カルシウム測定試薬及び測定方法
【課題】保存性に優れ、マグネシウムの干渉作用を受けることなく、カルシウムを測定可能な試薬及び方法を提供する。
【解決手段】前記カルシウム測定試薬は、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤と、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩（Ｒ１は水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数）を含む。
【化１】
【解決手段】前記カルシウム測定試薬は、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤と、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩（Ｒ１は水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数）を含む。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム測定試薬及び測定方法に関する。本発明は、生体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、髄液、唾液、尿など）中のカルシウムを測定することが可能で、臨床的診断に有用である。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムは生体内中にある無機質のうち最も多量に含まれ、約１ｋｇ存在している。カルシウムはリン酸とともに骨組織の形成に利用されており、全カルシウムの量の９９％が骨と歯、硬組織に含まれ、残りの１％が血液などの体液中に存在している。カルシウム低下では腎不全や副甲状腺機能低下症、骨疾患などの異常を示唆し、また逆にカルシウム増加では副甲状腺機能亢進症や多発性骨髄腫、悪性腫瘍（骨転移）などの異常を示唆するので、その測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】
試料中のカルシウムの測定方法として、滴定法、比色定量法、原子吸光法があり、臨床検査に汎用されているのはキレート発色剤を用いた比色定量法である。キレート発色剤としては、アルカリ性でカルシウムとのキレート結合が安定するｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン法（以下、ｏ−ＣＰＣ法と略称する）（例えば、特許文献１参照）や、ｐＨ５．０〜７．０で発色させるアルセナゾ−IIIを用いて、生体試料中のカルシウムを測定する方法で、キレート化剤（例えば、抗凝固剤であるＥＤＴＡ）と結合しているカルシウムをバナジン酸イオンにより解離させて、キレート化剤の影響を受けずに正確に生体試料中のカルシウムを測定することができる試薬（例えば、特許文献２参照）や、クロロホスホナゾ−IIIをキレート発色剤として用い、カルシウム及びマグネシウムを同時に定量する試薬（特許文献３参照）、バナジン酸イオンの存在下でクロロホスホナゾ−IIIをキレート発色剤として用い、検体ブランクを抑えることにより測定範囲が広い試薬（特許文献４参照）、アルセナゾ−IIIと、マグネシウム隠蔽剤である８−ヒドロキシキノリンとを含み、マグネシウムによる干渉を排除してカルシウムのみを測定可能な試薬（特許文献５参照）などがある。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５４−３６９９６号公報
【特許文献２】特開２００５−３００４３５号公報
【特許文献３】特開平０４−１２０４６４号公報
【特許文献４】特開２００６−２３１８２号公報
【特許文献５】特表平６−５０５５６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ｏ−ＣＰＣ法においては高ｐＨであるアルカリ性で発色させる為、空気中の炭酸ガスの吸収により使用時のｐＨの低下が大きく、また溶液状態で長時間保存すると試薬のｐＨが下がり、その結果、測定値が不正確になることもある。一方、アルセナゾ−IIIやクロロホスホナゾ−IIIを用いたカルシウム測定試薬はｏ−ＣＰＣ法よりｐＨが低いのでその点は問題ないが、発色域が弱酸性域であるがために、従来のマグネシウム隠蔽剤としてもっとも知られている８−ヒドロキシキノリンによる隠蔽効果が弱かったり、８−ヒドロキシキノリンによりカルシウムとの反応性が低いという問題も出てくる。
【０００６】
従って、本発明の課題は、上記問題点を解決することのできる、保存性に優れ、マグネシウムの干渉作用を受けることなく、カルシウムを測定可能な試薬及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、本発明による、（１）2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤、及び（２）一般式（Ｉ）：
【化１】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩を含む、カルシウム測定試薬により解決することができる。
【０００８】
また、本発明は、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を用いるカルシウム測定方法であって、一般式（Ｉ）：
【化２】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩の存在下で、被検試料と前記キレート発色剤との反応を実施することを特徴とする、前記カルシウム測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、高ｐＨに起因する炭酸ガス吸収の問題がなく、マグネシウムの干渉作用も受けずに正確にカルシウムを測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のカルシウム測定試薬又は測定方法は、キレート発色剤である2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤（以下、ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤と称する）を基質としてカルシウムを測定する際に、前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を使用することを特徴とする。
【００１１】
本発明では、キレート発色剤として、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤、すなわち、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸骨格を有し、カルシウムイオンと結合して発色可能な化合物を用いる。本発明で用いることのできるキレート発色剤としては、ｐＨ３〜９で使用可能なキレート発色剤が好ましく、ｐＨ５〜９で使用可能なキレート発色剤がより好ましい。本発明で用いることのできるキレート発色剤としては、例えば、
【化３】
で表される2,7-ビス（2-アルソノフェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸（アルセナゾ−III）[CAS No. 1668-00-4]若しくはその塩、又は2,7-ビス（4-クロロ-2-ホスホノフェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸若しくはその塩、例えば、
【化４】
で表される2,7-ビス（4-クロロ-2-ホスホノフェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩（クロロホスホナゾ−III）[CAS No. 1914-99-4]などを挙げることができる。
【００１２】
本発明においては、前記ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤と共に、前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を用いる。一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、マグネシウムとキレートし、カルシウムを測定する際のマグネシウムの干渉作用を防ぐことができる。
【００１３】
前記一般式（Ｉ）において、基Ｒ１におけるヌクレオシド残基とは、ヌクレオシドの糖部分の５位の水酸基を除いた残基である。前記ヌクレオシドとしては、例えば、リボヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、リボチミジン）、デオキシリボヌクレオシド（例えば、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、デオキシリボチミジン）を挙げることができ、好ましくはリボヌクレオシドであり、より好ましくはプリンリボヌクレオシド（アデノシン又はグアノシン）であり、特に好ましくはアデノシンである。
【００１４】
基Ｒ１がヌクレオシド残基である場合、一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、ヌクレオシド二リン酸（ｎ＝２の場合）、ヌクレオシド三リン酸（ｎ＝３の場合）である。特に、基Ｒ１がアデノシン残基である場合、一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ；ｎ＝２の場合）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ；ｎ＝３の場合）である。同様に、一般式（Ｉ）で表される化合物は、基Ｒ１がグアノシン残基である場合、例えば、ＧＤＰ、ＧＴＰであり、基Ｒ１がシチジン残基である場合、例えば、ＣＤＰ、ＣＴＰであり、基Ｒ１がウリジン残基である場合、例えば、ＵＤＰ、ＵＴＰであり、基Ｒ１がリボチミジン残基である場合、例えば、ＴＤＰ、ＴＴＰである。
基Ｒ１がヌクレオシド残基である場合、ｎの数は２以上であり、好ましくは３である。
【００１５】
基Ｒ１が水素原子である場合、一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、ピロリン酸（ｎ＝２）、トリポリリン酸（ｎ＝３）、ポリリン酸（ｎ＝４〜１１）を挙げることができる。基Ｒ１が水素原子である場合、ｎの数は２以上であり、好ましくは３以上であり、より好ましくは４以上である。
【００１６】
一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）を挙げることができる。
【００１７】
本発明においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩として、１種類のみを単独で使用することもできるし、あるいは、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
【００１８】
本発明のカルシウム測定方法は、測定対象化合物であるカルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応の際に、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の存在下で実施すること以外は、前記キレート発色剤を用いる公知測定方法と同様にして実施することができる。
【００１９】
カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤とを反応させる場合、反応系のｐＨは、通常、ｐＨ３．０〜９．０であり、好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。また、前記反応に基づく発色は、例えば、波長６００ｎｍ〜７００ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量することができる。本発明方法によりカルシウムを測定する場合、汎用の自動分析装置（例えば、日立７１７０Ｓ型）を使用可能である。
【００２０】
ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いる場合、クロロホスホナゾ−IIIの濃度は、カルシウムとの反応時の濃度として、好ましくは０．００５〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いる場合、アルセナゾ−IIIの濃度は、カルシウムとの反応時の濃度として、好ましくは０．００５〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２１】
一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に関して、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度は、各種反応条件（例えば、用いる前記化合物若しくはキレート発色剤の種類、反応系のｐＨ、発色の検出手段、又は被検試料の状態）に応じて最適濃度が変動する可能性があるため、特に限定されるものではないが、当業者であれば、例えば、実施例に示す手順を参考として、予備実験を行うことにより、実際の測定条件に応じた最適条件を設定することが可能である。
【００２２】
より具体的には、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の各種濃度存在下において、実際の測定条件に基づいて、実施例１又は２に記載の手順に従って、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液中のカルシウム濃度及びマグネシウム濃度（具体的には、例えば、吸光度変化）を測定する。カルシウム測定が可能であって、且つ、マグネシウム隠蔽効果が、例えば、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上である濃度を、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の好適濃度範囲として選択することができる。
【００２３】
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてＡＤＰを用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．０１％〜５％であり、より好ましくは０．０５％〜２％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてＡＴＰを用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．００１％〜１．０％であり、より好ましくは０．０１％〜０．５％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてピロリン酸を用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．００５％〜１．０％であり、より好ましくは０．０１％〜０．５％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてトリポリリン酸を用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．０００５％〜１．０％であり、より好ましくは０．００２％〜０．５％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてポリリン酸を用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．０００５％〜１．０％であり、より好ましくは０．００１％〜０．５％である。
【００２４】
従来、ｏ−ＣＰＣ法のようなキレート発色法においては、それに用いる試薬は強アルカリ性、例えばｐＨ１０．０〜１１．０であるので、長期間保存しておくと空気中の二酸化炭素を吸収し、試薬のｐＨが変動していき、その結果、測定値のバラツキが大きくなることもあった。それに対して、本発明において、ｐＨ３．０〜９．０で設定する場合、このようなｐＨの変動が起こりにくくなり、液体状態で長期間保存しておいてもカルシウムを正確に測定可能な液状試薬としても使用することができる。
【００２５】
本発明のカルシウム測定試薬は、本発明のカルシウム測定方法に使用することができる。本発明のカルシウム測定試薬は、１試薬系として構成することもできるし、２試薬系以上の構成とすることもできる。例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む第一試薬と、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を含む第二試薬とから構成することができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を共存させた試薬においてもカルシウム測定試薬とすることができる。本発明のカルシウム測定試薬は、ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤及び一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に加え、必要により、例えば、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、塩類（例えば、ナトリウム塩）、及び／又は各種界面活性剤などを適宜添加することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２７】
《実施例１：クロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系における一般式（Ｉ）で表される化合物の効果の確認》
本実施例では、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを使用し、一般式（Ｉ）で表される化合物として、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸（ｎ＝４〜１１）を下記試薬中に添加し、下記試料に含有されるカルシウム又はマグネシウムをそれぞれ測定した。なお、比較例として、カルシウムを測定する場合に一般的なキレート剤として使用されている８−ヒドロキシキノリンの効果も検討した。
【００２８】
試料
カルシウム１０ｍｇ／ｄＬを含む試料（カルシウム濃度として１０ｍｇ／ｄＬとなるように、塩化カルシウム２水和物を蒸留水に溶解して調製した試料。以下、「Ｃａ ＳＴＤ」と称する）
マグネシウム３ｍｇ／ｄＬを含む試料（マグネシウム濃度として３ｍｇ／ｄＬとなるように、塩化マグネシウム６水和物を蒸留水に溶解して調製した試料。以下、「Ｍｇ ＳＴＤ」と称する）
試薬
グッド緩衝液ＡＣＥＳ（株式会社 同仁化学研究所） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．５
クロロホスホナゾ−III（Ｎａ塩；株式会社 同仁化学研究所） ２０μｍｏｌ／Ｌ
【００２９】
測定は、以下の手順で行った。自動分析装置（日立７１７０Ｓ型）を用い、試料（Ｃａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤ）２．０μＬと試薬２００μＬとを３７℃にて５分間混合し、発色反応させた。試薬ブランク対照の液の吸光度変化を６６０ｎｍの測定波長前後で測定した。
【００３０】
結果を表１〜表６及び図１〜図６に示す。図１〜図６の横軸に示す化合物濃度は、発色反応時（すなわち、試料２．０μＬと試薬２００μＬとを混合した時点）の濃度であり、縦軸の記号「Ａｂｓ」は吸光度を意味する。また、表１〜表６の「Ｃａ ＳＴＤ」欄及び「Ｍｇ ＳＴＤ」欄に示す数値は、吸光度変化（単位：×１０４）である。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物を添加しない場合のＣａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤの吸光度変化は、それぞれ、４２６６及び９８１（単位：×１０４）であった。
【００３１】
《表１》
ＡＤＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4346 4459 4118 3985 3585 2695
Ｍｇ ＳＴＤ 636 498 260 128 69 10
【００３２】
《表２》
ＡＴＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4198 3991 3492 2805 2007 1062
Ｍｇ ＳＴＤ 192 83 0 -31 -39 -28
【００３３】
《表３》
ピロリン酸濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4389 4332 4042 3278 2580 1518
Ｍｇ ＳＴＤ 335 158 48 2 -21 -16
【００３４】
《表４》
トリポリリン酸濃度
[% (×1/1000)] 1 2 5 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4414 4414 4315 4039 3673 2731 1738 1096 524
Ｍｇ ＳＴＤ 537 304 123 2 -7 -35 -65 -64 -32
【００３５】
《表５》
ポリリン酸濃度
[% (×1/1000)] 1 2 5 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4435 4496 4365 4063 3640 2790 1749 1089 503
Ｍｇ ＳＴＤ 521 294 116 24 -7 -47 -23 -43 -27
【００３６】
《表６》
８−ヒドロキシキノリン濃度
[% (×1/1000)] 10 20
Ｃａ ＳＴＤ 3901 3791
Ｍｇ ＳＴＤ 344 314
【００３７】
キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用い、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、８−ヒドロキシキノリン（従来法で一般的に使用）を添加した場合を比較検討してみると、８−ヒドロキシキノリンでは完全にマグネシウムの反応はなくならなかったが、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸を添加した場合では、マグネシウムとキレートして反応していないのに対し、カルシウムとは反応していることが判明した。
【００３８】
本実施例の条件下においてＡＤＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０５〜５．０％であり、より好ましくは０．２〜２．０％であった。
本実施例の条件下においてＡＴＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０１〜１．０％であり、より好ましくは０．０５〜０．５％であった。
本実施例の条件下においてピロリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０１〜１．０％であり、より好ましくは０．０５〜０．５％であった。
本実施例の条件下においてトリポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００２〜１．０％であり、より好ましくは０．００５〜０．５％であった。
本実施例の条件下においてポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００２〜１．０％であり、より好ましくは０．００５〜０．５％であった。
【００３９】
《実施例２：アルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系における一般式（Ｉ）で表される化合物の効果の確認》
試薬として下記試薬を用いること以外は、実施例１の操作を繰り返した。
試薬
グッド緩衝液ＥＰＰＳ（株式会社 同仁化学研究所） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０
アルセナゾ−III（酸型；株式会社 同仁化学研究所） ２０μｍｏｌ／Ｌ
【００４０】
結果を表７〜表１２及び図７〜図１２に示す。一般式（Ｉ）で表される化合物を添加しない場合のＣａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤの吸光度変化は、表７〜表９に示す実験では、それぞれ、４７３７及び３６４（単位：×１０４）であり、表１０〜表１２に示す実験では、それぞれ、３７４６及び２８３（単位：×１０４）であった。キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いても、クロロホスホナゾ−IIIと同様の傾向を確認した。
【００４１】
《表７》
ＡＤＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4514 4240 3530 2703 1844 831
Ｍｇ ＳＴＤ 213 138 68 37 17 0
【００４２】
《表８》
ＡＴＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 2555 1683 793 395 194 77
Ｍｇ ＳＴＤ 35 7 0 -6 -1 -2
【００４３】
《表９》
ピロリン酸濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 2206 1194 412 190 89 29
Ｍｇ ＳＴＤ 36 -1 -4 -10 -10 -5
【００４４】
《表１０》
トリポリリン酸濃度
[% (×1/1000)]
0.1 0.2 0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500
Ca STD 3806 3651 3509 3072 2285 995 736 284 120 45 17 8
Mg STD 250 264 300 237 105 20 -2 -3 2 -3 -9 -2
【００４５】
《表１１》
ポリリン酸濃度
[% (×1/1000)] 0.1 0.2 0.5 1 2 5 10
Ｃａ ＳＴＤ 3692 3490 2818 1888 998 366 179
Ｍｇ ＳＴＤ 284 306 176 68 15 3 -1
【００４６】
《表１２》
８−ヒドロキシキノリン濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100
Ｃａ ＳＴＤ 5083 5067 5068 4788
Ｍｇ ＳＴＤ 349 314 230 121
【００４７】
本実施例の条件下においてＡＤＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０１〜０．５％であり、より好ましくは０．０５〜０．２％であった。
本実施例の条件下においてＡＴＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００５〜０．１％であり、より好ましくは０．０１〜０．０５％であった。
本実施例の条件下においてピロリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００５〜０．１％であり、より好ましくは０．０１〜０．０５％であった。
本実施例の条件下においてトリポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０００５〜０．１％であり、より好ましくは０．０１〜０．０５％であった。
本実施例の条件下においてポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０００５〜０．００２％であり、より好ましくは０．００１〜０．００５％であった。
【００４８】
《参考例１：ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ−ＣＰＣ）を用いるカルシウム測定系におけるＡＤＰの効果の確認》
一般式（Ｉ）で表される化合物としてＡＤＰを用いること、そして、試薬として下記試薬を用いること以外は、実施例１の操作を繰り返した。
試薬
２−アミノエタノール １．５ｍｏｌ／Ｌ
ほう酸 ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ１１．０
ｏ−ＣＰＣ（株式会社 同仁化学研究所） ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４９】
結果を表１３及び図１３に示す。ＡＤＰを添加しない場合のＣａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤの吸光度変化は、それぞれ、４６６８及び５６８（単位：×１０４）であった。キレート発色剤としてｏ−ＣＰＣを用いた場合、ＡＤＰは、マグネシウム隠蔽効果を示さなかった。
【００５０】
《表１３》
ＡＤＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4538 4508 4383 4230 3970 3620
Ｍｇ ＳＴＤ 588 570 579 571 563 583
【００５１】
《実施例３：クロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系におけるｐＨの検討》
一般式（Ｉ）で表される各化合物の濃度を、ＡＴＰで０．０５％、ピロリン酸で０．１％、トリポリリン酸で０．０１％、ポリリン酸で０．０１％、８−ヒドロキシキノリンで０．１％としたこと、そして、試薬のｐＨを５段階（ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５）としたことを除き、実施例１の操作を繰り返した。
【００５２】
結果を図１４〜図１９に示す。
ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸を添加した場合、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５のいずれのｐＨでも、マグネシウムの反応を抑え、かつカルシウムを測定することができることが判明した。また、これらの化合物を添加しなかったり、従来、一般的にマグネシウムのキレート剤として使用されている８−ヒドロキシキノリンを用いてもマグネシウムの反応を完全に抑えることができないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、臨床検査診断試薬分野におけるカルシウム測定の用途に適用することができる。本発明によれば、試薬を長時間保存しても安定であり、マグネシウムの干渉作用も抑えて正確にカルシウムを測定することが可能であり、臨床検査診断試薬分野で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＤＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図２】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＴＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図３】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のピロリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図４】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のトリポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図５】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図６】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度の８−ヒドロキシキノリン存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図７】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＤＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図８】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＴＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図９】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のピロリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のトリポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度の８−ヒドロキシキノリン存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】キレート発色剤としてｏ−クレゾールフタレインコンプレクソンを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＤＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（５７０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１４】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１５】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．０５％ＡＴＰ存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１６】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．１％ピロリン酸存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１７】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．０１％トリポリリン酸存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１８】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．０１％ポリリン酸存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１９】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．１％８−ヒドロキシキノリン存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム測定試薬及び測定方法に関する。本発明は、生体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、髄液、唾液、尿など）中のカルシウムを測定することが可能で、臨床的診断に有用である。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムは生体内中にある無機質のうち最も多量に含まれ、約１ｋｇ存在している。カルシウムはリン酸とともに骨組織の形成に利用されており、全カルシウムの量の９９％が骨と歯、硬組織に含まれ、残りの１％が血液などの体液中に存在している。カルシウム低下では腎不全や副甲状腺機能低下症、骨疾患などの異常を示唆し、また逆にカルシウム増加では副甲状腺機能亢進症や多発性骨髄腫、悪性腫瘍（骨転移）などの異常を示唆するので、その測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】
試料中のカルシウムの測定方法として、滴定法、比色定量法、原子吸光法があり、臨床検査に汎用されているのはキレート発色剤を用いた比色定量法である。キレート発色剤としては、アルカリ性でカルシウムとのキレート結合が安定するｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン法（以下、ｏ−ＣＰＣ法と略称する）（例えば、特許文献１参照）や、ｐＨ５．０〜７．０で発色させるアルセナゾ−IIIを用いて、生体試料中のカルシウムを測定する方法で、キレート化剤（例えば、抗凝固剤であるＥＤＴＡ）と結合しているカルシウムをバナジン酸イオンにより解離させて、キレート化剤の影響を受けずに正確に生体試料中のカルシウムを測定することができる試薬（例えば、特許文献２参照）や、クロロホスホナゾ−IIIをキレート発色剤として用い、カルシウム及びマグネシウムを同時に定量する試薬（特許文献３参照）、バナジン酸イオンの存在下でクロロホスホナゾ−IIIをキレート発色剤として用い、検体ブランクを抑えることにより測定範囲が広い試薬（特許文献４参照）、アルセナゾ−IIIと、マグネシウム隠蔽剤である８−ヒドロキシキノリンとを含み、マグネシウムによる干渉を排除してカルシウムのみを測定可能な試薬（特許文献５参照）などがある。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５４−３６９９６号公報
【特許文献２】特開２００５−３００４３５号公報
【特許文献３】特開平０４−１２０４６４号公報
【特許文献４】特開２００６−２３１８２号公報
【特許文献５】特表平６−５０５５６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ｏ−ＣＰＣ法においては高ｐＨであるアルカリ性で発色させる為、空気中の炭酸ガスの吸収により使用時のｐＨの低下が大きく、また溶液状態で長時間保存すると試薬のｐＨが下がり、その結果、測定値が不正確になることもある。一方、アルセナゾ−IIIやクロロホスホナゾ−IIIを用いたカルシウム測定試薬はｏ−ＣＰＣ法よりｐＨが低いのでその点は問題ないが、発色域が弱酸性域であるがために、従来のマグネシウム隠蔽剤としてもっとも知られている８−ヒドロキシキノリンによる隠蔽効果が弱かったり、８−ヒドロキシキノリンによりカルシウムとの反応性が低いという問題も出てくる。
【０００６】
従って、本発明の課題は、上記問題点を解決することのできる、保存性に優れ、マグネシウムの干渉作用を受けることなく、カルシウムを測定可能な試薬及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、本発明による、（１）2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤、及び（２）一般式（Ｉ）：
【化１】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩を含む、カルシウム測定試薬により解決することができる。
【０００８】
また、本発明は、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を用いるカルシウム測定方法であって、一般式（Ｉ）：
【化２】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩の存在下で、被検試料と前記キレート発色剤との反応を実施することを特徴とする、前記カルシウム測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、高ｐＨに起因する炭酸ガス吸収の問題がなく、マグネシウムの干渉作用も受けずに正確にカルシウムを測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のカルシウム測定試薬又は測定方法は、キレート発色剤である2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤（以下、ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤と称する）を基質としてカルシウムを測定する際に、前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を使用することを特徴とする。
【００１１】
本発明では、キレート発色剤として、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤、すなわち、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸骨格を有し、カルシウムイオンと結合して発色可能な化合物を用いる。本発明で用いることのできるキレート発色剤としては、ｐＨ３〜９で使用可能なキレート発色剤が好ましく、ｐＨ５〜９で使用可能なキレート発色剤がより好ましい。本発明で用いることのできるキレート発色剤としては、例えば、
【化３】
で表される2,7-ビス（2-アルソノフェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸（アルセナゾ−III）[CAS No. 1668-00-4]若しくはその塩、又は2,7-ビス（4-クロロ-2-ホスホノフェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸若しくはその塩、例えば、
【化４】
で表される2,7-ビス（4-クロロ-2-ホスホノフェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩（クロロホスホナゾ−III）[CAS No. 1914-99-4]などを挙げることができる。
【００１２】
本発明においては、前記ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤と共に、前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を用いる。一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、マグネシウムとキレートし、カルシウムを測定する際のマグネシウムの干渉作用を防ぐことができる。
【００１３】
前記一般式（Ｉ）において、基Ｒ１におけるヌクレオシド残基とは、ヌクレオシドの糖部分の５位の水酸基を除いた残基である。前記ヌクレオシドとしては、例えば、リボヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、リボチミジン）、デオキシリボヌクレオシド（例えば、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、デオキシリボチミジン）を挙げることができ、好ましくはリボヌクレオシドであり、より好ましくはプリンリボヌクレオシド（アデノシン又はグアノシン）であり、特に好ましくはアデノシンである。
【００１４】
基Ｒ１がヌクレオシド残基である場合、一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、ヌクレオシド二リン酸（ｎ＝２の場合）、ヌクレオシド三リン酸（ｎ＝３の場合）である。特に、基Ｒ１がアデノシン残基である場合、一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ；ｎ＝２の場合）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ；ｎ＝３の場合）である。同様に、一般式（Ｉ）で表される化合物は、基Ｒ１がグアノシン残基である場合、例えば、ＧＤＰ、ＧＴＰであり、基Ｒ１がシチジン残基である場合、例えば、ＣＤＰ、ＣＴＰであり、基Ｒ１がウリジン残基である場合、例えば、ＵＤＰ、ＵＴＰであり、基Ｒ１がリボチミジン残基である場合、例えば、ＴＤＰ、ＴＴＰである。
基Ｒ１がヌクレオシド残基である場合、ｎの数は２以上であり、好ましくは３である。
【００１５】
基Ｒ１が水素原子である場合、一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、ピロリン酸（ｎ＝２）、トリポリリン酸（ｎ＝３）、ポリリン酸（ｎ＝４〜１１）を挙げることができる。基Ｒ１が水素原子である場合、ｎの数は２以上であり、好ましくは３以上であり、より好ましくは４以上である。
【００１６】
一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）を挙げることができる。
【００１７】
本発明においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩として、１種類のみを単独で使用することもできるし、あるいは、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
【００１８】
本発明のカルシウム測定方法は、測定対象化合物であるカルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応の際に、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の存在下で実施すること以外は、前記キレート発色剤を用いる公知測定方法と同様にして実施することができる。
【００１９】
カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤とを反応させる場合、反応系のｐＨは、通常、ｐＨ３．０〜９．０であり、好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。また、前記反応に基づく発色は、例えば、波長６００ｎｍ〜７００ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量することができる。本発明方法によりカルシウムを測定する場合、汎用の自動分析装置（例えば、日立７１７０Ｓ型）を使用可能である。
【００２０】
ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いる場合、クロロホスホナゾ−IIIの濃度は、カルシウムとの反応時の濃度として、好ましくは０．００５〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いる場合、アルセナゾ−IIIの濃度は、カルシウムとの反応時の濃度として、好ましくは０．００５〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２１】
一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に関して、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度は、各種反応条件（例えば、用いる前記化合物若しくはキレート発色剤の種類、反応系のｐＨ、発色の検出手段、又は被検試料の状態）に応じて最適濃度が変動する可能性があるため、特に限定されるものではないが、当業者であれば、例えば、実施例に示す手順を参考として、予備実験を行うことにより、実際の測定条件に応じた最適条件を設定することが可能である。
【００２２】
より具体的には、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の各種濃度存在下において、実際の測定条件に基づいて、実施例１又は２に記載の手順に従って、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液中のカルシウム濃度及びマグネシウム濃度（具体的には、例えば、吸光度変化）を測定する。カルシウム測定が可能であって、且つ、マグネシウム隠蔽効果が、例えば、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上である濃度を、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の好適濃度範囲として選択することができる。
【００２３】
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてＡＤＰを用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．０１％〜５％であり、より好ましくは０．０５％〜２％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてＡＴＰを用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．００１％〜１．０％であり、より好ましくは０．０１％〜０．５％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてピロリン酸を用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．００５％〜１．０％であり、より好ましくは０．０１％〜０．５％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてトリポリリン酸を用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．０００５％〜１．０％であり、より好ましくは０．００２％〜０．５％である。
例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩としてポリリン酸を用いる場合には、カルシウムとナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤との反応時の濃度として、好ましくは０．０００５％〜１．０％であり、より好ましくは０．００１％〜０．５％である。
【００２４】
従来、ｏ−ＣＰＣ法のようなキレート発色法においては、それに用いる試薬は強アルカリ性、例えばｐＨ１０．０〜１１．０であるので、長期間保存しておくと空気中の二酸化炭素を吸収し、試薬のｐＨが変動していき、その結果、測定値のバラツキが大きくなることもあった。それに対して、本発明において、ｐＨ３．０〜９．０で設定する場合、このようなｐＨの変動が起こりにくくなり、液体状態で長期間保存しておいてもカルシウムを正確に測定可能な液状試薬としても使用することができる。
【００２５】
本発明のカルシウム測定試薬は、本発明のカルシウム測定方法に使用することができる。本発明のカルシウム測定試薬は、１試薬系として構成することもできるし、２試薬系以上の構成とすることもできる。例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む第一試薬と、2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を含む第二試薬とから構成することができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を共存させた試薬においてもカルシウム測定試薬とすることができる。本発明のカルシウム測定試薬は、ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤及び一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に加え、必要により、例えば、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、塩類（例えば、ナトリウム塩）、及び／又は各種界面活性剤などを適宜添加することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２７】
《実施例１：クロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系における一般式（Ｉ）で表される化合物の効果の確認》
本実施例では、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを使用し、一般式（Ｉ）で表される化合物として、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸（ｎ＝４〜１１）を下記試薬中に添加し、下記試料に含有されるカルシウム又はマグネシウムをそれぞれ測定した。なお、比較例として、カルシウムを測定する場合に一般的なキレート剤として使用されている８−ヒドロキシキノリンの効果も検討した。
【００２８】
試料
カルシウム１０ｍｇ／ｄＬを含む試料（カルシウム濃度として１０ｍｇ／ｄＬとなるように、塩化カルシウム２水和物を蒸留水に溶解して調製した試料。以下、「Ｃａ ＳＴＤ」と称する）
マグネシウム３ｍｇ／ｄＬを含む試料（マグネシウム濃度として３ｍｇ／ｄＬとなるように、塩化マグネシウム６水和物を蒸留水に溶解して調製した試料。以下、「Ｍｇ ＳＴＤ」と称する）
試薬
グッド緩衝液ＡＣＥＳ（株式会社 同仁化学研究所） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．５
クロロホスホナゾ−III（Ｎａ塩；株式会社 同仁化学研究所） ２０μｍｏｌ／Ｌ
【００２９】
測定は、以下の手順で行った。自動分析装置（日立７１７０Ｓ型）を用い、試料（Ｃａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤ）２．０μＬと試薬２００μＬとを３７℃にて５分間混合し、発色反応させた。試薬ブランク対照の液の吸光度変化を６６０ｎｍの測定波長前後で測定した。
【００３０】
結果を表１〜表６及び図１〜図６に示す。図１〜図６の横軸に示す化合物濃度は、発色反応時（すなわち、試料２．０μＬと試薬２００μＬとを混合した時点）の濃度であり、縦軸の記号「Ａｂｓ」は吸光度を意味する。また、表１〜表６の「Ｃａ ＳＴＤ」欄及び「Ｍｇ ＳＴＤ」欄に示す数値は、吸光度変化（単位：×１０４）である。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物を添加しない場合のＣａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤの吸光度変化は、それぞれ、４２６６及び９８１（単位：×１０４）であった。
【００３１】
《表１》
ＡＤＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4346 4459 4118 3985 3585 2695
Ｍｇ ＳＴＤ 636 498 260 128 69 10
【００３２】
《表２》
ＡＴＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4198 3991 3492 2805 2007 1062
Ｍｇ ＳＴＤ 192 83 0 -31 -39 -28
【００３３】
《表３》
ピロリン酸濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4389 4332 4042 3278 2580 1518
Ｍｇ ＳＴＤ 335 158 48 2 -21 -16
【００３４】
《表４》
トリポリリン酸濃度
[% (×1/1000)] 1 2 5 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4414 4414 4315 4039 3673 2731 1738 1096 524
Ｍｇ ＳＴＤ 537 304 123 2 -7 -35 -65 -64 -32
【００３５】
《表５》
ポリリン酸濃度
[% (×1/1000)] 1 2 5 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4435 4496 4365 4063 3640 2790 1749 1089 503
Ｍｇ ＳＴＤ 521 294 116 24 -7 -47 -23 -43 -27
【００３６】
《表６》
８−ヒドロキシキノリン濃度
[% (×1/1000)] 10 20
Ｃａ ＳＴＤ 3901 3791
Ｍｇ ＳＴＤ 344 314
【００３７】
キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用い、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、８−ヒドロキシキノリン（従来法で一般的に使用）を添加した場合を比較検討してみると、８−ヒドロキシキノリンでは完全にマグネシウムの反応はなくならなかったが、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸を添加した場合では、マグネシウムとキレートして反応していないのに対し、カルシウムとは反応していることが判明した。
【００３８】
本実施例の条件下においてＡＤＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０５〜５．０％であり、より好ましくは０．２〜２．０％であった。
本実施例の条件下においてＡＴＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０１〜１．０％であり、より好ましくは０．０５〜０．５％であった。
本実施例の条件下においてピロリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０１〜１．０％であり、より好ましくは０．０５〜０．５％であった。
本実施例の条件下においてトリポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００２〜１．０％であり、より好ましくは０．００５〜０．５％であった。
本実施例の条件下においてポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００２〜１．０％であり、より好ましくは０．００５〜０．５％であった。
【００３９】
《実施例２：アルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系における一般式（Ｉ）で表される化合物の効果の確認》
試薬として下記試薬を用いること以外は、実施例１の操作を繰り返した。
試薬
グッド緩衝液ＥＰＰＳ（株式会社 同仁化学研究所） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０
アルセナゾ−III（酸型；株式会社 同仁化学研究所） ２０μｍｏｌ／Ｌ
【００４０】
結果を表７〜表１２及び図７〜図１２に示す。一般式（Ｉ）で表される化合物を添加しない場合のＣａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤの吸光度変化は、表７〜表９に示す実験では、それぞれ、４７３７及び３６４（単位：×１０４）であり、表１０〜表１２に示す実験では、それぞれ、３７４６及び２８３（単位：×１０４）であった。キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いても、クロロホスホナゾ−IIIと同様の傾向を確認した。
【００４１】
《表７》
ＡＤＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4514 4240 3530 2703 1844 831
Ｍｇ ＳＴＤ 213 138 68 37 17 0
【００４２】
《表８》
ＡＴＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 2555 1683 793 395 194 77
Ｍｇ ＳＴＤ 35 7 0 -6 -1 -2
【００４３】
《表９》
ピロリン酸濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 2206 1194 412 190 89 29
Ｍｇ ＳＴＤ 36 -1 -4 -10 -10 -5
【００４４】
《表１０》
トリポリリン酸濃度
[% (×1/1000)]
0.1 0.2 0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500
Ca STD 3806 3651 3509 3072 2285 995 736 284 120 45 17 8
Mg STD 250 264 300 237 105 20 -2 -3 2 -3 -9 -2
【００４５】
《表１１》
ポリリン酸濃度
[% (×1/1000)] 0.1 0.2 0.5 1 2 5 10
Ｃａ ＳＴＤ 3692 3490 2818 1888 998 366 179
Ｍｇ ＳＴＤ 284 306 176 68 15 3 -1
【００４６】
《表１２》
８−ヒドロキシキノリン濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100
Ｃａ ＳＴＤ 5083 5067 5068 4788
Ｍｇ ＳＴＤ 349 314 230 121
【００４７】
本実施例の条件下においてＡＤＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０１〜０．５％であり、より好ましくは０．０５〜０．２％であった。
本実施例の条件下においてＡＴＰを用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００５〜０．１％であり、より好ましくは０．０１〜０．０５％であった。
本実施例の条件下においてピロリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．００５〜０．１％であり、より好ましくは０．０１〜０．０５％であった。
本実施例の条件下においてトリポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０００５〜０．１％であり、より好ましくは０．０１〜０．０５％であった。
本実施例の条件下においてポリリン酸を用いる場合、その好適濃度は、好ましくは０．０００５〜０．００２％であり、より好ましくは０．００１〜０．００５％であった。
【００４８】
《参考例１：ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ−ＣＰＣ）を用いるカルシウム測定系におけるＡＤＰの効果の確認》
一般式（Ｉ）で表される化合物としてＡＤＰを用いること、そして、試薬として下記試薬を用いること以外は、実施例１の操作を繰り返した。
試薬
２−アミノエタノール １．５ｍｏｌ／Ｌ
ほう酸 ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ１１．０
ｏ−ＣＰＣ（株式会社 同仁化学研究所） ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４９】
結果を表１３及び図１３に示す。ＡＤＰを添加しない場合のＣａ ＳＴＤ又はＭｇ ＳＴＤの吸光度変化は、それぞれ、４６６８及び５６８（単位：×１０４）であった。キレート発色剤としてｏ−ＣＰＣを用いた場合、ＡＤＰは、マグネシウム隠蔽効果を示さなかった。
【００５０】
《表１３》
ＡＤＰ濃度
[% (×1/1000)] 10 20 50 100 200 500
Ｃａ ＳＴＤ 4538 4508 4383 4230 3970 3620
Ｍｇ ＳＴＤ 588 570 579 571 563 583
【００５１】
《実施例３：クロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系におけるｐＨの検討》
一般式（Ｉ）で表される各化合物の濃度を、ＡＴＰで０．０５％、ピロリン酸で０．１％、トリポリリン酸で０．０１％、ポリリン酸で０．０１％、８−ヒドロキシキノリンで０．１％としたこと、そして、試薬のｐＨを５段階（ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５）としたことを除き、実施例１の操作を繰り返した。
【００５２】
結果を図１４〜図１９に示す。
ＡＴＰ、ピロリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸を添加した場合、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５のいずれのｐＨでも、マグネシウムの反応を抑え、かつカルシウムを測定することができることが判明した。また、これらの化合物を添加しなかったり、従来、一般的にマグネシウムのキレート剤として使用されている８−ヒドロキシキノリンを用いてもマグネシウムの反応を完全に抑えることができないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、臨床検査診断試薬分野におけるカルシウム測定の用途に適用することができる。本発明によれば、試薬を長時間保存しても安定であり、マグネシウムの干渉作用も抑えて正確にカルシウムを測定することが可能であり、臨床検査診断試薬分野で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＤＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図２】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＴＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図３】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のピロリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図４】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のトリポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図５】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図６】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度の８−ヒドロキシキノリン存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図７】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＤＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図８】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＴＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図９】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のピロリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のトリポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のポリリン酸存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】キレート発色剤としてアルセナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種濃度の８−ヒドロキシキノリン存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】キレート発色剤としてｏ−クレゾールフタレインコンプレクソンを用いるカルシウム測定系において、各種濃度のＡＤＰ存在下で、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（５７０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１４】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１５】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．０５％ＡＴＰ存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１６】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．１％ピロリン酸存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１７】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．０１％トリポリリン酸存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１８】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．０１％ポリリン酸存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１９】キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−IIIを用いるカルシウム測定系（０．１％８−ヒドロキシキノリン存在下）において、各種ｐＨにて、カルシウム標準水溶液及びマグネシウム標準水溶液の吸光度変化（６６０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤、及び（２）一般式（Ｉ）：
【化１】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩を含む、カルシウム測定試薬。
【請求項２】
2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を用いるカルシウム測定方法であって、一般式（Ｉ）：
【化２】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩の存在下で、被検試料と前記キレート発色剤との反応を実施することを特徴とする、前記カルシウム測定方法。
【請求項１】
（１）2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤、及び（２）一般式（Ｉ）：
【化１】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩を含む、カルシウム測定試薬。
【請求項２】
2,7-ビス（フェニルアゾ）-1,8-ジヒドロキシ-3,6-ナフタレンジスルホン酸系キレート発色剤を用いるカルシウム測定方法であって、一般式（Ｉ）：
【化２】
［式中、基Ｒ１は、水素原子又はヌクレオシド残基であり、ｎは２以上の整数である］で表される化合物又はその塩の存在下で、被検試料と前記キレート発色剤との反応を実施することを特徴とする、前記カルシウム測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２００７−３２２３３６（Ｐ２００７−３２２３３６Ａ）
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１５５０６４（Ｐ２００６−１５５０６４）
【出願日】平成１８年６月２日（２００６．６．２）
【出願人】（０００１３８２７７）株式会社三菱化学ヤトロン (30)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２日（２００６．６．２）
【出願人】（０００１３８２７７）株式会社三菱化学ヤトロン (30)
【Ｆターム（参考）】
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