グラム陽性菌の形質転換方法
【課題】グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌へのＤＮＡの導入（形質転換）方法であって、エレクトロポレーターなどの高価な機器がない環境でも実施可能で、かつ、エレクトロポレーション法と同等以上の実用的な形質転換頻度を実現する方法を提供し、又は、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法よりも簡便且つ効率的な方法を提供する。
【解決手段】グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法において、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している塩類を除いたものの濃度として０．０５Ｍ〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることで、グラム陽性菌の形質転換頻度を劇的に向上させる。
【解決手段】グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法において、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している塩類を除いたものの濃度として０．０５Ｍ〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることで、グラム陽性菌の形質転換頻度を劇的に向上させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌にＤＮＡを導入（形質転換）する方法に関する。詳細には、グラム陽性菌、例えばブレビバチルス属細菌などに、簡便且つ効率よくＤＮＡを導入（形質転換）する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性菌、例えば、組換えタンパク質生産の宿主として利用されているブレビバチルス属細菌へのプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡの導入（形質転換）方法としては、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法とエレクトロポレーション法が知られている。
【０００３】
Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法は、トリス塩酸緩衝液などのアルカリ性緩衝液等で細菌菌体を処理しコンピテントセル化した後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む緩衝液中で細菌にプラスミドＤＮＡ等のＤＮＡを導入する方法である。バチルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ４７）菌株（該菌株は現在、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に再分類されている）に用いた場合について、特許文献１及び非特許文献１などに記載されている。
【０００４】
なお、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法では、ＤＮＡ導入処理を、通常、以下の手順により行う。
１）アルカリ性緩衝液で処理後の細菌菌体を、ＴＰ培地（リン酸緩衝液と液体培地の混合溶液）に懸濁する。
２）導入するＤＮＡを１μｇ含む５０μｌ程度のＤＮＡ溶液にＴＰ培地を加え、１）の菌体懸濁溶液に添加する。
３）更に２）の溶液にＰＥＧ溶液を加え混合する。
４）混合後、１０分間の振とう培養を行う。
【０００５】
Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法を、例えばブレビバチルス・ブレビスに用いた場合、形質転換頻度が１×１０４ｃｆｕ／μｇＤＮＡ程度になる場合もあるが、通常は１×１０２〜１×１０３ｃｆｕ／μｇＤＮＡ程度の形質転換頻度である。しかしながら、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法をブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）に用いた場合には、形質転換頻度は１×１０１〜１×１０２ｃｆｕ／μｇＤＮＡと極めて低い。よって、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法は、特定のグラム陽性菌、特にブレビバチルス・チョウシネンシスに対しては実用的に利用可能な形質転換方法ではない。そのため、例えばブレビバチルス・チョウシネンシスでは、形質転換方法としてエレクトロポレーション法が専ら用いられている。
【０００６】
エレクトロポレーション法は、細菌菌体または細胞を短時間、強い電場の中に置くことにより細胞膜に穴を開け、強制的にＤＮＡを取り込ませる方法である。エレクトロポレーション法は、様々な細菌、細胞に対して用いられているが、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１）菌株（該菌株は現在、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）に再分類されている）に用いた場合については、非特許文献２、３等に記載されている。
【０００７】
ブレビバチルス・チョウシネンシスに対してエレクトロポレーション法を用いた場合の形質転換頻度は、通常、１×１０４〜１×１０６ｃｆｕ／μｇＤＮＡだが、１×１０７ｃｆｕ／μｇＤＮＡ以上になる場合もある。
【０００８】
なお、ブレビバチルス・ブレビスの細胞壁はペプチドグリカン層の外側を二層の結晶性表層タンパク質が覆う三層構造となっており、ブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁はペプチドグリカン層の外側を一層の結晶性表層タンパク質が覆う二層構造となっている。また、形質転換頻度の評価には、通常、プラスミドＤＮＡ１μｇあたりの形質転換体の個数（ｃｆｕ／μｇＤＮＡ）が用いられている。
【０００９】
エレクトロポレーション法は形質転換頻度が高いという利点がある一方、専用の高価な機器（エレクトロポレーター）が必要になるため、通常の実験室環境で簡便に実施できる方法ではない。また、強い電場の中に細菌菌体を置くため、菌体縣濁液中の塩濃度を出来る限り低くする必要がある。そのため、通常のＤＮＡライゲーション液をそのまま形質転換に用いることができず、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法では行わないエタノール沈殿等でＤＮＡを精製する工程が必要になるなどの問題もあった。
【００１０】
一方、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法は特別な機器を必要とせず、通常の実験室環境で実施可能であるという利点はあるものの、特定のグラム陽性菌、特にブレビバチルス・チョウシネンシスに対して用いた場合に実用的な形質転換頻度が得られないことが大きな問題だった。また、ブレビバチルス・ブレビスに対して用いた場合でも、再現性が乏しく、導入しようとする形質転換用プラスミドＤＮＡとの相性がよくない場合には、充分な形質転換頻度が得られないことが非常に多かった。
【００１１】
また、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法はＤＮＡ導入処理の実験操作を試験管スケールで行うため簡便さに欠け、また導入するＤＮＡも多量に用意する必要があった。更に、凍結した緩衝液処理済みの細菌菌体（コンピテントセル）を形質転換に用いた場合、形質転換頻度が更に低下することから、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法では凍結したコンピテントセルをＤＮＡ導入処理に用いることができなかった。そのため、形質転換の実験操作を行う場合には、その都度、コンピテントセル作製のための菌の培養から始める必要があり、形質転換の実験操作にほぼ丸一日を要するなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開昭６０−５８０７４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６（１９８３）：１１３０−１１３４
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５３（１９８９）：３０９９−３１００
【非特許文献３】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１（１９９７）：２０２−２０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌へのＤＮＡの導入（形質転換）方法であって、エレクトロポレーターなどの高価な機器がない環境でも実施可能で、かつ、エレクトロポレーション法と同等以上の実用的な形質転換頻度を実現する方法を提供すること、又は、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法よりも簡便且つ効率的な形質転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法を改良することにより、上記の課題の解決を目指した。そして様々な試行錯誤の末、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液に高濃度の塩類を含有させることにより、ブレビバチルス・チョウシネンシスの形質転換頻度を劇的に向上させることに成功した。この結果は、ＤＮＡ導入処理時の溶液のイオン強度が形質転換頻度に大きく影響していることを示している。更に本発明者は、ブレビバチルス・ブレビス等の他のグラム陽性菌においても同様に形質転換頻度が向上することを確認し本発明を完成させた。
また、本発明の方法は、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法がＤＮＡ導入処理時に用いていたＴＰ培地（リン酸緩衝液と液体培地の混合溶液）及びその後の振とう培養が不要であることも示された。
【００１６】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法であって、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している無機塩類及び／又は有機塩類を除いたものの濃度として０．０５〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることを特徴とする、グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法。
（２）無機塩類として硫酸塩を含有させることを特徴とする、（１）に記載の方法。
（３）硫酸塩が硫酸ナトリウム又は硫酸アンモニウムであることを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）コンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌を用いる（コンピテントセル化した後そのままの状態で用いるものでない）ことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）グラム陽性菌が、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌であることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）又はブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）であることを特徴とする、（５）に記載の方法。
（７）少なくとも、緩衝液で処理しコンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌、緩衝液を構成していない無機塩類及び／又は有機塩類を含む緩衝液（特に、無機塩類及び／又は有機塩類を含むリン酸緩衝液又はＭＯＰＳ緩衝液）、及び、ポリエチレングリコール溶液を含んでなることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法に用いる遺伝子工学キット。
【００１７】
（８）ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中のポリエチレングリコール濃度が１０〜５０％（ｗ／ｖ）であり、且つ、ポリエチレングリコールの平均分子量が１，０００〜１０，０００であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌に対して簡便に処理でき、かつ、高い形質転換頻度で形質転換体が得られる効率的、実用的なＤＮＡ導入（形質転換）方法及びその方法に用いるＤＮＡ導入処理用遺伝子工学キットを提供できる。そして、本発明で使用する塩類は、硫酸ナトリウムなどの一般に使用されている安価な試薬であり、エレクトロポレーターなどの高価な機器がない実験室環境下でも極めて簡便に実施することができる。
【００１９】
また、本発明の方法により、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法では試験管スケールで行っていた実験操作が約１０分の１にスケールダウンされエッペンチューブで行えるようになったため実験の操作性、経済性が格段に向上する。更に、これまで形質転換用ＤＮＡが１μｇ程度必要だったところ、本発明では１／１００の１０ｎｇ以下で実施可能であり、ＤＮＡ調製に要する労力が大幅に軽減され、試薬類の使用量も大幅に減る。また更に、従来行われていたＴｒｉｓ−ＰＥＧ法での必須工程である培地の添加や混合後の振とう培養の工程も不要となる。
【００２０】
更に、本発明の方法により、凍結したコンピテントセルを用いても実用的な形質転換頻度が得られるようになり、つまり、本発明では凍結したコンピテントセルも利用可能となる。その結果、形質転換の実験操作をＤＮＡ導入処理の段階から随時開始できるようになり、実験操作の時間的な制約が大幅に軽減される。また更に、緩衝液で処理した後に凍結したグラム陽性菌、例えばブレビバチルス属細菌のコンピテントセル、硫酸ナトリウムなどの塩類を含むリン酸緩衝液、及び、ポリエチレングリコール溶液を含むＤＮＡ導入処理用遺伝子工学キットを提供できることにより、グラム陽性菌、例えばブレビバチルス属細菌の形質転換の実験操作を簡便かつ随時、実施可能とする。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌を緩衝液（例えばアルカリ性緩衝液）で処理した後、ポリエチレングリコールを含む緩衝液中で該細菌菌体にＤＮＡを導入する方法であって、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液に高濃度の塩類（無機塩類又は有機塩類）を含むことを特徴とする方法である。
【００２２】
なお本発明に係る、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液は、緩衝液処理後の細菌菌体（コンピテントセル）、導入するＤＮＡ、無機塩類及び／又は有機塩類、及び、ポリエチレングリコールを含む。これらの添加順序、添加方法は特に限定されないが、以下の手順により行うのが好ましい。
１）緩衝液処理後の細菌菌体を集菌する。
２）ＤＮＡ溶液と、無機塩類及び／又は有機塩類を緩衝液に混合する。
３）２）の液を菌体に加える。
４）更にポリエチレングリコール溶液を加え混合する。
【００２３】
本発明で用いる塩類は、無機塩類でも有機塩類でも良く、これらの混合物でも良いが、無機塩類のみの使用が好ましく、更に無機塩類として硫酸塩が特に好ましい。
また、無機塩類及び／又は有機塩類のＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度は、形質転換効率を向上させる効果を発揮させるために一定の範囲である必要がある。つまり、塩類濃度が低過ぎると形質転換効率が低く、高過ぎても形質転換効率が低下する。塩類の濃度を高くし過ぎた場合の形質転換効率の低下は、溶液の浸透圧の過剰な上昇が影響しているものと思われる。
【００２４】
無機塩類及び／又は有機塩類のＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度範囲としては、当該緩衝液中において緩衝液を構成している（言い換えれば、緩衝液の緩衝作用に関与している）無機塩類及び有機塩類を除いたものの濃度として、０．０５〜０．２０Ｍが好ましく、０．０９〜０．１３Ｍがより好ましく、０．１２〜０．１３Ｍが特に好ましい。
【００２５】
なお、緩衝液を構成している塩類と添加する塩類が同一成分の場合（例えば、リン酸緩衝液にリン酸塩を添加する場合など）には、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に含まれる全ての塩類濃度（つまり、緩衝液を構成している塩類と添加塩類の合算の濃度）として０．０８〜０．３２Ｍ、好ましくは０．１３〜０．２３Ｍ、更に好ましくは０．１５〜０．２０Ｍとすれば良い。
【００２６】
ＤＮＡ導入処理時の溶液には、上述の通り緩衝液を用いることが必要である。緩衝液は、リン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（ロパンスルホン酸緩衝液）等が好ましいが、緩衝作用を有するものであれば幅広く使用することができる。例えば、リン酸緩衝液の場合、ｐＨは調整可能な範囲であれば特に限定されないが、濃度は４０〜１２０ｍＭが好ましく、７０ｍＭが特に好ましい。また、ＭＯＰＳ緩衝液の場合、ｐＨは調整可能な範囲であれば特に限定されないが、濃度は３０〜１００ｍＭが好ましく、５０ｍＭが特に好ましい。
【００２７】
また、使用するポリエチレングリコールは、特に限定されないが平均分子量１，０００〜１０，０００のものが好ましく、６，０００〜９，０００のものがより好ましい。さらに、ポリエチレングリコールの濃度も特に限定されないが、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度で１０〜５０％（ｗ／ｖ）が好ましく、３０〜４０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。例えば、ブレビバチルス属細菌の場合、ポリエチレングリコールの平均分子量は７，５００、反応液中の濃度は３０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
【００２８】
本発明の方法によりＤＮＡを導入する細菌としては、グラム陽性菌であれば特に限定されないが、グラム陽性桿菌が好ましく、グラム陽性好気性有胞子桿菌がより好ましく、ブレビバチルス属細菌が更に好ましい。ブレビバチルス属細菌とは、ブレビバチルス・アグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモサス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラチロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・リムノフィラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｓｚｅｒｉ）、ブレビバチルス・サーモルバー（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）などを含む。
【００２９】
ブレビバチルス属細菌では、ブレビバチルス・チョウシネンシスまたはブレビバチルス・ブレビスに用いた場合が好適であり、更に、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７９）、更にこれらの菌株から取得した栄養要求性変異株などの組換えタンパク質生産の宿主に用いられる菌株に用いた場合が特に好適である。
【００３０】
本発明において、グラム陽性菌に導入するＤＮＡは特に限定されず、環状でも直鎖状でもよいが、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ増幅断片等が好ましい。特にブレビバチルス属細菌に対しては、ブレビバチルス属細菌の形質転換に用いられているプラスミドＤＮＡ、及び該プラスミドＤＮＡに形質転換の目的である発現用ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡが好ましい。具体的には、ｐＮＹ３２６（タカラバイオ社製品）、ｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製品）等、及びそれらに発現用ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡが例示される。
ＤＮＡの大きさも細菌に導入可能であれば特に限定されないが、１００〜２０，０００ｂｐが好ましく、１００〜６，０００ｂｐがより好ましい。また、本発明において導入処理に使用するＤＮＡの量は１０ｎｇ以下（例えば１〜１０ｎｇ）でよい。
【００３１】
本発明の形質転換操作は、基本操作として、（１）培養、（２）緩衝液処理、（３）ＤＮＡ導入処理、（４）形質転換体の選択の４つの工程により行う。以下、それぞれの工程について説明する。
【００３２】
（１）培養
まず、細菌菌体の形質転換能が高くなっている時期、通常は対数増殖期までグラム陽性菌を培養する。
培地及び培養条件は、培養が可能であれば特に限定されない。例えば、ブレビバチルス属細菌の場合、培地として特許文献１に記載のＴ２培地の他にＴＭ培地（Ｔ２培地にＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％を添加した培地）等が例示される。培養終了の目安として、培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍ）を用いる場合には、ブレビバチルス・チョウシネンシスではＯ．Ｄ．６６０ｎｍ＝２．０〜６．０が好ましく、Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍ＝３．０〜４．０が特に好ましい。またブレビバチルス・ブレビスの場合はＯ．Ｄ．６６０ｎｍ＝１．５〜３．０が好ましい。
【００３３】
（２）緩衝液処理
培養後、細菌菌体の表層タンパク質層（及びペプチドグリカン層）を緩衝液で処理し、コンピテントセル化する。ブレビバチルス属細菌などの表層タンパク質層を有する細菌の場合は、この処理により表層タンパク質層が除去される。この処理は、特許文献１の記載に従って行えばよいが、コンピテントセル化（表層タンパク質層の除去）が可能であれば条件は適宜変更してよい。コンピテントセル化用の緩衝液は、トリス塩酸緩衝液が好ましいが、ＴＡＰＳ緩衝液などを用いてもよい。またコンピテントセル化用の緩衝液のｐＨは、弱アルカリ性が望ましいが、コンピテントセル化する効果があれば中性または弱酸性でもよい。なお、緩衝液で処理後の細菌菌体（コンピテントセル）をグリセロールを含む緩衝液に懸濁し凍結保存したものを解凍して使用することも可能である。
【００３４】
（３）ＤＮＡ導入処理
ＤＮＡ導入処理工程については、上述の通りであり、緩衝液中にコンピテントセル、導入するＤＮＡ、無機塩類及び／又は有機塩類、及び、ポリエチレングリコールを好適な範囲で含ませて混合するのみである。この工程において、従来法のような培地の添加や振とう培養は必要ない。
【００３５】
（４）形質転換体の選択
形質転換体（ＤＮＡが導入された菌体）の選択方法は、選択が可能であれば特に限定されないが、プラスミドＤＮＡを導入する場合などには、薬剤耐性遺伝子による選択方法を用いることができる。特にブレビバチルス属細菌の場合、薬剤耐性遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子またはエリスロマイシン耐性遺伝子が例示される。
【００３６】
以上の工程により、グラム陽性菌、特にブレビバチルス属細菌に簡便且つ効率よくＤＮＡを導入することができる。これにより、従来法よりも大幅なコスト削減、処理時間短縮を図ることができ、且つ、実用的な形質転換効率の高さがあるため、形質転換株の取得も容易である。また、凍結保存したコンピテントセルの使用が可能であり、且つ、特別な機器が必要でないため、本発明に用いる導入ＤＮＡ以外の試薬やセルをまとめてキット化し、形質転換用の遺伝子工学キットとして提供することもできる。
【００３７】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
（ブレビバチルス・チョウシネンシスへのプラスミドＤＮＡ導入）
本発明に係る方法によって、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３にｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの導入を行った。なお以下の操作は、培養等の処理温度が示されているもの以外はすべて室温（１５〜２５℃）で行った。
【００３９】
（１）培養
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３をＴＭ培地で３７℃で対数増殖期まで振とう培養した。培養後、遠心分離により集菌した。
【００４０】
（２）緩衝液処理
次いで５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、遠心分離により集菌した。集菌した細菌菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し、３７℃で６０分間振とうした。
【００４１】
（３）ＤＮＡ導入処理
振とう後、懸濁液をエッペンドルフチューブに５００μｌ採取し、更に微量遠心機により集菌し上澄みを取り除いた。次いで、ｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの溶液５μｌ（２ｎｇ／μｌ）と、硫酸ナトリウムを０．５Ｍ含む７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）５０μｌを混合した後、菌体が入ったエッペンドルフチューブに加え、ボルテックスにより懸濁した後、５分間静置した。次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００：平均分子量７，５００）を４０％（ｗ／ｖ）含む７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）１５０μｌをエッペンドルフチューブ内の溶液に加え、ボルテックスにより懸濁した。
【００４２】
（４）形質転換体の選択
次いで、微量遠心機により集菌し、ＭＴ培地（２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加したＴＭ培地）１ｍｌに縣濁し、３７℃で６０分間、振とうした。そして、ＴＭＮ寒天培地（ＴＭ培地にネオマイシンを５０μｇ／ｍｌ添加した寒天培地）に塗沫し、３７℃で３０時間培養し、選択用培地上に形成されたコロニーから形質転換体を得た。形質転換頻度は１．５×１０６ｃｆｕ／μｇＤＮＡであった。
なお、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の硫酸ナトリウムの濃度は０．１２Ｍである。
【実施例２】
【００４３】
実施例１の硫酸ナトリウムに替えて、各種塩類や糖などの非電解質の添加による形質転換効率を実施例１と同様の手順により確認した。添加した各物質の、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度はいずれも０．１２Ｍとした。また対照として、緩衝液を構成していない塩類が無添加の７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）を用いたものを無添加区とした。結果を表１に示す（実施例１の硫酸ナトリウム添加による形質転換頻度の結果も併せて記した）。
【００４４】
【表１】
【００４５】
糖や糖アルコールなどの非電解質の場合に比べ、溶解後イオンを生成する（つまり電解質である）各種塩類の場合に高い頻度で形質転換体が得られた。中でも硫酸塩を添加した場合に、特に高い形質転換促進効果を奏することが示された。
【実施例３】
【００４６】
塩類のＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度を変化させた場合の、形質転換頻度への影響を確認するため、以下の試験を行った。塩類には硫酸ナトリウムを用い、その添加量を変えた以外は実施例１と同様の手順により行った。結果を表２に示す。硫酸ナトリウムの濃度は、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度として示した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
この結果により、ＤＮＡ導入処理時のリン酸緩衝液中の硫酸塩濃度が０．０５Ｍ〜０．２０Ｍの場合に高い頻度で形質転換体が得られること、０．０９〜０．１３Ｍがより好ましく、０．１２Ｍが特に好ましいことが示された。
【実施例４】
【００４９】
さらに、緩衝液に５０ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を使用し、硫酸ナトリウムの濃度を変化させた場合の、形質転換頻度への影響を更に検討した。リン酸緩衝液に替えて５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した以外は実施例３と同様の手順により行った。
【００５０】
結果を表３に示す。硫酸ナトリウムの濃度は、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度で示した。
【００５１】
【表３】
【００５２】
この結果により、ＤＮＡ導入処理時のＭＯＰＳ緩衝液中の硫酸塩濃度が０．１０Ｍ〜０．１５Ｍの場合に高い頻度で形質転換体が得られること、０．１２〜０．１３Ｍがより好ましく、０．１３Ｍが特に好ましいことが示された。
【実施例５】
【００５３】
（ブレビバチルス・ブレビスへのＤＮＡ導入）
特許文献１の記載に従ってブレビバチルス・ブレビス４７の培養及び緩衝液処理を行った後、実施例１と同様の手順によりｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの導入を行った。形質転換頻度は４．４×１０３ｃｆｕ／μｇＤＮＡであった。
【００５４】
比較例として、従来法である特許文献１記載の方法に従ってブレビバチルス・ブレビス４７にｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの導入を行った。形質転換頻度は５×１０１ｃｆｕ／μｇＤＮＡであり、形質転換頻度が非常に低かった。
【００５５】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００５６】
本発明は、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌へのＤＮＡの導入（形質転換）方法であって、エレクトロポレーターなどの高価な機器がない環境でも実施可能で、かつ、エレクトロポレーション法と同等以上の実用的な形質転換頻度を実現する方法を提供し、更には、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法よりも簡便且つ効率的な方法を提供することを目的とする。
【００５７】
そして、グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法において、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している塩類を除いたものの濃度として０．０５Ｍ〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることで、グラム陽性菌の形質転換頻度を劇的に向上させる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌にＤＮＡを導入（形質転換）する方法に関する。詳細には、グラム陽性菌、例えばブレビバチルス属細菌などに、簡便且つ効率よくＤＮＡを導入（形質転換）する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性菌、例えば、組換えタンパク質生産の宿主として利用されているブレビバチルス属細菌へのプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡの導入（形質転換）方法としては、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法とエレクトロポレーション法が知られている。
【０００３】
Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法は、トリス塩酸緩衝液などのアルカリ性緩衝液等で細菌菌体を処理しコンピテントセル化した後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む緩衝液中で細菌にプラスミドＤＮＡ等のＤＮＡを導入する方法である。バチルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ４７）菌株（該菌株は現在、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に再分類されている）に用いた場合について、特許文献１及び非特許文献１などに記載されている。
【０００４】
なお、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法では、ＤＮＡ導入処理を、通常、以下の手順により行う。
１）アルカリ性緩衝液で処理後の細菌菌体を、ＴＰ培地（リン酸緩衝液と液体培地の混合溶液）に懸濁する。
２）導入するＤＮＡを１μｇ含む５０μｌ程度のＤＮＡ溶液にＴＰ培地を加え、１）の菌体懸濁溶液に添加する。
３）更に２）の溶液にＰＥＧ溶液を加え混合する。
４）混合後、１０分間の振とう培養を行う。
【０００５】
Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法を、例えばブレビバチルス・ブレビスに用いた場合、形質転換頻度が１×１０４ｃｆｕ／μｇＤＮＡ程度になる場合もあるが、通常は１×１０２〜１×１０３ｃｆｕ／μｇＤＮＡ程度の形質転換頻度である。しかしながら、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法をブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）に用いた場合には、形質転換頻度は１×１０１〜１×１０２ｃｆｕ／μｇＤＮＡと極めて低い。よって、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法は、特定のグラム陽性菌、特にブレビバチルス・チョウシネンシスに対しては実用的に利用可能な形質転換方法ではない。そのため、例えばブレビバチルス・チョウシネンシスでは、形質転換方法としてエレクトロポレーション法が専ら用いられている。
【０００６】
エレクトロポレーション法は、細菌菌体または細胞を短時間、強い電場の中に置くことにより細胞膜に穴を開け、強制的にＤＮＡを取り込ませる方法である。エレクトロポレーション法は、様々な細菌、細胞に対して用いられているが、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１）菌株（該菌株は現在、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）に再分類されている）に用いた場合については、非特許文献２、３等に記載されている。
【０００７】
ブレビバチルス・チョウシネンシスに対してエレクトロポレーション法を用いた場合の形質転換頻度は、通常、１×１０４〜１×１０６ｃｆｕ／μｇＤＮＡだが、１×１０７ｃｆｕ／μｇＤＮＡ以上になる場合もある。
【０００８】
なお、ブレビバチルス・ブレビスの細胞壁はペプチドグリカン層の外側を二層の結晶性表層タンパク質が覆う三層構造となっており、ブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞壁はペプチドグリカン層の外側を一層の結晶性表層タンパク質が覆う二層構造となっている。また、形質転換頻度の評価には、通常、プラスミドＤＮＡ１μｇあたりの形質転換体の個数（ｃｆｕ／μｇＤＮＡ）が用いられている。
【０００９】
エレクトロポレーション法は形質転換頻度が高いという利点がある一方、専用の高価な機器（エレクトロポレーター）が必要になるため、通常の実験室環境で簡便に実施できる方法ではない。また、強い電場の中に細菌菌体を置くため、菌体縣濁液中の塩濃度を出来る限り低くする必要がある。そのため、通常のＤＮＡライゲーション液をそのまま形質転換に用いることができず、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法では行わないエタノール沈殿等でＤＮＡを精製する工程が必要になるなどの問題もあった。
【００１０】
一方、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法は特別な機器を必要とせず、通常の実験室環境で実施可能であるという利点はあるものの、特定のグラム陽性菌、特にブレビバチルス・チョウシネンシスに対して用いた場合に実用的な形質転換頻度が得られないことが大きな問題だった。また、ブレビバチルス・ブレビスに対して用いた場合でも、再現性が乏しく、導入しようとする形質転換用プラスミドＤＮＡとの相性がよくない場合には、充分な形質転換頻度が得られないことが非常に多かった。
【００１１】
また、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法はＤＮＡ導入処理の実験操作を試験管スケールで行うため簡便さに欠け、また導入するＤＮＡも多量に用意する必要があった。更に、凍結した緩衝液処理済みの細菌菌体（コンピテントセル）を形質転換に用いた場合、形質転換頻度が更に低下することから、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法では凍結したコンピテントセルをＤＮＡ導入処理に用いることができなかった。そのため、形質転換の実験操作を行う場合には、その都度、コンピテントセル作製のための菌の培養から始める必要があり、形質転換の実験操作にほぼ丸一日を要するなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開昭６０−５８０７４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６（１９８３）：１１３０−１１３４
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５３（１９８９）：３０９９−３１００
【非特許文献３】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１（１９９７）：２０２−２０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌へのＤＮＡの導入（形質転換）方法であって、エレクトロポレーターなどの高価な機器がない環境でも実施可能で、かつ、エレクトロポレーション法と同等以上の実用的な形質転換頻度を実現する方法を提供すること、又は、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法よりも簡便且つ効率的な形質転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法を改良することにより、上記の課題の解決を目指した。そして様々な試行錯誤の末、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液に高濃度の塩類を含有させることにより、ブレビバチルス・チョウシネンシスの形質転換頻度を劇的に向上させることに成功した。この結果は、ＤＮＡ導入処理時の溶液のイオン強度が形質転換頻度に大きく影響していることを示している。更に本発明者は、ブレビバチルス・ブレビス等の他のグラム陽性菌においても同様に形質転換頻度が向上することを確認し本発明を完成させた。
また、本発明の方法は、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法がＤＮＡ導入処理時に用いていたＴＰ培地（リン酸緩衝液と液体培地の混合溶液）及びその後の振とう培養が不要であることも示された。
【００１６】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法であって、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している無機塩類及び／又は有機塩類を除いたものの濃度として０．０５〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることを特徴とする、グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法。
（２）無機塩類として硫酸塩を含有させることを特徴とする、（１）に記載の方法。
（３）硫酸塩が硫酸ナトリウム又は硫酸アンモニウムであることを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）コンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌を用いる（コンピテントセル化した後そのままの状態で用いるものでない）ことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）グラム陽性菌が、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌であることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）又はブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）であることを特徴とする、（５）に記載の方法。
（７）少なくとも、緩衝液で処理しコンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌、緩衝液を構成していない無機塩類及び／又は有機塩類を含む緩衝液（特に、無機塩類及び／又は有機塩類を含むリン酸緩衝液又はＭＯＰＳ緩衝液）、及び、ポリエチレングリコール溶液を含んでなることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法に用いる遺伝子工学キット。
【００１７】
（８）ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中のポリエチレングリコール濃度が１０〜５０％（ｗ／ｖ）であり、且つ、ポリエチレングリコールの平均分子量が１，０００〜１０，０００であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌に対して簡便に処理でき、かつ、高い形質転換頻度で形質転換体が得られる効率的、実用的なＤＮＡ導入（形質転換）方法及びその方法に用いるＤＮＡ導入処理用遺伝子工学キットを提供できる。そして、本発明で使用する塩類は、硫酸ナトリウムなどの一般に使用されている安価な試薬であり、エレクトロポレーターなどの高価な機器がない実験室環境下でも極めて簡便に実施することができる。
【００１９】
また、本発明の方法により、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法では試験管スケールで行っていた実験操作が約１０分の１にスケールダウンされエッペンチューブで行えるようになったため実験の操作性、経済性が格段に向上する。更に、これまで形質転換用ＤＮＡが１μｇ程度必要だったところ、本発明では１／１００の１０ｎｇ以下で実施可能であり、ＤＮＡ調製に要する労力が大幅に軽減され、試薬類の使用量も大幅に減る。また更に、従来行われていたＴｒｉｓ−ＰＥＧ法での必須工程である培地の添加や混合後の振とう培養の工程も不要となる。
【００２０】
更に、本発明の方法により、凍結したコンピテントセルを用いても実用的な形質転換頻度が得られるようになり、つまり、本発明では凍結したコンピテントセルも利用可能となる。その結果、形質転換の実験操作をＤＮＡ導入処理の段階から随時開始できるようになり、実験操作の時間的な制約が大幅に軽減される。また更に、緩衝液で処理した後に凍結したグラム陽性菌、例えばブレビバチルス属細菌のコンピテントセル、硫酸ナトリウムなどの塩類を含むリン酸緩衝液、及び、ポリエチレングリコール溶液を含むＤＮＡ導入処理用遺伝子工学キットを提供できることにより、グラム陽性菌、例えばブレビバチルス属細菌の形質転換の実験操作を簡便かつ随時、実施可能とする。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌を緩衝液（例えばアルカリ性緩衝液）で処理した後、ポリエチレングリコールを含む緩衝液中で該細菌菌体にＤＮＡを導入する方法であって、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液に高濃度の塩類（無機塩類又は有機塩類）を含むことを特徴とする方法である。
【００２２】
なお本発明に係る、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液は、緩衝液処理後の細菌菌体（コンピテントセル）、導入するＤＮＡ、無機塩類及び／又は有機塩類、及び、ポリエチレングリコールを含む。これらの添加順序、添加方法は特に限定されないが、以下の手順により行うのが好ましい。
１）緩衝液処理後の細菌菌体を集菌する。
２）ＤＮＡ溶液と、無機塩類及び／又は有機塩類を緩衝液に混合する。
３）２）の液を菌体に加える。
４）更にポリエチレングリコール溶液を加え混合する。
【００２３】
本発明で用いる塩類は、無機塩類でも有機塩類でも良く、これらの混合物でも良いが、無機塩類のみの使用が好ましく、更に無機塩類として硫酸塩が特に好ましい。
また、無機塩類及び／又は有機塩類のＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度は、形質転換効率を向上させる効果を発揮させるために一定の範囲である必要がある。つまり、塩類濃度が低過ぎると形質転換効率が低く、高過ぎても形質転換効率が低下する。塩類の濃度を高くし過ぎた場合の形質転換効率の低下は、溶液の浸透圧の過剰な上昇が影響しているものと思われる。
【００２４】
無機塩類及び／又は有機塩類のＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度範囲としては、当該緩衝液中において緩衝液を構成している（言い換えれば、緩衝液の緩衝作用に関与している）無機塩類及び有機塩類を除いたものの濃度として、０．０５〜０．２０Ｍが好ましく、０．０９〜０．１３Ｍがより好ましく、０．１２〜０．１３Ｍが特に好ましい。
【００２５】
なお、緩衝液を構成している塩類と添加する塩類が同一成分の場合（例えば、リン酸緩衝液にリン酸塩を添加する場合など）には、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に含まれる全ての塩類濃度（つまり、緩衝液を構成している塩類と添加塩類の合算の濃度）として０．０８〜０．３２Ｍ、好ましくは０．１３〜０．２３Ｍ、更に好ましくは０．１５〜０．２０Ｍとすれば良い。
【００２６】
ＤＮＡ導入処理時の溶液には、上述の通り緩衝液を用いることが必要である。緩衝液は、リン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（ロパンスルホン酸緩衝液）等が好ましいが、緩衝作用を有するものであれば幅広く使用することができる。例えば、リン酸緩衝液の場合、ｐＨは調整可能な範囲であれば特に限定されないが、濃度は４０〜１２０ｍＭが好ましく、７０ｍＭが特に好ましい。また、ＭＯＰＳ緩衝液の場合、ｐＨは調整可能な範囲であれば特に限定されないが、濃度は３０〜１００ｍＭが好ましく、５０ｍＭが特に好ましい。
【００２７】
また、使用するポリエチレングリコールは、特に限定されないが平均分子量１，０００〜１０，０００のものが好ましく、６，０００〜９，０００のものがより好ましい。さらに、ポリエチレングリコールの濃度も特に限定されないが、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度で１０〜５０％（ｗ／ｖ）が好ましく、３０〜４０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。例えば、ブレビバチルス属細菌の場合、ポリエチレングリコールの平均分子量は７，５００、反応液中の濃度は３０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
【００２８】
本発明の方法によりＤＮＡを導入する細菌としては、グラム陽性菌であれば特に限定されないが、グラム陽性桿菌が好ましく、グラム陽性好気性有胞子桿菌がより好ましく、ブレビバチルス属細菌が更に好ましい。ブレビバチルス属細菌とは、ブレビバチルス・アグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・ボルステレンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・セントロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモサス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルス・インボカタス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルス・ラチロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルス・リムノフィラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・パラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・レウスゼリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｓｚｅｒｉ）、ブレビバチルス・サーモルバー（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）などを含む。
【００２９】
ブレビバチルス属細菌では、ブレビバチルス・チョウシネンシスまたはブレビバチルス・ブレビスに用いた場合が好適であり、更に、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７９）、更にこれらの菌株から取得した栄養要求性変異株などの組換えタンパク質生産の宿主に用いられる菌株に用いた場合が特に好適である。
【００３０】
本発明において、グラム陽性菌に導入するＤＮＡは特に限定されず、環状でも直鎖状でもよいが、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ増幅断片等が好ましい。特にブレビバチルス属細菌に対しては、ブレビバチルス属細菌の形質転換に用いられているプラスミドＤＮＡ、及び該プラスミドＤＮＡに形質転換の目的である発現用ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡが好ましい。具体的には、ｐＮＹ３２６（タカラバイオ社製品）、ｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製品）等、及びそれらに発現用ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡが例示される。
ＤＮＡの大きさも細菌に導入可能であれば特に限定されないが、１００〜２０，０００ｂｐが好ましく、１００〜６，０００ｂｐがより好ましい。また、本発明において導入処理に使用するＤＮＡの量は１０ｎｇ以下（例えば１〜１０ｎｇ）でよい。
【００３１】
本発明の形質転換操作は、基本操作として、（１）培養、（２）緩衝液処理、（３）ＤＮＡ導入処理、（４）形質転換体の選択の４つの工程により行う。以下、それぞれの工程について説明する。
【００３２】
（１）培養
まず、細菌菌体の形質転換能が高くなっている時期、通常は対数増殖期までグラム陽性菌を培養する。
培地及び培養条件は、培養が可能であれば特に限定されない。例えば、ブレビバチルス属細菌の場合、培地として特許文献１に記載のＴ２培地の他にＴＭ培地（Ｔ２培地にＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％を添加した培地）等が例示される。培養終了の目安として、培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍ）を用いる場合には、ブレビバチルス・チョウシネンシスではＯ．Ｄ．６６０ｎｍ＝２．０〜６．０が好ましく、Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍ＝３．０〜４．０が特に好ましい。またブレビバチルス・ブレビスの場合はＯ．Ｄ．６６０ｎｍ＝１．５〜３．０が好ましい。
【００３３】
（２）緩衝液処理
培養後、細菌菌体の表層タンパク質層（及びペプチドグリカン層）を緩衝液で処理し、コンピテントセル化する。ブレビバチルス属細菌などの表層タンパク質層を有する細菌の場合は、この処理により表層タンパク質層が除去される。この処理は、特許文献１の記載に従って行えばよいが、コンピテントセル化（表層タンパク質層の除去）が可能であれば条件は適宜変更してよい。コンピテントセル化用の緩衝液は、トリス塩酸緩衝液が好ましいが、ＴＡＰＳ緩衝液などを用いてもよい。またコンピテントセル化用の緩衝液のｐＨは、弱アルカリ性が望ましいが、コンピテントセル化する効果があれば中性または弱酸性でもよい。なお、緩衝液で処理後の細菌菌体（コンピテントセル）をグリセロールを含む緩衝液に懸濁し凍結保存したものを解凍して使用することも可能である。
【００３４】
（３）ＤＮＡ導入処理
ＤＮＡ導入処理工程については、上述の通りであり、緩衝液中にコンピテントセル、導入するＤＮＡ、無機塩類及び／又は有機塩類、及び、ポリエチレングリコールを好適な範囲で含ませて混合するのみである。この工程において、従来法のような培地の添加や振とう培養は必要ない。
【００３５】
（４）形質転換体の選択
形質転換体（ＤＮＡが導入された菌体）の選択方法は、選択が可能であれば特に限定されないが、プラスミドＤＮＡを導入する場合などには、薬剤耐性遺伝子による選択方法を用いることができる。特にブレビバチルス属細菌の場合、薬剤耐性遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子またはエリスロマイシン耐性遺伝子が例示される。
【００３６】
以上の工程により、グラム陽性菌、特にブレビバチルス属細菌に簡便且つ効率よくＤＮＡを導入することができる。これにより、従来法よりも大幅なコスト削減、処理時間短縮を図ることができ、且つ、実用的な形質転換効率の高さがあるため、形質転換株の取得も容易である。また、凍結保存したコンピテントセルの使用が可能であり、且つ、特別な機器が必要でないため、本発明に用いる導入ＤＮＡ以外の試薬やセルをまとめてキット化し、形質転換用の遺伝子工学キットとして提供することもできる。
【００３７】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
（ブレビバチルス・チョウシネンシスへのプラスミドＤＮＡ導入）
本発明に係る方法によって、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３にｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの導入を行った。なお以下の操作は、培養等の処理温度が示されているもの以外はすべて室温（１５〜２５℃）で行った。
【００３９】
（１）培養
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３をＴＭ培地で３７℃で対数増殖期まで振とう培養した。培養後、遠心分離により集菌した。
【００４０】
（２）緩衝液処理
次いで５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、遠心分離により集菌した。集菌した細菌菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し、３７℃で６０分間振とうした。
【００４１】
（３）ＤＮＡ導入処理
振とう後、懸濁液をエッペンドルフチューブに５００μｌ採取し、更に微量遠心機により集菌し上澄みを取り除いた。次いで、ｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの溶液５μｌ（２ｎｇ／μｌ）と、硫酸ナトリウムを０．５Ｍ含む７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）５０μｌを混合した後、菌体が入ったエッペンドルフチューブに加え、ボルテックスにより懸濁した後、５分間静置した。次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００：平均分子量７，５００）を４０％（ｗ／ｖ）含む７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）１５０μｌをエッペンドルフチューブ内の溶液に加え、ボルテックスにより懸濁した。
【００４２】
（４）形質転換体の選択
次いで、微量遠心機により集菌し、ＭＴ培地（２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加したＴＭ培地）１ｍｌに縣濁し、３７℃で６０分間、振とうした。そして、ＴＭＮ寒天培地（ＴＭ培地にネオマイシンを５０μｇ／ｍｌ添加した寒天培地）に塗沫し、３７℃で３０時間培養し、選択用培地上に形成されたコロニーから形質転換体を得た。形質転換頻度は１．５×１０６ｃｆｕ／μｇＤＮＡであった。
なお、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の硫酸ナトリウムの濃度は０．１２Ｍである。
【実施例２】
【００４３】
実施例１の硫酸ナトリウムに替えて、各種塩類や糖などの非電解質の添加による形質転換効率を実施例１と同様の手順により確認した。添加した各物質の、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度はいずれも０．１２Ｍとした。また対照として、緩衝液を構成していない塩類が無添加の７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）を用いたものを無添加区とした。結果を表１に示す（実施例１の硫酸ナトリウム添加による形質転換頻度の結果も併せて記した）。
【００４４】
【表１】
【００４５】
糖や糖アルコールなどの非電解質の場合に比べ、溶解後イオンを生成する（つまり電解質である）各種塩類の場合に高い頻度で形質転換体が得られた。中でも硫酸塩を添加した場合に、特に高い形質転換促進効果を奏することが示された。
【実施例３】
【００４６】
塩類のＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度を変化させた場合の、形質転換頻度への影響を確認するため、以下の試験を行った。塩類には硫酸ナトリウムを用い、その添加量を変えた以外は実施例１と同様の手順により行った。結果を表２に示す。硫酸ナトリウムの濃度は、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度として示した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
この結果により、ＤＮＡ導入処理時のリン酸緩衝液中の硫酸塩濃度が０．０５Ｍ〜０．２０Ｍの場合に高い頻度で形質転換体が得られること、０．０９〜０．１３Ｍがより好ましく、０．１２Ｍが特に好ましいことが示された。
【実施例４】
【００４９】
さらに、緩衝液に５０ｍＭの濃度のＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を使用し、硫酸ナトリウムの濃度を変化させた場合の、形質転換頻度への影響を更に検討した。リン酸緩衝液に替えて５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した以外は実施例３と同様の手順により行った。
【００５０】
結果を表３に示す。硫酸ナトリウムの濃度は、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中の濃度で示した。
【００５１】
【表３】
【００５２】
この結果により、ＤＮＡ導入処理時のＭＯＰＳ緩衝液中の硫酸塩濃度が０．１０Ｍ〜０．１５Ｍの場合に高い頻度で形質転換体が得られること、０．１２〜０．１３Ｍがより好ましく、０．１３Ｍが特に好ましいことが示された。
【実施例５】
【００５３】
（ブレビバチルス・ブレビスへのＤＮＡ導入）
特許文献１の記載に従ってブレビバチルス・ブレビス４７の培養及び緩衝液処理を行った後、実施例１と同様の手順によりｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの導入を行った。形質転換頻度は４．４×１０３ｃｆｕ／μｇＤＮＡであった。
【００５４】
比較例として、従来法である特許文献１記載の方法に従ってブレビバチルス・ブレビス４７にｐＮＹ３２６プラスミドＤＮＡの導入を行った。形質転換頻度は５×１０１ｃｆｕ／μｇＤＮＡであり、形質転換頻度が非常に低かった。
【００５５】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００５６】
本発明は、グラム陽性菌、特にはブレビバチルス属細菌へのＤＮＡの導入（形質転換）方法であって、エレクトロポレーターなどの高価な機器がない環境でも実施可能で、かつ、エレクトロポレーション法と同等以上の実用的な形質転換頻度を実現する方法を提供し、更には、従来のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法よりも簡便且つ効率的な方法を提供することを目的とする。
【００５７】
そして、グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法において、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している塩類を除いたものの濃度として０．０５Ｍ〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることで、グラム陽性菌の形質転換頻度を劇的に向上させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法であって、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している塩類を除いたものの濃度として０．０５〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることを特徴とする、グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法。
【請求項２】
無機塩類として硫酸塩を含有させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
硫酸塩が硫酸ナトリウム又は硫酸アンモニウムであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌を用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グラム陽性菌が、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）又はブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも、緩衝液で処理しコンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌、緩衝液を構成していない無機塩類及び／又は有機塩類を含有する緩衝液、及び、ポリエチレングリコール溶液を含んでなることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いる遺伝子工学キット。
【請求項１】
グラム陽性菌を緩衝液で処理しコンピテントセル化した後、緩衝液中で該グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法であって、ＤＮＡ導入処理時の緩衝液中に、該グラム陽性菌、ポリエチレングリコール、導入するＤＮＡとともに、緩衝液を構成している塩類を除いたものの濃度として０．０５〜０．２０Ｍとなるように無機塩類及び／又は有機塩類を含有させることを特徴とする、グラム陽性菌にＤＮＡを導入する方法。
【請求項２】
無機塩類として硫酸塩を含有させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
硫酸塩が硫酸ナトリウム又は硫酸アンモニウムであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌を用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グラム陽性菌が、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）又はブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも、緩衝液で処理しコンピテントセル化した後に凍結したグラム陽性菌、緩衝液を構成していない無機塩類及び／又は有機塩類を含有する緩衝液、及び、ポリエチレングリコール溶液を含んでなることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いる遺伝子工学キット。
【公開番号】特開２０１２−１９７６５（Ｐ２０１２−１９７６５Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６２１１８（Ｐ２０１０−１６２１１８）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（０００１１２０６０）ヒゲタ醤油株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（０００１１２０６０）ヒゲタ醤油株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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