コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、コラーゲン担持物、絆創膏、コラーゲンキットおよびコラーゲン担持物の製造方法
【課題】熱安定性に優れ、かつｐＨ５．５〜８．５で溶解するコラーゲン粉末等を提供する。
【解決手段】等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末である。前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を、基材に担持させてコラーゲン担持物としてもよい。冷蔵することなく保存でき、中性溶液への溶解性に優れ、三重螺旋のコラーゲン溶液を簡便に調製することができる。
【解決手段】等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末である。前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を、基材に担持させてコラーゲン担持物としてもよい。冷蔵することなく保存でき、中性溶液への溶解性に優れ、三重螺旋のコラーゲン溶液を簡便に調製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性溶液に容易に溶解するコラーゲン粉末、前記コラーゲン粉末を担持してなるコラーゲン担持物、およびこれらの製造方法などに関し、更には、前記コラーゲン粉末と前記コラーゲンを溶解するための溶解液とからなるコラーゲンキット、粘着テープに前記コラーゲン粉末、コラーゲン担持物が添付された絆創膏などに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖が螺旋を巻いた構造を有し、約３００ｎｍの複数のコラーゲン分子が６７ｎｍずつずれて会合し、長いコラーゲン線維を形成する。コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質であるが、生体内に含まれる大部分は水に不溶性である。一方、生体成分であり安全性に優れ、動物間で相同性が高いため免疫反応を起こしにくいなどの利点を有する。このため、食品、医薬品、化粧品分野への応用が検討され、種々の可溶化法や可溶化コラーゲンの利用法が開発されている。可溶化コラーゲンとして、動物の皮や骨等の原料に含まれるわずかな可溶性コラーゲンを希酸により抽出したもののほか、プロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化したもの(特許文献１)、アルカリを添加して可溶化したもの(特許文献２)等がある。
【０００３】
一方、コラーゲンは、処理方法によって等電点が異なり、酸性条件下で可溶化したコラーゲンは、化粧品の一般的なｐＨ範囲であるｐＨ５．５〜８．５において等電点沈殿により白濁を生じる。このため、コラーゲンの溶解性、透明性などを向上させる目的でコハク化コラーゲンとし、コラーゲン分子の等電点をｐＨ４〜５にシフトさせる方法もある（特許文献３）。コラーゲン分子の側鎖に存在するアミノ基をカルボキシル基に変え、これによりコラーゲンの実効電荷を負にし、等電点をｐＨ４〜５に変化させると、ｐＨ４以下、またはｐＨ５以上の溶液への溶解性に優れるというものである。また、コラーゲンをエステル化し、水溶性を向上させる方法もある(特許文献４)。動物組織の状態でコラーゲンの修飾反応を行い、抽出操作を行うことでエステル化コラーゲンを得るというものであり、コラーゲン分子に存在するカルボキシル基を、アルコールでエステル化している。
【０００４】
更に、水溶性コラーゲンは、含水分量が多い透明に溶液化された状態では熱変性温度が低いため、熱変性温度を向上させたコラーゲンもある(特許文献５)。化粧品の処方に用いられるｐＨ範囲に等電点を有するコラーゲンの水不溶性の会合体は、乳白色かつ不均一となるなどの理由から化粧品原料として不向きと考えられていたが、ｐＨ５．５〜８．５の等電点を有するコラーゲンの水溶液を、その等電点付近のｐＨに調整して得られる会合体の熱変性温度が顕著に高いことを見出し、このような会合体を化粧品原料として使用するというものである。実施例では、等電点がｐＨ約７．０のコラーゲン溶液に終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えて塩析させ、得られたコラーゲン沈殿物を塩酸で溶解し、その後に水酸化ナトリウムで中和することで会合体の分散物を得ている。未変性のコラーゲンは、特有の三重螺旋構造を持った棒状の分子であるがその水溶液は耐熱性が低く、熱処理によって容易にコラーゲンの螺旋構造が破壊される。上記特許文献５では、得られた未変性コラーゲンを使用してヒト皮膚表皮細胞の接着性を評価し、ゼラチンでは３０分培養後の接着性は全くなく、３時間培養で若干の接着性が観察される程度であるが、未変性コラーゲンを使用する場合には、３０分間の培養で顕著な接着性が観察されることが示されている。
【０００５】
一方、未変性のコラーゲン溶液は常温でも変性する可能性があり、保管に関しては冷蔵などの温度管理が必要である。このようなコラーゲンの保存性に鑑みて、乾燥コラーゲンを使用する方法もある(特許文献６)。水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びモノメチルアミンを豚塩蔵皮に添加してコラーゲンを可溶化し、硫酸を滴下してｐＨを４．８に調整し、中和後の皮片を取出し、圧搾して液を除去した後にｐＨ５．０の乳酸水溶液で撹拌して脱塩し、ついで乳酸ナトリウム溶液を添加してｐＨを６．７に調整してコラーゲン溶液を得て、これを有機溶媒中に吐出して等電点ｐＨ４．９のコラーゲン繊維を得ている。この可溶化コラーゲン繊維は、水性溶媒にプロペラ式撹拌器で混合して溶解させている。
【０００６】
また、可溶性コラーゲンの粉末とその溶解液とを別体とし、可溶性コラーゲンをその溶解液で溶解し、ついでその溶解液のｐＨを当該可溶性コラーゲンの等電点に調整し、ゲル化して可溶性コラーゲン含有化粧品として使用するというものもある(特許文献７)。コラーゲンが等電点でゲル化することを利用したものであり、可溶性コラーゲンと等電点外の溶解液を組み合わせ、その後に溶解液のｐＨを等電点に調整し、ゲル状のパック剤として使用するというものである。実施例では、等電点がｐＨ４．８であるコラーゲン繊維を調整し、ｐＨ３．５の溶解液を使用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭４４−１１７５号公報
【特許文献２】特公昭４６−１５０３３号公報
【特許文献３】特開昭５５−２８９４７号公報
【特許文献４】特開平８−２７１９２号公報
【特許文献５】特開２０００−１２８７６４号公報
【特許文献６】特開２００５−３０６７３６号公報
【特許文献７】特許第４３５３８５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
三重螺旋構造を維持する未変性のコラーゲンは保湿性に優れ、かつヒト皮膚表皮細胞への接着性に優れるため、化粧品への配合や医療用の用途開発が希求される化合物である。しかしながら、溶液に溶解したコラーゲンは、熱変性温度が低く常温でも変性し、冷蔵保存が要求される。すなわち、三重螺旋構造を維持したコラーゲンが溶解された状態で配合されるコラーゲン化粧品は、コラーゲンの変性を防止するため冷蔵庫などに保管する必要があり、使用が簡便でない。また、コラーゲンは等電点で容易に析出するため、細菌感染などで溶解液のｐＨが変動すると溶液が白濁し、または析出による目詰まりなどが発生しやすい。したがって、溶解時に三重螺旋構造を構成しうる未変性のコラーゲン粉末の製造方法が望まれる。
【０００９】
耐熱性に優れる乾燥コラーゲンを調製し、必要なときに溶解して使用できれば便利である。しかしながら、コラーゲンは本来保湿性に優れる化合物である。上記特許公報４の比較例１に示すように、アテロコラーゲンを塩析したコラーゲンの沈殿物をエタノールで洗浄することを試みたが、コラーゲン繊維の中に食塩を含んだ水を抱き込んでいるため除去できなかった、と記載している。このように、コラーゲンの乾燥には、凍結乾燥などの技術を必要とし、製造工程や装置が複雑となる場合がある。
【００１０】
また、上記特許文献６記載の方法では、乾燥コラーゲンを得るために、可溶性コラーゲン溶液を有機溶媒中に吐出して繊維化している。しかしながら繊維化は、操作が極めて複雑である。しかも、得られるコラーゲン繊維の溶解性は十分でない。したがって、複雑な工程を必要とせず、簡便に乾燥コラーゲンを調製する方法、および溶解性に優れるコラーゲン粉末が望まれる。
【００１１】
なお、溶解性を改良するために加圧ノズルを介して塔頂から目的成分を含有する溶液を供給し、熱を送風して造粒する方法などがある。しかしながら、コラーゲンは熱変性しやすく、このような造粒方法によって溶解性を改良することも困難である。
【００１２】
更に、そもそも可溶性コラーゲンは抽出方法に依存する等電点を有し、可溶性コラーゲンは等電点で溶解性が低い。例えば、上記特許文献７では、等電点がｐＨ４．８のコラーゲン繊維を調整し、これをｐＨ３．５の溶解液を使用して溶解し、溶解液のｐＨを等電点に調整することでゲル状のパック剤に調製している。このように、一旦、酸性溶液に溶解し、ついでアルカリで中和する必要があり、従来の化粧水などを使用して乾燥コラーゲンを溶解することは困難である。したがって、化粧品用途として用いる場合には一般の化粧品のｐＨである５．５〜８．５で速やかに溶解するコラーゲン粉末が望まれる。
【００１３】
また、コラーゲンは、ｐＨを調整することでゲル化し、パック剤などとして使用することができる。例えば、上記特許文献７では、コラーゲン繊維とこの溶解液とを別体とし、使用時に混合して皮膚に塗布し、ついでこの溶液のｐＨを調整してゲル化してパック剤としている。しかしながら、コラーゲンは保湿性に優れるばかりでなく、表皮細胞の接着性が高くかつ免疫原性が低いため、パック剤として使用するのみならず、絆創膏などに塗布しても細胞活性を増加させる可能性がある。したがって、化粧品以外にも使用でき、かつ取り扱いが容易な乾燥コラーゲン物品の開発が望まれる。
【００１４】
コラーゲンを粉末化する要請は、天然のコラーゲンのみならず、コラーゲン誘導体でも同様である。
【００１５】
上記現状に鑑み、化粧品のｐＨ範囲で溶解性に優れる未変性の可溶性コラーゲンの乾燥体たるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を提供するものである。
【００１６】
また、このようなコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を簡便に使用できるコラーゲン担持物や絆創膏、およびその製造方法を提供するものである。
【００１７】
また、化粧品のｐＨ範囲で、乾燥コラーゲンを速やかに溶解できる溶解液と乾燥コラーゲン物品とのキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンを１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥すると、平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン粉末が得られること、前記粗コラーゲン沈殿物は、エタノールなどの親水性有機溶媒に分散することができるため、固形分を分取した後に風乾によって乾燥でき、この粉末を溶解するとコラーゲンが溶液中で三重螺旋構造を呈すること、得られたコラーゲン粉末は、化粧品のｐＨである５．５〜８．５の溶解液で極めて速やかに溶解し、かつ１１０℃と高温でも変性することなく耐熱性に優れること、前記コラーゲン粉末を基材に担持して得たコラーゲン担持物と溶解液とを組み合わせてなるコラーゲンキットは、室温で保存でき、必要時に速やかに溶解して保湿性に優れる三重螺旋構造のコラーゲン溶液を調製できるため、パック剤その他の化粧品として簡便に使用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材に担持させてなるコラーゲン担持物を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、前記基材が、紙、布またはこれらの複合物である、上記コラーゲン担持物を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、粘着テープの一部に上記コラーゲン担持物を添付した絆創膏を提供するものである。
【００２３】
また、本発明は、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、または上記コラーゲン担持物と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなるコラーゲンキットを提供するものである。
【００２４】
また、本発明は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することを特徴とする、コラーゲン担持物の製造方法を提供するものである。
【００２５】
また、本発明は、前記粗コラーゲン沈殿物が、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱させて平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％としたものである、前記コラーゲン担持物の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、平均粒子径が１〜１，０００μｍであり、極めて微細な粉末であって取扱に優れる。しかも、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であり、中性の化粧品などへの溶解性に優れる。
【００２７】
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、熱安定性、保存性に優れる。しかも、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の溶解液は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が三重螺旋構造を構成するため、皮膚などの保湿性に優れる。
【００２８】
本発明のコラーゲン担持物は、基材にコラーゲン粉末が担持されているため、基材に溶解液を含浸させるだけで容易にコラーゲンを溶解することができ、前記基材を皮膚に接着させることで保湿性に優れる三重螺旋構造のコラーゲンのパック剤などとして使用することができる。
【００２９】
本発明のコラーゲン担持物の製造方法は、粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％であるため、親水性有機溶媒による脱水が容易であり、これを基材に担持すればよく、製造が極めて簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例１で調製したコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図２】実施例１で調製したコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【図３】実施例１で調製した、コラーゲン粉末の示差走査熱量計（ＤＳＣ）の結果を示す図である。
【図４】実施例１における、粉末コラーゲンを再溶解したコラーゲン溶液の円二色性を示す図である。
【図５】実施例１、実施例５における粉末コラーゲンおよび比較例１、比較例５のコラーゲンの溶解初速度を算出した図である。
【図６】実施例１で得たコラーゲン粉末の粒度分布の図である。
【図７】実施例１において粒度分布を測定したコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【図８】比較例１で得たコラーゲンスポンジの電子顕微鏡像を示す図である。
【図９】比較例２で得たコラーゲンフィルムの電子顕微鏡像を示す図である。
【図１０】比較例３で得たコラーゲン繊維の電子顕微鏡像を示す図である。
【図１１】比較例４で調製した、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【図１２】比較例５で調製した、コラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図１３】比較例６で得たコラーゲン粉末の粒度分布の図である。
【図１４】比較例６において、噴霧乾燥機を使用して乾燥してなるコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の第一は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末である。
【００３２】
また、本発明の第二は、前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材に担持させてなるコラーゲン担持物であり、本発明の第三は、粘着テープの一部に前記コラーゲン担持物を添付した絆創膏であり、本発明の第四は、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、または上記のコラーゲン担持物と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなるコラーゲンキットである。
【００３３】
また、本発明の第五は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することを特徴とする、コラーゲン担持物の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
（１）定義
本願明細書において、「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、３本のポリペプチド鎖が螺旋を巻いたものの総称である。従来からＩ〜ＸＸＩＸ型が知られているが、本発明で使用するコラーゲンとしてはいずれであってもよく、新たに見出されるコラーゲンであってもよい。生体内に含まれるコラーゲンの大部分は水に不溶性であり、本発明では、動物の皮や骨等の原料に含まれるコラーゲンをプロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化したもの、アルカリを添加して可溶化したものを「可溶化コラーゲン」と称する。なお、生体内には、動物の皮や骨等の原料には、わずかに中性塩溶液や酸性溶液に溶ける可溶性コラーゲンも含まれている。本発明で使用するコラーゲンは、水溶液に溶解するものであれば、不溶性コラーゲンを可溶化したものであってもよく、本来含まれる可溶性コラーゲンであってもよい。なお、本願明細書では生体内に大量に存在する不溶性コラーゲンを原料として調製される「可溶化コラーゲン」を用いて説明するが、本願発明における「コラーゲン」には、「可溶性コラーゲン」と「可溶化コラーゲン」との双方が含まれる。また、「コラーゲン線維」とは、複数の「コラーゲン分子」どうしが会合したものを意味する。コラーゲン分子としては、前記可溶化コラーゲンや可溶性コラーゲンが相当する。可溶化コラーゲン溶液を等電点沈殿し、または塩析するとコラーゲン分子どうしが会合し、コラーゲン線維を沈殿物として分取することができる。コラーゲン線維は、沈殿の際に複数のコラーゲン線維が会合して大きな凝集体として沈殿する場合がある。従って、本発明において「会合」とは、コラーゲン分子どうしの結合とコラーゲン線維どうしの結合の双方を含むものとする。また、「コラーゲン沈殿物」とは、コラーゲン溶液から固体で析出したコラーゲンを意味し、「コラーゲン粉末」とは、「コラーゲン沈殿物の粉状固形物」を意味する。
【００３５】
なお、「可溶化コラーゲン」や「可溶性コラーゲン」は、化学的処理の際に構成アミノ酸が修飾される。従って、本発明で使用する「コラーゲン」としては、例えば、アルカリ処理によってアスパラギン残基やグルタミン残基などがアルカリによる脱アミド反応によっておのおのアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に変化したものを含む。すなわち、コラーゲン分子に含まれるアミド基をカルボキシル基に変え、コラーゲンの実効電荷を負にすることで等電点が酸性あるいは中性へと調整される。例えば、アルカリ可溶化コラーゲンは、アスパラギン残基およびグルタミン残基がアルカリによる脱アミド反応によっておのおのアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に変化され、等電点がｐＨ４．５〜６．０と酸性へと変化している。本発明では、このようにコラーゲンを構成するアミノ酸が修飾されたものであってもよい。
【００３６】
更に、本発明における「コラーゲン誘導体」とは、前記コラーゲンを構成するアミノ酸に他の官能基を修飾したものを意味する。例えば、アシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンなどがある。なお、コラーゲン誘導体としては、予め調製されたアシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンのほか、塩析や等電点沈殿の際にエステル化され、またはアシル化されたコラーゲンであってもよい。コラーゲン含有組織から可溶化コラーゲンや可溶性コラーゲンを抽出する工程に先立ち、コラーゲンをアシル化して等電点を調整する場合があり、また、エステル化コラーゲンの製造方法として、予めコラーゲン含有組織に含まれる不溶性コラーゲンをエステル化し、ついでエステル化コラーゲンを等電点沈殿して分取する場合がある。なお、アシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンとしては、以下のものがある。
【００３７】
（ｉ）アシル化コラーゲン
アシル化コラーゲンとしては、サクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどがある。例えば、酵素処理によって抽出したアテロコラーゲン溶液をｐＨ９〜１２に調整し、その後、無水コハク酸、無水フタル酸、無水マレイン酸などの酸無水物を添加してなるサクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどのアシル化コラーゲンなどがある。
【００３８】
（ｉｉ）エステル化コラーゲン
エステル化コラーゲンとしては、可溶化コラーゲンをエステル化したもののほか、不溶性コラーゲンをエステル化した後に酵素反応などで可溶化されたエステル化コラーゲンなどがある。
【００３９】
コラーゲンに作用させてエステル化コラーゲンを得るためのアルコール類としては、１級アルコールのほか、２級アルコール、３級アルコールであってもよい。また、１価アルコールに限定されず、２価アルコールや３価アルコール、その他の多価アルコールであってもよい。
例えば、１価アルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｄｌ−２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、ｄｌ−２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、ｄｌ−２−ヘキサノール、ｄｌ−３−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、ｄｌ−２−オクタノール、３−オクタノール、１−ノナノール、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノール、５−ノナノール、デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテルなどが挙げられる。
【００４０】
また、２価アルコールとしては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２００〜２００００）、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ジプロピレングリコール、グリセリン、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、２，４−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール，２，５−ヘキサンジオールがある。その他の多価アルコールとして、グリセリン、各種の糖アルコールなどがある。
【００４１】
本発明で使用するコラーゲン誘導体およびコラーゲンは、溶解液中で三重螺旋構造を有している。
【００４２】
（２）粗コラーゲン沈殿物
本発明で使用する粗コラーゲン沈殿物は、「等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する」ものである。
【００４３】
前記したようにコラーゲンは生体内で不溶性であり、このような不溶性コラーゲンを酵素処理やアルカリ処理して可溶化コラーゲンを調製することができる。このような可溶化コラーゲンは水溶液で調製され、塩析や等電点沈殿によって精製されて固形の沈殿物となる。本発明では、このようにして得たコラーゲンの沈殿物を使用する。このようなコラーゲンの沈殿物やこれらから得られるコラーゲン粉末は、再度溶液に溶解すると、三重螺旋構造を有するコラーゲン溶液となるからである。
【００４４】
また、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の平均粒子径を１〜１，０００μｍに限定したのは、この範囲であれば、コラーゲン沈殿物が親水性有機溶媒によって効率よく脱水でき、風乾によって粉末化でき、得られる粉末も微細なコラーゲン粉末となる。すなわち、可溶化コラーゲン溶液を等電点沈殿や塩析するとコラーゲン分子どうしが会合してコラーゲン線維となり、更にコラーゲン線維が会合して凝集体となるため、一般には、沈殿物の平均粒子径は約２，０００μｍとなる。しかしながら、平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿を使用すると、溶解性に優れるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を得ることができることが判明した。なお、等電点沈殿をｐＨ３．５〜８．０に限定したのは、中性溶液での溶解性に優れるコラーゲン粉末を調製するためである。
【００４５】
（ｉ）平均粒子径
本発明で使用する粗コラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１〜１，０００μｍ、より好ましくは５〜９００μｍ、特に好ましくは１０〜７５０μｍ、更に好ましくは３０〜５００μｍである。平均粒子径が１，０００μｍを超えると乾燥や粉末化が困難となる場合がある。なお、コラーゲン分子の長径は３００ｎｍであり、コラーゲン分子どうしの会合が生じない場合には、コラーゲンの粒子径は３００ｎｍとなる。しかしながら、後記するように、このような３００ｎｍのコラーゲン分子が平行に複数結合してなるＳＬＳ線維は、更にＳＬＳ線維が相互に会合して凝集体を形成し、沈殿物となる。このようなＳＬＳ線維の沈殿物では少なくとも３個以上のＳＬＳ線維が会合していると想定して１μｍを下限とした。なお、本願における平均粒子径は、位相差顕微鏡で観察した値である。位相差顕微鏡像の長径をもって粗コラーゲン沈殿物の粒子径とし、十視野に含まれる全ての粗コラーゲン沈殿物の粒子径を平均し、平均粒子径とした。
【００４６】
平均粒子径が上記範囲の粗コラーゲン沈殿物は、可溶化コラーゲンやコラーゲン誘導体を溶解する溶液を、物理的処理や化学的処理し、または生成した沈殿物を物理的に破砕することで調整することができる。
【００４７】
（ｉ−１）物理的処理
物理的処理方法としては、例えば、コラーゲンやコラーゲン誘導体を溶解する溶液を撹拌しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈殿させる方法がある。撹拌によってコラーゲン分子どうしの会合が抑制され線維長の短いコラーゲン線維となり、更に複数のコラーゲン線維の会合による凝集体の生成を抑制し、粒子径の短いコラーゲン沈殿物を沈殿させることができる。また、生成した沈殿物を破砕して更に粒子径の短いコラーゲン沈殿物を沈殿させてもよい。撹拌の程度は、溶液のコラーゲンやコラーゲン誘導体の濃度、撹拌方法、撹拌容器の形状やサイズなどによって適宜選択することができる。ホモジナイザーを使用する場合には回転数１，０００〜２０，０００ｒｐｍである。コラーゲン線維の会合による凝集体の生成を抑制し、または生成する沈殿物の破砕を効率的に行うため、撹拌と破砕機構を有する装置を使用してもよい。
【００４８】
（ｉ−２)化学的処理
また、化学的処理方法としては、コラーゲン分子同士の会合を阻止する会合阻止剤を添加する方法がある。このような会合阻止剤としては、グルコース、スクロース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、グリセリンなどの糖類がある。また、コラーゲン分子の束状集合体を形成させるＡＴＰがある。例えばコラーゲン溶液に酸性条件下でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加え、コラーゲン分子の塩基性部位同士をＡＴＰのリン酸基で架橋させる。ＡＴＰによって複数のコラーゲン分子が平行に架橋し、コラーゲン分子の塩基性部位同士がＡＴＰのリン酸基で架橋されたＳＬＳ（Segment-long-spacing）線維が生成される。すなわち、前記した疎水性相互作用によるコラーゲン分子どうしの会合に優先して、ＡＴＰによるコラーゲン分子の架橋が生じるため、３００ｎｍのコラーゲン分子が平行に連結された、平均粒子径３００ｎｍのＳＬＳ線維となる。なお、複数のＳＬＳ線維が会合して凝集体を形成し、沈殿する。ＳＬＳ線維には、コラーゲンのほかにＡＴＰが架橋剤として含まれるが、他のコラーゲンやコラーゲン誘導体と同様にＡＴＰを含んだまま粉末化することができる。また、ＳＬＳ線維の沈殿物を得た後にＡＴＰを除去し、その後に粉末化してもよい。
【００４９】
（ｉｉ）コラーゲン濃度
粗コラーゲン沈殿物における前記コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度は、１２〜５０質量％、より好ましくは１５〜４０質量％、特に好ましくは２０〜３５質量％である。１２質量％を下回ると、粗コラーゲン沈殿物の含水率が高すぎるため脱水効率が悪く、乾燥すると微細かつ多孔質のコラーゲン粉末とならずにフィルム状になる場合がある。一方、５０質量％以上の粗コラーゲン沈殿物を調製することは容易でない。なお、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物以外の主成分は、沈殿前のコラーゲン溶液やコラーゲン誘導体溶液を構成する水溶液である。
【００５０】
（ｉｉｉ）粗コラーゲン沈殿物の調製方法
本発明では、等電点沈殿や塩析で得たコラーゲン沈殿物を粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。等電点沈殿物の調製工程において塩析も行われるため、以下、等電点沈澱物を調製する場合で粗コラーゲン沈殿物の調製方法を説明する。また、本発明では、Ｉ〜ＸＸＩＸ型のいずれのコラーゲンも使用可能であるが、生体からＩ型コラーゲンを抽出する場合で以下に説明する。
【００５１】
本発明で使用するコラーゲンは、ウシ、ブタ、鳥、魚などの動物の皮膚やその他のコラーゲンを含む組織から採取することができる。一般に、コラーゲンは、動物の結合組織に多く含まれるが、熱処理によって抽出するとコラーゲンが熱変性して特有の三重螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。本発明では、三重螺旋構造を構成しうるコラーゲンを使用する。このようなコラーゲンの抽出法として、動物の骨、皮などを材料として、アルカリ処理や酸処理、酵素処理による可溶化法等がある。より好ましくは、コラーゲンの抽出原料として、ウシ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウマ、魚類等の真皮や腱がある。胎児由来などの若い動物の組織を使用すると収率が向上するためより好ましい。
【００５２】
（ｉｉｉ−１）等電点ｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物
例えば、原料となる不溶性コラーゲンとして、石灰漬け後の床皮を洗浄し、ハムスライサーで約１０ｃｍ角に細切、ミンチ後さらに機械的にすり潰したものを、アセトン、エーテルなどの有機溶剤あるいは脂肪分解酵素使用して脱脂後、十分に洗浄したものを使用することができる。
【００５３】
終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミンとなるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５質量％となるように不溶性コラーゲンを懸濁し、１８℃、３週間可溶化処理を行う。可溶化反応停止後、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウム等の塩を加えて塩析し、塩酸等で酸性に調製した水溶液に塩析沈澱を再溶解し、および布、ろ紙、金属メッシュ等で濾過して精製し、このコラーゲン溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ４．５となるよう調整すれば、等電点４．５の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。なお、平均粒子径は、上記コラーゲン溶液を撹拌しつつｐＨ４．５の等電点沈殿や塩析を行うことで１〜１，０００μｍに調整することができる。このような平均粒子径の制御方法は、（ｉｉｉ−２）、（ｉｉｉ−３）、（ｉｉｉ−４）でも同様である。
【００５４】
（ｉｉｉ−２）等電点ｐＨ４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿物
上記（ｉｉｉ−１）で調製した不溶性コラーゲンに、コラーゲン終濃度１質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整し、コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行い、酵素反応を停止して酵素可溶化コラーゲン液を得る。この酵素可溶化コラーゲンを終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミン水溶液に懸濁し、所望の時間アルカリ処理を行うことで沈殿物を得ることができる。より具体的には、４時間のアルカリ処理で等電点が７．８へと低下し、１日のアルカリ処理により等電点が５．６にまで低下する。所望の等電点となった時に、塩酸を加えて反応を停止し、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収する。回収した塩析沈殿物を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を得る。次に、このコラーゲン溶液を、布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムで所望の等電点のｐＨとなるよう調整すれば、等電点４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。なお、酵素可溶化コラーゲンに代えて、不溶性コラーゲンを使用し、終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミン水溶液に懸濁し、上記と同様に処理しても等電点ｐＨ４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿を得ることができる。
【００５５】
（ｉｉｉ−３）コラーゲン誘導体からなる粗コラーゲン沈殿物
上記（ｉｉｉ−１）で調製した不溶性コラーゲンや（ｉｉｉ−１）記載のアルカリ可溶化コラーゲン、（ｉｉｉ−２）に記載の酵素可溶化コラーゲンをアシル化あるいはエステル化して、等電点ｐＨ４．５〜９．０のコラーゲン誘導体を得て、これをアシル化やエステル化などの誘導体処理を行い、次いで塩析等により粗コラーゲン沈殿物を得る。例えば、等電点９．０の酵素可溶化コラーゲンをアシル化した場合、コラーゲンのアミノ基が修飾されて等電点が酸性側へとシフトする。また、例えば、等電点４．５のアルカリ可溶化コラーゲンをエステル化した場合、コラーゲンのカルボキシル基が修飾されて等電点が塩基性側へとシフトする。所望の等電点となった時に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収する。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を得る。次に、このコラーゲン溶液を布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムで所望の等電点のｐＨとなるよう調整することで、等電点４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。
なお、コラーゲン分子中のカルボキシル基を、カルボン酸クロライドに誘導し、前記アルコール類の水酸基と酸クロライドの脱塩酸反応によってもエステル化を行うこともできる。
【００５６】
(ｉｖ)等電点
上記したように、コラーゲンやコラーゲン誘導体の等電点は、可溶化方法やその他によって調整することができる。本発明では、等電点がｐＨ３．５〜８．０のコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を対象とする。これらは等電点沈殿物として得ることができ、例えば、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液をｐＨ３．５〜８．０に調整して得たコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を使用することができる。なお、等電点とは、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する水溶液でコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が最小の溶解度を示す溶液のｐＨを意味する。一般に、コラーゲンの等電点は、ｐＨ４．３〜９．３であるが、ｐＨ４．３未満の溶液でも沈殿物が形成されうるため、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液をｐＨ３．５以上とした。本発明は、本来、沈殿しやすいコラーゲンやコラーゲン誘導体の溶解性を確保する点に特徴があり、等電点がｐＨ４．０〜８．０、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ４．５〜６．０、特に好ましくは４．５〜５．０である。
【００５７】
なお、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体含有溶液をｐＨ４．５に調整して回収した粗コラーゲン沈殿物は等電点がｐＨ４．５であり、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体含有水溶液をｐＨ６．０に調整して回収した粗コラーゲン沈殿物の等電点はｐＨ６．０となる。本願発明で使用する「粗コラーゲン沈殿物」としては、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物や、等電点がｐＨ８．０の粗コラーゲン沈殿物に限定されず、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物と等電点がｐＨ８．０の粗コラーゲン沈殿物の混合物などであってもよい。
【００５８】
（３）コラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は、使用する粗コラーゲン沈殿物の等電点や平均粒子径に依存した等電点や平均粒子径を有する。このため、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物を使用した場合には、等電点ｐＨ４．５のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となり、等電点がｐＨ６．０の粗コラーゲン沈殿物を使用した場合は、等電点がｐＨ６．０のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となる。更に、例えば、等電点がｐＨ４．５〜６．０のコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の混合物を使用した場合には、等電点がｐＨ４．５〜６．０のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となる。
【００５９】
コラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の平均粒子径に限定はないが、平均粒子径１〜１，０００μｍの粗コラーゲン沈殿物等を使用することで、最終的に平均粒子径が８〜１，０００μｍ、好ましくは１０〜１０００μｍ、より好ましくは３０〜９５０μｍ、更に好ましくは３０〜９００μｍ、特に好ましくは３０〜８００μｍのコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末である。上記したように、会合により通常は２０００μｍ以上となり、噴霧乾燥によれば５μｍ未満となる。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、平均粒子径が８〜１，０００μｍであるから、微細にすぎずに飛散を防止でき、かつ流動性を確保することができる。しかも、後記する実施例に示すように、コラーゲン粉末の平均粒子径が５μｍ未満であると溶解液中でダマを形成し溶解性を低下させる場合があるが、上記範囲であればダマの形成がなく溶解性に優れる。なお、本願明細書において、粗コラーゲン沈殿物、コラーゲン粉末、コラーゲン誘導体粉末の平均粒子径は、電子顕微鏡によって測定した値である。電子顕微鏡像の長径をもってコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の粒子径とし、十視野に含まれる全てのコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉の粒子径を平均し、平均粒子径とした。
【００６０】
しかも、平均粒子径が上記範囲であるにも係わらず、平均粒子径が５μｍ未満の噴霧乾燥したコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末と同程度の比表面積を有し、親水性、溶解性に優れる。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒で分散したため、溶媒中にコラーゲンが微細に分散し、得られる沈殿物が多孔質となり、比表面積が拡大することが判明した。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末の比表面積は、０．５ｍ２／ｇ以上、好ましくは０．８〜３０ｍ２／ｇ、より好ましくは以上、１．０〜２５ｍ２／ｇ、特に好ましくは１．２〜２０ｍ２／ｇ、更に好ましくは１．５〜２０ｍ２／ｇである。このような比表面積によって、親水性、溶解性が確保される。
【００６１】
本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、前記粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする。好ましくは０．３ｍｇ／分以上、より好ましくは０．５ｍｇ／分以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／分以上である。本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、上記したようにｐＨ６．５の溶液に対する溶解性で評価されるが、溶解性を特定するためにｐＨ６．５に限定したに過ぎず、後記する実施例に示すようにｐＨ５．５〜８．２の溶解液に対する溶解性に優れる。なお、本発明において「溶解初速度」は、後記する実施例に示す方法で測定したものである。
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末が上記中性溶液で溶解性に優れる理由は明確ではないが、「等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物」を使用することが一因と考えられる。乾燥前のコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の平均粒子径が１〜１，０００μｍであるため、得られるコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末も微細となる。また、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させて乾燥させると、溶媒中にコラーゲンが微細に分散し、得られる沈殿物が多孔質となる。この多孔により表面積が拡大し、更に溶解が速やかに行われたためと考えられる。従来は、等電点ｐＨ４．０〜８．０のコラーゲンは、中性溶液での溶解性が十分でないため、一旦、その等電点より酸性側の溶液に溶解し、次いでアルカリを添加してｐＨ５．５〜８．５に調整する必要があった。本発明では、例えば等電点がｐＨ４．５のコラーゲン粉末の場合、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液に速やかに溶解するためより酸性の強い酸に溶解する必要がなく、従って、その後のアルカリの添加も不要である。溶解操作が簡便であるばかりでなく酸とアルカリとによる塩類の形成を回避することができる。また、アルカリに溶解する必要がないため、コラーゲンのペプチド化を回避することができ、三重螺旋構造の含有率の高いコラーゲン溶液を製造することができる。
【００６２】
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、前記凝集体やコラーゲン線維が元のコラーゲン分子やコラーゲン誘導体分子となって溶解する。従って、この溶液を従来の方法で等電点沈殿させ、または塩析させると、平均粒子径が１，０００μｍより大きい、すなわち従来の２，０００μｍのコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を生成することができる。
【００６３】
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は耐熱性に優れ、乾燥物であるから従来のコラーゲン溶液のように冷蔵保存する必要がない。なお、本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末１質量部に対する溶解液量は特に限定がない。本発明のコラーゲン粉末を溶解させず湿潤させて使用する場合もあるからである。
【００６４】
（４）用途
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は、医療用途や化粧用用途などに好適に使用することできる。例えば、化粧用用途としては、化粧水、乳液、美容液、一般クリーム、クレンジングなどの洗顔料、パック、ひげそり用クリーム、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼けローション、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、口紅、リップクリーム、シャンプー、リンスなどを例示することができる。
【００６５】
また、化粧品以外にも、食品、医薬品などの用途にも有効に使用することができる。例えば、医療用途としては、再生医療に用いられるＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の担体、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞など各種細胞の培養基材、止血剤、褥創治療剤、骨充填剤などを例示することができる。
【００６６】
（５）コラーゲン担持物
本発明のコラーゲン担持物は、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材に担持させてなる。
基材としては、紙や布、これらの複合材を好ましく使用することができる。紙基材としては、天然紙のほか合成樹脂からなる合成紙であってもよい。また、布としては木綿、絹、羊毛などやこれらの混合物の織物のほか不織布などであってもよい。更に、紙に布を貼り合わせた複合材であってもよい。
その形状は、円形、方形その他の多角形であってもよく、不定形であってもよい。例えば、基材が顔面の形状に成形されたものであれば、パック剤として使用することができる。
【００６７】
基材に対するコラーゲン粉末の担持量は、基材１ｃｍ２あたり、５０μｇ〜１５ｍｇ、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ、より好ましくは０．５〜１．５ｍｇである。１５ｍｇを上回ると基材への均一な担持が困難となる場合がある。一方、５０μｇを下回ると、コラーゲンの作用が十分に発揮されない場合がある。
【００６８】
本発明のコラーゲン担持物は、前記基材にｐＨ５．５〜８．５の溶解液を含浸させると担持されたコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末が速やかに溶解し、コラーゲン溶液含浸基材となる。このコラーゲン溶液含浸基材を皮膚に添付すれば、皮膚にコラーゲン溶液を塗布することができる。前記基材は、皮膚に貼付してもよいが、コラーゲン溶液含浸基材を押圧してコラーゲン溶液のみを皮膚に塗布してもよい。
【００６９】
本発明のコラーゲン担持物では、前記したコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末に加えて、プラセンタエキス、コウジ酸、ルシノール、アルブチン、エラグ酸、カミツレエキスなどの美白成分、紫外線吸収剤、他の機能成分を安定に配合するための溶媒、その他を適宜配合することができる。
【００７０】
他の機能成分としては、一般的に化粧料に添加される種々の成分が使用可能であり、例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ブタンジオール、ペンタンジオール、ポリエチレングリコール、尿素、乳酸塩、ピロリドンカルボン酸塩等の保湿剤、メチルパラベンなどの保存料、アロエエキス等の植物抽出物、ビタミンＡ、Ｂ２、Ｂ６、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、パントテン酸等のビタミン類、グリチルリチン等の抗炎症剤、オリーブ油等の油脂類、脂肪酸類、アミノ酸が挙げられる。
【００７１】
（６）絆創膏
本発明のコラーゲン担持物は、粘着テープの一部に添付することで、絆創膏として使用することができる。
絆創膏として使用する場合には、前記コラーゲン担持物に、塩化ベンザルコニウムなどの殺菌消毒剤などを配合することができる。
絆創膏として使用する場合、添付されたコラーゲン担持物に溶解液を含浸させてもよく、溶解液を使用しなくてもよい。例えば、溶解液を使用せず、乾いた状態でコラーゲン担持物を傷口に添付すると、絆創膏の基材に担持されたコラーゲンがリンパ液に溶解してゲル化するため、絆創膏からのリンパ液の遺漏を防止することができる。三重螺旋構造を呈する未変性コラーゲンは、皮膚細胞の接着性に優れ、かつ動物間で相同性が高いため免疫反応を起こしにくく、好適である。
【００７２】
（７）コラーゲンキット
（ｉ）キット
本発明の可溶性コラーゲンキットは、上記コラーゲン担持物、または上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなる。
前記したように、本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液に速やかに溶解するため、必要時に溶解液を添加して溶解し、コラーゲン溶液を調製することができる。従来は、コラーゲン溶液は、熱安定性が低いため冷蔵保存を必要とされていたが、本発明によれば、室温保存が可能となる。なお、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を使用する場合には、容器に入れたコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末に溶解液を投入して溶解させ、これを皮膚などに投与することができ、容器に代えて手のひらにコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を投入し、これを溶解液で溶解し、コラーゲン溶液として使用してもよい。
【００７３】
また、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末に代えて、コラーゲン担持物を使用する場合には、コラーゲン担持物の基材に溶解液を含浸させ、調製されたコラーゲン溶液のみを皮膚に塗布してもよく、コラーゲン溶液含浸基材をそのまま皮膚に添付してパック剤として使用することもできる。パック剤として使用する場合には、基材として不織布などを好適に使用することができる。
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末やコラーゲン担持物は、一回の使用量ごとに個別包装されていてもよく、同様に、溶解液も個別包装されていてもよい。このような溶解液の個別包装容器にコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末またはコラーゲン担持物を添加してコラーゲン溶液を調製してもよい。コラーゲンは吸湿性があるため、ガスバリア性の個別容器などに収納することが好ましい。
【００７４】
（ｉｉ）溶解液
本発明のコラーゲンキットを構成する溶解液としては、ｐＨ５．５〜８．５、より好ましくはｐＨ５．５〜８．５、特に好ましくはｐＨ５．５〜７．５の溶液である。ｐＨの調整は、無機または有機酸によって行うことができ、緩衝液であってもよい。なお、溶解液のｐＨは、使用するコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の等電点などに応じて適宜選択することができる。
【００７５】
さらに、本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末が化粧品に使用される場合を考慮して、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、デキストリンなどの(保湿剤)、クエン酸ナトリウムなどの有機酸塩からなるｐＨ調整剤、フェノキシエタノール、メチルパラベンなどの保存料、オクチルドデセスなどの界面活性剤、エタノールなどのアルコール類などを含有してもよい。上記アルコールの含有量は３０質量％以下であることが好ましく、界面活性剤は２．５質量％以下、有機酸塩は５質量％以下であることが好ましい。
【００７６】
なお、溶解液に前記したプラセンタエキス、コウジ酸、ルシノール、アルブチン、エラグ酸、カミツレエキスなどの美白成分、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、フェノキシエタノール等の保存料（防腐剤）、ブタンジオール、ペンタンジオール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、尿素、乳酸塩、ピロリドンカルボン酸塩等の保湿剤、アロエエキス等の植物抽出物、ビタミン類、抗炎症剤、オリーブ油等の油脂類、脂肪酸類、アミノ酸などを添加してもよい。
【００７７】
（８）コラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の製造方法
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させて調製することができる。乾燥方法に限定はないが、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の平均粒子径や形状を維持したまま乾燥することが好ましい。平均粒子径が８〜１，０００μｍであり、溶解性に優れるコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末が得られるからである。より好ましくは、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取した後に乾燥する方法である。粗コラーゲン沈殿物の脱水が簡便で風乾により粉末化しうる点で優れる。具体的には、コラーゲン含有溶液を、コラーゲンの会合を制御しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱させ、または塩析して平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥して製造する。なお、コラーゲン誘導体粉末を製造するには、等電点ｐＨ４．５〜９．０のコラーゲン沈殿物にエステル化やアシル化などの修飾処理を行い、ｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱し、または塩析などにより濃度１２〜５０質量％の粗コラーゲン誘導体を得て、これを親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することで製造することができる。なお、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の平均粒子径や形状を維持したまま乾燥することができれば、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させた後に固形物を分取しこれを凍結乾燥などによって乾燥してもよい。凍結乾燥その他の乾燥方法は、従来公知の方法を採用することができる。よって、以下、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取した後に乾燥する方法について説明する。
【００７８】
（ｉ）粗コラーゲン沈殿物の生成
コラーゲン溶液を等電点沈殿させ、または塩析させると、一般には、コラーゲンの会合によって平均粒子径が約２，０００μｍのコラーゲン沈殿物となって沈殿するが、コラーゲン分子の会合を抑制し、または物理的に粉砕することで平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物からなる粗コラーゲン沈殿物を調製することができる。
【００７９】
平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン沈殿物を得るには、コラーゲン沈殿物が生成する前とコラーゲン沈殿物が生成した後の双方を撹拌することが好ましい。コラーゲン沈殿物の生成前には、コラーゲン分子の会合を阻止して線維長の短いコラーゲン線維を生成させることができ、かつコラーゲン沈殿物の生成後には、コラーゲン線維の会合を阻止し凝集体の生成を抑制することができる。なお、マスコロイダーなどの石臼式磨砕機を使用する場合は、撹拌と同時に沈殿物の破砕が行われる点で好ましい。コラーゲン溶液から生成した沈殿物を破砕して粒子径を小さくすることができるからである。更に、塩析または等電点沈殿による沈殿物を得た後に、溶液ごと石臼式磨砕機などで前記沈殿物を破砕してもよい。溶液中であるから、沈殿物を加熱することなく破砕することができ、凝集体の会合を分離し、沈殿物の粒子径を小さくすることができる。
【００８０】
撹拌や破砕の程度としては、溶液のコラーゲンやコラーゲン誘導体の濃度、撹拌方法、撹拌容器の形状やサイズなどによって適宜選択することができるが、前記したように、ホモジナイザーを使用する場合には回転数１，０００〜２０，０００ｒｐｍ、より好ましくは２，０００〜１３，０００ｒｐｍ、特に好ましくは２，５００〜１０，０００ｒｐｍ、特に好ましくは３，０００〜５，０００ｒｐｍで撹拌する。撹拌時間は、回転数などに応じて適宜選択することができ、１分〜５時間、より好ましくは１分〜３時間、特に好ましくは３分〜１時間、更に好ましくは５分〜３０分である。実際の粒子径を測定し、撹拌強度を変化させることで所望の平均粒子径のコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を得ることができる。なお、本発明では、コラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の破砕は、上記したようにコラーゲン溶液中で行うことが好ましい。沈殿物を溶液から分離する工程が不用であり、かつ破砕効率に優れるからである。
【００８１】
なお、本発明では、コラーゲン分子の会合を抑制する方法として前記した会合阻止剤を添加してもよく、例えば、コラーゲン溶液に酸性条件下でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などの会合阻止剤を加えると、ＡＴＰの添加によって、３００ｎｍのＳＬＳ線維が生成され、複数のＳＬＳ線維が会合してなる凝集体を沈殿物として得ることができる。本発明では、会合阻止剤の添加と共に、コラーゲン溶液を撹拌して物理的に会合を抑制してもよい。撹拌によりＳＬＳ線維の凝集体を破砕し、沈殿物の粒子径をより短径に調整することができる。
【００８２】
本発明では、コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％の等電点沈殿物を粗コラーゲン沈殿物として使用する。含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２質量％に満たない場合には、遠心分離やろ過などによって回収した等電点沈殿物を再度等電点沈殿と同じｐＨに調整した水で洗浄して脱塩し、再度遠心分離やろ過などを行い粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。
【００８３】
同様に塩析によって沈殿物を生成した場合には、再び塩析と同じ塩濃度の水で洗浄した後に、再度遠心分離やろ過などを行い粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。なお、等電点沈殿物や塩析物の単回の遠心分離やろ過などによって上記濃度になった場合には、このような遠心分離やろ過が、同時に濃度調整工程となっており、特段の濃度調整工程を行う必要はない。
【００８４】
（ｉｉ）親水性有機溶媒への分散
前記粗コラーゲン沈殿物を前記親水性有機溶媒に分散させることで粗コラーゲン組成物を簡便に脱水し、かつ精製することができる。前記した粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒としては、水と混和しうる炭素含有溶媒であればよく、特に制限されず、例えばアルコール、ケトン、エーテル、エステル、極性非プロトン性溶媒などが挙げられる。
【００８５】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ‐ブタノール等の炭素数１〜６の一価アルコールやエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコールなどがある。ケトンとしてはアセトン、メチルエチルケトンなどがある。また、エーテルとしてはジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル等のグリコールエーテルや、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテルなどがある。更に、エステルとしては酢酸エチル、乳酸エチルなどがあり、極性非プロトン性溶媒としてはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジンなどがある。中でも好ましくは水と任意の割合で混和しうるもの、例えばアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。中でも、エタノール、アセトン、ジエチルエーテルまたはこれらの混合液を好適に使用することができる。
【００８６】
使用する親水性有機溶媒の温度は、１５℃以下であることが好ましい。可溶化コラーゲンやコラーゲン誘導体を変性させず、三重螺旋構造を維持するためである。
粗コラーゲン沈殿物に対する前記親水性有機溶媒の使用量は、使用する親水性有機溶媒によって適宜選択することができるが、例えば、エタノールを使用する場合は、前記粗コラーゲン沈殿物１質量部に対して、エタノールを３〜２０００質量部、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、特に好ましくは１０〜３０質量部添加することが好ましい。
【００８７】
なお、粗コラーゲン沈殿物を分散させた親水性有機溶媒において、前記親水性有機溶媒の濃度は７５質量％以上であることが好ましく、より好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９５質量％以上である。粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させたコラーゲン分散液における親水性有機溶媒の濃度が７５質量％を下回ると、親水性有機溶媒から回収したコラーゲンが吸湿しているため、長時間の乾燥時間を必要とし、かつ乾燥中にコラーゲン分子が相互に密着するため、微細かつ多孔質のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末とならない場合がある。
【００８８】
粗コラーゲン沈殿物は、親水性有機溶媒に分散した後にこれを撹拌してもよい。この際、ホモジナイザーを使用する場合は、会合を防止しつつ粗コラーゲン沈殿物を調製する際と同様の撹拌条件で親水性有機溶媒を撹拌してもよく、この条件は、撹拌装置の撹拌方法、実際の分散の程度に応じて適宜、選択することができる。なお、撹拌により熱が発生するため、冷却しながら撹拌することが好ましい。
（ｉｉｉ）固形物の分取
親水性有機溶媒に分散させた粗コラーゲン沈殿物は、溶媒中で沈殿する。本発明では、この沈殿物を分取するため、親水性有機溶媒分散液を濾過し、または遠心分離などの分離手段によってコラーゲン沈殿物を分取する。このような親水性有機溶媒による分散および分取は、１回で十分であるが、２〜３回など複数回行ってもよい。
【００８９】
（ｉｖ）乾燥
前記固形物を乾燥し、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を得ることができる。親水性有機溶媒に分散させた後に得た固形物は、室温で風乾することができる点に特徴がある。乾燥機を用いるなど他の方法で乾燥してもよいが、その際、温度は１５℃未満とすることが好ましい。
【００９０】
前記粗コラーゲン沈殿物を構成するコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物は、平均粒子径が１〜１，０００μｍと従来よりも短いため、単位質量あたりの表面積が広く、親水性有機溶媒による脱水が容易であること、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％であるため、親水性有機溶媒に含まれる水分量を低減させ、風乾による乾燥によってコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の粉末化を可能にしたと考えられる。しかも、風乾によれば加熱処理を回避し、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の熱変性を防止することができる。これにより、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の溶液は、三重螺旋構造を呈する。なお、本発明では、このようにして得られたコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を、さらにミルなどで破砕して粒子径を調整してもよい。
【００９１】
従来から、コラーゲンの精製方法としては、酸性のコラーゲン溶液に塩類を添加して沈殿させる塩析方法、有機溶媒を添加する有機溶媒沈殿法、酸もしくはアルカリを添加する等電点沈殿法などが知られている。しかしながら、等電点がｐＨ３．５〜８．０のコラーゲン溶液の等電点沈殿物に親水性有機溶媒を添加してコラーゲンを粉末化した例は存在しかなった。コラーゲンは本来親水性が高く等電点沈殿物にも多量の水が存在するため、凍結乾燥などによって固形物とすることが一般的だからである。むしろ、前記特許公報６の比較例１では、アテロコラーゲンを塩析したコラーゲンの沈殿物をエタノールで洗浄することを試みているが、コラーゲン繊維の中に食塩を含んだ水を抱き込んでいるため脱水ができなかったと記載している。しかしながら、本発明では、等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を、平均粒子径が１〜１，０００μｍに制御することで、親水性有機溶媒への分散を容易におこなうことができる。
更に、コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させても、コラーゲン濃度が低い場合には親水性有機溶媒による脱水が困難で、沈殿物がペレット状に固化し、粉末状の乾燥物を得ることができなかったが、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％であれば、親水性有機溶媒による脱水を効率的に行うことができ、このため、親水性有機溶媒から分取した固形分の含水率を極めて低く調整できる。しかも、これらを室温で乾燥することで微細なコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を調製することができたのである。加えて、親水性有機溶媒に分散させる前のコラーゲン沈殿物は、平均粒子径が１〜１，０００μｍであるため、これを風乾すると平均粒子径が８〜１，０００μｍのコラーゲン粉末となる。本発明では、上記コラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末を更に微細に加工するなどの処理を行ってもよい。
【００９２】
なお、コラーゲン溶液を長時間かけて室温で乾燥させるとコラーゲンの乾燥物を得ることができるが、容器の壁などにコラーゲンやコラーゲン誘導体が付着し、フィルム状や板状またはブロック状になる。本発明の特徴は、風乾によりコラーゲン粉末を得られる点にある。また、コラーゲン濃度が０．１〜１０質量％である溶解液をノズルの吐出孔を経て親水性有機溶媒に投入してコラーゲン繊維を沈殿させると、得られるコラーゲン繊維の表面には多孔が形成されず表面が平滑なフィルム状になる。
【００９３】
（９）コラーゲン担持物の製造方法
本発明のコラーゲン担持物は、前記粗コラーゲン沈殿物の親水性有機溶媒分散液と基材とを接触させる湿式法と、前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材の接触させる乾式法とによって製造することができる。
【００９４】
（ｉ）湿式製造法
本発明のコラーゲン担持物は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することで製造することができる。より具体的には、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５〜６．０で等電点沈澱させて平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥してもよい。また、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、ｐＨ３．５〜６．０で等電点沈澱させ、前記沈殿を破砕して平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥してもよい。
【００９５】
具体的には、前記粗コラーゲン沈殿物を前記親水性溶媒に分散させる。分散方法は、例えば、ミキサーやホモジナイザーを使用することができる。親水性溶媒の使用量は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の製造方法と同様であり、使用する親水性有機溶媒によって適宜選択することができるが、例えば、エタノールを使用する場合は、前記粗コラーゲン沈殿物１質量部に対して、エタノールを３〜２０００質量部、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、特に好ましくは１０〜３０質量部添加することが好ましい。
【００９６】
ついで、紙や布などの基材を使用し、前記親水性有機溶媒分散液を前記基材で濾過して基材にコラーゲンを担持させる。基材への担持方法としては、前記基材をコラーゲンの親水性有機溶媒分散液に含浸させてもよく、基材にコラーゲンの親水性有機溶媒分散液を塗工し乾燥させる方法、その他であってもよい。基材に対するコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の担持量は、基材１ｃｍ２あたり、５０μｇ〜１５ｍｇ、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ、より好ましくは０．５〜１．５ｍｇである。１５ｍｇを上回ると基材への均一な担持が困難となる場合がある。一方、５０μｇを下回ると、コラーゲンの作用が十分に発揮されない場合がある。
【００９７】
次いで、基材に担持したコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を乾燥する。本発明では、親水性有機溶媒によってコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が脱水されているため、室温で前記基材に担持したコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を乾燥しうる点に特徴がある。ただし、他の方法で乾燥してもよい。その際、温度は１５℃未満とすることが好ましい。
【００９８】
上記方法によれば、基材の表面にコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が薄く塗布されるため、コラーゲンの乾燥が容易である。また、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体以外を含ませることなく基材に担持できるため、特に医療用途で好適である。
【００９９】
（ｉｉ）乾式製造法
一方、予めコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を調製し、バインダーを介して基材に塗工してもよい。
このようなバインダーとしては、カラギーナン、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アルギン酸、澱粉およびその誘導体、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースやヒドロキシアルキルセルロースなど）などの水溶性高分子多糖類やポリビニルアルコール（ＰＶＡ）や変性ＰＶＡ、不飽和ジカルボン酸を共重合したもの、アクリル酸およびその誘導体、ポリエーテル（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなど）などの水溶性ポリマーなどを例示することができる。バインダーの配合量は使用するバインダーの種類によって適宜選択することができる。
【０１００】
基材に対するコラーゲン粉末の担持量は、湿式法と同様に、基材１ｃｍ２あたり、５０μｇ〜１５ｍｇである。
次いで、基材に担持したコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を乾燥する。バインダーの種類や配合量によって異なるが、室温で乾燥することができる。ただし、送風その他の方法で乾燥してもよい。その際、温度は１５℃未満とすることが好ましい。
上記方法によれば、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末に他の配合物を含有させる場合に好適である。
【実施例】
【０１０１】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【０１０２】
（実施例１）
（１）豚皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲンを原料とした。終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミンとなるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５質量％となるよう調製した不溶性コラーゲンを懸濁し、１８℃、３週間可溶化処理を行った。上記のようにして得たアルカリ可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収した。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度３質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解した。次に布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムでｐＨ４．５となるよう調整し、マスコロイダー（石臼式磨砕機：増幸産業社製）にて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１４１μｍであった。次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、再びｐＨ４．５に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３０質量％であった。得られたコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を図１に示す。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
【０１０３】
（２）得られたコラーゲン粉末を電子顕微鏡像により観察した。結果を図２に示す。粉末コラーゲンの平均粒子径は１５８μｍで、多孔質な粉体であることが判明した。表１に実施例１の概要および結果を示す。
【０１０４】
（３）得られたコラーゲン粉末の変性温度を示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定した。結果を図３および表２に示す。対照として実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲン溶液の結果も示す。粉末コラーゲンでは１１２．４℃に大きな熱量変化のピークが確認された。
（４）得られたコラーゲン粉末５ｍｇを１０ｍＭ酢酸１ｍｌに再溶解し、５ｍＭ酢酸で終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調製したコラーゲン溶液の円二色性（ＣＤ）を２０℃で測定した。結果を図４に示す。対照として実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲン溶液（未変性コラーゲン）および前記アルカリ可溶化コラーゲン溶液を温度１００℃で３分間熱変性させたアルカリ可溶化コラーゲン溶液（変性コラーゲン）の結果も示す。再溶解したコラーゲン溶液（本発明のコラーゲン粉末）は、未変性コラーゲンのカーブと略一致し、２０℃において三重らせん構造を維持していることが明らかとなった。
【０１０５】
（５） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを表３に示す組成の溶解基準液、溶解液Ａ、溶解液Ｂ、溶解液Ｃ、溶解液Ｄそれぞれ１ｍｌに添加して溶解性を評価した。
【０１０６】
（６） また、溶解液Ｂを用いて溶解初速度を測定した。コラーゲンは親水性が高く、溶解と膨潤との相違が不明確であるため、溶解初速度の測定は以下に従った。
【０１０７】
溶解初速度の測定
内径１０ｍｍ、長さ４０ｍｍ、容量２ｍｌの円筒形チューブに、サンプル５ｍｇを表１の溶解液Ｂ １ｍｌと共に混合して密栓し、１分間に２０回の１８０℃の転倒混和を行った。なお、溶解液Ｂおよび操作は、温度２０℃にて行った。混和後、２分、４分、６分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分にその一部をサンプリングし、５，０００ｒｐｍで遠心した上澄み液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルをＣＢＢで染色した。脱色後、コラーゲンのバンドの濃度を画像解析ソフト（ＮＩＨ ｉｍａｇｅ）を用いて定量し上澄み液のコラーゲン濃度を算出した。ついで、経過時間とコラーゲン濃度との関係から、溶解初速度を算出した。なお、溶解初速度は、混和０時から１０分以内の直線性のある時間で算出した。
表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。なお、表４において、◎は４５分未満に溶解した場合、○は４５分以上９０分未満内に溶解した場合、△は９０分以上１８０分未満内で溶解した場合、×は１８０分以内には溶解しない場合を示す。
また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１０８】
（７）上記（１）で調製した固形コラーゲンを、中央化工機株式会社製、製振動乾燥機ＶＵ−４５を使用し、真空度４０Ｔｏｒｒ乾燥温度４０℃で４時間乾燥し、コラーゲン粉末を得た。このコラーゲン粉末について、４連式比表面積・細孔分布測定装置（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ製、商品名「ＮＯＶＡ−４２００ｅ型」）を用い、ＢＥＴ１点法にて比表面積を測定した。結果を表６に示す。
【０１０９】
（８）上記（７）で調製したコラーゲン粉末について、レーザー回折・散乱法にて粒度分布を測定した。測定は、（株式会社セイシン企業製、商品名「ＬＭＳ−２０００ｅ」）を用いた。このコラーゲン粉末の平均粒子径を表６に、粒度分布を図６に、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図７に示す。
【０１１０】
（実施例２）
（１） 粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒をアセトンに変更した以外は実施例１と同様に操作してコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例２の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
【０１１１】
（実施例３）
（１） 粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒をジエチルエーテルに変更した以外は実施例１と同様に操作してコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例３の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
【０１１２】
（実施例４）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物１ｇを温度２０℃のエタノール９９９ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、コラーゲンを均一に分散させた分散液２０ｍｌを直径５０ｍｍの紙基材を濾紙として使用し、前記紙基材でコラーゲン沈殿物を濾取し、この紙基材を室温で乾燥させてコラーゲン担持物を作製した。
（２） 溶解液量を２ｍｌに変更した以外は実施例１と同様にして、得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、溶解性を評価した。表１に、実施例４の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
【０１１３】
（実施例５）
（１） 実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調製し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。その後、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍの条件で等電点沈澱を破砕した。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は７２４μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調製した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２７質量％であった。
【０１１４】
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例５の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１１５】
（実施例６）
（１） 実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調製し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。その後、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍの条件で、３回等電点沈澱を破砕した。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は３３５μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調製した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２８質量％であった。
【０１１６】
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例６の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。
【０１１７】
（実施例７）
実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲンの等電点沈殿物（等電点ｐＨ４．５）をメタノール中に分散し、終濃度０．１Ｍとなるように塩酸を加えた。室温で３時間撹拌しながらエステル化反応を行い、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを中性にして反応を停止させると共にコラーゲンを沈澱させた。沈殿物を遠心して分取した後、１０ｍＭの酢酸に再溶解し、メチルエステル化コラーゲンを得た。メチルエステル化コラーゲンの等電点はｐＨ７．９であった。
【０１１８】
メチルエステル化コラーゲン溶液に、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えてホモジナイザーで撹拌しながら塩析し、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は２４４μｍであり、コラーゲン濃度は２９質量％であった。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物０．５ｇを温度２０℃のエタノール９．５ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾してコラーゲン粉末を得た。表１に、実施例７の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。
【０１１９】
（実施例８）
牛皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲンを原料とした。不溶性コラーゲンをコラーゲン終濃度２質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整した。コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行った。この酵素可溶化コラーゲン液（等電点ｐＨ９．０）に水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ８〜９に調整し、コラーゲンを等電点沈澱させた。この等電点沈澱分散液に終濃度０．５ｍＭとなるように無水コハク酸を加え、室温で撹拌しながら１時間アシル化反応を行った。反応後、塩酸を加えて溶液を酸性にし、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えて反応を停止させると共にサクシニル化コラーゲンを沈澱させた。沈殿物を遠心して分取した後、サクシニル化コラーゲンを１０ｍＭの酢酸に再溶解し、サクシニル化コラーゲンを得た。サクシニル化コラーゲンの等電点は５．４であった。
【０１２０】
サクシニル化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えてホモジナイザーで撹拌しながら塩析させ、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１６７μｍであり、コラーゲン濃度は４２質量％であった。
【０１２１】
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物０．５ｇを温度２０℃のエタノール９．５ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。表１に、実施例８の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。
【０１２２】
（比較例１）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度１質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液を凍結乾燥し、コラーゲンスポンジを作製した。図８に、コラーゲンスポンジの電子顕微鏡像を示す。
（２） 得られたコラーゲンスポンジ５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例１の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１２３】
（比較例２）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度０．２５質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液をアクリル板にキャストし、風乾することによりコラーゲンフィルムを作製した。図９に、コラーゲンフィルムの電子顕微鏡像を示す。
（２） 得られたコラーゲンフィルム５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例２の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。
【０１２４】
（比較例３）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度１質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液を２７ゲージの注射針を用いてエタノール中に吐出し、その後風乾することによりコラーゲン繊維を作製した。図１０に、コラーゲン繊維の電子顕微鏡像を示す。
（２） 得られたコラーゲン繊維５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例３の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。
【０１２５】
（比較例４）
（１） 豚皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲン線維を原料とした。不溶性コラーゲン線維をコラーゲン終濃度２質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整した。コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行った。酵素反応停止後、上記のようにして得た酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収した。
回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解した。次に布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムでｐＨ９．０となるよう調整し、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１３１μｍであった。次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ９．０に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２３質量％であった。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。得られたコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図１１に示す。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例４の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。
【０１２６】
（比較例５）
（１） 実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調整し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１，８５８μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３３質量％であった。得られたコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を図１２に示す。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過した。しかし、濾過したコラーゲン分散物はフィルム状となり、粉末にはならなかった。
（２） 得られたコラーゲン固形物５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例５の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１２７】
（比較例６）
（１）実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲンの等電点沈殿物を終濃度３％となるように蒸留水に分散し、均一な分散液となるように３０分間ホモジナイズした。この分散液を、噴霧乾燥機を使用して、入口温度１２０℃、出口温度６０℃になるように熱風温度を調整してスプレードライし、コラーゲン粉末を得た。表１に、比較例６の概要を示し、表４に溶解性の結果を示す。
噴霧乾燥して得たコラーゲン粉末は２０時間後にも約２０％程度しか溶解しなかった。原料のコラーゲン沈殿物は実施例１と同じものであるため、実施例１との溶解性の差は、コラーゲン分子の相違ではなく処理工程に依存した形状の相違によるものである。溶け残りを観察すると、噴霧乾燥品はコラーゲン粉末が微細であるためダマ状になり、ダマの表面のみ半透明で溶解していた。噴霧乾燥ではコラーゲン粒子の平均粒子径が４．６０μｍと小さく、かつその表面が比較的滑らかであるため溶解液がダマの内部まで浸透しにくく、これが溶解性に劣る理由と考えられる。これに対し、実施例１〜８はいずれもダマを形成することは無かった。
（２）上記（１）で調製したコラーゲン粉末について、実施例１と同様にして、ＢＥＴ１点法にて比表面積を、レーザー回折・散乱法にて粒度分布を測定した。比表面積および平均粒子径を表６に、粒度分布を図１３に、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図１４に示
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
【表３】
【０１３１】
【表４】
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明によれば、簡便な操作でコラーゲン粉末を製造することができる。しかも、得られたコラーゲン粉末は熱安定性に優れており、ｐＨ５．５〜８．５の溶液に速やかに溶解し、三重螺旋構造のコラーゲン溶液となり、有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性溶液に容易に溶解するコラーゲン粉末、前記コラーゲン粉末を担持してなるコラーゲン担持物、およびこれらの製造方法などに関し、更には、前記コラーゲン粉末と前記コラーゲンを溶解するための溶解液とからなるコラーゲンキット、粘着テープに前記コラーゲン粉末、コラーゲン担持物が添付された絆創膏などに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖が螺旋を巻いた構造を有し、約３００ｎｍの複数のコラーゲン分子が６７ｎｍずつずれて会合し、長いコラーゲン線維を形成する。コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質であるが、生体内に含まれる大部分は水に不溶性である。一方、生体成分であり安全性に優れ、動物間で相同性が高いため免疫反応を起こしにくいなどの利点を有する。このため、食品、医薬品、化粧品分野への応用が検討され、種々の可溶化法や可溶化コラーゲンの利用法が開発されている。可溶化コラーゲンとして、動物の皮や骨等の原料に含まれるわずかな可溶性コラーゲンを希酸により抽出したもののほか、プロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化したもの(特許文献１)、アルカリを添加して可溶化したもの(特許文献２)等がある。
【０００３】
一方、コラーゲンは、処理方法によって等電点が異なり、酸性条件下で可溶化したコラーゲンは、化粧品の一般的なｐＨ範囲であるｐＨ５．５〜８．５において等電点沈殿により白濁を生じる。このため、コラーゲンの溶解性、透明性などを向上させる目的でコハク化コラーゲンとし、コラーゲン分子の等電点をｐＨ４〜５にシフトさせる方法もある（特許文献３）。コラーゲン分子の側鎖に存在するアミノ基をカルボキシル基に変え、これによりコラーゲンの実効電荷を負にし、等電点をｐＨ４〜５に変化させると、ｐＨ４以下、またはｐＨ５以上の溶液への溶解性に優れるというものである。また、コラーゲンをエステル化し、水溶性を向上させる方法もある(特許文献４)。動物組織の状態でコラーゲンの修飾反応を行い、抽出操作を行うことでエステル化コラーゲンを得るというものであり、コラーゲン分子に存在するカルボキシル基を、アルコールでエステル化している。
【０００４】
更に、水溶性コラーゲンは、含水分量が多い透明に溶液化された状態では熱変性温度が低いため、熱変性温度を向上させたコラーゲンもある(特許文献５)。化粧品の処方に用いられるｐＨ範囲に等電点を有するコラーゲンの水不溶性の会合体は、乳白色かつ不均一となるなどの理由から化粧品原料として不向きと考えられていたが、ｐＨ５．５〜８．５の等電点を有するコラーゲンの水溶液を、その等電点付近のｐＨに調整して得られる会合体の熱変性温度が顕著に高いことを見出し、このような会合体を化粧品原料として使用するというものである。実施例では、等電点がｐＨ約７．０のコラーゲン溶液に終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えて塩析させ、得られたコラーゲン沈殿物を塩酸で溶解し、その後に水酸化ナトリウムで中和することで会合体の分散物を得ている。未変性のコラーゲンは、特有の三重螺旋構造を持った棒状の分子であるがその水溶液は耐熱性が低く、熱処理によって容易にコラーゲンの螺旋構造が破壊される。上記特許文献５では、得られた未変性コラーゲンを使用してヒト皮膚表皮細胞の接着性を評価し、ゼラチンでは３０分培養後の接着性は全くなく、３時間培養で若干の接着性が観察される程度であるが、未変性コラーゲンを使用する場合には、３０分間の培養で顕著な接着性が観察されることが示されている。
【０００５】
一方、未変性のコラーゲン溶液は常温でも変性する可能性があり、保管に関しては冷蔵などの温度管理が必要である。このようなコラーゲンの保存性に鑑みて、乾燥コラーゲンを使用する方法もある(特許文献６)。水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びモノメチルアミンを豚塩蔵皮に添加してコラーゲンを可溶化し、硫酸を滴下してｐＨを４．８に調整し、中和後の皮片を取出し、圧搾して液を除去した後にｐＨ５．０の乳酸水溶液で撹拌して脱塩し、ついで乳酸ナトリウム溶液を添加してｐＨを６．７に調整してコラーゲン溶液を得て、これを有機溶媒中に吐出して等電点ｐＨ４．９のコラーゲン繊維を得ている。この可溶化コラーゲン繊維は、水性溶媒にプロペラ式撹拌器で混合して溶解させている。
【０００６】
また、可溶性コラーゲンの粉末とその溶解液とを別体とし、可溶性コラーゲンをその溶解液で溶解し、ついでその溶解液のｐＨを当該可溶性コラーゲンの等電点に調整し、ゲル化して可溶性コラーゲン含有化粧品として使用するというものもある(特許文献７)。コラーゲンが等電点でゲル化することを利用したものであり、可溶性コラーゲンと等電点外の溶解液を組み合わせ、その後に溶解液のｐＨを等電点に調整し、ゲル状のパック剤として使用するというものである。実施例では、等電点がｐＨ４．８であるコラーゲン繊維を調整し、ｐＨ３．５の溶解液を使用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭４４−１１７５号公報
【特許文献２】特公昭４６−１５０３３号公報
【特許文献３】特開昭５５−２８９４７号公報
【特許文献４】特開平８−２７１９２号公報
【特許文献５】特開２０００−１２８７６４号公報
【特許文献６】特開２００５−３０６７３６号公報
【特許文献７】特許第４３５３８５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
三重螺旋構造を維持する未変性のコラーゲンは保湿性に優れ、かつヒト皮膚表皮細胞への接着性に優れるため、化粧品への配合や医療用の用途開発が希求される化合物である。しかしながら、溶液に溶解したコラーゲンは、熱変性温度が低く常温でも変性し、冷蔵保存が要求される。すなわち、三重螺旋構造を維持したコラーゲンが溶解された状態で配合されるコラーゲン化粧品は、コラーゲンの変性を防止するため冷蔵庫などに保管する必要があり、使用が簡便でない。また、コラーゲンは等電点で容易に析出するため、細菌感染などで溶解液のｐＨが変動すると溶液が白濁し、または析出による目詰まりなどが発生しやすい。したがって、溶解時に三重螺旋構造を構成しうる未変性のコラーゲン粉末の製造方法が望まれる。
【０００９】
耐熱性に優れる乾燥コラーゲンを調製し、必要なときに溶解して使用できれば便利である。しかしながら、コラーゲンは本来保湿性に優れる化合物である。上記特許公報４の比較例１に示すように、アテロコラーゲンを塩析したコラーゲンの沈殿物をエタノールで洗浄することを試みたが、コラーゲン繊維の中に食塩を含んだ水を抱き込んでいるため除去できなかった、と記載している。このように、コラーゲンの乾燥には、凍結乾燥などの技術を必要とし、製造工程や装置が複雑となる場合がある。
【００１０】
また、上記特許文献６記載の方法では、乾燥コラーゲンを得るために、可溶性コラーゲン溶液を有機溶媒中に吐出して繊維化している。しかしながら繊維化は、操作が極めて複雑である。しかも、得られるコラーゲン繊維の溶解性は十分でない。したがって、複雑な工程を必要とせず、簡便に乾燥コラーゲンを調製する方法、および溶解性に優れるコラーゲン粉末が望まれる。
【００１１】
なお、溶解性を改良するために加圧ノズルを介して塔頂から目的成分を含有する溶液を供給し、熱を送風して造粒する方法などがある。しかしながら、コラーゲンは熱変性しやすく、このような造粒方法によって溶解性を改良することも困難である。
【００１２】
更に、そもそも可溶性コラーゲンは抽出方法に依存する等電点を有し、可溶性コラーゲンは等電点で溶解性が低い。例えば、上記特許文献７では、等電点がｐＨ４．８のコラーゲン繊維を調整し、これをｐＨ３．５の溶解液を使用して溶解し、溶解液のｐＨを等電点に調整することでゲル状のパック剤に調製している。このように、一旦、酸性溶液に溶解し、ついでアルカリで中和する必要があり、従来の化粧水などを使用して乾燥コラーゲンを溶解することは困難である。したがって、化粧品用途として用いる場合には一般の化粧品のｐＨである５．５〜８．５で速やかに溶解するコラーゲン粉末が望まれる。
【００１３】
また、コラーゲンは、ｐＨを調整することでゲル化し、パック剤などとして使用することができる。例えば、上記特許文献７では、コラーゲン繊維とこの溶解液とを別体とし、使用時に混合して皮膚に塗布し、ついでこの溶液のｐＨを調整してゲル化してパック剤としている。しかしながら、コラーゲンは保湿性に優れるばかりでなく、表皮細胞の接着性が高くかつ免疫原性が低いため、パック剤として使用するのみならず、絆創膏などに塗布しても細胞活性を増加させる可能性がある。したがって、化粧品以外にも使用でき、かつ取り扱いが容易な乾燥コラーゲン物品の開発が望まれる。
【００１４】
コラーゲンを粉末化する要請は、天然のコラーゲンのみならず、コラーゲン誘導体でも同様である。
【００１５】
上記現状に鑑み、化粧品のｐＨ範囲で溶解性に優れる未変性の可溶性コラーゲンの乾燥体たるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を提供するものである。
【００１６】
また、このようなコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を簡便に使用できるコラーゲン担持物や絆創膏、およびその製造方法を提供するものである。
【００１７】
また、化粧品のｐＨ範囲で、乾燥コラーゲンを速やかに溶解できる溶解液と乾燥コラーゲン物品とのキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンを１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥すると、平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン粉末が得られること、前記粗コラーゲン沈殿物は、エタノールなどの親水性有機溶媒に分散することができるため、固形分を分取した後に風乾によって乾燥でき、この粉末を溶解するとコラーゲンが溶液中で三重螺旋構造を呈すること、得られたコラーゲン粉末は、化粧品のｐＨである５．５〜８．５の溶解液で極めて速やかに溶解し、かつ１１０℃と高温でも変性することなく耐熱性に優れること、前記コラーゲン粉末を基材に担持して得たコラーゲン担持物と溶解液とを組み合わせてなるコラーゲンキットは、室温で保存でき、必要時に速やかに溶解して保湿性に優れる三重螺旋構造のコラーゲン溶液を調製できるため、パック剤その他の化粧品として簡便に使用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材に担持させてなるコラーゲン担持物を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、前記基材が、紙、布またはこれらの複合物である、上記コラーゲン担持物を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、粘着テープの一部に上記コラーゲン担持物を添付した絆創膏を提供するものである。
【００２３】
また、本発明は、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、または上記コラーゲン担持物と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなるコラーゲンキットを提供するものである。
【００２４】
また、本発明は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することを特徴とする、コラーゲン担持物の製造方法を提供するものである。
【００２５】
また、本発明は、前記粗コラーゲン沈殿物が、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱させて平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％としたものである、前記コラーゲン担持物の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、平均粒子径が１〜１，０００μｍであり、極めて微細な粉末であって取扱に優れる。しかも、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であり、中性の化粧品などへの溶解性に優れる。
【００２７】
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、熱安定性、保存性に優れる。しかも、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の溶解液は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が三重螺旋構造を構成するため、皮膚などの保湿性に優れる。
【００２８】
本発明のコラーゲン担持物は、基材にコラーゲン粉末が担持されているため、基材に溶解液を含浸させるだけで容易にコラーゲンを溶解することができ、前記基材を皮膚に接着させることで保湿性に優れる三重螺旋構造のコラーゲンのパック剤などとして使用することができる。
【００２９】
本発明のコラーゲン担持物の製造方法は、粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％であるため、親水性有機溶媒による脱水が容易であり、これを基材に担持すればよく、製造が極めて簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例１で調製したコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図２】実施例１で調製したコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【図３】実施例１で調製した、コラーゲン粉末の示差走査熱量計（ＤＳＣ）の結果を示す図である。
【図４】実施例１における、粉末コラーゲンを再溶解したコラーゲン溶液の円二色性を示す図である。
【図５】実施例１、実施例５における粉末コラーゲンおよび比較例１、比較例５のコラーゲンの溶解初速度を算出した図である。
【図６】実施例１で得たコラーゲン粉末の粒度分布の図である。
【図７】実施例１において粒度分布を測定したコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【図８】比較例１で得たコラーゲンスポンジの電子顕微鏡像を示す図である。
【図９】比較例２で得たコラーゲンフィルムの電子顕微鏡像を示す図である。
【図１０】比較例３で得たコラーゲン繊維の電子顕微鏡像を示す図である。
【図１１】比較例４で調製した、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【図１２】比較例５で調製した、コラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図１３】比較例６で得たコラーゲン粉末の粒度分布の図である。
【図１４】比較例６において、噴霧乾燥機を使用して乾燥してなるコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の第一は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末である。
【００３２】
また、本発明の第二は、前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材に担持させてなるコラーゲン担持物であり、本発明の第三は、粘着テープの一部に前記コラーゲン担持物を添付した絆創膏であり、本発明の第四は、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、または上記のコラーゲン担持物と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなるコラーゲンキットである。
【００３３】
また、本発明の第五は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することを特徴とする、コラーゲン担持物の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
（１）定義
本願明細書において、「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、３本のポリペプチド鎖が螺旋を巻いたものの総称である。従来からＩ〜ＸＸＩＸ型が知られているが、本発明で使用するコラーゲンとしてはいずれであってもよく、新たに見出されるコラーゲンであってもよい。生体内に含まれるコラーゲンの大部分は水に不溶性であり、本発明では、動物の皮や骨等の原料に含まれるコラーゲンをプロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化したもの、アルカリを添加して可溶化したものを「可溶化コラーゲン」と称する。なお、生体内には、動物の皮や骨等の原料には、わずかに中性塩溶液や酸性溶液に溶ける可溶性コラーゲンも含まれている。本発明で使用するコラーゲンは、水溶液に溶解するものであれば、不溶性コラーゲンを可溶化したものであってもよく、本来含まれる可溶性コラーゲンであってもよい。なお、本願明細書では生体内に大量に存在する不溶性コラーゲンを原料として調製される「可溶化コラーゲン」を用いて説明するが、本願発明における「コラーゲン」には、「可溶性コラーゲン」と「可溶化コラーゲン」との双方が含まれる。また、「コラーゲン線維」とは、複数の「コラーゲン分子」どうしが会合したものを意味する。コラーゲン分子としては、前記可溶化コラーゲンや可溶性コラーゲンが相当する。可溶化コラーゲン溶液を等電点沈殿し、または塩析するとコラーゲン分子どうしが会合し、コラーゲン線維を沈殿物として分取することができる。コラーゲン線維は、沈殿の際に複数のコラーゲン線維が会合して大きな凝集体として沈殿する場合がある。従って、本発明において「会合」とは、コラーゲン分子どうしの結合とコラーゲン線維どうしの結合の双方を含むものとする。また、「コラーゲン沈殿物」とは、コラーゲン溶液から固体で析出したコラーゲンを意味し、「コラーゲン粉末」とは、「コラーゲン沈殿物の粉状固形物」を意味する。
【００３５】
なお、「可溶化コラーゲン」や「可溶性コラーゲン」は、化学的処理の際に構成アミノ酸が修飾される。従って、本発明で使用する「コラーゲン」としては、例えば、アルカリ処理によってアスパラギン残基やグルタミン残基などがアルカリによる脱アミド反応によっておのおのアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に変化したものを含む。すなわち、コラーゲン分子に含まれるアミド基をカルボキシル基に変え、コラーゲンの実効電荷を負にすることで等電点が酸性あるいは中性へと調整される。例えば、アルカリ可溶化コラーゲンは、アスパラギン残基およびグルタミン残基がアルカリによる脱アミド反応によっておのおのアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に変化され、等電点がｐＨ４．５〜６．０と酸性へと変化している。本発明では、このようにコラーゲンを構成するアミノ酸が修飾されたものであってもよい。
【００３６】
更に、本発明における「コラーゲン誘導体」とは、前記コラーゲンを構成するアミノ酸に他の官能基を修飾したものを意味する。例えば、アシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンなどがある。なお、コラーゲン誘導体としては、予め調製されたアシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンのほか、塩析や等電点沈殿の際にエステル化され、またはアシル化されたコラーゲンであってもよい。コラーゲン含有組織から可溶化コラーゲンや可溶性コラーゲンを抽出する工程に先立ち、コラーゲンをアシル化して等電点を調整する場合があり、また、エステル化コラーゲンの製造方法として、予めコラーゲン含有組織に含まれる不溶性コラーゲンをエステル化し、ついでエステル化コラーゲンを等電点沈殿して分取する場合がある。なお、アシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンとしては、以下のものがある。
【００３７】
（ｉ）アシル化コラーゲン
アシル化コラーゲンとしては、サクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどがある。例えば、酵素処理によって抽出したアテロコラーゲン溶液をｐＨ９〜１２に調整し、その後、無水コハク酸、無水フタル酸、無水マレイン酸などの酸無水物を添加してなるサクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどのアシル化コラーゲンなどがある。
【００３８】
（ｉｉ）エステル化コラーゲン
エステル化コラーゲンとしては、可溶化コラーゲンをエステル化したもののほか、不溶性コラーゲンをエステル化した後に酵素反応などで可溶化されたエステル化コラーゲンなどがある。
【００３９】
コラーゲンに作用させてエステル化コラーゲンを得るためのアルコール類としては、１級アルコールのほか、２級アルコール、３級アルコールであってもよい。また、１価アルコールに限定されず、２価アルコールや３価アルコール、その他の多価アルコールであってもよい。
例えば、１価アルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｄｌ−２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、ｄｌ−２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、ｄｌ−２−ヘキサノール、ｄｌ−３−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、ｄｌ−２−オクタノール、３−オクタノール、１−ノナノール、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノール、５−ノナノール、デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテルなどが挙げられる。
【００４０】
また、２価アルコールとしては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２００〜２００００）、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ジプロピレングリコール、グリセリン、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、２，４−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール，２，５−ヘキサンジオールがある。その他の多価アルコールとして、グリセリン、各種の糖アルコールなどがある。
【００４１】
本発明で使用するコラーゲン誘導体およびコラーゲンは、溶解液中で三重螺旋構造を有している。
【００４２】
（２）粗コラーゲン沈殿物
本発明で使用する粗コラーゲン沈殿物は、「等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する」ものである。
【００４３】
前記したようにコラーゲンは生体内で不溶性であり、このような不溶性コラーゲンを酵素処理やアルカリ処理して可溶化コラーゲンを調製することができる。このような可溶化コラーゲンは水溶液で調製され、塩析や等電点沈殿によって精製されて固形の沈殿物となる。本発明では、このようにして得たコラーゲンの沈殿物を使用する。このようなコラーゲンの沈殿物やこれらから得られるコラーゲン粉末は、再度溶液に溶解すると、三重螺旋構造を有するコラーゲン溶液となるからである。
【００４４】
また、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の平均粒子径を１〜１，０００μｍに限定したのは、この範囲であれば、コラーゲン沈殿物が親水性有機溶媒によって効率よく脱水でき、風乾によって粉末化でき、得られる粉末も微細なコラーゲン粉末となる。すなわち、可溶化コラーゲン溶液を等電点沈殿や塩析するとコラーゲン分子どうしが会合してコラーゲン線維となり、更にコラーゲン線維が会合して凝集体となるため、一般には、沈殿物の平均粒子径は約２，０００μｍとなる。しかしながら、平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿を使用すると、溶解性に優れるコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を得ることができることが判明した。なお、等電点沈殿をｐＨ３．５〜８．０に限定したのは、中性溶液での溶解性に優れるコラーゲン粉末を調製するためである。
【００４５】
（ｉ）平均粒子径
本発明で使用する粗コラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１〜１，０００μｍ、より好ましくは５〜９００μｍ、特に好ましくは１０〜７５０μｍ、更に好ましくは３０〜５００μｍである。平均粒子径が１，０００μｍを超えると乾燥や粉末化が困難となる場合がある。なお、コラーゲン分子の長径は３００ｎｍであり、コラーゲン分子どうしの会合が生じない場合には、コラーゲンの粒子径は３００ｎｍとなる。しかしながら、後記するように、このような３００ｎｍのコラーゲン分子が平行に複数結合してなるＳＬＳ線維は、更にＳＬＳ線維が相互に会合して凝集体を形成し、沈殿物となる。このようなＳＬＳ線維の沈殿物では少なくとも３個以上のＳＬＳ線維が会合していると想定して１μｍを下限とした。なお、本願における平均粒子径は、位相差顕微鏡で観察した値である。位相差顕微鏡像の長径をもって粗コラーゲン沈殿物の粒子径とし、十視野に含まれる全ての粗コラーゲン沈殿物の粒子径を平均し、平均粒子径とした。
【００４６】
平均粒子径が上記範囲の粗コラーゲン沈殿物は、可溶化コラーゲンやコラーゲン誘導体を溶解する溶液を、物理的処理や化学的処理し、または生成した沈殿物を物理的に破砕することで調整することができる。
【００４７】
（ｉ−１）物理的処理
物理的処理方法としては、例えば、コラーゲンやコラーゲン誘導体を溶解する溶液を撹拌しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈殿させる方法がある。撹拌によってコラーゲン分子どうしの会合が抑制され線維長の短いコラーゲン線維となり、更に複数のコラーゲン線維の会合による凝集体の生成を抑制し、粒子径の短いコラーゲン沈殿物を沈殿させることができる。また、生成した沈殿物を破砕して更に粒子径の短いコラーゲン沈殿物を沈殿させてもよい。撹拌の程度は、溶液のコラーゲンやコラーゲン誘導体の濃度、撹拌方法、撹拌容器の形状やサイズなどによって適宜選択することができる。ホモジナイザーを使用する場合には回転数１，０００〜２０，０００ｒｐｍである。コラーゲン線維の会合による凝集体の生成を抑制し、または生成する沈殿物の破砕を効率的に行うため、撹拌と破砕機構を有する装置を使用してもよい。
【００４８】
（ｉ−２)化学的処理
また、化学的処理方法としては、コラーゲン分子同士の会合を阻止する会合阻止剤を添加する方法がある。このような会合阻止剤としては、グルコース、スクロース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、グリセリンなどの糖類がある。また、コラーゲン分子の束状集合体を形成させるＡＴＰがある。例えばコラーゲン溶液に酸性条件下でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加え、コラーゲン分子の塩基性部位同士をＡＴＰのリン酸基で架橋させる。ＡＴＰによって複数のコラーゲン分子が平行に架橋し、コラーゲン分子の塩基性部位同士がＡＴＰのリン酸基で架橋されたＳＬＳ（Segment-long-spacing）線維が生成される。すなわち、前記した疎水性相互作用によるコラーゲン分子どうしの会合に優先して、ＡＴＰによるコラーゲン分子の架橋が生じるため、３００ｎｍのコラーゲン分子が平行に連結された、平均粒子径３００ｎｍのＳＬＳ線維となる。なお、複数のＳＬＳ線維が会合して凝集体を形成し、沈殿する。ＳＬＳ線維には、コラーゲンのほかにＡＴＰが架橋剤として含まれるが、他のコラーゲンやコラーゲン誘導体と同様にＡＴＰを含んだまま粉末化することができる。また、ＳＬＳ線維の沈殿物を得た後にＡＴＰを除去し、その後に粉末化してもよい。
【００４９】
（ｉｉ）コラーゲン濃度
粗コラーゲン沈殿物における前記コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度は、１２〜５０質量％、より好ましくは１５〜４０質量％、特に好ましくは２０〜３５質量％である。１２質量％を下回ると、粗コラーゲン沈殿物の含水率が高すぎるため脱水効率が悪く、乾燥すると微細かつ多孔質のコラーゲン粉末とならずにフィルム状になる場合がある。一方、５０質量％以上の粗コラーゲン沈殿物を調製することは容易でない。なお、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物以外の主成分は、沈殿前のコラーゲン溶液やコラーゲン誘導体溶液を構成する水溶液である。
【００５０】
（ｉｉｉ）粗コラーゲン沈殿物の調製方法
本発明では、等電点沈殿や塩析で得たコラーゲン沈殿物を粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。等電点沈殿物の調製工程において塩析も行われるため、以下、等電点沈澱物を調製する場合で粗コラーゲン沈殿物の調製方法を説明する。また、本発明では、Ｉ〜ＸＸＩＸ型のいずれのコラーゲンも使用可能であるが、生体からＩ型コラーゲンを抽出する場合で以下に説明する。
【００５１】
本発明で使用するコラーゲンは、ウシ、ブタ、鳥、魚などの動物の皮膚やその他のコラーゲンを含む組織から採取することができる。一般に、コラーゲンは、動物の結合組織に多く含まれるが、熱処理によって抽出するとコラーゲンが熱変性して特有の三重螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。本発明では、三重螺旋構造を構成しうるコラーゲンを使用する。このようなコラーゲンの抽出法として、動物の骨、皮などを材料として、アルカリ処理や酸処理、酵素処理による可溶化法等がある。より好ましくは、コラーゲンの抽出原料として、ウシ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウマ、魚類等の真皮や腱がある。胎児由来などの若い動物の組織を使用すると収率が向上するためより好ましい。
【００５２】
（ｉｉｉ−１）等電点ｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物
例えば、原料となる不溶性コラーゲンとして、石灰漬け後の床皮を洗浄し、ハムスライサーで約１０ｃｍ角に細切、ミンチ後さらに機械的にすり潰したものを、アセトン、エーテルなどの有機溶剤あるいは脂肪分解酵素使用して脱脂後、十分に洗浄したものを使用することができる。
【００５３】
終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミンとなるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５質量％となるように不溶性コラーゲンを懸濁し、１８℃、３週間可溶化処理を行う。可溶化反応停止後、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウム等の塩を加えて塩析し、塩酸等で酸性に調製した水溶液に塩析沈澱を再溶解し、および布、ろ紙、金属メッシュ等で濾過して精製し、このコラーゲン溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ４．５となるよう調整すれば、等電点４．５の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。なお、平均粒子径は、上記コラーゲン溶液を撹拌しつつｐＨ４．５の等電点沈殿や塩析を行うことで１〜１，０００μｍに調整することができる。このような平均粒子径の制御方法は、（ｉｉｉ−２）、（ｉｉｉ−３）、（ｉｉｉ−４）でも同様である。
【００５４】
（ｉｉｉ−２）等電点ｐＨ４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿物
上記（ｉｉｉ−１）で調製した不溶性コラーゲンに、コラーゲン終濃度１質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整し、コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行い、酵素反応を停止して酵素可溶化コラーゲン液を得る。この酵素可溶化コラーゲンを終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミン水溶液に懸濁し、所望の時間アルカリ処理を行うことで沈殿物を得ることができる。より具体的には、４時間のアルカリ処理で等電点が７．８へと低下し、１日のアルカリ処理により等電点が５．６にまで低下する。所望の等電点となった時に、塩酸を加えて反応を停止し、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収する。回収した塩析沈殿物を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を得る。次に、このコラーゲン溶液を、布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムで所望の等電点のｐＨとなるよう調整すれば、等電点４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。なお、酵素可溶化コラーゲンに代えて、不溶性コラーゲンを使用し、終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミン水溶液に懸濁し、上記と同様に処理しても等電点ｐＨ４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿を得ることができる。
【００５５】
（ｉｉｉ−３）コラーゲン誘導体からなる粗コラーゲン沈殿物
上記（ｉｉｉ−１）で調製した不溶性コラーゲンや（ｉｉｉ−１）記載のアルカリ可溶化コラーゲン、（ｉｉｉ−２）に記載の酵素可溶化コラーゲンをアシル化あるいはエステル化して、等電点ｐＨ４．５〜９．０のコラーゲン誘導体を得て、これをアシル化やエステル化などの誘導体処理を行い、次いで塩析等により粗コラーゲン沈殿物を得る。例えば、等電点９．０の酵素可溶化コラーゲンをアシル化した場合、コラーゲンのアミノ基が修飾されて等電点が酸性側へとシフトする。また、例えば、等電点４．５のアルカリ可溶化コラーゲンをエステル化した場合、コラーゲンのカルボキシル基が修飾されて等電点が塩基性側へとシフトする。所望の等電点となった時に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収する。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を得る。次に、このコラーゲン溶液を布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムで所望の等電点のｐＨとなるよう調整することで、等電点４．５〜８．０の粗コラーゲン沈殿物を得ることができる。
なお、コラーゲン分子中のカルボキシル基を、カルボン酸クロライドに誘導し、前記アルコール類の水酸基と酸クロライドの脱塩酸反応によってもエステル化を行うこともできる。
【００５６】
(ｉｖ)等電点
上記したように、コラーゲンやコラーゲン誘導体の等電点は、可溶化方法やその他によって調整することができる。本発明では、等電点がｐＨ３．５〜８．０のコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を対象とする。これらは等電点沈殿物として得ることができ、例えば、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液をｐＨ３．５〜８．０に調整して得たコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を使用することができる。なお、等電点とは、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する水溶液でコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が最小の溶解度を示す溶液のｐＨを意味する。一般に、コラーゲンの等電点は、ｐＨ４．３〜９．３であるが、ｐＨ４．３未満の溶液でも沈殿物が形成されうるため、前記コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体溶液をｐＨ３．５以上とした。本発明は、本来、沈殿しやすいコラーゲンやコラーゲン誘導体の溶解性を確保する点に特徴があり、等電点がｐＨ４．０〜８．０、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ４．５〜６．０、特に好ましくは４．５〜５．０である。
【００５７】
なお、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体含有溶液をｐＨ４．５に調整して回収した粗コラーゲン沈殿物は等電点がｐＨ４．５であり、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体含有水溶液をｐＨ６．０に調整して回収した粗コラーゲン沈殿物の等電点はｐＨ６．０となる。本願発明で使用する「粗コラーゲン沈殿物」としては、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物や、等電点がｐＨ８．０の粗コラーゲン沈殿物に限定されず、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物と等電点がｐＨ８．０の粗コラーゲン沈殿物の混合物などであってもよい。
【００５８】
（３）コラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は、使用する粗コラーゲン沈殿物の等電点や平均粒子径に依存した等電点や平均粒子径を有する。このため、等電点がｐＨ４．５の粗コラーゲン沈殿物を使用した場合には、等電点ｐＨ４．５のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となり、等電点がｐＨ６．０の粗コラーゲン沈殿物を使用した場合は、等電点がｐＨ６．０のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となる。更に、例えば、等電点がｐＨ４．５〜６．０のコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の混合物を使用した場合には、等電点がｐＨ４．５〜６．０のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末となる。
【００５９】
コラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の平均粒子径に限定はないが、平均粒子径１〜１，０００μｍの粗コラーゲン沈殿物等を使用することで、最終的に平均粒子径が８〜１，０００μｍ、好ましくは１０〜１０００μｍ、より好ましくは３０〜９５０μｍ、更に好ましくは３０〜９００μｍ、特に好ましくは３０〜８００μｍのコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末である。上記したように、会合により通常は２０００μｍ以上となり、噴霧乾燥によれば５μｍ未満となる。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、平均粒子径が８〜１，０００μｍであるから、微細にすぎずに飛散を防止でき、かつ流動性を確保することができる。しかも、後記する実施例に示すように、コラーゲン粉末の平均粒子径が５μｍ未満であると溶解液中でダマを形成し溶解性を低下させる場合があるが、上記範囲であればダマの形成がなく溶解性に優れる。なお、本願明細書において、粗コラーゲン沈殿物、コラーゲン粉末、コラーゲン誘導体粉末の平均粒子径は、電子顕微鏡によって測定した値である。電子顕微鏡像の長径をもってコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の粒子径とし、十視野に含まれる全てのコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉の粒子径を平均し、平均粒子径とした。
【００６０】
しかも、平均粒子径が上記範囲であるにも係わらず、平均粒子径が５μｍ未満の噴霧乾燥したコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末と同程度の比表面積を有し、親水性、溶解性に優れる。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒で分散したため、溶媒中にコラーゲンが微細に分散し、得られる沈殿物が多孔質となり、比表面積が拡大することが判明した。本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末の比表面積は、０．５ｍ２／ｇ以上、好ましくは０．８〜３０ｍ２／ｇ、より好ましくは以上、１．０〜２５ｍ２／ｇ、特に好ましくは１．２〜２０ｍ２／ｇ、更に好ましくは１．５〜２０ｍ２／ｇである。このような比表面積によって、親水性、溶解性が確保される。
【００６１】
本発明のコラーゲン粉末およびコラーゲン誘導体粉末は、前記粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする。好ましくは０．３ｍｇ／分以上、より好ましくは０．５ｍｇ／分以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／分以上である。本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、上記したようにｐＨ６．５の溶液に対する溶解性で評価されるが、溶解性を特定するためにｐＨ６．５に限定したに過ぎず、後記する実施例に示すようにｐＨ５．５〜８．２の溶解液に対する溶解性に優れる。なお、本発明において「溶解初速度」は、後記する実施例に示す方法で測定したものである。
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末が上記中性溶液で溶解性に優れる理由は明確ではないが、「等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物」を使用することが一因と考えられる。乾燥前のコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の平均粒子径が１〜１，０００μｍであるため、得られるコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末も微細となる。また、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させて乾燥させると、溶媒中にコラーゲンが微細に分散し、得られる沈殿物が多孔質となる。この多孔により表面積が拡大し、更に溶解が速やかに行われたためと考えられる。従来は、等電点ｐＨ４．０〜８．０のコラーゲンは、中性溶液での溶解性が十分でないため、一旦、その等電点より酸性側の溶液に溶解し、次いでアルカリを添加してｐＨ５．５〜８．５に調整する必要があった。本発明では、例えば等電点がｐＨ４．５のコラーゲン粉末の場合、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液に速やかに溶解するためより酸性の強い酸に溶解する必要がなく、従って、その後のアルカリの添加も不要である。溶解操作が簡便であるばかりでなく酸とアルカリとによる塩類の形成を回避することができる。また、アルカリに溶解する必要がないため、コラーゲンのペプチド化を回避することができ、三重螺旋構造の含有率の高いコラーゲン溶液を製造することができる。
【００６２】
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、前記凝集体やコラーゲン線維が元のコラーゲン分子やコラーゲン誘導体分子となって溶解する。従って、この溶液を従来の方法で等電点沈殿させ、または塩析させると、平均粒子径が１，０００μｍより大きい、すなわち従来の２，０００μｍのコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を生成することができる。
【００６３】
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は耐熱性に優れ、乾燥物であるから従来のコラーゲン溶液のように冷蔵保存する必要がない。なお、本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末１質量部に対する溶解液量は特に限定がない。本発明のコラーゲン粉末を溶解させず湿潤させて使用する場合もあるからである。
【００６４】
（４）用途
本発明のコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末は、医療用途や化粧用用途などに好適に使用することできる。例えば、化粧用用途としては、化粧水、乳液、美容液、一般クリーム、クレンジングなどの洗顔料、パック、ひげそり用クリーム、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼けローション、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、口紅、リップクリーム、シャンプー、リンスなどを例示することができる。
【００６５】
また、化粧品以外にも、食品、医薬品などの用途にも有効に使用することができる。例えば、医療用途としては、再生医療に用いられるＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の担体、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞など各種細胞の培養基材、止血剤、褥創治療剤、骨充填剤などを例示することができる。
【００６６】
（５）コラーゲン担持物
本発明のコラーゲン担持物は、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材に担持させてなる。
基材としては、紙や布、これらの複合材を好ましく使用することができる。紙基材としては、天然紙のほか合成樹脂からなる合成紙であってもよい。また、布としては木綿、絹、羊毛などやこれらの混合物の織物のほか不織布などであってもよい。更に、紙に布を貼り合わせた複合材であってもよい。
その形状は、円形、方形その他の多角形であってもよく、不定形であってもよい。例えば、基材が顔面の形状に成形されたものであれば、パック剤として使用することができる。
【００６７】
基材に対するコラーゲン粉末の担持量は、基材１ｃｍ２あたり、５０μｇ〜１５ｍｇ、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ、より好ましくは０．５〜１．５ｍｇである。１５ｍｇを上回ると基材への均一な担持が困難となる場合がある。一方、５０μｇを下回ると、コラーゲンの作用が十分に発揮されない場合がある。
【００６８】
本発明のコラーゲン担持物は、前記基材にｐＨ５．５〜８．５の溶解液を含浸させると担持されたコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末が速やかに溶解し、コラーゲン溶液含浸基材となる。このコラーゲン溶液含浸基材を皮膚に添付すれば、皮膚にコラーゲン溶液を塗布することができる。前記基材は、皮膚に貼付してもよいが、コラーゲン溶液含浸基材を押圧してコラーゲン溶液のみを皮膚に塗布してもよい。
【００６９】
本発明のコラーゲン担持物では、前記したコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末に加えて、プラセンタエキス、コウジ酸、ルシノール、アルブチン、エラグ酸、カミツレエキスなどの美白成分、紫外線吸収剤、他の機能成分を安定に配合するための溶媒、その他を適宜配合することができる。
【００７０】
他の機能成分としては、一般的に化粧料に添加される種々の成分が使用可能であり、例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ブタンジオール、ペンタンジオール、ポリエチレングリコール、尿素、乳酸塩、ピロリドンカルボン酸塩等の保湿剤、メチルパラベンなどの保存料、アロエエキス等の植物抽出物、ビタミンＡ、Ｂ２、Ｂ６、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、パントテン酸等のビタミン類、グリチルリチン等の抗炎症剤、オリーブ油等の油脂類、脂肪酸類、アミノ酸が挙げられる。
【００７１】
（６）絆創膏
本発明のコラーゲン担持物は、粘着テープの一部に添付することで、絆創膏として使用することができる。
絆創膏として使用する場合には、前記コラーゲン担持物に、塩化ベンザルコニウムなどの殺菌消毒剤などを配合することができる。
絆創膏として使用する場合、添付されたコラーゲン担持物に溶解液を含浸させてもよく、溶解液を使用しなくてもよい。例えば、溶解液を使用せず、乾いた状態でコラーゲン担持物を傷口に添付すると、絆創膏の基材に担持されたコラーゲンがリンパ液に溶解してゲル化するため、絆創膏からのリンパ液の遺漏を防止することができる。三重螺旋構造を呈する未変性コラーゲンは、皮膚細胞の接着性に優れ、かつ動物間で相同性が高いため免疫反応を起こしにくく、好適である。
【００７２】
（７）コラーゲンキット
（ｉ）キット
本発明の可溶性コラーゲンキットは、上記コラーゲン担持物、または上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなる。
前記したように、本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液に速やかに溶解するため、必要時に溶解液を添加して溶解し、コラーゲン溶液を調製することができる。従来は、コラーゲン溶液は、熱安定性が低いため冷蔵保存を必要とされていたが、本発明によれば、室温保存が可能となる。なお、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を使用する場合には、容器に入れたコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末に溶解液を投入して溶解させ、これを皮膚などに投与することができ、容器に代えて手のひらにコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を投入し、これを溶解液で溶解し、コラーゲン溶液として使用してもよい。
【００７３】
また、上記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末に代えて、コラーゲン担持物を使用する場合には、コラーゲン担持物の基材に溶解液を含浸させ、調製されたコラーゲン溶液のみを皮膚に塗布してもよく、コラーゲン溶液含浸基材をそのまま皮膚に添付してパック剤として使用することもできる。パック剤として使用する場合には、基材として不織布などを好適に使用することができる。
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末やコラーゲン担持物は、一回の使用量ごとに個別包装されていてもよく、同様に、溶解液も個別包装されていてもよい。このような溶解液の個別包装容器にコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末またはコラーゲン担持物を添加してコラーゲン溶液を調製してもよい。コラーゲンは吸湿性があるため、ガスバリア性の個別容器などに収納することが好ましい。
【００７４】
（ｉｉ）溶解液
本発明のコラーゲンキットを構成する溶解液としては、ｐＨ５．５〜８．５、より好ましくはｐＨ５．５〜８．５、特に好ましくはｐＨ５．５〜７．５の溶液である。ｐＨの調整は、無機または有機酸によって行うことができ、緩衝液であってもよい。なお、溶解液のｐＨは、使用するコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の等電点などに応じて適宜選択することができる。
【００７５】
さらに、本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末が化粧品に使用される場合を考慮して、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、デキストリンなどの(保湿剤)、クエン酸ナトリウムなどの有機酸塩からなるｐＨ調整剤、フェノキシエタノール、メチルパラベンなどの保存料、オクチルドデセスなどの界面活性剤、エタノールなどのアルコール類などを含有してもよい。上記アルコールの含有量は３０質量％以下であることが好ましく、界面活性剤は２．５質量％以下、有機酸塩は５質量％以下であることが好ましい。
【００７６】
なお、溶解液に前記したプラセンタエキス、コウジ酸、ルシノール、アルブチン、エラグ酸、カミツレエキスなどの美白成分、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、フェノキシエタノール等の保存料（防腐剤）、ブタンジオール、ペンタンジオール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、尿素、乳酸塩、ピロリドンカルボン酸塩等の保湿剤、アロエエキス等の植物抽出物、ビタミン類、抗炎症剤、オリーブ油等の油脂類、脂肪酸類、アミノ酸などを添加してもよい。
【００７７】
（８）コラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末の製造方法
本発明のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させて調製することができる。乾燥方法に限定はないが、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の平均粒子径や形状を維持したまま乾燥することが好ましい。平均粒子径が８〜１，０００μｍであり、溶解性に優れるコラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末が得られるからである。より好ましくは、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取した後に乾燥する方法である。粗コラーゲン沈殿物の脱水が簡便で風乾により粉末化しうる点で優れる。具体的には、コラーゲン含有溶液を、コラーゲンの会合を制御しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱させ、または塩析して平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥して製造する。なお、コラーゲン誘導体粉末を製造するには、等電点ｐＨ４．５〜９．０のコラーゲン沈殿物にエステル化やアシル化などの修飾処理を行い、ｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱し、または塩析などにより濃度１２〜５０質量％の粗コラーゲン誘導体を得て、これを親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取し、乾燥することで製造することができる。なお、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の平均粒子径や形状を維持したまま乾燥することができれば、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させた後に固形物を分取しこれを凍結乾燥などによって乾燥してもよい。凍結乾燥その他の乾燥方法は、従来公知の方法を採用することができる。よって、以下、粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、固形物を分取した後に乾燥する方法について説明する。
【００７８】
（ｉ）粗コラーゲン沈殿物の生成
コラーゲン溶液を等電点沈殿させ、または塩析させると、一般には、コラーゲンの会合によって平均粒子径が約２，０００μｍのコラーゲン沈殿物となって沈殿するが、コラーゲン分子の会合を抑制し、または物理的に粉砕することで平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物からなる粗コラーゲン沈殿物を調製することができる。
【００７９】
平均粒子径が１〜１，０００μｍのコラーゲン沈殿物を得るには、コラーゲン沈殿物が生成する前とコラーゲン沈殿物が生成した後の双方を撹拌することが好ましい。コラーゲン沈殿物の生成前には、コラーゲン分子の会合を阻止して線維長の短いコラーゲン線維を生成させることができ、かつコラーゲン沈殿物の生成後には、コラーゲン線維の会合を阻止し凝集体の生成を抑制することができる。なお、マスコロイダーなどの石臼式磨砕機を使用する場合は、撹拌と同時に沈殿物の破砕が行われる点で好ましい。コラーゲン溶液から生成した沈殿物を破砕して粒子径を小さくすることができるからである。更に、塩析または等電点沈殿による沈殿物を得た後に、溶液ごと石臼式磨砕機などで前記沈殿物を破砕してもよい。溶液中であるから、沈殿物を加熱することなく破砕することができ、凝集体の会合を分離し、沈殿物の粒子径を小さくすることができる。
【００８０】
撹拌や破砕の程度としては、溶液のコラーゲンやコラーゲン誘導体の濃度、撹拌方法、撹拌容器の形状やサイズなどによって適宜選択することができるが、前記したように、ホモジナイザーを使用する場合には回転数１，０００〜２０，０００ｒｐｍ、より好ましくは２，０００〜１３，０００ｒｐｍ、特に好ましくは２，５００〜１０，０００ｒｐｍ、特に好ましくは３，０００〜５，０００ｒｐｍで撹拌する。撹拌時間は、回転数などに応じて適宜選択することができ、１分〜５時間、より好ましくは１分〜３時間、特に好ましくは３分〜１時間、更に好ましくは５分〜３０分である。実際の粒子径を測定し、撹拌強度を変化させることで所望の平均粒子径のコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を得ることができる。なお、本発明では、コラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の破砕は、上記したようにコラーゲン溶液中で行うことが好ましい。沈殿物を溶液から分離する工程が不用であり、かつ破砕効率に優れるからである。
【００８１】
なお、本発明では、コラーゲン分子の会合を抑制する方法として前記した会合阻止剤を添加してもよく、例えば、コラーゲン溶液に酸性条件下でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などの会合阻止剤を加えると、ＡＴＰの添加によって、３００ｎｍのＳＬＳ線維が生成され、複数のＳＬＳ線維が会合してなる凝集体を沈殿物として得ることができる。本発明では、会合阻止剤の添加と共に、コラーゲン溶液を撹拌して物理的に会合を抑制してもよい。撹拌によりＳＬＳ線維の凝集体を破砕し、沈殿物の粒子径をより短径に調整することができる。
【００８２】
本発明では、コラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％の等電点沈殿物を粗コラーゲン沈殿物として使用する。含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２質量％に満たない場合には、遠心分離やろ過などによって回収した等電点沈殿物を再度等電点沈殿と同じｐＨに調整した水で洗浄して脱塩し、再度遠心分離やろ過などを行い粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。
【００８３】
同様に塩析によって沈殿物を生成した場合には、再び塩析と同じ塩濃度の水で洗浄した後に、再度遠心分離やろ過などを行い粗コラーゲン沈殿物として使用することができる。なお、等電点沈殿物や塩析物の単回の遠心分離やろ過などによって上記濃度になった場合には、このような遠心分離やろ過が、同時に濃度調整工程となっており、特段の濃度調整工程を行う必要はない。
【００８４】
（ｉｉ）親水性有機溶媒への分散
前記粗コラーゲン沈殿物を前記親水性有機溶媒に分散させることで粗コラーゲン組成物を簡便に脱水し、かつ精製することができる。前記した粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒としては、水と混和しうる炭素含有溶媒であればよく、特に制限されず、例えばアルコール、ケトン、エーテル、エステル、極性非プロトン性溶媒などが挙げられる。
【００８５】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ‐ブタノール等の炭素数１〜６の一価アルコールやエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコールなどがある。ケトンとしてはアセトン、メチルエチルケトンなどがある。また、エーテルとしてはジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル等のグリコールエーテルや、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテルなどがある。更に、エステルとしては酢酸エチル、乳酸エチルなどがあり、極性非プロトン性溶媒としてはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジンなどがある。中でも好ましくは水と任意の割合で混和しうるもの、例えばアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。中でも、エタノール、アセトン、ジエチルエーテルまたはこれらの混合液を好適に使用することができる。
【００８６】
使用する親水性有機溶媒の温度は、１５℃以下であることが好ましい。可溶化コラーゲンやコラーゲン誘導体を変性させず、三重螺旋構造を維持するためである。
粗コラーゲン沈殿物に対する前記親水性有機溶媒の使用量は、使用する親水性有機溶媒によって適宜選択することができるが、例えば、エタノールを使用する場合は、前記粗コラーゲン沈殿物１質量部に対して、エタノールを３〜２０００質量部、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、特に好ましくは１０〜３０質量部添加することが好ましい。
【００８７】
なお、粗コラーゲン沈殿物を分散させた親水性有機溶媒において、前記親水性有機溶媒の濃度は７５質量％以上であることが好ましく、より好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９５質量％以上である。粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させたコラーゲン分散液における親水性有機溶媒の濃度が７５質量％を下回ると、親水性有機溶媒から回収したコラーゲンが吸湿しているため、長時間の乾燥時間を必要とし、かつ乾燥中にコラーゲン分子が相互に密着するため、微細かつ多孔質のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末とならない場合がある。
【００８８】
粗コラーゲン沈殿物は、親水性有機溶媒に分散した後にこれを撹拌してもよい。この際、ホモジナイザーを使用する場合は、会合を防止しつつ粗コラーゲン沈殿物を調製する際と同様の撹拌条件で親水性有機溶媒を撹拌してもよく、この条件は、撹拌装置の撹拌方法、実際の分散の程度に応じて適宜、選択することができる。なお、撹拌により熱が発生するため、冷却しながら撹拌することが好ましい。
（ｉｉｉ）固形物の分取
親水性有機溶媒に分散させた粗コラーゲン沈殿物は、溶媒中で沈殿する。本発明では、この沈殿物を分取するため、親水性有機溶媒分散液を濾過し、または遠心分離などの分離手段によってコラーゲン沈殿物を分取する。このような親水性有機溶媒による分散および分取は、１回で十分であるが、２〜３回など複数回行ってもよい。
【００８９】
（ｉｖ）乾燥
前記固形物を乾燥し、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を得ることができる。親水性有機溶媒に分散させた後に得た固形物は、室温で風乾することができる点に特徴がある。乾燥機を用いるなど他の方法で乾燥してもよいが、その際、温度は１５℃未満とすることが好ましい。
【００９０】
前記粗コラーゲン沈殿物を構成するコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物は、平均粒子径が１〜１，０００μｍと従来よりも短いため、単位質量あたりの表面積が広く、親水性有機溶媒による脱水が容易であること、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％であるため、親水性有機溶媒に含まれる水分量を低減させ、風乾による乾燥によってコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の粉末化を可能にしたと考えられる。しかも、風乾によれば加熱処理を回避し、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の熱変性を防止することができる。これにより、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の溶液は、三重螺旋構造を呈する。なお、本発明では、このようにして得られたコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を、さらにミルなどで破砕して粒子径を調整してもよい。
【００９１】
従来から、コラーゲンの精製方法としては、酸性のコラーゲン溶液に塩類を添加して沈殿させる塩析方法、有機溶媒を添加する有機溶媒沈殿法、酸もしくはアルカリを添加する等電点沈殿法などが知られている。しかしながら、等電点がｐＨ３．５〜８．０のコラーゲン溶液の等電点沈殿物に親水性有機溶媒を添加してコラーゲンを粉末化した例は存在しかなった。コラーゲンは本来親水性が高く等電点沈殿物にも多量の水が存在するため、凍結乾燥などによって固形物とすることが一般的だからである。むしろ、前記特許公報６の比較例１では、アテロコラーゲンを塩析したコラーゲンの沈殿物をエタノールで洗浄することを試みているが、コラーゲン繊維の中に食塩を含んだ水を抱き込んでいるため脱水ができなかったと記載している。しかしながら、本発明では、等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物を、平均粒子径が１〜１，０００μｍに制御することで、親水性有機溶媒への分散を容易におこなうことができる。
更に、コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させても、コラーゲン濃度が低い場合には親水性有機溶媒による脱水が困難で、沈殿物がペレット状に固化し、粉末状の乾燥物を得ることができなかったが、粗コラーゲン沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物やコラーゲン誘導体沈殿物の濃度が１２〜５０質量％であれば、親水性有機溶媒による脱水を効率的に行うことができ、このため、親水性有機溶媒から分取した固形分の含水率を極めて低く調整できる。しかも、これらを室温で乾燥することで微細なコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を調製することができたのである。加えて、親水性有機溶媒に分散させる前のコラーゲン沈殿物は、平均粒子径が１〜１，０００μｍであるため、これを風乾すると平均粒子径が８〜１，０００μｍのコラーゲン粉末となる。本発明では、上記コラーゲン粉末やコラーゲン誘導体粉末を更に微細に加工するなどの処理を行ってもよい。
【００９２】
なお、コラーゲン溶液を長時間かけて室温で乾燥させるとコラーゲンの乾燥物を得ることができるが、容器の壁などにコラーゲンやコラーゲン誘導体が付着し、フィルム状や板状またはブロック状になる。本発明の特徴は、風乾によりコラーゲン粉末を得られる点にある。また、コラーゲン濃度が０．１〜１０質量％である溶解液をノズルの吐出孔を経て親水性有機溶媒に投入してコラーゲン繊維を沈殿させると、得られるコラーゲン繊維の表面には多孔が形成されず表面が平滑なフィルム状になる。
【００９３】
（９）コラーゲン担持物の製造方法
本発明のコラーゲン担持物は、前記粗コラーゲン沈殿物の親水性有機溶媒分散液と基材とを接触させる湿式法と、前記コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を基材の接触させる乾式法とによって製造することができる。
【００９４】
（ｉ）湿式製造法
本発明のコラーゲン担持物は、等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することで製造することができる。より具体的には、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５〜６．０で等電点沈澱させて平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥してもよい。また、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、ｐＨ３．５〜６．０で等電点沈澱させ、前記沈殿を破砕して平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物とし、前記粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥してもよい。
【００９５】
具体的には、前記粗コラーゲン沈殿物を前記親水性溶媒に分散させる。分散方法は、例えば、ミキサーやホモジナイザーを使用することができる。親水性溶媒の使用量は、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の製造方法と同様であり、使用する親水性有機溶媒によって適宜選択することができるが、例えば、エタノールを使用する場合は、前記粗コラーゲン沈殿物１質量部に対して、エタノールを３〜２０００質量部、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、特に好ましくは１０〜３０質量部添加することが好ましい。
【００９６】
ついで、紙や布などの基材を使用し、前記親水性有機溶媒分散液を前記基材で濾過して基材にコラーゲンを担持させる。基材への担持方法としては、前記基材をコラーゲンの親水性有機溶媒分散液に含浸させてもよく、基材にコラーゲンの親水性有機溶媒分散液を塗工し乾燥させる方法、その他であってもよい。基材に対するコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末の担持量は、基材１ｃｍ２あたり、５０μｇ〜１５ｍｇ、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ、より好ましくは０．５〜１．５ｍｇである。１５ｍｇを上回ると基材への均一な担持が困難となる場合がある。一方、５０μｇを下回ると、コラーゲンの作用が十分に発揮されない場合がある。
【００９７】
次いで、基材に担持したコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を乾燥する。本発明では、親水性有機溶媒によってコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が脱水されているため、室温で前記基材に担持したコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を乾燥しうる点に特徴がある。ただし、他の方法で乾燥してもよい。その際、温度は１５℃未満とすることが好ましい。
【００９８】
上記方法によれば、基材の表面にコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が薄く塗布されるため、コラーゲンの乾燥が容易である。また、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体以外を含ませることなく基材に担持できるため、特に医療用途で好適である。
【００９９】
（ｉｉ）乾式製造法
一方、予めコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を調製し、バインダーを介して基材に塗工してもよい。
このようなバインダーとしては、カラギーナン、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アルギン酸、澱粉およびその誘導体、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースやヒドロキシアルキルセルロースなど）などの水溶性高分子多糖類やポリビニルアルコール（ＰＶＡ）や変性ＰＶＡ、不飽和ジカルボン酸を共重合したもの、アクリル酸およびその誘導体、ポリエーテル（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなど）などの水溶性ポリマーなどを例示することができる。バインダーの配合量は使用するバインダーの種類によって適宜選択することができる。
【０１００】
基材に対するコラーゲン粉末の担持量は、湿式法と同様に、基材１ｃｍ２あたり、５０μｇ〜１５ｍｇである。
次いで、基材に担持したコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を乾燥する。バインダーの種類や配合量によって異なるが、室温で乾燥することができる。ただし、送風その他の方法で乾燥してもよい。その際、温度は１５℃未満とすることが好ましい。
上記方法によれば、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末に他の配合物を含有させる場合に好適である。
【実施例】
【０１０１】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【０１０２】
（実施例１）
（１）豚皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲンを原料とした。終濃度３質量％水酸化ナトリウム、１．９％（ｖ／ｗ）モノメチルアミンとなるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５質量％となるよう調製した不溶性コラーゲンを懸濁し、１８℃、３週間可溶化処理を行った。上記のようにして得たアルカリ可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収した。回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度３質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解した。次に布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムでｐＨ４．５となるよう調整し、マスコロイダー（石臼式磨砕機：増幸産業社製）にて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１４１μｍであった。次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、再びｐＨ４．５に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３０質量％であった。得られたコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を図１に示す。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
【０１０３】
（２）得られたコラーゲン粉末を電子顕微鏡像により観察した。結果を図２に示す。粉末コラーゲンの平均粒子径は１５８μｍで、多孔質な粉体であることが判明した。表１に実施例１の概要および結果を示す。
【０１０４】
（３）得られたコラーゲン粉末の変性温度を示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定した。結果を図３および表２に示す。対照として実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲン溶液の結果も示す。粉末コラーゲンでは１１２．４℃に大きな熱量変化のピークが確認された。
（４）得られたコラーゲン粉末５ｍｇを１０ｍＭ酢酸１ｍｌに再溶解し、５ｍＭ酢酸で終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調製したコラーゲン溶液の円二色性（ＣＤ）を２０℃で測定した。結果を図４に示す。対照として実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲン溶液（未変性コラーゲン）および前記アルカリ可溶化コラーゲン溶液を温度１００℃で３分間熱変性させたアルカリ可溶化コラーゲン溶液（変性コラーゲン）の結果も示す。再溶解したコラーゲン溶液（本発明のコラーゲン粉末）は、未変性コラーゲンのカーブと略一致し、２０℃において三重らせん構造を維持していることが明らかとなった。
【０１０５】
（５） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを表３に示す組成の溶解基準液、溶解液Ａ、溶解液Ｂ、溶解液Ｃ、溶解液Ｄそれぞれ１ｍｌに添加して溶解性を評価した。
【０１０６】
（６） また、溶解液Ｂを用いて溶解初速度を測定した。コラーゲンは親水性が高く、溶解と膨潤との相違が不明確であるため、溶解初速度の測定は以下に従った。
【０１０７】
溶解初速度の測定
内径１０ｍｍ、長さ４０ｍｍ、容量２ｍｌの円筒形チューブに、サンプル５ｍｇを表１の溶解液Ｂ １ｍｌと共に混合して密栓し、１分間に２０回の１８０℃の転倒混和を行った。なお、溶解液Ｂおよび操作は、温度２０℃にて行った。混和後、２分、４分、６分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分にその一部をサンプリングし、５，０００ｒｐｍで遠心した上澄み液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルをＣＢＢで染色した。脱色後、コラーゲンのバンドの濃度を画像解析ソフト（ＮＩＨ ｉｍａｇｅ）を用いて定量し上澄み液のコラーゲン濃度を算出した。ついで、経過時間とコラーゲン濃度との関係から、溶解初速度を算出した。なお、溶解初速度は、混和０時から１０分以内の直線性のある時間で算出した。
表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。なお、表４において、◎は４５分未満に溶解した場合、○は４５分以上９０分未満内に溶解した場合、△は９０分以上１８０分未満内で溶解した場合、×は１８０分以内には溶解しない場合を示す。
また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１０８】
（７）上記（１）で調製した固形コラーゲンを、中央化工機株式会社製、製振動乾燥機ＶＵ−４５を使用し、真空度４０Ｔｏｒｒ乾燥温度４０℃で４時間乾燥し、コラーゲン粉末を得た。このコラーゲン粉末について、４連式比表面積・細孔分布測定装置（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ製、商品名「ＮＯＶＡ−４２００ｅ型」）を用い、ＢＥＴ１点法にて比表面積を測定した。結果を表６に示す。
【０１０９】
（８）上記（７）で調製したコラーゲン粉末について、レーザー回折・散乱法にて粒度分布を測定した。測定は、（株式会社セイシン企業製、商品名「ＬＭＳ−２０００ｅ」）を用いた。このコラーゲン粉末の平均粒子径を表６に、粒度分布を図６に、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図７に示す。
【０１１０】
（実施例２）
（１） 粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒をアセトンに変更した以外は実施例１と同様に操作してコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例２の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
【０１１１】
（実施例３）
（１） 粗コラーゲン沈殿物を分散させる親水性有機溶媒をジエチルエーテルに変更した以外は実施例１と同様に操作してコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例３の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
【０１１２】
（実施例４）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物１ｇを温度２０℃のエタノール９９９ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、コラーゲンを均一に分散させた分散液２０ｍｌを直径５０ｍｍの紙基材を濾紙として使用し、前記紙基材でコラーゲン沈殿物を濾取し、この紙基材を室温で乾燥させてコラーゲン担持物を作製した。
（２） 溶解液量を２ｍｌに変更した以外は実施例１と同様にして、得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、溶解性を評価した。表１に、実施例４の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解液の添加により、コラーゲン粉末は速やかに溶解し、透明のコラーゲン溶液となった。
【０１１３】
（実施例５）
（１） 実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調製し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。その後、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍの条件で等電点沈澱を破砕した。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は７２４μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調製した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２７質量％であった。
【０１１４】
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例５の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１１５】
（実施例６）
（１） 実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調製し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。その後、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍの条件で、３回等電点沈澱を破砕した。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は３３５μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調製した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２８質量％であった。
【０１１６】
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、実施例６の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。
【０１１７】
（実施例７）
実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲンの等電点沈殿物（等電点ｐＨ４．５）をメタノール中に分散し、終濃度０．１Ｍとなるように塩酸を加えた。室温で３時間撹拌しながらエステル化反応を行い、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを中性にして反応を停止させると共にコラーゲンを沈澱させた。沈殿物を遠心して分取した後、１０ｍＭの酢酸に再溶解し、メチルエステル化コラーゲンを得た。メチルエステル化コラーゲンの等電点はｐＨ７．９であった。
【０１１８】
メチルエステル化コラーゲン溶液に、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えてホモジナイザーで撹拌しながら塩析し、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は２４４μｍであり、コラーゲン濃度は２９質量％であった。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物０．５ｇを温度２０℃のエタノール９．５ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾してコラーゲン粉末を得た。表１に、実施例７の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。
【０１１９】
（実施例８）
牛皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲンを原料とした。不溶性コラーゲンをコラーゲン終濃度２質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整した。コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行った。この酵素可溶化コラーゲン液（等電点ｐＨ９．０）に水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ８〜９に調整し、コラーゲンを等電点沈澱させた。この等電点沈澱分散液に終濃度０．５ｍＭとなるように無水コハク酸を加え、室温で撹拌しながら１時間アシル化反応を行った。反応後、塩酸を加えて溶液を酸性にし、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えて反応を停止させると共にサクシニル化コラーゲンを沈澱させた。沈殿物を遠心して分取した後、サクシニル化コラーゲンを１０ｍＭの酢酸に再溶解し、サクシニル化コラーゲンを得た。サクシニル化コラーゲンの等電点は５．４であった。
【０１２０】
サクシニル化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるように塩化ナトリウムを加えてホモジナイザーで撹拌しながら塩析させ、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物を得た。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１６７μｍであり、コラーゲン濃度は４２質量％であった。
【０１２１】
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物０．５ｇを温度２０℃のエタノール９．５ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過して固形コラーゲンを分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。表１に、実施例８の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。
【０１２２】
（比較例１）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度１質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液を凍結乾燥し、コラーゲンスポンジを作製した。図８に、コラーゲンスポンジの電子顕微鏡像を示す。
（２） 得られたコラーゲンスポンジ５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例１の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１２３】
（比較例２）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度０．２５質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液をアクリル板にキャストし、風乾することによりコラーゲンフィルムを作製した。図９に、コラーゲンフィルムの電子顕微鏡像を示す。
（２） 得られたコラーゲンフィルム５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例２の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。
【０１２４】
（比較例３）
（１） 実施例１で得られた粗コラーゲン沈殿物を終濃度１質量％となるように塩酸に再溶解し、その後水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７．５のアルカリ可溶化コラーゲン溶液を得た。この溶液を２７ゲージの注射針を用いてエタノール中に吐出し、その後風乾することによりコラーゲン繊維を作製した。図１０に、コラーゲン繊維の電子顕微鏡像を示す。
（２） 得られたコラーゲン繊維５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例３の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。
【０１２５】
（比較例４）
（１） 豚皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した不溶性コラーゲン線維を原料とした。不溶性コラーゲン線維をコラーゲン終濃度２質量％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整した。コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行った。酵素反応停止後、上記のようにして得た酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度５質量％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈澱を回収した。
回収した塩析沈澱を、コラーゲン濃度２質量％となる容量の蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解した。次に布および濾紙で濾過した後、水酸化ナトリウムでｐＨ９．０となるよう調整し、マスコロイダーにて流速５００ｍｌ／ｍｉｎ、回転数１，５００ｒｐｍ、クリアランス５０μｍで撹拌しながらコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１３１μｍであった。次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ９．０に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は２３質量％であった。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過してコラーゲン粉末を分取し、室温で風乾することによりコラーゲン粉末を得た。得られたコラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図１１に示す。
（２） 得られたコラーゲン粉末５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例４の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。
【０１２６】
（比較例５）
（１） 実施例１で得られたアルカリ可溶化コラーゲン液に、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ４．５となるよう調整し、静置することによりコラーゲンを等電点沈澱させた。得られた沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物の平均粒子径は、１，８５８μｍであった。遠心分離により沈澱を回収後、再びｐＨ４．５に調整した蒸留水で洗浄して脱塩し、上記遠心分離を１０回行い、粗コラーゲン沈殿物として回収した。この粗コラーゲン沈殿物のコラーゲン濃度は３３質量％であった。得られたコラーゲン沈殿物の位相差顕微鏡像を図１２に示す。
次いで、得られた粗コラーゲン沈殿物５０ｇを温度２０℃のエタノール９５０ｇに投入し、ホモジナイザーを用いて３０分間分散させ、分散液を濾過した。しかし、濾過したコラーゲン分散物はフィルム状となり、粉末にはならなかった。
（２） 得られたコラーゲン固形物５ｍｇを使用し、実施例１と同様に操作し、溶解性を評価した。表１に、比較例５の概要を示し、表４に溶解性、表５に溶解初速度の結果を示す。溶解初速度の結果を示す。また、図５に溶解初速度の測定における、上記上澄みのコラーゲン濃度の経時変化を示す。
【０１２７】
（比較例６）
（１）実施例１で得たアルカリ可溶化コラーゲンの等電点沈殿物を終濃度３％となるように蒸留水に分散し、均一な分散液となるように３０分間ホモジナイズした。この分散液を、噴霧乾燥機を使用して、入口温度１２０℃、出口温度６０℃になるように熱風温度を調整してスプレードライし、コラーゲン粉末を得た。表１に、比較例６の概要を示し、表４に溶解性の結果を示す。
噴霧乾燥して得たコラーゲン粉末は２０時間後にも約２０％程度しか溶解しなかった。原料のコラーゲン沈殿物は実施例１と同じものであるため、実施例１との溶解性の差は、コラーゲン分子の相違ではなく処理工程に依存した形状の相違によるものである。溶け残りを観察すると、噴霧乾燥品はコラーゲン粉末が微細であるためダマ状になり、ダマの表面のみ半透明で溶解していた。噴霧乾燥ではコラーゲン粒子の平均粒子径が４．６０μｍと小さく、かつその表面が比較的滑らかであるため溶解液がダマの内部まで浸透しにくく、これが溶解性に劣る理由と考えられる。これに対し、実施例１〜８はいずれもダマを形成することは無かった。
（２）上記（１）で調製したコラーゲン粉末について、実施例１と同様にして、ＢＥＴ１点法にて比表面積を、レーザー回折・散乱法にて粒度分布を測定した。比表面積および平均粒子径を表６に、粒度分布を図１３に、コラーゲン粉末の電子顕微鏡像を図１４に示
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
【表３】
【０１３１】
【表４】
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明によれば、簡便な操作でコラーゲン粉末を製造することができる。しかも、得られたコラーゲン粉末は熱安定性に優れており、ｐＨ５．５〜８．５の溶液に速やかに溶解し、三重螺旋構造のコラーゲン溶液となり、有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末。
【請求項２】
請求項１記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を、基材に担持させてなるコラーゲン担持物。
【請求項３】
前記基材が、紙、布またはこれらの複合物である、請求項２記載のコラーゲン担持物。
【請求項４】
粘着テープの一部に請求項２または３記載のコラーゲン担持物を添付した絆創膏。
【請求項５】
請求項１記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、または請求項２もしくは３記載のコラーゲン担持物と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなるコラーゲンキット。
【請求項６】
等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、
得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することを特徴とする、コラーゲン担持物の製造方法。
【請求項７】
前記粗コラーゲン沈殿物が、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱させて平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、
前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％としたものである、請求項６記載のコラーゲン担持物の製造方法。
【請求項１】
等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を乾燥させてなる粉末であって、当該粉末５ｍｇのｐＨ６．５溶液の溶解初速度が０．２ｍｇ／分以上であることを特徴とする、コラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末。
【請求項２】
請求項１記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末を、基材に担持させてなるコラーゲン担持物。
【請求項３】
前記基材が、紙、布またはこれらの複合物である、請求項２記載のコラーゲン担持物。
【請求項４】
粘着テープの一部に請求項２または３記載のコラーゲン担持物を添付した絆創膏。
【請求項５】
請求項１記載のコラーゲン粉末および／またはコラーゲン誘導体粉末、または請求項２もしくは３記載のコラーゲン担持物と、ｐＨ５．５〜８．５の溶解液とからなるコラーゲンキット。
【請求項６】
等電点がｐＨ３．５〜８．０であり、平均粒子径１〜１，０００μｍのコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を１２〜５０質量％含有する粗コラーゲン沈殿物を親水性有機溶媒に分散させ、
得られた親水性有機溶媒分散液を基材に担持し、および乾燥することを特徴とする、コラーゲン担持物の製造方法。
【請求項７】
前記粗コラーゲン沈殿物が、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する溶液を、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の会合を制御しつつｐＨ３．５〜８．０で等電点沈澱させて平均粒子径１〜１，０００μｍの等電点沈殿物を得て、
前記等電点沈殿物に含まれるコラーゲン沈殿物および／またはコラーゲン誘導体沈殿物の濃度を調整して１２〜５０質量％としたものである、請求項６記載のコラーゲン担持物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−４６５１２（Ｐ２０１２−４６５１２Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６７８２２（Ｐ２０１１−１６７８２２）
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【出願人】（０００１３５１５１）株式会社ニッピ (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【出願人】（０００１３５１５１）株式会社ニッピ (18)
【Ｆターム（参考）】
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