サテライトＲＮＡ、同ＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、同弱毒ウイルスを接種したキュウリモザイクウイルス抵抗性植物及びキュウリモザイクウイルスの防除法
【課題】チャンギャン、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ及びスーパーマニタ等を含む唐辛子品種にウイルス症状を全く示さない、これら唐辛子品種から強毒ＣＭＶの感染を無症状で防除する弱毒ＣＭＶを提供する。
【解決手段】キュウリモザイクウイルスの特定の塩基配列からなるサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【解決手段】キュウリモザイクウイルスの特定の塩基配列からなるサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唐辛子に病害をもたらすキュウリモザイクウイルス（以下「ＣＭＶ」ともいう）に対して優れた防除効果を有するＣＭＶ弱毒ウイルス、当該ＣＭＶ弱毒ウイルスを得るためのサテライトＲＮＡ、該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予め唐辛子苗に接種したＣＭＶ抵抗性唐辛子、及び該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予め唐辛子苗に接種することによるＣＭＶの防除法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）は、ブロモウイルス（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）科ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）属の代表的な種であり、温帯地方や熱帯地方における多くの農作物を宿主とする。このウイルスは、ウイルスのなかで最も多くの宿主を持つと考えられ、キュウリ、カボチャ、メロン、トマト、ピーマン、トウガラシ、タバコ、ゴボウ、レタス、ダイコン、ハクサイ、ニンジン及びセロリ等のウリ科、ナス科、キク科、アブラナ科、マメ科及びセリ科等の８５科３５６属７７５種もの植物に感染する。
ＣＭＶの感染は、これらの植物体の矮化や叢生とともに、葉にモザイクや奇形を示して、輪点や壊疽症状若しくは葉脈上に葉状突起を生ずることもある。また、花にも花弁に斑入りをつくって花の奇形を生じたり、果実もその表面が凹凸になり、モザイク症状若しくは黄色斑点をつくったりと、果実収量を低下させる。
【０００３】
このようなＣＭＶの病害を防除する方法として、弱毒ウイルスによる干渉作用（ｃｒｏｓｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を利用したものがある。これは、既にウイルスに感染している植物は、そのウイルスと同じであるか、極めて近縁のウイルスには感染し難いという現象を利用したものであり、植物に予め、病原性ウイルスと同系統で病徴がないか、極めて軽微なウイルスを接種し感染させて、病原性ウイルスによる感染を防除する方法である。
【０００４】
また、ＣＭＶには、４種類のＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４）の他に、ＣＭＶのウイルス症状を緩和するサテライトＲＮＡを有するものがあり、本発明者らは、トマト、ピーマン、唐辛子及びタバコのＣＭＶによる病害を防除するため、このようなサテライトＲＮＡを有するＣＭＶの弱毒ウイルスをこれまでに開発している（特許文献１、２、３、４及び５参照）。
【特許文献１】特許第２９７５７３９号
【特許文献２】特許第３７２８３８１号
【特許文献３】特開２００６−３２０３０９号公報
【特許文献４】韓国特許第７４７６４９号
【特許文献５】特開２００７−８２４１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献３、４に係る唐辛子のＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０５−２は、代表的な赤唐辛子品種であるチャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタに接種した際に、軽微なウイルス症状（クロロシス）を示す。そのため、該唐辛子品種にウイルス症状を示さず、外界の強毒ＣＭＶに高い感染防除能を有する弱毒ウイルスが長く希求されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、唐辛子圃場で採取したウイルス症状の微弱な唐辛子からＣＭＶ弱毒ウイルスを分離し選抜して、検討を重ねた結果、特定塩基配列からなるサテライトＲＮＡを有する弱毒ＣＭＶが、多くの唐辛子品種に接種した際にウイルス症状を全く示さず、外界強毒ＣＭＶに高い防除能を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
よって、本発明は、以下に関する。
なお、ここで本発明のサテライトＲＮＡは、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１から直接採取したものでも、採取したＲＮＡを鋳型としてクローニングしたものでも、また、ＲＮＡ自動合成装置で化学合成したものでも良い。
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ。
（２）上記（１）に記載のサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
（３）上記（２）に記載のキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
（４）植物苗が唐辛子苗である、上記（３）に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
（５）上記（２）に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる、植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
（６）植物苗が唐辛子苗である、上記（５）に記載の植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスによって、ＣＭＶの病害から多くの唐辛子品種を防除することができ、ウイルス症状のない高品質で多収量の唐辛子を減農薬栽培で生産することができる。よって、唐辛子を原料とするキムチ等の食品産業の発展にも資すること大である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）ＣＭＶ弱毒ウイルスの採取と作出
ＣＭＶ弱毒ウイルスは、例えば、唐辛子圃場よりウイルス症状を持つ唐辛子及びトマトの葉を採集することにより、採取することができる。
ＣＭＶ弱毒ウイルスの検出は、例えば、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗に接種し、エライザー検定により、ＣＭＶの感染を確認することにより行うことができる。
【００１０】
弱毒ウイルスの選抜は、上記トマト苗の感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ６０２８）１０株ずつに接種して、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析することにより、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶを検出することにより行うことができる。
サテライトＲＮＡを有するＣＭＶについて、該トマト苗におけるウイルス症状調査を行って、ネクロシスやモザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除いて、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜することができる。
弱毒ウイルスは、遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっているので、該トマト苗にこれら弱毒ウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜する。
サテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採取して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマト苗に接種し、同じ選抜操作を行って、ウイルス接種液を調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行うことにより、サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルスを作出する。
【００１１】
（２）サテライトＲＮＡの単離
サテライトＲＮＡの単離は、以下のようにして行うことができる。
上記サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルスをトマト苗（ＴＭＫ６０２８）の子葉に接種して感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取して−８０℃の冷凍庫で凍結する。
次いで、この感染葉を粉砕して、２倍量の０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と、同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダー（ワーリング社製）で破砕する。この破砕液を９，５００×ｇ、１０分間遠心して、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加えて溶解させた後、４０分間静置する。
次いで、この溶液を９，５００×ｇで２０分間遠心して、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁し均一化する。この粗精製品を１２，０００×ｇで遠心分離した上清を２４０，０００×ｇで４５分間遠心して、沈殿を回収した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁する。
この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加えて、さらにこの溶液と等量のフェノールを加えた後、１２，０００×ｇで１５分間遠心する。
この上層（水層）を回収して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、ＲＮＡを単離精製することができる。感染葉１００ｇより、約２０ｍｇのＲＮＡを得ることができる。
【００１２】
次いで、得られたＲＮＡを水に溶解して、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離（１７５，０００×ｇで１６時間）し、得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製することができる。
精製が不十分な場合は、６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行って、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリで切り取り、透析チューブに入れ、ＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動により溶出し、サテライトＲＮＡを回収して、常法に従いエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製することができる。
この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））に従って行うことができる。
【００１３】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンシング
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するためには、−鎖ｃＤＮＡ合成反応は、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（キアゲン社製）を用いて行うことができる。
次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させる。このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出して、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて精製する。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）にクローニングして、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによって、サテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認することができる。
【００１４】
サテライトＲＮＡの塩基配列は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所社製）を用いて決定することができる。
【００１５】
（４）弱毒ウイルスの安定性
ガラス温室において、上記弱毒ウイルスをチャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの唐辛子苗の子葉又は本葉に、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで接種して、さらに５世代に亘って継代接種し、本葉６〜８枚期までそのウイルス症状を調査することにより、唐辛子に全くウイルス症状を発生せず、変異によってモザイク症状や壊死が発生しない安定な弱毒ウイルスを選抜することができる。
【００１６】
チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタは、唐辛子の品種名で、韓国内の種苗会社（例えば、住所１１９７−４ Ｍａｅｔａｎ ２−Ｄｏｎｇ， Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−Ｇｕ， Ｓｕｗｏｎ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−Ｄｏ， Ｋｏｒｅａ、会社名Ｎｏｎｇｗｏｏ Ｂｏｉ Ｃｏ．（農友バイオ））等から容易に入手可能である。
【００１７】
（５）弱毒ウイルスの副作用チェック及び強毒ＣＭＶに対する防除試験
チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの種子を培養土に播種して、約１ヶ月間温室内で育苗する。
本葉１〜２枚期の唐辛子の幼苗に、弱毒ウイルスと以前開発した唐辛子用弱毒ウイルスのＮＤＭ０５−２を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで１次接種して、一定期間後に、唐辛子圃場で分離した強毒ＣＭＶのＣＭＶ−Ｐ０又はより毒性の強いＣＭＶ−Ｐ１を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで上記一次接種した唐辛子苗に二次接種する。
【００１８】
ここでＣＭＶ−Ｐ０は、病原性遺伝子Ｐ０を持つＣＭＶであり、ＣＭＶ−Ｐ１は、病原性遺伝子Ｐ１を持つＣＭＶである（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．２２， Ｎｏ．３， Ｐ２６５−２７０， ２００６， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ３ ｏｆ ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ参照）。
強毒ＣＭＶ接種３０日後に唐辛子苗のウイルス症状度を詳細に観察して点数化し、評価することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００１９】
（１）ＣＭＶ弱毒ウイルスの採取と作出
韓国内の唐辛子圃場より、ウイルス症状を持つ約６００枚の唐辛子及びトマトの葉を採集して、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗（日本デルモンテ社製ＴＭＫ６０２８）に接種した。一週間後、各々のエライザー検定を行った結果、２０９系統についてＣＭＶの感染を確認した。
【００２０】
これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、２０９系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ６０２８）１０株ずつに接種して、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析を行った。その結果、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶが９２系統から検出された。
これら９２系統について該トマト苗におけるウイルス症状調査を行って、ネクロシスやモザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除いて、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっていたので、該トマト苗１００株にこれら弱毒ウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜した。
さらにサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマト苗に接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行った。その結果、サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルス（ＮＤＭ０８−１）を作出した。
【００２１】
（２）サテライトＲＮＡの単離
ＮＤＭ０８−１をトマト苗（ＴＭＫ６０２８）の子葉に接種して感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取して−８０℃の冷凍庫で凍結した。
次いで、この感染葉を粉砕して、２倍量の０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダー（ワーリング社製）で破砕した。この破砕液を９，５００×ｇ、１０分間遠心して、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加えて溶解させた後、４０分間静置した。
次いで、この溶液を９，５００×ｇで２０分間遠心して、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁し均一化した。この粗精製品を１２，０００×ｇで遠心分離した上清を２４０，０００×ｇで４５分間遠心して、沈殿を回収した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加えて、さらにこの溶液と等量のフェノールを加えた後、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。
この上層（水層）を回収して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、ＲＮＡを単離精製した。その結果、感染葉１００ｇより、約２０ｍｇのＲＮＡを得た。
【００２２】
次いで、得られたＲＮＡを水に溶解して、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離（１７５，０００×ｇで１６時間）し、得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。精製が不十分な場合は、６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行って、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリで切り取って、透析チューブに入れ、ＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行った後、サテライトＲＮＡを回収して、常法に従いエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。
この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））に従って行った。
【００２３】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μＭ）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングした。この−鎖ｃＤＮＡ合成反応はＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（キアゲン社製）を用いて、３７℃、６０分の条件で行った。
次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させた。すなわち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用いて、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行った（ＰＣＲ反応液；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製））。
このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出して、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて精製した。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）にクローニングして、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによって、ＮＤＭ０８−１のサテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認した。
【００２４】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所社製）を用いて決定した。
本発明のキュウリモザイク弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１のサテライトＲＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【００２５】
なお、本発明のＮＤＭ０８−１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて受託が拒否されている（寄託受託証不交付通知書における識別のための表示：ＮＤＭ０８−１）。よって、ＮＤＭ０８−１は、出願人自らが保管し、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、譲渡を行う用意がある（保管場所：〒３７８−００１６、群馬県沼田市清水町３７８４番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部）。
【００２６】
また、比較のためＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０５−２（韓国特許第７４７６４９号）のサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号２）を配列表に示す。
【００２７】
（４）弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１の安定性
ガラス温室において、ＮＤＭ０８−１をチャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの韓国唐辛子苗の子葉又は本葉に、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで接種して、さらに５世代に亘って継代接種して本葉６〜８枚期までそのウイルス症状を調査した。その結果、ＮＤＭ０８−１は上記５品種の唐辛子に全くウイルス症状を発生せず、変異によってモザイク症状や壊死が発生しない安定な弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２８】
なお、チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタは、韓国における唐辛子の品種名で、韓国内の種苗会社（例えば、住所１１９７−４ Ｍａｅｔａｎ ２−Ｄｏｎｇ， Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−Ｇｕ， Ｓｕｗｏｎ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−Ｄｏ， Ｋｏｒｅａ、会社名Ｎｏｎｇｗｏｏ Ｂｏｉ Ｃｏ．（農友バイオ））等から容易に入手可能である。
【００２９】
（５）弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１の副作用及び強毒ＣＭＶに対する防除試験
チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの種子を培養土に播種して、約１ヶ月間温室内で育苗した。そして、本葉１〜２枚期の当該６種類の韓国唐辛子の幼苗を１試験区８株ずつに、本発明の弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１と以前開発した唐辛子用弱毒ウイルスのＮＤＭ０５−２を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで１次接種して、その２１日後に、韓国の唐辛子圃場で分離した強毒ＣＭＶのＣＭＶ−Ｐ０又はより毒性の強いＣＭＶ−Ｐ１を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで上記一次接種した唐辛子苗に二次接種した。
【００３０】
ここでＣＭＶ−Ｐ０は、病原性遺伝子Ｐ０を持つＣＭＶであり、ＣＭＶ−Ｐ１は、病原性遺伝子Ｐ１を持つＣＭＶである（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．２２， Ｎｏ．３， Ｐ２６５−２７０， ２００６， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ３ ｏｆ ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ参照）。
強毒ＣＭＶ接種３０日後に唐辛子苗のウイルス症状度を詳細に観察して点数化した。その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１の結果より、唐辛子苗にＣＭＶ−Ｐ０を接種すると、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性であるチャンギャン、トギャチョンチョン、デチョン、チャンマニ及びスーパーマニタにはウイルス症状は現れないが、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性でないハンバンドやクンサンリムにはモザイクや細葉等の重度のウイルス症状が現れ、ＣＭＶ−Ｐ１を接種すると、全ての唐辛子品種で重度のウイルス症状が現れた。
【００３３】
また、ＮＤＭ０５−２を一次接種すると、二次接種しない唐辛子苗においては、その全てから微弱なクロロシス症状が現れたが、ＣＭＶ−Ｐ０を二次接種すると、微弱なクロロシス症状が現れながらも、全ての唐辛子苗からその感染を防除できた。また、ＣＭＶ−Ｐ１を二次接種すると、ハンバンドとクンサンリムにモルト症状が現れたが、その他の品種では微弱なクロロシス症状が現れながらも、その感染を防除した。
【００３４】
一方、本発明のＮＤＭ０８−１を一次接種すると、二次接種しない唐辛子苗においては、その全てにウイルス症状が全く現れず、ＣＭＶ−Ｐ０を二次接種しても、無症状で全ての唐辛子苗からその感染を防除できた。また、ＣＭＶ−Ｐ１を二次接種するとＮＤＭ０５−２と同様に、ハンバンドとクンサンリムに弱いモルト症状が現れたが、その他の品種では、その感染を無症状で防除した。
【００３５】
よって、本発明のＮＤＭ０８−１は唐辛子に接種した際に、全くウイルス症状を発現しないという副作用の点で、ＮＤＭ０５−２より優れており、ＮＤＭ０８−１を接種することで、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性のないハンバンドやクンサンリム等の唐辛子から病原性遺伝子Ｐ０を有するＣＭＶ−Ｐ０の感染を無症状で防除することができ、また、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性を有するチャンギャン、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ及びスーパーマニタ等の唐辛子から、病原性遺伝子Ｐ０又はＰ１を有する強毒ＣＭＶ−Ｐ０とＣＭＶ−Ｐ１の感染を無症状で防除できることが分かった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唐辛子に病害をもたらすキュウリモザイクウイルス（以下「ＣＭＶ」ともいう）に対して優れた防除効果を有するＣＭＶ弱毒ウイルス、当該ＣＭＶ弱毒ウイルスを得るためのサテライトＲＮＡ、該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予め唐辛子苗に接種したＣＭＶ抵抗性唐辛子、及び該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予め唐辛子苗に接種することによるＣＭＶの防除法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）は、ブロモウイルス（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）科ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）属の代表的な種であり、温帯地方や熱帯地方における多くの農作物を宿主とする。このウイルスは、ウイルスのなかで最も多くの宿主を持つと考えられ、キュウリ、カボチャ、メロン、トマト、ピーマン、トウガラシ、タバコ、ゴボウ、レタス、ダイコン、ハクサイ、ニンジン及びセロリ等のウリ科、ナス科、キク科、アブラナ科、マメ科及びセリ科等の８５科３５６属７７５種もの植物に感染する。
ＣＭＶの感染は、これらの植物体の矮化や叢生とともに、葉にモザイクや奇形を示して、輪点や壊疽症状若しくは葉脈上に葉状突起を生ずることもある。また、花にも花弁に斑入りをつくって花の奇形を生じたり、果実もその表面が凹凸になり、モザイク症状若しくは黄色斑点をつくったりと、果実収量を低下させる。
【０００３】
このようなＣＭＶの病害を防除する方法として、弱毒ウイルスによる干渉作用（ｃｒｏｓｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を利用したものがある。これは、既にウイルスに感染している植物は、そのウイルスと同じであるか、極めて近縁のウイルスには感染し難いという現象を利用したものであり、植物に予め、病原性ウイルスと同系統で病徴がないか、極めて軽微なウイルスを接種し感染させて、病原性ウイルスによる感染を防除する方法である。
【０００４】
また、ＣＭＶには、４種類のＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４）の他に、ＣＭＶのウイルス症状を緩和するサテライトＲＮＡを有するものがあり、本発明者らは、トマト、ピーマン、唐辛子及びタバコのＣＭＶによる病害を防除するため、このようなサテライトＲＮＡを有するＣＭＶの弱毒ウイルスをこれまでに開発している（特許文献１、２、３、４及び５参照）。
【特許文献１】特許第２９７５７３９号
【特許文献２】特許第３７２８３８１号
【特許文献３】特開２００６−３２０３０９号公報
【特許文献４】韓国特許第７４７６４９号
【特許文献５】特開２００７−８２４１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献３、４に係る唐辛子のＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０５−２は、代表的な赤唐辛子品種であるチャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタに接種した際に、軽微なウイルス症状（クロロシス）を示す。そのため、該唐辛子品種にウイルス症状を示さず、外界の強毒ＣＭＶに高い感染防除能を有する弱毒ウイルスが長く希求されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、唐辛子圃場で採取したウイルス症状の微弱な唐辛子からＣＭＶ弱毒ウイルスを分離し選抜して、検討を重ねた結果、特定塩基配列からなるサテライトＲＮＡを有する弱毒ＣＭＶが、多くの唐辛子品種に接種した際にウイルス症状を全く示さず、外界強毒ＣＭＶに高い防除能を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
よって、本発明は、以下に関する。
なお、ここで本発明のサテライトＲＮＡは、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１から直接採取したものでも、採取したＲＮＡを鋳型としてクローニングしたものでも、また、ＲＮＡ自動合成装置で化学合成したものでも良い。
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ。
（２）上記（１）に記載のサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
（３）上記（２）に記載のキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
（４）植物苗が唐辛子苗である、上記（３）に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
（５）上記（２）に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる、植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
（６）植物苗が唐辛子苗である、上記（５）に記載の植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスによって、ＣＭＶの病害から多くの唐辛子品種を防除することができ、ウイルス症状のない高品質で多収量の唐辛子を減農薬栽培で生産することができる。よって、唐辛子を原料とするキムチ等の食品産業の発展にも資すること大である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）ＣＭＶ弱毒ウイルスの採取と作出
ＣＭＶ弱毒ウイルスは、例えば、唐辛子圃場よりウイルス症状を持つ唐辛子及びトマトの葉を採集することにより、採取することができる。
ＣＭＶ弱毒ウイルスの検出は、例えば、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗に接種し、エライザー検定により、ＣＭＶの感染を確認することにより行うことができる。
【００１０】
弱毒ウイルスの選抜は、上記トマト苗の感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ６０２８）１０株ずつに接種して、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析することにより、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶを検出することにより行うことができる。
サテライトＲＮＡを有するＣＭＶについて、該トマト苗におけるウイルス症状調査を行って、ネクロシスやモザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除いて、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜することができる。
弱毒ウイルスは、遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっているので、該トマト苗にこれら弱毒ウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜する。
サテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採取して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマト苗に接種し、同じ選抜操作を行って、ウイルス接種液を調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行うことにより、サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルスを作出する。
【００１１】
（２）サテライトＲＮＡの単離
サテライトＲＮＡの単離は、以下のようにして行うことができる。
上記サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルスをトマト苗（ＴＭＫ６０２８）の子葉に接種して感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取して−８０℃の冷凍庫で凍結する。
次いで、この感染葉を粉砕して、２倍量の０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と、同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダー（ワーリング社製）で破砕する。この破砕液を９，５００×ｇ、１０分間遠心して、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加えて溶解させた後、４０分間静置する。
次いで、この溶液を９，５００×ｇで２０分間遠心して、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁し均一化する。この粗精製品を１２，０００×ｇで遠心分離した上清を２４０，０００×ｇで４５分間遠心して、沈殿を回収した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁する。
この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加えて、さらにこの溶液と等量のフェノールを加えた後、１２，０００×ｇで１５分間遠心する。
この上層（水層）を回収して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、ＲＮＡを単離精製することができる。感染葉１００ｇより、約２０ｍｇのＲＮＡを得ることができる。
【００１２】
次いで、得られたＲＮＡを水に溶解して、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離（１７５，０００×ｇで１６時間）し、得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製することができる。
精製が不十分な場合は、６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行って、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリで切り取り、透析チューブに入れ、ＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動により溶出し、サテライトＲＮＡを回収して、常法に従いエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製することができる。
この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））に従って行うことができる。
【００１３】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンシング
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するためには、−鎖ｃＤＮＡ合成反応は、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（キアゲン社製）を用いて行うことができる。
次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させる。このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出して、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて精製する。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）にクローニングして、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによって、サテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認することができる。
【００１４】
サテライトＲＮＡの塩基配列は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所社製）を用いて決定することができる。
【００１５】
（４）弱毒ウイルスの安定性
ガラス温室において、上記弱毒ウイルスをチャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの唐辛子苗の子葉又は本葉に、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで接種して、さらに５世代に亘って継代接種し、本葉６〜８枚期までそのウイルス症状を調査することにより、唐辛子に全くウイルス症状を発生せず、変異によってモザイク症状や壊死が発生しない安定な弱毒ウイルスを選抜することができる。
【００１６】
チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタは、唐辛子の品種名で、韓国内の種苗会社（例えば、住所１１９７−４ Ｍａｅｔａｎ ２−Ｄｏｎｇ， Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−Ｇｕ， Ｓｕｗｏｎ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−Ｄｏ， Ｋｏｒｅａ、会社名Ｎｏｎｇｗｏｏ Ｂｏｉ Ｃｏ．（農友バイオ））等から容易に入手可能である。
【００１７】
（５）弱毒ウイルスの副作用チェック及び強毒ＣＭＶに対する防除試験
チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの種子を培養土に播種して、約１ヶ月間温室内で育苗する。
本葉１〜２枚期の唐辛子の幼苗に、弱毒ウイルスと以前開発した唐辛子用弱毒ウイルスのＮＤＭ０５−２を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで１次接種して、一定期間後に、唐辛子圃場で分離した強毒ＣＭＶのＣＭＶ−Ｐ０又はより毒性の強いＣＭＶ−Ｐ１を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで上記一次接種した唐辛子苗に二次接種する。
【００１８】
ここでＣＭＶ−Ｐ０は、病原性遺伝子Ｐ０を持つＣＭＶであり、ＣＭＶ−Ｐ１は、病原性遺伝子Ｐ１を持つＣＭＶである（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．２２， Ｎｏ．３， Ｐ２６５−２７０， ２００６， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ３ ｏｆ ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ参照）。
強毒ＣＭＶ接種３０日後に唐辛子苗のウイルス症状度を詳細に観察して点数化し、評価することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００１９】
（１）ＣＭＶ弱毒ウイルスの採取と作出
韓国内の唐辛子圃場より、ウイルス症状を持つ約６００枚の唐辛子及びトマトの葉を採集して、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗（日本デルモンテ社製ＴＭＫ６０２８）に接種した。一週間後、各々のエライザー検定を行った結果、２０９系統についてＣＭＶの感染を確認した。
【００２０】
これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、２０９系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ６０２８）１０株ずつに接種して、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析を行った。その結果、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶが９２系統から検出された。
これら９２系統について該トマト苗におけるウイルス症状調査を行って、ネクロシスやモザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除いて、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっていたので、該トマト苗１００株にこれら弱毒ウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜した。
さらにサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマト苗に接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行った。その結果、サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルス（ＮＤＭ０８−１）を作出した。
【００２１】
（２）サテライトＲＮＡの単離
ＮＤＭ０８−１をトマト苗（ＴＭＫ６０２８）の子葉に接種して感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取して−８０℃の冷凍庫で凍結した。
次いで、この感染葉を粉砕して、２倍量の０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダー（ワーリング社製）で破砕した。この破砕液を９，５００×ｇ、１０分間遠心して、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加えて溶解させた後、４０分間静置した。
次いで、この溶液を９，５００×ｇで２０分間遠心して、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁し均一化した。この粗精製品を１２，０００×ｇで遠心分離した上清を２４０，０００×ｇで４５分間遠心して、沈殿を回収した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加えて、さらにこの溶液と等量のフェノールを加えた後、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。
この上層（水層）を回収して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、ＲＮＡを単離精製した。その結果、感染葉１００ｇより、約２０ｍｇのＲＮＡを得た。
【００２２】
次いで、得られたＲＮＡを水に溶解して、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離（１７５，０００×ｇで１６時間）し、得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。精製が不十分な場合は、６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行って、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリで切り取って、透析チューブに入れ、ＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行った後、サテライトＲＮＡを回収して、常法に従いエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。
この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））に従って行った。
【００２３】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μＭ）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングした。この−鎖ｃＤＮＡ合成反応はＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（キアゲン社製）を用いて、３７℃、６０分の条件で行った。
次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させた。すなわち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用いて、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行った（ＰＣＲ反応液；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製））。
このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出して、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて精製した。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）にクローニングして、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによって、ＮＤＭ０８−１のサテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認した。
【００２４】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所社製）を用いて決定した。
本発明のキュウリモザイク弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１のサテライトＲＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【００２５】
なお、本発明のＮＤＭ０８−１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて受託が拒否されている（寄託受託証不交付通知書における識別のための表示：ＮＤＭ０８−１）。よって、ＮＤＭ０８−１は、出願人自らが保管し、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、譲渡を行う用意がある（保管場所：〒３７８−００１６、群馬県沼田市清水町３７８４番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部）。
【００２６】
また、比較のためＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０５−２（韓国特許第７４７６４９号）のサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号２）を配列表に示す。
【００２７】
（４）弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１の安定性
ガラス温室において、ＮＤＭ０８−１をチャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの韓国唐辛子苗の子葉又は本葉に、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで接種して、さらに５世代に亘って継代接種して本葉６〜８枚期までそのウイルス症状を調査した。その結果、ＮＤＭ０８−１は上記５品種の唐辛子に全くウイルス症状を発生せず、変異によってモザイク症状や壊死が発生しない安定な弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２８】
なお、チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタは、韓国における唐辛子の品種名で、韓国内の種苗会社（例えば、住所１１９７−４ Ｍａｅｔａｎ ２−Ｄｏｎｇ， Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−Ｇｕ， Ｓｕｗｏｎ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−Ｄｏ， Ｋｏｒｅａ、会社名Ｎｏｎｇｗｏｏ Ｂｏｉ Ｃｏ．（農友バイオ））等から容易に入手可能である。
【００２９】
（５）弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１の副作用及び強毒ＣＭＶに対する防除試験
チャンギャン、ハンバンド、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ、クンサルリム及びスーパーマニタの種子を培養土に播種して、約１ヶ月間温室内で育苗した。そして、本葉１〜２枚期の当該６種類の韓国唐辛子の幼苗を１試験区８株ずつに、本発明の弱毒ウイルスＮＤＭ０８−１と以前開発した唐辛子用弱毒ウイルスのＮＤＭ０５−２を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで１次接種して、その２１日後に、韓国の唐辛子圃場で分離した強毒ＣＭＶのＣＭＶ−Ｐ０又はより毒性の強いＣＭＶ−Ｐ１を、それぞれウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで上記一次接種した唐辛子苗に二次接種した。
【００３０】
ここでＣＭＶ−Ｐ０は、病原性遺伝子Ｐ０を持つＣＭＶであり、ＣＭＶ−Ｐ１は、病原性遺伝子Ｐ１を持つＣＭＶである（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．２２， Ｎｏ．３， Ｐ２６５−２７０， ２００６， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ３ ｏｆ ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ参照）。
強毒ＣＭＶ接種３０日後に唐辛子苗のウイルス症状度を詳細に観察して点数化した。その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１の結果より、唐辛子苗にＣＭＶ−Ｐ０を接種すると、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性であるチャンギャン、トギャチョンチョン、デチョン、チャンマニ及びスーパーマニタにはウイルス症状は現れないが、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性でないハンバンドやクンサンリムにはモザイクや細葉等の重度のウイルス症状が現れ、ＣＭＶ−Ｐ１を接種すると、全ての唐辛子品種で重度のウイルス症状が現れた。
【００３３】
また、ＮＤＭ０５−２を一次接種すると、二次接種しない唐辛子苗においては、その全てから微弱なクロロシス症状が現れたが、ＣＭＶ−Ｐ０を二次接種すると、微弱なクロロシス症状が現れながらも、全ての唐辛子苗からその感染を防除できた。また、ＣＭＶ−Ｐ１を二次接種すると、ハンバンドとクンサンリムにモルト症状が現れたが、その他の品種では微弱なクロロシス症状が現れながらも、その感染を防除した。
【００３４】
一方、本発明のＮＤＭ０８−１を一次接種すると、二次接種しない唐辛子苗においては、その全てにウイルス症状が全く現れず、ＣＭＶ−Ｐ０を二次接種しても、無症状で全ての唐辛子苗からその感染を防除できた。また、ＣＭＶ−Ｐ１を二次接種するとＮＤＭ０５−２と同様に、ハンバンドとクンサンリムに弱いモルト症状が現れたが、その他の品種では、その感染を無症状で防除した。
【００３５】
よって、本発明のＮＤＭ０８−１は唐辛子に接種した際に、全くウイルス症状を発現しないという副作用の点で、ＮＤＭ０５−２より優れており、ＮＤＭ０８−１を接種することで、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性のないハンバンドやクンサンリム等の唐辛子から病原性遺伝子Ｐ０を有するＣＭＶ−Ｐ０の感染を無症状で防除することができ、また、病原性遺伝子Ｐ０に抵抗性を有するチャンギャン、トギャチョンチョン、デチョン、チャムマニ及びスーパーマニタ等の唐辛子から、病原性遺伝子Ｐ０又はＰ１を有する強毒ＣＭＶ−Ｐ０とＣＭＶ−Ｐ１の感染を無症状で防除できることが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【請求項３】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項４】
植物苗が唐辛子苗である、請求項３に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項５】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる、植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項６】
植物苗が唐辛子苗である、請求項５に記載の植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【請求項３】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項４】
植物苗が唐辛子苗である、請求項３に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項５】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる、植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項６】
植物苗が唐辛子苗である、請求項５に記載の植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【公開番号】特開２００９−２３２７３７（Ｐ２００９−２３２７３７Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８２３４５（Ｐ２００８−８２３４５）
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（０００１０４５５９）日本デルモンテ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（０００１０４５５９）日本デルモンテ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
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