グリコサミノグリカン画分中の不純物の除去方法
【課題】グリコサミノグリカン画分中に存在する核酸、鉄、タンパク質等の不純物を簡便、迅速かつ効率よく除去できる方法、これらの不純物が除去されたグリコサミノグリカン画分を大量に製造しうる方法等を提供すること。
【解決手段】次の工程（１）及び（２）を含む、グリコサミノグリカン画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法；工程（１）グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭とを接触させる工程、工程（２）：グリコサミノグリカン画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のグリコサミノグリカン画分を採取する工程。これら工程を含む、次の性質（ａ）〜（ｃ）を有するグリコサミノグリカン画分の生産方法；性質（ａ）核酸含量がグリコサミノグリカン画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である、性質（ｂ）鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である、性質（ｃ）タンパク質含量が０．４％以下である。
【解決手段】次の工程（１）及び（２）を含む、グリコサミノグリカン画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法；工程（１）グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭とを接触させる工程、工程（２）：グリコサミノグリカン画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のグリコサミノグリカン画分を採取する工程。これら工程を含む、次の性質（ａ）〜（ｃ）を有するグリコサミノグリカン画分の生産方法；性質（ａ）核酸含量がグリコサミノグリカン画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である、性質（ｂ）鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である、性質（ｃ）タンパク質含量が０．４％以下である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン画分から不純物を効率よく除去する方法、不純物が除去されたグリコサミノグリカン画分の生産方法、及びこれらの物質の除去に有用な除去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書中で用いた略号について説明する。
ＥｔＯＨ：エタノール
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid）
ＣＨ：コンドロイチン（chondroitin）
ＣＳ：コンドロイチン硫酸（chondroitin sulfate）
ＤＳ：デルマタン硫酸（dermatan sulfate）
Ｈｅｐ：ヘパリン（heparin）
ＨＳ：ヘパラン硫酸（heparan sulfate）
ＫＳ：ケラタン硫酸（keratan sulfate）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediamine tetraacetic acid）
特許文献１には、低分子キトサンを有効成分として含有することを特徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤が記載されている。そして当該文献中には、エンドトキシンを除去する方法として活性炭などによる方法が知られている旨の開示がある。
【０００３】
また特許文献２には、ＨＡの水溶液に活性炭とＥｔＯＨを加え、その後減圧濾過を行い、濾液にＥｔＯＨを加えて沈殿させて、ＨＡを取得することが開示されている。
【０００４】
しかし、活性炭によって、ＧＡＧ画分中に存在する核酸、鉄、タンパク質が極めて効率よく除去できることについては知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特公平６−４１４７９号公報
【特許文献２】特開２００１−２７０８２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＧＡＧ画分中に存在する核酸、鉄、タンパク質等の不純物を簡便、迅速かつ効率よく除去できる方法、これらの不純物が除去されたＧＡＧ画分を大量に製造しうる方法、及びこれらの方法に使用できる不純物の除去剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、活性炭を用いることにより、極めて効率的に核酸、鉄、タンパク質等の不純物を除去することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法（以下、本発明除去方法という。）を提供する。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
【０００９】
ＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。また、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満であることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、溶液中のＧＡＧ画分に実質的に悪影響を与えない条件下で行われる限り特に限定されず、例えばｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、５分間以上保持されることが好ましい。
【００１０】
また本発明は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するＧＡＧ画分の生産方法（以下、本発明生産方法という。）を提供する。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、ＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である。
【００１１】
ＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。また、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満であることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、５分間以上保持されることが好ましい。
【００１２】
さらに本発明は、活性炭を有効成分とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去剤（以下、本発明除去剤という。）を提供する。ＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。本発明除去剤は、ＧＡＧ画分の溶液と接触させて用いられることが好ましい。またこの場合、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満であることが好ましい。また本発明除去剤は、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で使用されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明除去方法は、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質等の不純物を極めて効率よく、簡便かつ迅速に除去することができ、極めて有用である。また、本発明生産方法は、これらの不純物が除去されたＧＡＧ画分を簡便、迅速かつ大量に製造することができ、極めて有用である。さらに本発明除去剤は、このような本発明除去方法や生産方法にそのまま使用することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
＜１＞本発明除去方法
本発明除去方法は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法である。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
【００１５】
ここで、核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質を除去する対象となるＧＡＧ画分は、ＧＡＧを含有する画分である限りにおいて特に限定されないが、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれる画分であることが好ましい。このようなＧＡＧの画分は、市販のもの等を用いることもでき、また次のような公知の方法で製造することもできる；例えば、ＨＡはニワトリの鶏冠、サメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシ、ブタ等の哺乳動物の軟骨、臍帯、皮、ＨＡを産生する微生物の培養物などを原料に、ＣＨやＣＳはチョウザメの脊索、クジラ、サメ、イカなどの軟骨やヒレなどや、ウシの気管などを原料に、ＤＳはニワトリの鶏冠やブタの皮などを原料に、Ｈｅｐはブタの腸などを原料に、ＨＳはウシの腎臓などを原料に、ＫＳはサメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシなどの哺乳動物の軟骨、角膜などを原料にして、破砕、プロテアーゼ等の酵素を用いる方法、オートクレーブを用いる方法、第四級アンモニウム塩を用いる方法などによって抽出・処理し、有機溶媒（例えばアルコール）による沈殿、塩析などをして回収する方法。
【００１６】
本発明除去方法は、このようなＧＡＧ画分中から核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質を除去するものである。どの物質を除去するかは、目的に応じて適宜選定することができる。例えば本発明除去方法を、ＧＡＧ画分中の核酸を除去するために実施してもよく、鉄を除去するために実施してもよく、タンパク質を除去するために実施してもよく、核酸及び鉄を除去するために実施してもよく、核酸及びタンパク質を除去するために実施してもよく、鉄及びタンパク質を除去するために実施してもよく、核酸、鉄及びタンパク質の全てを除去するために実施してもよい。
【００１７】
本発明における「核酸」の用語には、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡが包含され、本発明除去方法によって除去出来る核酸関連物質である限りにおいて特に限定されず、その組成や配列、分子量も特に限定されない。また、本発明における「鉄」の用語には、鉄分子、鉄イオン（２価、３価）、鉄原子を含有する化合物、鉄を含有する錯体や、タンパク質や脂質等の生体物質に結合した鉄分子や鉄イオン等が包含され、本発明除去方法によって除去出来る鉄含有物質である限りにおいて特に限定されず、その存在様式・形態等は特に限定されない。また、本発明における「タンパク質」の用語には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等が包含されるが、本発明除去方法によって除去出来るペプチド配列を有する物質であれば特に限定されず、そのアミノ酸組成や配列、分子量も特に限定されない。
【００１８】
また本出願書類において「除去」とは、ある物質を完全に除き去ることのみならず、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことをも意味する用語として用いる。
【００１９】
本発明除去方法は、前記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする。以下、工程ごとに説明する。
【００２０】
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
【００２１】
工程（１）は、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程である。
【００２２】
ここで用いるＧＡＧ画分の溶液は、ＧＡＧ画分が何らかの溶媒に溶解しているものである限りにおいて特に限定されない。ＧＡＧ画分を溶解する溶媒も特に限定されないが、水性溶媒が好ましい。水性溶媒としては、水、緩衝液、生理的塩類溶液等が例示される。また、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満となるように調整することが好ましく、１５％（v/v）以下となるように調整することがより好ましく、１０％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、８％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、７％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、６％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、５％（v/v）以下となるように調整することが特に好ましく、有機溶剤を実質的に含有しないよう調整することが極めて好ましい。このような有機溶剤含量が少ない溶液を採用することによって、タンパク質等の含量をさらに低減でき、より精製度が高いＧＡＧ画分を得られるという利点がある。ここで「実質的に含有しない」とは、一分子たりとも存在しないという意味ではなく、本発明除去方法における除去の効果に実質的な影響を与えない限りにおいて多少の含有は許される、という趣旨である。
「有機溶剤」の一例として、例えばメタノール、ＥｔＯＨ、プロパノールといったアルコール類や、アセトンなどのケトン類が例示される。
【００２３】
また、ここで用いる活性炭も、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質をＧＡＧ画分中において吸着する能力を有する限りにおいて特に限定されない。例えば、活性炭のベースとなる素材としては木、ヤシ殻、石炭等が例示される。活性炭が製造される際の賦活化の方法としては、水蒸気による高温処理や塩化亜鉛などを用いた方法が例示される。またその形状としては、粉末状、粒状等を例示することができる。粒状のものとしては破砕状、顆粒状、円柱状、球状等の形状を例示することができる。またこのような活性炭をさらにフィルター状、フェルト状、布状等に加工したものを用いてもよい。
【００２４】
このような活性炭をＧＡＧ画分の溶液と接触させる方法も、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸分子、上述した鉄又はタンパク質分子と、活性炭とが接触するものである限りにおいて特に限定されない。例えば、両者を直接混合して接触させてもよく、活性炭を充填したカラムにＧＡＧ画分の溶液を通すことによって接触させてもよく、活性炭を保持する膜、フィルター、フェルト、布等にＧＡＧ画分の溶液を通すことによって接触させてもよい。また、この際に用いる活性炭の量も、ＧＡＧ画分の溶液量や、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸分子、鉄、たんぱく質分子をどの程度除去するか、ということに応じて当業者が適宜設定することができる。好ましくは、これら分子を十分除去するために必要な、十分な量の活性炭を用いればよい。
【００２５】
また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触が行われる条件も、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質がＧＡＧ画分中において活性炭に吸着され、保持される条件である限りにおいて特に限定されないが、ｐＨ５〜９の条件下で行われることが好ましい。また、温度は２０〜７０℃の条件下で行われることが好ましい。また活性炭と接触させる際のＧＡＧ画分の溶液の濃度は、当該溶液が、活性炭の表面に密に接触しうる程度の流動性を有する限りにおいて特に限定されないが、０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とが接触している時間も特に限定されないが、核酸、鉄又はタンパク質が活性炭に十分吸着させるという観点では、好ましくは５分間以上、より好ましくは１５分間以上、さらに好ましくは３０分間以上、最も好ましくは１時間以上保持されることが好ましい。
【００２６】
このように、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させることにより、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸、鉄及びタンパク質が活性炭に吸着される。
【００２７】
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
【００２８】
工程（２）は、ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離して、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程である。ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭には、ＧＡＧ画分の溶液中に存在していた核酸、鉄及びタンパク質が吸着しているため、これを分離することによって核酸、鉄及びタンパク質が除去されたＧＡＧ画分を得ることができる、
ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離する方法も特に限定されないが、例えば濾過、フィルタープレス分離、デカンテーション、遠心分離等の方法を例示することができる。この場合、その濾液や上清を採取することによって、活性炭と分離した後のＧＡＧ画分を採取することができる。また、カラムや膜、フィルター、フェルト、布状のものにＧＡＧ画分の溶液を通した場合には、その通過した溶液を採取することによって活性炭を分離すると同時に当該分離後のＧＡＧ画分を採取することができる。
【００２９】
本発明除去方法は、このような工程（１）及び（２）を少なくとも含んでいれば良く、さらに他の工程を含んでいてもよい。例えば、工程（１）の前にＧＡＧ画分を製造したり、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質を測定する工程等をさらに含んでいてもよい。また工程（２）の後に、採取したＧＡＧ画分を乾燥させたり、別の溶媒に置換したり、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質を測定する工程等をさらに含んでいてもよい。
【００３０】
本発明除去方法によってＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質が除去されたか否かは、活性炭に接触させる前のＧＡＧ画分中のこれらの物質の量と、接触後のＧＡＧ画分中のこれらの物質の量とを比較することによって調べることができる。これらの物質の定量は、公知の測定方法によって行うことができる。例えば、核酸の定量はエチジウムブロマイド法によって行うことができ、鉄の定量は原子吸光測定法によって行うことができ、タンパク質の定量はローリー法によって行うことができる。これらの具体的な方法は、後述の実施例を参照されたい。
＜２＞本発明生産方法
本発明生産方法は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するＧＡＧ画分の生産方法である。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、ＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。より好ましくは０．０６ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である。
【００３１】
本発明生産方法におけるＧＡＧ画分は、ＧＡＧを含有する画分である限りにおいて特に限定されないが、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれる画分であることが好ましい。本発明生産方法における工程（１）及び（２）その他の説明は、前記＜１＞に記載した本発明除去方法におけるものと同じである。
【００３２】
本発明生産方法によって生産されるＧＡＧ画分は、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するものである。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、ＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である。
【００３３】
エチジウムブロマイド法、原子吸光測定法及びローリー法についての詳細は、後述の実施例を参照されたい。
＜３＞本発明除去剤
本発明除去剤は、活性炭を有効成分とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去剤である。
【００３４】
本発明除去剤を用いた、核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去の対象となるＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。また、本発明除去剤は、ＧＡＧ画分の溶液と接触させて用いられることが好ましい。この場合、本発明除去剤をＧＡＧ画分の溶液と接触させる方法や、ＧＡＧ画分の溶液と本発明除去剤との接触が行われる条件（ｐＨ、温度、ＧＡＧ画分の溶液の濃度、有機溶剤含有量、時間など）等については、前記＜１＞に記載したものと同様である。
【００３５】
本発明除去剤は、前記＜１＞に記載した本発明除去方法に従って使用することができる。また、前記＜２＞に記載した本発明生産方法に従って使用することもできる。
【００３６】
本発明除去剤において、ＧＡＧ画分を溶解させる溶媒、ＧＡＧ画分の溶液や、有効成分である活性炭等についての説明も、前記＜１＞に記載したものと同じである。本発明除去剤においては、活性炭を有効成分として含有する限りにおいて、他の成分を含有していてもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明する。
【００３８】
まず、本実施例において共通して用いた方法を説明する。
（１）エチジウムブロマイド法
試料を１％となるようにTris-EDTA緩衝液（pH7.2）で溶解し、必要に応じてＧＡＧ分解酵素でＧＡＧの粘性を低下させた。この試料、ＤＮＡ標準液（Tris-EDTA緩衝液（pH7.2）で１μｇ／ｍＬに調製したもの）及びブランク（Tris-EDTA緩衝液（pH7.2））各１ｍＬに、臭化エチジウム溶液（蒸留水で0.0002%としたもの）をそれぞれ１ｍＬ添加して攪拌した。その後、それぞれ蛍光分光光度計を用いて励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにより蛍光強度を測定した。
（２）原子吸光測定法
試料２５ｍｇを試験管に量り取り、２mol/Lの塩酸２ｍLで溶解した後、１０分間煮沸した。その後、蒸留水０．５ｍLを添加してよく攪拌した。この試料及び鉄標準液（０〜４ppm；検量線を作成用）について、原子吸光分光光度計（Z−８０００形偏光ゼーマン原子吸光分光光度計（HITACHI製））とホローカソードランプ（Fe）を用いて吸光度を測定した。
（３）ローリー法
Ｌｏｗｒｙ．Ｏ．Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３、ｐ．２６５―２７５（１９５１）記載の方法を参考に、一般的な方法に従って行った。
（実施例１）ＨＡを用いた実施例
鶏冠を、特公昭６１−２１２４１号公報に記載の方法で処理し、ＨＡを含有するアルコール沈殿画分を得た。
【００３９】
このアルコール沈殿画分を、精製水に溶解し、これにオートクレーブ処理した活性炭を添加して、１時間撹拌した。
【００４０】
その後、セラミックフィルターを用いて濾過した。その際の濾過助剤としては珪藻土を用いた。
【００４１】
その濾液を回収し、さらにフィルタープレスを用いて濾過した。その際の濾過助剤としては珪藻土を用いた。濾液を回収し、「活性炭処理後の画分」とした。
【００４２】
なお、以上の濾過助剤は全てオートクレーブ処理したものを用いた。
【００４３】
アルコール沈殿画分（活性炭処理前の画分）及び活性炭処理後の画分について、核酸含量、鉄含量及びタンパク質含量を測定した。核酸含量の結果を表１に（単位：μg/mgHA）、鉄含量の結果を表２に（単位：ｐｐｍ）、ＨＡ含量に対するタンパク質含量の比を表３にそれぞれ示した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
表１〜３から明らかな通り、活性炭処理するだけで、核酸含量については少なくとも１／１３以下に、鉄含量については１／４以下に、タンパク質含量は１／６５以下となることが示された。したがって、活性炭を用いることによって、ＨＡ画分中に存在するこれらの物質を極めて効率よく除去できることが示された。
【００４８】
さらに、これによって（ａ）エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量がＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満であり、（ｂ）原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が０．０７ｐｐｍ以下（０．０６ｐｐｍ以下）であり、かつ（ｃ）ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である、という性質を有するＨＡが製造できることが示された。
（実施例２）ＣＳ（サメのヒレ由来）を用いた実施例
サメヒレからのＣＳの調製は、一般的な方法を用いて行った。すなわち、サメのヒレを粉砕し、これにタンパク質分解酵素（エスペラーゼ；ノボザイムズ社製）を作用させることにより、ＣＳを抽出した。この抽出物についてアルコール沈殿を行い、ＣＳを含むアルコール沈殿画分を得た。得られた画分について、実施例１と同様の方法により１回目の活性炭処理（１次処理）を行い、セラミックフィルターを用いて濾過することにより、１次処理液を得た。この処理液についてアルコール分画を２回連続して行うことにより、分画液を得た。さらにこの分画液について再度１回目と同様に活性炭処理（２次処理）と濾過を行うことにより、２次処理液を得た。
【００４９】
アルコール沈殿画分（活性炭処理前の画分）及び活性炭処理後の画分（１次処理液、２次処理液）について、タンパク質含量を測定した。ＣＳ含量に対するタンパク質含量の比を表４に示した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４から明らかな通り、１次活性炭処理を行うだけで、タンパク質含量が１／３以下（含有比０．１５％以下）になることが示された。さらに２次活性炭処理を行うことにより、タンパク質含量が当初の１／１７以下（含有比０．０３％以下）となることが示された。
（実施例３）ＣＳ（ウシの気管由来）を用いた実施例
実施例２と同様の方法により、牛気管由来のＣＳを得、活性炭処理、濾過、アルコール分画（１回）を行った。アルコール沈殿画分（活性炭処理前の画分）及び活性炭処理後の画分（１次処理液、２次処理液）について、タンパク質含量を測定した。ＣＳ含量に対するタンパク質含量の比を表５に示した。
【００５２】
【表５】
【００５３】
実施例２及び実施例３により、活性炭を用いることにより、ＨＡのみならずＣＳ中の不
純物をも極めて高度かつ効率的に除去できることが明らかになった。
以上の結果から、活性炭を用いることによりＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質を極めて効率的に除去することができ、不純物含量が極めて低いＧＡＧ画分を極めて簡便、迅速かつ大量に製造できることが示された。また、本発明によって得られるＧＡＧ画分は、一般に医薬として利用しうる程度にまで、高度に精製されたものであることが明らかになった。したがって、活性炭を、ＧＡＧ画分中のこれら不純物を高度に取り除く除去剤として利用できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明除去方法は、医薬品、化粧品、食品、飲料等の原料となりうるＧＡＧ画分中の不純物（核酸、鉄、タンパク質）の除去に利用することができる。本発明生産方法は、このような不純物が除去されたＧＡＧ画分の生産に利用することができる。本発明除去剤は、このような本発明除去方法や生産方法に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン画分から不純物を効率よく除去する方法、不純物が除去されたグリコサミノグリカン画分の生産方法、及びこれらの物質の除去に有用な除去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書中で用いた略号について説明する。
ＥｔＯＨ：エタノール
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid）
ＣＨ：コンドロイチン（chondroitin）
ＣＳ：コンドロイチン硫酸（chondroitin sulfate）
ＤＳ：デルマタン硫酸（dermatan sulfate）
Ｈｅｐ：ヘパリン（heparin）
ＨＳ：ヘパラン硫酸（heparan sulfate）
ＫＳ：ケラタン硫酸（keratan sulfate）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediamine tetraacetic acid）
特許文献１には、低分子キトサンを有効成分として含有することを特徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤が記載されている。そして当該文献中には、エンドトキシンを除去する方法として活性炭などによる方法が知られている旨の開示がある。
【０００３】
また特許文献２には、ＨＡの水溶液に活性炭とＥｔＯＨを加え、その後減圧濾過を行い、濾液にＥｔＯＨを加えて沈殿させて、ＨＡを取得することが開示されている。
【０００４】
しかし、活性炭によって、ＧＡＧ画分中に存在する核酸、鉄、タンパク質が極めて効率よく除去できることについては知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特公平６−４１４７９号公報
【特許文献２】特開２００１−２７０８２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＧＡＧ画分中に存在する核酸、鉄、タンパク質等の不純物を簡便、迅速かつ効率よく除去できる方法、これらの不純物が除去されたＧＡＧ画分を大量に製造しうる方法、及びこれらの方法に使用できる不純物の除去剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、活性炭を用いることにより、極めて効率的に核酸、鉄、タンパク質等の不純物を除去することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法（以下、本発明除去方法という。）を提供する。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
【０００９】
ＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。また、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満であることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、溶液中のＧＡＧ画分に実質的に悪影響を与えない条件下で行われる限り特に限定されず、例えばｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、５分間以上保持されることが好ましい。
【００１０】
また本発明は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するＧＡＧ画分の生産方法（以下、本発明生産方法という。）を提供する。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、ＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である。
【００１１】
ＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。また、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満であることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触は、５分間以上保持されることが好ましい。
【００１２】
さらに本発明は、活性炭を有効成分とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去剤（以下、本発明除去剤という。）を提供する。ＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。本発明除去剤は、ＧＡＧ画分の溶液と接触させて用いられることが好ましい。またこの場合、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満であることが好ましい。また本発明除去剤は、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で使用されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明除去方法は、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質等の不純物を極めて効率よく、簡便かつ迅速に除去することができ、極めて有用である。また、本発明生産方法は、これらの不純物が除去されたＧＡＧ画分を簡便、迅速かつ大量に製造することができ、極めて有用である。さらに本発明除去剤は、このような本発明除去方法や生産方法にそのまま使用することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
＜１＞本発明除去方法
本発明除去方法は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法である。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
【００１５】
ここで、核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質を除去する対象となるＧＡＧ画分は、ＧＡＧを含有する画分である限りにおいて特に限定されないが、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれる画分であることが好ましい。このようなＧＡＧの画分は、市販のもの等を用いることもでき、また次のような公知の方法で製造することもできる；例えば、ＨＡはニワトリの鶏冠、サメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシ、ブタ等の哺乳動物の軟骨、臍帯、皮、ＨＡを産生する微生物の培養物などを原料に、ＣＨやＣＳはチョウザメの脊索、クジラ、サメ、イカなどの軟骨やヒレなどや、ウシの気管などを原料に、ＤＳはニワトリの鶏冠やブタの皮などを原料に、Ｈｅｐはブタの腸などを原料に、ＨＳはウシの腎臓などを原料に、ＫＳはサメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシなどの哺乳動物の軟骨、角膜などを原料にして、破砕、プロテアーゼ等の酵素を用いる方法、オートクレーブを用いる方法、第四級アンモニウム塩を用いる方法などによって抽出・処理し、有機溶媒（例えばアルコール）による沈殿、塩析などをして回収する方法。
【００１６】
本発明除去方法は、このようなＧＡＧ画分中から核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質を除去するものである。どの物質を除去するかは、目的に応じて適宜選定することができる。例えば本発明除去方法を、ＧＡＧ画分中の核酸を除去するために実施してもよく、鉄を除去するために実施してもよく、タンパク質を除去するために実施してもよく、核酸及び鉄を除去するために実施してもよく、核酸及びタンパク質を除去するために実施してもよく、鉄及びタンパク質を除去するために実施してもよく、核酸、鉄及びタンパク質の全てを除去するために実施してもよい。
【００１７】
本発明における「核酸」の用語には、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡが包含され、本発明除去方法によって除去出来る核酸関連物質である限りにおいて特に限定されず、その組成や配列、分子量も特に限定されない。また、本発明における「鉄」の用語には、鉄分子、鉄イオン（２価、３価）、鉄原子を含有する化合物、鉄を含有する錯体や、タンパク質や脂質等の生体物質に結合した鉄分子や鉄イオン等が包含され、本発明除去方法によって除去出来る鉄含有物質である限りにおいて特に限定されず、その存在様式・形態等は特に限定されない。また、本発明における「タンパク質」の用語には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等が包含されるが、本発明除去方法によって除去出来るペプチド配列を有する物質であれば特に限定されず、そのアミノ酸組成や配列、分子量も特に限定されない。
【００１８】
また本出願書類において「除去」とは、ある物質を完全に除き去ることのみならず、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことをも意味する用語として用いる。
【００１９】
本発明除去方法は、前記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする。以下、工程ごとに説明する。
【００２０】
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
【００２１】
工程（１）は、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程である。
【００２２】
ここで用いるＧＡＧ画分の溶液は、ＧＡＧ画分が何らかの溶媒に溶解しているものである限りにおいて特に限定されない。ＧＡＧ画分を溶解する溶媒も特に限定されないが、水性溶媒が好ましい。水性溶媒としては、水、緩衝液、生理的塩類溶液等が例示される。また、「ＧＡＧ画分の溶液」における有機溶剤含量は、２０％（v/v）未満となるように調整することが好ましく、１５％（v/v）以下となるように調整することがより好ましく、１０％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、８％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、７％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、６％（v/v）以下となるように調整することがさらに好ましく、５％（v/v）以下となるように調整することが特に好ましく、有機溶剤を実質的に含有しないよう調整することが極めて好ましい。このような有機溶剤含量が少ない溶液を採用することによって、タンパク質等の含量をさらに低減でき、より精製度が高いＧＡＧ画分を得られるという利点がある。ここで「実質的に含有しない」とは、一分子たりとも存在しないという意味ではなく、本発明除去方法における除去の効果に実質的な影響を与えない限りにおいて多少の含有は許される、という趣旨である。
「有機溶剤」の一例として、例えばメタノール、ＥｔＯＨ、プロパノールといったアルコール類や、アセトンなどのケトン類が例示される。
【００２３】
また、ここで用いる活性炭も、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質をＧＡＧ画分中において吸着する能力を有する限りにおいて特に限定されない。例えば、活性炭のベースとなる素材としては木、ヤシ殻、石炭等が例示される。活性炭が製造される際の賦活化の方法としては、水蒸気による高温処理や塩化亜鉛などを用いた方法が例示される。またその形状としては、粉末状、粒状等を例示することができる。粒状のものとしては破砕状、顆粒状、円柱状、球状等の形状を例示することができる。またこのような活性炭をさらにフィルター状、フェルト状、布状等に加工したものを用いてもよい。
【００２４】
このような活性炭をＧＡＧ画分の溶液と接触させる方法も、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸分子、上述した鉄又はタンパク質分子と、活性炭とが接触するものである限りにおいて特に限定されない。例えば、両者を直接混合して接触させてもよく、活性炭を充填したカラムにＧＡＧ画分の溶液を通すことによって接触させてもよく、活性炭を保持する膜、フィルター、フェルト、布等にＧＡＧ画分の溶液を通すことによって接触させてもよい。また、この際に用いる活性炭の量も、ＧＡＧ画分の溶液量や、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸分子、鉄、たんぱく質分子をどの程度除去するか、ということに応じて当業者が適宜設定することができる。好ましくは、これら分子を十分除去するために必要な、十分な量の活性炭を用いればよい。
【００２５】
また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭との接触が行われる条件も、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質がＧＡＧ画分中において活性炭に吸着され、保持される条件である限りにおいて特に限定されないが、ｐＨ５〜９の条件下で行われることが好ましい。また、温度は２０〜７０℃の条件下で行われることが好ましい。また活性炭と接触させる際のＧＡＧ画分の溶液の濃度は、当該溶液が、活性炭の表面に密に接触しうる程度の流動性を有する限りにおいて特に限定されないが、０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。また、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とが接触している時間も特に限定されないが、核酸、鉄又はタンパク質が活性炭に十分吸着させるという観点では、好ましくは５分間以上、より好ましくは１５分間以上、さらに好ましくは３０分間以上、最も好ましくは１時間以上保持されることが好ましい。
【００２６】
このように、ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させることにより、ＧＡＧ画分の溶液中に存在する核酸、鉄及びタンパク質が活性炭に吸着される。
【００２７】
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
【００２８】
工程（２）は、ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離して、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程である。ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭には、ＧＡＧ画分の溶液中に存在していた核酸、鉄及びタンパク質が吸着しているため、これを分離することによって核酸、鉄及びタンパク質が除去されたＧＡＧ画分を得ることができる、
ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離する方法も特に限定されないが、例えば濾過、フィルタープレス分離、デカンテーション、遠心分離等の方法を例示することができる。この場合、その濾液や上清を採取することによって、活性炭と分離した後のＧＡＧ画分を採取することができる。また、カラムや膜、フィルター、フェルト、布状のものにＧＡＧ画分の溶液を通した場合には、その通過した溶液を採取することによって活性炭を分離すると同時に当該分離後のＧＡＧ画分を採取することができる。
【００２９】
本発明除去方法は、このような工程（１）及び（２）を少なくとも含んでいれば良く、さらに他の工程を含んでいてもよい。例えば、工程（１）の前にＧＡＧ画分を製造したり、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質を測定する工程等をさらに含んでいてもよい。また工程（２）の後に、採取したＧＡＧ画分を乾燥させたり、別の溶媒に置換したり、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質を測定する工程等をさらに含んでいてもよい。
【００３０】
本発明除去方法によってＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質が除去されたか否かは、活性炭に接触させる前のＧＡＧ画分中のこれらの物質の量と、接触後のＧＡＧ画分中のこれらの物質の量とを比較することによって調べることができる。これらの物質の定量は、公知の測定方法によって行うことができる。例えば、核酸の定量はエチジウムブロマイド法によって行うことができ、鉄の定量は原子吸光測定法によって行うことができ、タンパク質の定量はローリー法によって行うことができる。これらの具体的な方法は、後述の実施例を参照されたい。
＜２＞本発明生産方法
本発明生産方法は、下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するＧＡＧ画分の生産方法である。
工程（１）：ＧＡＧ画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：ＧＡＧ画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のＧＡＧ画分を採取する工程。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、ＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。より好ましくは０．０６ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である。
【００３１】
本発明生産方法におけるＧＡＧ画分は、ＧＡＧを含有する画分である限りにおいて特に限定されないが、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれる画分であることが好ましい。本発明生産方法における工程（１）及び（２）その他の説明は、前記＜１＞に記載した本発明除去方法におけるものと同じである。
【００３２】
本発明生産方法によって生産されるＧＡＧ画分は、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するものである。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、ＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である。
【００３３】
エチジウムブロマイド法、原子吸光測定法及びローリー法についての詳細は、後述の実施例を参照されたい。
＜３＞本発明除去剤
本発明除去剤は、活性炭を有効成分とする、ＧＡＧ画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去剤である。
【００３４】
本発明除去剤を用いた、核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去の対象となるＧＡＧは、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、Ｈｅｐ、ＨＳ、及びＫＳから選ばれることが好ましい。また、本発明除去剤は、ＧＡＧ画分の溶液と接触させて用いられることが好ましい。この場合、本発明除去剤をＧＡＧ画分の溶液と接触させる方法や、ＧＡＧ画分の溶液と本発明除去剤との接触が行われる条件（ｐＨ、温度、ＧＡＧ画分の溶液の濃度、有機溶剤含有量、時間など）等については、前記＜１＞に記載したものと同様である。
【００３５】
本発明除去剤は、前記＜１＞に記載した本発明除去方法に従って使用することができる。また、前記＜２＞に記載した本発明生産方法に従って使用することもできる。
【００３６】
本発明除去剤において、ＧＡＧ画分を溶解させる溶媒、ＧＡＧ画分の溶液や、有効成分である活性炭等についての説明も、前記＜１＞に記載したものと同じである。本発明除去剤においては、活性炭を有効成分として含有する限りにおいて、他の成分を含有していてもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明する。
【００３８】
まず、本実施例において共通して用いた方法を説明する。
（１）エチジウムブロマイド法
試料を１％となるようにTris-EDTA緩衝液（pH7.2）で溶解し、必要に応じてＧＡＧ分解酵素でＧＡＧの粘性を低下させた。この試料、ＤＮＡ標準液（Tris-EDTA緩衝液（pH7.2）で１μｇ／ｍＬに調製したもの）及びブランク（Tris-EDTA緩衝液（pH7.2））各１ｍＬに、臭化エチジウム溶液（蒸留水で0.0002%としたもの）をそれぞれ１ｍＬ添加して攪拌した。その後、それぞれ蛍光分光光度計を用いて励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにより蛍光強度を測定した。
（２）原子吸光測定法
試料２５ｍｇを試験管に量り取り、２mol/Lの塩酸２ｍLで溶解した後、１０分間煮沸した。その後、蒸留水０．５ｍLを添加してよく攪拌した。この試料及び鉄標準液（０〜４ppm；検量線を作成用）について、原子吸光分光光度計（Z−８０００形偏光ゼーマン原子吸光分光光度計（HITACHI製））とホローカソードランプ（Fe）を用いて吸光度を測定した。
（３）ローリー法
Ｌｏｗｒｙ．Ｏ．Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３、ｐ．２６５―２７５（１９５１）記載の方法を参考に、一般的な方法に従って行った。
（実施例１）ＨＡを用いた実施例
鶏冠を、特公昭６１−２１２４１号公報に記載の方法で処理し、ＨＡを含有するアルコール沈殿画分を得た。
【００３９】
このアルコール沈殿画分を、精製水に溶解し、これにオートクレーブ処理した活性炭を添加して、１時間撹拌した。
【００４０】
その後、セラミックフィルターを用いて濾過した。その際の濾過助剤としては珪藻土を用いた。
【００４１】
その濾液を回収し、さらにフィルタープレスを用いて濾過した。その際の濾過助剤としては珪藻土を用いた。濾液を回収し、「活性炭処理後の画分」とした。
【００４２】
なお、以上の濾過助剤は全てオートクレーブ処理したものを用いた。
【００４３】
アルコール沈殿画分（活性炭処理前の画分）及び活性炭処理後の画分について、核酸含量、鉄含量及びタンパク質含量を測定した。核酸含量の結果を表１に（単位：μg/mgHA）、鉄含量の結果を表２に（単位：ｐｐｍ）、ＨＡ含量に対するタンパク質含量の比を表３にそれぞれ示した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
表１〜３から明らかな通り、活性炭処理するだけで、核酸含量については少なくとも１／１３以下に、鉄含量については１／４以下に、タンパク質含量は１／６５以下となることが示された。したがって、活性炭を用いることによって、ＨＡ画分中に存在するこれらの物質を極めて効率よく除去できることが示された。
【００４８】
さらに、これによって（ａ）エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量がＧＡＧ画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満であり、（ｂ）原子吸光測定法によって測定したＧＡＧ画分中の鉄含量が０．０７ｐｐｍ以下（０．０６ｐｐｍ以下）であり、かつ（ｃ）ローリー法によって測定したＧＡＧ画分中のタンパク質含量がＧＡＧ含量の０．４％以下である、という性質を有するＨＡが製造できることが示された。
（実施例２）ＣＳ（サメのヒレ由来）を用いた実施例
サメヒレからのＣＳの調製は、一般的な方法を用いて行った。すなわち、サメのヒレを粉砕し、これにタンパク質分解酵素（エスペラーゼ；ノボザイムズ社製）を作用させることにより、ＣＳを抽出した。この抽出物についてアルコール沈殿を行い、ＣＳを含むアルコール沈殿画分を得た。得られた画分について、実施例１と同様の方法により１回目の活性炭処理（１次処理）を行い、セラミックフィルターを用いて濾過することにより、１次処理液を得た。この処理液についてアルコール分画を２回連続して行うことにより、分画液を得た。さらにこの分画液について再度１回目と同様に活性炭処理（２次処理）と濾過を行うことにより、２次処理液を得た。
【００４９】
アルコール沈殿画分（活性炭処理前の画分）及び活性炭処理後の画分（１次処理液、２次処理液）について、タンパク質含量を測定した。ＣＳ含量に対するタンパク質含量の比を表４に示した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４から明らかな通り、１次活性炭処理を行うだけで、タンパク質含量が１／３以下（含有比０．１５％以下）になることが示された。さらに２次活性炭処理を行うことにより、タンパク質含量が当初の１／１７以下（含有比０．０３％以下）となることが示された。
（実施例３）ＣＳ（ウシの気管由来）を用いた実施例
実施例２と同様の方法により、牛気管由来のＣＳを得、活性炭処理、濾過、アルコール分画（１回）を行った。アルコール沈殿画分（活性炭処理前の画分）及び活性炭処理後の画分（１次処理液、２次処理液）について、タンパク質含量を測定した。ＣＳ含量に対するタンパク質含量の比を表５に示した。
【００５２】
【表５】
【００５３】
実施例２及び実施例３により、活性炭を用いることにより、ＨＡのみならずＣＳ中の不
純物をも極めて高度かつ効率的に除去できることが明らかになった。
以上の結果から、活性炭を用いることによりＧＡＧ画分中の核酸、鉄、タンパク質を極めて効率的に除去することができ、不純物含量が極めて低いＧＡＧ画分を極めて簡便、迅速かつ大量に製造できることが示された。また、本発明によって得られるＧＡＧ画分は、一般に医薬として利用しうる程度にまで、高度に精製されたものであることが明らかになった。したがって、活性炭を、ＧＡＧ画分中のこれら不純物を高度に取り除く除去剤として利用できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明除去方法は、医薬品、化粧品、食品、飲料等の原料となりうるＧＡＧ画分中の不純物（核酸、鉄、タンパク質）の除去に利用することができる。本発明生産方法は、このような不純物が除去されたＧＡＧ画分の生産に利用することができる。本発明除去剤は、このような本発明除去方法や生産方法に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、グリコサミノグリカン画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法。
工程（１）：グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：グリコサミノグリカン画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のグリコサミノグリカン画分を採取する工程。
【請求項２】
グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の除去方法。
【請求項３】
「グリコサミノグリカン画分の溶液」における有機溶剤含量が、２０％（v/v）未満であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の除去方法。
【請求項４】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の除去方法。
【請求項５】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、５分間以上保持されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の除去方法。
【請求項６】
下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するグリコサミノグリカン画分の生産方法。
工程（１）：グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：グリコサミノグリカン画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のグリコサミノグリカン画分を採取する工程。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、グリコサミノグリカン画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したグリコサミノグリカン画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したグリコサミノグリカン画分中のタンパク質含量がグリコサミノグリカン含量の０．４％以下である。
【請求項７】
グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】
「グリコサミノグリカン画分の溶液」における有機溶剤含量が、２０％（v/v）未満であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の生産方法。
【請求項９】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項１０】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、５分間以上保持されることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項１１】
活性炭を有効成分とする、グリコサミノグリカン画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去剤。
【請求項１２】
グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の除去剤。
【請求項１３】
グリコサミノグリカン画分の溶液と接触させて用いられることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の除去剤。
【請求項１４】
「グリコサミノグリカン画分の溶液」における有機溶剤含量が、２０％（v/v）未満であることを特徴とする、請求項１３に記載の除去剤。
【請求項１５】
ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で使用されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の除去剤。
【請求項１】
下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、グリコサミノグリカン画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去方法。
工程（１）：グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：グリコサミノグリカン画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のグリコサミノグリカン画分を採取する工程。
【請求項２】
グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の除去方法。
【請求項３】
「グリコサミノグリカン画分の溶液」における有機溶剤含量が、２０％（v/v）未満であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の除去方法。
【請求項４】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の除去方法。
【請求項５】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、５分間以上保持されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の除去方法。
【請求項６】
下記の工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、下記の性質（ａ）〜（ｃ）を有するグリコサミノグリカン画分の生産方法。
工程（１）：グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭とを接触させる工程。
工程（２）：グリコサミノグリカン画分の溶液に接触させた活性炭を分離し、当該分離後のグリコサミノグリカン画分を採取する工程。
性質（ａ）：エチジウムブロマイド法によって測定した核酸含量が、グリコサミノグリカン画分１ｍｇあたり０．０８μｇ未満である。
性質（ｂ）：原子吸光測定法によって測定したグリコサミノグリカン画分中の鉄含量が、０．０７ｐｐｍ以下である。
性質（ｃ）：ローリー法によって測定したグリコサミノグリカン画分中のタンパク質含量がグリコサミノグリカン含量の０．４％以下である。
【請求項７】
グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】
「グリコサミノグリカン画分の溶液」における有機溶剤含量が、２０％（v/v）未満であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の生産方法。
【請求項９】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で行われることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項１０】
グリコサミノグリカン画分の溶液と活性炭との接触が、５分間以上保持されることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項１１】
活性炭を有効成分とする、グリコサミノグリカン画分中の核酸、鉄及びタンパク質から選ばれる１又は２以上の物質の除去剤。
【請求項１２】
グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の除去剤。
【請求項１３】
グリコサミノグリカン画分の溶液と接触させて用いられることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の除去剤。
【請求項１４】
「グリコサミノグリカン画分の溶液」における有機溶剤含量が、２０％（v/v）未満であることを特徴とする、請求項１３に記載の除去剤。
【請求項１５】
ｐＨ５〜９かつ２０〜７０℃の条件下で使用されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の除去剤。
【公開番号】特開２００６−１０４４６１（Ｐ２００６−１０４４６１Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２６１６８９（Ｐ２００５−２６１６８９）
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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