コア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、コア‐シェル構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬
【課題】多孔性構造のコアのシリカ粒子内部の連通孔に蛍光色素化合物、吸光色素化合物等の機能性化合物を閉じ込めたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の提供。
【解決手段】次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とするコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。（ａ）オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを共有結合により形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程。
【解決手段】次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とするコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。（ａ）オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを共有結合により形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメートルサイズのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法に関する。より詳しくは、タンパク質等の特定物質の検出用ないしは定量用の標識試薬として用いる、ナノメートルサイズのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニア存在下、水を加えて加水分解するとシリカ粒子が形成される（例えば、非特許文献１参照。）。ＴＥＯＳ等のテトラアルコキシシランは中心のケイ素原子（Ｓｉ）と結合している全てのアルコキシ基が加水分解されるため、縮重合後、最終的には組成式ＳｉＯ２で表されるシリカへと変化し、緻密な構造のシリカガラスの粒子となる。
シリカ自身には光吸収特性や磁性がないためその粒子を検出することができず、標識試薬として用いることはできない。しかし、シリカには高い化学的安定性や表面修飾についての高い自由度、生体に対する無害性といった標識試薬にとって好ましい特性をいくつも兼ね備えている。そのため、従来蛍光もしくは吸光色素分子をそのまま標識試薬として用いていたのに対して、これら色素分子をシリカ粒子内部に閉じ込めることができれば前述のような好ましい特性を持った標識試薬を得ることができる。
【０００３】
シリカ粒子の内部に有機色素分子を取り込む手法としては、アミノ基と共有結合しやすいＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを有する色素分子をシランカップリング剤の一種であるγ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）分子のアミノ基と結合させ、さらにＡＰＳのエトキシ基を加水分解させてシリカと重合させることで結果的にシリカと前記色素分子をアミド結合によって結合させるという方法がある（例えば、特許文献１参照。）。しかし、この方法を適用できるＮＨＳエステルを有する色素分子が非常に高価である上、その種類も限られてしまうという問題があった。
また、標識試薬として用いるためには試薬に含まれる粒子の粒径が揃っているほうが好ましい。検出する標的物質の結合選択性が粒径に依存する場合、粒子の粒径が揃っていないと、測定される蛍光強度もしくは吸光強度と標的物質の量が比例関係から逸脱してしまい、標的物質の定量検出は不可能となってしまうという問題があった。
【特許文献１】ＥＰ１０３６７６３Ｂ１公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６，６２−６９（１９６８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、多孔性構造のコアのシリカ粒子内部の連通孔に蛍光色素化合物、吸光色素化合物等の機能性化合物を閉じ込めたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、粒径が揃った、ｎｍオーダーのシリカナノ粒子の製造方法、及びそれにより製造されるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を提供することにある。また、本発明の目的は、測定結果の再現性に優れる、極微量標的試料の高感度分析が可能な標識試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題は下記の手段により達成された。
（１） 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とするコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ａ）下記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物を下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程、
一般式１
Ｒ１ｎＳｉ（ＯＲ２）４−ｎ
（式中、Ｒ１はアンモニア水に対して非加水分解性の置換基を表す。ＯＲ２はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは１〜３の整数を示し、Ｒ１が複数ある場合、各Ｒ１はたがいに同一であっても異なっていてもよく、ＯＲ２が複数ある場合、各ＯＲ２はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
一般式２
Ｓｉ（ＯＲ３）４
（式中、ＯＲ３はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。各ＯＲ３はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
【０００６】
（２） 前記オルガノアルコキシシラン化合物がγ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン又はγ-アミノプロピルトリエトキシシランであり、前記テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランである（１）に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（３） 前記工程（ａ）において、前記オルガノアルコキシシラン化合物と、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率が１：１００〜１：５の範囲で反応させることを特徴とする（１）又は（２）に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（４） 前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（５） 前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製する工程（ａ）における前記粒子形成を２０〜６０℃の温度条件下で行い、前記工程（ｂ）における前記シェルの形成を０〜２０℃の温度条件下で８時間以上かけて行うことを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
【０００７】
（６） 前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、
（７） オルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を緻密シリカのシェルが包囲してなるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、
前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径を有し、前記緻密シリカのシェルが、前記機能性化合物を透過させない程度に緻密であることにより、前記連通孔に前記機能性化合物を閉じ込めていることを特徴とするシリカナノ粒子、
（８） 前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である（７）に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、
（９） 平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする（７）〜（８）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、
【０００８】
（１０） 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする（７）〜（８）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、及び
（１１） 前記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬
を提供するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において、「シリカナノ粒子」とは、平均粒径が１，０００ｎｍ以下のコロイドシリカ粒子をいう。前記シリカナノ粒子を標識試薬として用いる場合、検出物質や検出法によって使用するのに好適な粒子径は様々であるが、２０〜５００ｎｍの範囲内である場合が多く、この範囲にあるシリカナノ粒子であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法は、ＮＨＳエステル等を有する種類の限られた色素化合物を用いることがないゆえに、前記限られた色素化合物を化学結合して粒子に含有させる煩雑な工程を要しない。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法は、色素化合物等の機能性化合物を含有する液中において、連通孔を有するシリカ粒子のコアを調製後、その粒子表面上に前記機能性化合物を透過させない程度に緻密なシリカのシェルを形成することにより前記連通孔内に色素化合物等の機能性化合物を高濃度に閉じ込めることができる。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法は、得られるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の粒度分布の幅が狭く粒径を揃え、かつ平均粒径を制御できる。
【００１０】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記製造方法により得られるので、蛍光色素化合物、吸光色素化合物等の機能性化合物を高濃度に含有し、高感度標識に用いることが可能である。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記製造方法により得られるので、平均粒径がナノメートルサイズであり、かつ粒度分布の幅が狭く粒径が揃っている。
本発明の標識試薬は、平均粒径が揃った前記シリカナノ粒子を用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高い極微量標的試料の高感度分析が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という。）について説明する。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなる。
（ａ）前記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物を前記一般式２で表されるテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程。
【００１２】
本発明の製造方法で用いられる前記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物は、工程（ａ）において４−ｎ個のアルコキシ基ＯＲ２がアンモニア水により加水分解し脱離し、前記オルガノアルコキシシラン化合物は生じた脱離部分で重縮合し４−ｎ個のシロキサン結合を形成することができる。Ｒ１はアンモニア水に対して非加水分解性の置換基であるから、工程（ａ）において加水分解されてシロキサン結合を形成することはない。これにより、縮重合を繰り返して調製される前記シリカ粒子の内部に置換基Ｒ１が取り込まれて残存し、前記機能性化合物等の有機分子を１つ以上内包できる大きさ（例えば、孔径１〜３ｎｍ）の前記連通孔を形成することができる。
【００１３】
【化１】
【００１４】
このようにコアとなる前記シリカ粒子内部において、連通孔を形成し、多孔性（ポーラス）構造となる理由は定かではないが、前記置換基Ｒ１がある程度の嵩高さを有しており、加えて疎水性基であるため、親水性溶媒中で凝集しやすいことに起因しているものと推定される。
一方、前記一般式２で表されるテトラアルコキシシランにおいて、４個のアルコキシ基ＯＲ３は全て、アンモニア水により加水分解し、オルトケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）４）が生じる。生じた前記オルトケイ酸は４個のシロキサン結合を形成することができる。
ここで、シリカとは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）に基づくケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体をいい、前述のようにオルガノシロキサン成分を含有するケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を含むものとする。
【００１５】
本発明の製造方法に用いられる前記テトラアルコキシシランとしては、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン等が挙げられ、ＴＥＯＳが好ましい。
前記一般式１中、アンモニア水に対して非加水分解性の置換基Ｒ１は、置換ないしは非置換の、炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
本発明の製造方法に用いられる前記オルガノアルコキシシラン化合物としては、例えば、メルカプトアルキルトリアルコキシシラン（例えば、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン）、アミノアルキルトリアルコキシシラン（例えば、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ））、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン等が挙げられ、ＭＰＳが好ましい。
【００１６】
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記オルガノアルコキシシラン化合物と、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率は、１：１００〜１：５の範囲で反応させることが好ましく、１：５０〜１：１０の範囲で反応させることがより好ましい。
前記オルガノアルコキシシラン化合物の混合モル比率が低すぎると、前記多孔性シリカ粒子の空隙率が低くなり、前記機能性化合物の取り込み効率が低くなる。一方、前記オルガノアルコキシシラン化合物はシリカの生成反応を阻害する作用を有し、その混合モル比率が高すぎると、目的のシリカ粒子の収率が低下するばかりでなく、粒度分布が広がってしまう。
【００１７】
シリカ粒子をポーラス化するための前記オルガノアルコキシシラン化合物としては、粒子内部に閉じ込めたい前記機能性化合物の性質に合わせて選択することが好ましい。前記シリカ粒子の表面には一定量のヒドロキシル基（ＯＨ基）もしくはシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ基）が存在しており、これが負に帯電しやすいため正に帯電しやすい前記機能性化合物は前記シリカ粒子表面に吸着される。そのため、正に帯電しやすい前記機能性化合物もしくは中性の前記機能性化合物を粒子内部に閉じ込めたい場合には、電気的に中性なメルカプトプロピル基を持つＭＰＳを用いることが好ましい。これに対してＡＰＳのアミノプロピル基は正に帯電しやすく、逆に負に帯電しやすい前記機能性化合物を粒子内部に閉じ込める場合にはＡＰＳを用いることが好ましい。ただし、ＡＰＳの使用量が多いとシリカ表面に存在するヒドロキシル基との間に引力が働いて調製されるシリカ粒子が凝集化傾向を持ってしまう。そのため、ＡＰＳを用いる場合、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率は、１：１００〜１：５０の範囲で反応させることが好ましい。
【００１８】
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒は、アンモニア水そのものであってもよいが（例えば、３〜２８質量％アンモニア水）、前記機能性化合物を溶解させる観点から、アンモニアを含有させてなる水と親水性溶媒との混合溶媒であることが好ましい。水と混合させる前記親水性溶媒としては、エタノール、メタノール等が挙げられるが、エタノールが好ましい。前記水と前記親水性溶媒との体積比が１：２０〜１：３の混合溶媒であることが好ましく、１：６〜１：４の混合溶媒であることがより好ましい。
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒において、アンモニアの含有量としては特に制限はないが、前記オルガノアルコキシシラン化合物を混合させるため前記コアとなる前記シリカ粒子の成長速度が低下することと、目的のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の平均粒径を制御する観点から、１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。
【００１９】
前記アンモニアの含有量（アンモニア濃度）が高いほどシリカ粒子の核形成頻度、シリカ粒子の成長速度共に高くなるが、そのアンモニア濃度依存性はシリカ粒子の成長速度の方が高い。したがって、このアンモニア濃度依存性の違い（差）により加水分解反応の触媒として作用するアンモニアの濃度によって目的のコア‐シェル構造の前記シリカナノ粒子及び前記コアとなる前記シリカ粒子の平均粒径を調整することができる。
例えば、前記アンモニア水含有溶媒におけるアンモニアの含有量を４．０質量％とすると、平均粒径１５０ｎｍの目的のコア‐シェル構造の前記シリカナノ粒子を調製することができる。
【００２０】
前記工程（ａ）における前記コアとなる前記シリカ粒子の形成の温度条件としては特に制限はないが、調製される前記コアとなる前記シリカ粒子をより多孔質とする観点から、後述する工程（ｂ）におけるシリカシェルの形成の温度条件に比較して高い温度条件、すなわち、２０〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、４〜２４時間行うことが好ましい。
このように比較的に高い温度条件とすることにより得られる前記シリカ粒子がより多孔質になる理由は定かではないが、前記アルコキシ基（ＯＲ２、ＯＲ３）の加水分解反応の方が、ヒドロキシル基の脱水重縮合反応よりも温度依存性が高く、比較的に高い温度条件では熱力学的に異物（例えば、前記オルガノアルコキシシラン化合物）の混入が行われ易くなる。よって、ＡＰＳ、ＭＰＳ等の前記オルガノアルコキシシラン化合物が前記テトラアルコキシシランの反応によって形成されるシリカに混入しやすいためと推定される。
【００２１】
前記機能性化合物は、前記アンモニア水含有溶媒に可溶性であることが好ましく、水溶性もしくはエタノール可溶性であることがより好ましい。
前記機能性化合物としては、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物が好ましい。
前記蛍光色素化合物、前記吸光色素化合物の具体例として下記式でそれぞれ表されるローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、Ｘ‐ローダミン等が挙げられる。
【００２２】
【化２】
【００２３】
前記蛍光色素化合物、前記吸光色素化合物は、商業的に市販のものを入手することも可能である。
本発明の製造方法において、前記アンモニア水含有溶媒へ前記機能性化合物の少なくとも１種をあらかじめ溶解ないしは含有させておく量は、特に制限はないが、前記アンモニア水含有溶媒中、０．０５〜０．５質量％が好ましく、０．１〜０．２質量がより好ましい。本発明の製造方法によれば、この溶解ないしは含有させておく前記機能性化合物の量により、得られるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子中の前記機能性化合物の含有量を制御できる。
【００２４】
前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製する際に、前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておくことで、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を含有させることができる。
しかし、前記連通孔は外界に開孔しているものが多く、工程（ａ）により得られた前記連通孔を有する前記シリカ粒子を洗浄・単離する際に前記機能性化合物の多くは流出してしまう。
【００２５】
そこで、本発明の製造方法においては、前記工程（ｂ）の緻密シリカシェル形成工程において、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記テトラアルコキシシランのみから形成される緻密シリカのシェルを前記シリカ粒子の表面上に包囲して形成させることにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に含有された前記機能性化合物の閉じ込めを完全なものとすることができる。
【００２６】
ここで、「シリカが緻密であること」とは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）の三次元ネットワークが前記機能性化合物を透過させない程度に隙間なく形成されることをいう。
【００２７】
【化３】
【００２８】
前記ローダミンＢはおおよそ１ｎｍの分子サイズを有することが知られ、本明細書の実施例の項において後述するように、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記緻密シリカのシェルにより前記ローダミンＢ等の前記機能性化合物を前記連通孔に閉じ込めることができる。
【００２９】
前記工程（ｂ）において、薄くて緻密な前記緻密シリカシェルを、前記連通孔を有する前記シリカ粒子の表面上に包囲して形成させる観点から、前記アンモニア水含有溶媒に追加的に含有させる前記テトラアルコキシシランの使用量としては、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して、５〜１００質量部が好ましく、２０〜５０質量部がより好ましい。
前記工程（ｂ）における前記緻密シリカシェルの形成反応の温度条件としては特に制限はないが、前記コアとなる前記シリカ粒子を調製する前述した工程（ａ）とは逆に緻密な構造のシリカシェルを形成する観点から、前記工程（ａ）における温度条件に比較して低い温度条件、並びに反応時間については比較的に長時間かけて行うことが好ましい。具体的には、０〜２０℃の温度条件下で８時間以上かけて行うことが好ましく、８〜４８時間かけて行うことがより好ましい。
【００３０】
シリカシェル形成工程である前記工程（ｂ）は、前記工程（ａ）の前記コアとなる前記シリカ粒子の調製に引き続いて連続して行うことが好ましい。具体的には、前記工程（ａ）において調製された前記コアとなる前記シリカ粒子を洗浄又は精製を行うことなく、前記工程（ａ）における前記アンモニア水含有溶媒中で工程（ｂ）を行うことが好ましい。
前記工程（ａ）及び（ｂ）の間に、調製された前記コアとなる前記シリカ粒子の洗浄又は精製を行うと、アンモニア水含有溶媒中での粒子同士の凝集傾向が高まってしまい、前記工程（ｂ）のシェル形成反応により前記シリカ粒子同士の不可逆的な融合が生じてしまう。
【００３１】
本発明の製造方法によれば、球状、もしくは、球状に近いシリカナノ粒子が製造できる。球状に近いシリカナノ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が１．２以下の形状である。
【００３２】
次に、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子について説明する。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述した本発明の製造方法により製造することができる。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を緻密シリカのシェルがシロキサン結合により包囲してなるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、
前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径を有し、前記緻密シリカのシェルが、前記機能性化合物を透過させない程度に緻密であることにより、前記連通孔に前記機能性化合物を閉じ込めていることを特徴とする。
【００３３】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子において、前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径とは、１ｎｍ以上の連通孔の直径をいい、２〜１０ｎｍの範囲にあることが好ましい。
前記ローダミンＢはおおよそ１ｎｍの分子サイズを有することが知られている（例えば、ベンゼン環のＣ−Ｃ間距離は、約１．４Åであり（例えば、理化学辞典第５版第３０５頁参照。）、そのデータに基づいて幾何学的に計算が可能である。）。本明細書の実施例の項において後述するように、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記蛍光色素化合物、前記吸光色素化合物等の前記機能性化合物を前記連通孔に内包し、閉じ込めることができる。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子において、前記緻密シリカのシェルの厚みは特に制限はないが、１０ｎｍ以下が好ましく、５ｎｍ以下がより好ましい。
【００３４】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子において、前記緻密シリカのシェルの厚みは、厚いほど色素の閉じ込める効率が高くなるが、逆に厚いほどシリカ粒子の質量が増大してシリカ粒子のコロイド質量濃度あたりの蛍光強度が低下していく。例えば、平均粒径５０ｎｍのコアとなるシリカ粒子に厚み５ｎｍのシェルを形成するのと厚み１０ｎｍのシェルを形成するのとを比較すると、１粒子あたりの蛍光強度は１０ｎｍのシェルを有する粒子のほうが高くなるが、１粒子あたりの重量は１０ｎｍのシェルを有する粒子のほうが約３０％重く、したがって１粒子あたりの蛍光強度に３０％以上の差がない場合はコロイド質量濃度あたりの蛍光強度は５ｎｍのシェルを有するシリカ粒子からなるコロイド分散液の方が高くなる。
なお、形成されるシェルの厚みは、前記工程（ｂ）においてシェルを形成するために追加的に使用するテトラアルコキシシランの量によって制御できる。具体的には、例えば１ｍｌのテトラアルコキシシランによって粒径１００ｎｍのコアを製造している場合、前記工程（ａ）において含有させた量の２５％に相当する０．２５ｍｌのテトラアルコキシシランを追加的に使用してシェルを形成させると、シェルの体積比率は２０％、すなわち粒径換算でコア径の８％にあたる８ｎｍの厚みとなる。ただし、これは平均値であり、粒子ごと、あるいは単一粒子の表面部位によって厚みにある程度のばらつきが生じるものと考えられる。
【００３５】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御することにより粒径が揃ったｎｍサイズの所望の平均粒径とすることができる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から直接各粒子（少なくとも１００個）の直径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
本発明により得られたシリカナノ粒子の粒度分布の変動係数（以下ＣＶということもある。）は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。ここで、前記変動係数は、粒度の分布の標準偏差を平均粒径で割った値をいう。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御することにより２０〜１００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１５％以下とすることができる。
また、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、１００〜５００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１０％以下とすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とは変動係数１５％以下の粒子群をいう。
【００３６】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法において、前記アンモニア水含有溶媒へ前記機能性化合物の少なくとも１種をあらかじめ溶解ないしは含有させておく量を制御することにより、少なくとも1種の前記機能性化合物を高濃度に取り込み、閉じ込んでなる。例えば、平均粒子径１５０ｎｍのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子１個当たり、１万〜２万分子の前記機能性化合物を含有させることができる。
【００３７】
次に「シリカナノ粒子表面修飾」について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能である。
【００３８】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、所望の標的生体分子を分子認識する物質を表面に結合もしくは吸着させることが好ましい。
前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子が、前記機能性化合物として蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物を前記連通孔に内包する場合、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中の標的生体分子（生理活性物質を含む。）を蛍光ないしは吸光色素標識付けすることができる。
前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子を表面修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、リガンド、受容体、化学物質等が挙げられる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
【００３９】
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
すなわち、前記シリカナノ粒子を表面修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
【００４０】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の表面への、前記生体分子による吸着等の表面修飾が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより行われることが好ましい。
例えば、縮合剤等の非存在下、前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカナノ粒子の表面と吸着することができる。
前記縮合剤ないしは架橋剤を用いる場合の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
表面修飾に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については表面修飾が進行する限り特に制限はない。
前記表面修飾した後、前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子と前記シリカナノ粒子に結合ないし吸着していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記生体分子により前記シリカナノ粒子を表面修飾した後は、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の表面修飾が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
【００４１】
次に、本発明の標識試薬について説明する。
本発明の標識試薬は、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いてなる。前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いて、蛍光ないし吸光色素標識を付与することが好ましい。さらに前述のシリカナノ粒子の表面修飾により抗体やホルモンなどの標的生体分子を分子認識する物質でシリカ粒子表面を修飾し、光学特性を検出する装置又は目視によって前記標的生体分子が評価されるべき試料中に存在するか否か等の評価を可能にする標識試薬として利用することができる。
本発明の標識試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記標的生体分子を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記標的生体分子との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記シリカナノ粒子を用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
４．０質量％のアンモニア水２０体積％とエタノール８０体積％のアンモニア水含有溶媒１００ｍｌに、ＭＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比１：９の混合液５００μｌとローダミンＢ色素（２０ｍｍｏｌ／ｌＤＭＦ溶液）１０μｍｏｌを投入し、攪拌しながら室温（２５℃）で４時間反応を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、緻密シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、洗浄・分取した。
具体的な洗浄操作としては、上記得られた反応混合液の一部を取り出し、遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、余分なＴＥＯＳ等を除去した。
得られた粒子の蛍光を測定した。測定は蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、前記シリカ粒子由来の蛍光強度、すなわち、５５５ｎｍの励起光における５８０ｎｍの蛍光強度を測定した。
測定値は、得られたシリカ粒子の質量で規格化し、単位をａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａｕ：任意単位）として表した。以下同様である。
得られた蛍光強度は９．４ａｕであったが、下記シェル形成後のシリカ粒子の蛍光強度４６ａｕと比較すると弱く、上記一連の洗浄操作により連通孔に内包されていたローダミンＢがほとんど流出してしまったといえる。
【００４３】
２．工程（ｂ）
上記得られたコアとなるシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳを１００μｌ添加し、さらに室温で１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、上記の洗浄操作と同様な操作により遠心分離を行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物をエタノールで２回、蒸留水で４回洗浄した。その結果、コア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドが得られた。得られたシリカ粒子を実施例１のシリカ粒子とする。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として平均粒径を算出したところ、緻密シリカシェル形成前（工程（ｂ）前）に測定した平均粒径に対し、前記緻密シリカシェル分だけ平均粒径が増加し（約１０ｎｍ）、平均粒径１５０ｎｍのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子が得られた。
また、上記一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢ色素が存在し、上記と同様に蛍光強度測定を行った結果、蛍光強度は４６ａｕと強く、平均粒径１５０ｎｍのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子１個の内部にローダミンＢ１万〜２万分子に相当する蛍光強度が得られた。
これにより、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることが確認された。
【００４４】
比較例
１．工程（ａ）
アンモニア水含有溶媒１００ｍｌに添加するＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液の代わりに、ＭＰＳを混合させないＴＥＯＳ５００μｌを用いた以外は実施例１と同様にして、シリカ粒子の調製を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、実施例１と同様な洗浄操作により洗浄・分取後、実施例１と同様に蛍光強度を測定した。
上記洗浄操作によりローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は２．７ａｕと極めて弱いものであった。
【００４５】
２．工程（ｂ）
続いて、上記得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを追加的に添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作によりシリカ粒子コロイドを得た。得られたシリカ粒子を比較例のシリカ粒子とする。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として平均粒径を算出したところ、平均粒径１５０ｎｍのシリカナノ粒子が得られた。
上記と同様に蛍光強度測定を行った結果、上記と同様な一連の洗浄操作を行うことでローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は２ａｕと極めて弱いものであった。
実施例１の蛍光強度の結果との比較からＭＰＳを含有させないでＴＥＯＳのみからシリカ粒子を調製してもポーラスな構造が得られず粒子内部にローダミンＢは殆ど取り込まれない。
【００４６】
実施例２（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
工程（ａ）として、４．０質量％のアンモニア水の代わりに２．４質量％のアンモニア水を用いてのアンモニア水含有溶媒１００ｍｌを調製して用いたこと以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
続いて工程（ｂ）として、得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを追加的に添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作により遠心分離を行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物をエタノールで２回、蒸留水で４回洗浄した。その結果、コア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドが得られた。
なお、上記一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢ色素が存在し、多孔性シリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることを上記蛍光強度測定と同様な方法により確認した。
図１に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図１中のスケールバーは６００ｎｍを示す（倍率５万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子である。
図２は、実施例２で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。図２から明らかなように、得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、平均粒径７０ｎｍでＣＶ１２．５％の粒度分布で粒径が揃っていることが分かる。緻密シリカシェル形成前（工程（ｂ）前）に測定した平均粒径に対し、前記緻密シリカシェル分だけ平均粒径が増加した（約１０ｎｍ）。
なお、前記平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（４９４個）の直径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
実施例１の結果との比較から反応混合液中のアンモニア濃度を低くすることで平均粒径の小さなシリカ粒子を調製できることがわかる。
【００４７】
実施例３（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
工程（ａ）として、４．０質量％のアンモニア水の代わりに１２質量％のアンモニア水を用いてのアンモニア水含有溶媒１００ｍｌを調製して用いたこと以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
続いて工程（ｂ）として、得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを追加的に添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作により遠心分離を行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物をエタノールで２回、蒸留水で４回洗浄した。その結果、コア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドが得られた。
【００４８】
上記一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢ色素が存在し、多孔性シリカ粒子の表面にローダミンＢ色素を透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢ色素を閉じ込めていることを上記蛍光強度測定と同様な方法により確認した。
図３に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図３中のスケールバーは１．０μｍを示す（倍率３万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られたシリカナノ粒子である。
図４は、実施例３で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。図４から明らかなように、平均粒径１９２ｎｍでＣＶ６．６％の粒度分布で粒径が揃っていることが分かる。
なお、前記平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（２３９個）の直径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
実施例１の結果との比較から反応混合液中のアンモニア濃度を高く設定することで平均粒径の大きなシリカ粒子を調製できることがわかる。
【００４９】
実施例４（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
アンモニア水含有溶媒１００ｍｌに添加するＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液として、ＭＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比１：９９の混合液５００μｌを用いた以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、実施例１と同様な洗浄操作により洗浄・分取後、実施例１と同様に蛍光強度を測定した。
上記洗浄操作によりローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は１．１ａｕと極めて弱いものであった。
【００５０】
２．工程（ｂ）
続いて、上記得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作によりコア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドを得た。得られたシリカ粒子を実施例４のシリカ粒子とする。同様に蛍光強度測定を行った結果、上記と同様な一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢが存在し、蛍光強度は５．５ａｕを示した。
これにより、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることが確認された。
実施例１の蛍光強度の結果との比較からＭＰＳを多く取り込ませることでよりポーラスな構造のコアとなるシリカ粒子とし、より多くの色素を粒子内部に取り込ませることができることがわかる。
【００５１】
実施例５（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
アンモニア水含有溶媒１００ｍｌに添加するＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液の代わりに、ＡＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比１：９９の混合液５００μｌを用いたこと以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、実施例１と同様な洗浄操作により洗浄・分取後、実施例１と同様に蛍光強度を測定した。
上記洗浄操作によりローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は１ａｕと弱いものであった。
２．工程（ｂ）
続いて、上記得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳを１００μｌ添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作によりコア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドを得た。得られたシリカ粒子を実施例５のシリカ粒子とする。上記と同様な一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢが存在し、蛍光強度は２４ａｕと高かった。
これにより、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることが確認された。
実施例１、４、５及び比較例の蛍光強度を下記表にまとめる。
【００５２】
【表１】
【００５３】
前記実施例５のＡＰＳを用いて得たシリカ粒子のζ電位（粒子のすべり面における）を測定したところ、ＡＰＳを用いないで調製した実施例１〜４のシリカ粒子のζ電位よりもわずかにプラス寄りとなった。尚、ζ電位の測定は、測定装置としてゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）を用いて行なった。
さらにＡＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比を１：９の混合液５００μｌを用いてシリカ粒子を調製するとシリカ粒子のζ電位は符号が反転してプラスとなった。この場合、負に帯電しているシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）と正に帯電しているアミノプロピル基（Ｃ３Ｈ６−ＮＨ２）がシリカ粒子表面に混在していることになり、粒子間で相互引力が働いてコロイドがゲル化してしまった。これに対してＭＰＳが有するメルカプトプロピル基は中性であるため粒子間の相互引力が働かず、実施例１のようにＭＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比を１：９としてもζ電位はＴＥＯＳのみで調製されるシリカ粒子と同様、粒子は純水中で安定に分散し続けた。
【００５４】
実施例６（工程（ａ）及び（ｂ）の温度条件の検討）
工程（ａ）においては反応条件を５０℃１時間とし、工程（ｂ）においては反応条件を０℃８時間とする以外は実施例１と同様にしてシェル形成することにより多くのローダミンＢを粒子内部に閉じ込められることを確認した。
また、非加水分解性置換基を有するＭＰＳ等のオルガノアルコキシシラン化合物は加水分解の反応速度がＴＥＯＳよりも遅く、前記アンモニア水含有溶媒に投入したＭＰＳ等のすべてがシリカ粒子に取り込まれるわけではなく、そのシリカ粒子への取り込み率はシリカ粒子調製時の温度条件に依存し、その取り込み率はシリカ粒子調製時の温度に対応して単調に増大することを確認している。
この結果から、工程（ａ）においては反応温度条件を高くしてＭＰＳ等のオルガノアルコキシシラン化合物を多く取り込ませることでよりポーラスな構造とし、工程（ｂ）においては反応温度条件を低くしてシェル構造を緻密化させることでより多くのローダミンＢを粒子内部に閉じ込められることがわかる。
【００５５】
実施例７
（コア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例２のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
【００５６】
（分子認識試験）
続いて、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾したコア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた抗ｈＣＧ抗体を表面修飾したコア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドに浸し、１時間放置した。
図５から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色し、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾したコア‐シェル構造のシリカナノ粒子が形成されていることが確認された。また、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、実施例２で得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図２】図２は、実施例２で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。
【図３】図３は、実施例３で得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図４】図４は、実施例３で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。
【図５】図５は、実施例７の分子認識試験に用いたストリップの平面図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメートルサイズのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法に関する。より詳しくは、タンパク質等の特定物質の検出用ないしは定量用の標識試薬として用いる、ナノメートルサイズのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニア存在下、水を加えて加水分解するとシリカ粒子が形成される（例えば、非特許文献１参照。）。ＴＥＯＳ等のテトラアルコキシシランは中心のケイ素原子（Ｓｉ）と結合している全てのアルコキシ基が加水分解されるため、縮重合後、最終的には組成式ＳｉＯ２で表されるシリカへと変化し、緻密な構造のシリカガラスの粒子となる。
シリカ自身には光吸収特性や磁性がないためその粒子を検出することができず、標識試薬として用いることはできない。しかし、シリカには高い化学的安定性や表面修飾についての高い自由度、生体に対する無害性といった標識試薬にとって好ましい特性をいくつも兼ね備えている。そのため、従来蛍光もしくは吸光色素分子をそのまま標識試薬として用いていたのに対して、これら色素分子をシリカ粒子内部に閉じ込めることができれば前述のような好ましい特性を持った標識試薬を得ることができる。
【０００３】
シリカ粒子の内部に有機色素分子を取り込む手法としては、アミノ基と共有結合しやすいＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを有する色素分子をシランカップリング剤の一種であるγ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）分子のアミノ基と結合させ、さらにＡＰＳのエトキシ基を加水分解させてシリカと重合させることで結果的にシリカと前記色素分子をアミド結合によって結合させるという方法がある（例えば、特許文献１参照。）。しかし、この方法を適用できるＮＨＳエステルを有する色素分子が非常に高価である上、その種類も限られてしまうという問題があった。
また、標識試薬として用いるためには試薬に含まれる粒子の粒径が揃っているほうが好ましい。検出する標的物質の結合選択性が粒径に依存する場合、粒子の粒径が揃っていないと、測定される蛍光強度もしくは吸光強度と標的物質の量が比例関係から逸脱してしまい、標的物質の定量検出は不可能となってしまうという問題があった。
【特許文献１】ＥＰ１０３６７６３Ｂ１公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６，６２−６９（１９６８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、多孔性構造のコアのシリカ粒子内部の連通孔に蛍光色素化合物、吸光色素化合物等の機能性化合物を閉じ込めたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、粒径が揃った、ｎｍオーダーのシリカナノ粒子の製造方法、及びそれにより製造されるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を提供することにある。また、本発明の目的は、測定結果の再現性に優れる、極微量標的試料の高感度分析が可能な標識試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題は下記の手段により達成された。
（１） 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とするコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（ａ）下記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物を下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程、
一般式１
Ｒ１ｎＳｉ（ＯＲ２）４−ｎ
（式中、Ｒ１はアンモニア水に対して非加水分解性の置換基を表す。ＯＲ２はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは１〜３の整数を示し、Ｒ１が複数ある場合、各Ｒ１はたがいに同一であっても異なっていてもよく、ＯＲ２が複数ある場合、各ＯＲ２はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
一般式２
Ｓｉ（ＯＲ３）４
（式中、ＯＲ３はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。各ＯＲ３はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
【０００６】
（２） 前記オルガノアルコキシシラン化合物がγ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン又はγ-アミノプロピルトリエトキシシランであり、前記テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランである（１）に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（３） 前記工程（ａ）において、前記オルガノアルコキシシラン化合物と、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率が１：１００〜１：５の範囲で反応させることを特徴とする（１）又は（２）に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（４） 前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
（５） 前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製する工程（ａ）における前記粒子形成を２０〜６０℃の温度条件下で行い、前記工程（ｂ）における前記シェルの形成を０〜２０℃の温度条件下で８時間以上かけて行うことを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法、
【０００７】
（６） 前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、
（７） オルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を緻密シリカのシェルが包囲してなるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、
前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径を有し、前記緻密シリカのシェルが、前記機能性化合物を透過させない程度に緻密であることにより、前記連通孔に前記機能性化合物を閉じ込めていることを特徴とするシリカナノ粒子、
（８） 前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である（７）に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、
（９） 平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする（７）〜（８）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、
【０００８】
（１０） 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする（７）〜（８）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子、及び
（１１） 前記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬
を提供するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において、「シリカナノ粒子」とは、平均粒径が１，０００ｎｍ以下のコロイドシリカ粒子をいう。前記シリカナノ粒子を標識試薬として用いる場合、検出物質や検出法によって使用するのに好適な粒子径は様々であるが、２０〜５００ｎｍの範囲内である場合が多く、この範囲にあるシリカナノ粒子であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法は、ＮＨＳエステル等を有する種類の限られた色素化合物を用いることがないゆえに、前記限られた色素化合物を化学結合して粒子に含有させる煩雑な工程を要しない。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法は、色素化合物等の機能性化合物を含有する液中において、連通孔を有するシリカ粒子のコアを調製後、その粒子表面上に前記機能性化合物を透過させない程度に緻密なシリカのシェルを形成することにより前記連通孔内に色素化合物等の機能性化合物を高濃度に閉じ込めることができる。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法は、得られるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の粒度分布の幅が狭く粒径を揃え、かつ平均粒径を制御できる。
【００１０】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記製造方法により得られるので、蛍光色素化合物、吸光色素化合物等の機能性化合物を高濃度に含有し、高感度標識に用いることが可能である。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記製造方法により得られるので、平均粒径がナノメートルサイズであり、かつ粒度分布の幅が狭く粒径が揃っている。
本発明の標識試薬は、平均粒径が揃った前記シリカナノ粒子を用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高い極微量標的試料の高感度分析が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という。）について説明する。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなる。
（ａ）前記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物を前記一般式２で表されるテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程。
【００１２】
本発明の製造方法で用いられる前記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物は、工程（ａ）において４−ｎ個のアルコキシ基ＯＲ２がアンモニア水により加水分解し脱離し、前記オルガノアルコキシシラン化合物は生じた脱離部分で重縮合し４−ｎ個のシロキサン結合を形成することができる。Ｒ１はアンモニア水に対して非加水分解性の置換基であるから、工程（ａ）において加水分解されてシロキサン結合を形成することはない。これにより、縮重合を繰り返して調製される前記シリカ粒子の内部に置換基Ｒ１が取り込まれて残存し、前記機能性化合物等の有機分子を１つ以上内包できる大きさ（例えば、孔径１〜３ｎｍ）の前記連通孔を形成することができる。
【００１３】
【化１】
【００１４】
このようにコアとなる前記シリカ粒子内部において、連通孔を形成し、多孔性（ポーラス）構造となる理由は定かではないが、前記置換基Ｒ１がある程度の嵩高さを有しており、加えて疎水性基であるため、親水性溶媒中で凝集しやすいことに起因しているものと推定される。
一方、前記一般式２で表されるテトラアルコキシシランにおいて、４個のアルコキシ基ＯＲ３は全て、アンモニア水により加水分解し、オルトケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）４）が生じる。生じた前記オルトケイ酸は４個のシロキサン結合を形成することができる。
ここで、シリカとは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）に基づくケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体をいい、前述のようにオルガノシロキサン成分を含有するケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を含むものとする。
【００１５】
本発明の製造方法に用いられる前記テトラアルコキシシランとしては、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン等が挙げられ、ＴＥＯＳが好ましい。
前記一般式１中、アンモニア水に対して非加水分解性の置換基Ｒ１は、置換ないしは非置換の、炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
本発明の製造方法に用いられる前記オルガノアルコキシシラン化合物としては、例えば、メルカプトアルキルトリアルコキシシラン（例えば、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン）、アミノアルキルトリアルコキシシラン（例えば、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ））、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン等が挙げられ、ＭＰＳが好ましい。
【００１６】
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記オルガノアルコキシシラン化合物と、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率は、１：１００〜１：５の範囲で反応させることが好ましく、１：５０〜１：１０の範囲で反応させることがより好ましい。
前記オルガノアルコキシシラン化合物の混合モル比率が低すぎると、前記多孔性シリカ粒子の空隙率が低くなり、前記機能性化合物の取り込み効率が低くなる。一方、前記オルガノアルコキシシラン化合物はシリカの生成反応を阻害する作用を有し、その混合モル比率が高すぎると、目的のシリカ粒子の収率が低下するばかりでなく、粒度分布が広がってしまう。
【００１７】
シリカ粒子をポーラス化するための前記オルガノアルコキシシラン化合物としては、粒子内部に閉じ込めたい前記機能性化合物の性質に合わせて選択することが好ましい。前記シリカ粒子の表面には一定量のヒドロキシル基（ＯＨ基）もしくはシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ基）が存在しており、これが負に帯電しやすいため正に帯電しやすい前記機能性化合物は前記シリカ粒子表面に吸着される。そのため、正に帯電しやすい前記機能性化合物もしくは中性の前記機能性化合物を粒子内部に閉じ込めたい場合には、電気的に中性なメルカプトプロピル基を持つＭＰＳを用いることが好ましい。これに対してＡＰＳのアミノプロピル基は正に帯電しやすく、逆に負に帯電しやすい前記機能性化合物を粒子内部に閉じ込める場合にはＡＰＳを用いることが好ましい。ただし、ＡＰＳの使用量が多いとシリカ表面に存在するヒドロキシル基との間に引力が働いて調製されるシリカ粒子が凝集化傾向を持ってしまう。そのため、ＡＰＳを用いる場合、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率は、１：１００〜１：５０の範囲で反応させることが好ましい。
【００１８】
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒は、アンモニア水そのものであってもよいが（例えば、３〜２８質量％アンモニア水）、前記機能性化合物を溶解させる観点から、アンモニアを含有させてなる水と親水性溶媒との混合溶媒であることが好ましい。水と混合させる前記親水性溶媒としては、エタノール、メタノール等が挙げられるが、エタノールが好ましい。前記水と前記親水性溶媒との体積比が１：２０〜１：３の混合溶媒であることが好ましく、１：６〜１：４の混合溶媒であることがより好ましい。
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒において、アンモニアの含有量としては特に制限はないが、前記オルガノアルコキシシラン化合物を混合させるため前記コアとなる前記シリカ粒子の成長速度が低下することと、目的のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の平均粒径を制御する観点から、１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。
【００１９】
前記アンモニアの含有量（アンモニア濃度）が高いほどシリカ粒子の核形成頻度、シリカ粒子の成長速度共に高くなるが、そのアンモニア濃度依存性はシリカ粒子の成長速度の方が高い。したがって、このアンモニア濃度依存性の違い（差）により加水分解反応の触媒として作用するアンモニアの濃度によって目的のコア‐シェル構造の前記シリカナノ粒子及び前記コアとなる前記シリカ粒子の平均粒径を調整することができる。
例えば、前記アンモニア水含有溶媒におけるアンモニアの含有量を４．０質量％とすると、平均粒径１５０ｎｍの目的のコア‐シェル構造の前記シリカナノ粒子を調製することができる。
【００２０】
前記工程（ａ）における前記コアとなる前記シリカ粒子の形成の温度条件としては特に制限はないが、調製される前記コアとなる前記シリカ粒子をより多孔質とする観点から、後述する工程（ｂ）におけるシリカシェルの形成の温度条件に比較して高い温度条件、すなわち、２０〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、４〜２４時間行うことが好ましい。
このように比較的に高い温度条件とすることにより得られる前記シリカ粒子がより多孔質になる理由は定かではないが、前記アルコキシ基（ＯＲ２、ＯＲ３）の加水分解反応の方が、ヒドロキシル基の脱水重縮合反応よりも温度依存性が高く、比較的に高い温度条件では熱力学的に異物（例えば、前記オルガノアルコキシシラン化合物）の混入が行われ易くなる。よって、ＡＰＳ、ＭＰＳ等の前記オルガノアルコキシシラン化合物が前記テトラアルコキシシランの反応によって形成されるシリカに混入しやすいためと推定される。
【００２１】
前記機能性化合物は、前記アンモニア水含有溶媒に可溶性であることが好ましく、水溶性もしくはエタノール可溶性であることがより好ましい。
前記機能性化合物としては、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物が好ましい。
前記蛍光色素化合物、前記吸光色素化合物の具体例として下記式でそれぞれ表されるローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、Ｘ‐ローダミン等が挙げられる。
【００２２】
【化２】
【００２３】
前記蛍光色素化合物、前記吸光色素化合物は、商業的に市販のものを入手することも可能である。
本発明の製造方法において、前記アンモニア水含有溶媒へ前記機能性化合物の少なくとも１種をあらかじめ溶解ないしは含有させておく量は、特に制限はないが、前記アンモニア水含有溶媒中、０．０５〜０．５質量％が好ましく、０．１〜０．２質量がより好ましい。本発明の製造方法によれば、この溶解ないしは含有させておく前記機能性化合物の量により、得られるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子中の前記機能性化合物の含有量を制御できる。
【００２４】
前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製する際に、前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておくことで、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を含有させることができる。
しかし、前記連通孔は外界に開孔しているものが多く、工程（ａ）により得られた前記連通孔を有する前記シリカ粒子を洗浄・単離する際に前記機能性化合物の多くは流出してしまう。
【００２５】
そこで、本発明の製造方法においては、前記工程（ｂ）の緻密シリカシェル形成工程において、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記テトラアルコキシシランのみから形成される緻密シリカのシェルを前記シリカ粒子の表面上に包囲して形成させることにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に含有された前記機能性化合物の閉じ込めを完全なものとすることができる。
【００２６】
ここで、「シリカが緻密であること」とは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）の三次元ネットワークが前記機能性化合物を透過させない程度に隙間なく形成されることをいう。
【００２７】
【化３】
【００２８】
前記ローダミンＢはおおよそ１ｎｍの分子サイズを有することが知られ、本明細書の実施例の項において後述するように、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記緻密シリカのシェルにより前記ローダミンＢ等の前記機能性化合物を前記連通孔に閉じ込めることができる。
【００２９】
前記工程（ｂ）において、薄くて緻密な前記緻密シリカシェルを、前記連通孔を有する前記シリカ粒子の表面上に包囲して形成させる観点から、前記アンモニア水含有溶媒に追加的に含有させる前記テトラアルコキシシランの使用量としては、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して、５〜１００質量部が好ましく、２０〜５０質量部がより好ましい。
前記工程（ｂ）における前記緻密シリカシェルの形成反応の温度条件としては特に制限はないが、前記コアとなる前記シリカ粒子を調製する前述した工程（ａ）とは逆に緻密な構造のシリカシェルを形成する観点から、前記工程（ａ）における温度条件に比較して低い温度条件、並びに反応時間については比較的に長時間かけて行うことが好ましい。具体的には、０〜２０℃の温度条件下で８時間以上かけて行うことが好ましく、８〜４８時間かけて行うことがより好ましい。
【００３０】
シリカシェル形成工程である前記工程（ｂ）は、前記工程（ａ）の前記コアとなる前記シリカ粒子の調製に引き続いて連続して行うことが好ましい。具体的には、前記工程（ａ）において調製された前記コアとなる前記シリカ粒子を洗浄又は精製を行うことなく、前記工程（ａ）における前記アンモニア水含有溶媒中で工程（ｂ）を行うことが好ましい。
前記工程（ａ）及び（ｂ）の間に、調製された前記コアとなる前記シリカ粒子の洗浄又は精製を行うと、アンモニア水含有溶媒中での粒子同士の凝集傾向が高まってしまい、前記工程（ｂ）のシェル形成反応により前記シリカ粒子同士の不可逆的な融合が生じてしまう。
【００３１】
本発明の製造方法によれば、球状、もしくは、球状に近いシリカナノ粒子が製造できる。球状に近いシリカナノ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が１．２以下の形状である。
【００３２】
次に、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子について説明する。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述した本発明の製造方法により製造することができる。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を緻密シリカのシェルがシロキサン結合により包囲してなるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、
前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径を有し、前記緻密シリカのシェルが、前記機能性化合物を透過させない程度に緻密であることにより、前記連通孔に前記機能性化合物を閉じ込めていることを特徴とする。
【００３３】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子において、前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径とは、１ｎｍ以上の連通孔の直径をいい、２〜１０ｎｍの範囲にあることが好ましい。
前記ローダミンＢはおおよそ１ｎｍの分子サイズを有することが知られている（例えば、ベンゼン環のＣ−Ｃ間距離は、約１．４Åであり（例えば、理化学辞典第５版第３０５頁参照。）、そのデータに基づいて幾何学的に計算が可能である。）。本明細書の実施例の項において後述するように、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前記蛍光色素化合物、前記吸光色素化合物等の前記機能性化合物を前記連通孔に内包し、閉じ込めることができる。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子において、前記緻密シリカのシェルの厚みは特に制限はないが、１０ｎｍ以下が好ましく、５ｎｍ以下がより好ましい。
【００３４】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子において、前記緻密シリカのシェルの厚みは、厚いほど色素の閉じ込める効率が高くなるが、逆に厚いほどシリカ粒子の質量が増大してシリカ粒子のコロイド質量濃度あたりの蛍光強度が低下していく。例えば、平均粒径５０ｎｍのコアとなるシリカ粒子に厚み５ｎｍのシェルを形成するのと厚み１０ｎｍのシェルを形成するのとを比較すると、１粒子あたりの蛍光強度は１０ｎｍのシェルを有する粒子のほうが高くなるが、１粒子あたりの重量は１０ｎｍのシェルを有する粒子のほうが約３０％重く、したがって１粒子あたりの蛍光強度に３０％以上の差がない場合はコロイド質量濃度あたりの蛍光強度は５ｎｍのシェルを有するシリカ粒子からなるコロイド分散液の方が高くなる。
なお、形成されるシェルの厚みは、前記工程（ｂ）においてシェルを形成するために追加的に使用するテトラアルコキシシランの量によって制御できる。具体的には、例えば１ｍｌのテトラアルコキシシランによって粒径１００ｎｍのコアを製造している場合、前記工程（ａ）において含有させた量の２５％に相当する０．２５ｍｌのテトラアルコキシシランを追加的に使用してシェルを形成させると、シェルの体積比率は２０％、すなわち粒径換算でコア径の８％にあたる８ｎｍの厚みとなる。ただし、これは平均値であり、粒子ごと、あるいは単一粒子の表面部位によって厚みにある程度のばらつきが生じるものと考えられる。
【００３５】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御することにより粒径が揃ったｎｍサイズの所望の平均粒径とすることができる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から直接各粒子（少なくとも１００個）の直径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
本発明により得られたシリカナノ粒子の粒度分布の変動係数（以下ＣＶということもある。）は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。ここで、前記変動係数は、粒度の分布の標準偏差を平均粒径で割った値をいう。
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御することにより２０〜１００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１５％以下とすることができる。
また、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、１００〜５００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１０％以下とすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とは変動係数１５％以下の粒子群をいう。
【００３６】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法において、前記アンモニア水含有溶媒へ前記機能性化合物の少なくとも１種をあらかじめ溶解ないしは含有させておく量を制御することにより、少なくとも1種の前記機能性化合物を高濃度に取り込み、閉じ込んでなる。例えば、平均粒子径１５０ｎｍのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子１個当たり、１万〜２万分子の前記機能性化合物を含有させることができる。
【００３７】
次に「シリカナノ粒子表面修飾」について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能である。
【００３８】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、所望の標的生体分子を分子認識する物質を表面に結合もしくは吸着させることが好ましい。
前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子が、前記機能性化合物として蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物を前記連通孔に内包する場合、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中の標的生体分子（生理活性物質を含む。）を蛍光ないしは吸光色素標識付けすることができる。
前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子を表面修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、リガンド、受容体、化学物質等が挙げられる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
【００３９】
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
すなわち、前記シリカナノ粒子を表面修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
【００４０】
本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の表面への、前記生体分子による吸着等の表面修飾が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより行われることが好ましい。
例えば、縮合剤等の非存在下、前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカナノ粒子の表面と吸着することができる。
前記縮合剤ないしは架橋剤を用いる場合の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
表面修飾に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については表面修飾が進行する限り特に制限はない。
前記表面修飾した後、前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子と前記シリカナノ粒子に結合ないし吸着していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記生体分子により前記シリカナノ粒子を表面修飾した後は、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の表面修飾が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
【００４１】
次に、本発明の標識試薬について説明する。
本発明の標識試薬は、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いてなる。前記コア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いて、蛍光ないし吸光色素標識を付与することが好ましい。さらに前述のシリカナノ粒子の表面修飾により抗体やホルモンなどの標的生体分子を分子認識する物質でシリカ粒子表面を修飾し、光学特性を検出する装置又は目視によって前記標的生体分子が評価されるべき試料中に存在するか否か等の評価を可能にする標識試薬として利用することができる。
本発明の標識試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記標的生体分子を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記標的生体分子との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記シリカナノ粒子を用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
４．０質量％のアンモニア水２０体積％とエタノール８０体積％のアンモニア水含有溶媒１００ｍｌに、ＭＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比１：９の混合液５００μｌとローダミンＢ色素（２０ｍｍｏｌ／ｌＤＭＦ溶液）１０μｍｏｌを投入し、攪拌しながら室温（２５℃）で４時間反応を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、緻密シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、洗浄・分取した。
具体的な洗浄操作としては、上記得られた反応混合液の一部を取り出し、遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、余分なＴＥＯＳ等を除去した。
得られた粒子の蛍光を測定した。測定は蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、前記シリカ粒子由来の蛍光強度、すなわち、５５５ｎｍの励起光における５８０ｎｍの蛍光強度を測定した。
測定値は、得られたシリカ粒子の質量で規格化し、単位をａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａｕ：任意単位）として表した。以下同様である。
得られた蛍光強度は９．４ａｕであったが、下記シェル形成後のシリカ粒子の蛍光強度４６ａｕと比較すると弱く、上記一連の洗浄操作により連通孔に内包されていたローダミンＢがほとんど流出してしまったといえる。
【００４３】
２．工程（ｂ）
上記得られたコアとなるシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳを１００μｌ添加し、さらに室温で１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、上記の洗浄操作と同様な操作により遠心分離を行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物をエタノールで２回、蒸留水で４回洗浄した。その結果、コア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドが得られた。得られたシリカ粒子を実施例１のシリカ粒子とする。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として平均粒径を算出したところ、緻密シリカシェル形成前（工程（ｂ）前）に測定した平均粒径に対し、前記緻密シリカシェル分だけ平均粒径が増加し（約１０ｎｍ）、平均粒径１５０ｎｍのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子が得られた。
また、上記一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢ色素が存在し、上記と同様に蛍光強度測定を行った結果、蛍光強度は４６ａｕと強く、平均粒径１５０ｎｍのコア‐シェル構造のシリカナノ粒子１個の内部にローダミンＢ１万〜２万分子に相当する蛍光強度が得られた。
これにより、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることが確認された。
【００４４】
比較例
１．工程（ａ）
アンモニア水含有溶媒１００ｍｌに添加するＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液の代わりに、ＭＰＳを混合させないＴＥＯＳ５００μｌを用いた以外は実施例１と同様にして、シリカ粒子の調製を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、実施例１と同様な洗浄操作により洗浄・分取後、実施例１と同様に蛍光強度を測定した。
上記洗浄操作によりローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は２．７ａｕと極めて弱いものであった。
【００４５】
２．工程（ｂ）
続いて、上記得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを追加的に添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作によりシリカ粒子コロイドを得た。得られたシリカ粒子を比較例のシリカ粒子とする。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として平均粒径を算出したところ、平均粒径１５０ｎｍのシリカナノ粒子が得られた。
上記と同様に蛍光強度測定を行った結果、上記と同様な一連の洗浄操作を行うことでローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は２ａｕと極めて弱いものであった。
実施例１の蛍光強度の結果との比較からＭＰＳを含有させないでＴＥＯＳのみからシリカ粒子を調製してもポーラスな構造が得られず粒子内部にローダミンＢは殆ど取り込まれない。
【００４６】
実施例２（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
工程（ａ）として、４．０質量％のアンモニア水の代わりに２．４質量％のアンモニア水を用いてのアンモニア水含有溶媒１００ｍｌを調製して用いたこと以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
続いて工程（ｂ）として、得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを追加的に添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作により遠心分離を行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物をエタノールで２回、蒸留水で４回洗浄した。その結果、コア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドが得られた。
なお、上記一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢ色素が存在し、多孔性シリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることを上記蛍光強度測定と同様な方法により確認した。
図１に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図１中のスケールバーは６００ｎｍを示す（倍率５万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子である。
図２は、実施例２で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。図２から明らかなように、得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子は、平均粒径７０ｎｍでＣＶ１２．５％の粒度分布で粒径が揃っていることが分かる。緻密シリカシェル形成前（工程（ｂ）前）に測定した平均粒径に対し、前記緻密シリカシェル分だけ平均粒径が増加した（約１０ｎｍ）。
なお、前記平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（４９４個）の直径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
実施例１の結果との比較から反応混合液中のアンモニア濃度を低くすることで平均粒径の小さなシリカ粒子を調製できることがわかる。
【００４７】
実施例３（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
工程（ａ）として、４．０質量％のアンモニア水の代わりに１２質量％のアンモニア水を用いてのアンモニア水含有溶媒１００ｍｌを調製して用いたこと以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
続いて工程（ｂ）として、得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを追加的に添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作により遠心分離を行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去し、得られた沈殿物をエタノールで２回、蒸留水で４回洗浄した。その結果、コア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドが得られた。
【００４８】
上記一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢ色素が存在し、多孔性シリカ粒子の表面にローダミンＢ色素を透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢ色素を閉じ込めていることを上記蛍光強度測定と同様な方法により確認した。
図３に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図３中のスケールバーは１．０μｍを示す（倍率３万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られたシリカナノ粒子である。
図４は、実施例３で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。図４から明らかなように、平均粒径１９２ｎｍでＣＶ６．６％の粒度分布で粒径が揃っていることが分かる。
なお、前記平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（２３９個）の直径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
実施例１の結果との比較から反応混合液中のアンモニア濃度を高く設定することで平均粒径の大きなシリカ粒子を調製できることがわかる。
【００４９】
実施例４（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
アンモニア水含有溶媒１００ｍｌに添加するＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液として、ＭＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比１：９９の混合液５００μｌを用いた以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、実施例１と同様な洗浄操作により洗浄・分取後、実施例１と同様に蛍光強度を測定した。
上記洗浄操作によりローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は１．１ａｕと極めて弱いものであった。
【００５０】
２．工程（ｂ）
続いて、上記得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳ１００μｌを添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作によりコア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドを得た。得られたシリカ粒子を実施例４のシリカ粒子とする。同様に蛍光強度測定を行った結果、上記と同様な一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢが存在し、蛍光強度は５．５ａｕを示した。
これにより、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることが確認された。
実施例１の蛍光強度の結果との比較からＭＰＳを多く取り込ませることでよりポーラスな構造のコアとなるシリカ粒子とし、より多くの色素を粒子内部に取り込ませることができることがわかる。
【００５１】
実施例５（本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
アンモニア水含有溶媒１００ｍｌに添加するＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液の代わりに、ＡＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比１：９９の混合液５００μｌを用いたこと以外は実施例１と同様にして、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の調製を行った。
反応終了後、得られたシリカ粒子を洗浄・分取することなく下記工程（ｂ）に供したが、得られたシリカ粒子の一部については、シリカシェル形成前の平均粒径及び蛍光強度を測定するため、実施例１と同様な洗浄操作により洗浄・分取後、実施例１と同様に蛍光強度を測定した。
上記洗浄操作によりローダミンＢはほとんど流出してしまい、蛍光強度は１ａｕと弱いものであった。
２．工程（ｂ）
続いて、上記得られたシリカ粒子が分散する前記アンモニア水含有溶媒中に、ＴＥＯＳを１００μｌ添加し、さらに１８時間反応を行いシェル構造を形成した。反応終了後、実施例１の洗浄操作と同様な操作によりコア‐シェル構造のシリカ粒子コロイドを得た。得られたシリカ粒子を実施例５のシリカ粒子とする。上記と同様な一連の洗浄操作を行っても流出しないローダミンＢが存在し、蛍光強度は２４ａｕと高かった。
これにより、コアとなる連通孔を有するシリカ粒子の表面にローダミンＢを透過させない程度に緻密なシェル構造が形成され、ローダミンＢを閉じ込めていることが確認された。
実施例１、４、５及び比較例の蛍光強度を下記表にまとめる。
【００５２】
【表１】
【００５３】
前記実施例５のＡＰＳを用いて得たシリカ粒子のζ電位（粒子のすべり面における）を測定したところ、ＡＰＳを用いないで調製した実施例１〜４のシリカ粒子のζ電位よりもわずかにプラス寄りとなった。尚、ζ電位の測定は、測定装置としてゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）を用いて行なった。
さらにＡＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比を１：９の混合液５００μｌを用いてシリカ粒子を調製するとシリカ粒子のζ電位は符号が反転してプラスとなった。この場合、負に帯電しているシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）と正に帯電しているアミノプロピル基（Ｃ３Ｈ６−ＮＨ２）がシリカ粒子表面に混在していることになり、粒子間で相互引力が働いてコロイドがゲル化してしまった。これに対してＭＰＳが有するメルカプトプロピル基は中性であるため粒子間の相互引力が働かず、実施例１のようにＭＰＳ：ＴＥＯＳの混合モル比を１：９としてもζ電位はＴＥＯＳのみで調製されるシリカ粒子と同様、粒子は純水中で安定に分散し続けた。
【００５４】
実施例６（工程（ａ）及び（ｂ）の温度条件の検討）
工程（ａ）においては反応条件を５０℃１時間とし、工程（ｂ）においては反応条件を０℃８時間とする以外は実施例１と同様にしてシェル形成することにより多くのローダミンＢを粒子内部に閉じ込められることを確認した。
また、非加水分解性置換基を有するＭＰＳ等のオルガノアルコキシシラン化合物は加水分解の反応速度がＴＥＯＳよりも遅く、前記アンモニア水含有溶媒に投入したＭＰＳ等のすべてがシリカ粒子に取り込まれるわけではなく、そのシリカ粒子への取り込み率はシリカ粒子調製時の温度条件に依存し、その取り込み率はシリカ粒子調製時の温度に対応して単調に増大することを確認している。
この結果から、工程（ａ）においては反応温度条件を高くしてＭＰＳ等のオルガノアルコキシシラン化合物を多く取り込ませることでよりポーラスな構造とし、工程（ｂ）においては反応温度条件を低くしてシェル構造を緻密化させることでより多くのローダミンＢを粒子内部に閉じ込められることがわかる。
【００５５】
実施例７
（コア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例２のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
【００５６】
（分子認識試験）
続いて、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾したコア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた抗ｈＣＧ抗体を表面修飾したコア‐シェル構造のシリカナノ粒子のコロイドに浸し、１時間放置した。
図５から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色し、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾したコア‐シェル構造のシリカナノ粒子が形成されていることが確認された。また、本発明のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、実施例２で得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図２】図２は、実施例２で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。
【図３】図３は、実施例３で得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図４】図４は、実施例３で得られたシリカナノ粒子の粒度分布のヒストグラムを示す図である。
【図５】図５は、実施例７の分子認識試験に用いたストリップの平面図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とするコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（ａ）下記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物を下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程。
一般式１
Ｒ１ｎＳｉ（ＯＲ２）４−ｎ
（式中、Ｒ１はアンモニア水に対して非加水分解性の置換基を表す。ＯＲ２はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは１〜３の整数を示し、Ｒ１が複数ある場合、各Ｒ１はたがいに同一であっても異なっていてもよく、ＯＲ２が複数ある場合、各ＯＲ２はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
一般式２
Ｓｉ（ＯＲ３）４
（式中、ＯＲ３はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。各ＯＲ３はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
【請求項２】
前記オルガノアルコキシシラン化合物がγ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン又はγ-アミノプロピルトリエトキシシランであり、前記テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランである請求項１に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）において、前記オルガノアルコキシシラン化合物と、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率が１：１００〜１：５の範囲で反応させることを特徴とする請求項１又は２に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製する工程（ａ）における前記粒子形成を２０〜６０℃の温度条件下で行い、前記工程（ｂ）における前記シェルの形成を０〜２０℃の温度条件下で８時間以上かけて行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項７】
オルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を緻密シリカのシェルが包囲してなるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、
前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径を有し、前記緻密シリカのシェルが、前記機能性化合物を透過させない程度に緻密であることにより、前記連通孔に前記機能性化合物を閉じ込めていることを特徴とするシリカナノ粒子。
【請求項８】
前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である請求項７に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項９】
平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする請求項７〜８のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項１０】
平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする請求項７〜８のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬。
【請求項１】
次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とするコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（ａ）下記一般式１で表されるオルガノアルコキシシラン化合物を下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後に縮重合させ、前記オルガノアルコキシシラン化合物に由来するオルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子を調製する工程、及び
（ｂ）前記アンモニア水含有溶媒に機能性化合物をあらかじめ溶解させておき、前記工程（ａ）により前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製した後に、前記アンモニア水含有溶媒に下記一般式２で表されるテトラアルコキシシランを追加的に含有させ、前記シリカ粒子の表面上を包囲してなる緻密シリカのシェルを形成することにより、前記シリカ粒子内部の前記連通孔に前記機能性化合物を前記シェルにより閉じ込める工程。
一般式１
Ｒ１ｎＳｉ（ＯＲ２）４−ｎ
（式中、Ｒ１はアンモニア水に対して非加水分解性の置換基を表す。ＯＲ２はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは１〜３の整数を示し、Ｒ１が複数ある場合、各Ｒ１はたがいに同一であっても異なっていてもよく、ＯＲ２が複数ある場合、各ＯＲ２はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
一般式２
Ｓｉ（ＯＲ３）４
（式中、ＯＲ３はアンモニア水に対して加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。各ＯＲ３はたがいに同一であっても異なっていてもよい。）
【請求項２】
前記オルガノアルコキシシラン化合物がγ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン又はγ-アミノプロピルトリエトキシシランであり、前記テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランである請求項１に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）において、前記オルガノアルコキシシラン化合物と、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率が１：１００〜１：５の範囲で反応させることを特徴とする請求項１又は２に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記連通孔を有する前記シリカ粒子を調製する工程（ａ）における前記粒子形成を２０〜６０℃の温度条件下で行い、前記工程（ｂ）における前記シェルの形成を０〜２０℃の温度条件下で８時間以上かけて行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項７】
オルガノシロキサン成分を含有することにより連通孔を有するシリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を緻密シリカのシェルが包囲してなるコア‐シェル構造のシリカナノ粒子であって、
前記連通孔が、前記機能性化合物を内包し得る孔径を有し、前記緻密シリカのシェルが、前記機能性化合物を透過させない程度に緻密であることにより、前記連通孔に前記機能性化合物を閉じ込めていることを特徴とするシリカナノ粒子。
【請求項８】
前記機能性化合物が、蛍光色素化合物もしくは吸光色素化合物である請求項７に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項９】
平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする請求項７〜８のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項１０】
平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする請求項７〜８のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のコア‐シェル構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬。
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１９６８２９（Ｐ２００９−１９６８２９Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３８０２７（Ｐ２００８−３８０２７）
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【出願人】（０００００５２９０）古河電気工業株式会社 (4,457)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１９日（２００８．２．１９）
【出願人】（０００００５２９０）古河電気工業株式会社 (4,457)
【Ｆターム（参考）】
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