キュウリ植物の収量を改善する方法
本発明は、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有するキュウリ育成系統の植物であって、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の種子の代表試料はＮＣＩＭＢ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄに受託番号ＮＣＩＭＢ４１５３２及び寄託者参照番号ＰＩ１６９３８３で寄託されており、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群４上の遺伝子移入であり、前記植物が前記遺伝子移入のない前記キュウリ育成系統の植物よりも高収量を示し、前記高収量とは植物１本当たりのより高い総果実重量を指す、キュウリ育成系統の植物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物育種に関し、より詳細には、本発明は、キュウリ植物の収量を改善する方法に関する。本発明は、さらに、作物収量の改善されたキュウリ植物、及びかかる植物の種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）は、世界的に主要な野菜作物であり、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ科の最も重要な作物種の１つである。キュウリは、野菜として、生で、調理して、又はピクルスにして食される。１００を超える変種が、ピクルス用の小さなものから薄切り用の大きなものまで楕円形の果実を実らせ、栽培品種は黄色又は褐色から濃緑色の範囲に及び得る。最近の栽培キュウリは、典型的には種無しであり、大部分の他の果実よりも栄養価が低いと一般に考えられているが、新鮮なキュウリは、良好なビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ９、Ｃ及びＫ並びにミネラル源である。大部分の温室品種は、受粉なしで結実し、開花に関して雌性型である（すなわち、雌花のみをつける）。
【０００３】
温室のキュウリの生産力は高い。それは、どの葉の基部にも１個以上の花が咲き、結実するからである。果実は、果実の長さ全体にわたって均一な直径を必要とする市場用の成熟度で収穫される。一般に、開花後１２から１５日で収穫又は市場に出せる時期になる。多数の作物と比較して、キュウリは早く収穫時期に達する。実際、キュウリの多くの変種は、播種から５０〜６０日後に収穫できるようになる。キュウリのつるは大量に果実をつけ、頻繁に（２から３日ごとに）収穫されるときに、特に果実が完熟する前に、新しい花の結実が促進され、収穫期間は１０から１２週間持続し得る。二毛作が最も一般的であるが、三毛作も採用される。
【０００４】
キュウリの収量は、収穫期間の長さ、個々の植物の空間的配置、採用される剪定法、利用可能な光、一般的な温度、個別の変種、並びに良好な栄養及び害虫管理に主に依存する。所与の面積の温室で栽培される植物の数は、日照条件及び植物の這わせ方によって決まる。葉の重なり及び隣接する植物による遮光は避けなければならないが、夏の日照条件は冬の条件よりも栽植密度を高くすることができる。キュウリ植物は、垂直又は傘状に這わせることができる。栽植密度は、一般に植物２本／ｍ２である。これらの変数を考慮すると、平均的な植物は、植物１本当たりキュウリ１０〜５０本／収穫期間を生産することができる。収穫真っ最中の傘状に這わせた作物では、収量は、植物１本当たり果実０．５〜１．５ｋｇ／週の範囲であり得る。
【０００５】
現行のキュウリハイブリッドの収量、特に果実ｋｇ／植物で表される収量を改善することは、最近のキュウリ栽培者の課題である。従来の育種方法は、これまで作物収量の大きな改善をもたらさなかった。例えば、米国におけるピクルス用キュウリの平均収量は、培養方法が改善され、収量及び耐病性について選抜されたために、１９６０〜１９８０年のほぼ２倍である。しかし、最近２０年間はさほど改善されていない。この問題を解決するには幾つかある道筋の１つをとることができる。
【０００６】
収量を改善する一方法は、栄養及び害虫の管理を更に改善することに基づく。しかし、最近の制御された生産環境では、これらのパラメータは、通常、最適化されている。
【０００７】
別の方法は、育成系統を改善するものである。植物育種家、特に種子会社は、「エリート系統」と一般に称されるエリート育成系統を使用して、一定品質の製品を提供する。エリート系統は、長年の同系交配の結果であり、高収量、高果実品質、及び害虫、病気又は非生物的ストレスに対する抵抗性などの複数の優れた特性を組み合わせる。これらのエリート系統の平均収量は、一般に、現代のキュウリの多くがその子孫である最初の野生（在来種）登録種（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ）よりもはるかに高い。エリート系統は作物として直接使用され、又はエリート系統を使用して、２つの（同型接合又は近交系）エリート系統間の交雑によって生産される、いわゆるＦ１、すなわち単交雑ハイブリッドを生産することができる。したがって、Ｆ１ハイブリッドは、２種類の親の遺伝的性質を組み合わせて単一植物にしたものである。ハイブリッドに付随する利点は、雑種強勢又はヘテロシスを示すことである。雑種強勢は、ハイブリッド植物がどちらの（近交系）親よりも成長し、より高収量を示すという十分に理解されていない現象である。
【０００８】
戻し交雑又は系統選抜は、育種家が、望ましい農業形質をそのエリート育成系統に追加する一方法である。この方法は、育成系統を望ましい形質を発現する系統と交雑させ、続いて該形質を発現する子植物を反復親と戻し交雑することを含む。その結果、育種計画における親としての個体の選抜は、その祖先の性能に基づく。かかる方法は、定性的遺伝形質、すなわちポジティブ又はネガティブにスコアされる形質のための育種に最も有効である。しかし、収量、早生、品質など、栽培者が関心のある多数の形質は、定量的に遺伝され、遺伝率が低い。適切な形質源の非存在下では、改善することができない。
【０００９】
循環選抜は、育成系統を改善する選択的育種方法であり、望ましい子孫の系統的な試験及び選抜と、それに続いて新しい集団を形成する選抜個体の組み換えを含む。循環選抜は、キュウリにおいて、収量などの遺伝率の低い量的形質を改善するのに有効であることが判明した。しかし、循環選抜は、育種計画において種々の形質の根底にある遺伝的基盤を増強せず、したがってその潜在能力は限られている。徐々にほんのわずかな改善がなされたにすぎない。
【００１０】
キュウリの収量を改善する更に別の方法が必要である。本発明の一目的は、作物収量の改善されたキュウリ植物を生産する方法を提供することである。本発明の別の一目的は、作物収量の改善された栽培キュウリ植物を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、特定の野生型キュウリ登録種が、キュウリの栽培品種の収量を改善する方法に使用できることを発見した。この発見は、ドナー植物としての野生型キュウリ（Ｃｕｃｕｍｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）登録種ＰＩ１６９３８３（図２参照）由来の染色体セグメントを、レシピエントとしての市販用キュウリハイブリッド（やはり、Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）の親のうちの１つの植物における対応する染色体位置に移入することによって開発された、遺伝子移入系（ＩＬ：ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅ）ライブラリーを調査したときにもたらされた。開発されたＩＬライブラリーのフェノタイピングによって、遺伝子移入系の幾つかの収量が著しい増加を示した。詳細なマッピング研究によって、改善された収量特性が連鎖群４におけるＰＩ１６９３８３由来の３個のセグメントに関連することが明らかになった。栽培キュウリ植物の対応する染色体におけるこれらのセグメントの遺伝子移入は、前記栽培キュウリ植物の子孫において収量の増加をもたらした。遺伝子移入セグメントは、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｉｔ Ｌｏｃｉ）として特徴づけることができ、キュウリのゲノムにおけるこれらのＱＴＬの位置は、７種類のＡＦＬＰマーカーによって規定された。遺伝子移入の更なるフェノタイピングは、異型接合的状況及びハイブリッド状況で実施された。結果を下記実施例に示す。
【００１２】
この知見に基づいて、本発明者らは、改善された収量に関連した望ましい表現型特性のための新規遺伝的基盤を提供する。この遺伝的基盤は、野生型キュウリ（Ｃｕｃｕｍｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）登録種ＰＩ１６９３８３に存在するものである。
【００１３】
高収量の表現型特性の根底にある遺伝子又は原因配列は（まだ）特定されていないが、遺伝子又は原因配列のゲノム位置（すなわち、座）が決定された。これは、遺伝子又は制御配列が所望のキュウリ育成系統に導入される育種プロセスを促進する。
【００１４】
第１の態様においては、本発明は、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有するキュウリ育成系統の植物であって、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群３及び／又は４上の遺伝子移入であり、前記植物が前記遺伝子移入のない前記キュウリ育成系統の植物よりも高収量を示す、キュウリ育成系統の植物を提供する。好ましくは、前記高収量とは、植物１本当たりのより高い総果実重量を指す。
【００１５】
例として、本発明者らは、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の植物を遺伝子移入のドナー系統として、キュウリ系統Ｐｙｒ４２の植物と交雑させた。キュウリ系統Ｐｙｒ４２の種子の代表試料は、ＮＣＩＭＢ、スコットランド、アバディーンに受託番号ＮＣＩＭＢ４１５９４及び寄託者参照番号Ｐｙｒ４２で寄託されている。生成した子孫を、Ｐｙｒ４２を反復親として用いて戻し交雑させた。本明細書では収量改善ＱＴＬと称する遺伝子移入を含む植物は、前記遺伝子移入のないＰｙｒ４２系統の植物よりも高収量の植物を生成することが見いだされた。
【００１６】
本発明の態様においては、収量増加は、好ましくは、植物１本当たりの総果実重量が、前記遺伝子移入のない前記キュウリ育成系統の植物に比べて、少なくとも３〜５％、より好ましくは少なくとも１０％増加するようなものである。
【００１７】
植物１本当たりの総果実重量とは、好ましくは、１収穫期間に植物１本で生産される販売可能な果実の総重量を表すものとする。キュウリは、販売重量で収穫され、販売重量の多数の果実をつける植物は、販売重量未満の多数の果実をつける植物よりも有利である。販売可能な果実の重量は、キュウリのタイプに応じて決まる。薄切り用及びベイトアルファ（Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａ）は、ピクルス用よりも販売可能な果実の重量が大きい。好ましくは、本発明では収量増加とは、薄切り用、Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａ及び長いキュウリ（Ｌｏｎｇ Ｄｕｔｃｈ又はヨーロッパ温室キュウリ）、最も好ましくは長いキュウリの収量増加を指す。本発明の好ましいキュウリ果実は、２６、最も好ましくは２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５ｃｍの長さである。本発明の植物の果実の長さ／直径比は、好ましくは４、５、６、７、８、９以上、例えば２５である。本発明の植物の販売可能な果実の重量は、好ましくは１５０〜９００ｇ、より好ましくは２００〜８００ｇ、更により好ましくは２５０〜６００ｇである。典型的な販売可能な果実の重量は、キュウリのタイプに大きく左右され得る。Ａｍｅｒｉｃａｎ薄切り用の場合、販売可能な果実の重量は約１５０〜２３０ｇであるが、ヨーロッパ温室キュウリの場合、販売可能な果実の重量は典型的には約３００〜７００ｇである。Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａの場合、販売可能な果実の重量は約９０〜２００ｇである。典型的には、Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａキュウリは長さ１２〜１８ｃｍである。ピクルス用タイプの場合、販売可能な果実の重量は約８０〜１１０ｇである。典型的には、ピクルス用キュウリは長さ９〜１２ｃｍである。これらの果実重量は商業的育成条件下で得られ、植物は最適性能のために剪定及び収穫される。かかる条件下で、本明細書で企図される販売可能な果実の重量に達する。
【００１８】
好ましい一実施形態においては、本発明によるキュウリ育成系統の植物は、本質的に、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の特定の遺伝子移入を獲得し、前記遺伝子移入は、高収量に関連したＱＴＬを含む連鎖群３及び／又は４上に位置する。遺伝子移入を受けた植物は、同じドナーから別の遺伝子移入を得ることもあるが、大多数のレシピエントゲノムが不変であり、その結果、育成系統植物の表現型が本質的に保存されることが好ましい。これは、ＰＩ１６９３８３系統の植物をキュウリ育成系統の植物と単に交雑させるだけでは、本明細書に定義された収量ＱＴＬの遺伝子移入が得られず、一組みのＰＩ１６９３８３由来の染色体と前記キュウリ育成系統の植物由来の別の染色体とを有するハイブリッドが生成するにすぎないので、達成することができない。代わりに、ＰＩ１６９３８３における収量増加に関連した連鎖群３及び／又は４上のセグメントは、キュウリ育成系統の植物を交雑させることと、それに続いて自家受粉及び／又は（反復親として前記キュウリ育成系統の別の植物に）戻し交雑すること、並びに遺伝子移入を有する前記自家受粉及び／又は戻し交雑の子孫集団からマーカー利用選抜を使用して植物を選抜することの１つ以上のステップとによって、キュウリ育成系統の植物のゲノムに移入することができる。
【００１９】
好ましい一実施形態においては、連鎖群３及び／又は４上の前記遺伝子移入は、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連したセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連したセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連したセグメント
からなる群から選択される連鎖群４上の少なくとも１個のセグメント、及び／又は
連鎖群３の染色体置換
を含む。
【００２０】
遺伝距離は、図１でセンチモルガンで示し、表示され、検討中の集団に対して決定された。これらの値は、別の集団では異なり得る。したがって、マーカー自体がＱＴＬの位置を最適に規定する。図は、高収量に関連したセグメントを規定しないマーカーも示す。
【００２１】
前記遺伝子移入を有するキュウリ育成系統の植物は、系統をますます純粋又は近交系にするために、反復親に戻し交雑する連続ステップによって、エリート系統にすることができる。したがって、本発明は、高収量を有するエリート系統も提供する。前記エリート系統は、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有し、前記遺伝子移入は、収量増加に関連した連鎖群３及び／又は４上の遺伝子移入である。
【００２２】
別の一態様においては、本発明は、本発明のキュウリ育成系統の植物を交雑又は自家受粉させることによって生産されるキュウリ種子を提供する。好ましくは、前記種子はハイブリッド種子、特にＦ１ハイブリッド種子である。かかるハイブリッド種子は、例えば、本発明の２つのエリート系統を交雑させることによって生産することができる。
【００２３】
別の一態様においては、本発明は、本発明の種子を育成することによって生産されるキュウリ植物を提供する。別の一態様においては、本発明は、この植物の植物部分を提供する。好ましくは、前記植物部分はキュウリ果実又は種子である。
【００２４】
別の一態様においては、本発明は、上記キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する本発明のキュウリの育成系統（好ましくは、エリート系統）の植物を別のキュウリ植物と交雑させ、得られるハイブリッドキュウリ種子を収穫することを含む、ハイブリッドキュウリ種子を生産する方法を提供する。好ましい一実施形態においては、前記別のキュウリ植物は、キュウリの育成系統の植物、より好ましくは（異なる）エリート系統の植物である。前記別のキュウリ植物は、好ましくは、上記キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する植物である。
【００２５】
別の一態様においては、本発明は、本発明の方法によって生産されるハイブリッドキュウリ種子を提供する。このハイブリッドキュウリ種子は、上記キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入をキュウリの育成系統（好ましくは、エリート系統）のゲノムバックグラウンド中に異型接合的又は同型接合的に含み、前記遺伝子移入が好ましくは上記ＡＦＬＰマーカーによって規定されることを特徴とする。このハイブリッド種子は、発芽すると、本発明のキュウリの育成系統（好ましくは、エリート系統）の前記植物と上記別のキュウリ植物との正常な交雑種の全特性を有する（すなわち、かなりの商品価値のある販売可能な果実をつける）ハイブリッドキュウリ植物をより高収量で与える。同型接合植物と異型接合植物のどちらも本発明の一部である。というのは、収量特性は、相加的特徴であり、異型接合植物でも発現するからである。
【００２６】
別の一態様においては、本発明は、本発明のハイブリッドキュウリ種子を育成することによって生産されるハイブリッドキュウリ植物を提供する。
【００２７】
別の一態様においては、本発明は、本発明のハイブリッドキュウリ植物の植物部分を提供する。
【００２８】
別の一態様においては、本発明は、キュウリ育成系統の植物の収量を改善する方法を提供する。前記方法は、
ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記キュウリ育成系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合であるキュウリ育成系統の植物を生産するステップと
を含む。
【００２９】
かかる方法の好ましい一実施形態においては、前記キュウリ育成系統はエリート系統である。
【００３０】
別の一態様においては、本発明は、Ｆ１キュウリハイブリッドの収量を改善する方法を提供する。前記方法は、
ａ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの少なくとも第１の親系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの前記親系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合である前記Ｆ１キュウリハイブリッドの親系統を生成するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記親系統を、高収量を有するＦ１ハイブリッドの生産のための親系統として使用するステップと
を含み、ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜はマーカー利用選抜によって実施される。
上記方法の好ましい実施形態においては、マーカー利用選抜手順は、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に対する選抜を含む。
【００３１】
更に別の一態様においては、本発明は、本発明による方法によって得られるキュウリ育成系統又はＦ１キュウリハイブリッドを提供する。更に別の一態様においては、本発明は、キュウリにおける高収量に関連したＱＴＬを含む単離核酸配列を提供する。前記ＱＴＬは、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント
によって規定される。
【００３２】
更に別の一態様においては、本発明は、キュウリ植物における高収量に関連したＱＴＬの検出のための、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２からなる群から選択される遺伝マーカーの使用を提供する。
【００３３】
更に別の一態様においては、本発明は、キュウリ植物、又は種子を含めたその部分を選抜する方法であって、
（ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させ、前記交雑から種子を得、前記種子を子植物に育成することによって、子孫キュウリ植物又はその部分を生産するステップと、
（ｂ）キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入セグメントの存在について前記子孫キュウリ植物又はその部分を試験し、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の種子の代表試料がＮＣＩＭＢ、スコットランド、アバディーンに受託番号ＮＣＩＭＢ４１５３２及び寄託者参照番号ＰＩ１６９３８３で寄託されており、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群４上の遺伝子移入であるステップと、
（ｃ）前記試験から得られる情報に基づいて前記子孫キュウリ植物又はその部分を選抜するステップと、
（ｄ）場合によっては、更なる育種を考慮するために前記情報を使用するステップと
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】連鎖群４（全長１００．１ｃＭ）の遺伝地図である。マーカーの識別情報及びそのそれぞれの相対的位置を示し、収量に対する効果を有する（＋）又は持たない（−）（左側に示した）遺伝子移入セグメントとの関連も示す（表２と比較されたい。）。収量に対して効果を有することが見いだされた連鎖群４上の３個のセグメントを図の下に「＋」で示す。
【図２】（左側、「ＩＬ０６ＡＢ」によって示される）実用品種に近いＩＬ、及び（右側、「ドナー０６ＡＢ」によって示される）ドナーＰＩ１６９３８３から得られる果実の写真である。果実は、植物の一わきの下（ａｒｍｐｉｔ）から収穫される。
【図３】本明細書に定義されたプライマー組合せＥ１２／Ｍ２４を用いて増幅された、（４７レーンの各々で異なる）選抜されたキュウリ植物のゲノムのＡＦＬＰパターンを示す、ＡＦＬＰゲルの部分的（切り抜き）画像である。長さ１７６及び１７７塩基対の断片は、隣接する矢印（左）で示され、両アレルマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２／Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１を示す。ゲルは上から下に泳動された。
【図４】本明細書に定義されたプライマー組合せＥ１１／Ｍ６２を用いて増幅された、（４９レーンの各々で異なる）選抜されたキュウリ植物のゲノムのＡＦＬＰパターンを示す、ＡＦＬＰゲルの部分的（切り抜き）画像である。マーカーＥ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１を示す２００塩基対の断片を矢印で示す（左）。
【図５】Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓの染色体３（連鎖群３）の連鎖地図である。本願は、染色体３の染色体置換の使用も企図する。かかる置換系統においては、連鎖群３におけるマーカーによって特徴づけられる染色体を除いて、すべての核ＤＮＡが反復親から生ずる。好ましくはユニークであり遺伝的に連鎖した、連鎖地図に記されたマーカーに関連するすべてのＤＮＡがドナー親ＰＩ１６９３８３から生ずる。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書では「キュウリ」という用語は、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｈａｒｄｗｉｃｋｉｉ（Ｒｏｙｌｅ）又はやせ細ったキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ又は栽培キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（中国群）又は網目模様の黄色キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．（ガーキン群）又はピクルス用キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（インド群）又は白縞キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（日本群）又は日本キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（レバノン群）又はレバノンキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（ロシア群）又はロシアキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（種無し群）又は種無しキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（標準群）又は普通のキュウリ／温室キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ Ｈｏｏｋ．ｆ．又は褐色網目模様のキュウリ、及びＣｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｘｉｓｈｕａｎｇｂａｎｎａｎｅｓｉｓ ｉｎｅｄ又はシーサンパンナウリを含めて、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．種を指す。植物学的には、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．という名称は、野生種を指すが、種子及び野菜の取引では、分類学者が栽培品種に適用し得る任意のより長い植物名の同義語として使用される。「Ｃ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ」は、ＵＳＤＡ ＧＲＩＮデータベースに入力されたほぼ１５００の登録種に基づいて、一般に使用される。しかし、分類学者は植物学的変種「ｖａｒ．」と称する栽培植物を認めないので、この名称は将来変わり得る。「キュウリ」という用語は、（アメリカ及びヨーロッパ）ピクルス用、（アメリカ及びヨーロッパ）薄切り用、ヨーロッパ温室（単為結実）、中東（Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａタイプ）、及び東洋つる棚（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｒｅｌｌｉｓ）バープレス（Ｂｕｒｐｌｅｓｓ）キュウリという表現を含む。ヨーロッパ、アメリカ、中東又は東洋という用語は、本発明のキュウリの地域的起源又は産地を限定するものではなく、単にキュウリ育種分野において市場タイプの一般に使用される参照にすぎない。
【００３６】
Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ登録種ＰＩ１６９３８３は、アメリカ、アイオワ州エイムスのＮｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ（ノース・セントラル・リージョナル・プラント・イントロダクション・ステーション）（ＵＳＤＡ，ＡＲＳ，ＮＣＲＰＩＳ，Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（アイオワ州立大学），Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ）によって維持され、この登録種の種子は、自由に配布することができる。この登録種は、生物学的状態「野生型」を有する。この植物学的変種は、トルコのイスタンブールで最初に収集された。その果実は、熟すと典型的な黄色を帯びる。低収量であり、一般的には緑色果実が要求されることから、商品価値が限られる。本発明の植物に言及するときには、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３への言及は意図されず、したがってかかる植物は本発明から除かれる。この登録種についての更なる情報は、Ｏｎｌｉｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ（生殖質資源情報ネットワークのオンライン・データベース）（ＧＲＩＮ），ＵＳＤＡ，ＡＲＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（国立遺伝資源プログラム）．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（国立生殖質資源研究所），メリーランド州ベルツビル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｓ−ｇｒｉｎ．ｇｏｖ）（２００７年８月８日））から入手することができる。キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の種子の代表試料は、ＮＣＩＭＢ、スコットランド、アバディーンに本願の出願人／譲受人によって２００７年１２月１７日に受託番号ＮＣＩＭＢ４１５３２及び寄託者参照番号ＰＩ１６９３８３で寄託された。
【００３７】
本明細書では「交雑」という用語は、雄株（又は配偶子）による雌株（又は配偶子）の受精を指す。「配偶子」という用語は、植物において配偶体から有糸分裂によって産生され、有性生殖に関与する、半数体生殖細胞（卵又は精子）を指す。有性生殖中には、異性の２個の配偶子が融合して二倍体接合子を形成する。この用語は、一般に、（精細胞を含めた）花粉及び（卵子を含めた）胚珠という表現を含む。したがって、「交雑」は、一般に、別の個体の花粉による１個体の胚珠の受精を指すのに対して、「自家受粉」とは、同じ個体の花粉による１個体の胚珠の受精を指す。ゲノム領域又はセグメントの遺伝子移入を行う状況において交雑に言及するときには、一植物の染色体の一部のみを別の植物の染色体に移入するために、両方の親系統のゲノムの無作為部分が親系統における配偶子の生成において交差現象の発生によって交雑中に組み換えられる必要があることを当業者は理解するであろう。したがって、両方の親のゲノムは単細胞中で交雑によって結合しなければならず、前記細胞からの配偶子の生成、及び受精におけるその融合後、遺伝子移入現象をもたらす。
【００３８】
本明細書では「ハイブリッド」という用語は、２つの遺伝的に異なる個体間の交雑種の任意の子孫を意味し、より好ましくは、この用語は、種子から親の形質どおりに再生しない、２つの（エリート）育成系統間の交雑種を指す。本発明のハイブリッドキュウリは、好ましくは、強い雌性を示す。
【００３９】
本明細書では「育成系統」という用語は、商業的に価値がある又は農学的に望ましい諸特性を有する栽培キュウリの系統を指し、野生型品種又は在来種と対比される。特に、育成系統は、優れた果実品質（まっすぐな円柱状のずんぐりした形状及び均一な濃緑色）を有することを特徴とする。この用語は、Ｆ１ハイブリッドの生産に使用される、本質的に同型接合的な、通常は近交系の、植物系統である、エリート育成系統又はエリート系統という表現を含む。本発明の育成系統は、好ましくは、ウドンコ病抵抗性を示す。
【００４０】
本明細書では「収量」という用語は、果実収量（キュウリ）を指し、畑１ｍ２当たりの総果実重量（ｋｇ）／収穫期間、植物１本当たりの総果実重量（ｋｇ）／収穫期間、及びその組合せで表される生産量を指し得る。「収穫期間」という用語は、最初の販売可能な果実の生産から作物の活性化が必要な生産期の最後までの期間を指し、一般に温室のキュウリでは約１２週間である。
【００４１】
本明細書では「対立遺伝子（単数又は複数）」という用語は、遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれかを意味し、対立遺伝子のすべてが少なくとも１つの形質又は特性に関係する。二倍体細胞又は生物体においては、所与の遺伝子の２個の対立遺伝子は、１対の相同染色体上の対応する座を占める。本発明はＱＴＬ、すなわち１個以上の遺伝子だけでなく制御配列も含み得るゲノム領域に関するので、場合によっては、「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）と称する方がより正確である。しかし、その場合、「対立遺伝子」という用語は、「ハプロタイプ」という用語を含むと理解すべきである。
【００４２】
「遺伝子」は、染色体上の特定の位置を占め、かつ植物における特定の表現型特性又は形質に対する遺伝的指令を含む、（ＤＮＡ配列によって示されることが多い）遺伝単位として本明細書では定義される。ＱＴＬ（量的形質遺伝子座）は、染色体上の特定の位置を占め、かつ植物における特定の表現型特性又は形質に対する遺伝的指令を含む、（１個以上の分子ゲノムマーカーによって示されることが多い）遺伝単位である。遺伝子とは対照的に、ＱＴＬの正確な境界は知られていないが、遺伝子マッピングの分野で周知であるファインマッピング技術と、それに続くＤＮＡ塩基配列決定ルーチンを使用して、当業者が過度の負担なしに見つけることができる。ＱＴＬは、その発現が、単独で若しくは別の遺伝子と組み合わせて、発現される表現型形質をもたらす少なくとも１個の遺伝子をコードし、又はその発現が、単独で若しくは別の遺伝子と組み合わせて、発現される表現型形質をもたらす少なくとも１個の遺伝子の発現を制御する少なくとも１個の調節領域をコードする。ＱＴＬは、１個以上の分子ゲノムマーカーを使用して、ＱＴＬを含む遺伝子移入のドナーのゲノムにおけるその遺伝子位置を示すことによって規定することができる。１個以上のマーカーは、特定の座を示す。各座間の距離は、通常、同じ染色体上の座の交差頻度によって測定される。２個の座が遠く離れているほど、それらの交差が起こる可能性は高くなる。逆に、２個の座が近いと、それらの交差が起こる可能性は低くなる。概して、１センチモルガン（ｃＭ）は、座（マーカー）間の１％の組み換えに等しい。ＱＴＬを複数のマーカーによって示すことができるときには、終点マーカー間の遺伝距離がＱＴＬサイズを示す。ＱＴＬを規定するマーカーは、ＱＴＬと連鎖したマーカー、又はＱＴＬと連鎖不平衡にあるマーカーであり得る。
【００４３】
本明細書では「分子ゲノムマーカー」又は簡潔に「マーカー (Marker)」という用語は、核酸配列の特性差を可視化する方法に使用される指標を指す。かかる指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、挿入変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴的（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）増幅領域（ＳＣＡＲ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ：ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー、又は特定の遺伝子及び染色体位置を規定する本明細書に記載のマーカーの組合せである。したがって、本明細書に定義された「ＱＴＬと連鎖した分子マーカー」とは、ＳＮＰ、挿入変異、及びより一般的なＡＦＬＰマーカー、又は同分野で使用される任意の他のタイプのマーカーを指し得る。本明細書で名前を挙げるＡＦＬＰマーカーに関して、ＡＦＬＰマーカーは、２個のＡＦＬＰプライマーが隣接するキュウリ特異的ＤＮＡ配列を示し、ＡＦＬＰプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩの切断部位と合致する「コアプライマー」Ｅ及びＭからなり（Ｖｏｓ（ヴォス）等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）２３：４４０７−４４１４；Ｂａｉ（バイ）等、２００３，Ｍｏｌ．ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（モレキュラー・プラント・マイクロープ・インタラクション） １６：１６９−１７６）、示した２又は３個の余分な選択塩基が続き、各々「コアプライマー」が伸長される選択ヌクレオチドを特定する２桁のコードが続く（１１：ＡＡ；１２：ＡＣ；１３：ＡＧ；１４：ＡＴ；１５：ＣＡ；１６：ＣＣ；１７：ＣＧ；１８：ＣＴ；２１：ＧＧ；２２：ＧＴ；２４：ＴＣ；２５：ＴＧ；６０：ＣＴＣ；６２：ＣＴＴ）。したがって、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２は、全長６３ｂｐの断片を生成する増幅プライマーＥｃｏＲＩ＋ＡＣ及びＭｓｅＩ＋ＴＣを用いて得られるマーカーを表す。断片の長さは、断片の検出に使用される方法に依存し得、その真の長さ±少数塩基の近似値である。本明細書に記載のマーカーを規定する際には、染色体上の該マーカーの位置を連鎖地図中の別のマーカーに対して表記すべきである。したがって、マーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２は、そのプライマー配列、及び増幅産物としてのその長さと、図１においてｃＭ単位の対応する距離で示されるＥ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１及び／又はＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２に対するその位置、又は本明細書に記載のように、別のマーカーに対するその位置との両方で定義される。
【００４４】
「座」は、所与の植物種の染色体上の所与の遺伝子が占める位置として本明細書では定義される。
【００４５】
本明細書では「異型接合」という用語は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する座に存在するときの遺伝子状態を意味する。
【００４６】
本明細書では「同型接合」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する座に存在するときの遺伝子状態を意味する。
【００４７】
本明細書では「遺伝子移入系」という用語は、ＩＬと略記され、他の点では均一なバックグラウンドにおいてドナー親から生ずる明確な染色体セグメント（好ましくは、マーカー分解能に応じた単一の明確な染色体セグメント）を収容し、典型的には９５％を超えるレシピエントゲノム（通常、レシピエント及び反復親として使用される育成系統のゲノム）を含む系統を指す。（ドナーのゲノム全体を一緒に網羅する）ＩＬライブラリー中の異なるＩＬと反復親の表現型変異は移入セグメントに直接関連するので、ＩＬはＱＴＬの特定を容易にする。遺伝子移入系は、典型的には同型接合的である。
【００４８】
本明細書では「純粋近交系」又は「近交系」という用語は、自家受粉の繰り返しによって得られる実質的に同型接合的な植物又は植物系を指す。
【００４９】
「組み換え現象」とは、減数分裂交差現象を指す。
【００５０】
本明細書では「遺伝子移入」という用語は、個体、種、変種又は栽培変種を交雑させることによって、一個体、種、変種又は栽培変種から別の個体、種、変種又は栽培変種のゲノムに移動した、ゲノムセグメントを指す。
【００５１】
本明細書では「移入すること」、「移入する」及び「移入された」という用語は、個々の遺伝子又は形質全体が、種、変種又は栽培変種を交雑させることによって、一個体、種、変種又は栽培変種から別の種、変種又は栽培変種のゲノムに移動する、自然と人工プロセスの両方を指す。植物育種においては、プロセスは、通常、移入された遺伝子又は形質に加えて反復親の特性を本質的に有するますます同型接合的な植物を規定する、自家受粉又は反復親への戻し交雑を含む。
【００５２】
「戻し交雑」という用語は、２つの親系統間の交雑から得られる植物をその親系統の一方と交雑させるプロセスを指し、戻し交雑に使用された親系統を反復親と称する。戻し交雑を繰り返すと、ゲノムはますます同型接合的又は近交系になる。
【００５３】
「自家受粉」という用語は、個体がそれ自体の花粉で授粉又は受精する自家受精プロセスを指す。
【００５４】
「遺伝子操作」、「形質転換」及び「遺伝子改変」はすべて、別の生物体のＤＮＡ、通常は染色体ＤＮＡ又はゲノムへの単離及びクローン化された遺伝子の移行の同義語として本明細書では使用される。
【００５５】
本明細書では「分子マーカー」という用語は、核酸配列の特性差を可視化する方法に使用される指標を指す。かかる指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライトマーカー（例えば、ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）マーカー、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー、又は特定の遺伝子及び染色体位置を規定する本明細書に記載のマーカーの組合せである。
【００５６】
本明細書では「植物部分」という用語は、植物中で損なわれていない植物細胞などの単細胞及び細胞組織、細胞塊、並びにキュウリ植物を再生することができる組織培養物を含めて、キュウリ植物の一部を指す。植物部分の例としては、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、やく、花、果実、茎 苗条及び種子の単細胞及び組織、並びに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、やく、花、果実、茎、苗条、若枝、台木、種子、プロトプラスト、カルスなどが挙げられるが、それだけに限定されない。本発明の植物部分は、本発明の態様においては、生及び／又は加工された形態で使用することができる。
【００５７】
本明細書では「集団」という用語は、共通の遺伝的起源を有する植物の遺伝的に異質なコレクションを意味する。
【００５８】
本明細書では「変種」という用語は、構造又は遺伝的な特徴及び／又は性能によって同じ種内の別の変種から識別することができる類似植物の群を指す。
【００５９】
（栽培品種を表す）「栽培変種」という用語は、通常は天然に存在しないが、ヒトによって栽培された、すなわち「野生型」状態以外の生物学的状態を有する、変種を意味するのに本明細書では使用される。「野生型」状態は、植物又は登録種の最初の栽培されていない状態、すなわち自然状態を示す。「栽培変種」という用語は、半自然、半野生、やせ細った、伝統的栽培変種、在来種、育種材料、研究材料、ブリーダー系（ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓ ｌｉｎｅ）、合成集団、ハイブリッド、創始者株（ｆｏｕｎｄｅｒ ｓｔｏｃｋ）／基礎集団、近交系（ハイブリッド栽培変種の親）、分離集団、変異体／遺伝株、及び進化した／改善された栽培変種を含むが、それだけに限定されない。
【００６０】
「エリートバックグラウンド」という用語は、ＱＴＬ又は遺伝子移入の遺伝的背景が育成系統の遺伝的背景であることを示すのに本明細書では使用される。本明細書では、自然バックグラウンドは、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の遺伝的背景である。キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の連鎖群（染色体）４から育成系統の植物の染色体４上の同じ位置へのＱＴＬを含むＤＮＡの移行を含む方法は、ＱＴＬがその天然の遺伝的背景ではなくエリートバックグラウンドに存在する結果になる。この用語は、異型接合的状況と同型接合的状況の両方を含む。
【００６１】
好ましい実施形態の説明
【００６２】
より高収量の植物の生産
【００６３】
本明細書で確認される遺伝子移入の効果は、果実重量の高収量である。これは、多数の果実間の関係が研究されたＳｈｅｔｔｙ（シェティ）等（Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ（クロップ・サイエンス） ４２：２１７４−２１８３（２００２））による刊行物とは対照的である。Ｓｈｅｔｔｙ等は、ＰＩ１６９３８３の実際の収量データを開示せず、その性能について単に結論を下しているだけである。さらに、Ｓｈｅｔｔｙ等は、晩生、低収量、雌性型近交系のＰＩ１６９３８３を含めた遺伝子バンク登録種を比較した。近交系の１つは、例えばＷＩ２７５７であった。ＷＩ２７５７は、１ｈａ当たり２７．０００個の販売可能な果実をつけ（Ｓｈｅｔｔｙ等、表５）、これは１平方メートル当たり２．７個の販売可能な果実に等しい。それに対して、今回の試験のＰＩ１６９３８３は、１平方メートル当たり３．４個の販売可能な果実をつけることが判明したが、今回の試験に使用した近交系は、はるかに高い収量を示し、１平方メートル当たり約７個以上の販売可能な果実をつける。Ｓｈｅｔｔｙ等は、その実験設定の結果として、ＰＩ１６９３８３をより高収量の登録種であると考えた。しかし、通常の高収量近交系と比較して、ＰＩ１６９３８３は、植物１本又は１ｍ２当たりの果実重量、さらに、植物１本当たりの果実数の点で低収量登録種である。これは、本発明の実施例に記載のデータによって強調される。そのデータは、Ｓｈｅｔｔｙ等の観察を適切にとらえ、ＰＩ１６９３８３が栽培キュウリと比較しても少ない果実をつけることを示している。しかし、ＰＩ１６９３８３がキュウリの数によって高収率を示すと考えられるとしても、ＰＩ１６９３８３が、重量の点で高収量をもたらす遺伝子領域を含むことは依然として予想外である。結局、数量と重量の負の相関は、植物育種にはつきものである。一例を下記図２に示す。図２は、ドナー系統ＰＩ１６９３８３が多数の小さいキュウリを房につけるのに対して、遺伝子移入系（ＩＬ）がそれより少ない大きい果実を房につけることを示している。別の周知の例としては、果実サイズがかなり異なるにもかかわらず、サクランボ対ビーフステークトマトからの等重量の収量が挙げられる。したがって、任意の高重量収量遺伝子移入が、高数量収量を示すと報告されたＰＩ１６９３８３に由来し得ることは予想外であった。
【００６４】
キュウリ育種においては、数量収量と重量収量は、別々に考慮される形質である。果実１個当たりの重量は、市場の要件によって決まる固定値であり、重量の高収量は、（小さいキュウリの）数の高収量よりも重要である。
【００６５】
本発明者らは、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３において、高収量に関連した遺伝子又は制御配列が連鎖群４上に存在することを発見した。Ｈｏｒｅｊｓｉ（ホジエイシ）等、（２０００）によれば、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌの連鎖群４は、べと病（ｄｍ）抵抗性に対する抵抗性の遺伝子も含む。ＬＧ４は、さらに、以下の周知のマーカーの１種類又は組合せを特徴とし得る：１）ＣＳＣ４４３／Ｈ３（ＲＦＬＰマーカー、Ｂｒａｄｅｅｎ（ブラディーン）等、２００１，Ｇｅｎｏｍｅ（ゲノム） ４４：１１１−１１９）、２）ＢＣ５５１．５５０（ＲＡＰＤマーカー、Ｐａｒｋ（パーク）等、２０００，Ｇｅｎｏｍｅ ４３：１００３−１０１０）、３）ＰＥＲ（アイソザイム、Ｂｒａｄｅｅｎ等、上掲）。
【００６６】
最終的な染色体番号（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｎｕｍｂｅｒ）は、高収量用ＱＴＬが位置するキュウリ染色体にまだ割り当てられていない。しかし、染色体は、これら及び別のゲノム領域が位置する連鎖群（ＬＧ４）を参照して明示することができる。連鎖群という用語は、収量改善を与える対立遺伝子が位置し、染色体と同じ階層レベルを有する、物理的ゲノム単位を指すのに本明細書では使用される。
【００６７】
第１の方法は、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の植物から目的キュウリ系統の植物に高収量用ＱＴＬを移入することを含む。これは、ＱＴＬが目的キュウリ系統の遺伝的背景に存在する状況をもたらす。子植物における適切な遺伝子移入の確立は、ＱＴＬ特異的マーカーを使用することによってモニターすることができる。
【００６８】
組み換えは、減数分裂中の２個の相同染色体間の情報交換である。組み換え植物では、染色体内の特定の位置に最初に存在するＤＮＡは、別の植物のＤＮＡと（すなわち、母性は父性と、又は父性は母性と）交換される。必要な材料のみを交換し、染色体上の価値ある最初の情報をできるだけ維持するために、通常は２回の交差現象を必要とする。かかる組み換えを見いだす通常の方法は、Ｆ２植物集団をスクリーニングすることである。この集団は、まれな（低頻度の）二重組み換えを検出するために、十分なサイズでなければならない。組み換え頻度は以下のように計算することができる。例えば、１０ｃＭ領域における組み換えは、１０％の頻度で見つけることができる（１センチモルガンは、検定交雑における１％の組み換え子孫として定義される。）。
【００６９】
本発明は、今回、マーカー利用選抜（ＭＡＳ：ｍａｒｋｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のより良好なモデルを規定する。したがって、本発明は、植物育種方法に関し、さらに、植物、特にキュウリ植物、特に育種計画に使用される育種植物としての栽培キュウリ植物、又は本明細書では農学的に望ましい植物とも称する、価値あるキュウリ果実の生産に特に関連した、所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を有するための栽培キュウリ植物を選抜する方法に関する。ここで、栽培植物は、所望の遺伝子型又は潜在的表現型特性を有するために農業又は園芸作業において意図的に選抜された植物、又は意図的に選抜された植物に由来する植物、特に同系交配によって得られる植物として定義される。
【００７０】
収量改善ＱＴＬは相加的形質であるので（ハイブリッドは、２種類の親の中間的な表現型を発現する。）、収量改善ＱＴＬはＦ１又はＢＣ１において植物収量を測定することによってモニターすることができる。しかし、これは管理条件下では多数の栽培週間を必要とするので、子植物における適切な遺伝子移入の確立を、以下に説明するシス又はトランスカップリングにおいて、本明細書に記載のＱＴＬ特異的マーカーを使用することによってモニターできることが特に有利である。したがって、ＭＡＳ又はＭＡＢ法を使用することによって、植物を選抜する方法が当業者に提供される。
【００７１】
したがって、本発明は、高収量を示すＣｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ種の植物を選抜する方法であって、前記植物において、本明細書に定義された収量改善ＱＴＬの連鎖群（染色体）４上の存在を検出することを含む、方法も提供する。かかる植物を選抜する本発明の好ましい方法において、該方法は、
ａ）キュウリ植物からゲノムＤＮＡの試料を作製すること、
ｂ）前記ゲノムＤＮＡ試料において収量改善ＱＴＬと連鎖した少なくとも１個の分子マーカーを検出すること
を含む。
【００７２】
キュウリ植物からゲノムＤＮＡの試料を作製するステップは、当分野で周知である標準ＤＮＡ単離方法によって実施することができる。
【００７３】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、好ましい一実施形態においては、ＡＦＬＰ法に使用された１セットの双方向性プライマーを使用してＱＴＬ用マーカーである増幅産物を産生することを含むことができる。かかる１セットのプライマーを、本明細書ではＡＦＬＰマーカーを規定するプライマー、又はマーカー特異的プライマーと称する。双方向性とは、プライマーの方向が、核酸増幅反応において、一方は順方向プライマーとして機能し、一方は逆方向プライマーとして機能するようなものであることを意味する。
【００７４】
あるいは、分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、別の好ましい一実施形態においては、前記分子マーカーを規定する核酸配列に実質的に相補的である塩基配列を有する核酸プローブの使用を含むことができる。この核酸プローブは、前記分子マーカーを規定する核酸配列と厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する。適切な核酸プローブは、例えば、マーカーに対応する一本鎖の増幅産物とすることができる。
【００７５】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、前記ゲノムＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、前記ＱＴＬを検出することも含むことができる。これは、１セットのマーカー特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応を実施することによって適切に行うことができる。好ましい一実施形態においては、前記ステップｂ）は、前記ＱＴＬ用ＡＦＬＰマーカーを規定する少なくとも１セットのプライマー、又は前記ＱＴＬ用ＡＦＬＰマーカーの核酸配列と厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する１セットのプライマーの使用を含む。
【００７６】
ステップｄ）の予測長さ又は予測核酸配列を有する増幅ＤＮＡ断片を検出するステップは、増幅ＤＮＡ断片が、マーカーが最初に検出された植物からのＤＮＡとの同じプライマーを用いた類似の反応に基づく予想長さに対応する長さ（±数塩基、例えば、１、２又は３塩基多い又は少ない長さ）、又は前記マーカーが最初に検出された植物におけるＱＴＬに関連したマーカーの配列に基づく予想配列に対応する（８０％を超える、好ましくは９０％を超える、より好ましくは９５％を超える、更により好ましくは９７％を超える、更により好ましくは９９％を超える相同性を有する）核酸配列を有するように好ましくは実施される。本明細書に定義された遺伝子移入を有する植物（ドナー計画）にないが、遺伝子移入を受ける植物（レシピエント植物）に存在するマーカー（いわゆる、トランスマーカー）も、子植物間の遺伝子移入を検出するアッセイに有用であり得るが、マーカーがないことを試験して、特定の遺伝子移入の存在を検出することが最適ではないことを当業者は承知している。
【００７７】
予測長さ又は予測核酸配列を有する増幅ＤＮＡ断片を検出するステップは、標準ゲル電気泳動技術によって、又は自動ＤＮＡ配列決定装置を使用することによって、実施することができる。これらの方法は、当業者に周知であるので、本明細書で述べる必要はない。マーカーは、そのプライマー配列に基づいて、増幅産物の長さ、及び連鎖地図上の別のマーカーに対するマーカー位置と組み合わせて、定義されることに留意されたい。
【００７８】
分子マーカー及びＱＴＬ
【００７９】
分子マーカーは、核酸配列の差の可視化に使用される。この可視化は、制限酵素を用いた消化後のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術（ＲＦＬＰ）、及び／又はポリメラーゼ連鎖反応法を用いた技術（例えば、ＳＴＳ、マイクロサテライト、ＡＦＬＰ）によって可能である。２つの親遺伝子型間の差はすべて、これらの親遺伝子型の交雑に基づくマッピング集団（例えば、ＢＣ１、Ｆ２）において分離する。異なるマーカーの分離を比較することができ、組み換え頻度を計算することができる。異なる染色体上の分子マーカーの組み換え頻度は、一般に５０％である。同じ染色体上に位置する分子マーカー間では、組み換え頻度は、マーカー間距離に依存する。低組み換え頻度は、染色体上のマーカー間の短い遺伝距離に対応する。すべての組み換え頻度を比較すると、染色体上の分子マーカーの最も論理的な順序が得られる。この最も論理的な順序を連鎖地図において示すことができる。連鎖地図上の高収量に関連した隣接又は近接マーカー群は、高収量に関連したＱＴＬの位置を正確に示す。
【００８０】
本明細書で特定するマーカーは使用することができ、以下に説明する本発明の種々の態様である。本発明の態様は、本明細書で特定するマーカーの使用に限定されない。態様は、本明細書に明示的に開示されないマーカー、さらにはまだ特定されていないマーカーを使用することもできることが強調される。形質発現が多数の予測できない因子に依存する遺伝単位「遺伝子」とは異なり、遺伝単位「ＱＴＬ」は、表現型の定量化可能な形質に直接関連したゲノム上の領域を意味する。したがって、遺伝子自体は植物育種にほとんど又は全く関係しないが、ＱＴＬは植物育種に直接適用することができる。
【００８１】
本明細書で特定されるＱＴＬは連鎖群４上に位置し、その位置は、幾つかの別の任意のマーカーによって最適に特徴づけられる。この検討では、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、及び挿入変異マーカーを使用したが、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、マイクロサテライトマーカー（例えば、ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）マーカー、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー又はこれらのマーカーの組合せを使用することもできた。一般に、ＱＴＬは、数百万塩基の領域に及ぶことがある。したがって、ＱＴＬの全配列情報を提供することは、実際には不可能であるだけでなく、不必要でもある。というのは、一連の近接ゲノムマーカーの存在と特定の表現型形質の存在との間で認められた相関を通じてＱＴＬが最初に検出される方法によって、子植物集団中で特定の表現型形質を示す遺伝的潜在能力を有する植物を追跡することができるからである。したがって、マーカーの非限定的リストを提供することによって、本発明は、育種計画におけるＱＴＬの有用性を規定する。
【００８２】
マーカーは、特定の品種系統に特異的である。したがって、特定の形質は特定のマーカーに関連する。本願に示すマーカーは、ＱＴＬの位置を示すだけでなく、植物における特定の表現型形質の存在とも相関する。ゲノム上のＱＴＬの位置を示す近接ゲノムマーカーは、主に任意又は非限定的であることに留意することが重要である。一般に、ＱＴＬの位置は、表現型形質と統計学的相関を示す、近接する一連のマーカーによって示される。マーカーがその一連の外側に存在すると（すなわち、あるしきい値未満のＬＯＤスコアを有するマーカー。マーカーが離れすぎて領域におけるマーカーとＱＴＬの組み換えが頻繁に起こりすぎ、マーカーの存在が表現型の存在と統計的に有意に相関しないことを示す。）、ＱＴＬの境界が設定される。したがって、指定領域内に位置する別のマーカーによってＱＴＬの位置を示すこともできる。
【００８３】
近接ゲノムマーカーは、個々の植物において、ＱＴＬ（したがって、表現型）の存在を示すのに使用することもでき、すなわち、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）手順に使用できることに留意することも更に重要である。原則的には、潜在的に有用であるマーカーの数は、有限であるが、極めて大きい可能性がある。当業者は、本願に記載のマーカーに加えて別のマーカーを容易に特定することができる。例えばあるしきい値を超える確立されたＬＯＤスコアを有するマーカーが広がるゲノム領域の物理的境界内にあり、それによって交雑においてマーカーとＱＴＬの組み換えが全く又はほとんど起こらないことを示す、ＱＴＬと連鎖した任意のマーカー、及びＱＴＬと連鎖不平衡にある任意のマーカー、及びＱＴＬ内の実際の原因となる変異を表すマーカーを、ＭＡＳ手順において使用することができる。これは、収量改善ＱＴＬに対するＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２、Ｅ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２などのＱＴＬに関連すると本明細書で認めたマーカーが、ＭＡＳ手順における使用に適したマーカーの単なる例であることを意味する。マーカーＥ２２Ｍ１２−Ｆ−２７８−Ｐ１及びＥ２２／Ｍ１２−Ｆ−０９２−Ｐ２も、図１に示す形質と連鎖しているので、使用することができる。これらのマーカーは、適切に、その存在がＱＴＬの存在と一致することを示す「シスマーカー」であり得る。さらに、ＱＴＬ又はその特定の形質付与部分が別の遺伝的背景（すなわち、別の植物系のゲノム）に移入されると、幾つかのマーカーはもはや子孫には存在しないこともあるが、形質は子孫中に存在する。これは、かかるマーカーが、最初の親系統におけるＱＴＬの特定の形質付与部分であるゲノム領域の外側にのみあることを示し、新しい遺伝的背景が、異なるゲノム機構を有することを示している。その欠如が子孫への遺伝因子の導入に成功したことを示すかかるマーカーは、「トランスマーカー」と称され、本発明下のＭＡＳ手順において同様に適切であり得る。
【００８４】
マーカーに関する本発明の収量ＱＴＬのハプロタイプは、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ０６３−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１トランス（マーカーの欠如）、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１トランス（マーカーの欠如）、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ２２Ｍ１２−Ｆ−２７８−Ｐ１トランス（マーカーの欠如）、Ｅ２２／Ｍ１２−Ｆ−０９２−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２シス（マーカーの存在）である。Ｐ１又はＰ２はマーカーの親ラベル（ゲノムバックグラウンド）を示し、Ｐ１は反復親であり、Ｐ２はドナー親である。
【００８５】
ＱＴＬを特定した後、ＱＴＬ効果（改善された収量）は、例えば、検討中のＱＴＬに対する分離したＢＣ２Ｓ１子孫の収量を評価することによって確認することができる。好ましくは、本発明のＱＴＬの存在を検出することは、本明細書に定義されたＱＴＬマーカーの少なくとも１種類を用いて実施される。したがって、本発明は、前記マーカーを使用することによって、キュウリにおける改善された収量のためのＱＴＬの存在を検出する方法にも関する。
【００８６】
本発明のＱＴＬのヌクレオチド配列は、前記ＱＴＬに関連した１種類以上のマーカーのヌクレオチド配列を決定し、前記マーカー配列の内部プライマーを設計することによって解明することができる。次いで、内部プライマーを使用して、前記マーカー配列の外側の配列ＱＴＬを更に決定することができる。例えば、ＡＦＬＰマーカーのヌクレオチド配列は、対象植物のゲノム中の前記マーカーの存在の判定に使用される電気泳動ゲルから前記マーカーを単離し、例えば当分野で周知であるジデオキシ鎖終結法によって、前記マーカーのヌクレオチド配列を決定することによって得ることができる。
【００８７】
キュウリ植物におけるＱＴＬの存在を検出する方法の実施形態においては、該方法は、前記ＱＴＬと連鎖したマーカーの核酸配列と厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを生成するステップ、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをキュウリ植物の消化されたゲノム核酸と接触させるステップ、及び前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと前記消化されたゲノム核酸との特定のハイブリダイゼーションの存在を判定するステップも含むことができる。
【００８８】
好ましくは、前記方法は、前記キュウリ植物から得られる核酸試料に対して実施されるが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用することもできる。あるいは、より好ましい一実施形態においては、当業者は、ＱＴＬのヌクレオチド配列が決定された後に、厳密なハイブリダイゼーション条件下で前記ＱＴＬの核酸配列とハイブリッド形成可能な特定のハイブリダイゼーションプローブ又はオリゴヌクレオチドを設計することができ、かかるハイブリダイゼーションプローブをキュウリ植物における本発明のＱＴＬの存在を検出する方法に使用することができる。
【００８９】
原則的には、本明細書で使用される個々のＡＦＬＰマーカーは、指定マーカーコードを有する。このコードは、規定された登録種においてプライマーの増幅産物の長さを示す図と場合によっては組み合わせて、２種類のプライマーを規定する（上記表１の説明も参照されたい。）。したがって、ＡＦＬＰマーカーは、キュウリゲノムＤＮＡに対して増幅反応を実施することによって得られる一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ断片を規定する。増幅反応は、示した登録種の場合には、示した長さの断片をもたらす。さらに、マーカーは、５’−３’方向に、第１のプライマー配列、キュウリ特異的ＤＮＡ配列及び第２のプライマー配列からなる配列、及びその補足配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む。こうして２個のプライマーが隣接したキュウリ特異的ＤＮＡ配列。「キュウリ特異的ＤＮＡ配列」という用語は、それぞれのプライマーが隣接する領域のヌクレオチド配列を意味し、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３から増幅された配列、又はそれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列相同性を有する配列を表す。
【００９０】
トランスジェニック法による高収量を有するキュウリ植物の生産
【００９１】
本発明の別の一態様によれば、ＱＴＬを含む核酸（好ましくはＤＮＡ）配列を、高収量を有するキュウリ植物の生産に使用することができる。この態様においては、本発明は、改善された収量を有するキュウリ植物を生産するための、本明細書に定義されたＱＴＬ又はその収量改善部分の使用を規定する。この使用は、適切なレシピエント植物における前記ＱＴＬを含む核酸配列の導入を含む。上述したように、前記核酸配列は、適切なドナー植物に由来することができる。本発明による適切な収量改善ＱＴＬ源は、トルコ産のキュウリ在来種ＰＩ１６９３８３である。かかる植物は、例えば、Ｔ．Ｃ．Ｗｅｈｎｅｒ（ウェナー），ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｅｎｅ ｃｕｒａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｃｕｒｂｉｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ（ウリ科植物の遺伝学共同体のためのキュウリ遺伝子のキュレータ）（ＣＧＣ），Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（デパートメント・オブ・ホルティカルチュラル・サイエンス），Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ノースカロライナ州立大学），ノースカロライナ州ローリー、２７６９５−７６０９ Ｕ．Ｓ．Ａ．、又はＵＳＤＡのＮａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メリーランド州ベルツビルによって主催されるＧｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＧＲＩＮ）から得ることができる。
【００９２】
収量を改善するＱＴＬを含む核酸配列又はその収量改善部分は、利用可能な任意の方法によって適切なレシピエント植物に移行させることができる。例えば、前記核酸配列は、ＰＩ１６９３８３系統の植物をその収量を改善すべき選抜育成系統と交雑させることによって（すなわち、遺伝子移入によって）、形質転換によって、プロトプラスト融合によって、倍加半数体技術によって、胚救出によって、又は任意の他の核酸移行系によって、場合によっては続いてＱＴＬを含み高収量を示す子植物の選抜によって、移行させることができる。遺伝子導入による移行方法では、高収量用ＱＴＬを含む核酸配列を前記ドナー植物から当分野で公知の方法によって単離することができる。こうして単離された核酸配列は、トランスジェニック法によって、例えば、ベクターによって、配偶子中で、又は前記核酸配列で被覆された弾道粒子などの任意の他の適切な移行要素中で、レシピエント植物に移行させることができる。
【００９３】
植物の形質転換は、一般に、植物細胞中で機能する発現ベクターの構築を含む。本発明においては、かかるベクターは、高収量用ＱＴＬを含む核酸配列を含み、プロモーターなどの調節エレメントの制御下にある、又は調節エレメントに作用可能に結合した、収量改善遺伝子を含むことができる。発現ベクターは、１個以上のかかる作動可能に結合した遺伝子／調節エレメントの組合せを含むことができる。ただし、組合せに含まれる遺伝子の少なくとも１個は、改善された収量をコードする。ベクター（単数又は複数）は、プラスミドの形とすることができ、単独で又は別のプラスミドと組み合わせて使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系などの当分野で公知の形質転換方法によって、改善された収量を示すトランスジェニック植物を生産することができる。
【００９４】
発現ベクターは、マーカーを含む形質転換細胞をネガティブ選択によって（選択マーカー遺伝子を含まない細胞の成長を阻害することによって）、又はポジティブ選択によって（マーカー遺伝子によってコードされる産物をスクリーニングすることによって）回収できるようにする（プロモーターなどの）調節エレメントに作動可能に結合した少なくとも１個のマーカー遺伝子を含むことができる。植物の形質転換のために多数の一般に使用される選択マーカー遺伝子が当分野で公知であり、例えば、抗生物質や除草剤などの選択化学薬品を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、又は阻害剤に非感受性である変化した標的をコードする遺伝子が挙げられる。マンノース選択などの幾つかのポジティブ選択方法が当分野で公知である。あるいは、マーカーのない形質転換を使用して、上記マーカー遺伝子のない植物を得ることができ、その技術は当分野で公知である。
【００９５】
発現ベクターを植物に導入する一方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然形質転換系に基づく（例えば、Ｈｏｒｓｃｈ（ホーシュ）等，１９８５参照）。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓそれぞれのＴｉ及びＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因である遺伝子を有する。発現ベクターを植物組織に導入する方法は、植物細胞とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの直接感染又は共培養を含む。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター系及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性遺伝子導入方法の記述は、米国特許第５，５９１，６１６号にある。植物発現ベクター及びレポーター遺伝子及び形質転換プロトコルの一般的記述、並びにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター系及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性遺伝子導入方法の記述は、Ｇｒｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｓｂｙ（グルーバー及びクロスビー），１９９３に見いだすことができる。植物組織の一般的培養方法は、例えば、Ｍｉｋｉ（ミキ）等、１９９３及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（フィリップス）等、１９８８に記載されている。分子クローニング技術及び適切な発現ベクターの適切な入門書は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１である。
【００９６】
発現ベクターを植物に導入する別の方法は、微粒子媒介性形質転換に基づき、ＤＮＡは微粒子表面に載って輸送される。発現ベクターは、微粒子銃装置を用いて植物組織に導入される。微粒子銃装置は、植物細胞壁及び膜を貫通するのに十分な速度３００から６００ｍ／ｓに微粒子を加速する。ＤＮＡを植物に導入する別の方法は、標的細胞の超音波処理による。あるいは、リポソーム又はスフェロプラスト融合を使用して、発現ベクターを植物に導入してきた。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコール又はポリ−Ｌ−オルニチンを使用したＤＮＡのプロトプラストへの直接取り込みも報告された。プロトプラスト及び細胞全体及び組織の電気穿孔法も記述された。
【００９７】
キュウリゲノムの一部を細菌人工染色体（ＢＡＣ）、すなわち細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に存在する天然Ｆ因子プラスミドに基づく、Ｅ．ｃｏｌｉ．細胞中でＤＮＡ断片（１００から３００ｋｂ挿入断片サイズ、平均１５０ｋｂ）をクローン化するのに使用されるベクターに導入する、ＢＡＣの使用などの別の周知技術を、例えば、ＢＩＢＡＣ系と組み合わせて使用して、トランスジェニック植物を生産することができる。
【００９８】
キュウリ標的組織の形質転換後、上記選択マーカー遺伝子の発現によって、当分野で現在周知である再生及び選択方法を用いた形質転換細胞、組織及び／又は植物の優先的選択が可能になる。
【００９９】
非トランスジェニック法による改善された収量を有するキュウリ植物の生産
【０１００】
改善された収量を有するキュウリ植物を生産する別の実施形態においては、プロトプラスト融合をドナー植物からレシピエント植物への核酸移行に使用することができる。プロトプラスト融合は、単一の二核又は多核細胞を産生する、２個以上のプロトプラスト（細胞壁が酵素処理によって除去された細胞）間の体細胞交雑などの誘発又は自発性結合である。融合細胞は、天然に雑種形成させることができない植物種を用いてさえ得ることができ、形質の望ましい組合せを示すハイブリッド植物に組織培養される。より具体的には、第１のプロトプラストは、ＰＩ１６９３８３のキュウリ植物から得ることができる。第２のプロトプラストは、第２のキュウリ又は別の植物変種、好ましくは耐病性、耐虫性、価値ある果実特性など、ただしそれだけに限定されない商業的に価値のある特性を含むキュウリ系統から得ることができる。次いで、プロトプラストは、当分野で公知である伝統的プロトプラスト融合手順を使用して融合される。
【０１０１】
あるいは、本明細書に記載のＱＴＬを含む核酸のドナー植物からレシピエント植物への移行に胚救出を使用することができる。胚救出は、生存可能な種子を植物が生成することができない交雑種から胚を単離する手順として使用することができる。このプロセスでは、植物の受精した子房又は未熟な種子を組織培養して、新しい植物を生産する。
【０１０２】
本発明は、キュウリ育成系統の植物の収量を改善する方法であって、
【０１０３】
ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
【０１０４】
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
【０１０５】
ｃ）前記キュウリ育成系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
【０１０６】
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
【０１０７】
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合であるキュウリ育成系統の植物を生産するステップと
【０１０８】
を含み、
【０１０９】
ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜がマーカー利用選抜によって実施される、
【０１１０】
方法にも関する。
【０１１１】
かかる方法の好ましい一実施形態においては、前記キュウリ育成系統はエリート系統である。
【０１１２】
上記方法の別の好ましい実施形態においては、マーカー利用選抜手順は、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及び／又はＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に対する選抜を含む。
【０１１３】
かかる方法の好ましい実施形態は、前記植物を交雑させることによって、ドナーキュウリ植物としてのＰＩ１６９３８３からレシピエントキュウリ植物への前記核酸配列の遺伝子移入による移行を含む。したがって、本発明によるＱＴＬを含む核酸配列の遺伝子移入は、伝統的育種技術を使用することによって適切に遂行することができる。ＱＴＬは、好ましくは、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）又はマーカー利用育種（ＭＡＢ）を使用することによって市販用キュウリ変種に移入される。ＭＡＳ及びＭＡＢは、所望の形質をコードする遺伝子の１種類以上を含む子植物の特定及び選抜のための分子マーカーの１種類以上の使用を含む。この場合、かかる特定及び選抜は、本発明のＱＴＬ又はそれに関連したマーカーの選抜に基づく。ＭＡＳを使用して、目的ＱＴＬを収容する準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を開発することもでき、各ＱＴＬ効果のより詳細な研究が可能になる。ＭＡＳは、戻し交雑近交系（ＢＩＬ）集団の開発に有効な方法でもある。この実施形態によって開発されたキュウリ植物は、有利には、レシピエント植物由来の形質の大多数を受け継ぎ、ドナー植物由来の改善された収量を受け継ぐことができる。
【０１１４】
上で手短に考察したように、伝統的育種技術を使用して、改善された収量をコードする核酸配列を収量改善が必要なレシピエントキュウリ植物に移入することができる。系統育種と称される一方法においては、改善された収量を示し、本明細書に定義された改善された収量に関連したＱＴＬをコードする核酸配列を含むドナーキュウリ植物を、耐病性、耐虫性、価値ある果実特性など、ただしそれだけに限定されない農学的に望ましい特性を示すレシピエントキュウリ植物（好ましくは、エリート系統の植物）と交雑させる。次いで、（Ｆ１ハイブリッドである）生成した植物集団を自家受粉させ、種子をつけさせる（Ｆ２種子）。次いで、Ｆ２種子から育成されたＦ２植物を、改善された収量についてスクリーニングする。集団は、幾つかの異なる方法でスクリーニングすることができる。
【０１１５】
まず、集団を伝統的な収量アッセイによってスクリーニングする。かかるアッセイは当分野で公知である。第２に、上記分子マーカーの１種類以上を使用してマーカー利用選抜を実施して、本明細書に定義された改善された収量をコードする核酸配列を含む子孫を特定することができる。ＱＴＬの存在を検出する方法によって上で言及された、別の方法を使用することもできる。さらに、マーカー利用選抜を使用して、収量アッセイから得られる結果を確認することができ、したがって、幾つかの方法を組み合わせて使用することもできる。
【０１１６】
改善された収量を有する近交系キュウリ植物系は、循環選抜及び戻し交雑、自家受粉及び／又は二ゲノム性半数体の技術、又は親系統の作製に使用される任意の他の技術を用いて、開発することができる。循環選抜及び戻し交雑の方法においては、反復親を第１のドナー植物と交雑させることによって、本明細書に開示する改善された収量を与える遺伝因子を標的レシピエント植物（反復親）に移入することができる。第１のドナー植物は、反復親とは異なり、本明細書では「非反復親」と称する。反復親は、収量を改善すべき植物であり、耐病性、耐虫性、価値ある果実特性など、ただしそれだけに限定されない農学的に望ましい特性を有する。非反復親は、ＰＩ１６９３８３系統の植物であり、改善された収量をコードする核酸配列を含む。あるいは、非反復親は、反復親と交雑受精する任意の植物変種又は近交系とすることができ、改善された収量のためのＱＴＬをＰＩ１６９３８３系統の植物との以前の交雑で獲得している。反復親と非反復親の交雑から得られる子孫を反復親に戻し交雑する。次いで、生成した植物集団を所望の特性についてスクリーニングする。スクリーニングは、幾つかの異なる方法で行うことができる。例えば、当分野で公知の表現型スクリーニングによって集団をスクリーニングすることができる。あるいは、表現型アッセイを使用する代わりに、上記分子マーカー、ハイブリダイゼーションプローブ又はポリヌクレオチドの１種類以上を使用してマーカー利用選抜（ＭＡＳ）を実施して、改善された収量をコードする核酸配列を含む子孫を特定することができる。
【０１１７】
スクリーニング後、キュウリ植物をますます近交系にするために、次いで、改善された収量表現型、より好ましくは遺伝子型を示し、高収量をコードする必要な核酸配列を含むＦ１ハイブリッド植物を選抜し、数世代にわたって反復親に戻し交雑する。このプロセスを２から５世代以上にわたって実施することができる。原則的には、反復親を非反復親と交雑させるプロセスから得られる子孫は、改善された収量をコードする１個以上の遺伝子に対して異型接合的である。
【０１１８】
一般に、所望の形質をハイブリッドキュウリ変種に導入する方法は、
【０１１９】
（ａ）近交系キュウリ親を１つ以上の所望の形質を含む別のキュウリ植物と交雑させて、Ｆ１子植物を生産し、所望の形質がＰＩ１６９３８３由来の収量改善ＱＴＬによって付与される改善された収量であるステップと、
【０１２０】
（ｂ）好ましくは本明細書に定義された分子マーカーを使用して、所望の形質を有する前記Ｆ１子植物を選抜して、選抜されたＦ１子植物を生産するステップと、
【０１２１】
（ｃ）選抜された子植物を前記近交系キュウリ親植物と戻し交雑させて、戻し交雑子植物を生産するステップと、
【０１２２】
（ｄ）所望の形質並びに前記近交系キュウリ親植物の形態学的及び生理学的特性を有する戻し交雑子植物を選抜し、前記選抜が、ゲノムＤＮＡの単離、及び上で定義した少なくとも１種類のＱＴＬ用分子マーカーの存在について前記ＤＮＡを試験することを含むステップと、
【０１２３】
（ｅ）ステップ（ｃ）と（ｄ）を２回以上連続して繰り返して、選抜された第３以上の戻し交雑子植物を生産するステップと、
【０１２４】
（ｆ）場合によっては、同型接合植物を特定するために、選抜された戻し交雑子孫を自家受粉させるステップと、
【０１２５】
（ｇ）前記戻し交雑子孫又は自家受粉植物の少なくとも１種類を別の近交系キュウリ親植物と交雑させて、所望の形質並びに同じ環境条件で育成されたときのハイブリッドキュウリ変種の形態学的及び生理学的特性のすべてを有するハイブリッドキュウリ変種を生産するステップと
【０１２６】
を含む。
【０１２７】
示したように、最後の戻し交雑世代は、改善された収量を有する同型接合純粋育種（近交系）子孫を規定するために、自家受粉させることができる。したがって、循環選抜、戻し交雑及び自家受粉の結果、改善された収量に関連した遺伝子及び商業的に重要な形質に関連した別の遺伝子に対して遺伝的に相同である系統が生成する。
【０１２８】
異型接合植物は改善された収量も示し、したがってかかる植物も本発明の一態様であることに留意されたい。
【０１２９】
キュウリ植物及び種子
【０１３０】
植物育種の目標は、単一の変種又はハイブリッドにおいて種々の望ましい形質を組み合わせることである。商品作物の場合、これらの形質としては、病気及び昆虫に対する抵抗性、熱及び乾燥に対する耐性、作物成熟時間の短縮、収量増加、並びに農学的品質改良を挙げることができる。発芽、苗立、成長速度、成熟度、草高などの植物特性の均一性も重要であり得る。
【０１３１】
商品作物は、植物の受粉方法を利用する技術によって栽培される。１つの花の花粉が同じ植物の同じ又は別の花に移行する場合、植物は自家受粉する。同じ系統群又は系統内の個体が受粉に使用されるとき、植物は姉妹受粉する。花粉が異なる系統群又は系統からの異なる植物の花に由来する場合、植物は他家受粉する。
【０１３２】
自家受粉し、多数の世代にわたってタイプごとに選抜された植物は、ほぼすべての遺伝子座において同型接合的になり、純種子孫の均一集団を生じる。２種類の同型接合系統の交雑は、多数の遺伝子座について異型接合的であり得るハイブリッド植物の均一集団を生じる。幾つかの遺伝子座において各々異型接合的な２種類の植物の交雑は、遺伝的に異なる不均一な異種植物の集団を生じる。
【０１３３】
キュウリ育種計画におけるハイブリッドキュウリ変種の開発は以下の３ステップを含む：（１）初期の育種交雑種に対する種々の生殖質プールからの植物の選抜、（２）数世代にわたる育種交雑種から選抜された植物の自家受粉による一連の近交系の生成（近交系は、それぞれ純種を繁殖させ、高度に均一である。）、及び（３）選抜された近交系を無関係の近交系と交雑させ、ハイブリッド子孫（Ｆ１）を生成すること。十分な量の同系交配後、連続的な雑種世代は、開発された近交系の種子を増加させるのに役立つにすぎない。好ましくは、近交系は、その座の約９５％以上において同型接合対立遺伝子を含むべきである。
【０１３４】
近交系の同型接合性及び均一性の重要な結果は、一定の対の近交系を交雑させることによって生成されるハイブリッドが常に同じであるということである。優れたハイブリッドを生成する近交系が特定されると、ハイブリッド種子は、これらの近交系親を使用して連続的に供給することができ、次いで、このハイブリッド種子供給からハイブリッドキュウリ植物を生産することができる。
【０１３５】
上述した方法を使用して、当業者は、必要な近交系を生産することができ、そこから前記近交系を交雑させることによって市販用（Ｆ１）ハイブリッド種子を生産することができる。
【実施例】
【０１３６】
収量改善遺伝子移入
【０１３７】
ＩＬ集団の開発
【０１３８】
外来ドナーＰＩ６９３８３を、市販用キュウリハイブリッド変種の母系統である市販親系統と交雑させた。遺伝子移入系をＡＦＬＰマーカーを使用して開発して、ＢＣ１、ＢＣ２及び後続の自家受粉世代中のゲノムカバー率及び重複セグメントについて選抜した（ＩＬに応じて、１又は２回の自家受粉を実施した。）。ＢＣ１世代を使用して、キュウリの遺伝地図を得た。他の地図と共通したマーカーは見いだされず、したがって染色体番号を割り当てることができなかった。
【０１３９】
本明細書では連鎖群は、無作為な連鎖群番号を指す。ゲノムカバー率についての選抜によって、３０種類の遺伝子移入系（ＩＬ）を選抜した。
【０１４０】
ＩＬを反復親（Ｆ１ＩＬ）と交雑させて、ドナーセグメントに対して異型接合的であるが、ゲノムの残りの部分に対して同型接合的である系統を得た。ＩＬを変種の別の市販親（父系統）とも交雑させて、ドナーセグメント及びゲノムの残りの部分に対して異型接合的であるハイブリッド（ＨＹＩＬ）を得た。
【０１４１】
この実験設定では、いわゆるハイブリッドＩＬ（すなわち、最初の変種Ａｃｃｏｌａｄｅの親系統２と交雑させた遺伝子移入を有する親系統１）は、極めて良好に機能した（表１参照）。
【０１４２】
集団のフェノタイピング
【０１４３】
３０種類のＩＬを温室内の２つの反復ブロックで育成した。５．７５ｍ２の各ブロックは８本の植物を含み、植物１．３９本／平方メートルの栽植密度になった。ＱＴＬは、早春の実験中のＩＬでしか検出されず、夏季の実験では検出されなかった。
【０１４４】
長いキュウリのｋｇ／ｍ２単位の生産量、果実重量及び収穫の早さを求めるために、収穫時期に植物が果実をつける少なくとも２か月間、ＩＬの果実を週２又は３回収穫した（果実の中央で少なくとも４ｃｍの直径を有する果実。直径４ｃｍに達しなくても、３日間生長の停止した果実も収穫する。）。収穫ごとに、収穫の総重量及び果実数としての収量を求めた。結果を表１に示す。示した値は１ブロック当たりの平均値である。
【０１４５】
生産量（Ｐ）に換算した収量を収量／ｍ２で表し、以下のように計算した。
【０１４６】
（総重量（ｋｇ単位）／ブロック／栽培）
Ｐ＝ ×（植物密度／ｍ２）
（植物本数／ブロック）
【０１４７】
果実重量＝総重量（ｋｇ）／果実総数
【０１４８】
果実から１ｃｍの距離で果実脚を切断して果実を収穫した。収量を収穫から２時間以内に秤を用いて測定した。収穫の早さは、播種後の畑の最初の収穫日である。
【０１４９】
表１ 遺伝子移入系の収量。一番上の行は対照値を示す。対照より高い値を（＋）で示し、対照より低い値を（−）で示す。対照ＢＣ＝Ｐｙｒ４２系統、対照＊＝市販ハイブリッドＡｃｃｏｌａｄｅの特許登録親、対照＊＊＝ＰＩ６９３８３、親系統＝市販ハイブリッドＡｃｃｏｌａｄｅ。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
本願は、染色体３の染色体置換の使用も企図する。かかる置換系統においては、連鎖群３におけるマーカーによって特徴づけられる染色体を除いて、すべての核ＤＮＡが反復親に由来する（図５参照）。後続の実験によれば、ＬＩＬ３−１（連鎖群３に対応する染色体がドナー材料で置換された染色体置換系統）及びその子孫は、対照よりも高い収量（ｋｇ）と精力を示す植物をもたらした。特に、この特定の遺伝子移入は、この試験において、任意の他の（ハイブリッド）ＩＬと比較して（最初の変種の第２の親と交雑させたときに）ハイブリッド段階で顕著な性能を示した。図５に示した任意及びすべてのマーカーは、原則的には、本発明の植物において連鎖群３に対応する染色体の有無を示すのに使用することができる。
【０１５２】
ＬＩＬ４−２のファインマッピングのための高分解能ＩＬパネルの構築
【０１５３】
ＬＩＬ４−２を重要な主要ＩＬとみなした。
【０１５４】
収量ＱＴＬのファインマッピングは、「高分解能ＩＬパネル」を用意することによって実施することができる。パネルは、ＬＩＬ４−２系統に由来するより小さい遺伝子移入を有する系統からなった。
【０１５５】
ＬＩＬ４−２×反復親の１８４Ｆ２個体の葉材料を試験した。ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩテンプレートを作製した。
【０１５６】
組み換えの選抜を２段階で実施した。第一段階では、ＬＩＬ４−２の３個のＬＧ４遺伝子移入セグメントの各々（図１参照）及びＬＧ５上の遺伝子移入セグメントに位置する少なくとも１個のマーカーを増幅する種々のプライマー組合せ（ＰＣ）（Ｅ１２／Ｍ２４、Ｅ１８／Ｍ１５、Ｅ１４／Ｍ６０、Ｅ１１／Ｍ６２、Ｅ１３／Ｍ１７、Ｅ２５／Ｍ１３、Ｅ２２／Ｍ１２、Ｅ２１／Ｍ１６）を使用して、すべての個体をスクリーニングした（ＬＩＬ４−２は、図２に示すＬＧ５上の望ましくないドナーセグメントを含む。）。９６種類の植物を以下の判定基準に基づいて更なる分析のために選抜した。
【０１５７】
１）ドナーセグメントＬＧ５は、同型接合が存在しない。
【０１５８】
２）植物は、最高３個のドナーセグメント（ＬＧ４上の３個のドナーセグメントの１個）を含む。
【０１５９】
続いて、９６種類のＦ２植物のこの選抜を、ＬＧ４ドナーセグメント上に位置するマーカーを含む２種類の追加のＰＣを用いてスクリーニングする。これら９６種類のＦ２植物の全データセットに基づいて、２セットの植物をＦ３への繁殖用に選抜した。４７個体からなる１セットを更なる試験用に選抜した。
【０１６０】
マーカー検出
【０１６１】
ＡＦＬＰ分析をＶｏｓ等（１９９５）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７−４４１４に従って実施した。
【０１６２】
マーカー配列
【０１６３】
ＬＩＬ４−２と連鎖したＡＦＬＰマーカーの配列の概要。配列は、順方向及び逆方向「コアプライマー」（ＥｃｏＲ１制限酵素切断部位を有する）Ｅ及び（ＭｓｅＩ制限酵素切断部位を有する）Ｍを含む。プライマー配列に下線を引いた。逆方向プライマーは、配列に逆方向補足配列として含まれる。「コアプライマー」が伸長される選択的ヌクレオチドには二重下線を引いた。
【０１６４】
Ｅ１８／Ｍ１５−Ｆ−０８９−Ｐ２
【０１６５】
【化１】
【０１６６】
Ｅ１４／Ｍ６０−Ｆ−２２６Ａ−Ｐ１（ＡＦＬＰ Ｅ１４／Ｍ６０−２２６の場合、恐らくはバックグラウンドバンドのために、２個の異なる配列が得られた。）
【０１６７】
【化２】
【０１６８】
Ｅ１４／Ｍ６０−Ｆ−２２６Ｂ−Ｐ１（ＡＦＬＰ Ｅ１４／Ｍ６０−２２６の場合、恐らくはバックグラウンドバンドのために、２個の異なる配列が得られた。）
【０１６９】
【化３】
【０１７０】
Ｅ１４／Ｍ６０−Ｆ−１８５−Ｐ１
【０１７１】
【化４】
【０１７２】
Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１
【０１７３】
【化５】
【０１７４】
Ｅ１８／Ｍ１５−Ｆ−２２１−Ｐ２
【０１７５】
【化６】
【０１７６】
Ｅ１３／Ｍ１７−Ｆ−２２６−Ｐ２
【０１７７】
【化７】
【０１７８】
Ｅ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２
【０１７９】
【化８】
【０１８０】
遺伝研究
【０１８１】
遺伝様式を決定するために、ＩＬの表現型を異型接合ＩＬ及びハイブリッドＩＬの表現型と比較した。結果を表２に示す。
【０１８２】
表２ 遺伝研究の結果。（ＩＬ、ライブラリーの最初の（同型接合）遺伝子移入系。Ｆ１ＩＬは、反復親と交雑させたＩＬであり、ＨＹＩＬは、実用品種の別の親系統（父系統）と交雑させたＩＬである。）。
【０１８３】
【表２】
【０１８４】
ドナー登録種の典型的な追加の特性は、多量の雄花開花、短い果実及び高い果実発育不全、商品価値なしである。
【０１８５】
同型接合、異型接合及びハイブリッド植物は、これらのネガティブな形質をもはや持たず、市販ハイブリッドの収量をはるかに超えるかなり高い収量を有する。果実の末端部分は、特有の星形の黄色であり、連鎖を引きずった結果であると考えられる。ドナー系統の上記ネガティブ形質は、従来の育種方法（戻し交雑）によって除去された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物育種に関し、より詳細には、本発明は、キュウリ植物の収量を改善する方法に関する。本発明は、さらに、作物収量の改善されたキュウリ植物、及びかかる植物の種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）は、世界的に主要な野菜作物であり、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ科の最も重要な作物種の１つである。キュウリは、野菜として、生で、調理して、又はピクルスにして食される。１００を超える変種が、ピクルス用の小さなものから薄切り用の大きなものまで楕円形の果実を実らせ、栽培品種は黄色又は褐色から濃緑色の範囲に及び得る。最近の栽培キュウリは、典型的には種無しであり、大部分の他の果実よりも栄養価が低いと一般に考えられているが、新鮮なキュウリは、良好なビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ９、Ｃ及びＫ並びにミネラル源である。大部分の温室品種は、受粉なしで結実し、開花に関して雌性型である（すなわち、雌花のみをつける）。
【０００３】
温室のキュウリの生産力は高い。それは、どの葉の基部にも１個以上の花が咲き、結実するからである。果実は、果実の長さ全体にわたって均一な直径を必要とする市場用の成熟度で収穫される。一般に、開花後１２から１５日で収穫又は市場に出せる時期になる。多数の作物と比較して、キュウリは早く収穫時期に達する。実際、キュウリの多くの変種は、播種から５０〜６０日後に収穫できるようになる。キュウリのつるは大量に果実をつけ、頻繁に（２から３日ごとに）収穫されるときに、特に果実が完熟する前に、新しい花の結実が促進され、収穫期間は１０から１２週間持続し得る。二毛作が最も一般的であるが、三毛作も採用される。
【０００４】
キュウリの収量は、収穫期間の長さ、個々の植物の空間的配置、採用される剪定法、利用可能な光、一般的な温度、個別の変種、並びに良好な栄養及び害虫管理に主に依存する。所与の面積の温室で栽培される植物の数は、日照条件及び植物の這わせ方によって決まる。葉の重なり及び隣接する植物による遮光は避けなければならないが、夏の日照条件は冬の条件よりも栽植密度を高くすることができる。キュウリ植物は、垂直又は傘状に這わせることができる。栽植密度は、一般に植物２本／ｍ２である。これらの変数を考慮すると、平均的な植物は、植物１本当たりキュウリ１０〜５０本／収穫期間を生産することができる。収穫真っ最中の傘状に這わせた作物では、収量は、植物１本当たり果実０．５〜１．５ｋｇ／週の範囲であり得る。
【０００５】
現行のキュウリハイブリッドの収量、特に果実ｋｇ／植物で表される収量を改善することは、最近のキュウリ栽培者の課題である。従来の育種方法は、これまで作物収量の大きな改善をもたらさなかった。例えば、米国におけるピクルス用キュウリの平均収量は、培養方法が改善され、収量及び耐病性について選抜されたために、１９６０〜１９８０年のほぼ２倍である。しかし、最近２０年間はさほど改善されていない。この問題を解決するには幾つかある道筋の１つをとることができる。
【０００６】
収量を改善する一方法は、栄養及び害虫の管理を更に改善することに基づく。しかし、最近の制御された生産環境では、これらのパラメータは、通常、最適化されている。
【０００７】
別の方法は、育成系統を改善するものである。植物育種家、特に種子会社は、「エリート系統」と一般に称されるエリート育成系統を使用して、一定品質の製品を提供する。エリート系統は、長年の同系交配の結果であり、高収量、高果実品質、及び害虫、病気又は非生物的ストレスに対する抵抗性などの複数の優れた特性を組み合わせる。これらのエリート系統の平均収量は、一般に、現代のキュウリの多くがその子孫である最初の野生（在来種）登録種（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ）よりもはるかに高い。エリート系統は作物として直接使用され、又はエリート系統を使用して、２つの（同型接合又は近交系）エリート系統間の交雑によって生産される、いわゆるＦ１、すなわち単交雑ハイブリッドを生産することができる。したがって、Ｆ１ハイブリッドは、２種類の親の遺伝的性質を組み合わせて単一植物にしたものである。ハイブリッドに付随する利点は、雑種強勢又はヘテロシスを示すことである。雑種強勢は、ハイブリッド植物がどちらの（近交系）親よりも成長し、より高収量を示すという十分に理解されていない現象である。
【０００８】
戻し交雑又は系統選抜は、育種家が、望ましい農業形質をそのエリート育成系統に追加する一方法である。この方法は、育成系統を望ましい形質を発現する系統と交雑させ、続いて該形質を発現する子植物を反復親と戻し交雑することを含む。その結果、育種計画における親としての個体の選抜は、その祖先の性能に基づく。かかる方法は、定性的遺伝形質、すなわちポジティブ又はネガティブにスコアされる形質のための育種に最も有効である。しかし、収量、早生、品質など、栽培者が関心のある多数の形質は、定量的に遺伝され、遺伝率が低い。適切な形質源の非存在下では、改善することができない。
【０００９】
循環選抜は、育成系統を改善する選択的育種方法であり、望ましい子孫の系統的な試験及び選抜と、それに続いて新しい集団を形成する選抜個体の組み換えを含む。循環選抜は、キュウリにおいて、収量などの遺伝率の低い量的形質を改善するのに有効であることが判明した。しかし、循環選抜は、育種計画において種々の形質の根底にある遺伝的基盤を増強せず、したがってその潜在能力は限られている。徐々にほんのわずかな改善がなされたにすぎない。
【００１０】
キュウリの収量を改善する更に別の方法が必要である。本発明の一目的は、作物収量の改善されたキュウリ植物を生産する方法を提供することである。本発明の別の一目的は、作物収量の改善された栽培キュウリ植物を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、特定の野生型キュウリ登録種が、キュウリの栽培品種の収量を改善する方法に使用できることを発見した。この発見は、ドナー植物としての野生型キュウリ（Ｃｕｃｕｍｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）登録種ＰＩ１６９３８３（図２参照）由来の染色体セグメントを、レシピエントとしての市販用キュウリハイブリッド（やはり、Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）の親のうちの１つの植物における対応する染色体位置に移入することによって開発された、遺伝子移入系（ＩＬ：ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅ）ライブラリーを調査したときにもたらされた。開発されたＩＬライブラリーのフェノタイピングによって、遺伝子移入系の幾つかの収量が著しい増加を示した。詳細なマッピング研究によって、改善された収量特性が連鎖群４におけるＰＩ１６９３８３由来の３個のセグメントに関連することが明らかになった。栽培キュウリ植物の対応する染色体におけるこれらのセグメントの遺伝子移入は、前記栽培キュウリ植物の子孫において収量の増加をもたらした。遺伝子移入セグメントは、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｉｔ Ｌｏｃｉ）として特徴づけることができ、キュウリのゲノムにおけるこれらのＱＴＬの位置は、７種類のＡＦＬＰマーカーによって規定された。遺伝子移入の更なるフェノタイピングは、異型接合的状況及びハイブリッド状況で実施された。結果を下記実施例に示す。
【００１２】
この知見に基づいて、本発明者らは、改善された収量に関連した望ましい表現型特性のための新規遺伝的基盤を提供する。この遺伝的基盤は、野生型キュウリ（Ｃｕｃｕｍｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）登録種ＰＩ１６９３８３に存在するものである。
【００１３】
高収量の表現型特性の根底にある遺伝子又は原因配列は（まだ）特定されていないが、遺伝子又は原因配列のゲノム位置（すなわち、座）が決定された。これは、遺伝子又は制御配列が所望のキュウリ育成系統に導入される育種プロセスを促進する。
【００１４】
第１の態様においては、本発明は、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有するキュウリ育成系統の植物であって、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群３及び／又は４上の遺伝子移入であり、前記植物が前記遺伝子移入のない前記キュウリ育成系統の植物よりも高収量を示す、キュウリ育成系統の植物を提供する。好ましくは、前記高収量とは、植物１本当たりのより高い総果実重量を指す。
【００１５】
例として、本発明者らは、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の植物を遺伝子移入のドナー系統として、キュウリ系統Ｐｙｒ４２の植物と交雑させた。キュウリ系統Ｐｙｒ４２の種子の代表試料は、ＮＣＩＭＢ、スコットランド、アバディーンに受託番号ＮＣＩＭＢ４１５９４及び寄託者参照番号Ｐｙｒ４２で寄託されている。生成した子孫を、Ｐｙｒ４２を反復親として用いて戻し交雑させた。本明細書では収量改善ＱＴＬと称する遺伝子移入を含む植物は、前記遺伝子移入のないＰｙｒ４２系統の植物よりも高収量の植物を生成することが見いだされた。
【００１６】
本発明の態様においては、収量増加は、好ましくは、植物１本当たりの総果実重量が、前記遺伝子移入のない前記キュウリ育成系統の植物に比べて、少なくとも３〜５％、より好ましくは少なくとも１０％増加するようなものである。
【００１７】
植物１本当たりの総果実重量とは、好ましくは、１収穫期間に植物１本で生産される販売可能な果実の総重量を表すものとする。キュウリは、販売重量で収穫され、販売重量の多数の果実をつける植物は、販売重量未満の多数の果実をつける植物よりも有利である。販売可能な果実の重量は、キュウリのタイプに応じて決まる。薄切り用及びベイトアルファ（Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａ）は、ピクルス用よりも販売可能な果実の重量が大きい。好ましくは、本発明では収量増加とは、薄切り用、Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａ及び長いキュウリ（Ｌｏｎｇ Ｄｕｔｃｈ又はヨーロッパ温室キュウリ）、最も好ましくは長いキュウリの収量増加を指す。本発明の好ましいキュウリ果実は、２６、最も好ましくは２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５ｃｍの長さである。本発明の植物の果実の長さ／直径比は、好ましくは４、５、６、７、８、９以上、例えば２５である。本発明の植物の販売可能な果実の重量は、好ましくは１５０〜９００ｇ、より好ましくは２００〜８００ｇ、更により好ましくは２５０〜６００ｇである。典型的な販売可能な果実の重量は、キュウリのタイプに大きく左右され得る。Ａｍｅｒｉｃａｎ薄切り用の場合、販売可能な果実の重量は約１５０〜２３０ｇであるが、ヨーロッパ温室キュウリの場合、販売可能な果実の重量は典型的には約３００〜７００ｇである。Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａの場合、販売可能な果実の重量は約９０〜２００ｇである。典型的には、Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａキュウリは長さ１２〜１８ｃｍである。ピクルス用タイプの場合、販売可能な果実の重量は約８０〜１１０ｇである。典型的には、ピクルス用キュウリは長さ９〜１２ｃｍである。これらの果実重量は商業的育成条件下で得られ、植物は最適性能のために剪定及び収穫される。かかる条件下で、本明細書で企図される販売可能な果実の重量に達する。
【００１８】
好ましい一実施形態においては、本発明によるキュウリ育成系統の植物は、本質的に、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の特定の遺伝子移入を獲得し、前記遺伝子移入は、高収量に関連したＱＴＬを含む連鎖群３及び／又は４上に位置する。遺伝子移入を受けた植物は、同じドナーから別の遺伝子移入を得ることもあるが、大多数のレシピエントゲノムが不変であり、その結果、育成系統植物の表現型が本質的に保存されることが好ましい。これは、ＰＩ１６９３８３系統の植物をキュウリ育成系統の植物と単に交雑させるだけでは、本明細書に定義された収量ＱＴＬの遺伝子移入が得られず、一組みのＰＩ１６９３８３由来の染色体と前記キュウリ育成系統の植物由来の別の染色体とを有するハイブリッドが生成するにすぎないので、達成することができない。代わりに、ＰＩ１６９３８３における収量増加に関連した連鎖群３及び／又は４上のセグメントは、キュウリ育成系統の植物を交雑させることと、それに続いて自家受粉及び／又は（反復親として前記キュウリ育成系統の別の植物に）戻し交雑すること、並びに遺伝子移入を有する前記自家受粉及び／又は戻し交雑の子孫集団からマーカー利用選抜を使用して植物を選抜することの１つ以上のステップとによって、キュウリ育成系統の植物のゲノムに移入することができる。
【００１９】
好ましい一実施形態においては、連鎖群３及び／又は４上の前記遺伝子移入は、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連したセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連したセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連したセグメント
からなる群から選択される連鎖群４上の少なくとも１個のセグメント、及び／又は
連鎖群３の染色体置換
を含む。
【００２０】
遺伝距離は、図１でセンチモルガンで示し、表示され、検討中の集団に対して決定された。これらの値は、別の集団では異なり得る。したがって、マーカー自体がＱＴＬの位置を最適に規定する。図は、高収量に関連したセグメントを規定しないマーカーも示す。
【００２１】
前記遺伝子移入を有するキュウリ育成系統の植物は、系統をますます純粋又は近交系にするために、反復親に戻し交雑する連続ステップによって、エリート系統にすることができる。したがって、本発明は、高収量を有するエリート系統も提供する。前記エリート系統は、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有し、前記遺伝子移入は、収量増加に関連した連鎖群３及び／又は４上の遺伝子移入である。
【００２２】
別の一態様においては、本発明は、本発明のキュウリ育成系統の植物を交雑又は自家受粉させることによって生産されるキュウリ種子を提供する。好ましくは、前記種子はハイブリッド種子、特にＦ１ハイブリッド種子である。かかるハイブリッド種子は、例えば、本発明の２つのエリート系統を交雑させることによって生産することができる。
【００２３】
別の一態様においては、本発明は、本発明の種子を育成することによって生産されるキュウリ植物を提供する。別の一態様においては、本発明は、この植物の植物部分を提供する。好ましくは、前記植物部分はキュウリ果実又は種子である。
【００２４】
別の一態様においては、本発明は、上記キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する本発明のキュウリの育成系統（好ましくは、エリート系統）の植物を別のキュウリ植物と交雑させ、得られるハイブリッドキュウリ種子を収穫することを含む、ハイブリッドキュウリ種子を生産する方法を提供する。好ましい一実施形態においては、前記別のキュウリ植物は、キュウリの育成系統の植物、より好ましくは（異なる）エリート系統の植物である。前記別のキュウリ植物は、好ましくは、上記キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する植物である。
【００２５】
別の一態様においては、本発明は、本発明の方法によって生産されるハイブリッドキュウリ種子を提供する。このハイブリッドキュウリ種子は、上記キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入をキュウリの育成系統（好ましくは、エリート系統）のゲノムバックグラウンド中に異型接合的又は同型接合的に含み、前記遺伝子移入が好ましくは上記ＡＦＬＰマーカーによって規定されることを特徴とする。このハイブリッド種子は、発芽すると、本発明のキュウリの育成系統（好ましくは、エリート系統）の前記植物と上記別のキュウリ植物との正常な交雑種の全特性を有する（すなわち、かなりの商品価値のある販売可能な果実をつける）ハイブリッドキュウリ植物をより高収量で与える。同型接合植物と異型接合植物のどちらも本発明の一部である。というのは、収量特性は、相加的特徴であり、異型接合植物でも発現するからである。
【００２６】
別の一態様においては、本発明は、本発明のハイブリッドキュウリ種子を育成することによって生産されるハイブリッドキュウリ植物を提供する。
【００２７】
別の一態様においては、本発明は、本発明のハイブリッドキュウリ植物の植物部分を提供する。
【００２８】
別の一態様においては、本発明は、キュウリ育成系統の植物の収量を改善する方法を提供する。前記方法は、
ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記キュウリ育成系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合であるキュウリ育成系統の植物を生産するステップと
を含む。
【００２９】
かかる方法の好ましい一実施形態においては、前記キュウリ育成系統はエリート系統である。
【００３０】
別の一態様においては、本発明は、Ｆ１キュウリハイブリッドの収量を改善する方法を提供する。前記方法は、
ａ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの少なくとも第１の親系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの前記親系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合である前記Ｆ１キュウリハイブリッドの親系統を生成するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記親系統を、高収量を有するＦ１ハイブリッドの生産のための親系統として使用するステップと
を含み、ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜はマーカー利用選抜によって実施される。
上記方法の好ましい実施形態においては、マーカー利用選抜手順は、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に対する選抜を含む。
【００３１】
更に別の一態様においては、本発明は、本発明による方法によって得られるキュウリ育成系統又はＦ１キュウリハイブリッドを提供する。更に別の一態様においては、本発明は、キュウリにおける高収量に関連したＱＴＬを含む単離核酸配列を提供する。前記ＱＴＬは、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント
によって規定される。
【００３２】
更に別の一態様においては、本発明は、キュウリ植物における高収量に関連したＱＴＬの検出のための、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２からなる群から選択される遺伝マーカーの使用を提供する。
【００３３】
更に別の一態様においては、本発明は、キュウリ植物、又は種子を含めたその部分を選抜する方法であって、
（ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させ、前記交雑から種子を得、前記種子を子植物に育成することによって、子孫キュウリ植物又はその部分を生産するステップと、
（ｂ）キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入セグメントの存在について前記子孫キュウリ植物又はその部分を試験し、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の種子の代表試料がＮＣＩＭＢ、スコットランド、アバディーンに受託番号ＮＣＩＭＢ４１５３２及び寄託者参照番号ＰＩ１６９３８３で寄託されており、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群４上の遺伝子移入であるステップと、
（ｃ）前記試験から得られる情報に基づいて前記子孫キュウリ植物又はその部分を選抜するステップと、
（ｄ）場合によっては、更なる育種を考慮するために前記情報を使用するステップと
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】連鎖群４（全長１００．１ｃＭ）の遺伝地図である。マーカーの識別情報及びそのそれぞれの相対的位置を示し、収量に対する効果を有する（＋）又は持たない（−）（左側に示した）遺伝子移入セグメントとの関連も示す（表２と比較されたい。）。収量に対して効果を有することが見いだされた連鎖群４上の３個のセグメントを図の下に「＋」で示す。
【図２】（左側、「ＩＬ０６ＡＢ」によって示される）実用品種に近いＩＬ、及び（右側、「ドナー０６ＡＢ」によって示される）ドナーＰＩ１６９３８３から得られる果実の写真である。果実は、植物の一わきの下（ａｒｍｐｉｔ）から収穫される。
【図３】本明細書に定義されたプライマー組合せＥ１２／Ｍ２４を用いて増幅された、（４７レーンの各々で異なる）選抜されたキュウリ植物のゲノムのＡＦＬＰパターンを示す、ＡＦＬＰゲルの部分的（切り抜き）画像である。長さ１７６及び１７７塩基対の断片は、隣接する矢印（左）で示され、両アレルマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２／Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１を示す。ゲルは上から下に泳動された。
【図４】本明細書に定義されたプライマー組合せＥ１１／Ｍ６２を用いて増幅された、（４９レーンの各々で異なる）選抜されたキュウリ植物のゲノムのＡＦＬＰパターンを示す、ＡＦＬＰゲルの部分的（切り抜き）画像である。マーカーＥ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１を示す２００塩基対の断片を矢印で示す（左）。
【図５】Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓの染色体３（連鎖群３）の連鎖地図である。本願は、染色体３の染色体置換の使用も企図する。かかる置換系統においては、連鎖群３におけるマーカーによって特徴づけられる染色体を除いて、すべての核ＤＮＡが反復親から生ずる。好ましくはユニークであり遺伝的に連鎖した、連鎖地図に記されたマーカーに関連するすべてのＤＮＡがドナー親ＰＩ１６９３８３から生ずる。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書では「キュウリ」という用語は、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｈａｒｄｗｉｃｋｉｉ（Ｒｏｙｌｅ）又はやせ細ったキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ又は栽培キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（中国群）又は網目模様の黄色キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．（ガーキン群）又はピクルス用キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（インド群）又は白縞キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（日本群）又は日本キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（レバノン群）又はレバノンキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（ロシア群）又はロシアキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（種無し群）又は種無しキュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ（標準群）又は普通のキュウリ／温室キュウリ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ Ｈｏｏｋ．ｆ．又は褐色網目模様のキュウリ、及びＣｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｘｉｓｈｕａｎｇｂａｎｎａｎｅｓｉｓ ｉｎｅｄ又はシーサンパンナウリを含めて、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．種を指す。植物学的には、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．という名称は、野生種を指すが、種子及び野菜の取引では、分類学者が栽培品種に適用し得る任意のより長い植物名の同義語として使用される。「Ｃ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ」は、ＵＳＤＡ ＧＲＩＮデータベースに入力されたほぼ１５００の登録種に基づいて、一般に使用される。しかし、分類学者は植物学的変種「ｖａｒ．」と称する栽培植物を認めないので、この名称は将来変わり得る。「キュウリ」という用語は、（アメリカ及びヨーロッパ）ピクルス用、（アメリカ及びヨーロッパ）薄切り用、ヨーロッパ温室（単為結実）、中東（Ｂｅｉｔ Ａｌｐｈａタイプ）、及び東洋つる棚（ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｒｅｌｌｉｓ）バープレス（Ｂｕｒｐｌｅｓｓ）キュウリという表現を含む。ヨーロッパ、アメリカ、中東又は東洋という用語は、本発明のキュウリの地域的起源又は産地を限定するものではなく、単にキュウリ育種分野において市場タイプの一般に使用される参照にすぎない。
【００３６】
Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ登録種ＰＩ１６９３８３は、アメリカ、アイオワ州エイムスのＮｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ（ノース・セントラル・リージョナル・プラント・イントロダクション・ステーション）（ＵＳＤＡ，ＡＲＳ，ＮＣＲＰＩＳ，Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（アイオワ州立大学），Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ）によって維持され、この登録種の種子は、自由に配布することができる。この登録種は、生物学的状態「野生型」を有する。この植物学的変種は、トルコのイスタンブールで最初に収集された。その果実は、熟すと典型的な黄色を帯びる。低収量であり、一般的には緑色果実が要求されることから、商品価値が限られる。本発明の植物に言及するときには、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３への言及は意図されず、したがってかかる植物は本発明から除かれる。この登録種についての更なる情報は、Ｏｎｌｉｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ（生殖質資源情報ネットワークのオンライン・データベース）（ＧＲＩＮ），ＵＳＤＡ，ＡＲＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（国立遺伝資源プログラム）．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（国立生殖質資源研究所），メリーランド州ベルツビル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｓ−ｇｒｉｎ．ｇｏｖ）（２００７年８月８日））から入手することができる。キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の種子の代表試料は、ＮＣＩＭＢ、スコットランド、アバディーンに本願の出願人／譲受人によって２００７年１２月１７日に受託番号ＮＣＩＭＢ４１５３２及び寄託者参照番号ＰＩ１６９３８３で寄託された。
【００３７】
本明細書では「交雑」という用語は、雄株（又は配偶子）による雌株（又は配偶子）の受精を指す。「配偶子」という用語は、植物において配偶体から有糸分裂によって産生され、有性生殖に関与する、半数体生殖細胞（卵又は精子）を指す。有性生殖中には、異性の２個の配偶子が融合して二倍体接合子を形成する。この用語は、一般に、（精細胞を含めた）花粉及び（卵子を含めた）胚珠という表現を含む。したがって、「交雑」は、一般に、別の個体の花粉による１個体の胚珠の受精を指すのに対して、「自家受粉」とは、同じ個体の花粉による１個体の胚珠の受精を指す。ゲノム領域又はセグメントの遺伝子移入を行う状況において交雑に言及するときには、一植物の染色体の一部のみを別の植物の染色体に移入するために、両方の親系統のゲノムの無作為部分が親系統における配偶子の生成において交差現象の発生によって交雑中に組み換えられる必要があることを当業者は理解するであろう。したがって、両方の親のゲノムは単細胞中で交雑によって結合しなければならず、前記細胞からの配偶子の生成、及び受精におけるその融合後、遺伝子移入現象をもたらす。
【００３８】
本明細書では「ハイブリッド」という用語は、２つの遺伝的に異なる個体間の交雑種の任意の子孫を意味し、より好ましくは、この用語は、種子から親の形質どおりに再生しない、２つの（エリート）育成系統間の交雑種を指す。本発明のハイブリッドキュウリは、好ましくは、強い雌性を示す。
【００３９】
本明細書では「育成系統」という用語は、商業的に価値がある又は農学的に望ましい諸特性を有する栽培キュウリの系統を指し、野生型品種又は在来種と対比される。特に、育成系統は、優れた果実品質（まっすぐな円柱状のずんぐりした形状及び均一な濃緑色）を有することを特徴とする。この用語は、Ｆ１ハイブリッドの生産に使用される、本質的に同型接合的な、通常は近交系の、植物系統である、エリート育成系統又はエリート系統という表現を含む。本発明の育成系統は、好ましくは、ウドンコ病抵抗性を示す。
【００４０】
本明細書では「収量」という用語は、果実収量（キュウリ）を指し、畑１ｍ２当たりの総果実重量（ｋｇ）／収穫期間、植物１本当たりの総果実重量（ｋｇ）／収穫期間、及びその組合せで表される生産量を指し得る。「収穫期間」という用語は、最初の販売可能な果実の生産から作物の活性化が必要な生産期の最後までの期間を指し、一般に温室のキュウリでは約１２週間である。
【００４１】
本明細書では「対立遺伝子（単数又は複数）」という用語は、遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれかを意味し、対立遺伝子のすべてが少なくとも１つの形質又は特性に関係する。二倍体細胞又は生物体においては、所与の遺伝子の２個の対立遺伝子は、１対の相同染色体上の対応する座を占める。本発明はＱＴＬ、すなわち１個以上の遺伝子だけでなく制御配列も含み得るゲノム領域に関するので、場合によっては、「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）と称する方がより正確である。しかし、その場合、「対立遺伝子」という用語は、「ハプロタイプ」という用語を含むと理解すべきである。
【００４２】
「遺伝子」は、染色体上の特定の位置を占め、かつ植物における特定の表現型特性又は形質に対する遺伝的指令を含む、（ＤＮＡ配列によって示されることが多い）遺伝単位として本明細書では定義される。ＱＴＬ（量的形質遺伝子座）は、染色体上の特定の位置を占め、かつ植物における特定の表現型特性又は形質に対する遺伝的指令を含む、（１個以上の分子ゲノムマーカーによって示されることが多い）遺伝単位である。遺伝子とは対照的に、ＱＴＬの正確な境界は知られていないが、遺伝子マッピングの分野で周知であるファインマッピング技術と、それに続くＤＮＡ塩基配列決定ルーチンを使用して、当業者が過度の負担なしに見つけることができる。ＱＴＬは、その発現が、単独で若しくは別の遺伝子と組み合わせて、発現される表現型形質をもたらす少なくとも１個の遺伝子をコードし、又はその発現が、単独で若しくは別の遺伝子と組み合わせて、発現される表現型形質をもたらす少なくとも１個の遺伝子の発現を制御する少なくとも１個の調節領域をコードする。ＱＴＬは、１個以上の分子ゲノムマーカーを使用して、ＱＴＬを含む遺伝子移入のドナーのゲノムにおけるその遺伝子位置を示すことによって規定することができる。１個以上のマーカーは、特定の座を示す。各座間の距離は、通常、同じ染色体上の座の交差頻度によって測定される。２個の座が遠く離れているほど、それらの交差が起こる可能性は高くなる。逆に、２個の座が近いと、それらの交差が起こる可能性は低くなる。概して、１センチモルガン（ｃＭ）は、座（マーカー）間の１％の組み換えに等しい。ＱＴＬを複数のマーカーによって示すことができるときには、終点マーカー間の遺伝距離がＱＴＬサイズを示す。ＱＴＬを規定するマーカーは、ＱＴＬと連鎖したマーカー、又はＱＴＬと連鎖不平衡にあるマーカーであり得る。
【００４３】
本明細書では「分子ゲノムマーカー」又は簡潔に「マーカー (Marker)」という用語は、核酸配列の特性差を可視化する方法に使用される指標を指す。かかる指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、挿入変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴的（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）増幅領域（ＳＣＡＲ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ：ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー、又は特定の遺伝子及び染色体位置を規定する本明細書に記載のマーカーの組合せである。したがって、本明細書に定義された「ＱＴＬと連鎖した分子マーカー」とは、ＳＮＰ、挿入変異、及びより一般的なＡＦＬＰマーカー、又は同分野で使用される任意の他のタイプのマーカーを指し得る。本明細書で名前を挙げるＡＦＬＰマーカーに関して、ＡＦＬＰマーカーは、２個のＡＦＬＰプライマーが隣接するキュウリ特異的ＤＮＡ配列を示し、ＡＦＬＰプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩの切断部位と合致する「コアプライマー」Ｅ及びＭからなり（Ｖｏｓ（ヴォス）等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）２３：４４０７−４４１４；Ｂａｉ（バイ）等、２００３，Ｍｏｌ．ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（モレキュラー・プラント・マイクロープ・インタラクション） １６：１６９−１７６）、示した２又は３個の余分な選択塩基が続き、各々「コアプライマー」が伸長される選択ヌクレオチドを特定する２桁のコードが続く（１１：ＡＡ；１２：ＡＣ；１３：ＡＧ；１４：ＡＴ；１５：ＣＡ；１６：ＣＣ；１７：ＣＧ；１８：ＣＴ；２１：ＧＧ；２２：ＧＴ；２４：ＴＣ；２５：ＴＧ；６０：ＣＴＣ；６２：ＣＴＴ）。したがって、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２は、全長６３ｂｐの断片を生成する増幅プライマーＥｃｏＲＩ＋ＡＣ及びＭｓｅＩ＋ＴＣを用いて得られるマーカーを表す。断片の長さは、断片の検出に使用される方法に依存し得、その真の長さ±少数塩基の近似値である。本明細書に記載のマーカーを規定する際には、染色体上の該マーカーの位置を連鎖地図中の別のマーカーに対して表記すべきである。したがって、マーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２は、そのプライマー配列、及び増幅産物としてのその長さと、図１においてｃＭ単位の対応する距離で示されるＥ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１及び／又はＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２に対するその位置、又は本明細書に記載のように、別のマーカーに対するその位置との両方で定義される。
【００４４】
「座」は、所与の植物種の染色体上の所与の遺伝子が占める位置として本明細書では定義される。
【００４５】
本明細書では「異型接合」という用語は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する座に存在するときの遺伝子状態を意味する。
【００４６】
本明細書では「同型接合」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する座に存在するときの遺伝子状態を意味する。
【００４７】
本明細書では「遺伝子移入系」という用語は、ＩＬと略記され、他の点では均一なバックグラウンドにおいてドナー親から生ずる明確な染色体セグメント（好ましくは、マーカー分解能に応じた単一の明確な染色体セグメント）を収容し、典型的には９５％を超えるレシピエントゲノム（通常、レシピエント及び反復親として使用される育成系統のゲノム）を含む系統を指す。（ドナーのゲノム全体を一緒に網羅する）ＩＬライブラリー中の異なるＩＬと反復親の表現型変異は移入セグメントに直接関連するので、ＩＬはＱＴＬの特定を容易にする。遺伝子移入系は、典型的には同型接合的である。
【００４８】
本明細書では「純粋近交系」又は「近交系」という用語は、自家受粉の繰り返しによって得られる実質的に同型接合的な植物又は植物系を指す。
【００４９】
「組み換え現象」とは、減数分裂交差現象を指す。
【００５０】
本明細書では「遺伝子移入」という用語は、個体、種、変種又は栽培変種を交雑させることによって、一個体、種、変種又は栽培変種から別の個体、種、変種又は栽培変種のゲノムに移動した、ゲノムセグメントを指す。
【００５１】
本明細書では「移入すること」、「移入する」及び「移入された」という用語は、個々の遺伝子又は形質全体が、種、変種又は栽培変種を交雑させることによって、一個体、種、変種又は栽培変種から別の種、変種又は栽培変種のゲノムに移動する、自然と人工プロセスの両方を指す。植物育種においては、プロセスは、通常、移入された遺伝子又は形質に加えて反復親の特性を本質的に有するますます同型接合的な植物を規定する、自家受粉又は反復親への戻し交雑を含む。
【００５２】
「戻し交雑」という用語は、２つの親系統間の交雑から得られる植物をその親系統の一方と交雑させるプロセスを指し、戻し交雑に使用された親系統を反復親と称する。戻し交雑を繰り返すと、ゲノムはますます同型接合的又は近交系になる。
【００５３】
「自家受粉」という用語は、個体がそれ自体の花粉で授粉又は受精する自家受精プロセスを指す。
【００５４】
「遺伝子操作」、「形質転換」及び「遺伝子改変」はすべて、別の生物体のＤＮＡ、通常は染色体ＤＮＡ又はゲノムへの単離及びクローン化された遺伝子の移行の同義語として本明細書では使用される。
【００５５】
本明細書では「分子マーカー」という用語は、核酸配列の特性差を可視化する方法に使用される指標を指す。かかる指標の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライトマーカー（例えば、ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）マーカー、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー、又は特定の遺伝子及び染色体位置を規定する本明細書に記載のマーカーの組合せである。
【００５６】
本明細書では「植物部分」という用語は、植物中で損なわれていない植物細胞などの単細胞及び細胞組織、細胞塊、並びにキュウリ植物を再生することができる組織培養物を含めて、キュウリ植物の一部を指す。植物部分の例としては、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、やく、花、果実、茎 苗条及び種子の単細胞及び組織、並びに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、やく、花、果実、茎、苗条、若枝、台木、種子、プロトプラスト、カルスなどが挙げられるが、それだけに限定されない。本発明の植物部分は、本発明の態様においては、生及び／又は加工された形態で使用することができる。
【００５７】
本明細書では「集団」という用語は、共通の遺伝的起源を有する植物の遺伝的に異質なコレクションを意味する。
【００５８】
本明細書では「変種」という用語は、構造又は遺伝的な特徴及び／又は性能によって同じ種内の別の変種から識別することができる類似植物の群を指す。
【００５９】
（栽培品種を表す）「栽培変種」という用語は、通常は天然に存在しないが、ヒトによって栽培された、すなわち「野生型」状態以外の生物学的状態を有する、変種を意味するのに本明細書では使用される。「野生型」状態は、植物又は登録種の最初の栽培されていない状態、すなわち自然状態を示す。「栽培変種」という用語は、半自然、半野生、やせ細った、伝統的栽培変種、在来種、育種材料、研究材料、ブリーダー系（ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓ ｌｉｎｅ）、合成集団、ハイブリッド、創始者株（ｆｏｕｎｄｅｒ ｓｔｏｃｋ）／基礎集団、近交系（ハイブリッド栽培変種の親）、分離集団、変異体／遺伝株、及び進化した／改善された栽培変種を含むが、それだけに限定されない。
【００６０】
「エリートバックグラウンド」という用語は、ＱＴＬ又は遺伝子移入の遺伝的背景が育成系統の遺伝的背景であることを示すのに本明細書では使用される。本明細書では、自然バックグラウンドは、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の遺伝的背景である。キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の連鎖群（染色体）４から育成系統の植物の染色体４上の同じ位置へのＱＴＬを含むＤＮＡの移行を含む方法は、ＱＴＬがその天然の遺伝的背景ではなくエリートバックグラウンドに存在する結果になる。この用語は、異型接合的状況と同型接合的状況の両方を含む。
【００６１】
好ましい実施形態の説明
【００６２】
より高収量の植物の生産
【００６３】
本明細書で確認される遺伝子移入の効果は、果実重量の高収量である。これは、多数の果実間の関係が研究されたＳｈｅｔｔｙ（シェティ）等（Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ（クロップ・サイエンス） ４２：２１７４−２１８３（２００２））による刊行物とは対照的である。Ｓｈｅｔｔｙ等は、ＰＩ１６９３８３の実際の収量データを開示せず、その性能について単に結論を下しているだけである。さらに、Ｓｈｅｔｔｙ等は、晩生、低収量、雌性型近交系のＰＩ１６９３８３を含めた遺伝子バンク登録種を比較した。近交系の１つは、例えばＷＩ２７５７であった。ＷＩ２７５７は、１ｈａ当たり２７．０００個の販売可能な果実をつけ（Ｓｈｅｔｔｙ等、表５）、これは１平方メートル当たり２．７個の販売可能な果実に等しい。それに対して、今回の試験のＰＩ１６９３８３は、１平方メートル当たり３．４個の販売可能な果実をつけることが判明したが、今回の試験に使用した近交系は、はるかに高い収量を示し、１平方メートル当たり約７個以上の販売可能な果実をつける。Ｓｈｅｔｔｙ等は、その実験設定の結果として、ＰＩ１６９３８３をより高収量の登録種であると考えた。しかし、通常の高収量近交系と比較して、ＰＩ１６９３８３は、植物１本又は１ｍ２当たりの果実重量、さらに、植物１本当たりの果実数の点で低収量登録種である。これは、本発明の実施例に記載のデータによって強調される。そのデータは、Ｓｈｅｔｔｙ等の観察を適切にとらえ、ＰＩ１６９３８３が栽培キュウリと比較しても少ない果実をつけることを示している。しかし、ＰＩ１６９３８３がキュウリの数によって高収率を示すと考えられるとしても、ＰＩ１６９３８３が、重量の点で高収量をもたらす遺伝子領域を含むことは依然として予想外である。結局、数量と重量の負の相関は、植物育種にはつきものである。一例を下記図２に示す。図２は、ドナー系統ＰＩ１６９３８３が多数の小さいキュウリを房につけるのに対して、遺伝子移入系（ＩＬ）がそれより少ない大きい果実を房につけることを示している。別の周知の例としては、果実サイズがかなり異なるにもかかわらず、サクランボ対ビーフステークトマトからの等重量の収量が挙げられる。したがって、任意の高重量収量遺伝子移入が、高数量収量を示すと報告されたＰＩ１６９３８３に由来し得ることは予想外であった。
【００６４】
キュウリ育種においては、数量収量と重量収量は、別々に考慮される形質である。果実１個当たりの重量は、市場の要件によって決まる固定値であり、重量の高収量は、（小さいキュウリの）数の高収量よりも重要である。
【００６５】
本発明者らは、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３において、高収量に関連した遺伝子又は制御配列が連鎖群４上に存在することを発見した。Ｈｏｒｅｊｓｉ（ホジエイシ）等、（２０００）によれば、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌの連鎖群４は、べと病（ｄｍ）抵抗性に対する抵抗性の遺伝子も含む。ＬＧ４は、さらに、以下の周知のマーカーの１種類又は組合せを特徴とし得る：１）ＣＳＣ４４３／Ｈ３（ＲＦＬＰマーカー、Ｂｒａｄｅｅｎ（ブラディーン）等、２００１，Ｇｅｎｏｍｅ（ゲノム） ４４：１１１−１１９）、２）ＢＣ５５１．５５０（ＲＡＰＤマーカー、Ｐａｒｋ（パーク）等、２０００，Ｇｅｎｏｍｅ ４３：１００３−１０１０）、３）ＰＥＲ（アイソザイム、Ｂｒａｄｅｅｎ等、上掲）。
【００６６】
最終的な染色体番号（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｎｕｍｂｅｒ）は、高収量用ＱＴＬが位置するキュウリ染色体にまだ割り当てられていない。しかし、染色体は、これら及び別のゲノム領域が位置する連鎖群（ＬＧ４）を参照して明示することができる。連鎖群という用語は、収量改善を与える対立遺伝子が位置し、染色体と同じ階層レベルを有する、物理的ゲノム単位を指すのに本明細書では使用される。
【００６７】
第１の方法は、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の植物から目的キュウリ系統の植物に高収量用ＱＴＬを移入することを含む。これは、ＱＴＬが目的キュウリ系統の遺伝的背景に存在する状況をもたらす。子植物における適切な遺伝子移入の確立は、ＱＴＬ特異的マーカーを使用することによってモニターすることができる。
【００６８】
組み換えは、減数分裂中の２個の相同染色体間の情報交換である。組み換え植物では、染色体内の特定の位置に最初に存在するＤＮＡは、別の植物のＤＮＡと（すなわち、母性は父性と、又は父性は母性と）交換される。必要な材料のみを交換し、染色体上の価値ある最初の情報をできるだけ維持するために、通常は２回の交差現象を必要とする。かかる組み換えを見いだす通常の方法は、Ｆ２植物集団をスクリーニングすることである。この集団は、まれな（低頻度の）二重組み換えを検出するために、十分なサイズでなければならない。組み換え頻度は以下のように計算することができる。例えば、１０ｃＭ領域における組み換えは、１０％の頻度で見つけることができる（１センチモルガンは、検定交雑における１％の組み換え子孫として定義される。）。
【００６９】
本発明は、今回、マーカー利用選抜（ＭＡＳ：ｍａｒｋｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のより良好なモデルを規定する。したがって、本発明は、植物育種方法に関し、さらに、植物、特にキュウリ植物、特に育種計画に使用される育種植物としての栽培キュウリ植物、又は本明細書では農学的に望ましい植物とも称する、価値あるキュウリ果実の生産に特に関連した、所望の遺伝子型又は潜在的な表現型特性を有するための栽培キュウリ植物を選抜する方法に関する。ここで、栽培植物は、所望の遺伝子型又は潜在的表現型特性を有するために農業又は園芸作業において意図的に選抜された植物、又は意図的に選抜された植物に由来する植物、特に同系交配によって得られる植物として定義される。
【００７０】
収量改善ＱＴＬは相加的形質であるので（ハイブリッドは、２種類の親の中間的な表現型を発現する。）、収量改善ＱＴＬはＦ１又はＢＣ１において植物収量を測定することによってモニターすることができる。しかし、これは管理条件下では多数の栽培週間を必要とするので、子植物における適切な遺伝子移入の確立を、以下に説明するシス又はトランスカップリングにおいて、本明細書に記載のＱＴＬ特異的マーカーを使用することによってモニターできることが特に有利である。したがって、ＭＡＳ又はＭＡＢ法を使用することによって、植物を選抜する方法が当業者に提供される。
【００７１】
したがって、本発明は、高収量を示すＣｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ種の植物を選抜する方法であって、前記植物において、本明細書に定義された収量改善ＱＴＬの連鎖群（染色体）４上の存在を検出することを含む、方法も提供する。かかる植物を選抜する本発明の好ましい方法において、該方法は、
ａ）キュウリ植物からゲノムＤＮＡの試料を作製すること、
ｂ）前記ゲノムＤＮＡ試料において収量改善ＱＴＬと連鎖した少なくとも１個の分子マーカーを検出すること
を含む。
【００７２】
キュウリ植物からゲノムＤＮＡの試料を作製するステップは、当分野で周知である標準ＤＮＡ単離方法によって実施することができる。
【００７３】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、好ましい一実施形態においては、ＡＦＬＰ法に使用された１セットの双方向性プライマーを使用してＱＴＬ用マーカーである増幅産物を産生することを含むことができる。かかる１セットのプライマーを、本明細書ではＡＦＬＰマーカーを規定するプライマー、又はマーカー特異的プライマーと称する。双方向性とは、プライマーの方向が、核酸増幅反応において、一方は順方向プライマーとして機能し、一方は逆方向プライマーとして機能するようなものであることを意味する。
【００７４】
あるいは、分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、別の好ましい一実施形態においては、前記分子マーカーを規定する核酸配列に実質的に相補的である塩基配列を有する核酸プローブの使用を含むことができる。この核酸プローブは、前記分子マーカーを規定する核酸配列と厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する。適切な核酸プローブは、例えば、マーカーに対応する一本鎖の増幅産物とすることができる。
【００７５】
分子マーカーを検出するステップ（ステップｂ）は、前記ゲノムＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、前記ＱＴＬを検出することも含むことができる。これは、１セットのマーカー特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応を実施することによって適切に行うことができる。好ましい一実施形態においては、前記ステップｂ）は、前記ＱＴＬ用ＡＦＬＰマーカーを規定する少なくとも１セットのプライマー、又は前記ＱＴＬ用ＡＦＬＰマーカーの核酸配列と厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する１セットのプライマーの使用を含む。
【００７６】
ステップｄ）の予測長さ又は予測核酸配列を有する増幅ＤＮＡ断片を検出するステップは、増幅ＤＮＡ断片が、マーカーが最初に検出された植物からのＤＮＡとの同じプライマーを用いた類似の反応に基づく予想長さに対応する長さ（±数塩基、例えば、１、２又は３塩基多い又は少ない長さ）、又は前記マーカーが最初に検出された植物におけるＱＴＬに関連したマーカーの配列に基づく予想配列に対応する（８０％を超える、好ましくは９０％を超える、より好ましくは９５％を超える、更により好ましくは９７％を超える、更により好ましくは９９％を超える相同性を有する）核酸配列を有するように好ましくは実施される。本明細書に定義された遺伝子移入を有する植物（ドナー計画）にないが、遺伝子移入を受ける植物（レシピエント植物）に存在するマーカー（いわゆる、トランスマーカー）も、子植物間の遺伝子移入を検出するアッセイに有用であり得るが、マーカーがないことを試験して、特定の遺伝子移入の存在を検出することが最適ではないことを当業者は承知している。
【００７７】
予測長さ又は予測核酸配列を有する増幅ＤＮＡ断片を検出するステップは、標準ゲル電気泳動技術によって、又は自動ＤＮＡ配列決定装置を使用することによって、実施することができる。これらの方法は、当業者に周知であるので、本明細書で述べる必要はない。マーカーは、そのプライマー配列に基づいて、増幅産物の長さ、及び連鎖地図上の別のマーカーに対するマーカー位置と組み合わせて、定義されることに留意されたい。
【００７８】
分子マーカー及びＱＴＬ
【００７９】
分子マーカーは、核酸配列の差の可視化に使用される。この可視化は、制限酵素を用いた消化後のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術（ＲＦＬＰ）、及び／又はポリメラーゼ連鎖反応法を用いた技術（例えば、ＳＴＳ、マイクロサテライト、ＡＦＬＰ）によって可能である。２つの親遺伝子型間の差はすべて、これらの親遺伝子型の交雑に基づくマッピング集団（例えば、ＢＣ１、Ｆ２）において分離する。異なるマーカーの分離を比較することができ、組み換え頻度を計算することができる。異なる染色体上の分子マーカーの組み換え頻度は、一般に５０％である。同じ染色体上に位置する分子マーカー間では、組み換え頻度は、マーカー間距離に依存する。低組み換え頻度は、染色体上のマーカー間の短い遺伝距離に対応する。すべての組み換え頻度を比較すると、染色体上の分子マーカーの最も論理的な順序が得られる。この最も論理的な順序を連鎖地図において示すことができる。連鎖地図上の高収量に関連した隣接又は近接マーカー群は、高収量に関連したＱＴＬの位置を正確に示す。
【００８０】
本明細書で特定するマーカーは使用することができ、以下に説明する本発明の種々の態様である。本発明の態様は、本明細書で特定するマーカーの使用に限定されない。態様は、本明細書に明示的に開示されないマーカー、さらにはまだ特定されていないマーカーを使用することもできることが強調される。形質発現が多数の予測できない因子に依存する遺伝単位「遺伝子」とは異なり、遺伝単位「ＱＴＬ」は、表現型の定量化可能な形質に直接関連したゲノム上の領域を意味する。したがって、遺伝子自体は植物育種にほとんど又は全く関係しないが、ＱＴＬは植物育種に直接適用することができる。
【００８１】
本明細書で特定されるＱＴＬは連鎖群４上に位置し、その位置は、幾つかの別の任意のマーカーによって最適に特徴づけられる。この検討では、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、及び挿入変異マーカーを使用したが、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、マイクロサテライトマーカー（例えば、ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）マーカー、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー又はこれらのマーカーの組合せを使用することもできた。一般に、ＱＴＬは、数百万塩基の領域に及ぶことがある。したがって、ＱＴＬの全配列情報を提供することは、実際には不可能であるだけでなく、不必要でもある。というのは、一連の近接ゲノムマーカーの存在と特定の表現型形質の存在との間で認められた相関を通じてＱＴＬが最初に検出される方法によって、子植物集団中で特定の表現型形質を示す遺伝的潜在能力を有する植物を追跡することができるからである。したがって、マーカーの非限定的リストを提供することによって、本発明は、育種計画におけるＱＴＬの有用性を規定する。
【００８２】
マーカーは、特定の品種系統に特異的である。したがって、特定の形質は特定のマーカーに関連する。本願に示すマーカーは、ＱＴＬの位置を示すだけでなく、植物における特定の表現型形質の存在とも相関する。ゲノム上のＱＴＬの位置を示す近接ゲノムマーカーは、主に任意又は非限定的であることに留意することが重要である。一般に、ＱＴＬの位置は、表現型形質と統計学的相関を示す、近接する一連のマーカーによって示される。マーカーがその一連の外側に存在すると（すなわち、あるしきい値未満のＬＯＤスコアを有するマーカー。マーカーが離れすぎて領域におけるマーカーとＱＴＬの組み換えが頻繁に起こりすぎ、マーカーの存在が表現型の存在と統計的に有意に相関しないことを示す。）、ＱＴＬの境界が設定される。したがって、指定領域内に位置する別のマーカーによってＱＴＬの位置を示すこともできる。
【００８３】
近接ゲノムマーカーは、個々の植物において、ＱＴＬ（したがって、表現型）の存在を示すのに使用することもでき、すなわち、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）手順に使用できることに留意することも更に重要である。原則的には、潜在的に有用であるマーカーの数は、有限であるが、極めて大きい可能性がある。当業者は、本願に記載のマーカーに加えて別のマーカーを容易に特定することができる。例えばあるしきい値を超える確立されたＬＯＤスコアを有するマーカーが広がるゲノム領域の物理的境界内にあり、それによって交雑においてマーカーとＱＴＬの組み換えが全く又はほとんど起こらないことを示す、ＱＴＬと連鎖した任意のマーカー、及びＱＴＬと連鎖不平衡にある任意のマーカー、及びＱＴＬ内の実際の原因となる変異を表すマーカーを、ＭＡＳ手順において使用することができる。これは、収量改善ＱＴＬに対するＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２、Ｅ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２などのＱＴＬに関連すると本明細書で認めたマーカーが、ＭＡＳ手順における使用に適したマーカーの単なる例であることを意味する。マーカーＥ２２Ｍ１２−Ｆ−２７８−Ｐ１及びＥ２２／Ｍ１２−Ｆ−０９２−Ｐ２も、図１に示す形質と連鎖しているので、使用することができる。これらのマーカーは、適切に、その存在がＱＴＬの存在と一致することを示す「シスマーカー」であり得る。さらに、ＱＴＬ又はその特定の形質付与部分が別の遺伝的背景（すなわち、別の植物系のゲノム）に移入されると、幾つかのマーカーはもはや子孫には存在しないこともあるが、形質は子孫中に存在する。これは、かかるマーカーが、最初の親系統におけるＱＴＬの特定の形質付与部分であるゲノム領域の外側にのみあることを示し、新しい遺伝的背景が、異なるゲノム機構を有することを示している。その欠如が子孫への遺伝因子の導入に成功したことを示すかかるマーカーは、「トランスマーカー」と称され、本発明下のＭＡＳ手順において同様に適切であり得る。
【００８４】
マーカーに関する本発明の収量ＱＴＬのハプロタイプは、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ０６３−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１トランス（マーカーの欠如）、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１トランス（マーカーの欠如）、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ２２Ｍ１２−Ｆ−２７８−Ｐ１トランス（マーカーの欠如）、Ｅ２２／Ｍ１２−Ｆ−０９２−Ｐ２シス（マーカーの存在）、Ｅ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２シス（マーカーの存在）である。Ｐ１又はＰ２はマーカーの親ラベル（ゲノムバックグラウンド）を示し、Ｐ１は反復親であり、Ｐ２はドナー親である。
【００８５】
ＱＴＬを特定した後、ＱＴＬ効果（改善された収量）は、例えば、検討中のＱＴＬに対する分離したＢＣ２Ｓ１子孫の収量を評価することによって確認することができる。好ましくは、本発明のＱＴＬの存在を検出することは、本明細書に定義されたＱＴＬマーカーの少なくとも１種類を用いて実施される。したがって、本発明は、前記マーカーを使用することによって、キュウリにおける改善された収量のためのＱＴＬの存在を検出する方法にも関する。
【００８６】
本発明のＱＴＬのヌクレオチド配列は、前記ＱＴＬに関連した１種類以上のマーカーのヌクレオチド配列を決定し、前記マーカー配列の内部プライマーを設計することによって解明することができる。次いで、内部プライマーを使用して、前記マーカー配列の外側の配列ＱＴＬを更に決定することができる。例えば、ＡＦＬＰマーカーのヌクレオチド配列は、対象植物のゲノム中の前記マーカーの存在の判定に使用される電気泳動ゲルから前記マーカーを単離し、例えば当分野で周知であるジデオキシ鎖終結法によって、前記マーカーのヌクレオチド配列を決定することによって得ることができる。
【００８７】
キュウリ植物におけるＱＴＬの存在を検出する方法の実施形態においては、該方法は、前記ＱＴＬと連鎖したマーカーの核酸配列と厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを生成するステップ、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをキュウリ植物の消化されたゲノム核酸と接触させるステップ、及び前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと前記消化されたゲノム核酸との特定のハイブリダイゼーションの存在を判定するステップも含むことができる。
【００８８】
好ましくは、前記方法は、前記キュウリ植物から得られる核酸試料に対して実施されるが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用することもできる。あるいは、より好ましい一実施形態においては、当業者は、ＱＴＬのヌクレオチド配列が決定された後に、厳密なハイブリダイゼーション条件下で前記ＱＴＬの核酸配列とハイブリッド形成可能な特定のハイブリダイゼーションプローブ又はオリゴヌクレオチドを設計することができ、かかるハイブリダイゼーションプローブをキュウリ植物における本発明のＱＴＬの存在を検出する方法に使用することができる。
【００８９】
原則的には、本明細書で使用される個々のＡＦＬＰマーカーは、指定マーカーコードを有する。このコードは、規定された登録種においてプライマーの増幅産物の長さを示す図と場合によっては組み合わせて、２種類のプライマーを規定する（上記表１の説明も参照されたい。）。したがって、ＡＦＬＰマーカーは、キュウリゲノムＤＮＡに対して増幅反応を実施することによって得られる一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ断片を規定する。増幅反応は、示した登録種の場合には、示した長さの断片をもたらす。さらに、マーカーは、５’−３’方向に、第１のプライマー配列、キュウリ特異的ＤＮＡ配列及び第２のプライマー配列からなる配列、及びその補足配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む。こうして２個のプライマーが隣接したキュウリ特異的ＤＮＡ配列。「キュウリ特異的ＤＮＡ配列」という用語は、それぞれのプライマーが隣接する領域のヌクレオチド配列を意味し、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３から増幅された配列、又はそれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列相同性を有する配列を表す。
【００９０】
トランスジェニック法による高収量を有するキュウリ植物の生産
【００９１】
本発明の別の一態様によれば、ＱＴＬを含む核酸（好ましくはＤＮＡ）配列を、高収量を有するキュウリ植物の生産に使用することができる。この態様においては、本発明は、改善された収量を有するキュウリ植物を生産するための、本明細書に定義されたＱＴＬ又はその収量改善部分の使用を規定する。この使用は、適切なレシピエント植物における前記ＱＴＬを含む核酸配列の導入を含む。上述したように、前記核酸配列は、適切なドナー植物に由来することができる。本発明による適切な収量改善ＱＴＬ源は、トルコ産のキュウリ在来種ＰＩ１６９３８３である。かかる植物は、例えば、Ｔ．Ｃ．Ｗｅｈｎｅｒ（ウェナー），ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｅｎｅ ｃｕｒａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｃｕｒｂｉｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ（ウリ科植物の遺伝学共同体のためのキュウリ遺伝子のキュレータ）（ＣＧＣ），Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（デパートメント・オブ・ホルティカルチュラル・サイエンス），Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ノースカロライナ州立大学），ノースカロライナ州ローリー、２７６９５−７６０９ Ｕ．Ｓ．Ａ．、又はＵＳＤＡのＮａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メリーランド州ベルツビルによって主催されるＧｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＧＲＩＮ）から得ることができる。
【００９２】
収量を改善するＱＴＬを含む核酸配列又はその収量改善部分は、利用可能な任意の方法によって適切なレシピエント植物に移行させることができる。例えば、前記核酸配列は、ＰＩ１６９３８３系統の植物をその収量を改善すべき選抜育成系統と交雑させることによって（すなわち、遺伝子移入によって）、形質転換によって、プロトプラスト融合によって、倍加半数体技術によって、胚救出によって、又は任意の他の核酸移行系によって、場合によっては続いてＱＴＬを含み高収量を示す子植物の選抜によって、移行させることができる。遺伝子導入による移行方法では、高収量用ＱＴＬを含む核酸配列を前記ドナー植物から当分野で公知の方法によって単離することができる。こうして単離された核酸配列は、トランスジェニック法によって、例えば、ベクターによって、配偶子中で、又は前記核酸配列で被覆された弾道粒子などの任意の他の適切な移行要素中で、レシピエント植物に移行させることができる。
【００９３】
植物の形質転換は、一般に、植物細胞中で機能する発現ベクターの構築を含む。本発明においては、かかるベクターは、高収量用ＱＴＬを含む核酸配列を含み、プロモーターなどの調節エレメントの制御下にある、又は調節エレメントに作用可能に結合した、収量改善遺伝子を含むことができる。発現ベクターは、１個以上のかかる作動可能に結合した遺伝子／調節エレメントの組合せを含むことができる。ただし、組合せに含まれる遺伝子の少なくとも１個は、改善された収量をコードする。ベクター（単数又は複数）は、プラスミドの形とすることができ、単独で又は別のプラスミドと組み合わせて使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系などの当分野で公知の形質転換方法によって、改善された収量を示すトランスジェニック植物を生産することができる。
【００９４】
発現ベクターは、マーカーを含む形質転換細胞をネガティブ選択によって（選択マーカー遺伝子を含まない細胞の成長を阻害することによって）、又はポジティブ選択によって（マーカー遺伝子によってコードされる産物をスクリーニングすることによって）回収できるようにする（プロモーターなどの）調節エレメントに作動可能に結合した少なくとも１個のマーカー遺伝子を含むことができる。植物の形質転換のために多数の一般に使用される選択マーカー遺伝子が当分野で公知であり、例えば、抗生物質や除草剤などの選択化学薬品を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、又は阻害剤に非感受性である変化した標的をコードする遺伝子が挙げられる。マンノース選択などの幾つかのポジティブ選択方法が当分野で公知である。あるいは、マーカーのない形質転換を使用して、上記マーカー遺伝子のない植物を得ることができ、その技術は当分野で公知である。
【００９５】
発現ベクターを植物に導入する一方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然形質転換系に基づく（例えば、Ｈｏｒｓｃｈ（ホーシュ）等，１９８５参照）。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓそれぞれのＴｉ及びＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因である遺伝子を有する。発現ベクターを植物組織に導入する方法は、植物細胞とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの直接感染又は共培養を含む。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター系及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性遺伝子導入方法の記述は、米国特許第５，５９１，６１６号にある。植物発現ベクター及びレポーター遺伝子及び形質転換プロトコルの一般的記述、並びにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター系及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性遺伝子導入方法の記述は、Ｇｒｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｓｂｙ（グルーバー及びクロスビー），１９９３に見いだすことができる。植物組織の一般的培養方法は、例えば、Ｍｉｋｉ（ミキ）等、１９９３及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（フィリップス）等、１９８８に記載されている。分子クローニング技術及び適切な発現ベクターの適切な入門書は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１である。
【００９６】
発現ベクターを植物に導入する別の方法は、微粒子媒介性形質転換に基づき、ＤＮＡは微粒子表面に載って輸送される。発現ベクターは、微粒子銃装置を用いて植物組織に導入される。微粒子銃装置は、植物細胞壁及び膜を貫通するのに十分な速度３００から６００ｍ／ｓに微粒子を加速する。ＤＮＡを植物に導入する別の方法は、標的細胞の超音波処理による。あるいは、リポソーム又はスフェロプラスト融合を使用して、発現ベクターを植物に導入してきた。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコール又はポリ−Ｌ−オルニチンを使用したＤＮＡのプロトプラストへの直接取り込みも報告された。プロトプラスト及び細胞全体及び組織の電気穿孔法も記述された。
【００９７】
キュウリゲノムの一部を細菌人工染色体（ＢＡＣ）、すなわち細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に存在する天然Ｆ因子プラスミドに基づく、Ｅ．ｃｏｌｉ．細胞中でＤＮＡ断片（１００から３００ｋｂ挿入断片サイズ、平均１５０ｋｂ）をクローン化するのに使用されるベクターに導入する、ＢＡＣの使用などの別の周知技術を、例えば、ＢＩＢＡＣ系と組み合わせて使用して、トランスジェニック植物を生産することができる。
【００９８】
キュウリ標的組織の形質転換後、上記選択マーカー遺伝子の発現によって、当分野で現在周知である再生及び選択方法を用いた形質転換細胞、組織及び／又は植物の優先的選択が可能になる。
【００９９】
非トランスジェニック法による改善された収量を有するキュウリ植物の生産
【０１００】
改善された収量を有するキュウリ植物を生産する別の実施形態においては、プロトプラスト融合をドナー植物からレシピエント植物への核酸移行に使用することができる。プロトプラスト融合は、単一の二核又は多核細胞を産生する、２個以上のプロトプラスト（細胞壁が酵素処理によって除去された細胞）間の体細胞交雑などの誘発又は自発性結合である。融合細胞は、天然に雑種形成させることができない植物種を用いてさえ得ることができ、形質の望ましい組合せを示すハイブリッド植物に組織培養される。より具体的には、第１のプロトプラストは、ＰＩ１６９３８３のキュウリ植物から得ることができる。第２のプロトプラストは、第２のキュウリ又は別の植物変種、好ましくは耐病性、耐虫性、価値ある果実特性など、ただしそれだけに限定されない商業的に価値のある特性を含むキュウリ系統から得ることができる。次いで、プロトプラストは、当分野で公知である伝統的プロトプラスト融合手順を使用して融合される。
【０１０１】
あるいは、本明細書に記載のＱＴＬを含む核酸のドナー植物からレシピエント植物への移行に胚救出を使用することができる。胚救出は、生存可能な種子を植物が生成することができない交雑種から胚を単離する手順として使用することができる。このプロセスでは、植物の受精した子房又は未熟な種子を組織培養して、新しい植物を生産する。
【０１０２】
本発明は、キュウリ育成系統の植物の収量を改善する方法であって、
【０１０３】
ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
【０１０４】
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
【０１０５】
ｃ）前記キュウリ育成系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
【０１０６】
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
【０１０７】
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合であるキュウリ育成系統の植物を生産するステップと
【０１０８】
を含み、
【０１０９】
ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜がマーカー利用選抜によって実施される、
【０１１０】
方法にも関する。
【０１１１】
かかる方法の好ましい一実施形態においては、前記キュウリ育成系統はエリート系統である。
【０１１２】
上記方法の別の好ましい実施形態においては、マーカー利用選抜手順は、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及び／又はＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に対する選抜を含む。
【０１１３】
かかる方法の好ましい実施形態は、前記植物を交雑させることによって、ドナーキュウリ植物としてのＰＩ１６９３８３からレシピエントキュウリ植物への前記核酸配列の遺伝子移入による移行を含む。したがって、本発明によるＱＴＬを含む核酸配列の遺伝子移入は、伝統的育種技術を使用することによって適切に遂行することができる。ＱＴＬは、好ましくは、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）又はマーカー利用育種（ＭＡＢ）を使用することによって市販用キュウリ変種に移入される。ＭＡＳ及びＭＡＢは、所望の形質をコードする遺伝子の１種類以上を含む子植物の特定及び選抜のための分子マーカーの１種類以上の使用を含む。この場合、かかる特定及び選抜は、本発明のＱＴＬ又はそれに関連したマーカーの選抜に基づく。ＭＡＳを使用して、目的ＱＴＬを収容する準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を開発することもでき、各ＱＴＬ効果のより詳細な研究が可能になる。ＭＡＳは、戻し交雑近交系（ＢＩＬ）集団の開発に有効な方法でもある。この実施形態によって開発されたキュウリ植物は、有利には、レシピエント植物由来の形質の大多数を受け継ぎ、ドナー植物由来の改善された収量を受け継ぐことができる。
【０１１４】
上で手短に考察したように、伝統的育種技術を使用して、改善された収量をコードする核酸配列を収量改善が必要なレシピエントキュウリ植物に移入することができる。系統育種と称される一方法においては、改善された収量を示し、本明細書に定義された改善された収量に関連したＱＴＬをコードする核酸配列を含むドナーキュウリ植物を、耐病性、耐虫性、価値ある果実特性など、ただしそれだけに限定されない農学的に望ましい特性を示すレシピエントキュウリ植物（好ましくは、エリート系統の植物）と交雑させる。次いで、（Ｆ１ハイブリッドである）生成した植物集団を自家受粉させ、種子をつけさせる（Ｆ２種子）。次いで、Ｆ２種子から育成されたＦ２植物を、改善された収量についてスクリーニングする。集団は、幾つかの異なる方法でスクリーニングすることができる。
【０１１５】
まず、集団を伝統的な収量アッセイによってスクリーニングする。かかるアッセイは当分野で公知である。第２に、上記分子マーカーの１種類以上を使用してマーカー利用選抜を実施して、本明細書に定義された改善された収量をコードする核酸配列を含む子孫を特定することができる。ＱＴＬの存在を検出する方法によって上で言及された、別の方法を使用することもできる。さらに、マーカー利用選抜を使用して、収量アッセイから得られる結果を確認することができ、したがって、幾つかの方法を組み合わせて使用することもできる。
【０１１６】
改善された収量を有する近交系キュウリ植物系は、循環選抜及び戻し交雑、自家受粉及び／又は二ゲノム性半数体の技術、又は親系統の作製に使用される任意の他の技術を用いて、開発することができる。循環選抜及び戻し交雑の方法においては、反復親を第１のドナー植物と交雑させることによって、本明細書に開示する改善された収量を与える遺伝因子を標的レシピエント植物（反復親）に移入することができる。第１のドナー植物は、反復親とは異なり、本明細書では「非反復親」と称する。反復親は、収量を改善すべき植物であり、耐病性、耐虫性、価値ある果実特性など、ただしそれだけに限定されない農学的に望ましい特性を有する。非反復親は、ＰＩ１６９３８３系統の植物であり、改善された収量をコードする核酸配列を含む。あるいは、非反復親は、反復親と交雑受精する任意の植物変種又は近交系とすることができ、改善された収量のためのＱＴＬをＰＩ１６９３８３系統の植物との以前の交雑で獲得している。反復親と非反復親の交雑から得られる子孫を反復親に戻し交雑する。次いで、生成した植物集団を所望の特性についてスクリーニングする。スクリーニングは、幾つかの異なる方法で行うことができる。例えば、当分野で公知の表現型スクリーニングによって集団をスクリーニングすることができる。あるいは、表現型アッセイを使用する代わりに、上記分子マーカー、ハイブリダイゼーションプローブ又はポリヌクレオチドの１種類以上を使用してマーカー利用選抜（ＭＡＳ）を実施して、改善された収量をコードする核酸配列を含む子孫を特定することができる。
【０１１７】
スクリーニング後、キュウリ植物をますます近交系にするために、次いで、改善された収量表現型、より好ましくは遺伝子型を示し、高収量をコードする必要な核酸配列を含むＦ１ハイブリッド植物を選抜し、数世代にわたって反復親に戻し交雑する。このプロセスを２から５世代以上にわたって実施することができる。原則的には、反復親を非反復親と交雑させるプロセスから得られる子孫は、改善された収量をコードする１個以上の遺伝子に対して異型接合的である。
【０１１８】
一般に、所望の形質をハイブリッドキュウリ変種に導入する方法は、
【０１１９】
（ａ）近交系キュウリ親を１つ以上の所望の形質を含む別のキュウリ植物と交雑させて、Ｆ１子植物を生産し、所望の形質がＰＩ１６９３８３由来の収量改善ＱＴＬによって付与される改善された収量であるステップと、
【０１２０】
（ｂ）好ましくは本明細書に定義された分子マーカーを使用して、所望の形質を有する前記Ｆ１子植物を選抜して、選抜されたＦ１子植物を生産するステップと、
【０１２１】
（ｃ）選抜された子植物を前記近交系キュウリ親植物と戻し交雑させて、戻し交雑子植物を生産するステップと、
【０１２２】
（ｄ）所望の形質並びに前記近交系キュウリ親植物の形態学的及び生理学的特性を有する戻し交雑子植物を選抜し、前記選抜が、ゲノムＤＮＡの単離、及び上で定義した少なくとも１種類のＱＴＬ用分子マーカーの存在について前記ＤＮＡを試験することを含むステップと、
【０１２３】
（ｅ）ステップ（ｃ）と（ｄ）を２回以上連続して繰り返して、選抜された第３以上の戻し交雑子植物を生産するステップと、
【０１２４】
（ｆ）場合によっては、同型接合植物を特定するために、選抜された戻し交雑子孫を自家受粉させるステップと、
【０１２５】
（ｇ）前記戻し交雑子孫又は自家受粉植物の少なくとも１種類を別の近交系キュウリ親植物と交雑させて、所望の形質並びに同じ環境条件で育成されたときのハイブリッドキュウリ変種の形態学的及び生理学的特性のすべてを有するハイブリッドキュウリ変種を生産するステップと
【０１２６】
を含む。
【０１２７】
示したように、最後の戻し交雑世代は、改善された収量を有する同型接合純粋育種（近交系）子孫を規定するために、自家受粉させることができる。したがって、循環選抜、戻し交雑及び自家受粉の結果、改善された収量に関連した遺伝子及び商業的に重要な形質に関連した別の遺伝子に対して遺伝的に相同である系統が生成する。
【０１２８】
異型接合植物は改善された収量も示し、したがってかかる植物も本発明の一態様であることに留意されたい。
【０１２９】
キュウリ植物及び種子
【０１３０】
植物育種の目標は、単一の変種又はハイブリッドにおいて種々の望ましい形質を組み合わせることである。商品作物の場合、これらの形質としては、病気及び昆虫に対する抵抗性、熱及び乾燥に対する耐性、作物成熟時間の短縮、収量増加、並びに農学的品質改良を挙げることができる。発芽、苗立、成長速度、成熟度、草高などの植物特性の均一性も重要であり得る。
【０１３１】
商品作物は、植物の受粉方法を利用する技術によって栽培される。１つの花の花粉が同じ植物の同じ又は別の花に移行する場合、植物は自家受粉する。同じ系統群又は系統内の個体が受粉に使用されるとき、植物は姉妹受粉する。花粉が異なる系統群又は系統からの異なる植物の花に由来する場合、植物は他家受粉する。
【０１３２】
自家受粉し、多数の世代にわたってタイプごとに選抜された植物は、ほぼすべての遺伝子座において同型接合的になり、純種子孫の均一集団を生じる。２種類の同型接合系統の交雑は、多数の遺伝子座について異型接合的であり得るハイブリッド植物の均一集団を生じる。幾つかの遺伝子座において各々異型接合的な２種類の植物の交雑は、遺伝的に異なる不均一な異種植物の集団を生じる。
【０１３３】
キュウリ育種計画におけるハイブリッドキュウリ変種の開発は以下の３ステップを含む：（１）初期の育種交雑種に対する種々の生殖質プールからの植物の選抜、（２）数世代にわたる育種交雑種から選抜された植物の自家受粉による一連の近交系の生成（近交系は、それぞれ純種を繁殖させ、高度に均一である。）、及び（３）選抜された近交系を無関係の近交系と交雑させ、ハイブリッド子孫（Ｆ１）を生成すること。十分な量の同系交配後、連続的な雑種世代は、開発された近交系の種子を増加させるのに役立つにすぎない。好ましくは、近交系は、その座の約９５％以上において同型接合対立遺伝子を含むべきである。
【０１３４】
近交系の同型接合性及び均一性の重要な結果は、一定の対の近交系を交雑させることによって生成されるハイブリッドが常に同じであるということである。優れたハイブリッドを生成する近交系が特定されると、ハイブリッド種子は、これらの近交系親を使用して連続的に供給することができ、次いで、このハイブリッド種子供給からハイブリッドキュウリ植物を生産することができる。
【０１３５】
上述した方法を使用して、当業者は、必要な近交系を生産することができ、そこから前記近交系を交雑させることによって市販用（Ｆ１）ハイブリッド種子を生産することができる。
【実施例】
【０１３６】
収量改善遺伝子移入
【０１３７】
ＩＬ集団の開発
【０１３８】
外来ドナーＰＩ６９３８３を、市販用キュウリハイブリッド変種の母系統である市販親系統と交雑させた。遺伝子移入系をＡＦＬＰマーカーを使用して開発して、ＢＣ１、ＢＣ２及び後続の自家受粉世代中のゲノムカバー率及び重複セグメントについて選抜した（ＩＬに応じて、１又は２回の自家受粉を実施した。）。ＢＣ１世代を使用して、キュウリの遺伝地図を得た。他の地図と共通したマーカーは見いだされず、したがって染色体番号を割り当てることができなかった。
【０１３９】
本明細書では連鎖群は、無作為な連鎖群番号を指す。ゲノムカバー率についての選抜によって、３０種類の遺伝子移入系（ＩＬ）を選抜した。
【０１４０】
ＩＬを反復親（Ｆ１ＩＬ）と交雑させて、ドナーセグメントに対して異型接合的であるが、ゲノムの残りの部分に対して同型接合的である系統を得た。ＩＬを変種の別の市販親（父系統）とも交雑させて、ドナーセグメント及びゲノムの残りの部分に対して異型接合的であるハイブリッド（ＨＹＩＬ）を得た。
【０１４１】
この実験設定では、いわゆるハイブリッドＩＬ（すなわち、最初の変種Ａｃｃｏｌａｄｅの親系統２と交雑させた遺伝子移入を有する親系統１）は、極めて良好に機能した（表１参照）。
【０１４２】
集団のフェノタイピング
【０１４３】
３０種類のＩＬを温室内の２つの反復ブロックで育成した。５．７５ｍ２の各ブロックは８本の植物を含み、植物１．３９本／平方メートルの栽植密度になった。ＱＴＬは、早春の実験中のＩＬでしか検出されず、夏季の実験では検出されなかった。
【０１４４】
長いキュウリのｋｇ／ｍ２単位の生産量、果実重量及び収穫の早さを求めるために、収穫時期に植物が果実をつける少なくとも２か月間、ＩＬの果実を週２又は３回収穫した（果実の中央で少なくとも４ｃｍの直径を有する果実。直径４ｃｍに達しなくても、３日間生長の停止した果実も収穫する。）。収穫ごとに、収穫の総重量及び果実数としての収量を求めた。結果を表１に示す。示した値は１ブロック当たりの平均値である。
【０１４５】
生産量（Ｐ）に換算した収量を収量／ｍ２で表し、以下のように計算した。
【０１４６】
（総重量（ｋｇ単位）／ブロック／栽培）
Ｐ＝ ×（植物密度／ｍ２）
（植物本数／ブロック）
【０１４７】
果実重量＝総重量（ｋｇ）／果実総数
【０１４８】
果実から１ｃｍの距離で果実脚を切断して果実を収穫した。収量を収穫から２時間以内に秤を用いて測定した。収穫の早さは、播種後の畑の最初の収穫日である。
【０１４９】
表１ 遺伝子移入系の収量。一番上の行は対照値を示す。対照より高い値を（＋）で示し、対照より低い値を（−）で示す。対照ＢＣ＝Ｐｙｒ４２系統、対照＊＝市販ハイブリッドＡｃｃｏｌａｄｅの特許登録親、対照＊＊＝ＰＩ６９３８３、親系統＝市販ハイブリッドＡｃｃｏｌａｄｅ。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
本願は、染色体３の染色体置換の使用も企図する。かかる置換系統においては、連鎖群３におけるマーカーによって特徴づけられる染色体を除いて、すべての核ＤＮＡが反復親に由来する（図５参照）。後続の実験によれば、ＬＩＬ３−１（連鎖群３に対応する染色体がドナー材料で置換された染色体置換系統）及びその子孫は、対照よりも高い収量（ｋｇ）と精力を示す植物をもたらした。特に、この特定の遺伝子移入は、この試験において、任意の他の（ハイブリッド）ＩＬと比較して（最初の変種の第２の親と交雑させたときに）ハイブリッド段階で顕著な性能を示した。図５に示した任意及びすべてのマーカーは、原則的には、本発明の植物において連鎖群３に対応する染色体の有無を示すのに使用することができる。
【０１５２】
ＬＩＬ４−２のファインマッピングのための高分解能ＩＬパネルの構築
【０１５３】
ＬＩＬ４−２を重要な主要ＩＬとみなした。
【０１５４】
収量ＱＴＬのファインマッピングは、「高分解能ＩＬパネル」を用意することによって実施することができる。パネルは、ＬＩＬ４−２系統に由来するより小さい遺伝子移入を有する系統からなった。
【０１５５】
ＬＩＬ４−２×反復親の１８４Ｆ２個体の葉材料を試験した。ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩテンプレートを作製した。
【０１５６】
組み換えの選抜を２段階で実施した。第一段階では、ＬＩＬ４−２の３個のＬＧ４遺伝子移入セグメントの各々（図１参照）及びＬＧ５上の遺伝子移入セグメントに位置する少なくとも１個のマーカーを増幅する種々のプライマー組合せ（ＰＣ）（Ｅ１２／Ｍ２４、Ｅ１８／Ｍ１５、Ｅ１４／Ｍ６０、Ｅ１１／Ｍ６２、Ｅ１３／Ｍ１７、Ｅ２５／Ｍ１３、Ｅ２２／Ｍ１２、Ｅ２１／Ｍ１６）を使用して、すべての個体をスクリーニングした（ＬＩＬ４−２は、図２に示すＬＧ５上の望ましくないドナーセグメントを含む。）。９６種類の植物を以下の判定基準に基づいて更なる分析のために選抜した。
【０１５７】
１）ドナーセグメントＬＧ５は、同型接合が存在しない。
【０１５８】
２）植物は、最高３個のドナーセグメント（ＬＧ４上の３個のドナーセグメントの１個）を含む。
【０１５９】
続いて、９６種類のＦ２植物のこの選抜を、ＬＧ４ドナーセグメント上に位置するマーカーを含む２種類の追加のＰＣを用いてスクリーニングする。これら９６種類のＦ２植物の全データセットに基づいて、２セットの植物をＦ３への繁殖用に選抜した。４７個体からなる１セットを更なる試験用に選抜した。
【０１６０】
マーカー検出
【０１６１】
ＡＦＬＰ分析をＶｏｓ等（１９９５）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７−４４１４に従って実施した。
【０１６２】
マーカー配列
【０１６３】
ＬＩＬ４−２と連鎖したＡＦＬＰマーカーの配列の概要。配列は、順方向及び逆方向「コアプライマー」（ＥｃｏＲ１制限酵素切断部位を有する）Ｅ及び（ＭｓｅＩ制限酵素切断部位を有する）Ｍを含む。プライマー配列に下線を引いた。逆方向プライマーは、配列に逆方向補足配列として含まれる。「コアプライマー」が伸長される選択的ヌクレオチドには二重下線を引いた。
【０１６４】
Ｅ１８／Ｍ１５−Ｆ−０８９−Ｐ２
【０１６５】
【化１】
【０１６６】
Ｅ１４／Ｍ６０−Ｆ−２２６Ａ−Ｐ１（ＡＦＬＰ Ｅ１４／Ｍ６０−２２６の場合、恐らくはバックグラウンドバンドのために、２個の異なる配列が得られた。）
【０１６７】
【化２】
【０１６８】
Ｅ１４／Ｍ６０−Ｆ−２２６Ｂ−Ｐ１（ＡＦＬＰ Ｅ１４／Ｍ６０−２２６の場合、恐らくはバックグラウンドバンドのために、２個の異なる配列が得られた。）
【０１６９】
【化３】
【０１７０】
Ｅ１４／Ｍ６０−Ｆ−１８５−Ｐ１
【０１７１】
【化４】
【０１７２】
Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１
【０１７３】
【化５】
【０１７４】
Ｅ１８／Ｍ１５−Ｆ−２２１−Ｐ２
【０１７５】
【化６】
【０１７６】
Ｅ１３／Ｍ１７−Ｆ−２２６−Ｐ２
【０１７７】
【化７】
【０１７８】
Ｅ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２
【０１７９】
【化８】
【０１８０】
遺伝研究
【０１８１】
遺伝様式を決定するために、ＩＬの表現型を異型接合ＩＬ及びハイブリッドＩＬの表現型と比較した。結果を表２に示す。
【０１８２】
表２ 遺伝研究の結果。（ＩＬ、ライブラリーの最初の（同型接合）遺伝子移入系。Ｆ１ＩＬは、反復親と交雑させたＩＬであり、ＨＹＩＬは、実用品種の別の親系統（父系統）と交雑させたＩＬである。）。
【０１８３】
【表２】
【０１８４】
ドナー登録種の典型的な追加の特性は、多量の雄花開花、短い果実及び高い果実発育不全、商品価値なしである。
【０１８５】
同型接合、異型接合及びハイブリッド植物は、これらのネガティブな形質をもはや持たず、市販ハイブリッドの収量をはるかに超えるかなり高い収量を有する。果実の末端部分は、特有の星形の黄色であり、連鎖を引きずった結果であると考えられる。ドナー系統の上記ネガティブ形質は、従来の育種方法（戻し交雑）によって除去された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有するキュウリ育成系統の植物であって、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の種子の代表試料はＮＣＩＭＢ、アバディーン、スコットランドに受託番号ＮＣＩＭＢ４１５３２及び寄託者参照番号ＰＩ１６９３８３で寄託されており、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群３及び／又は４上の遺伝子移入であり、前記植物が前記遺伝子移入のない前記キュウリ育成系統の植物よりも高収量を示し、好ましくは前記高収量とは植物１本当たりのより高い総果実重量を指す、キュウリ育成系統の植物。
【請求項２】
前記植物が本質的に同型接合の純粋エリート育成系統の植物である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記植物がキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の他の遺伝子移入を本質的に含まない、請求項１又は２に記載の植物。
【請求項４】
連鎖群３及び／又は４上の前記遺伝子移入が、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連したセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連したセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連したセグメント
からなる群から選択される連鎖群４上の少なくとも１個のセグメント、及び／又は
連鎖群３の染色体置換
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の植物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項のキュウリ植物を交雑又は自家受粉させることによって生産される、キュウリ種子。
【請求項６】
請求項５に記載の種子を育成することによって生産される、キュウリ植物。
【請求項７】
請求項６に記載の植物の植物部分。
【請求項８】
前記植物部分がキュウリ果実又は種子である、請求項７に記載の植物部分。
【請求項９】
請求項１から４又は６のいずれか一項に記載の植物を別のキュウリ植物と交雑させること、及び得られるハイブリッドキュウリ種子を収穫することを含む、ハイブリッドキュウリ種子を生産する方法。
【請求項１０】
前記別のキュウリ植物がキュウリの育成系統の植物、より好ましくは異なるエリート系統の請求項２に記載の植物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法によって生産される、ハイブリッドキュウリ種子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のハイブリッドキュウリ種子を育成することによって生産される、ハイブリッドキュウリ植物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のハイブリッドキュウリ植物の植物部分。
【請求項１４】
キュウリ育成系統の植物の収量を改善する方法であって、
ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記キュウリ育成系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合であるキュウリ育成系統の植物を生産するステップと
を含み、
ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜がマーカー利用選抜によって実施される、方法。
【請求項１５】
前記キュウリ育成系統がエリート系統である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｆ１キュウリハイブリッドの収量を改善する方法であって、
ａ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの少なくとも第１の親系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの前記親系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合である前記Ｆ１キュウリハイブリッドの親系統を生成するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記親系統を、高収量を有するＦ１ハイブリッドの生産のための親系統として使用するステップと
を含み、
ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜がマーカー利用選抜によって実施される、方法。
【請求項１７】
前記マーカー利用選抜手順が、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に対する選抜を含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法によって得られる、キュウリ育成系統又はＦ１キュウリハイブリッド。
【請求項１９】
キュウリにおける高収量に関連したＱＴＬを含む単離核酸配列であって、前記ＱＴＬが、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント
によって規定される、単離核酸配列。
【請求項２０】
キュウリ植物における高収量に関連したＱＴＬの検出のための、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２からなる群から選択される遺伝マーカーの使用。
【請求項２１】
キュウリ植物、又は種子を含めたその部分を選抜する方法であって、
（ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させることによって、子孫キュウリ植物又はその部分を生産するステップと、
（ｂ）キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入セグメントの存在について前記子孫キュウリ植物又はその部分を試験し、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群４上の遺伝子移入であるステップと、
（ｃ）前記試験から得られる情報に基づいて前記子孫キュウリ植物又はその部分を選抜するステップと、
（ｄ）場合によっては、更なる育種を考慮するために前記情報を使用するステップと
を含む、方法。
【請求項１】
キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有するキュウリ育成系統の植物であって、キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３の種子の代表試料はＮＣＩＭＢ、アバディーン、スコットランドに受託番号ＮＣＩＭＢ４１５３２及び寄託者参照番号ＰＩ１６９３８３で寄託されており、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群３及び／又は４上の遺伝子移入であり、前記植物が前記遺伝子移入のない前記キュウリ育成系統の植物よりも高収量を示し、好ましくは前記高収量とは植物１本当たりのより高い総果実重量を指す、キュウリ育成系統の植物。
【請求項２】
前記植物が本質的に同型接合の純粋エリート育成系統の植物である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記植物がキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の他の遺伝子移入を本質的に含まない、請求項１又は２に記載の植物。
【請求項４】
連鎖群３及び／又は４上の前記遺伝子移入が、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連したセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連したセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連したセグメント
からなる群から選択される連鎖群４上の少なくとも１個のセグメント、及び／又は
連鎖群３の染色体置換
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の植物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項のキュウリ植物を交雑又は自家受粉させることによって生産される、キュウリ種子。
【請求項６】
請求項５に記載の種子を育成することによって生産される、キュウリ植物。
【請求項７】
請求項６に記載の植物の植物部分。
【請求項８】
前記植物部分がキュウリ果実又は種子である、請求項７に記載の植物部分。
【請求項９】
請求項１から４又は６のいずれか一項に記載の植物を別のキュウリ植物と交雑させること、及び得られるハイブリッドキュウリ種子を収穫することを含む、ハイブリッドキュウリ種子を生産する方法。
【請求項１０】
前記別のキュウリ植物がキュウリの育成系統の植物、より好ましくは異なるエリート系統の請求項２に記載の植物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法によって生産される、ハイブリッドキュウリ種子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のハイブリッドキュウリ種子を育成することによって生産される、ハイブリッドキュウリ植物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のハイブリッドキュウリ植物の植物部分。
【請求項１４】
キュウリ育成系統の植物の収量を改善する方法であって、
ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記キュウリ育成系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合であるキュウリ育成系統の植物を生産するステップと
を含み、
ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜がマーカー利用選抜によって実施される、方法。
【請求項１５】
前記キュウリ育成系統がエリート系統である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｆ１キュウリハイブリッドの収量を改善する方法であって、
ａ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの少なくとも第１の親系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させるステップと、
ｂ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、前記交雑ステップから得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｃ）前記Ｆ１キュウリハイブリッドの前記親系統を反復親として使用して、ステップ（ｂ）で選抜された前記子孫キュウリ植物を自家受粉及び／又は戻し交雑させるステップと、
ｄ）高収量に関連した連鎖群４上のキュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入を有する、ステップ（ｃ）の自家受粉又は戻し交雑から得られる子孫キュウリ植物を選抜するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）の自家受粉及び／又は戻し交雑及び選抜の前記ステップを繰り返して、前記遺伝子移入に対して本質的に同型接合である前記Ｆ１キュウリハイブリッドの親系統を生成するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記親系統を、高収量を有するＦ１ハイブリッドの生産のための親系統として使用するステップと
を含み、
ステップ（ｂ）又は（ｄ）で実施される少なくとも１回の選抜がマーカー利用選抜によって実施される、方法。
【請求項１７】
前記マーカー利用選抜手順が、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に対する選抜を含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法によって得られる、キュウリ育成系統又はＦ１キュウリハイブリッド。
【請求項１９】
キュウリにおける高収量に関連したＱＴＬを含む単離核酸配列であって、前記ＱＴＬが、
ｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント、
ｉｉｉ）ＡＦＬＰマーカーＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２に関連した連鎖群４上のセグメント
によって規定される、単離核酸配列。
【請求項２０】
キュウリ植物における高収量に関連したＱＴＬの検出のための、ＡＦＬＰマーカーＥ１２／Ｍ２４−Ｆ−０６３−Ｐ２、Ｅ１１／Ｍ６２−Ｆ−２００−Ｐ１、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７７−Ｐ２、Ｅ１２／Ｍ２４−Ｆ−１７６−Ｐ１、Ｅ２５／Ｍ１３−Ｆ−１２８−Ｐ２及びＥ２１／Ｍ１６−Ｆ−０８０−Ｐ２からなる群から選択される遺伝マーカーの使用。
【請求項２１】
キュウリ植物、又は種子を含めたその部分を選抜する方法であって、
（ａ）キュウリ育成系統の植物をキュウリ系統ＰＩ１６９３８３の植物と交雑させることによって、子孫キュウリ植物又はその部分を生産するステップと、
（ｂ）キュウリ登録種ＰＩ１６９３８３由来の遺伝子移入セグメントの存在について前記子孫キュウリ植物又はその部分を試験し、前記遺伝子移入が前記植物の高収量に関連した連鎖群４上の遺伝子移入であるステップと、
（ｃ）前記試験から得られる情報に基づいて前記子孫キュウリ植物又はその部分を選抜するステップと、
（ｄ）場合によっては、更なる育種を考慮するために前記情報を使用するステップと
を含む、方法。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５０７５０８（Ｐ２０１１−５０７５０８Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９３３６（Ｐ２０１０−５３９３３６）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８２２２２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５１０１６１１４１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８２２２２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５１０１６１１４１）
【Ｆターム（参考）】
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