コンパニオンアニマルのためのプロバイオティク乳酸桿菌の使用方法
本発明によれば、コンパニオンアニマルにおける、乳酸桿菌属のプロバイオティク細菌の使用方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティク乳酸桿菌の分野、更に明確にはコンパニオンアニマルにおけるプロバイオティク乳酸桿菌の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌によるコロニー形成から哺乳類の胃腸（ＧＩ）管を保護するための防衛機構は非常に複雑である。大抵の哺乳類のＧＩ管は、天然微生物相、及び体をむしばむ病原微生物によってコロニー形成される。健康な状態では、これらの対抗する微生物相は平衡状態にある。ヒト、並びにネコ、イヌ及びウサギを包含するコンパニオンアニマルなどの他の哺乳類種の両者において、腸の微生物層平衡の変更が多くのＧＩ疾患を引き起こすか又は予防することがある。コンパニオンアニマルにおける健康は、その摂食やＧＩの健康と密接に関係しており、及びこれら動物体内での腸微生物層の平衡の維持が、より健康なペットをもたらすことがある。
【０００３】
腸微生物相の数と組成は安定している傾向にあるが、年齢及び食餌によって変更されることがある。胃液酸性度、胆汁、腸ぜん動運動及び局所免疫は、ヒト及び様々な他の哺乳類の小腸内の細菌叢の調節に重要であると考えられている因子である。イヌ科動物及びネコ科動物に見出されるものを包含するペットにおけるＧＩ疾患はしばしば、細菌の異常増殖及び病原菌によるエンテロトキシンの生成と関係がある。これら因子は、腸内微生物相平衡を乱して、炎症及び異常な免疫反応を促進することがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
最近、切除及び洗浄されたヒト及びイヌ科動物などの哺乳類の胃腸管から単離することによって得られるいくつかの貴重な細菌株、並びにプロバイオティク（probiotic）剤としてのそれらの潜在的な利用に脚光を当てた研究が始まっている。プロバイオティクスは、生菌もしくは死菌、タンパク質もしくは炭水化物などのそれらの構成成分、又は天然微生物相をＧＩ管内に保存することによって哺乳類の健康を促進する細菌発酵の精製画分を調製して、異常な免疫反応における正常な制御を強化すると考えられている。プロバイオティク細菌は、治療を意図している種に由来するか又は近縁種である場合、より有効であると一部で考えられている。幾つかのプロバイオティク細菌株は解明されているが、これら菌株の使用方法及びそれらの治療上の有効性はヒトの胃腸疾患の調節に限られていた。これら生物体が、イヌ科動物及びネコ科動物などのコンパニオンアニマルにおける胃腸管以外の生理学的系に有利な影響を及ぼす可能性については今までのところ検討されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、コンパニオンアニマルにおける哺乳類の切除及び洗浄された胃腸管から単離することによって得られるプロバイオティク乳酸桿菌の使用方法が提供される。前記方法には、免疫系、体重制御及び身体組成、泌尿器の健康、皮膚及び被毛疾患、並びに老化の予防的又は治療上の処置が包含される。
【０００６】
本発明のこれら及びその他の特徴、態様、及び利点は、本開示を読むことにより当業者に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（配列）
配列番号１ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ １２２２（ＮＣＩＭＢ ４１１９４）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号２ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ ３１３３（ＮＣＩＭＢ ４１１９５）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号３ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ ５３２３（ＮＣＩＭＢ ４１１９６）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号４ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ ６３３１（ＮＣＩＭＢ ４１１９７）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号５ − 配列分析用１６ｓ−２３ｓ 左ＰＣＲプライマー配列。
配列番号６ − 配列分析用１６ｓ−２３ｓ 右ＰＣＲプライマー配列。
【０００８】
（菌委託番号）
以下の表に、本発明に有用な、切除及び洗浄された哺乳類の胃腸管から単離することによって得られるプロバイオティク乳酸桿菌についての種、菌株番号及び寄託番号を表す。菌株は、国立産業食品及び海洋菌収集所（National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria（ＮＣＩＭＢ））、英国アバディーン、に寄託されている。
【表１】
【０００９】
本明細書の全ての重量、測定値及び濃度は、特に指定のない限り、組成物全体に関して２５℃で測定される。
【００１０】
指示がない限り、本明細書で言及される組成物のすべてのパーセンテージは重量％であり、すべての比率は重量比である。
【００１１】
指示がない限り、分子量は全て、重量平均分子量である。
【００１２】
特に指示のない限り、本文内で参照される全ての文献の内容は、その全てを本明細書に参考として組み込む。
【００１３】
実際に測定した値の特定の例を提示する場合を除いて、本明細書で言及される数値は、「約」という言葉で修飾されていると考えるべきである。
【００１４】
以下の記載に於いて、略語ＣＦＵ（「コロニー形成単位」）は、当該分野に於いて通常理解されているであろうように、寒天プレート上での微生物の総数によって示される細菌細胞の数を意味する。
【００１５】
本明細書で使用する時、「その突然変異体類」という用語には、参照菌株の１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性を有する派生した細菌株が包含されるが、そうでなければ、細菌ゲノム内の他のＤＮＡ配列中のＤＮＡ突然変異を含む。
【００１６】
本明細書で使用する時、「ＤＮＡ突然変異」という用語には、親ヌクレオチド又はアミノ酸配列に組み込まれる遺伝子組換えを包含するが、親配列と少なくとも５０％の相同性を維持する、欠失、挿入、トランスバージョン、及び当業者に公知の他のＤＮＡ修飾などの少なくとも一塩基変化を含む自然又は誘導突然変異が包含される。好ましくは、ＤＮＡ突然変異（単数又は複数）を含む配列は、親配列と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは８５％の相同性を有する。本明細書で使用する時、配列の「相同性」は、当業者に公知の標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、相同性は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で公的に入手可能なオンライン相同性アルゴリズム「ＢＬＡＳＴ」プログラムを用いて決定することができる。
【００１７】
本明細書で使用する時、「遺伝子組換え」は、外来性及び／又は内在性ＤＮＡ配列を生物体のゲノムへ、前記生物体のゲノムへの挿入によって又は当業者に公知のプラスミドＤＮＡもしくはバクテリオファージを包含するベクターによって、組み込むことを包含し、前記ＤＮＡ配列の長さは、デオキシリボ核酸塩基少なくとも２個分である。
【００１８】
本明細書で使用する時、「コンパニオンアニマル」は家畜を意味する。好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、飼い慣らされたイヌ科動物、ネコ科動物、ウサギ、フェレット、ウマ、ウシなどを意味する。より好ましくは、「コンパニオンアニマル」は飼い慣らされたイヌ科動物又はネコ科動物を意味する。
【００１９】
切除及び洗浄されたイヌ胃腸管から単離することによって得られるラクトバシラス ムリヌス属の乳酸菌株は、動物、好ましくはコンパニオンアニマル又はヒト、における経口消費後にプロバイオティク効果を供給するために使用することができる。このプロバイオティク効果は一般に、動物の健康全般を維持及び改善する。症状を治療上軽減する際又は予防法による病気の予防において利益を得る、動物の健康及び生理機能の非限定的な要素としては、炎症性疾患、免疫不全症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、癌（特に胃腸及び免疫系の癌）、下痢性疾患、抗生物質による下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、アミロイド症、リウマチ様関節炎、関節炎、関節可動性、真性糖尿病、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染症、歯周病、泌尿生殖器疾患、手術による外傷、手術に起因する転移性疾患、敗血症、体重減少、体重増加、過剰な脂肪組織の蓄積、拒食症、体温の調節、悪液質、創傷治癒、潰瘍、腸バリア感染症、アレルギー、喘息、呼吸器系疾患、循環器系疾患、冠状動脈性心疾患、貧血、血液凝固系の疾患、腎疾患、中枢神経系の疾患、肝疾患、虚血、栄養障害、骨粗鬆症、内分泌系疾患、及び上皮疾患が挙げられる。胃腸管の治療が好ましく、下痢の治療又は予防；免疫系の調節、好ましくは自己免疫疾患及び炎症の治療又は予防；皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、好ましくはアトピー性皮膚疾患の治療又は予防；精神的な自覚及び活動レベルを包含する、老化の影響の改善又は低減；並びに感染中及び感染後の体重減少の予防が挙げられる。
【００２０】
上記の疾患の治療は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。例えば、自己免疫疾患や炎症を包含する炎症性疾患は、リンパ球幼若化現象、ナチュラルキラー細胞活性、ワクチンに対する抗体反応、遅延型過敏症、及びこれらの組み合わせなどの生体内免疫機能試験を用いて検出及びモニターすることができる。かかる方法は、本明細書で詳細に説明するが、当業者には周知である。
【００２１】
１．リンパ球幼若化現象：このアッセイは、様々な分裂促進因子に対する試験動物と対照動物の新鮮全血から分離したリンパ球のインビトロ増殖反応を測定し、総体的なＴ細胞機能及びＢ細胞機能の測度である。詳細には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、当業者に公知のフィコール・ハイパーク密度遠心分離法によって全血から分離する。分離されたＰＢＭＣを、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０細胞培養液で２回洗浄する。洗浄した細胞をＲＰＭＩ １６４０中に再懸濁し、数を数えて、細胞密度を適切に調節する。２×１０５細胞を、様々な分裂促進因子の濃度範囲（０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）に曝露するが、そのうちの幾つかの例としては、ポークウィード・マイトジェン（ギブコ（Gibco））、植物性血球凝集素（ギブコ（Gibco））及びコンカナバリンＡ（シグマ（Sigma））に３７℃において７２時間で３回、並びに１０％ウシ胎児血清（シグマ（Sigma））を含む５％ ＣＯ２が挙げられる。５４時間で、細胞を１μＣｉ３Ｈ−チミジンに適用し、前記細胞を収集して、シンチレーション計数をトップカウント（TopCount）ＮＸＴにおいて７２時間で読み取る。
【００２２】
２．ナチュラルキラー細胞活性：米国特許第６，３１０，０９０号に記載の通り、このアッセイは、試験動物と対照動物の新鮮全血から分離されたナチュラルキラー細胞のインビトロエフェクター活性を測定する。ナチュラルキラー細胞は、哺乳類の生得的な免疫機能の一構成要素である。イヌ甲状腺の腺ガン細胞を、ＮＫ細胞の細胞毒性活性を評価する際に標的細胞として使用した。この細胞株は、イヌＮＫ細胞によって殺され易いことが以前に示された。標的細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬが補充された最小必須培養液（ＭＥＭ；シグマ・ケム社（Sigma Chem.Co.）、ミズーリ州セントルイス）２０ｍＬを含むＴ７５フラスコ内で培養した。密集したら、標的細胞をトリプシン処理し、３回洗浄して、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０ ＋ １０％ＦＣＳ ＋ ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ ＋ ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）に５×１０５細胞／ｍＬまで再懸濁した。３通りの標的細胞のアリコート１００μＬをピペットで９６穴のＵ底プレート（コスター（Costar）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に移し、８時間インキュベートして細胞を粘着させた。（上述と同様の）フィコール・ハイパーク分離で分離したリンパ球（エフェクター細胞；１００μＬ）を次に標的細胞に添加して、エフェクター／標的細胞（Ｅ：Ｔ）比１０：１を提供した。３７℃で１０時間インキュベートした後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）５μｇを含有する基質２０μＬを添加した。前記混合物を３７℃で４時間インキュベートし、その後、未代謝のＭＴＴを吸引により除去した。９５％エタノール２００μＬを添加することによって、ホルマザン結晶を溶解した。マイクロプレート読み取り機を用いて、５７０ｎｍで光学密度を測定した。ＮＫ細胞−特異的溶解の百分率を以下のようにして計算した：
特異的細胞毒性（％）＝１００×｛１−［（標的細胞及びエフェクター細胞のＯＤ−エフェクター細胞のＯＤ）／（標的細胞のＯＤ）］｝
【００２３】
３．ワクチンに対する抗体反応：試験対象に、プロバイオティクス又は対照摂食の少なくとも１２週後に複数のワクチン（５つまで）を与える。ワクチンは新規ワクチンと重複性ワクチンの混合物であってよい。使用できる複数のワクチンの非限定的な例には、フォートドッジ・アニマル・ヘルス社（Fort Dodge Animal Health）で調製されたワクチンの混合物が包含される。本明細書に用いるのに好適なワクチンの非限定的な例としては、犬ジステンパー、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザ、及びパルボウイルスが挙げられる。試験対象のワクチン履歴によって、使用すべきワクチンが決定される。与えられたワクチンに対する特異抗体を、血中で３週間測定し、対照及びプロバイオティクス摂食群での反応の長さ及び強さを比較する。
【００２４】
４．遅延型過敏症：免疫系状態を評価する生体内非侵襲法。この試験は、ヒツジ赤血球多価ワクチン、ヒスタミン（０．０２７５ｇ／Ｌ リン酸ヒスタミン １００μＬ；グリア（Greer）、ノースカロライナ州ルノアール）、又はＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水１００μＬ、８．５ｇ／Ｌ；シグマ（Sigma））と組み合わせたポリクローナル分裂促進因子フィトヘムマグルチニン（ＰＨＡ）の皮内注射を含む。抗原に対する免疫反応を、キャリパーを用い、注射後０、２４、４８及び７２時間の時間間隔で皮下脂肪厚として記録する。皮下脂肪厚の増加は、本発明の細菌の処置により低下すべき高い敏捷反応の指標である。
【００２５】
本発明の乳酸桿菌細菌の効果を求めるための追加的な方法は、米国特許第６，１３３，３２３号及び米国特許第６，３１０，０９０号に記載されている。
【００２６】
更に、老化の影響を改善させることは、体脂肪重量、除脂肪体重及び骨塩量を包含する身体組成を測定するための複式Ｘ線吸光光度計又はＣＴスキャンを用いて決定することができる。同様に、この方法は、感染後の対象の体重減少又は骨密度などの解剖学形態変化を決定するのに用いることができる。
【００２７】
本発明の乳酸桿菌はまた、コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルを減少させるための方法に使用することもできる。エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、コルチゾール及びＣ反応性タンパク質を包含する血中ストレスホルモンレベルを測定して、ストレスレベル及びその低下又は維持を決定することができる。これらホルモンは、ストレスの公認生物マーカーであり、当業者に公知の方法を用いて容易に測定することができる。
【００２８】
更にその上、アトピー性皮膚疾患を包含するコンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善を、２人の訓練された個人によって行われる皮膚及び被毛判定を用いて測定することができる。かかる判定中に評価される判定基準の例としては以下のものが挙げられる：
ａ）抜け毛指数：抜け毛指数は、標準化されたブラシがけセッション中に発生した毛髪を集めることによって各試験対象に割り当てられる。毛髪を確保して重さを計り、対照及び試験対象を比較する。
ｂ）主観的な皮膚／被毛評価：訓練された官能試験員が、抜け毛、フケ、つや、均一性、柔軟性及び密度を評価することによって皮膚及び被毛状態を主観的に評価する。
ｃ）皮膚機能性判定：皮膚表面をアセトン浸漬ガーゼで拭くことによって皮膚のバリア機能を判定することができる。この方法は、単細胞層と、関連する角質層の脂質画分とを除去することによって、皮膚バリアを効果的に破壊する。バリア破壊を、経皮水分損失（ＴＥＷＬ）の増加、及び障害を受けた部分の赤みの程度を当業者に公知の方法を用いて測定することによって定量化する。赤み（紅斑）スコアは、先に記載したカメラと照明装置を用いて得られる。破壊直前及び直後にＴＥＷＬ読み及び赤みスコアを入手し、５時間及び２４時間終点において皮膚の保護及び回復特性を判定する。
【００２９】
コンパニオンアニマルにおける下痢を含む胃腸感染の治療又は予防は、便スコアを用いて測定することができる。便スコアは、以下のガイドラインに従って毎日記録することができ、本発明にかかる細菌を摂食した前後で対照群及び試験群を比較する。
【００３０】
スコア：５ 非常に乾燥している
この便は堅くて、表面に張り付かない。便は、押すと転がる。便を摘み上げた時に、凹みが生じない。便は、１個の完成単位の代わりにしばしば個々の便の群で排泄される。回収後、便は元の形を保持している。
【００３１】
スコア：４ 堅い（理想的な便）
この便は堅くて、形がよく、円筒形である。この便は、摘み上げた時に容易にはばらばらにならない。この便は表面及び手袋に残留物を残すことがある。この便はしばしば一単位として排泄される。回収後、便は元の形を保持している。
【００３２】
スコア：３ 柔らかく、形がある
この便は柔らかいが、明確な形がある。この便は、容易にばらばらになり、また例外なく表面及び手袋に残留物を残す。便は回収後にしばしば元の形を失う。この便はしばしば別のスコアと共に現れるが、全便試料を含むことができる。
【００３３】
スコア：２ 柔らかく、形がない
この便は柔らかく、円筒形ではない。しばしば「２」を連想させる形は「牛のパテ」型である。この便は回収する時に元の形を失い、例外なく表面及び手袋に残留物を残す。この便スコアはしばしば別のスコアと共に現れるが、全便試料を含むことができる。この便試料は数インチ（５〜１５センチ）の面積に広がっていることがある。
【００３４】
スコア：１ 液状
この便スコアは、常に液体のようであり、粒状物が存在しているかどうか分からない。この便は、１個の完全な単位の代わりに、しばしば何層もの層状に排泄される。この便試料には粘液がしばしば存在する。この便試料は非常に回収し難く、表面及び手袋に残留物が常に残る。この便試料は数インチ（５〜１５センチ）の面積に広がっていることがある。
【００３５】
加えて、血便；便の中の異物；又は便中の粘液を包含する他の観測結果もしばしば記録される。
【００３６】
更に、コンパニオンアニマルにおける胃腸管の治療は、コンパニオンアニマルにおける微生物生態系の改善を含むこともできる。コンパニオンアニマルにおける微生物生態系の改善は、好ましくは、コンパニオンアニマルにおける糞便中の病原菌レベルの低下を含む。コンパニオンアニマルにおける糞便中に存在する病原菌のレベルは、当業者に公知の標準的な平板計数法を用いて数えることができる。より好ましくは、病原菌は、クロストリジウム（Clostridia）属、エシェリキア（Escherichia）属、サルモネラ属（Salmonella）、バクテリオデス（bacteriodes）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。病原菌の好適な菌株の非限定的な例としては、ウェルシュ菌、クロストリジウム ディフィシレ、エシェリキア（Eschericia coli）、ネズミチフス菌及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３７】
本発明の細菌の使用方法は、哺乳類、好ましくはコンパニオンアニマルにおける尿路の予防上又は治療上の処置を包含することもできる。尿路処置の非限定的な例としては、尿路感染の治療又は予防、腎結石を包含する腎疾患の治療又は予防、膀胱感染の治療又は予防などが挙げられる。理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸桿菌は、インビトロにて立証されるように、そのシュウ酸の分解能の結果としてこれら疾患の予防に有用であると考えられる。シュウ酸は、腎臓、膀胱及び他の尿路感染をもたらす不溶性沈殿を形成し得る尿代謝の副産物である。シュウ酸を分解して、その結果その沈殿及び尿路内での蓄積を潜在的に予防することによって、本発明の細菌は、尿路感染及び他の疾患を治療及び予防することができる。シュウ酸の分解は、ベーリンガー・マンハイム／Ｒ−バイオ医薬品（Boehringer Mannheim/R-Biopharm）から市販されているシュウ酸試験キット カタログ番号７５５６９９を用いてインビトロにて測定することができる。
【００３８】
本発明の乳酸桿菌は、繊維消化の改善を含む、コンパニオンアニマルにおける健康を改善又は維持するための方法で使用することができる。繊維消化の改善は、前記プロバイオティク細菌並びに有益な内因性微生物相の増殖を促進し、そのことがいくつかの潜在的な病原菌の阻害に役立つので、望ましい。加えて、有害な代謝産物及び結腸発酵から生じる有害な酵素の量を低減することが、ヒトについて報告されている（トモマツ・Ｈ（Tomomatsu,H.）「オリゴ糖類の健康効果（Health effects of oligosaccharides）」、（１９９４年）フード・テクノル（Food Technol）４８、６１〜６５）。繊維消化は、希釈糞便試料を用いて接種する代わりに、各実験が、重要な細菌株の純粋培養を用いたこと以外は、ヴィッカーズ（Vickers）ら（２００１年）、「イヌ科動物結腸微生物相による、選ばれたフラクトオリゴ糖類及び他の繊維基質の発酵の比較（Comparison of fermentation of selected fructooligosaccharides and othe rfiber substrates by canine colonic microflora）」、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．６１（４）、６０９〜６１５に記載の方法を用いて決定することができる。
【００３９】
好ましくは、本発明の方法は、ラクトバシラス サリバリウス(Lactobacilli salivarius)、ラクトバシラス種 カゼイ(Lactobacilli casei)、又はラクトバシラス ムリヌス(Lactobacilli murinus)からなる種から選択される乳酸桿菌の投与を含む。
【００４０】
本発明で有用な、切除及び洗浄された哺乳類ＧＩ管から単離することによって得られるプロバイオティク乳酸桿菌の非限定的な例は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９８／３５０１４、同ＷＯ０３／０１０２９８、及び同ＷＯ０３／０１０２９９に更に詳細に記載されている。
【００４１】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９８／３５０１４には、切除及び洗浄されたヒトＧＩ管から単離されたプロバイオティク ラクトバシラス サリバリウス種が記載されている。これら細菌は、ＮＣＩＭＢに寄託番号４０８２９及び４０８３０で寄託されている。
【００４２】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０３／０１０２９８には、切除及び洗浄されたヒトＧＩ管から単離されたプロバイオティク ラクトバシラス サリバリウス種の更なる例が記載されている。これら細菌は、ＮＣＩＭＢに寄託番号４１０４４、４１０４５、４１０４７、４１０９３及び４１０９４で寄託されている。
【００４３】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０３／０１０２９９には、切除及び洗浄されたヒトＧＩ管から単離されたプロバイオティク ラクトバシラス カゼイ種の更なる例が記載されている。これら細菌は、ＮＣＩＭＢに寄託番号４１０４３、４１０４６、４１０９５、４１０９６及び４１０９７で寄託されている。
【００４４】
更なる例として、動物体内でプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ胃腸管から単離することによって得られる乳酸桿菌の菌株が挙げられる。プロバイオティクスは、生存可能かもしくは死んだ微生物、微生物の加工組成物、タンパク質もしくは炭水化物などのそれらの構成成分、又は宿主に有利に作用する細菌発酵の精製画分である。プロバイオティク細菌の一般的な使用は、生存可能な細胞の形である。しかしながら、それは、死菌液類又はプロバイオティク細菌で表される有益な要因を含有する組成物などの生育不能な細胞にまで拡大することができる。これには、加熱殺菌された微生物類、又は変化したｐＨへの曝露もしくは圧迫を受けることによって殺菌された微生物類を包含することができる。本発明の目的のために、「プロバイオティクス」は、別個に表示されないのであれば、発酵中に本発明の微生物類によって産生された代謝産物も包含するものとする。これらの代謝産物は、発酵の媒質から放出されることがあるか、又は微生物の体内に保存されることがある。本明細書で使用する時、「プロバイオティクス」は、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌性抽出物、細菌性発酵上澄み、及びこれらの組み合わせをも包含し、これらは、治療投与量で与えられると宿主動物に有利な機能を発揮する。
【００４５】
切除及び洗浄された哺乳類のＧＩ管から直接単離することによって得られる乳酸桿菌属の乳酸菌は、生存可能な細菌細胞の摂食後にＧＩ管に接着すること、及び生存可能な形、生育不能な形又は分割された形で動物に与えると、著しく免疫調節性でもあることが分かっている。理論に束縛されるものではないが、切除及び洗浄されたＧＩ管から単離することによって得られる乳酸桿菌は、腸粘膜組織と密に結び付くと考えられる。更に理論に束縛されるものではないが、これによって、プロバイオティク作用を引き起こす代替の宿主反応を生じさせる本発明のプロバイオティク乳酸桿菌が得られると考えられる。切除及び洗浄されたＧＩ管から単離することによって得られるプロバイオティク細菌は、粘膜上皮及び宿主の免疫細胞との直接的な相互作用を介して宿主の免疫系を調節し得ることが分かっている。この免疫調節は、プロバイオティク細菌に関連する伝統的な作用機序、すなわち栄養素のための閉塞及び競合による病原体の腸への接着を予防することと併せて、プロバイオティク生物体として非常に有効な本発明の乳酸桿菌をもたらす。
【００４６】
切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管から単離することによって得られる本発明の乳酸桿菌は、多数の病原菌株／種に対してインビトロ抗菌活性を有する。理論に束縛されるものではないが、インビトロ抗菌活性は動物、好ましくはイヌ科動物及びネコ科動物などのコンパニオンアニマルにおける生体内での潜在的なプロバイオティク活性の指標となると考えられる。本発明の乳酸菌は、好ましくは、ネズミチフス菌、リステリア菌、リステリア イノキュア又はエシェリキア（Eschericia coli）、より好ましくはこれら菌株の組み合わせ、更に好ましくはこれら菌株全て、に対してインビトロ抗菌活性を有する。
【００４７】
理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸菌の前記抗菌活性は、本明細書中の乳酸菌による多数の異なる作用の結果であり得ると考えられる。糞便試料から単離された幾つかの細菌株は、閉塞による腸粘膜への病原体類の接着を予防することによって、経口消費の後でＧＩ管内でそれらのプロバイオティク効果を発揮することが、当該分野では以前に提案されている。これには、細菌コロニーが腸内で確立されるために「生」又は生存可能な細菌細胞の経口消費が必要である。しかしながら、切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管から単離によって得られる本発明の乳酸桿菌は、生存可能な形で与えられた場合には、閉塞に起因していくらかのプロバイオティク効果を発揮すると同時に、病原微生物の増殖を阻害するか又は病原微生物を殺す物質（単数又は複数）のインビトロ発酵中の産生に起因して、生存可能な形か又は生育不能な形で実質的なプロバイオティク効果を供給することができ、及び／又は宿主動物の免疫適合性を変えることができると考えられる。この形のプロバイオティク活性は、本発明の細菌が生存可能もしくは生育不能な培養菌又は精製された発酵産物として与えられ、その上、宿主動物に有益な治療効果を供給することができるので、望ましい。
【００４８】
好ましくは、本発明の乳酸菌は、ＧＩ管内を通過した後に生存能を維持することが可能である。このことは、前記細菌の生きた培養菌を経口服用するため、及び食道及び胃を通過した後で腸及び腸管の中でコロニー形成が生じるために、望ましい。本発明の乳酸菌による腸及び腸管のコロニー形成は、長期のプロバイオティク効果が宿主に供給されるため望ましい。生育不能な細胞又はそれらの精製単離株の経口服用は、一時的な効果を引き起こすが、細菌は生存可能ではないので、増殖することや、その場でプロバイオティク効果を連続的に供給することができない。結果として、これは、健康上の利益を維持するために宿主に定期的に投与される必要があるかもしれない。対照して、生存可能な形で胃通過において生存して、その後、腸粘膜に接着して増殖することによってコロニー形成することができる生存可能な細胞は、その場で連続的にプロバイオティク効果を供給することが可能である。
【００４９】
従って、本発明の乳酸菌はｐＨ２．５の培地中において１時間懸濁した後に生存能を維持することが好ましい。本明細書で使用する時、「生存能を維持する」とは、試験培地中で初期懸濁された細菌の少なくとも２５％が、当業者に公知の平板計数法を用いて生存可能であることを意味する。好ましくは、「生存能を維持する」とは、初期懸濁された細菌の少なくとも５０％が生存可能であることを意味する。本発明の乳酸菌にとって、低いｐＨにおいて曝露した後に生存能を維持することは、このことが動物体内での経口消費後の生体内の胃及び上部腸内での胃液への曝露を模倣するので、望ましい。
【００５０】
更に、本発明の乳酸菌は、少なくとも０．５％ブタ胆汁酸塩が存在下にある場合（whenin）、少なくとも６６％の増殖を示すことが好ましい。本明細書で使用する増殖は、実施例３で更に詳細に説明する。より好ましくは、本発明の細菌は、少なくとも１％ブタ胆汁酸塩の存在下にある場合、少なくとも３３％の増殖を示す。更に好ましくは、本発明の細菌は、少なくとも０．５％ブタ胆汁酸塩の存在下で、１００％の増殖を示す。理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸菌は、少なくとも０．５％ブタ胆汁酸塩の存在下で生存能を維持することができ、腸内に存する状況で生存することが可能である。このことは、腸の状況を模倣する培地へのブタ胆汁の添加の結果であると考えられる。
【００５１】
更にその上、本発明の乳酸菌は、インビトロ腸上皮細胞への顕著な接着を示すことが好ましい。本明細書で使用する時、「顕著な接着」とは、上皮細胞と共インキュベーションされた乳酸菌の総数の少なくとも０．２％が上皮細胞とインビトロにて接着することを意味する。より好ましくは、共インキュベーションされた細菌細胞の少なくとも０．３％が上皮細胞とインビトロにて接着する。理論に束縛されるものではないが、腸上皮細胞のインビトロ接着は、インビトロにて動物のＧＩ管をコロニー形成する乳酸菌の能力の指標であると考えられる。
【００５２】
好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス（Lactobacillus murinus/ruminus）種、ラクトバシラス クリスパトゥス（Lactobacillus crispatus）種、ラクトバシラス アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）種、ラクトバシラス フェルメントゥム（Lactobacillus fermentum）種、ラクトバシラス ブクネリ（Lactobacillus buchneri）種、ラクトバシラス ロイテリ（Lactobacillus reuteri）種、ラクトバシラス ラクティス（Lactobacillus lactis）種、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される種、より好ましくはラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス種である。
【００５３】
１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、様々な細菌の種及び菌株を同定するために使用され得る細菌ゲノム中のＤＮＡの配列として当業者には公知である。この遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、以下に詳述する方法によって決定することができる。
【００５４】
乳酸桿菌コロニーを寒天プレートから選らんで、ＩＸ ＰＣＲ緩衝液中に再懸濁し、９６℃で５分間加熱し、−７０℃で５〜１０分間凍結させ、解凍して、アリコートをＰＣＲエッペンドルフ（eppendorf）チューブに入れた。ＰＣＲは、遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）プライマーであるＩＧＳ Ｌ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ−３’（配列番号５）及びＩＧＳ Ｒ：５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号６）を用いて行った。サイクル条件は、９６℃で１分（１サイクル）、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で３０秒（２８サイクル）であった。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ ５μＬ、ＰＣＲ緩衝液（バイオライン（Bioline）、英国）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ロッシュ（Roche）、英国）、０．４μＭ ＩＧＳ Ｌ及びＲプライマー（１５０ ｎｇ／５０μＬ）（ＭＷＧバイオテック（Biotech）、ドイツ）並びにバイオライン（Bioline）Ｔａｑポリメラーゼ（０．６単位）を含有していた。ＰＣＲ反応はハイバイド（Hybaid）熱循環装置で行った。ＰＣＲ生成物（８μＬ）は、分子量マーカー（φΧ１７４ Ｈａｅ ＩＩＩ、プロメガ（Promega））と一緒にＴＡＥ中２％アガロースＥｔＢｒ染色ゲル上でにじませて、それらのＩＧＳ特性を求めた。上記と同じプライマーを用いて、４種のイヌ科動物の乳酸桿菌株についての遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）ＤＮＡを、当業者に公知の方法を用いて配列決定した。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号１に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号１に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９４（ＡＨＣ１２２２）又はその突然変異体である。
【００５６】
本発明の別の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号２に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号２に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９６（ＡＨＣ５３２３）又はその突然変異体である。
【００５７】
本発明の別の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号３に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号３に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９７（ＡＨＣ６３３１）又はその突然変異体である。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号４に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号４に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９５（ＡＨＣ３１３３）又はその突然変異体である。
【００５９】
配列決定後、４種の預けられた菌株について得られた配列を、他の預けられた細菌１６ｓ−２３ｓ配列との相同性についてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なオンライン配列データベース「ＢＬＡＳＴ」と比較した。ＡＨＣ１２２２，３１３３，５３２３及び６３３１（それぞれＮＣＩＭＢ ４１１９４，４１１９５，４１１９６及び４１１９７）と最もよく一致したのは、ラクトバシラス ルミニス（Lactobacillus ruminis）菌株ＡＦ０８０１０３であった。しかしながら、ＡＨＣ菌株とラクトバシラス ルミニス（Lactobacillus ruminis）菌株との間の幾つかの大きな違いがスペーサー領域にあり、その結果、相同性スコアは８７％、及びＢＬＡＳＴスコアは少なくとも１７０となる。
【００６０】
本発明の乳酸菌の使用方法は、典型的には動物による経口消費を伴う。経口消費は、標準的な食事摂取量の一部として、又はそのサプリメントとして行われてよい。前記の経口消費は、典型的には、少なくとも月１回、好ましくは少なくとも週１回、より好ましくは少なくとも一日１回行う。前記乳酸桿菌は、コンパニオンアニマルに治療上有効な量で与えて、動物、好ましくはコンパニオンアニマルにおける健康を維持又は改善することができる。本明細書で使用する時、乳酸菌に関する「治療上有効な量」とは、治療が必要な宿主動物に望ましい効果、又は利益を与えるのには十分であり、更には毒性、過敏、又はアレルギー反応などの副作用を回避するのに十分低く、本発明の方式で用いられる場合に適切な利益／危険比に見合う、細菌の量を意味する。特定の「治療上有効な量」は、治療されている特定の状態、ユーザーの物理的状態、治療の期間、併用している療法（もしあれば）の性質、用いられる特定の投薬形態、使用されるキャリア、投与形態の溶解性、及び特定の投与レジメンなどの要因によって変化する。
【００６１】
好ましくは、乳酸菌は、コンパニオンアニマルに一日に１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１４ ＣＦＵ、より好ましくは一日に１．０Ｅ＋０６〜１．０Ｅ＋１２ ＣＦＵの投与量で与える。前記組成物は好ましくは、切除及び洗浄された哺乳類ＧＩ管から分離することによって得られる乳酸桿菌１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１２ ＣＦＵ／ｇを少なくとも０．００１％含有し得る。乳酸菌は、生存可能な形態で、又は死んだ細胞、又は留出物、分離物もしくは本発明の乳酸菌の発酵産物の他の画分、あるいはこれらのいずれかの組み合わせとして、動物に与えることができる。
【００６２】
好ましくは、乳酸菌、又はその精製もしくは分離された画分を用いて、動物の健康を維持又は改善することを目的とする組成物を調製する。上述の通り、前記組成物は標準的な食事摂取量の一部又はサプリメントであってよい。前記組成物が標準的な食事摂取量の一部を構成する場合、前記組成物は、ビスケット又は粗挽きの穀物（kibbles）のような乾燥アニマルフード、加工された粒餌、湿式アニマルフード、ヨーグルト、肉汁、噛み物（chews）、トリーツなどの形態であってもよい。
【００６３】
かかる組成物は、更なる構成成分を含んでいてよい。他の構成成分は、本明細書で使用される組成物に含めるのに有益であるが、本発明の目的には任意である。例えば、フード組成物は好ましくは、栄養的にバランスが取れている。１つの実施形態では、フード組成物は、乾燥物質基準で、フード組成物の約２０重量％〜約５０重量％の粗タンパク質、好ましくは約２２重量％〜約４０重量％の粗タンパク質を含んでもよい。粗タンパク質材料は、タンパク質含量が少なくとも約１５重量％のいずれかの材料を含んでいてよく、その非限定的な例としては、大豆、綿実及び落花生などの植物性タンパク質、カゼイン、アルブミン、及び肉組織などの動物性タンパク質が挙げられる。本明細書で有用な肉組織の非限定的な例としては、新鮮な肉、及び魚粉、家禽の肉粉、肉粉、骨粉などのような乾燥粉又は粉砕物（rendered meals）が挙げられる。好適な粗たんぱく質源の他の種類としては、小麦グルテン又はトウモロコシグルテン、及び酵母などの微生物起源から抽出されたタンパク質類が挙げられる。
【００６４】
更に、フード組成物は、乾燥物質基準で、フード組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、好ましくは約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。その上更に、本発明の乳酸菌を含むフード組成物は、合計食物繊維を約４％〜約２５％含んでいてもよい。前記組成物は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９９／５１１０８に記載されているような複合的デンプン源を含んでいてもよい。
【００６５】
本発明の組成物は、炭水化物源を更に含んでよい。米、トウモロコシ、ミロ、サトウモロコシ、大麦、アルファルファ、小麦などのグレイン又は穀物類が実例的な供給源である。加えて、前記組成物は、乾燥乳清及び他の酪農副産物などの他の材料を含有していてもよい。
【００６６】
本発明の細菌を含む組成物は、プレバイオティクスを含んでいてもよい。「プレバイオティクス」には、ペットの腸管内菌叢によって発酵され、それにより病原菌を犠牲にして、ペットの胃腸管内での乳酸菌の増殖又は発達を促進する物質又は化合物が包含される。この発酵の結果は、脂肪酸の放出、特に結腸内での短鎖脂肪酸の放出である。これは、結腸内でｐＨを下げる効果を発揮する。好適なプレバイオティクスの非限定的な例としては、イヌリン、及びフラクトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、キシロオリゴ糖類又はデンプンのオリゴ誘導体類として一般に知られているその加水分解生成物などのオリゴ糖類が挙げられる。プレバイオティクスは、いずれかの好適な形態で提供することができる。例えば、プレバイオティクスは、繊維を含有する植物材料の形態で提供することができる。好適な植物材料としては、アスパラガス、アーティチョーク、たまねぎ、小麦又はチコリ、あるいはこれら植物材料の残留物が挙げられる。別法として、プレバイオティク繊維は、イヌリン抽出物として提供することができ、例えばチコリからの抽出物が適している。好適なイヌリン抽出物は、ベルギー国チルルモン３３００のオラフティＳＡ（Orafti SA）から「ラフチリン（Raftiline）」の商標で入手可能である。例えば、イヌリンは、白色微粉末であって、約９０〜９４重量％のイヌリン、約４重量％までのグルコース及びフルクトース、並びに約４〜９重量％のスクロースを含有するラフチリン（Raftiline）（ｇ）ＳＴの形態で提供され得る。あるいは、前記繊維は、ベルギー国チルルモン３３００のオラフティＳＡ（Orafti SA）から「ラフチロース（Raftilose）」の商標で得られるようなフラクトオリゴ糖の形態であってよい。例えば、イヌリンは、ラフチロース（Raftilose）（ｇ）Ｐ９５の形態で（in the form o）提供され得る。別法では、フラクトオリゴ糖類は、酵素法によって又は微生物を用いて、イヌリンを加水分解することにより入手可能である。
【００６７】
乾燥ペットフードの場合、適した加工は、押出し成形調理であるが、焼くことや他の好適な加工を使用してもよい。押出し成形調理の場合、乾燥ペットフードは通常、粗挽きの穀物の形態で提供される。プレバイオティクスを用いる場合、加工する前にプレバイオティクスを乾燥ペットフードの他の成分と混合することができる。適した加工は、欧州特許出願第０８５０５６９号に記載されている。プロバイオティク微生物を用いる場合、生物体を最善には乾燥ペットフードにコーティングするか又は乾燥ペットフードに詰める。好適なプロセスは、欧州特許出願ＥＰ０８６２８６３号に記載されている。
【００６８】
湿式フードの場合、米国特許第４，７８１，９３９号及び同第５，１３２，１３７号に記載のプロセスを用いて、擬似肉製品を製造することができる。ぶつ切りタイプの製品を製造する他の手順を用いてもよい；例えば、蒸気オーブンでの調理など。あるいは、ローフ型の製品は、適した肉材料を乳化して肉エマルションを製造し、好適なゲル化剤を添加して、缶又は他の容器に詰める前に肉エマルションを加熱することによって製造することができる。典型的な湿式フード組成物は、約５％〜約１５％のタンパク質、約１％〜約１０％の脂肪、及び約１％〜約７％の繊維を含んでいてもよい。湿式フード組成物に使用できる非限定的な成分としては、鶏肉、シチメンチョウ、牛肉、ホワイトフィッシュ、チキンブロス、シチメンチョウブロス、ビーフブロス、鶏レバー、発酵用米、挽き割りトウモロコシ、魚肉、卵、ビートパルプ、塩化物、亜麻粉、子羊、牛肉副産物、鶏肉副産物及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６９】
別の実施形態では、ビスケット、噛み物及び他のトリーツなどのサプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約２０重量％〜約６０重量％のタンパク質、又は約２２重量％〜約４０重量％のタンパク質を含んでもよい。別の例としては、前記サプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、又は約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。イヌ科動物又はネコ科動物による使用を意図されたフード及びサプリメント組成物は、一般的に当該技術分野において既知である。
【００７０】
ペットフードは、長鎖脂肪酸及び亜鉛などの他の活性剤を含有していてもよい。好適な長鎖脂肪酸には、α−リノール酸、γ−リノレン酸、リノール酸、エイコサペンタン酸（eicosapentanoic acid）、及びドコサヘキサン酸（docosahexanoic acid）が包含される。魚油は、エイコサペンタン酸（eicosapentanoic acid）及びドコサヘキサン酸（docosahexanoic acid）の好適な供給源である。
【００７１】
ルリチシャ油、黒フサスグリ実油及びマツヨイグサ油はγ−リノレン酸の好適な供給源である。ベニバナ油、ヒマワリ油、コーン油及び大豆油は、リノール酸の好適な供給源である。これらの油は、前記のコーティング基材中で使用することもできる。亜鉛は様々な好適な形態で、例えば硫酸亜鉛又は酸化亜鉛として提供され得る。更に、ペットフードに通常使用される多くの成分は、脂肪酸及び亜鉛の供給源である。プレバイオティクス供給源としてのチコリと、大豆油などのリノール酸リッチオイルとの組み合わせは、相乗効果を連想させる、予期しない利益を提供することが観察されている。
【００７２】
前記組成物が肉汁の形態である場合、組成物は好ましくは、少なくとも１０％のブロス、又はストックを含み、ストックの非限定的な例としては、ベジタブル ビーフ（vegetable beef）、チキン又はハムのストックが挙げられる。典型的な肉汁組成物は、約０．５％〜約５％の粗タンパク質、約２％〜約５％の粗脂肪、及び約１％〜約５％の繊維を含んでいてもよい。
【００７３】
本明細書で使用するのに好適なサプリメントの更なる非限定的な例としては、粉末、油懸濁液、乳をベースとした懸濁液であるチーズ、及びピル又はカプセルが挙げられる。前記組成物がピルの形状である場合、好適な結合剤は、ピルを固体の加圧形状に保持するよう要求される。好適な結合剤の非限定的な例には、キサンタンガムなどの天然ゴム類、ペクチン、レシチン、アルギネート及び当業者に公知の他のものが包含される。前記組成物がカプセルの形状である場合、組成物は好ましくは、当業者に公知の技術を用いてカプセル封入される。好適な封入材料の非限定的な例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アルギネート及びゼラチンが挙げられる。ヨーグルト系組成物は、約１％〜約５％のタンパク質、約１０％〜約２０％の炭水化物、約１％〜約５％の繊維、約１％〜約５％の脂肪及び約５０％〜約９０％の乳などの液体キャリアを含んでいてもよい。
【実施例】
【００７４】
実施例１〜４は、本発明で使用されるプロバイオティク ラクトバシラス ムリヌス種を含む乾燥した粗挽き穀物組成物の例である。
【表２】
【００７５】
実施例５〜７は、本発明で使用されるプロバイオティク ラクトバシラス ムリヌス種を含む湿式ペットフード組成物の例である。
【表３】
【００７６】
実施例８〜１０は、本発明で使用されるプロバイオティク ラクトバシラス ムリヌス種を含むヨーグルトサプリメント組成物の例である。
【表４】
【００７７】
本発明の特定の実施形態を例示し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明白であろう。従って、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティク乳酸桿菌の分野、更に明確にはコンパニオンアニマルにおけるプロバイオティク乳酸桿菌の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌によるコロニー形成から哺乳類の胃腸（ＧＩ）管を保護するための防衛機構は非常に複雑である。大抵の哺乳類のＧＩ管は、天然微生物相、及び体をむしばむ病原微生物によってコロニー形成される。健康な状態では、これらの対抗する微生物相は平衡状態にある。ヒト、並びにネコ、イヌ及びウサギを包含するコンパニオンアニマルなどの他の哺乳類種の両者において、腸の微生物層平衡の変更が多くのＧＩ疾患を引き起こすか又は予防することがある。コンパニオンアニマルにおける健康は、その摂食やＧＩの健康と密接に関係しており、及びこれら動物体内での腸微生物層の平衡の維持が、より健康なペットをもたらすことがある。
【０００３】
腸微生物相の数と組成は安定している傾向にあるが、年齢及び食餌によって変更されることがある。胃液酸性度、胆汁、腸ぜん動運動及び局所免疫は、ヒト及び様々な他の哺乳類の小腸内の細菌叢の調節に重要であると考えられている因子である。イヌ科動物及びネコ科動物に見出されるものを包含するペットにおけるＧＩ疾患はしばしば、細菌の異常増殖及び病原菌によるエンテロトキシンの生成と関係がある。これら因子は、腸内微生物相平衡を乱して、炎症及び異常な免疫反応を促進することがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
最近、切除及び洗浄されたヒト及びイヌ科動物などの哺乳類の胃腸管から単離することによって得られるいくつかの貴重な細菌株、並びにプロバイオティク（probiotic）剤としてのそれらの潜在的な利用に脚光を当てた研究が始まっている。プロバイオティクスは、生菌もしくは死菌、タンパク質もしくは炭水化物などのそれらの構成成分、又は天然微生物相をＧＩ管内に保存することによって哺乳類の健康を促進する細菌発酵の精製画分を調製して、異常な免疫反応における正常な制御を強化すると考えられている。プロバイオティク細菌は、治療を意図している種に由来するか又は近縁種である場合、より有効であると一部で考えられている。幾つかのプロバイオティク細菌株は解明されているが、これら菌株の使用方法及びそれらの治療上の有効性はヒトの胃腸疾患の調節に限られていた。これら生物体が、イヌ科動物及びネコ科動物などのコンパニオンアニマルにおける胃腸管以外の生理学的系に有利な影響を及ぼす可能性については今までのところ検討されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、コンパニオンアニマルにおける哺乳類の切除及び洗浄された胃腸管から単離することによって得られるプロバイオティク乳酸桿菌の使用方法が提供される。前記方法には、免疫系、体重制御及び身体組成、泌尿器の健康、皮膚及び被毛疾患、並びに老化の予防的又は治療上の処置が包含される。
【０００６】
本発明のこれら及びその他の特徴、態様、及び利点は、本開示を読むことにより当業者に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（配列）
配列番号１ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ １２２２（ＮＣＩＭＢ ４１１９４）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号２ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ ３１３３（ＮＣＩＭＢ ４１１９５）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号３ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ ５３２３（ＮＣＩＭＢ ４１１９６）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号４ − ラクトバシラス ムリヌス種ＡＨＣ ６３３１（ＮＣＩＭＢ ４１１９７）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーヌクレオチド配列。
配列番号５ − 配列分析用１６ｓ−２３ｓ 左ＰＣＲプライマー配列。
配列番号６ − 配列分析用１６ｓ−２３ｓ 右ＰＣＲプライマー配列。
【０００８】
（菌委託番号）
以下の表に、本発明に有用な、切除及び洗浄された哺乳類の胃腸管から単離することによって得られるプロバイオティク乳酸桿菌についての種、菌株番号及び寄託番号を表す。菌株は、国立産業食品及び海洋菌収集所（National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria（ＮＣＩＭＢ））、英国アバディーン、に寄託されている。
【表１】
【０００９】
本明細書の全ての重量、測定値及び濃度は、特に指定のない限り、組成物全体に関して２５℃で測定される。
【００１０】
指示がない限り、本明細書で言及される組成物のすべてのパーセンテージは重量％であり、すべての比率は重量比である。
【００１１】
指示がない限り、分子量は全て、重量平均分子量である。
【００１２】
特に指示のない限り、本文内で参照される全ての文献の内容は、その全てを本明細書に参考として組み込む。
【００１３】
実際に測定した値の特定の例を提示する場合を除いて、本明細書で言及される数値は、「約」という言葉で修飾されていると考えるべきである。
【００１４】
以下の記載に於いて、略語ＣＦＵ（「コロニー形成単位」）は、当該分野に於いて通常理解されているであろうように、寒天プレート上での微生物の総数によって示される細菌細胞の数を意味する。
【００１５】
本明細書で使用する時、「その突然変異体類」という用語には、参照菌株の１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサーポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性を有する派生した細菌株が包含されるが、そうでなければ、細菌ゲノム内の他のＤＮＡ配列中のＤＮＡ突然変異を含む。
【００１６】
本明細書で使用する時、「ＤＮＡ突然変異」という用語には、親ヌクレオチド又はアミノ酸配列に組み込まれる遺伝子組換えを包含するが、親配列と少なくとも５０％の相同性を維持する、欠失、挿入、トランスバージョン、及び当業者に公知の他のＤＮＡ修飾などの少なくとも一塩基変化を含む自然又は誘導突然変異が包含される。好ましくは、ＤＮＡ突然変異（単数又は複数）を含む配列は、親配列と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは８５％の相同性を有する。本明細書で使用する時、配列の「相同性」は、当業者に公知の標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、相同性は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で公的に入手可能なオンライン相同性アルゴリズム「ＢＬＡＳＴ」プログラムを用いて決定することができる。
【００１７】
本明細書で使用する時、「遺伝子組換え」は、外来性及び／又は内在性ＤＮＡ配列を生物体のゲノムへ、前記生物体のゲノムへの挿入によって又は当業者に公知のプラスミドＤＮＡもしくはバクテリオファージを包含するベクターによって、組み込むことを包含し、前記ＤＮＡ配列の長さは、デオキシリボ核酸塩基少なくとも２個分である。
【００１８】
本明細書で使用する時、「コンパニオンアニマル」は家畜を意味する。好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、飼い慣らされたイヌ科動物、ネコ科動物、ウサギ、フェレット、ウマ、ウシなどを意味する。より好ましくは、「コンパニオンアニマル」は飼い慣らされたイヌ科動物又はネコ科動物を意味する。
【００１９】
切除及び洗浄されたイヌ胃腸管から単離することによって得られるラクトバシラス ムリヌス属の乳酸菌株は、動物、好ましくはコンパニオンアニマル又はヒト、における経口消費後にプロバイオティク効果を供給するために使用することができる。このプロバイオティク効果は一般に、動物の健康全般を維持及び改善する。症状を治療上軽減する際又は予防法による病気の予防において利益を得る、動物の健康及び生理機能の非限定的な要素としては、炎症性疾患、免疫不全症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、癌（特に胃腸及び免疫系の癌）、下痢性疾患、抗生物質による下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、アミロイド症、リウマチ様関節炎、関節炎、関節可動性、真性糖尿病、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染症、歯周病、泌尿生殖器疾患、手術による外傷、手術に起因する転移性疾患、敗血症、体重減少、体重増加、過剰な脂肪組織の蓄積、拒食症、体温の調節、悪液質、創傷治癒、潰瘍、腸バリア感染症、アレルギー、喘息、呼吸器系疾患、循環器系疾患、冠状動脈性心疾患、貧血、血液凝固系の疾患、腎疾患、中枢神経系の疾患、肝疾患、虚血、栄養障害、骨粗鬆症、内分泌系疾患、及び上皮疾患が挙げられる。胃腸管の治療が好ましく、下痢の治療又は予防；免疫系の調節、好ましくは自己免疫疾患及び炎症の治療又は予防；皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、好ましくはアトピー性皮膚疾患の治療又は予防；精神的な自覚及び活動レベルを包含する、老化の影響の改善又は低減；並びに感染中及び感染後の体重減少の予防が挙げられる。
【００２０】
上記の疾患の治療は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。例えば、自己免疫疾患や炎症を包含する炎症性疾患は、リンパ球幼若化現象、ナチュラルキラー細胞活性、ワクチンに対する抗体反応、遅延型過敏症、及びこれらの組み合わせなどの生体内免疫機能試験を用いて検出及びモニターすることができる。かかる方法は、本明細書で詳細に説明するが、当業者には周知である。
【００２１】
１．リンパ球幼若化現象：このアッセイは、様々な分裂促進因子に対する試験動物と対照動物の新鮮全血から分離したリンパ球のインビトロ増殖反応を測定し、総体的なＴ細胞機能及びＢ細胞機能の測度である。詳細には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、当業者に公知のフィコール・ハイパーク密度遠心分離法によって全血から分離する。分離されたＰＢＭＣを、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０細胞培養液で２回洗浄する。洗浄した細胞をＲＰＭＩ １６４０中に再懸濁し、数を数えて、細胞密度を適切に調節する。２×１０５細胞を、様々な分裂促進因子の濃度範囲（０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）に曝露するが、そのうちの幾つかの例としては、ポークウィード・マイトジェン（ギブコ（Gibco））、植物性血球凝集素（ギブコ（Gibco））及びコンカナバリンＡ（シグマ（Sigma））に３７℃において７２時間で３回、並びに１０％ウシ胎児血清（シグマ（Sigma））を含む５％ ＣＯ２が挙げられる。５４時間で、細胞を１μＣｉ３Ｈ−チミジンに適用し、前記細胞を収集して、シンチレーション計数をトップカウント（TopCount）ＮＸＴにおいて７２時間で読み取る。
【００２２】
２．ナチュラルキラー細胞活性：米国特許第６，３１０，０９０号に記載の通り、このアッセイは、試験動物と対照動物の新鮮全血から分離されたナチュラルキラー細胞のインビトロエフェクター活性を測定する。ナチュラルキラー細胞は、哺乳類の生得的な免疫機能の一構成要素である。イヌ甲状腺の腺ガン細胞を、ＮＫ細胞の細胞毒性活性を評価する際に標的細胞として使用した。この細胞株は、イヌＮＫ細胞によって殺され易いことが以前に示された。標的細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬが補充された最小必須培養液（ＭＥＭ；シグマ・ケム社（Sigma Chem.Co.）、ミズーリ州セントルイス）２０ｍＬを含むＴ７５フラスコ内で培養した。密集したら、標的細胞をトリプシン処理し、３回洗浄して、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０ ＋ １０％ＦＣＳ ＋ ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ ＋ ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）に５×１０５細胞／ｍＬまで再懸濁した。３通りの標的細胞のアリコート１００μＬをピペットで９６穴のＵ底プレート（コスター（Costar）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に移し、８時間インキュベートして細胞を粘着させた。（上述と同様の）フィコール・ハイパーク分離で分離したリンパ球（エフェクター細胞；１００μＬ）を次に標的細胞に添加して、エフェクター／標的細胞（Ｅ：Ｔ）比１０：１を提供した。３７℃で１０時間インキュベートした後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）５μｇを含有する基質２０μＬを添加した。前記混合物を３７℃で４時間インキュベートし、その後、未代謝のＭＴＴを吸引により除去した。９５％エタノール２００μＬを添加することによって、ホルマザン結晶を溶解した。マイクロプレート読み取り機を用いて、５７０ｎｍで光学密度を測定した。ＮＫ細胞−特異的溶解の百分率を以下のようにして計算した：
特異的細胞毒性（％）＝１００×｛１−［（標的細胞及びエフェクター細胞のＯＤ−エフェクター細胞のＯＤ）／（標的細胞のＯＤ）］｝
【００２３】
３．ワクチンに対する抗体反応：試験対象に、プロバイオティクス又は対照摂食の少なくとも１２週後に複数のワクチン（５つまで）を与える。ワクチンは新規ワクチンと重複性ワクチンの混合物であってよい。使用できる複数のワクチンの非限定的な例には、フォートドッジ・アニマル・ヘルス社（Fort Dodge Animal Health）で調製されたワクチンの混合物が包含される。本明細書に用いるのに好適なワクチンの非限定的な例としては、犬ジステンパー、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザ、及びパルボウイルスが挙げられる。試験対象のワクチン履歴によって、使用すべきワクチンが決定される。与えられたワクチンに対する特異抗体を、血中で３週間測定し、対照及びプロバイオティクス摂食群での反応の長さ及び強さを比較する。
【００２４】
４．遅延型過敏症：免疫系状態を評価する生体内非侵襲法。この試験は、ヒツジ赤血球多価ワクチン、ヒスタミン（０．０２７５ｇ／Ｌ リン酸ヒスタミン １００μＬ；グリア（Greer）、ノースカロライナ州ルノアール）、又はＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水１００μＬ、８．５ｇ／Ｌ；シグマ（Sigma））と組み合わせたポリクローナル分裂促進因子フィトヘムマグルチニン（ＰＨＡ）の皮内注射を含む。抗原に対する免疫反応を、キャリパーを用い、注射後０、２４、４８及び７２時間の時間間隔で皮下脂肪厚として記録する。皮下脂肪厚の増加は、本発明の細菌の処置により低下すべき高い敏捷反応の指標である。
【００２５】
本発明の乳酸桿菌細菌の効果を求めるための追加的な方法は、米国特許第６，１３３，３２３号及び米国特許第６，３１０，０９０号に記載されている。
【００２６】
更に、老化の影響を改善させることは、体脂肪重量、除脂肪体重及び骨塩量を包含する身体組成を測定するための複式Ｘ線吸光光度計又はＣＴスキャンを用いて決定することができる。同様に、この方法は、感染後の対象の体重減少又は骨密度などの解剖学形態変化を決定するのに用いることができる。
【００２７】
本発明の乳酸桿菌はまた、コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルを減少させるための方法に使用することもできる。エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、コルチゾール及びＣ反応性タンパク質を包含する血中ストレスホルモンレベルを測定して、ストレスレベル及びその低下又は維持を決定することができる。これらホルモンは、ストレスの公認生物マーカーであり、当業者に公知の方法を用いて容易に測定することができる。
【００２８】
更にその上、アトピー性皮膚疾患を包含するコンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善を、２人の訓練された個人によって行われる皮膚及び被毛判定を用いて測定することができる。かかる判定中に評価される判定基準の例としては以下のものが挙げられる：
ａ）抜け毛指数：抜け毛指数は、標準化されたブラシがけセッション中に発生した毛髪を集めることによって各試験対象に割り当てられる。毛髪を確保して重さを計り、対照及び試験対象を比較する。
ｂ）主観的な皮膚／被毛評価：訓練された官能試験員が、抜け毛、フケ、つや、均一性、柔軟性及び密度を評価することによって皮膚及び被毛状態を主観的に評価する。
ｃ）皮膚機能性判定：皮膚表面をアセトン浸漬ガーゼで拭くことによって皮膚のバリア機能を判定することができる。この方法は、単細胞層と、関連する角質層の脂質画分とを除去することによって、皮膚バリアを効果的に破壊する。バリア破壊を、経皮水分損失（ＴＥＷＬ）の増加、及び障害を受けた部分の赤みの程度を当業者に公知の方法を用いて測定することによって定量化する。赤み（紅斑）スコアは、先に記載したカメラと照明装置を用いて得られる。破壊直前及び直後にＴＥＷＬ読み及び赤みスコアを入手し、５時間及び２４時間終点において皮膚の保護及び回復特性を判定する。
【００２９】
コンパニオンアニマルにおける下痢を含む胃腸感染の治療又は予防は、便スコアを用いて測定することができる。便スコアは、以下のガイドラインに従って毎日記録することができ、本発明にかかる細菌を摂食した前後で対照群及び試験群を比較する。
【００３０】
スコア：５ 非常に乾燥している
この便は堅くて、表面に張り付かない。便は、押すと転がる。便を摘み上げた時に、凹みが生じない。便は、１個の完成単位の代わりにしばしば個々の便の群で排泄される。回収後、便は元の形を保持している。
【００３１】
スコア：４ 堅い（理想的な便）
この便は堅くて、形がよく、円筒形である。この便は、摘み上げた時に容易にはばらばらにならない。この便は表面及び手袋に残留物を残すことがある。この便はしばしば一単位として排泄される。回収後、便は元の形を保持している。
【００３２】
スコア：３ 柔らかく、形がある
この便は柔らかいが、明確な形がある。この便は、容易にばらばらになり、また例外なく表面及び手袋に残留物を残す。便は回収後にしばしば元の形を失う。この便はしばしば別のスコアと共に現れるが、全便試料を含むことができる。
【００３３】
スコア：２ 柔らかく、形がない
この便は柔らかく、円筒形ではない。しばしば「２」を連想させる形は「牛のパテ」型である。この便は回収する時に元の形を失い、例外なく表面及び手袋に残留物を残す。この便スコアはしばしば別のスコアと共に現れるが、全便試料を含むことができる。この便試料は数インチ（５〜１５センチ）の面積に広がっていることがある。
【００３４】
スコア：１ 液状
この便スコアは、常に液体のようであり、粒状物が存在しているかどうか分からない。この便は、１個の完全な単位の代わりに、しばしば何層もの層状に排泄される。この便試料には粘液がしばしば存在する。この便試料は非常に回収し難く、表面及び手袋に残留物が常に残る。この便試料は数インチ（５〜１５センチ）の面積に広がっていることがある。
【００３５】
加えて、血便；便の中の異物；又は便中の粘液を包含する他の観測結果もしばしば記録される。
【００３６】
更に、コンパニオンアニマルにおける胃腸管の治療は、コンパニオンアニマルにおける微生物生態系の改善を含むこともできる。コンパニオンアニマルにおける微生物生態系の改善は、好ましくは、コンパニオンアニマルにおける糞便中の病原菌レベルの低下を含む。コンパニオンアニマルにおける糞便中に存在する病原菌のレベルは、当業者に公知の標準的な平板計数法を用いて数えることができる。より好ましくは、病原菌は、クロストリジウム（Clostridia）属、エシェリキア（Escherichia）属、サルモネラ属（Salmonella）、バクテリオデス（bacteriodes）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。病原菌の好適な菌株の非限定的な例としては、ウェルシュ菌、クロストリジウム ディフィシレ、エシェリキア（Eschericia coli）、ネズミチフス菌及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３７】
本発明の細菌の使用方法は、哺乳類、好ましくはコンパニオンアニマルにおける尿路の予防上又は治療上の処置を包含することもできる。尿路処置の非限定的な例としては、尿路感染の治療又は予防、腎結石を包含する腎疾患の治療又は予防、膀胱感染の治療又は予防などが挙げられる。理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸桿菌は、インビトロにて立証されるように、そのシュウ酸の分解能の結果としてこれら疾患の予防に有用であると考えられる。シュウ酸は、腎臓、膀胱及び他の尿路感染をもたらす不溶性沈殿を形成し得る尿代謝の副産物である。シュウ酸を分解して、その結果その沈殿及び尿路内での蓄積を潜在的に予防することによって、本発明の細菌は、尿路感染及び他の疾患を治療及び予防することができる。シュウ酸の分解は、ベーリンガー・マンハイム／Ｒ−バイオ医薬品（Boehringer Mannheim/R-Biopharm）から市販されているシュウ酸試験キット カタログ番号７５５６９９を用いてインビトロにて測定することができる。
【００３８】
本発明の乳酸桿菌は、繊維消化の改善を含む、コンパニオンアニマルにおける健康を改善又は維持するための方法で使用することができる。繊維消化の改善は、前記プロバイオティク細菌並びに有益な内因性微生物相の増殖を促進し、そのことがいくつかの潜在的な病原菌の阻害に役立つので、望ましい。加えて、有害な代謝産物及び結腸発酵から生じる有害な酵素の量を低減することが、ヒトについて報告されている（トモマツ・Ｈ（Tomomatsu,H.）「オリゴ糖類の健康効果（Health effects of oligosaccharides）」、（１９９４年）フード・テクノル（Food Technol）４８、６１〜６５）。繊維消化は、希釈糞便試料を用いて接種する代わりに、各実験が、重要な細菌株の純粋培養を用いたこと以外は、ヴィッカーズ（Vickers）ら（２００１年）、「イヌ科動物結腸微生物相による、選ばれたフラクトオリゴ糖類及び他の繊維基質の発酵の比較（Comparison of fermentation of selected fructooligosaccharides and othe rfiber substrates by canine colonic microflora）」、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．６１（４）、６０９〜６１５に記載の方法を用いて決定することができる。
【００３９】
好ましくは、本発明の方法は、ラクトバシラス サリバリウス(Lactobacilli salivarius)、ラクトバシラス種 カゼイ(Lactobacilli casei)、又はラクトバシラス ムリヌス(Lactobacilli murinus)からなる種から選択される乳酸桿菌の投与を含む。
【００４０】
本発明で有用な、切除及び洗浄された哺乳類ＧＩ管から単離することによって得られるプロバイオティク乳酸桿菌の非限定的な例は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９８／３５０１４、同ＷＯ０３／０１０２９８、及び同ＷＯ０３／０１０２９９に更に詳細に記載されている。
【００４１】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９８／３５０１４には、切除及び洗浄されたヒトＧＩ管から単離されたプロバイオティク ラクトバシラス サリバリウス種が記載されている。これら細菌は、ＮＣＩＭＢに寄託番号４０８２９及び４０８３０で寄託されている。
【００４２】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０３／０１０２９８には、切除及び洗浄されたヒトＧＩ管から単離されたプロバイオティク ラクトバシラス サリバリウス種の更なる例が記載されている。これら細菌は、ＮＣＩＭＢに寄託番号４１０４４、４１０４５、４１０４７、４１０９３及び４１０９４で寄託されている。
【００４３】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０３／０１０２９９には、切除及び洗浄されたヒトＧＩ管から単離されたプロバイオティク ラクトバシラス カゼイ種の更なる例が記載されている。これら細菌は、ＮＣＩＭＢに寄託番号４１０４３、４１０４６、４１０９５、４１０９６及び４１０９７で寄託されている。
【００４４】
更なる例として、動物体内でプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ胃腸管から単離することによって得られる乳酸桿菌の菌株が挙げられる。プロバイオティクスは、生存可能かもしくは死んだ微生物、微生物の加工組成物、タンパク質もしくは炭水化物などのそれらの構成成分、又は宿主に有利に作用する細菌発酵の精製画分である。プロバイオティク細菌の一般的な使用は、生存可能な細胞の形である。しかしながら、それは、死菌液類又はプロバイオティク細菌で表される有益な要因を含有する組成物などの生育不能な細胞にまで拡大することができる。これには、加熱殺菌された微生物類、又は変化したｐＨへの曝露もしくは圧迫を受けることによって殺菌された微生物類を包含することができる。本発明の目的のために、「プロバイオティクス」は、別個に表示されないのであれば、発酵中に本発明の微生物類によって産生された代謝産物も包含するものとする。これらの代謝産物は、発酵の媒質から放出されることがあるか、又は微生物の体内に保存されることがある。本明細書で使用する時、「プロバイオティクス」は、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌性抽出物、細菌性発酵上澄み、及びこれらの組み合わせをも包含し、これらは、治療投与量で与えられると宿主動物に有利な機能を発揮する。
【００４５】
切除及び洗浄された哺乳類のＧＩ管から直接単離することによって得られる乳酸桿菌属の乳酸菌は、生存可能な細菌細胞の摂食後にＧＩ管に接着すること、及び生存可能な形、生育不能な形又は分割された形で動物に与えると、著しく免疫調節性でもあることが分かっている。理論に束縛されるものではないが、切除及び洗浄されたＧＩ管から単離することによって得られる乳酸桿菌は、腸粘膜組織と密に結び付くと考えられる。更に理論に束縛されるものではないが、これによって、プロバイオティク作用を引き起こす代替の宿主反応を生じさせる本発明のプロバイオティク乳酸桿菌が得られると考えられる。切除及び洗浄されたＧＩ管から単離することによって得られるプロバイオティク細菌は、粘膜上皮及び宿主の免疫細胞との直接的な相互作用を介して宿主の免疫系を調節し得ることが分かっている。この免疫調節は、プロバイオティク細菌に関連する伝統的な作用機序、すなわち栄養素のための閉塞及び競合による病原体の腸への接着を予防することと併せて、プロバイオティク生物体として非常に有効な本発明の乳酸桿菌をもたらす。
【００４６】
切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管から単離することによって得られる本発明の乳酸桿菌は、多数の病原菌株／種に対してインビトロ抗菌活性を有する。理論に束縛されるものではないが、インビトロ抗菌活性は動物、好ましくはイヌ科動物及びネコ科動物などのコンパニオンアニマルにおける生体内での潜在的なプロバイオティク活性の指標となると考えられる。本発明の乳酸菌は、好ましくは、ネズミチフス菌、リステリア菌、リステリア イノキュア又はエシェリキア（Eschericia coli）、より好ましくはこれら菌株の組み合わせ、更に好ましくはこれら菌株全て、に対してインビトロ抗菌活性を有する。
【００４７】
理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸菌の前記抗菌活性は、本明細書中の乳酸菌による多数の異なる作用の結果であり得ると考えられる。糞便試料から単離された幾つかの細菌株は、閉塞による腸粘膜への病原体類の接着を予防することによって、経口消費の後でＧＩ管内でそれらのプロバイオティク効果を発揮することが、当該分野では以前に提案されている。これには、細菌コロニーが腸内で確立されるために「生」又は生存可能な細菌細胞の経口消費が必要である。しかしながら、切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管から単離によって得られる本発明の乳酸桿菌は、生存可能な形で与えられた場合には、閉塞に起因していくらかのプロバイオティク効果を発揮すると同時に、病原微生物の増殖を阻害するか又は病原微生物を殺す物質（単数又は複数）のインビトロ発酵中の産生に起因して、生存可能な形か又は生育不能な形で実質的なプロバイオティク効果を供給することができ、及び／又は宿主動物の免疫適合性を変えることができると考えられる。この形のプロバイオティク活性は、本発明の細菌が生存可能もしくは生育不能な培養菌又は精製された発酵産物として与えられ、その上、宿主動物に有益な治療効果を供給することができるので、望ましい。
【００４８】
好ましくは、本発明の乳酸菌は、ＧＩ管内を通過した後に生存能を維持することが可能である。このことは、前記細菌の生きた培養菌を経口服用するため、及び食道及び胃を通過した後で腸及び腸管の中でコロニー形成が生じるために、望ましい。本発明の乳酸菌による腸及び腸管のコロニー形成は、長期のプロバイオティク効果が宿主に供給されるため望ましい。生育不能な細胞又はそれらの精製単離株の経口服用は、一時的な効果を引き起こすが、細菌は生存可能ではないので、増殖することや、その場でプロバイオティク効果を連続的に供給することができない。結果として、これは、健康上の利益を維持するために宿主に定期的に投与される必要があるかもしれない。対照して、生存可能な形で胃通過において生存して、その後、腸粘膜に接着して増殖することによってコロニー形成することができる生存可能な細胞は、その場で連続的にプロバイオティク効果を供給することが可能である。
【００４９】
従って、本発明の乳酸菌はｐＨ２．５の培地中において１時間懸濁した後に生存能を維持することが好ましい。本明細書で使用する時、「生存能を維持する」とは、試験培地中で初期懸濁された細菌の少なくとも２５％が、当業者に公知の平板計数法を用いて生存可能であることを意味する。好ましくは、「生存能を維持する」とは、初期懸濁された細菌の少なくとも５０％が生存可能であることを意味する。本発明の乳酸菌にとって、低いｐＨにおいて曝露した後に生存能を維持することは、このことが動物体内での経口消費後の生体内の胃及び上部腸内での胃液への曝露を模倣するので、望ましい。
【００５０】
更に、本発明の乳酸菌は、少なくとも０．５％ブタ胆汁酸塩が存在下にある場合（whenin）、少なくとも６６％の増殖を示すことが好ましい。本明細書で使用する増殖は、実施例３で更に詳細に説明する。より好ましくは、本発明の細菌は、少なくとも１％ブタ胆汁酸塩の存在下にある場合、少なくとも３３％の増殖を示す。更に好ましくは、本発明の細菌は、少なくとも０．５％ブタ胆汁酸塩の存在下で、１００％の増殖を示す。理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸菌は、少なくとも０．５％ブタ胆汁酸塩の存在下で生存能を維持することができ、腸内に存する状況で生存することが可能である。このことは、腸の状況を模倣する培地へのブタ胆汁の添加の結果であると考えられる。
【００５１】
更にその上、本発明の乳酸菌は、インビトロ腸上皮細胞への顕著な接着を示すことが好ましい。本明細書で使用する時、「顕著な接着」とは、上皮細胞と共インキュベーションされた乳酸菌の総数の少なくとも０．２％が上皮細胞とインビトロにて接着することを意味する。より好ましくは、共インキュベーションされた細菌細胞の少なくとも０．３％が上皮細胞とインビトロにて接着する。理論に束縛されるものではないが、腸上皮細胞のインビトロ接着は、インビトロにて動物のＧＩ管をコロニー形成する乳酸菌の能力の指標であると考えられる。
【００５２】
好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス（Lactobacillus murinus/ruminus）種、ラクトバシラス クリスパトゥス（Lactobacillus crispatus）種、ラクトバシラス アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）種、ラクトバシラス フェルメントゥム（Lactobacillus fermentum）種、ラクトバシラス ブクネリ（Lactobacillus buchneri）種、ラクトバシラス ロイテリ（Lactobacillus reuteri）種、ラクトバシラス ラクティス（Lactobacillus lactis）種、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される種、より好ましくはラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス種である。
【００５３】
１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、様々な細菌の種及び菌株を同定するために使用され得る細菌ゲノム中のＤＮＡの配列として当業者には公知である。この遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、以下に詳述する方法によって決定することができる。
【００５４】
乳酸桿菌コロニーを寒天プレートから選らんで、ＩＸ ＰＣＲ緩衝液中に再懸濁し、９６℃で５分間加熱し、−７０℃で５〜１０分間凍結させ、解凍して、アリコートをＰＣＲエッペンドルフ（eppendorf）チューブに入れた。ＰＣＲは、遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）プライマーであるＩＧＳ Ｌ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ−３’（配列番号５）及びＩＧＳ Ｒ：５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号６）を用いて行った。サイクル条件は、９６℃で１分（１サイクル）、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で３０秒（２８サイクル）であった。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ ５μＬ、ＰＣＲ緩衝液（バイオライン（Bioline）、英国）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ロッシュ（Roche）、英国）、０．４μＭ ＩＧＳ Ｌ及びＲプライマー（１５０ ｎｇ／５０μＬ）（ＭＷＧバイオテック（Biotech）、ドイツ）並びにバイオライン（Bioline）Ｔａｑポリメラーゼ（０．６単位）を含有していた。ＰＣＲ反応はハイバイド（Hybaid）熱循環装置で行った。ＰＣＲ生成物（８μＬ）は、分子量マーカー（φΧ１７４ Ｈａｅ ＩＩＩ、プロメガ（Promega））と一緒にＴＡＥ中２％アガロースＥｔＢｒ染色ゲル上でにじませて、それらのＩＧＳ特性を求めた。上記と同じプライマーを用いて、４種のイヌ科動物の乳酸桿菌株についての遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）ＤＮＡを、当業者に公知の方法を用いて配列決定した。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号１に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号１に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９４（ＡＨＣ１２２２）又はその突然変異体である。
【００５６】
本発明の別の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号２に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号２に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９６（ＡＨＣ５３２３）又はその突然変異体である。
【００５７】
本発明の別の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号３に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号３に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９７（ＡＨＣ６３３１）又はその突然変異体である。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施形態において、乳酸桿菌属の乳酸菌株は、配列番号４に係るポリヌクレオチド配列と少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明の乳酸菌株は、配列番号４に係る１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。更に好ましくは、本発明の乳酸菌株は、ラクトバシラス ムリヌス／ルミヌス菌株ＮＣＩＭＢ ４１１９５（ＡＨＣ３１３３）又はその突然変異体である。
【００５９】
配列決定後、４種の預けられた菌株について得られた配列を、他の預けられた細菌１６ｓ−２３ｓ配列との相同性についてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なオンライン配列データベース「ＢＬＡＳＴ」と比較した。ＡＨＣ１２２２，３１３３，５３２３及び６３３１（それぞれＮＣＩＭＢ ４１１９４，４１１９５，４１１９６及び４１１９７）と最もよく一致したのは、ラクトバシラス ルミニス（Lactobacillus ruminis）菌株ＡＦ０８０１０３であった。しかしながら、ＡＨＣ菌株とラクトバシラス ルミニス（Lactobacillus ruminis）菌株との間の幾つかの大きな違いがスペーサー領域にあり、その結果、相同性スコアは８７％、及びＢＬＡＳＴスコアは少なくとも１７０となる。
【００６０】
本発明の乳酸菌の使用方法は、典型的には動物による経口消費を伴う。経口消費は、標準的な食事摂取量の一部として、又はそのサプリメントとして行われてよい。前記の経口消費は、典型的には、少なくとも月１回、好ましくは少なくとも週１回、より好ましくは少なくとも一日１回行う。前記乳酸桿菌は、コンパニオンアニマルに治療上有効な量で与えて、動物、好ましくはコンパニオンアニマルにおける健康を維持又は改善することができる。本明細書で使用する時、乳酸菌に関する「治療上有効な量」とは、治療が必要な宿主動物に望ましい効果、又は利益を与えるのには十分であり、更には毒性、過敏、又はアレルギー反応などの副作用を回避するのに十分低く、本発明の方式で用いられる場合に適切な利益／危険比に見合う、細菌の量を意味する。特定の「治療上有効な量」は、治療されている特定の状態、ユーザーの物理的状態、治療の期間、併用している療法（もしあれば）の性質、用いられる特定の投薬形態、使用されるキャリア、投与形態の溶解性、及び特定の投与レジメンなどの要因によって変化する。
【００６１】
好ましくは、乳酸菌は、コンパニオンアニマルに一日に１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１４ ＣＦＵ、より好ましくは一日に１．０Ｅ＋０６〜１．０Ｅ＋１２ ＣＦＵの投与量で与える。前記組成物は好ましくは、切除及び洗浄された哺乳類ＧＩ管から分離することによって得られる乳酸桿菌１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１２ ＣＦＵ／ｇを少なくとも０．００１％含有し得る。乳酸菌は、生存可能な形態で、又は死んだ細胞、又は留出物、分離物もしくは本発明の乳酸菌の発酵産物の他の画分、あるいはこれらのいずれかの組み合わせとして、動物に与えることができる。
【００６２】
好ましくは、乳酸菌、又はその精製もしくは分離された画分を用いて、動物の健康を維持又は改善することを目的とする組成物を調製する。上述の通り、前記組成物は標準的な食事摂取量の一部又はサプリメントであってよい。前記組成物が標準的な食事摂取量の一部を構成する場合、前記組成物は、ビスケット又は粗挽きの穀物（kibbles）のような乾燥アニマルフード、加工された粒餌、湿式アニマルフード、ヨーグルト、肉汁、噛み物（chews）、トリーツなどの形態であってもよい。
【００６３】
かかる組成物は、更なる構成成分を含んでいてよい。他の構成成分は、本明細書で使用される組成物に含めるのに有益であるが、本発明の目的には任意である。例えば、フード組成物は好ましくは、栄養的にバランスが取れている。１つの実施形態では、フード組成物は、乾燥物質基準で、フード組成物の約２０重量％〜約５０重量％の粗タンパク質、好ましくは約２２重量％〜約４０重量％の粗タンパク質を含んでもよい。粗タンパク質材料は、タンパク質含量が少なくとも約１５重量％のいずれかの材料を含んでいてよく、その非限定的な例としては、大豆、綿実及び落花生などの植物性タンパク質、カゼイン、アルブミン、及び肉組織などの動物性タンパク質が挙げられる。本明細書で有用な肉組織の非限定的な例としては、新鮮な肉、及び魚粉、家禽の肉粉、肉粉、骨粉などのような乾燥粉又は粉砕物（rendered meals）が挙げられる。好適な粗たんぱく質源の他の種類としては、小麦グルテン又はトウモロコシグルテン、及び酵母などの微生物起源から抽出されたタンパク質類が挙げられる。
【００６４】
更に、フード組成物は、乾燥物質基準で、フード組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、好ましくは約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。その上更に、本発明の乳酸菌を含むフード組成物は、合計食物繊維を約４％〜約２５％含んでいてもよい。前記組成物は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９９／５１１０８に記載されているような複合的デンプン源を含んでいてもよい。
【００６５】
本発明の組成物は、炭水化物源を更に含んでよい。米、トウモロコシ、ミロ、サトウモロコシ、大麦、アルファルファ、小麦などのグレイン又は穀物類が実例的な供給源である。加えて、前記組成物は、乾燥乳清及び他の酪農副産物などの他の材料を含有していてもよい。
【００６６】
本発明の細菌を含む組成物は、プレバイオティクスを含んでいてもよい。「プレバイオティクス」には、ペットの腸管内菌叢によって発酵され、それにより病原菌を犠牲にして、ペットの胃腸管内での乳酸菌の増殖又は発達を促進する物質又は化合物が包含される。この発酵の結果は、脂肪酸の放出、特に結腸内での短鎖脂肪酸の放出である。これは、結腸内でｐＨを下げる効果を発揮する。好適なプレバイオティクスの非限定的な例としては、イヌリン、及びフラクトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、キシロオリゴ糖類又はデンプンのオリゴ誘導体類として一般に知られているその加水分解生成物などのオリゴ糖類が挙げられる。プレバイオティクスは、いずれかの好適な形態で提供することができる。例えば、プレバイオティクスは、繊維を含有する植物材料の形態で提供することができる。好適な植物材料としては、アスパラガス、アーティチョーク、たまねぎ、小麦又はチコリ、あるいはこれら植物材料の残留物が挙げられる。別法として、プレバイオティク繊維は、イヌリン抽出物として提供することができ、例えばチコリからの抽出物が適している。好適なイヌリン抽出物は、ベルギー国チルルモン３３００のオラフティＳＡ（Orafti SA）から「ラフチリン（Raftiline）」の商標で入手可能である。例えば、イヌリンは、白色微粉末であって、約９０〜９４重量％のイヌリン、約４重量％までのグルコース及びフルクトース、並びに約４〜９重量％のスクロースを含有するラフチリン（Raftiline）（ｇ）ＳＴの形態で提供され得る。あるいは、前記繊維は、ベルギー国チルルモン３３００のオラフティＳＡ（Orafti SA）から「ラフチロース（Raftilose）」の商標で得られるようなフラクトオリゴ糖の形態であってよい。例えば、イヌリンは、ラフチロース（Raftilose）（ｇ）Ｐ９５の形態で（in the form o）提供され得る。別法では、フラクトオリゴ糖類は、酵素法によって又は微生物を用いて、イヌリンを加水分解することにより入手可能である。
【００６７】
乾燥ペットフードの場合、適した加工は、押出し成形調理であるが、焼くことや他の好適な加工を使用してもよい。押出し成形調理の場合、乾燥ペットフードは通常、粗挽きの穀物の形態で提供される。プレバイオティクスを用いる場合、加工する前にプレバイオティクスを乾燥ペットフードの他の成分と混合することができる。適した加工は、欧州特許出願第０８５０５６９号に記載されている。プロバイオティク微生物を用いる場合、生物体を最善には乾燥ペットフードにコーティングするか又は乾燥ペットフードに詰める。好適なプロセスは、欧州特許出願ＥＰ０８６２８６３号に記載されている。
【００６８】
湿式フードの場合、米国特許第４，７８１，９３９号及び同第５，１３２，１３７号に記載のプロセスを用いて、擬似肉製品を製造することができる。ぶつ切りタイプの製品を製造する他の手順を用いてもよい；例えば、蒸気オーブンでの調理など。あるいは、ローフ型の製品は、適した肉材料を乳化して肉エマルションを製造し、好適なゲル化剤を添加して、缶又は他の容器に詰める前に肉エマルションを加熱することによって製造することができる。典型的な湿式フード組成物は、約５％〜約１５％のタンパク質、約１％〜約１０％の脂肪、及び約１％〜約７％の繊維を含んでいてもよい。湿式フード組成物に使用できる非限定的な成分としては、鶏肉、シチメンチョウ、牛肉、ホワイトフィッシュ、チキンブロス、シチメンチョウブロス、ビーフブロス、鶏レバー、発酵用米、挽き割りトウモロコシ、魚肉、卵、ビートパルプ、塩化物、亜麻粉、子羊、牛肉副産物、鶏肉副産物及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６９】
別の実施形態では、ビスケット、噛み物及び他のトリーツなどのサプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約２０重量％〜約６０重量％のタンパク質、又は約２２重量％〜約４０重量％のタンパク質を含んでもよい。別の例としては、前記サプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、又は約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。イヌ科動物又はネコ科動物による使用を意図されたフード及びサプリメント組成物は、一般的に当該技術分野において既知である。
【００７０】
ペットフードは、長鎖脂肪酸及び亜鉛などの他の活性剤を含有していてもよい。好適な長鎖脂肪酸には、α−リノール酸、γ−リノレン酸、リノール酸、エイコサペンタン酸（eicosapentanoic acid）、及びドコサヘキサン酸（docosahexanoic acid）が包含される。魚油は、エイコサペンタン酸（eicosapentanoic acid）及びドコサヘキサン酸（docosahexanoic acid）の好適な供給源である。
【００７１】
ルリチシャ油、黒フサスグリ実油及びマツヨイグサ油はγ−リノレン酸の好適な供給源である。ベニバナ油、ヒマワリ油、コーン油及び大豆油は、リノール酸の好適な供給源である。これらの油は、前記のコーティング基材中で使用することもできる。亜鉛は様々な好適な形態で、例えば硫酸亜鉛又は酸化亜鉛として提供され得る。更に、ペットフードに通常使用される多くの成分は、脂肪酸及び亜鉛の供給源である。プレバイオティクス供給源としてのチコリと、大豆油などのリノール酸リッチオイルとの組み合わせは、相乗効果を連想させる、予期しない利益を提供することが観察されている。
【００７２】
前記組成物が肉汁の形態である場合、組成物は好ましくは、少なくとも１０％のブロス、又はストックを含み、ストックの非限定的な例としては、ベジタブル ビーフ（vegetable beef）、チキン又はハムのストックが挙げられる。典型的な肉汁組成物は、約０．５％〜約５％の粗タンパク質、約２％〜約５％の粗脂肪、及び約１％〜約５％の繊維を含んでいてもよい。
【００７３】
本明細書で使用するのに好適なサプリメントの更なる非限定的な例としては、粉末、油懸濁液、乳をベースとした懸濁液であるチーズ、及びピル又はカプセルが挙げられる。前記組成物がピルの形状である場合、好適な結合剤は、ピルを固体の加圧形状に保持するよう要求される。好適な結合剤の非限定的な例には、キサンタンガムなどの天然ゴム類、ペクチン、レシチン、アルギネート及び当業者に公知の他のものが包含される。前記組成物がカプセルの形状である場合、組成物は好ましくは、当業者に公知の技術を用いてカプセル封入される。好適な封入材料の非限定的な例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アルギネート及びゼラチンが挙げられる。ヨーグルト系組成物は、約１％〜約５％のタンパク質、約１０％〜約２０％の炭水化物、約１％〜約５％の繊維、約１％〜約５％の脂肪及び約５０％〜約９０％の乳などの液体キャリアを含んでいてもよい。
【実施例】
【００７４】
実施例１〜４は、本発明で使用されるプロバイオティク ラクトバシラス ムリヌス種を含む乾燥した粗挽き穀物組成物の例である。
【表２】
【００７５】
実施例５〜７は、本発明で使用されるプロバイオティク ラクトバシラス ムリヌス種を含む湿式ペットフード組成物の例である。
【表３】
【００７６】
実施例８〜１０は、本発明で使用されるプロバイオティク ラクトバシラス ムリヌス種を含むヨーグルトサプリメント組成物の例である。
【表４】
【００７７】
本発明の特定の実施形態を例示し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明白であろう。従って、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパニオンアニマルにおける免疫系の調節、コンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、コンパニオンアニマルにおける老化の影響の改善又は低減、コンパニオンアニマルにおける感染中及び感染後の体重減少の予防、コンパニオンアニマルにおける尿路疾患の治療又は予防、コンパニオンアニマルにおける繊維消化の向上、コンパニオンアニマルにおける胃腸管の感染症の予防又は治療、コンパニオンアニマルにおける消化の改善、コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルの低下あるいはこれらの組み合わせから選択されるコンパニオンアニマルの処置のための薬剤の製造における、切除及び洗浄された哺乳類の胃腸管から単離することによって得られる乳酸桿菌のプロバイオティク菌株を含む、組成物の使用。
【請求項２】
前記コンパニオンアニマルが、イヌ科動物又はネコ科動物からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記乳酸桿菌のプロバイオティク菌株が、ヒト、イヌ科動物又はネコ科動物から得られる切除及び洗浄された胃腸組織から分離される、請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、コンパニオンアニマルの胃腸管において生存してコロニーを形成する能力で選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、０．５％胆汁酸塩の存在下で培養すると少なくとも３３％増殖する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、ｐＨ２．５において１時間後に生存能を維持することが可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、ラクトバシラス サリバリウス種、ラクトバシラス カゼイ種又はラクトバシラス ムリヌス種から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、ＮＣＩＭＢ ４０８２９、ＮＣＩＭＢ ４０８３０、ＮＣＩＭＢ ４１０４４、ＮＣＩＭＢ ４１０４５、ＮＣＩＭＢ ４１０４７、ＮＣＩＭＢ ４１０９３、ＮＣＩＭＢ ４１０９４、ＮＣＩＭＢ ４１０４３、ＮＣＩＭＢ ４１０４６、ＮＣＩＭＢ ４１０９５、ＮＣＩＭＢ ４１０９６、ＮＣＩＭＢ ４１０９７、ＮＣＩＭＢ ４１１９４、ＮＣＩＭＢ ４１１９５、ＮＣＩＭＢ ４１１９６、ＮＣＩＭＢ ４１１９７、これらの突然変異体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
コンパニオンアニマルにおける免疫系を調節するための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記調節が、コンパニオンアニマルにおける自己免疫疾患の治療又は予防、コンパニオンアニマルにおける炎症の治療又は予防あるいはこれらの組み合わせを含む、使用。
【請求項１０】
コンパニオンアニマルにおけるアトピー性皮膚疾患を治療又は予防することを含む、コンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康を維持又は改善するための薬剤の製造における、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
コンパニオンアニマルにおける尿路疾患を治療又は予防するための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記尿路疾患が、尿路感染、腎結石又はこれらの組み合わせを含む、使用。
【請求項１２】
前記プロバイオティク ビフィズス菌がインビトロにてシュウ酸の分解を増進する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
胃腸管の感染症の予防又は治療のための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記予防又は治療が、前記コンパニオンアニマルにおける微生物生態系を改善すること、前記コンパニオンアニマルの糞便中で発見される病原菌の数を低減することあるいはこれらの組み合わせを含む、使用。
【請求項１４】
前記病原菌が、クロストリジウム属、エシェリキア属、サルモネラ属及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルを低下するための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記ストレスレベルが、エピネフリン、ノルエポネフリン（noreponephrine）、ドーパミン、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるストレスホルモンの、前記コンパニオンアニマルにおける血中レベルを決定することによって測定される、使用。
【請求項１】
コンパニオンアニマルにおける免疫系の調節、コンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、コンパニオンアニマルにおける老化の影響の改善又は低減、コンパニオンアニマルにおける感染中及び感染後の体重減少の予防、コンパニオンアニマルにおける尿路疾患の治療又は予防、コンパニオンアニマルにおける繊維消化の向上、コンパニオンアニマルにおける胃腸管の感染症の予防又は治療、コンパニオンアニマルにおける消化の改善、コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルの低下あるいはこれらの組み合わせから選択されるコンパニオンアニマルの処置のための薬剤の製造における、切除及び洗浄された哺乳類の胃腸管から単離することによって得られる乳酸桿菌のプロバイオティク菌株を含む、組成物の使用。
【請求項２】
前記コンパニオンアニマルが、イヌ科動物又はネコ科動物からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記乳酸桿菌のプロバイオティク菌株が、ヒト、イヌ科動物又はネコ科動物から得られる切除及び洗浄された胃腸組織から分離される、請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、コンパニオンアニマルの胃腸管において生存してコロニーを形成する能力で選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、０．５％胆汁酸塩の存在下で培養すると少なくとも３３％増殖する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、ｐＨ２．５において１時間後に生存能を維持することが可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、ラクトバシラス サリバリウス種、ラクトバシラス カゼイ種又はラクトバシラス ムリヌス種から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記プロバイオティク乳酸桿菌が、ＮＣＩＭＢ ４０８２９、ＮＣＩＭＢ ４０８３０、ＮＣＩＭＢ ４１０４４、ＮＣＩＭＢ ４１０４５、ＮＣＩＭＢ ４１０４７、ＮＣＩＭＢ ４１０９３、ＮＣＩＭＢ ４１０９４、ＮＣＩＭＢ ４１０４３、ＮＣＩＭＢ ４１０４６、ＮＣＩＭＢ ４１０９５、ＮＣＩＭＢ ４１０９６、ＮＣＩＭＢ ４１０９７、ＮＣＩＭＢ ４１１９４、ＮＣＩＭＢ ４１１９５、ＮＣＩＭＢ ４１１９６、ＮＣＩＭＢ ４１１９７、これらの突然変異体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
コンパニオンアニマルにおける免疫系を調節するための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記調節が、コンパニオンアニマルにおける自己免疫疾患の治療又は予防、コンパニオンアニマルにおける炎症の治療又は予防あるいはこれらの組み合わせを含む、使用。
【請求項１０】
コンパニオンアニマルにおけるアトピー性皮膚疾患を治療又は予防することを含む、コンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康を維持又は改善するための薬剤の製造における、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
コンパニオンアニマルにおける尿路疾患を治療又は予防するための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記尿路疾患が、尿路感染、腎結石又はこれらの組み合わせを含む、使用。
【請求項１２】
前記プロバイオティク ビフィズス菌がインビトロにてシュウ酸の分解を増進する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
胃腸管の感染症の予防又は治療のための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記予防又は治療が、前記コンパニオンアニマルにおける微生物生態系を改善すること、前記コンパニオンアニマルの糞便中で発見される病原菌の数を低減することあるいはこれらの組み合わせを含む、使用。
【請求項１４】
前記病原菌が、クロストリジウム属、エシェリキア属、サルモネラ属及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルを低下するための薬剤の製造における請求項１に記載の使用であって、前記ストレスレベルが、エピネフリン、ノルエポネフリン（noreponephrine）、ドーパミン、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるストレスホルモンの、前記コンパニオンアニマルにおける血中レベルを決定することによって測定される、使用。
【公表番号】特表２００７−５３７９９８（Ｐ２００７−５３７９９８Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４５５９７（Ｐ２００６−５４５５９７）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４３０６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６０７０７
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５９５０５６８５９）ザ・アイムス・カンパニー (52)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｉａｍｓ Ｃｏｍｐａｎｙ
【出願人】（５０６１２８０２０）アリメンタリー、ヘルス、リミテッド (10)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＩＭＥＮＴＡＲＹ ＨＥＡＬＴＨ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４３０６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６０７０７
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５９５０５６８５９）ザ・アイムス・カンパニー (52)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｉａｍｓ Ｃｏｍｐａｎｙ
【出願人】（５０６１２８０２０）アリメンタリー、ヘルス、リミテッド (10)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＩＭＥＮＴＡＲＹ ＨＥＡＬＴＨ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
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