グルコース消費量測定による細胞成長因子の活性評価方法
【課題】
従来、培養基材に含有された細胞成長因子の活性を測定するためには破壊的な方法しかなく、同じサンプルを用いて経時的に活性を測定することができなかった。本発明は、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで非破壊的にかつ、簡便に、しかも経時的に測定することが可能な新規な方法を提供するものである。
【解決手段】
本発明は細胞成長因子を含む組織再生用基材に細胞を播種し、一定期間培養後に、培養液中のグルコース消費量を測定することによって細胞成長因子の活性を測定することを特徴とする。
従来、培養基材に含有された細胞成長因子の活性を測定するためには破壊的な方法しかなく、同じサンプルを用いて経時的に活性を測定することができなかった。本発明は、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで非破壊的にかつ、簡便に、しかも経時的に測定することが可能な新規な方法を提供するものである。
【解決手段】
本発明は細胞成長因子を含む組織再生用基材に細胞を播種し、一定期間培養後に、培養液中のグルコース消費量を測定することによって細胞成長因子の活性を測定することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性を簡便に、かつ非破壊的に測定することができる新規な方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
受傷による皮膚欠損が広範囲にわたる場合、そのまま放置しておくと感染や生体内の水分の蒸発によって生命に関わる重篤な状態になることが多く、早期に皮膚欠損部を閉鎖する必要がある。皮膚組織の再生を促進させる方法としては、細胞成長因子、例えば塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を吸着させた人工真皮材料を用いる治療方法がある。このような治療方法としては、例えばゼラチンとコラーゲンからなる組織再生用基材を生体に移植して生体内で擬似真皮組織を再生させる方法がある（特許文献１）。
【０００３】
組織再生用基材に含有させた細胞成長因子の活性を測定する方法としては、動物の背部に作製した皮膚欠損層に該組織再生用基材を移植して所定期間後に組織切片を作製、周囲組織からの細胞の侵入や血管新生の度合いなどを評価する方法が一般的である。
【０００４】
しかしながら、この方法では時間がかかる上に実験動物の個体差も大きく、定量的な評価が困難であるという問題点があった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−６８８８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述のような問題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、非破壊的にかつ、簡便に測定する新規な方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は細胞成長因子を含む組織再生用基材に細胞を播種し、所定期間培養後に、培養液中のグルコース消費量を測定することによって細胞成長因子の活性を測定することを特徴とする。
【０００８】
従来、細胞成長因子の評価方法としては細胞の増殖を指標としていた。例えば代表的なＭＴＴアッセイ法は、細胞または細胞を含む組織再生用基材をＭＴＴ含有培養液中で一定時間（通常は３時間程度）培養する。そして、細胞質内に取り込まれたＭＴＴは、ミトコンドリア内の脱水素酵素の働きによって水不溶性のＭＴＴホルマザンに還元され、細胞内に蓄積される。すなわち、生きている細胞内でのみ青紫色のＭＴＴホルマザン色素が生成することから、ＭＴＴホルマザン色素量を定量することによって、「細胞の成長」を判定するものである。
【０００９】
この方法は操作が比較的簡便であり、かつ費用も安価であることから最も頻繁に利用されている方法の一つであるが、測定の際に細胞または細胞を含む組織再生用基材それ自体を使用する「破壊的」方法であるため、同一サンプルについて経時的変化を測定することは不可能であった。
【００１０】
一方、細胞はその増殖や代謝機能維持のために栄養素を必要とする。本発明は、これら栄養素の中でグルコースに着目し、細胞を播種した細胞成長因子含有組織再生用基材を培養液中で培養し、培養液中のグルコース消費量を測定することによって、細胞成長因子の活性を「非破壊的」方法で評価することを目的としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は上述したように、細胞成長因子を含む組織再生用基材に細胞を播種し、一定期間培養後に培養液中の消費されたグルコース量を測定することによって、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで非破壊的にかつ、簡便に測定することが可能となるものである。すなわち、本発明に係る方法を用いることによってはじめて、同一サンプルについて組織再生用基材に含有される細胞成長因子の活性の経時的変化を評価することが可能になったものである。さらに、グルコースセンサーを用いることによって、培養液中のグルコース消費量を経時的に、しかも自動的に測定することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１３】
（１）ゼラチン／コラーゲンスポンジの作製
ブタ腱由来Ｉ型コラーゲンとブタ皮膚由来ゼラチンとを混合して水溶液とした。コラーゲンとゼラチンの質量比は、１００：０（コラーゲンスポンジ）および９０：１０（１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジ）とした。水溶液を型枠に流し込み、−４０℃で凍結した。これを凍結乾燥した後、真空減圧下、１１０℃で２４時間熱脱水架橋を加えた後、０．２％グルタルアルデヒド溶液に２４時間浸漬することにより化学架橋を導入した。これを再び凍結乾燥してゼラチン/コラーゲンスポンジを得た。
【００１４】
（２）ｂＦＧＦとの複合化
４８ウェル培養プレートに、前記（１）で作製したゼラチン／コラーゲンスポンジ（直径１０ｍｍに打ち抜いたもの）を敷き詰め、ｂＦＧＦが５．５μg含浸するようｂＦＧＦ水溶液５５μLをスポンジに滴下し、４℃下で一晩放置することで、ゼラチン／コラーゲンスポンジにｂＦＧＦを複合化させた。
【００１５】
（３）ヒト線維芽細胞の播種および培養
前記（２）で作製したｂＦＧＦを含浸させたゼラチン／コラーゲンスポンジにクロネティクス社から購入したヒト線維芽細胞をDME培地（血清不含）に懸濁し、このスポンジ上に３．５×１０５ｃｅｌｌｓを播種し、細胞が接着するまで３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２時間培養した。その後、ＤＭＥ培地（血清不含、３．０ｍＬ）中に、このヒト線維芽細胞を播種したゼラチン／コラーゲンスポンジを浸漬し、さらに３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００１６】
（４）ＭＴＴ法による細胞数の測定
前記（３）で作製したヒト線維芽細胞を播種したゼラチン／コラーゲンスポンジ（培養０日目および３日目）を、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＭＴＴ溶液（１．０ｍＬ）中で３時間培養した後、生細胞中に蓄積された青紫色のＭＴＴホルマザンをイソプロパノール（４．０ｍＬ）にて抽出し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１７】
（５）グルコース消費量の測定
前記（３）の方法でヒト線維芽細胞を播種したゼラチン/コラーゲンスポンジを３日間培養した際の培養液を回収し、市販のグルコース濃度測定用のキット（グルコースＣII−テストワコー、和光純薬製）を用いて、グルコース消費量を測定した。
【００１８】
（６）結果
上記の方法で得られた試験結果を図１および図２に示す。図１にはゼラチン/コラーゲンスポンジ中で繊維芽細胞を３日間培養したときの培養液中グルコース消費量を示す。図２にはゼラチン/コラーゲンスポンジ中で繊維芽細胞を培養したときの、繊維芽細胞数（培養０日目および３日目）を示した。
【００１９】
図１に示すように、ｂＦＧＦを含浸させることによって、コラーゲンスポンジおよび１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジともにグルコース消費量が増加していた。すなわち、ｂＦＧＦの細胞成長活性によって播種された繊維芽細胞の代謝が増加していることがわかる。一方、図２に示すようにコラーゲンスポンジおよび１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジ中の繊維芽細胞の数は、コラーゲンスポンジおよび１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジの差異、ならびにｂＦＧＦの含浸の有無に関わらず変化が認められなかった。
【００２０】
以上のことから、本発明に係る測定方法を利用することにより、細胞の数に影響されることなく組織再生基材に含有された細胞成長因子の活性を評価することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
組織再生基材に含有された細胞成長因子の非破壊的評価方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】培養液中のグルコース消費量（培養３日間）
【図２】組織再生基材に含有される繊維芽細胞数（培養０日目および３日目）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性を簡便に、かつ非破壊的に測定することができる新規な方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
受傷による皮膚欠損が広範囲にわたる場合、そのまま放置しておくと感染や生体内の水分の蒸発によって生命に関わる重篤な状態になることが多く、早期に皮膚欠損部を閉鎖する必要がある。皮膚組織の再生を促進させる方法としては、細胞成長因子、例えば塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を吸着させた人工真皮材料を用いる治療方法がある。このような治療方法としては、例えばゼラチンとコラーゲンからなる組織再生用基材を生体に移植して生体内で擬似真皮組織を再生させる方法がある（特許文献１）。
【０００３】
組織再生用基材に含有させた細胞成長因子の活性を測定する方法としては、動物の背部に作製した皮膚欠損層に該組織再生用基材を移植して所定期間後に組織切片を作製、周囲組織からの細胞の侵入や血管新生の度合いなどを評価する方法が一般的である。
【０００４】
しかしながら、この方法では時間がかかる上に実験動物の個体差も大きく、定量的な評価が困難であるという問題点があった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−６８８８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述のような問題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、非破壊的にかつ、簡便に測定する新規な方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は細胞成長因子を含む組織再生用基材に細胞を播種し、所定期間培養後に、培養液中のグルコース消費量を測定することによって細胞成長因子の活性を測定することを特徴とする。
【０００８】
従来、細胞成長因子の評価方法としては細胞の増殖を指標としていた。例えば代表的なＭＴＴアッセイ法は、細胞または細胞を含む組織再生用基材をＭＴＴ含有培養液中で一定時間（通常は３時間程度）培養する。そして、細胞質内に取り込まれたＭＴＴは、ミトコンドリア内の脱水素酵素の働きによって水不溶性のＭＴＴホルマザンに還元され、細胞内に蓄積される。すなわち、生きている細胞内でのみ青紫色のＭＴＴホルマザン色素が生成することから、ＭＴＴホルマザン色素量を定量することによって、「細胞の成長」を判定するものである。
【０００９】
この方法は操作が比較的簡便であり、かつ費用も安価であることから最も頻繁に利用されている方法の一つであるが、測定の際に細胞または細胞を含む組織再生用基材それ自体を使用する「破壊的」方法であるため、同一サンプルについて経時的変化を測定することは不可能であった。
【００１０】
一方、細胞はその増殖や代謝機能維持のために栄養素を必要とする。本発明は、これら栄養素の中でグルコースに着目し、細胞を播種した細胞成長因子含有組織再生用基材を培養液中で培養し、培養液中のグルコース消費量を測定することによって、細胞成長因子の活性を「非破壊的」方法で評価することを目的としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は上述したように、細胞成長因子を含む組織再生用基材に細胞を播種し、一定期間培養後に培養液中の消費されたグルコース量を測定することによって、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで非破壊的にかつ、簡便に測定することが可能となるものである。すなわち、本発明に係る方法を用いることによってはじめて、同一サンプルについて組織再生用基材に含有される細胞成長因子の活性の経時的変化を評価することが可能になったものである。さらに、グルコースセンサーを用いることによって、培養液中のグルコース消費量を経時的に、しかも自動的に測定することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１３】
（１）ゼラチン／コラーゲンスポンジの作製
ブタ腱由来Ｉ型コラーゲンとブタ皮膚由来ゼラチンとを混合して水溶液とした。コラーゲンとゼラチンの質量比は、１００：０（コラーゲンスポンジ）および９０：１０（１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジ）とした。水溶液を型枠に流し込み、−４０℃で凍結した。これを凍結乾燥した後、真空減圧下、１１０℃で２４時間熱脱水架橋を加えた後、０．２％グルタルアルデヒド溶液に２４時間浸漬することにより化学架橋を導入した。これを再び凍結乾燥してゼラチン/コラーゲンスポンジを得た。
【００１４】
（２）ｂＦＧＦとの複合化
４８ウェル培養プレートに、前記（１）で作製したゼラチン／コラーゲンスポンジ（直径１０ｍｍに打ち抜いたもの）を敷き詰め、ｂＦＧＦが５．５μg含浸するようｂＦＧＦ水溶液５５μLをスポンジに滴下し、４℃下で一晩放置することで、ゼラチン／コラーゲンスポンジにｂＦＧＦを複合化させた。
【００１５】
（３）ヒト線維芽細胞の播種および培養
前記（２）で作製したｂＦＧＦを含浸させたゼラチン／コラーゲンスポンジにクロネティクス社から購入したヒト線維芽細胞をDME培地（血清不含）に懸濁し、このスポンジ上に３．５×１０５ｃｅｌｌｓを播種し、細胞が接着するまで３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２時間培養した。その後、ＤＭＥ培地（血清不含、３．０ｍＬ）中に、このヒト線維芽細胞を播種したゼラチン／コラーゲンスポンジを浸漬し、さらに３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
【００１６】
（４）ＭＴＴ法による細胞数の測定
前記（３）で作製したヒト線維芽細胞を播種したゼラチン／コラーゲンスポンジ（培養０日目および３日目）を、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＭＴＴ溶液（１．０ｍＬ）中で３時間培養した後、生細胞中に蓄積された青紫色のＭＴＴホルマザンをイソプロパノール（４．０ｍＬ）にて抽出し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１７】
（５）グルコース消費量の測定
前記（３）の方法でヒト線維芽細胞を播種したゼラチン/コラーゲンスポンジを３日間培養した際の培養液を回収し、市販のグルコース濃度測定用のキット（グルコースＣII−テストワコー、和光純薬製）を用いて、グルコース消費量を測定した。
【００１８】
（６）結果
上記の方法で得られた試験結果を図１および図２に示す。図１にはゼラチン/コラーゲンスポンジ中で繊維芽細胞を３日間培養したときの培養液中グルコース消費量を示す。図２にはゼラチン/コラーゲンスポンジ中で繊維芽細胞を培養したときの、繊維芽細胞数（培養０日目および３日目）を示した。
【００１９】
図１に示すように、ｂＦＧＦを含浸させることによって、コラーゲンスポンジおよび１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジともにグルコース消費量が増加していた。すなわち、ｂＦＧＦの細胞成長活性によって播種された繊維芽細胞の代謝が増加していることがわかる。一方、図２に示すようにコラーゲンスポンジおよび１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジ中の繊維芽細胞の数は、コラーゲンスポンジおよび１０％ゼラチン/コラーゲンスポンジの差異、ならびにｂＦＧＦの含浸の有無に関わらず変化が認められなかった。
【００２０】
以上のことから、本発明に係る測定方法を利用することにより、細胞の数に影響されることなく組織再生基材に含有された細胞成長因子の活性を評価することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
組織再生基材に含有された細胞成長因子の非破壊的評価方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】培養液中のグルコース消費量（培養３日間）
【図２】組織再生基材に含有される繊維芽細胞数（培養０日目および３日目）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞成長因子を含有する組織再生用基材上に細胞を播種して培養液中で培養し、前記培養液中のグルコース消費量を測定することによって、非破壊的に前記組織再生用基材に含有されている細胞成長因子の活性を評価する方法。
【請求項２】
培養液中のグルコース消費量を経時的に自動計測することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１】
細胞成長因子を含有する組織再生用基材上に細胞を播種して培養液中で培養し、前記培養液中のグルコース消費量を測定することによって、非破壊的に前記組織再生用基材に含有されている細胞成長因子の活性を評価する方法。
【請求項２】
培養液中のグルコース消費量を経時的に自動計測することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１３０９１３（Ｐ２０１０−１３０９１３Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０７４３９（Ｐ２００８−３０７４３９）
【出願日】平成２０年１２月２日（２００８．１２．２）
【出願人】（０００００１３３９）グンゼ株式会社 (919)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２日（２００８．１２．２）
【出願人】（０００００１３３９）グンゼ株式会社 (919)
【Ｆターム（参考）】
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