（ＯＨ）2およびＨ3ＰＯ4水溶液に、ＮＨ4ＯＨ水溶液をそれぞれ加え、ｐＨが１１となるように調整した。０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、ｐＨ調整されたＣａ（ＯＨ）2水溶液を３００ｍＬ添加して混合した後、０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液を、Ｃａ（ＯＨ）2水溶液の添加量と同量の３００ｍＬをさらに加え、混合した。０．２％ヒアルロン酸粗抽出物、Ｃａ（ＯＨ）2、およびＨ3ＰＯ4の混合水溶液を、１時間撹拌した。
【００６３】
［実施例４］
工程（１）において、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、ｐＨ調整された０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液を５００ｍＬ添加して混合した後、そこに０．８７５ＭのＣａ（ＯＨ）２水溶液を、０．５ＭのＨ3ＰＯ4水溶液の添加量と同量添加したことを除いては、実施例３と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
【００６４】
［実施例５］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．３ＭのＨＣｌ水溶液に、ＣａＣＯ3を１７ｍＭの濃度となるように溶解し、カルシウムイオン含有ＨＣｌ水溶液を調製した。１０ｍＭのＨ3ＰＯ4水溶液と１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液をそれぞれ調製した。０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、調製したカルシウムイオン含有ＨＣｌ水溶液を１０００ｍＬ添加して混合した後、得られた溶液に、１０ｍＭのＨ3ＰＯ4水溶液と１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液をそれぞれ１０００ｍＬ添加して、混合した。十分に混合した後、ＮＨ4ＯＨを添加して、ｐＨが１０となるように調整した。ｐＨを調整した後、得られた溶液を３時間撹拌した。
【００６５】
［実施例６］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．２ＭのＨＣｌ水溶液を調製し、そこにリン酸カルシウム化合物としてオクタカルシウムホスフェート２ｇを加え、溶解した。このようにして調製されたリン酸カルシウム−ＨＣｌ水溶液１０００ｍＬに、０．２％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを加えて、十分に混合するように撹拌しながら、そこにＮａＯＨをさらに添加してｐＨが９になるように調整した。ｐＨを調整した後、得られた溶液を３時間撹拌した。
【００６６】
［実施例７］
下記の工程（１）を除いては、実施例１と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
工程（１）において、実施例１の前処理工程で得られたヒアルロン酸粗抽出物粉末を蒸留水に溶解して、０．３％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬを調製した。０．２ＭのＨＣｌおよび１ＭのＣＨ3ＣＯＯＨ水溶液をそれぞれ調製し、０．２Ｍ ＨＣｌ:１Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＨの体積混合比が１：４となる量でＨＣｌ水溶液とＣＨ3ＣＯＯＨ水溶液とを混合し、有機酸−無機酸混合酸性水溶液を調製した。得られた混合酸性水溶液に、リン酸カルシウム化合物としてジカルシウムホスフェート無水物（ＤＣＰＡ）４ｇを加えて溶解した。０．３％ヒアルロン酸粗抽出物水溶液１０００ｍＬに、調製したリン酸カルシウム含有酸性水溶液１０００ｍＬを加えて、十分に混合されるように撹拌しながら、そこにＮＨ4ＯＨを加えてｐＨが１０になるように調整した。ｐＨを調整した後、得られた溶液を１時間撹拌した。
【００６７】
［実施例８］
ヒアルロン酸粗抽出物水溶液として微生物から得られたヒアルロン酸含有培養液を用いたことを除いては、実施例１の工程（１）および工程（２）と同様にしてヒアルロン酸を精製した。
【００６８】
下記の表３および表４は、本発明の実施例１〜８によって精製されたヒアルロン酸の、韓国食品医薬品局（ＫＦＤＡ）告示ヒアルロン酸（眼科用）試験方法、およびその分析結果をそれぞれ示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明に係るヒアルロン酸精製方法は、ヒアルロン酸含有抽出液または培養液からヒアルロン酸を高純度かつ速かに精製することができ、タンパク質、核酸、脂質等を非常に効率的に除去することができる。さらに本発明は、従来の有機溶媒を用いた精製方法の問題を克服し、工程を単純化して大量生産に適した工程の設計を可能とし、また高収率を保証する。本発明に係る精製方法によって精製されたヒアルロン酸は、９０％以上の高純度を示し、医療用に適している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理して得られるか、または微生物由来のヒアルロン酸を含有する培養液から得られるヒアルロン酸粗抽出物を、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩と処理する工程、
（２）前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることによってヒアルロン酸を精製する工程
を有することを特徴とするヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸粗抽出物が、ヒアルロン酸含有天然物として雄鶏とさかを３０℃〜６０℃の温度で３時間〜７２時間タンパク質分解酵素で処理し、脂質層を分離、除去することによって得られるものである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項３】
前記カルシウム塩が、Ｃａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2、およびＣａＳＯ2・２Ｈ2Ｏよりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項４】
前記リン酸塩が、Ｈ3ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、Ｈ4Ｐ2Ｏ7、ＮａＨ2ＰＯ4、およびＫＨ2ＰＯ4よりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項５】
前記カルシウム塩と前記リン酸塩が、Ｃａ／Ｐモル比０．５〜３．０で使用される請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項６】
前記リン酸カルシウム塩が、テトラカルシウムホスフェート、ヒドロキシアパタイト、非化学量論的ヒドロキシアパタイト、非晶質カルシウムホスフェート、トリカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート二水和物、ジカルシウムホスフェート無水和物、カルシウムピロリン酸、カルシウムピロリン酸二水和物、ヘプタカルシウムホスフェート、テトラカルシウム二水素ホスフェート、モノカルシウムホスフェート一水和物、およびカルシウムメタホスフェートよりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項７】
前記工程（１）の前記ヒアルロン酸粗抽出物を水溶液の形態で処理し、前記リン酸塩および前記カルシウム塩、または前記リン酸カルシウム塩を、水溶液の形態で前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項８】
前記リン酸塩水溶液、前記カルシウム塩水溶液、および前記リン酸カルシウム塩水溶液のうちの少なくとも１つを、酸性水溶液として、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合する請求項７に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項９】
前記酸性水溶液が、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨよりなる群から選ばれる少なくとも１つの酸を含む請求項８に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、混合と同時にまたは混合後に、ｐＨ５〜１４の条件で処理する請求項７または８に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１１】
前記ｐＨ５〜１４の条件が、塩基性化合物を用いることにより達成される請求項１０に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１２】
前記塩基性化合物が、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１３】
前記工程（１）において、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、カルシウム塩の供給源として、カルシウムイオンを含有しリン酸イオンを含有しない水溶液（第１水溶液）と処理し、リン酸塩供給源として、リン酸イオンを含有しカルシウムイオンを含有しない水溶液（第２水溶液）と処理する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１４】
前記第１水溶液のカルシウムイオン濃度と前記第２水溶液のリン酸イオン濃度がそれぞれ０．００１Ｍ〜１０Ｍであり、前記カルシウム塩の前記リン酸塩に対するＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０である請求項１３に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１５】
前記第１水溶液と前記第２水溶液のうちの少なくとも１つが、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨから選ばれる少なくとも１つの酸を含有する酸性水溶液である請求項１３に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１６】
前記第１水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第２水溶液を添加する第１混合方法、または、
前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第１水溶液を添加する第２混合方法、または、
前記第１水溶液と前記第２水溶液のそれぞれに、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を添加し、得られた各水溶液を混合する第３混合方法、または、
前記第１水溶液と前記第２水溶液との混合水溶液に、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を添加する第４混合方法により、
前記第１水溶液と前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液を形成することにより、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を処理する請求項１３または１４に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１７】
前記第１水溶液；
前記第２水溶液；
前記第１水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液；
前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液；
前記第１水溶液と前記第２水溶液との前記混合水溶液；および
前記第１水溶液と前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液；
のうち少なくとも１つは、ｐＨ５〜１４となるように調整されている請求項１６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１８】
前記ｐＨを５〜１４の範囲に調整するために、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性化合物を用いる請求項１７に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１９】
前記第１混合方法または前記第３混合方法において、前記第１水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（第１水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）、
前記第２混合方法または前記第３混合方法において、前記第２水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（第２水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）、および
前記第４混合方法において、前記第１水溶液と前記第２水溶液の前記混合水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（第１水溶液と第２水溶液の混合水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）
が０．００１〜１００である請求項１６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２０】
前記工程（１）において、テトラカルシウムホスフェート、ヒドロキシアパタイト、非化学量論的ヒドロキシアパタイト、非晶質カルシウムホスフェート、トリカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート二水和物、ジカルシウムホスフェート無水和物、カルシウムピロリン酸、カルシウムピロリン酸二水和物、ヘプタカルシウムホスフェート、テトラカルシウム二水素ホスフェート、モノカルシウムホスフェート一水和物、およびカルシウムメタホスフェートよりなる群から選ばれる少なくとも１つのリン酸カルシウム塩の水溶液と混合することにより、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液をリン酸カルシウム塩水溶液と処理する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２１】
前記リン酸カルシウム塩の水溶液が、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨから選ばれる少なくとも１つの酸を含む酸性水溶液である請求項２０に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２２】
前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、前記リン酸カルシウム塩水溶液との混合と同時にまたは混合後に、ｐＨ５〜１４の条件で処理する請求項２０または２１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２３】
前記ｐＨ５〜１４の条件が、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性化合物を用いることにより達成される請求項２２に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２４】
前記リン酸カルシウム塩水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（リン酸カルシウム塩水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）が０．１〜２．０である請求項２０に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２５】
前記工程（２）において、前記工程（１）の処理結果物を、澄明な溶液が得られるまで遠心分離し、前記澄明な溶液をろ過する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２６】
遠心分離およびろ過により得られた前記澄明な溶液に、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物を含む酸性水溶液を添加し、ｐＨを２〜１０の範囲に調整する請求項２５に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２７】
前記工程（２）において、前記工程（１）の処理結果物をろ過した後、エタノールを用いてヒアルロン酸を沈殿させる請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２８】
前記ヒアルロン酸の沈殿が生じる溶液に、水溶性中性塩を添加する請求項２７に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２９】
前記工程（２）において、前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ヒアルロン酸を沈殿させた後、沈殿したヒアルロン酸をエタノールで洗浄し、さらにｐＨが１〜５の範囲に調整された７０％〜９０％エタノールで再洗浄する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項３０】
前記工程（２）で得られたヒアルロン酸を、前記工程（１）のカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理し、処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることを含む追加の精製工程を、前記工程（２）の後に１回以上有する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項３１】
前記工程（１）のヒアルロン酸粗抽出物を、４℃〜９０℃の温度で、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１】
（１）ヒアルロン酸含有天然物をタンパク質分解酵素で処理して得られるか、または微生物由来のヒアルロン酸を含有する培養液から得られるヒアルロン酸粗抽出物を、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩と処理する工程、
（２）前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることによってヒアルロン酸を精製する工程
を有することを特徴とするヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸粗抽出物が、ヒアルロン酸含有天然物として雄鶏とさかを３０℃〜６０℃の温度で３時間〜７２時間タンパク質分解酵素で処理し、脂質層を分離、除去することによって得られるものである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項３】
前記カルシウム塩が、Ｃａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2、およびＣａＳＯ2・２Ｈ2Ｏよりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項４】
前記リン酸塩が、Ｈ3ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、Ｈ4Ｐ2Ｏ7、ＮａＨ2ＰＯ4、およびＫＨ2ＰＯ4よりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項５】
前記カルシウム塩と前記リン酸塩が、Ｃａ／Ｐモル比０．５〜３．０で使用される請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項６】
前記リン酸カルシウム塩が、テトラカルシウムホスフェート、ヒドロキシアパタイト、非化学量論的ヒドロキシアパタイト、非晶質カルシウムホスフェート、トリカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート二水和物、ジカルシウムホスフェート無水和物、カルシウムピロリン酸、カルシウムピロリン酸二水和物、ヘプタカルシウムホスフェート、テトラカルシウム二水素ホスフェート、モノカルシウムホスフェート一水和物、およびカルシウムメタホスフェートよりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項７】
前記工程（１）の前記ヒアルロン酸粗抽出物を水溶液の形態で処理し、前記リン酸塩および前記カルシウム塩、または前記リン酸カルシウム塩を、水溶液の形態で前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項８】
前記リン酸塩水溶液、前記カルシウム塩水溶液、および前記リン酸カルシウム塩水溶液のうちの少なくとも１つを、酸性水溶液として、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液と混合する請求項７に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項９】
前記酸性水溶液が、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨよりなる群から選ばれる少なくとも１つの酸を含む請求項８に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、混合と同時にまたは混合後に、ｐＨ５〜１４の条件で処理する請求項７または８に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１１】
前記ｐＨ５〜１４の条件が、塩基性化合物を用いることにより達成される請求項１０に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１２】
前記塩基性化合物が、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１３】
前記工程（１）において、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、カルシウム塩の供給源として、カルシウムイオンを含有しリン酸イオンを含有しない水溶液（第１水溶液）と処理し、リン酸塩供給源として、リン酸イオンを含有しカルシウムイオンを含有しない水溶液（第２水溶液）と処理する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１４】
前記第１水溶液のカルシウムイオン濃度と前記第２水溶液のリン酸イオン濃度がそれぞれ０．００１Ｍ〜１０Ｍであり、前記カルシウム塩の前記リン酸塩に対するＣａ／Ｐモル比が０．５〜３．０である請求項１３に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１５】
前記第１水溶液と前記第２水溶液のうちの少なくとも１つが、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨから選ばれる少なくとも１つの酸を含有する酸性水溶液である請求項１３に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１６】
前記第１水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第２水溶液を添加する第１混合方法、または、
前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液に、前記第１水溶液を添加する第２混合方法、または、
前記第１水溶液と前記第２水溶液のそれぞれに、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を添加し、得られた各水溶液を混合する第３混合方法、または、
前記第１水溶液と前記第２水溶液との混合水溶液に、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を添加する第４混合方法により、
前記第１水溶液と前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との混合水溶液を形成することにより、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を処理する請求項１３または１４に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１７】
前記第１水溶液；
前記第２水溶液；
前記第１水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液；
前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液；
前記第１水溶液と前記第２水溶液との前記混合水溶液；および
前記第１水溶液と前記第２水溶液と前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液との前記混合水溶液；
のうち少なくとも１つは、ｐＨ５〜１４となるように調整されている請求項１６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１８】
前記ｐＨを５〜１４の範囲に調整するために、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性化合物を用いる請求項１７に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項１９】
前記第１混合方法または前記第３混合方法において、前記第１水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（第１水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）、
前記第２混合方法または前記第３混合方法において、前記第２水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（第２水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）、および
前記第４混合方法において、前記第１水溶液と前記第２水溶液の前記混合水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（第１水溶液と第２水溶液の混合水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）
が０．００１〜１００である請求項１６に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２０】
前記工程（１）において、テトラカルシウムホスフェート、ヒドロキシアパタイト、非化学量論的ヒドロキシアパタイト、非晶質カルシウムホスフェート、トリカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート二水和物、ジカルシウムホスフェート無水和物、カルシウムピロリン酸、カルシウムピロリン酸二水和物、ヘプタカルシウムホスフェート、テトラカルシウム二水素ホスフェート、モノカルシウムホスフェート一水和物、およびカルシウムメタホスフェートよりなる群から選ばれる少なくとも１つのリン酸カルシウム塩の水溶液と混合することにより、前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液をリン酸カルシウム塩水溶液と処理する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２１】
前記リン酸カルシウム塩の水溶液が、ＨＣｌ、ＨＮＯ3、ＨＦ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＣｌＯ4、ＨＣｌＯ、Ｈ2ＣＯ3、ＣＨ3ＣＯＯＨ、Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）2、ＨＯＯＣＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨから選ばれる少なくとも１つの酸を含む酸性水溶液である請求項２０に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２２】
前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液を、前記リン酸カルシウム塩水溶液との混合と同時にまたは混合後に、ｐＨ５〜１４の条件で処理する請求項２０または２１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２３】
前記ｐＨ５〜１４の条件が、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）2、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、ビス−２−ヒドロキシエチル−アミノトリス−ヒドロキシメチル−メタン、および１，３−ビス−［トリス−ヒドロキシメチル］−メチル−アミノプロパンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性化合物を用いることにより達成される請求項２２に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２４】
前記リン酸カルシウム塩水溶液の前記ヒアルロン酸粗抽出物水溶液に対する体積混合比（リン酸カルシウム塩水溶液体積／ヒアルロン酸粗抽出物水溶液体積）が０．１〜２．０である請求項２０に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２５】
前記工程（２）において、前記工程（１）の処理結果物を、澄明な溶液が得られるまで遠心分離し、前記澄明な溶液をろ過する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２６】
遠心分離およびろ過により得られた前記澄明な溶液に、無機酸、有機酸、またはそれらの混合物を含む酸性水溶液を添加し、ｐＨを２〜１０の範囲に調整する請求項２５に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２７】
前記工程（２）において、前記工程（１）の処理結果物をろ過した後、エタノールを用いてヒアルロン酸を沈殿させる請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２８】
前記ヒアルロン酸の沈殿が生じる溶液に、水溶性中性塩を添加する請求項２７に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項２９】
前記工程（２）において、前記工程（１）の処理結果物をろ過し、ヒアルロン酸を沈殿させた後、沈殿したヒアルロン酸をエタノールで洗浄し、さらにｐＨが１〜５の範囲に調整された７０％〜９０％エタノールで再洗浄する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項３０】
前記工程（２）で得られたヒアルロン酸を、前記工程（１）のカルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理し、処理結果物をろ過し、ろ液からヒアルロン酸を沈殿させることを含む追加の精製工程を、前記工程（２）の後に１回以上有する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【請求項３１】
前記工程（１）のヒアルロン酸粗抽出物を、４℃〜９０℃の温度で、カルシウム塩およびリン酸塩、またはリン酸カルシウム塩で処理する請求項１に記載のヒアルロン酸の精製方法。
【公表番号】特表２００８−５０２３４４（Ｐ２００８−５０２３４４Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１６３９０（Ｐ２００７−５１６３９０）
【出願日】平成１７年６月１５日（２００５．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１８２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２３９３４
【国際公開日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【出願人】（５０６４１９３０８）ティー アンド ライフ システム コ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１５日（２００５．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１８２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２３９３４
【国際公開日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【出願人】（５０６４１９３０８）ティー アンド ライフ システム コ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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