サンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−
【課題】検体液を作製する際に医療従事者が誤って検体を入れ忘れた場合には偽陰性と判定できるサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−を提供する。
【解決手段】凹部が形成された光学的に透明な板を支持体に載せて前記板と前記支持体との間に流路を形成し、前記流路の一端に検体を含む測定溶液を順次注排液するための注排水口と他端に排気口とを設けたバイオセンサ−において、前記測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と、前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置したバイオセンサ−。
【解決手段】凹部が形成された光学的に透明な板を支持体に載せて前記板と前記支持体との間に流路を形成し、前記流路の一端に検体を含む測定溶液を順次注排液するための注排水口と他端に排気口とを設けたバイオセンサ−において、前記測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と、前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置したバイオセンサ−。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の被検出物質をサンドイッチイムノアッセイ法により検出する検出装置およびそれを用いて検出する方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成２０年度、２１年度、および２２年度独立行政法人 科学技術振興機構、産学イノベ−ション加速事業「先端計測分析技術・機器開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）である。
【背景技術】
【０００３】
検体中の特定成分量を検出する方法の一つにサンドイッチアッセイ法がある。サンドイッチアッセイ法は、検出したい物質を２種類の物質で挟み込み定量する方法で、迅速かつ高感度に検出できるために化学物質の測定や臨床検査などで広く利用されている。サンドイッチアッセイ法の中でも、検出した物質を抗体で挟み込み定量する方法を特にサンドイッチイムノアッセイ法と呼ぶ。
【０００４】
サンドイッチイムノアッセイ法を利用した臨床用検査キットには、インフルエンザの診断用迅速測定キットがある。このキットには、試料混合容器とラテラルフロ−を原理とした検出装置が用意されている。ここでラテラルフロ−とは、一般的には、イムノクロマトとも言われメンブレン上で行なうイムノアッセイのことである。本検出装置には、アッセイを行なうための反応場としてニトロセルロ−スメンブレンが備えられており、このメンブレンを覆う形でプラスチック容器が設置されている。さらに、メンブレンの一角には検査結果を目視判定するための捕捉試薬部が用意されている。これによるインフルエンザウイルスの診断は以下のようにして行う。まず、採取した検体と金コロイド標識抗インフルエンザウイルス抗体とを試料混合容器内で混合し検体液とする。その後、検体液を検出装置に設けた供給部へ添加する。添加された検体液は、毛細管現象により吸水性担体方向にむかって展開される。最後に、捕捉試薬部で金コロイドが発する色の変化を確認することで、検体中のヒトインフルエンザウイルスの有無を検出する。
【０００５】
ところが、こうした検体の検出では、被検出物質が検体中に存在しているにも係わらず陰性と判定される、いわゆる偽陰性が問題となる。この偽陰性が生じると、原因特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置で病状がより重篤になるなど、重大な医療事故の要因となる。すなわち、偽陰性を防止することは、極めて重要な課題である。
【０００６】
そのため、ニトロセルロ−スメンブレンの捕捉試薬部よりも下流側に対照部として試料中の標識試薬と特異的反応するする組換え体のインフルエンザウイルス抗原を固定化し、対照部の発色を確認することで検体液が捕捉試薬部に到達したことを見分ける方法により、偽陰性を防ぐ手段が知られている（例えば特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３３３４２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記従来の構成では、検体液を作製する際に医療従事者が誤って検体を入れ忘れた場合にも陰性と表示し、誤った結果（偽陰性）が生じるという課題を有していた。
【０００９】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、検体液を作製する際に医療従事者が誤って検体を入れ忘れた場合には偽陰性と判定できるサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記従来の課題を解決するために、本発明のサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−は、凹部が形成された光学的に透明な板を支持体に載せて前記板と前記支持体との間に流路を形成し、前記流路の一端に検体を含む測定溶液を順次注排液するための注排水口と他端に排気口とを設けたバイオセンサ−において、前記測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と、前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置したことを特徴としたものである。
また、本発明は、サンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−において、検体を含む測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識抗ＩｇＥ抗体を捕捉するためのＩｇＥ抗体捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識用酵素を捕捉するための標識蛋白捕捉部と前記測定溶液に含まれる検出試薬を捕捉するための標識酵素捕捉部とを有する免疫反応系に、検体を含む複数の試料溶液を順次注入し免疫反応させた後、前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性が検出されず、かつ前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記検体が含まれていないと判定とすることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−によれば、検体が検体液に正しく添加されているかどうかを判別出来れば偽陰性の発生を防止できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサ−の構成図
【図２】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサ−の分解図
【図３】本発明の実施の形態１におけるサンドイッチイムノアッセイ法の測定手順を示す図
【図４】本発明の実施例１〜６におけるバイオセンサ−の構成図
【図５】本発明の実施例１における測光画像を示す図
【図６】本発明の実施例２における測光画像を示す図
【図７】本発明の実施例３における測光画像を示す図
【図８】本発明の実施例４における測光画像を示す図
【図９】本発明の実施例５における測光画像を示す図
【図１０】本発明の実施例６における測光画像を示す図
【図１１】従来のバイオセンサ−の構成図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、図１１に示した従来技術を説明する。従来の捕捉方法は、ニトロセルロ−スメンブレン１１０１上に設けた捕捉試薬部１１０２よりも下流域に対照部１１０３として標識試薬である金コロイド標識抗インフルエンザウイルス抗体を捕捉可能なものを設けている。そのため、供給部１１０４から検体１１０７及び標識試薬１１０８を含む検体液１１０９が注液されると検体液１１０９が毛細管現象によりニトロセルロ−スメンブレン１１０１内を吸水性担体１１０５方向にむかって展開される。最後に、捕捉試薬部１１０２及び対照部１１０３で金コロイドが発する色の変化を確認することで、検体液１１０９の注液の有無を確認している。しかし従来の構成では、標識成分のみで判定しているので、検体が含まれていないときは陰性と判定（偽陰性）し誤判定する。
【００１４】
そのため、本法では、偽陰性を完全に防止するために、標識成分だけで無く、検体成分を始めとする各試料溶液成分を捕捉可能なものを捕捉部に捕捉することで、検体成分を始めとする試料溶液がバイオセンサ−内に正常に展開されたことを判定できるようにした。
以下に、本発明のサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１５】
（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施の形態におけるバイオセンサ−の構成図を示す。
図１の支持体１０１は、生体分子を捕捉することが出来る捕捉部領域１０２を設けている。その上に、前記捕捉部領域１０２を覆うように流路１１１が形成された上カバ−１０８を接続されている。前記上カバ−１０８の一端には、流路１１１内に検体を含む測定に必要な複数の種類の試料溶液を順次注排液するための注排水口１０９と、他端に排気口１１０を有している。さらに、流路１１１内の捕捉部領域１０２には、アレルゲン捕捉部１０３と、抗ＩｇＥ抗体捕捉部１０４と、ＩｇＥ抗体捕捉部１０５と、標識蛋白捕捉部１０６と、標識酵素捕捉部１０７とを配置することで構成されている。ここで、標識蛋白捕捉部１０６における標識物とは、ビオチン又はアビジン又はストレプトアビジン標識物のことである。また、標識酵素捕捉部１０７は、酵素を直接又は酵素標識抗体を捕捉することができる。
【００１６】
本実施の形態では、各捕捉部を利用することで、偽陰性を発生させること無く、検体中の特定のＩｇＥ量を検出する方法を例に説明する。
図２は、図１に示したバイオセンサ−の分解図である。本実施例では、支持体２０１の寸法は、縦２５〜４０ｍｍ、横４０〜８０ｍｍとした。また、上カバ−２０８の寸法は支持体と同程度とし、上下方向の厚さは、２〜１０ｍｍとし、形成する流路２１１の厚みは、０．１〜０．５ｍｍとした。ただし、図２に示したバイオセンサ−を構成するための各部材の寸法は自由に変更できる。また、上カバ−の材質は、透明なものであれば利用できる。
【００１７】
支持体２０１は、捕捉部領域２０２を設けることが可能な材質で構成され、例えば、合成樹脂、ガラス、金属、ニトロセルロ−ス、フッ化ビニリデンが利用できる。捕捉部領域２０２は、生体分子を捕捉できるものが利用可能で、例えば、ガラス、ポリスチレン、金被膜、アルミニウム被膜、ニトロセルロ−ス、フッ化ビニリデン、カチオン性ポリマ−被膜、親水性ポリマ−被膜、表面化学処理及び支持体を多孔質化したものが利用できる。表面化学処理としては、シラン化、アミノ化、アルデヒド化、チオ−ル化、エポキシ化や活性エステル化がある。上カバ−は、透明なガラス又は透明樹脂素材のものが利用できる。透明樹脂としては、例えば、アクリル、ポリカ−ボネ−ト、ポリスチレン、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレ−ト）がある。
【００１８】
図２の中図に示す粘着シ−ト２１２を用いて上図の上カバ−２０８と下図の支持体２０１を接合した。各捕捉部を作製した支持体２０１と上カバ−２０８の接合は、流路内に注液した液が、液漏れを起こさないように密閉空間を形成できるものが利用可能である。粘着シ−ト以外の接合方法としては、例えば、ＵＶ接着、熱圧着、超音波接着を挙げることができる。
【００１９】
以下に支持体２０１中の各捕捉部について作製方法と理由を簡単に説明する。詳細については後述する。
【００２０】
アレルゲン捕捉部２０３は、検体中の目的の被検出物質である各アレルゲン由来のＩｇＥを特異的に捕らえるためのもので、精製したアレルゲンを用いて作製する。ここには、検体中のＩｇＧも結合可能であるが、後に述べる試料溶液の一つである標識抗ＩｇＥ抗体が、ＩｇＧとは結合しないため本サンドイッチイムノアッセイ法による測定には影響しないので、以降ＩｇＧの結合については省略する。
【００２１】
抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４は、検体中のＩｇＥを捕らえるためのもので、抗ＩｇＥ抗体を用いて作製する。ここで、抗ＩｇＥ抗体捕捉部で捕捉する抗体は、ＩｇＥであれば、どんなＩｇＥでも捕捉可能なものを使用する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への検体注入の有無を評価する。
【００２２】
ＩｇＥ抗体捕捉部２０５は、試料溶液中の抗ＩｇＥ抗体を特異的に捕らえるためのもので、ＩｇＥ抗体を用いて作製する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への抗ＩｇＥ抗体の有無を評価する。
【００２３】
標識蛋白捕捉部２０６は、試料溶液中の標識酵素を捕らえるためのもので、標識蛋白を用いて作製する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への標識用酵素注入の有無を評価する。標識蛋白捕捉部に捕捉する蛋白は、試料溶液中のビオチン又はアビジン又はストレプトアビジン標識酵素のビオチン又はアビジン又はストレプトアビジンと結合可能なものを標識したものとする。
【００２４】
標識酵素捕捉部２０７は、試料溶液中の検出用試薬を捕らえるためのもので、標識用酵素を用いて作製する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への検出用試薬の有無を評価する。
【００２５】
各捕捉部は、上カバ−２０８の注排水口２０９から排気口２１０の間の流路２１１内に位置する支持体の捕捉部領域２０２に設けることができる。
【００２６】
また、アレルゲン捕捉部２０３は、検体中の被検出物質が１種でも複数箇所に捕捉することが可能である。また、検体中の被検出物質が複数種ある場合は、それぞれに対応した捕捉部を設けることもできる。アレルゲン捕捉部２０３に捕捉するアレルゲンの例としては、スギ、ダニ、コムギ等から抽出した精製アレルゲンが利用できる。
【００２７】
同様に、アレルゲン以外の捕捉部も、複数箇所に設けることができる。また、アレルゲン捕捉部２０３よりも、注排水口２０９側から遠い箇所に捕捉すると、流路２１１内に確実に注液が行われていると判定できるので好ましい。さらに、アレルゲン捕捉部２０３を挟むように注排水口２０９側から近い箇所と遠い箇所に捕捉させれば、前後の捕捉部の値から攪拌の様子を推察することもできる。これは、送液が一定しないような例えば、新規の流路開発段階で有効である。このようにして各捕捉部を作製する。
【００２８】
また、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５、標識蛋白捕捉部２０６、及び標識酵素捕捉部２０７をバイオセンサ−内に設けることにより、検体成分以外の試料溶液注液不良も検出可能となり、不良箇所の検索を行なうことができる。
【００２９】
また、捕捉部以外の捕捉部領域に生体分子が捕捉されるとノイズとなってしまうので、捕捉部以外の場所とは、試料溶液が反応することが無いようにブロッキング処理を実施する。ブロッキング剤としては、一般的なものが利用可能で、例えば、ＢＳＡ、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、正常ヤギ血清、人工合成高分子等が挙げられる。
【００３０】
このようにして作製したバイオセンサ−に対し、図３に示したフロ−チャ−トに従って検体を含む測定に必要な複数の試料溶液を順次注入し反応させ、各捕捉部における酵素活性の有無を検出することで実施した試料溶液処理が正しく行なわれたか判定できる。
まず、検体の注液判定の方法を説明する前に、アレルゲン捕捉部２０３が検体の注液判定に利用できないことを説明する。これは、アレルゲン捕捉部２０３が捕捉できる抗体が、捕捉アレルゲンに対し結合できるＩｇＥ抗体が、捕捉アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体のみであることに起因する。つまり、アレルゲン捕捉部２０３に対し、特異的に結合できるＩｇＥ抗体を保有しない検体を使用した場合、アレルゲン捕捉部２０３では全く酵素活性が確認されないことがあり得る。そのため、アレルゲン捕捉部２０３で、検体注液の有無を正確に判定することはできない。
【００３１】
次に、検体注液の有無を正確に判定できる抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４について理由と合わせて説明する。ここで、人が有するＩｇＥについて説明すると、人が保有するＩｇＥ量は、全免疫グルブリンの約０．００４％を占め、血中濃度としては、約０．０３ｍｇ／ｄｌを占めている。つまり、ＩｇＥ抗体であれば、どんなＩｇＥ抗体でも捕捉可能な抗体を捕捉してある抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４においては、検体さえ注液されれば、人体に必ず一定の割合で存在しているＩｇＥ抗体と結合できる。そのため、検体注液の判定に使用でき、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４で酵素活性が検出されたときに、アレルゲン捕捉部２０３の酵素活性を検出することで、正しく検体処理が行なわれたことを確認した上で、被検体中の特定のＩｇＥ量を算出できる。
【００３２】
次に、試料溶液の検体注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。判定は、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において標識酵素の活性が検出されるときを、試料溶液に検体が含まれていないと判定できる。そのため、偽陰性を防止することが出来る。これは、前述した抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４が検体注液され、以降の処理も正確に実施されれば必ず酵素活性を示すことに加え、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５が、フロ−チャ−トＳ０７以降の処理が正常に行なわれたときには必ず酵素活性を有する試薬を予めバイオセンサ−として捕捉しておくことで判定できる。
【００３３】
つまり、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５には、本来検体処理を実施することで捕捉するＩｇＥ抗体をバイオセンサ−作製時点で既に捕捉しておくので、検体の有無に係わらず、バイオセンサ−内にＩｇＥ抗体が存在する状態となっているためＳ０７以降の処理に関与できる。よって、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において標識用酵素の活性が検出されるときを、試料溶液に検体が含まれていないと判定できる。ＩｇＥ抗体捕捉部２０５で酵素活性が確認できれば、標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７においては必ず酵素活性が確認できるが、その詳細については後述する。
【００３４】
以下、図３のフロ−チャ−トに従い、第１から第７の試料溶液を順次注入した際に生じる現象を詳細に述べる。
【００３５】
まず、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、検体を含んだ第１の試料溶液を注入する（Ｓ０１）。ここで第１の試料溶液は、検体を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と検体を一定時間反応させる（Ｓ０２）。その後、注排水口から第１の試料溶液を廃棄する（Ｓ０３）。ここで使用可能な検体は、全血又は血漿又は血清である。バイオセンサ−内に、検体を直接注入することも可能だが、少量の検体を使用する場合には、希釈液で希釈を行い添加する。希釈液は、目的の免疫反応を阻害しないように、使用する緩衝液の種類やｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度、及び高分子化合物の添加等を考慮した上で実施する。希釈液としては、一般的に知られている希釈液が利用でき、例えば、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、ＰＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒ、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＴｏＹｏＢｏ）、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（ＴｏＹｏＢｏ）等が挙げられる。
【００３６】
第１の試料溶液との反応で、抗ＩｇＥ抗体捕捉において、検体中に存在するＩｇＥ抗体を捕捉し、アレルゲン捕捉部において、検体中に存在するアレルゲンに特異なＩｇＥのみを捕捉する。
【００３７】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第２の試料溶液を注入する（Ｓ０４）。ここで、第２の試料溶液は、洗浄液を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と第２の試料溶液を一定時間反応させる（Ｓ０５）。その後、注排水口から第２の試料溶液を廃棄する（Ｓ０６）。ここで使用可能な洗浄液は、一般的に知られている洗浄液が利用でき、例えば、ＰＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒが利用できる。洗浄液は、希釈液に比べ、より高塩濃度にすることや、より界面活性剤濃度を高くすることで、非特異に捕捉された成分を除去できる。
【００３８】
第２の試料溶液との反応で、未反応な検体を除去するとともに、非特異的に捕捉した成分を除去する。この工程を実施することで、ノイズを低減させることができる。
【００３９】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第３の試料溶液を注入する（Ｓ０７）。ここで第３の試料溶液は、標識抗ＩｇＥ抗体を含んだものである。ここで、標識抗ＩｇＥ抗体の標識物とは、ビオチン又はアビジン又はストレプトアビジン標識物のことである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と標識抗ＩｇＥ抗体を一定時間反応させる（Ｓ０８）。その後、注排水口から第３の試料溶液を廃棄する（Ｓ０９）。バイオセンサ−内に、標識抗ＩｇＥ抗体を直接注入することも可能だが、少量の標識抗ＩｇＥ抗体を使用する場合には、希釈液で希釈を行い添加する。希釈液は、第１の試料溶液を希釈するとき使用したものを使用できる。免疫反応を阻害しないように緩衝液の種類やｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度、及び高分子化合物の添加等を変更して使用することもできる。
【００４０】
第３の試料溶液との反応で、アレルゲン捕捉部が捕捉したＩｇＥ抗体及び抗ＩｇＥ抗体捕捉が捕捉したＩｇＥ抗体及びＩｇＥ抗体捕捉部が、標識抗ＩｇＥ抗体の抗ＩｇＥ抗体部分を捕捉する。
【００４１】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第４の試料溶液を注入する（Ｓ１０）。ここで、第４の試料溶液は、洗浄液を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と第４の試料溶液を一定時間反応させる（Ｓ１１）。その後、注排水口から第４の試料溶液を廃棄する（Ｓ１２）。ここで使用する洗浄液は、第２の試料溶液として使用した洗浄液と同一のものを使用できる。第２の試料溶液とは、洗浄力を変更したい場合は、試薬組成を変更して使用することも出来る。
【００４２】
第４の試料溶液との反応で、未反応な標識抗ＩｇＥ抗体を除去するとともに、非特異的に捕捉した成分を除去する。この工程を実施することで、ノイズを低減させることができる。
【００４３】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第５の試料溶液を注入する（Ｓ１３）。ここで第５の試料溶液は、標識用酵素を含んだものである。ここで、標識用酵素の標識は、アビジン又はストレプトアビジン又はビオチンであり、第３の試料溶液で注入した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部と結合可能なものとする。例えば、標識抗ＩｇＥ抗体として、アビジン標識抗ＩｇＥ抗体を使用するなら、標識用酵素は、ビオチン標識酵素を使用する。また、ここで利用できる酵素としては、ルシフェラ−ゼ又はペルオキシダ−ゼ又はアルカリホスファタ−ゼ又はグルコ−スオキシダ−ゼ又はグルコ−ス−６−燐酸脱水素酵素又はβ−ガラクトシダ−ゼを挙げることができる。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と標識用酵素を一定時間反応させる（Ｓ１４）。その後、注排水口から第５の試料溶液を廃棄する（Ｓ１５）。バイオセンサ−内に、標識用酵素を直接注入することも可能だが、少量の標識用酵素を使用する場合には、希釈液で希釈を行い添加する。希釈液は、第１の試料溶液を希釈するとき使用したものを使用できる。免疫反応を阻害しないように使用する緩衝液の種類及びｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度、高分子化合物の添加等を変更して使用することもできる。
【００４４】
第５の試料溶液との反応で、アレルゲン捕捉部が捕捉した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分、及び抗ＩｇＥ抗体捕捉が捕捉した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分、及びＩｇＥ抗体捕捉部が捕捉した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分、及び標識蛋白捕捉部の標識部分が、標識用酵素の標識部分を捕捉する。ここで使用する標識蛋白捕捉部として捕捉する蛋白は、第３の試料溶液として注液した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分と結合可能なものを標識した蛋白を使用する。
【００４５】
次に、前記バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第６の試料溶液を注入する（Ｓ１６）。ここで、第６の試料溶液は、洗浄液を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と第６の試料溶液を一定時間反応させる（Ｓ１７）。その後、注排水口から第６の試料溶液を廃棄する（Ｓ１８）。ここで使用する洗浄液は、第２の試料溶液として使用した洗浄液と同一のものを使用できる。第２の試料溶液とは、洗浄力を変更したい場合は、試薬組成を変更して使用することも出来る。
【００４６】
第６の試料溶液との反応で、未反応な標識用酵素を除去するとともに、非特異的に捕捉した成分を除去する。この工程を実施することで、ノイズを低減させることができる。
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第７の試料溶液を注入する（Ｓ１９）。ここで第７の試料溶液は、検出用試薬を含んだものである。また、検出用試薬とは、酵素と反応する基質成分を含み効率よく酵素反応が行なわれるようにｐＨ等を調整した試料溶液のことである。ここで利用できる基質としては、ルシフェリン＋ＡＴＰ＋マグネシウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム塩（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）、燐酸ナフト−ルＡＳ−ＴＲ／ファストレッドＲＣ、フクシン、β−Ｄ−グルコ−ス＋ＨＲＰ＋３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、グルコ−ス−６−燐酸＋ＮＡＤＰ、２，２‘−アジノジ(３−エチルベンゾチアゾリソ６−スルホン酸)アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾル（ＡＥＣ）、４−クロロ−１−ナフト−ル（４Ｃ１Ｎ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｏ−ＮＰＧ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ルミノ−ル、チラミン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸を挙げることができる。その後、流路内の密閉空間で、各捕捉部が捕捉した酵素が基質と反応する。
【００４７】
第７の試料溶液との反応で、抗ＩｇＥ抗体捕捉部が捕捉した標識用酵素、及びアレルゲン捕捉部が捕捉した標識用酵素、及びＩｇＥ抗体捕捉部が捕捉した標識用酵素、及び標識蛋白捕捉部が捕捉した標識用酵素、及び標識酵素捕捉部の各酵素が、基質と反応する。ここで、標識酵素捕捉部として捕捉する酵素は、第７の試料溶液として注液した標識用酵素の酵素部分と同一のものを使用する。これにより全ての捕捉部で同一の基質が利用できる。
【００４８】
次に、第７の試薬反応により生じる各捕捉部から生じる酵素活性を測光する（Ｓ２０）。測光方法としては、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ）カメラ等で捕捉部を一度に測光画像として撮影する方法がある。
【００４９】
次に、撮影した測光画像の各捕捉部から得られる光量を算出し、判定を行う（Ｓ２１）。判定方法は、前述したように抗ＩｇＥ抗体捕捉部において酵素活性が検出されるとき、検体をはじめとする試料溶液処理が正常にできたと判定する。
【００５０】
ここで、検体処理以外の処理に不備があったときの判定方法を説明する。
まず、試料溶液の標識抗ＩｇＥ抗体注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。これは、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつ標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において標識用酵素の活性が検出されるときは、試料溶液に標識抗ＩｇＥ抗体が含まれていないと判定とすることができる。これは、前述した抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５の役割に加え、標識蛋白捕捉部２０６が、フロ−チャ−トＳ１３以降の処理が正常に行なわれると必ず酵素活性を有することから判定できる。これは、標識蛋白捕捉部２０６は、本来検体処理を実施することで捕捉する抗ＩｇＥ抗体をバイオセンサ−作製時点で既に捕捉しておくので、試料溶液として注液する検体及び標識抗ＩｇＥ抗体の有無に係わらず、Ｓ１３以降の処理に関与できるためである。また、このことから、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５で酵素活性が確認できれば、標識蛋白捕捉部２０６でも酵素活性が確認できると言える。
【００５１】
次に、試料溶液の標識用酵素注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。これは、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつ標識酵素捕捉部２０７において標識用酵素の活性が検出されるときは、試料溶液に標識用酵素が含まれていないと判定とすることができる。これは、前述した抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６の役割に加え、標識酵素捕捉部２０７が、フロ−チャ−トＳ１９以降の処理が正常に行なわれると必ず酵素活性を有することから判定できる。
【００５２】
これは、標識酵素捕捉部２０７は、本来標識用酵素注液を実施することで捕捉する標識用酵素をバイオセンサ−作製時点で既に捕捉しておくので、試料溶液として注液する検体及び標識抗ＩｇＥ抗体及び標識用酵素の有無に係わらず、Ｓ１９以降の処理に関与できるためである。また、このことから、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５で酵素活性が確認できれば、標識酵素捕捉部２０７でも酵素活性が確認できると言える。さらに、標識蛋白捕捉部２０６で酵素活性が確認できれば、標識酵素捕捉部２０７でも酵素活性が確認できるとも言える。
【００５３】
次に、試料溶液の検出用試薬注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。
【００５４】
これは、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において試料溶液に酵素活性が検出されないときは、試料溶液に検出用試薬が含まれていないと判定とすることができる。これは、前述したフロ−チャ−トＳ１９以降の処理が正常に行なわれると必ず酵素活性を有する標識酵素捕捉部２０７からも酵素活性が確認できないことから判定できる。
【００５５】
最後に、正常処理ができたと判定したときに、アレルゲン捕捉部の酵素活性を検出し、被検体中の特定のＩｇＥ量として算出し、解析結果として表示する（Ｓ２２）。また、正常処理ができなかったときは、判定に従い、不備工程を表示する。
【００５６】
このように、本法では、各試料溶液に対応する捕捉部を設け、被検出物質の測定結果を表示する前に、各捕捉部の酵素活性を判定し、正常処理ができたことを確認するので、試料の入れ忘れによる偽発光を防止できる。
【実施例１】
【００５７】
測定溶液には人の血清を用いて実験を行なった。実験のために作製したバイオセンサ−を図４に示す。
【００５８】
上述したバイオセンサ−の支持体には、捕捉部領域にニトロセルロ−ス４０２処理が行なわれたガラス基板４０１（ＧｅｎＴｅｌ社、ＰＡＴＨ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｌｉｄｅ）を用いた。支持体上に、アレルゲン捕捉部としてスギアレルゲン４０３を捕捉し、抗ＩｇＥ抗体捕捉部として抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４（株式会社バイオマトリックス研究所製）を捕捉し、ＩｇＥ抗体捕捉部としてヒトＩｇＥ抗体４０５（ヤマサ醤油株式会社製）を捕捉し、標識蛋白捕捉部としてビオチン化ＢＳＡ４０６を捕捉し、標識酵素捕捉部としてルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７（キッコ−マン株式会社製）を捕捉した。
【００５９】
スギアレルゲン４０３捕捉部への塗布溶液中には、スギ花粉抗原ＳＢＰ（生化学工業株式会社製）にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸緩衝液を添加後、混合した。グリセロ−ルは自身が持つ粘性のために塗布時のばらつきを抑制できるので、塗布時の再現性向上剤として添加した。ＢＳＡ及びホウ酸緩衝液は、スギ花粉抗原ＳＢＰの溶液時の構造安定化剤として添加した。塗布用混合液は、グリセロ−ル、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）及びホウ酸緩衝液を混合することで、スギ花粉抗原ＳＢＰが１．５倍希釈されるように調整した。調整した塗布用混合液を、１スポットあたりの塗布量が４．５ｎＬになるように、Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ ＮＰ２．１（ＧｅＳｉＭ社製）を用いて支持体上へ塗布を行なった。塗布サンプルは、濡らした布を敷いたタッパ−中で、３０℃の下、８時間放置し固定化させた。このようにしてアレルゲン捕捉部を作製した。
【００６０】
スギアレルゲン４０３捕捉部と同様の方法で抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部にも塗布を行なった。その際に、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部への塗布溶液中には、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４（株式会社バイオマトリックス研究所製、ｆ１９７４はＣｌｏｎｅ Ｎｏ．）にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸緩衝液を混合し、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４が６０倍希釈されるように調整した。また、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部への塗布溶液中には、ヒトＩｇＥ（ヤマサ醤油株式会社）にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸を混合し、ヒトＩｇＥが６０００倍希釈されるように調整した。また、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部への塗布溶液中には、２５０μｇ／ｍＬに調整したビオチン化ＢＳＡ溶液(ＳＩＧＭＡ社製)にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸を混合し、ビオチン化ＢＳＡ溶液が４０倍希釈されるように調整した。ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部への塗布溶液中には、抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２（株式会社バイオマトリックス研究所製、ｆ０８２２はＣｌｏｎｅ Ｎｏ．）にルシフェラ−ゼ（キッコ−マン株式会社製）を結合させた抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２標識ルシフェラ−ゼにグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸を混合し、抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２標識ルシフェラ−ゼが１０倍希釈されるように調整した。ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部には、直接ルシフェラ−ゼを捕捉することも可能だが、酵素の可変性に影響が生じ、基質認識力が低下するので、酵素そのものでは無く、酵素に標識物を結合させたものを捕捉した。
【００６１】
上述のように各試料を捕捉した支持体の捕捉面に対し、粘着シ−ト４１２を支持体の幅に合わせてカットするとともに、上カバ−側に加工した流路４１１及び注排水口４０９及び排気口４１０の形状に合わせてカットし、粘着面の片側を支持体の固定化面に貼り、残る一面に流路形状を後加工したアクリルプレ−トを透明樹脂製上カバ−４０８として貼り合わせることでバイオセンサ−を作製した。
【００６２】
次に、このバイオセンサ−を用いて測定を行なった。まず、ブロッキング剤としてＮ１０１（日本油脂株式会社製）をバイオセンサ−内に満たした。ブロッキング処理は、３７℃下で１ｈ静置させながら行なった。このブロッキング剤は、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、標識用酵素又は酵素標識抗体補足部以外のむき出しになっている捕捉部領域に結合するので、検体中に含まれるタンパク質をはじめ糖質、脂質やホルモンがアレルゲン捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部以外へ吸着し、この後の処理でノイズとなり悪影響を及ぼすことを抑制することができる。
【００６３】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部及び抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部と検体を反応させる工程を行なった。血清１８μＬに対し、希釈液としてＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉ（ＴｏＹｏＢｏ社製）４２μＬを混合した第１の試料溶液をバイオセンサ−内に展開させ反応させた。５分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、第１の試料溶液をバイオセンサ−内から排除した。Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉは、反応効率を高めるために添加した。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部に対しては、検体中のスギ由来のＩｇＥ抗体が特異的に結合し、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部に対しては、希釈液中のＩｇＥが特異的に結合する。
【００６４】
引き続き、第２の試料溶液を用い流路内の洗浄を行った。バイオセンサ−内の壁面に残った第１の試料溶液の除去やスギアレルゲン４０３捕捉部及び抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部と非特異に捕捉した物質の除去を目的に実施した。この工程により、ノイズを低減することができる。洗浄剤としては、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（東京化成工業株式会社製）を添加したものをバイオセンサ−内に展開させ使用した。１分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、洗浄剤をバイオセンサ−内から排除した。
【００６５】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部に結合したＩｇＥ抗体及びヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部に対し、抗ＩｇＥ抗体を添加し、捕捉反応を実施した。本実施例では、ビオチン標識した抗ＩｇＥ抗体クロ−ンＮｏ．ｆ０８２２（株式会社バイオマトリックス研究所製）を含む抗体溶液を使用した。ビオチン標識した抗ＩｇＥ抗体クロ−ンＮｏ．ｆ０８２２ ４．５μＬに対し、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉ（ＴｏＹｏＢｏ社製）５５．５μＬを混合した第３の試料溶液をバイオセンサ−内に展開させ反応させた。５分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、第３の試料溶液をバイオセンサ−内から排除した。Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉは、反応効率を高めるために添加した。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部及びヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部に存在するＩｇＥに対し、抗体溶液中の抗ＩｇＥ抗体クロ−ンＮｏ．ｆ０８２２が特異的に結合する。
【００６６】
引き続き、第４の試料溶液を用い流路内の洗浄を行った。バイオセンサ−内の壁面に残った第３の試料溶液の除去やスギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部及びヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部と非特異に結合した物質の除去を目的に実施した。この工程により、ノイズを低減することができる。洗浄剤としては、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したものをバイオセンサ−内に展開させ使用した。１分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、洗浄剤をバイオセンサ−内から排除した。
【００６７】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部に結合した抗ＩｇＥ抗体及びビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部に対し、標識酵素として、ストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼ（キッコ−マン株式会社製）を添加し、反応を行なった。１０００×ストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼ６μＬに対し、ルシフェラ−ゼ希釈溶液（キッコ−マン株式会社製）５４μＬを混合した第５の試料溶液をバイオセンサ−内に展開させ反応させた。５分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、第５の試料溶液をバイオセンサ−内から排除した。Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉは、反応効率を高めるために添加した。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部及びビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部に存在するビオチン構造に対し、酵素溶液中のストレプトアビジンが特異的に結合する。
【００６８】
引き続き、第６の試料溶液を用い流路内の洗浄を行った。バイオセンサ−内の壁面に残った第５の試料溶液の除去やスギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ＩｇＥ抗体捕捉部及びビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部と非特異に結合した物質の除去を目的に実施した。この工程により、ノイズを低減することができる。洗浄剤としては、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したものをバイオセンサ−内に展開させ使用した。１分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、洗浄剤をバイオセンサ−内から排除した。
【００６９】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部に結合したルシフェラ−ゼ及びルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部に対し、発光基質として、ルシフェリン、ＡＴＰ、マグネシウムイオンが含まれたＩｎｔｅｌｉｔｅ ＡＢのルシフェラ−ゼ発光基質液（キッコ−マン株式会社製）を第７の試料溶液として添加し、発光反応を行なった。１×ルシフェラ−ゼ発光基質液６０μＬをバイオセンサ−内に展開させた。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部中のルシフェラ−ゼによる発光反応が起こる。
【００７０】
次に、発光量を測光した。第７の試料溶液をバイオセンサ−内に展開後、速やかにバイオセンサ−の固定化面をＣＣＤカメラと対向したステ−ジに固定し、発光量を３分間撮影し、ＣＣＤカメラの各画素の輝度の３分間の積算値をマッピングした測光画像を生成した。
【００７１】
そして、画像解析の工程で、バイオセンサ−内の各スポットに対応する画素を特定し、その輝度値を測定値とした。
【００７２】
図５は、図３のフロ−チャ−トで説明したように測光の工程で出力された、各画素の輝度の３分間の積算値をマッピングした測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。５０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。５０２がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポットに相当し、５０３が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポットに相当し、５０４がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポットに相当し、５０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、５０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００７３】
図５を見ると、５０３、５０４、５０５、５０６において、発光が確認されることから、各工程における処理が正常に行なわれたことを示す。そのため、アレルギ−の測定ができる。
【００７４】
次に、５０２から得られた輝度値を算出すると、１４９２５１４であった。
【００７５】
ここで、スギＩｇＥ濃度既知の検体を使用し、スギアレルゲンのみを塗布したバイオセンサ−を使用して、検量線式を作成した。その結果得られた検量線式は、ｙ＝２５２７６Ｘ＋１２９２６１であった。この検量線式にアレルゲン捕捉部から得られた輝度値１４９２５１４を入力し、血清中のスギＩｇＥ値を算出した。この数値を検量線式ｙ＝２５２７６Ｘ＋１２９２６１に当てはめると、５３．９３ＵＩ／ｍＬと換算できた。これは、アレルギ−スコアの０〜７で表示すると５であった。同様の血清を、検定機であるＤｉａＰａｃｋ２０００（日本ケミファ株式会社製）で測定した際のアレルギ−スコアも同様に５であった。このことから、スコアの上で相関があることが確認できた。これは、正しく測定できたことを示す。
【００７６】
また、相関が得られたことから、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部がスギアレルゲン４０３捕捉部に対して、反応阻害物として作用していないことも確認できた。
【実施例２】
【００７７】
故意に検体のみを添加せずに、実施例１と同様の工程を実施した。図６は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。６０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。６０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、６０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。６０４がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポットに相当し、６０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、６０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００７８】
図６では、６０２において輝度が確認できなかった。通常であれば、スギＩｇＥ抗体を保持しない検体として扱うが、６０３において輝度が観察できない。一方、６０４と、６０５と、６０６では輝度が確認できることから、検体が含まれていないと判定することができる。これにより、偽陰性が防止できた。
【実施例３】
【００７９】
故意に抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２を含まない試料溶液で、実施例１と同様の工程を実施した。図７は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。７０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。７０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、７０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、７０４で示した丸の点線がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポット位置に相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。７０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、７０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００８０】
７０２、７０３及び７０４において輝度が確認できない。一方、７０５と、７０６では輝度が確認できることから、試料溶液中に抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２が含まれていないと判定することができる。
【実施例４】
【００８１】
故意にストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼを含まない試料溶液で実施例１と同様の工程を実施した。図８は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。８０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。８０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、８０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、８０４で示した丸の点線がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポット位置に相当し、８０５で示した丸の点線がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。８０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００８２】
８０２、８０３、８０４及び８０５において輝度が確認できない。一方、８０６では輝度が確認できることから、試料溶液中にストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼが含まれていないと判定することができる。
【実施例５】
【００８３】
故意に検出用試薬を含まない試料溶液で実施例１と同様の工程を実施した。図９は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。９０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。９０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、９０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、９０４で示した丸の点線がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポット位置に相当し、９０５で示した丸の点線がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、９０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。
【００８４】
測光画像の何処からも輝度が得られないことから試料溶液中に検出用試薬が含まれていないと判定することができる。
【実施例６】
【００８５】
実施例１と同様の工程を実施した。ただし、実施例１とは異なり、基準機によるスギＩｇＥスコアが０の検体を使用した。図１０は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。６０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。６０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。６０３が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、６０４がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポットに相当し、６０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、６０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００８６】
６０２において輝度がほとんど確認できない。輝度値は、３８５６であった。
一方、抗ＩｇＥ抗体捕捉部では輝度が確認できる。このことから、正常に処理が行なわれたと判定することができるので、検量線式ｙ＝２５２７６Ｘ＋１２９２６１から０．１５３ＵＩ／ｍＬと換算できた。これは、スコア表示で０に相当する。
よって、本検体には、スギＩｇＥに対するスコアが０の検体と判定することができる。
以上の実施例１〜６の結果より、正しく血清が注液されたかどうか判定できる。また、血清があっても測定が出来なかったとき、どこの工程が正常に実施できなかったか判定できる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明にかかるサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−は、検体が正しく添加されているかどうかを識別して偽陰性を識別する能力を有し、検体中の被検出物質をサンドイッチイムノアッセイ法により検出する検出装置およびそれを用いて検出する方法等として有用である。
【符号の説明】
【００８８】
１０１、２０１ 支持体
１０２、２０２ 捕捉部領域
１０３、２０３ アレルゲン捕捉部
１０４、２０４ 抗ＩｇＥ抗体捕捉部
１０５、２０５ ＩｇＥ抗体捕捉部
１０６、２０６ 標識蛋白捕捉部
１０７、２０７ 標識酵素捕捉部
１０８、２０８ 上カバ−
１０９、２０９、４０９ 注排水口
１１０、２１０、４１０ 排気口
１１１、２１１、４１１ 流路
２１２、４１２ 粘着シ−ト
４０１ ガラス基板
４０２ ニトロセルロ−ス
４０３ スギアレルゲン
４０４ 抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４
４０５ ヒトＩｇＥ抗体
４０６ ビオチン標識ＢＳＡ
４０７ ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体
４０８ 透明樹脂製上カバ−
５０１、６０１、７０１、８０１、９０１、１００１ 注排液口付近の流路形状
５０２、１００２ スギアレルゲン４０３捕捉部による発光スポット
５０３、１００３ 抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４による発光スポット
５０４、６０４、１００４ ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部による発光スポット
５０５、６０５、７０５、１００５ ビオチン標識ＢＳＡ４０６捕捉部による発光スポット
５０６、６０６、７０６、８０６、１００６ ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２ ４０７捕捉部による発光スポット
６０２、７０２、８０２、９０２ スギアレルゲン４０３捕捉部による発光スポット
６０３、７０３、８０３、９０３ 抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４による発光スポット
７０４、８０４、９０４ ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部による発光スポット
８０５、９０５ ビオチン標識ＢＳＡ４０６捕捉部による発光スポット
９０６ ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２ ４０７捕捉部による発光スポット
１１０１ ニトロセルロ−スメンブレン
１１０２ 捕捉試薬部
１１０３ 対照部
１１０４ 供給部
１１０５ 吸水性担体
１１０６ 検体液の展開方向
１１０７ 検体
１１０８ 標識試薬
１１０９ 検体液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の被検出物質をサンドイッチイムノアッセイ法により検出する検出装置およびそれを用いて検出する方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成２０年度、２１年度、および２２年度独立行政法人 科学技術振興機構、産学イノベ−ション加速事業「先端計測分析技術・機器開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）である。
【背景技術】
【０００３】
検体中の特定成分量を検出する方法の一つにサンドイッチアッセイ法がある。サンドイッチアッセイ法は、検出したい物質を２種類の物質で挟み込み定量する方法で、迅速かつ高感度に検出できるために化学物質の測定や臨床検査などで広く利用されている。サンドイッチアッセイ法の中でも、検出した物質を抗体で挟み込み定量する方法を特にサンドイッチイムノアッセイ法と呼ぶ。
【０００４】
サンドイッチイムノアッセイ法を利用した臨床用検査キットには、インフルエンザの診断用迅速測定キットがある。このキットには、試料混合容器とラテラルフロ−を原理とした検出装置が用意されている。ここでラテラルフロ−とは、一般的には、イムノクロマトとも言われメンブレン上で行なうイムノアッセイのことである。本検出装置には、アッセイを行なうための反応場としてニトロセルロ−スメンブレンが備えられており、このメンブレンを覆う形でプラスチック容器が設置されている。さらに、メンブレンの一角には検査結果を目視判定するための捕捉試薬部が用意されている。これによるインフルエンザウイルスの診断は以下のようにして行う。まず、採取した検体と金コロイド標識抗インフルエンザウイルス抗体とを試料混合容器内で混合し検体液とする。その後、検体液を検出装置に設けた供給部へ添加する。添加された検体液は、毛細管現象により吸水性担体方向にむかって展開される。最後に、捕捉試薬部で金コロイドが発する色の変化を確認することで、検体中のヒトインフルエンザウイルスの有無を検出する。
【０００５】
ところが、こうした検体の検出では、被検出物質が検体中に存在しているにも係わらず陰性と判定される、いわゆる偽陰性が問題となる。この偽陰性が生じると、原因特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置で病状がより重篤になるなど、重大な医療事故の要因となる。すなわち、偽陰性を防止することは、極めて重要な課題である。
【０００６】
そのため、ニトロセルロ−スメンブレンの捕捉試薬部よりも下流側に対照部として試料中の標識試薬と特異的反応するする組換え体のインフルエンザウイルス抗原を固定化し、対照部の発色を確認することで検体液が捕捉試薬部に到達したことを見分ける方法により、偽陰性を防ぐ手段が知られている（例えば特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３３３４２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記従来の構成では、検体液を作製する際に医療従事者が誤って検体を入れ忘れた場合にも陰性と表示し、誤った結果（偽陰性）が生じるという課題を有していた。
【０００９】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、検体液を作製する際に医療従事者が誤って検体を入れ忘れた場合には偽陰性と判定できるサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記従来の課題を解決するために、本発明のサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−は、凹部が形成された光学的に透明な板を支持体に載せて前記板と前記支持体との間に流路を形成し、前記流路の一端に検体を含む測定溶液を順次注排液するための注排水口と他端に排気口とを設けたバイオセンサ−において、前記測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と、前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置したことを特徴としたものである。
また、本発明は、サンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−において、検体を含む測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識抗ＩｇＥ抗体を捕捉するためのＩｇＥ抗体捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識用酵素を捕捉するための標識蛋白捕捉部と前記測定溶液に含まれる検出試薬を捕捉するための標識酵素捕捉部とを有する免疫反応系に、検体を含む複数の試料溶液を順次注入し免疫反応させた後、前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性が検出されず、かつ前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記検体が含まれていないと判定とすることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−によれば、検体が検体液に正しく添加されているかどうかを判別出来れば偽陰性の発生を防止できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサ−の構成図
【図２】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサ−の分解図
【図３】本発明の実施の形態１におけるサンドイッチイムノアッセイ法の測定手順を示す図
【図４】本発明の実施例１〜６におけるバイオセンサ−の構成図
【図５】本発明の実施例１における測光画像を示す図
【図６】本発明の実施例２における測光画像を示す図
【図７】本発明の実施例３における測光画像を示す図
【図８】本発明の実施例４における測光画像を示す図
【図９】本発明の実施例５における測光画像を示す図
【図１０】本発明の実施例６における測光画像を示す図
【図１１】従来のバイオセンサ−の構成図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、図１１に示した従来技術を説明する。従来の捕捉方法は、ニトロセルロ−スメンブレン１１０１上に設けた捕捉試薬部１１０２よりも下流域に対照部１１０３として標識試薬である金コロイド標識抗インフルエンザウイルス抗体を捕捉可能なものを設けている。そのため、供給部１１０４から検体１１０７及び標識試薬１１０８を含む検体液１１０９が注液されると検体液１１０９が毛細管現象によりニトロセルロ−スメンブレン１１０１内を吸水性担体１１０５方向にむかって展開される。最後に、捕捉試薬部１１０２及び対照部１１０３で金コロイドが発する色の変化を確認することで、検体液１１０９の注液の有無を確認している。しかし従来の構成では、標識成分のみで判定しているので、検体が含まれていないときは陰性と判定（偽陰性）し誤判定する。
【００１４】
そのため、本法では、偽陰性を完全に防止するために、標識成分だけで無く、検体成分を始めとする各試料溶液成分を捕捉可能なものを捕捉部に捕捉することで、検体成分を始めとする試料溶液がバイオセンサ−内に正常に展開されたことを判定できるようにした。
以下に、本発明のサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１５】
（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施の形態におけるバイオセンサ−の構成図を示す。
図１の支持体１０１は、生体分子を捕捉することが出来る捕捉部領域１０２を設けている。その上に、前記捕捉部領域１０２を覆うように流路１１１が形成された上カバ−１０８を接続されている。前記上カバ−１０８の一端には、流路１１１内に検体を含む測定に必要な複数の種類の試料溶液を順次注排液するための注排水口１０９と、他端に排気口１１０を有している。さらに、流路１１１内の捕捉部領域１０２には、アレルゲン捕捉部１０３と、抗ＩｇＥ抗体捕捉部１０４と、ＩｇＥ抗体捕捉部１０５と、標識蛋白捕捉部１０６と、標識酵素捕捉部１０７とを配置することで構成されている。ここで、標識蛋白捕捉部１０６における標識物とは、ビオチン又はアビジン又はストレプトアビジン標識物のことである。また、標識酵素捕捉部１０７は、酵素を直接又は酵素標識抗体を捕捉することができる。
【００１６】
本実施の形態では、各捕捉部を利用することで、偽陰性を発生させること無く、検体中の特定のＩｇＥ量を検出する方法を例に説明する。
図２は、図１に示したバイオセンサ−の分解図である。本実施例では、支持体２０１の寸法は、縦２５〜４０ｍｍ、横４０〜８０ｍｍとした。また、上カバ−２０８の寸法は支持体と同程度とし、上下方向の厚さは、２〜１０ｍｍとし、形成する流路２１１の厚みは、０．１〜０．５ｍｍとした。ただし、図２に示したバイオセンサ−を構成するための各部材の寸法は自由に変更できる。また、上カバ−の材質は、透明なものであれば利用できる。
【００１７】
支持体２０１は、捕捉部領域２０２を設けることが可能な材質で構成され、例えば、合成樹脂、ガラス、金属、ニトロセルロ−ス、フッ化ビニリデンが利用できる。捕捉部領域２０２は、生体分子を捕捉できるものが利用可能で、例えば、ガラス、ポリスチレン、金被膜、アルミニウム被膜、ニトロセルロ−ス、フッ化ビニリデン、カチオン性ポリマ−被膜、親水性ポリマ−被膜、表面化学処理及び支持体を多孔質化したものが利用できる。表面化学処理としては、シラン化、アミノ化、アルデヒド化、チオ−ル化、エポキシ化や活性エステル化がある。上カバ−は、透明なガラス又は透明樹脂素材のものが利用できる。透明樹脂としては、例えば、アクリル、ポリカ−ボネ−ト、ポリスチレン、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレ−ト）がある。
【００１８】
図２の中図に示す粘着シ−ト２１２を用いて上図の上カバ−２０８と下図の支持体２０１を接合した。各捕捉部を作製した支持体２０１と上カバ−２０８の接合は、流路内に注液した液が、液漏れを起こさないように密閉空間を形成できるものが利用可能である。粘着シ−ト以外の接合方法としては、例えば、ＵＶ接着、熱圧着、超音波接着を挙げることができる。
【００１９】
以下に支持体２０１中の各捕捉部について作製方法と理由を簡単に説明する。詳細については後述する。
【００２０】
アレルゲン捕捉部２０３は、検体中の目的の被検出物質である各アレルゲン由来のＩｇＥを特異的に捕らえるためのもので、精製したアレルゲンを用いて作製する。ここには、検体中のＩｇＧも結合可能であるが、後に述べる試料溶液の一つである標識抗ＩｇＥ抗体が、ＩｇＧとは結合しないため本サンドイッチイムノアッセイ法による測定には影響しないので、以降ＩｇＧの結合については省略する。
【００２１】
抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４は、検体中のＩｇＥを捕らえるためのもので、抗ＩｇＥ抗体を用いて作製する。ここで、抗ＩｇＥ抗体捕捉部で捕捉する抗体は、ＩｇＥであれば、どんなＩｇＥでも捕捉可能なものを使用する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への検体注入の有無を評価する。
【００２２】
ＩｇＥ抗体捕捉部２０５は、試料溶液中の抗ＩｇＥ抗体を特異的に捕らえるためのもので、ＩｇＥ抗体を用いて作製する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への抗ＩｇＥ抗体の有無を評価する。
【００２３】
標識蛋白捕捉部２０６は、試料溶液中の標識酵素を捕らえるためのもので、標識蛋白を用いて作製する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への標識用酵素注入の有無を評価する。標識蛋白捕捉部に捕捉する蛋白は、試料溶液中のビオチン又はアビジン又はストレプトアビジン標識酵素のビオチン又はアビジン又はストレプトアビジンと結合可能なものを標識したものとする。
【００２４】
標識酵素捕捉部２０７は、試料溶液中の検出用試薬を捕らえるためのもので、標識用酵素を用いて作製する。この捕捉部が、各試料溶液にうち、バイオセンサ−内への検出用試薬の有無を評価する。
【００２５】
各捕捉部は、上カバ−２０８の注排水口２０９から排気口２１０の間の流路２１１内に位置する支持体の捕捉部領域２０２に設けることができる。
【００２６】
また、アレルゲン捕捉部２０３は、検体中の被検出物質が１種でも複数箇所に捕捉することが可能である。また、検体中の被検出物質が複数種ある場合は、それぞれに対応した捕捉部を設けることもできる。アレルゲン捕捉部２０３に捕捉するアレルゲンの例としては、スギ、ダニ、コムギ等から抽出した精製アレルゲンが利用できる。
【００２７】
同様に、アレルゲン以外の捕捉部も、複数箇所に設けることができる。また、アレルゲン捕捉部２０３よりも、注排水口２０９側から遠い箇所に捕捉すると、流路２１１内に確実に注液が行われていると判定できるので好ましい。さらに、アレルゲン捕捉部２０３を挟むように注排水口２０９側から近い箇所と遠い箇所に捕捉させれば、前後の捕捉部の値から攪拌の様子を推察することもできる。これは、送液が一定しないような例えば、新規の流路開発段階で有効である。このようにして各捕捉部を作製する。
【００２８】
また、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５、標識蛋白捕捉部２０６、及び標識酵素捕捉部２０７をバイオセンサ−内に設けることにより、検体成分以外の試料溶液注液不良も検出可能となり、不良箇所の検索を行なうことができる。
【００２９】
また、捕捉部以外の捕捉部領域に生体分子が捕捉されるとノイズとなってしまうので、捕捉部以外の場所とは、試料溶液が反応することが無いようにブロッキング処理を実施する。ブロッキング剤としては、一般的なものが利用可能で、例えば、ＢＳＡ、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、正常ヤギ血清、人工合成高分子等が挙げられる。
【００３０】
このようにして作製したバイオセンサ−に対し、図３に示したフロ−チャ−トに従って検体を含む測定に必要な複数の試料溶液を順次注入し反応させ、各捕捉部における酵素活性の有無を検出することで実施した試料溶液処理が正しく行なわれたか判定できる。
まず、検体の注液判定の方法を説明する前に、アレルゲン捕捉部２０３が検体の注液判定に利用できないことを説明する。これは、アレルゲン捕捉部２０３が捕捉できる抗体が、捕捉アレルゲンに対し結合できるＩｇＥ抗体が、捕捉アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体のみであることに起因する。つまり、アレルゲン捕捉部２０３に対し、特異的に結合できるＩｇＥ抗体を保有しない検体を使用した場合、アレルゲン捕捉部２０３では全く酵素活性が確認されないことがあり得る。そのため、アレルゲン捕捉部２０３で、検体注液の有無を正確に判定することはできない。
【００３１】
次に、検体注液の有無を正確に判定できる抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４について理由と合わせて説明する。ここで、人が有するＩｇＥについて説明すると、人が保有するＩｇＥ量は、全免疫グルブリンの約０．００４％を占め、血中濃度としては、約０．０３ｍｇ／ｄｌを占めている。つまり、ＩｇＥ抗体であれば、どんなＩｇＥ抗体でも捕捉可能な抗体を捕捉してある抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４においては、検体さえ注液されれば、人体に必ず一定の割合で存在しているＩｇＥ抗体と結合できる。そのため、検体注液の判定に使用でき、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４で酵素活性が検出されたときに、アレルゲン捕捉部２０３の酵素活性を検出することで、正しく検体処理が行なわれたことを確認した上で、被検体中の特定のＩｇＥ量を算出できる。
【００３２】
次に、試料溶液の検体注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。判定は、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において標識酵素の活性が検出されるときを、試料溶液に検体が含まれていないと判定できる。そのため、偽陰性を防止することが出来る。これは、前述した抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４が検体注液され、以降の処理も正確に実施されれば必ず酵素活性を示すことに加え、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５が、フロ−チャ−トＳ０７以降の処理が正常に行なわれたときには必ず酵素活性を有する試薬を予めバイオセンサ−として捕捉しておくことで判定できる。
【００３３】
つまり、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５には、本来検体処理を実施することで捕捉するＩｇＥ抗体をバイオセンサ−作製時点で既に捕捉しておくので、検体の有無に係わらず、バイオセンサ−内にＩｇＥ抗体が存在する状態となっているためＳ０７以降の処理に関与できる。よって、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において標識用酵素の活性が検出されるときを、試料溶液に検体が含まれていないと判定できる。ＩｇＥ抗体捕捉部２０５で酵素活性が確認できれば、標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７においては必ず酵素活性が確認できるが、その詳細については後述する。
【００３４】
以下、図３のフロ−チャ−トに従い、第１から第７の試料溶液を順次注入した際に生じる現象を詳細に述べる。
【００３５】
まず、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、検体を含んだ第１の試料溶液を注入する（Ｓ０１）。ここで第１の試料溶液は、検体を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と検体を一定時間反応させる（Ｓ０２）。その後、注排水口から第１の試料溶液を廃棄する（Ｓ０３）。ここで使用可能な検体は、全血又は血漿又は血清である。バイオセンサ−内に、検体を直接注入することも可能だが、少量の検体を使用する場合には、希釈液で希釈を行い添加する。希釈液は、目的の免疫反応を阻害しないように、使用する緩衝液の種類やｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度、及び高分子化合物の添加等を考慮した上で実施する。希釈液としては、一般的に知られている希釈液が利用でき、例えば、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、ＰＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒ、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＴｏＹｏＢｏ）、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（ＴｏＹｏＢｏ）等が挙げられる。
【００３６】
第１の試料溶液との反応で、抗ＩｇＥ抗体捕捉において、検体中に存在するＩｇＥ抗体を捕捉し、アレルゲン捕捉部において、検体中に存在するアレルゲンに特異なＩｇＥのみを捕捉する。
【００３７】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第２の試料溶液を注入する（Ｓ０４）。ここで、第２の試料溶液は、洗浄液を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と第２の試料溶液を一定時間反応させる（Ｓ０５）。その後、注排水口から第２の試料溶液を廃棄する（Ｓ０６）。ここで使用可能な洗浄液は、一般的に知られている洗浄液が利用でき、例えば、ＰＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒ、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒが利用できる。洗浄液は、希釈液に比べ、より高塩濃度にすることや、より界面活性剤濃度を高くすることで、非特異に捕捉された成分を除去できる。
【００３８】
第２の試料溶液との反応で、未反応な検体を除去するとともに、非特異的に捕捉した成分を除去する。この工程を実施することで、ノイズを低減させることができる。
【００３９】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第３の試料溶液を注入する（Ｓ０７）。ここで第３の試料溶液は、標識抗ＩｇＥ抗体を含んだものである。ここで、標識抗ＩｇＥ抗体の標識物とは、ビオチン又はアビジン又はストレプトアビジン標識物のことである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と標識抗ＩｇＥ抗体を一定時間反応させる（Ｓ０８）。その後、注排水口から第３の試料溶液を廃棄する（Ｓ０９）。バイオセンサ−内に、標識抗ＩｇＥ抗体を直接注入することも可能だが、少量の標識抗ＩｇＥ抗体を使用する場合には、希釈液で希釈を行い添加する。希釈液は、第１の試料溶液を希釈するとき使用したものを使用できる。免疫反応を阻害しないように緩衝液の種類やｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度、及び高分子化合物の添加等を変更して使用することもできる。
【００４０】
第３の試料溶液との反応で、アレルゲン捕捉部が捕捉したＩｇＥ抗体及び抗ＩｇＥ抗体捕捉が捕捉したＩｇＥ抗体及びＩｇＥ抗体捕捉部が、標識抗ＩｇＥ抗体の抗ＩｇＥ抗体部分を捕捉する。
【００４１】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第４の試料溶液を注入する（Ｓ１０）。ここで、第４の試料溶液は、洗浄液を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と第４の試料溶液を一定時間反応させる（Ｓ１１）。その後、注排水口から第４の試料溶液を廃棄する（Ｓ１２）。ここで使用する洗浄液は、第２の試料溶液として使用した洗浄液と同一のものを使用できる。第２の試料溶液とは、洗浄力を変更したい場合は、試薬組成を変更して使用することも出来る。
【００４２】
第４の試料溶液との反応で、未反応な標識抗ＩｇＥ抗体を除去するとともに、非特異的に捕捉した成分を除去する。この工程を実施することで、ノイズを低減させることができる。
【００４３】
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第５の試料溶液を注入する（Ｓ１３）。ここで第５の試料溶液は、標識用酵素を含んだものである。ここで、標識用酵素の標識は、アビジン又はストレプトアビジン又はビオチンであり、第３の試料溶液で注入した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部と結合可能なものとする。例えば、標識抗ＩｇＥ抗体として、アビジン標識抗ＩｇＥ抗体を使用するなら、標識用酵素は、ビオチン標識酵素を使用する。また、ここで利用できる酵素としては、ルシフェラ−ゼ又はペルオキシダ−ゼ又はアルカリホスファタ−ゼ又はグルコ−スオキシダ−ゼ又はグルコ−ス−６−燐酸脱水素酵素又はβ−ガラクトシダ−ゼを挙げることができる。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と標識用酵素を一定時間反応させる（Ｓ１４）。その後、注排水口から第５の試料溶液を廃棄する（Ｓ１５）。バイオセンサ−内に、標識用酵素を直接注入することも可能だが、少量の標識用酵素を使用する場合には、希釈液で希釈を行い添加する。希釈液は、第１の試料溶液を希釈するとき使用したものを使用できる。免疫反応を阻害しないように使用する緩衝液の種類及びｐＨ、塩濃度、界面活性剤濃度、高分子化合物の添加等を変更して使用することもできる。
【００４４】
第５の試料溶液との反応で、アレルゲン捕捉部が捕捉した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分、及び抗ＩｇＥ抗体捕捉が捕捉した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分、及びＩｇＥ抗体捕捉部が捕捉した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分、及び標識蛋白捕捉部の標識部分が、標識用酵素の標識部分を捕捉する。ここで使用する標識蛋白捕捉部として捕捉する蛋白は、第３の試料溶液として注液した標識抗ＩｇＥ抗体の標識部分と結合可能なものを標識した蛋白を使用する。
【００４５】
次に、前記バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第６の試料溶液を注入する（Ｓ１６）。ここで、第６の試料溶液は、洗浄液を含んだものである。その後、流路内の密閉空間で、シリンジを上下にピストン運動させながら、撹拌操作を実施し、各捕捉部と第６の試料溶液を一定時間反応させる（Ｓ１７）。その後、注排水口から第６の試料溶液を廃棄する（Ｓ１８）。ここで使用する洗浄液は、第２の試料溶液として使用した洗浄液と同一のものを使用できる。第２の試料溶液とは、洗浄力を変更したい場合は、試薬組成を変更して使用することも出来る。
【００４６】
第６の試料溶液との反応で、未反応な標識用酵素を除去するとともに、非特異的に捕捉した成分を除去する。この工程を実施することで、ノイズを低減させることができる。
次に、バイオセンサ−の注排水口からシリンジを使用し、第７の試料溶液を注入する（Ｓ１９）。ここで第７の試料溶液は、検出用試薬を含んだものである。また、検出用試薬とは、酵素と反応する基質成分を含み効率よく酵素反応が行なわれるようにｐＨ等を調整した試料溶液のことである。ここで利用できる基質としては、ルシフェリン＋ＡＴＰ＋マグネシウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム塩（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）、燐酸ナフト−ルＡＳ−ＴＲ／ファストレッドＲＣ、フクシン、β−Ｄ−グルコ−ス＋ＨＲＰ＋３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、グルコ−ス−６−燐酸＋ＮＡＤＰ、２，２‘−アジノジ(３−エチルベンゾチアゾリソ６−スルホン酸)アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾル（ＡＥＣ）、４−クロロ−１−ナフト−ル（４Ｃ１Ｎ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｏ−ＮＰＧ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ルミノ−ル、チラミン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸を挙げることができる。その後、流路内の密閉空間で、各捕捉部が捕捉した酵素が基質と反応する。
【００４７】
第７の試料溶液との反応で、抗ＩｇＥ抗体捕捉部が捕捉した標識用酵素、及びアレルゲン捕捉部が捕捉した標識用酵素、及びＩｇＥ抗体捕捉部が捕捉した標識用酵素、及び標識蛋白捕捉部が捕捉した標識用酵素、及び標識酵素捕捉部の各酵素が、基質と反応する。ここで、標識酵素捕捉部として捕捉する酵素は、第７の試料溶液として注液した標識用酵素の酵素部分と同一のものを使用する。これにより全ての捕捉部で同一の基質が利用できる。
【００４８】
次に、第７の試薬反応により生じる各捕捉部から生じる酵素活性を測光する（Ｓ２０）。測光方法としては、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ）カメラ等で捕捉部を一度に測光画像として撮影する方法がある。
【００４９】
次に、撮影した測光画像の各捕捉部から得られる光量を算出し、判定を行う（Ｓ２１）。判定方法は、前述したように抗ＩｇＥ抗体捕捉部において酵素活性が検出されるとき、検体をはじめとする試料溶液処理が正常にできたと判定する。
【００５０】
ここで、検体処理以外の処理に不備があったときの判定方法を説明する。
まず、試料溶液の標識抗ＩｇＥ抗体注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。これは、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつ標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において標識用酵素の活性が検出されるときは、試料溶液に標識抗ＩｇＥ抗体が含まれていないと判定とすることができる。これは、前述した抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５の役割に加え、標識蛋白捕捉部２０６が、フロ−チャ−トＳ１３以降の処理が正常に行なわれると必ず酵素活性を有することから判定できる。これは、標識蛋白捕捉部２０６は、本来検体処理を実施することで捕捉する抗ＩｇＥ抗体をバイオセンサ−作製時点で既に捕捉しておくので、試料溶液として注液する検体及び標識抗ＩｇＥ抗体の有無に係わらず、Ｓ１３以降の処理に関与できるためである。また、このことから、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５で酵素活性が確認できれば、標識蛋白捕捉部２０６でも酵素活性が確認できると言える。
【００５１】
次に、試料溶液の標識用酵素注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。これは、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６において試料溶液に酵素活性が検出されず、かつ標識酵素捕捉部２０７において標識用酵素の活性が検出されるときは、試料溶液に標識用酵素が含まれていないと判定とすることができる。これは、前述した抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６の役割に加え、標識酵素捕捉部２０７が、フロ−チャ−トＳ１９以降の処理が正常に行なわれると必ず酵素活性を有することから判定できる。
【００５２】
これは、標識酵素捕捉部２０７は、本来標識用酵素注液を実施することで捕捉する標識用酵素をバイオセンサ−作製時点で既に捕捉しておくので、試料溶液として注液する検体及び標識抗ＩｇＥ抗体及び標識用酵素の有無に係わらず、Ｓ１９以降の処理に関与できるためである。また、このことから、ＩｇＥ抗体捕捉部２０５で酵素活性が確認できれば、標識酵素捕捉部２０７でも酵素活性が確認できると言える。さらに、標識蛋白捕捉部２０６で酵素活性が確認できれば、標識酵素捕捉部２０７でも酵素活性が確認できるとも言える。
【００５３】
次に、試料溶液の検出用試薬注液が正常に実施できていないと判定する方法を説明する。
【００５４】
これは、抗ＩｇＥ抗体捕捉部２０４及びＩｇＥ抗体捕捉部２０５及び標識蛋白捕捉部２０６及び標識酵素捕捉部２０７において試料溶液に酵素活性が検出されないときは、試料溶液に検出用試薬が含まれていないと判定とすることができる。これは、前述したフロ−チャ−トＳ１９以降の処理が正常に行なわれると必ず酵素活性を有する標識酵素捕捉部２０７からも酵素活性が確認できないことから判定できる。
【００５５】
最後に、正常処理ができたと判定したときに、アレルゲン捕捉部の酵素活性を検出し、被検体中の特定のＩｇＥ量として算出し、解析結果として表示する（Ｓ２２）。また、正常処理ができなかったときは、判定に従い、不備工程を表示する。
【００５６】
このように、本法では、各試料溶液に対応する捕捉部を設け、被検出物質の測定結果を表示する前に、各捕捉部の酵素活性を判定し、正常処理ができたことを確認するので、試料の入れ忘れによる偽発光を防止できる。
【実施例１】
【００５７】
測定溶液には人の血清を用いて実験を行なった。実験のために作製したバイオセンサ−を図４に示す。
【００５８】
上述したバイオセンサ−の支持体には、捕捉部領域にニトロセルロ−ス４０２処理が行なわれたガラス基板４０１（ＧｅｎＴｅｌ社、ＰＡＴＨ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｌｉｄｅ）を用いた。支持体上に、アレルゲン捕捉部としてスギアレルゲン４０３を捕捉し、抗ＩｇＥ抗体捕捉部として抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４（株式会社バイオマトリックス研究所製）を捕捉し、ＩｇＥ抗体捕捉部としてヒトＩｇＥ抗体４０５（ヤマサ醤油株式会社製）を捕捉し、標識蛋白捕捉部としてビオチン化ＢＳＡ４０６を捕捉し、標識酵素捕捉部としてルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７（キッコ−マン株式会社製）を捕捉した。
【００５９】
スギアレルゲン４０３捕捉部への塗布溶液中には、スギ花粉抗原ＳＢＰ（生化学工業株式会社製）にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸緩衝液を添加後、混合した。グリセロ−ルは自身が持つ粘性のために塗布時のばらつきを抑制できるので、塗布時の再現性向上剤として添加した。ＢＳＡ及びホウ酸緩衝液は、スギ花粉抗原ＳＢＰの溶液時の構造安定化剤として添加した。塗布用混合液は、グリセロ−ル、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）及びホウ酸緩衝液を混合することで、スギ花粉抗原ＳＢＰが１．５倍希釈されるように調整した。調整した塗布用混合液を、１スポットあたりの塗布量が４．５ｎＬになるように、Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ ＮＰ２．１（ＧｅＳｉＭ社製）を用いて支持体上へ塗布を行なった。塗布サンプルは、濡らした布を敷いたタッパ−中で、３０℃の下、８時間放置し固定化させた。このようにしてアレルゲン捕捉部を作製した。
【００６０】
スギアレルゲン４０３捕捉部と同様の方法で抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部にも塗布を行なった。その際に、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部への塗布溶液中には、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４（株式会社バイオマトリックス研究所製、ｆ１９７４はＣｌｏｎｅ Ｎｏ．）にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸緩衝液を混合し、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４が６０倍希釈されるように調整した。また、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部への塗布溶液中には、ヒトＩｇＥ（ヤマサ醤油株式会社）にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸を混合し、ヒトＩｇＥが６０００倍希釈されるように調整した。また、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部への塗布溶液中には、２５０μｇ／ｍＬに調整したビオチン化ＢＳＡ溶液(ＳＩＧＭＡ社製)にグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸を混合し、ビオチン化ＢＳＡ溶液が４０倍希釈されるように調整した。ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部への塗布溶液中には、抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２（株式会社バイオマトリックス研究所製、ｆ０８２２はＣｌｏｎｅ Ｎｏ．）にルシフェラ−ゼ（キッコ−マン株式会社製）を結合させた抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２標識ルシフェラ−ゼにグリセロ−ル、ＢＳＡ及びホウ酸を混合し、抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２標識ルシフェラ−ゼが１０倍希釈されるように調整した。ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部には、直接ルシフェラ−ゼを捕捉することも可能だが、酵素の可変性に影響が生じ、基質認識力が低下するので、酵素そのものでは無く、酵素に標識物を結合させたものを捕捉した。
【００６１】
上述のように各試料を捕捉した支持体の捕捉面に対し、粘着シ−ト４１２を支持体の幅に合わせてカットするとともに、上カバ−側に加工した流路４１１及び注排水口４０９及び排気口４１０の形状に合わせてカットし、粘着面の片側を支持体の固定化面に貼り、残る一面に流路形状を後加工したアクリルプレ−トを透明樹脂製上カバ−４０８として貼り合わせることでバイオセンサ−を作製した。
【００６２】
次に、このバイオセンサ−を用いて測定を行なった。まず、ブロッキング剤としてＮ１０１（日本油脂株式会社製）をバイオセンサ−内に満たした。ブロッキング処理は、３７℃下で１ｈ静置させながら行なった。このブロッキング剤は、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、標識用酵素又は酵素標識抗体補足部以外のむき出しになっている捕捉部領域に結合するので、検体中に含まれるタンパク質をはじめ糖質、脂質やホルモンがアレルゲン捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部以外へ吸着し、この後の処理でノイズとなり悪影響を及ぼすことを抑制することができる。
【００６３】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部及び抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部と検体を反応させる工程を行なった。血清１８μＬに対し、希釈液としてＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉ（ＴｏＹｏＢｏ社製）４２μＬを混合した第１の試料溶液をバイオセンサ−内に展開させ反応させた。５分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、第１の試料溶液をバイオセンサ−内から排除した。Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉは、反応効率を高めるために添加した。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部に対しては、検体中のスギ由来のＩｇＥ抗体が特異的に結合し、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部に対しては、希釈液中のＩｇＥが特異的に結合する。
【００６４】
引き続き、第２の試料溶液を用い流路内の洗浄を行った。バイオセンサ−内の壁面に残った第１の試料溶液の除去やスギアレルゲン４０３捕捉部及び抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部と非特異に捕捉した物質の除去を目的に実施した。この工程により、ノイズを低減することができる。洗浄剤としては、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（東京化成工業株式会社製）を添加したものをバイオセンサ−内に展開させ使用した。１分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、洗浄剤をバイオセンサ−内から排除した。
【００６５】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部に結合したＩｇＥ抗体及びヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部に対し、抗ＩｇＥ抗体を添加し、捕捉反応を実施した。本実施例では、ビオチン標識した抗ＩｇＥ抗体クロ−ンＮｏ．ｆ０８２２（株式会社バイオマトリックス研究所製）を含む抗体溶液を使用した。ビオチン標識した抗ＩｇＥ抗体クロ−ンＮｏ．ｆ０８２２ ４．５μＬに対し、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉ（ＴｏＹｏＢｏ社製）５５．５μＬを混合した第３の試料溶液をバイオセンサ−内に展開させ反応させた。５分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、第３の試料溶液をバイオセンサ−内から排除した。Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉは、反応効率を高めるために添加した。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部及びヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部に存在するＩｇＥに対し、抗体溶液中の抗ＩｇＥ抗体クロ−ンＮｏ．ｆ０８２２が特異的に結合する。
【００６６】
引き続き、第４の試料溶液を用い流路内の洗浄を行った。バイオセンサ−内の壁面に残った第３の試料溶液の除去やスギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部及びヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部と非特異に結合した物質の除去を目的に実施した。この工程により、ノイズを低減することができる。洗浄剤としては、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したものをバイオセンサ−内に展開させ使用した。１分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、洗浄剤をバイオセンサ−内から排除した。
【００６７】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部に結合した抗ＩｇＥ抗体及びビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部に対し、標識酵素として、ストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼ（キッコ−マン株式会社製）を添加し、反応を行なった。１０００×ストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼ６μＬに対し、ルシフェラ−ゼ希釈溶液（キッコ−マン株式会社製）５４μＬを混合した第５の試料溶液をバイオセンサ−内に展開させ反応させた。５分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、第５の試料溶液をバイオセンサ−内から排除した。Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉは、反応効率を高めるために添加した。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部及びビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部に存在するビオチン構造に対し、酵素溶液中のストレプトアビジンが特異的に結合する。
【００６８】
引き続き、第６の試料溶液を用い流路内の洗浄を行った。バイオセンサ−内の壁面に残った第５の試料溶液の除去やスギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ＩｇＥ抗体捕捉部及びビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部と非特異に結合した物質の除去を目的に実施した。この工程により、ノイズを低減することができる。洗浄剤としては、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したものをバイオセンサ−内に展開させ使用した。１分間、ピペッティング方式による流路内攪拌を行なった後、洗浄剤をバイオセンサ−内から排除した。
【００６９】
次に、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部に結合したルシフェラ−ゼ及びルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部に対し、発光基質として、ルシフェリン、ＡＴＰ、マグネシウムイオンが含まれたＩｎｔｅｌｉｔｅ ＡＢのルシフェラ−ゼ発光基質液（キッコ−マン株式会社製）を第７の試料溶液として添加し、発光反応を行なった。１×ルシフェラ−ゼ発光基質液６０μＬをバイオセンサ−内に展開させた。この工程により、スギアレルゲン４０３捕捉部、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部中のルシフェラ−ゼによる発光反応が起こる。
【００７０】
次に、発光量を測光した。第７の試料溶液をバイオセンサ−内に展開後、速やかにバイオセンサ−の固定化面をＣＣＤカメラと対向したステ−ジに固定し、発光量を３分間撮影し、ＣＣＤカメラの各画素の輝度の３分間の積算値をマッピングした測光画像を生成した。
【００７１】
そして、画像解析の工程で、バイオセンサ−内の各スポットに対応する画素を特定し、その輝度値を測定値とした。
【００７２】
図５は、図３のフロ−チャ−トで説明したように測光の工程で出力された、各画素の輝度の３分間の積算値をマッピングした測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。５０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。５０２がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポットに相当し、５０３が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポットに相当し、５０４がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポットに相当し、５０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、５０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００７３】
図５を見ると、５０３、５０４、５０５、５０６において、発光が確認されることから、各工程における処理が正常に行なわれたことを示す。そのため、アレルギ−の測定ができる。
【００７４】
次に、５０２から得られた輝度値を算出すると、１４９２５１４であった。
【００７５】
ここで、スギＩｇＥ濃度既知の検体を使用し、スギアレルゲンのみを塗布したバイオセンサ−を使用して、検量線式を作成した。その結果得られた検量線式は、ｙ＝２５２７６Ｘ＋１２９２６１であった。この検量線式にアレルゲン捕捉部から得られた輝度値１４９２５１４を入力し、血清中のスギＩｇＥ値を算出した。この数値を検量線式ｙ＝２５２７６Ｘ＋１２９２６１に当てはめると、５３．９３ＵＩ／ｍＬと換算できた。これは、アレルギ−スコアの０〜７で表示すると５であった。同様の血清を、検定機であるＤｉａＰａｃｋ２０００（日本ケミファ株式会社製）で測定した際のアレルギ−スコアも同様に５であった。このことから、スコアの上で相関があることが確認できた。これは、正しく測定できたことを示す。
【００７６】
また、相関が得られたことから、抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部、ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部、ビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部、ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部がスギアレルゲン４０３捕捉部に対して、反応阻害物として作用していないことも確認できた。
【実施例２】
【００７７】
故意に検体のみを添加せずに、実施例１と同様の工程を実施した。図６は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。６０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。６０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、６０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。６０４がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポットに相当し、６０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、６０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００７８】
図６では、６０２において輝度が確認できなかった。通常であれば、スギＩｇＥ抗体を保持しない検体として扱うが、６０３において輝度が観察できない。一方、６０４と、６０５と、６０６では輝度が確認できることから、検体が含まれていないと判定することができる。これにより、偽陰性が防止できた。
【実施例３】
【００７９】
故意に抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２を含まない試料溶液で、実施例１と同様の工程を実施した。図７は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。７０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。７０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、７０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、７０４で示した丸の点線がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポット位置に相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。７０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、７０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００８０】
７０２、７０３及び７０４において輝度が確認できない。一方、７０５と、７０６では輝度が確認できることから、試料溶液中に抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２が含まれていないと判定することができる。
【実施例４】
【００８１】
故意にストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼを含まない試料溶液で実施例１と同様の工程を実施した。図８は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。８０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。８０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、８０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、８０４で示した丸の点線がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポット位置に相当し、８０５で示した丸の点線がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。８０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００８２】
８０２、８０３、８０４及び８０５において輝度が確認できない。一方、８０６では輝度が確認できることから、試料溶液中にストレプトアビジン標識ルシフェラ−ゼが含まれていないと判定することができる。
【実施例５】
【００８３】
故意に検出用試薬を含まない試料溶液で実施例１と同様の工程を実施した。図９は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。９０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。９０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当し、９０３で示した丸の点線が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、９０４で示した丸の点線がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポット位置に相当し、９０５で示した丸の点線がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、９０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。
【００８４】
測光画像の何処からも輝度が得られないことから試料溶液中に検出用試薬が含まれていないと判定することができる。
【実施例６】
【００８５】
実施例１と同様の工程を実施した。ただし、実施例１とは異なり、基準機によるスギＩｇＥスコアが０の検体を使用した。図１０は、そのとき得られた測光画像を示す図である。輝度値が大きいほど、白く表示されている。６０１で示した破線は、注排液口付近の流路形状を示している。実際の測光画像では、流路部分は、確認できないが、ここでは分かり易くするために示している。６０２で示した丸の点線がスギアレルゲン４０３捕捉部の発光スポット位置に相当する。丸の点線で示した部分は、目視レベルで輝度を確認できないが、捕捉位置に相当する箇所をわかり易くするために丸の点線で囲んである。６０３が抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４捕捉部の発光スポット位置に相当し、６０４がヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部の発光スポットに相当し、６０５がビオチン化ＢＳＡ４０６捕捉部の発光スポットに相当し、６０６がルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体４０７補足部の発光スポットに相当する。
【００８６】
６０２において輝度がほとんど確認できない。輝度値は、３８５６であった。
一方、抗ＩｇＥ抗体捕捉部では輝度が確認できる。このことから、正常に処理が行なわれたと判定することができるので、検量線式ｙ＝２５２７６Ｘ＋１２９２６１から０．１５３ＵＩ／ｍＬと換算できた。これは、スコア表示で０に相当する。
よって、本検体には、スギＩｇＥに対するスコアが０の検体と判定することができる。
以上の実施例１〜６の結果より、正しく血清が注液されたかどうか判定できる。また、血清があっても測定が出来なかったとき、どこの工程が正常に実施できなかったか判定できる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明にかかるサンドイッチイムノアッセイ法及びそれを用いたバイオセンサ−は、検体が正しく添加されているかどうかを識別して偽陰性を識別する能力を有し、検体中の被検出物質をサンドイッチイムノアッセイ法により検出する検出装置およびそれを用いて検出する方法等として有用である。
【符号の説明】
【００８８】
１０１、２０１ 支持体
１０２、２０２ 捕捉部領域
１０３、２０３ アレルゲン捕捉部
１０４、２０４ 抗ＩｇＥ抗体捕捉部
１０５、２０５ ＩｇＥ抗体捕捉部
１０６、２０６ 標識蛋白捕捉部
１０７、２０７ 標識酵素捕捉部
１０８、２０８ 上カバ−
１０９、２０９、４０９ 注排水口
１１０、２１０、４１０ 排気口
１１１、２１１、４１１ 流路
２１２、４１２ 粘着シ−ト
４０１ ガラス基板
４０２ ニトロセルロ−ス
４０３ スギアレルゲン
４０４ 抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４
４０５ ヒトＩｇＥ抗体
４０６ ビオチン標識ＢＳＡ
４０７ ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体
４０８ 透明樹脂製上カバ−
５０１、６０１、７０１、８０１、９０１、１００１ 注排液口付近の流路形状
５０２、１００２ スギアレルゲン４０３捕捉部による発光スポット
５０３、１００３ 抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４による発光スポット
５０４、６０４、１００４ ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部による発光スポット
５０５、６０５、７０５、１００５ ビオチン標識ＢＳＡ４０６捕捉部による発光スポット
５０６、６０６、７０６、８０６、１００６ ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２ ４０７捕捉部による発光スポット
６０２、７０２、８０２、９０２ スギアレルゲン４０３捕捉部による発光スポット
６０３、７０３、８０３、９０３ 抗ＩｇＥ抗体ｆ１９７４ ４０４による発光スポット
７０４、８０４、９０４ ヒトＩｇＥ抗体４０５捕捉部による発光スポット
８０５、９０５ ビオチン標識ＢＳＡ４０６捕捉部による発光スポット
９０６ ルシフェラ−ゼ標識抗ＩｇＥ抗体ｆ０８２２ ４０７捕捉部による発光スポット
１１０１ ニトロセルロ−スメンブレン
１１０２ 捕捉試薬部
１１０３ 対照部
１１０４ 供給部
１１０５ 吸水性担体
１１０６ 検体液の展開方向
１１０７ 検体
１１０８ 標識試薬
１１０９ 検体液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹部が形成された光学的に透明な板を支持体に載せて前記板と前記支持体との間に流路を形成し、前記流路の一端に検体を含む測定溶液を順次注排液するための注排水口と他端に排気口とを設けたバイオセンサ−において、
前記測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と、
前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置したバイオセンサ−。
【請求項２】
さらに、
前記測定溶液に含まれる標識抗ＩｇＥ抗体を捕捉するためのＩｇＥ抗体捕捉部と、
前記測定溶液に含まれる標識用酵素を捕捉するための標識蛋白捕捉部と、
前記測定溶液に含まれる検出試薬を捕捉するための標識酵素捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置した請求項１に記載のバイオセンサ−。
【請求項３】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部は、前記標識抗ＩｇＥ抗体と結合しないものである請求項２に記載のバイオセンサ−。
【請求項４】
前記検体は、全血又は血漿又は血清とする請求項１に記載のバイオセンサ−。
【請求項５】
前記標識用酵素は、ルシフェラ−ゼ又はペルオキシダ−ゼ又はアルカリホスファタ−ゼ又はグルコ−スオキシダ−ゼ又はグルコ−ス−６−燐酸脱水素酵素又はβ−ガラクトシダ−ゼからなる請求項１または２に記載のバイオセンサ−。
【請求項６】
前記測定溶液の基質は、ルシフェリン＋ＡＴＰ＋マグネシウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム塩（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）、燐酸ナフト−ルＡＳ−ＴＲ／ファストレッドＲＣ、フクシン、β−Ｄ−グルコ−ス＋ＨＲＰ＋３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、グルコ−ス−６−燐酸＋ＮＡＤＰ、２，２‘−アジノジ(３−エチルベンゾチアゾリソ６−スルホン酸)アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾル（ＡＥＣ）、４−クロロ−１−ナフト−ル（４Ｃ１Ｎ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｏ−ＮＰＧ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ルミノ−ル、チラミン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸の何れかからなる請求項２に記載のバイオセンサ−。
【請求項７】
検体を含む測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識抗ＩｇＥ抗体を捕捉するためのＩｇＥ抗体捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識用酵素を捕捉するための標識蛋白捕捉部と前記測定溶液に含まれる検出試薬を捕捉するための標識酵素捕捉部とを有する免疫反応系に、
検体を含む複数の試料溶液を順次注入し免疫反応させた後、
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性が検出されず、かつ前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記検体が含まれていないと判定とするサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項８】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性を検出したときは、
前記アレルゲン捕捉部の酵素活性を検出して被検体中の特定の前記ＩｇＥ量として算出する請求項７に記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項９】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性が検出されず、かつ前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記標識抗ＩｇＥ抗体が含まれていないと判定とする請求項７記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項１０】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部の全てに酵素活性が検出されず、かつ標識酵素捕捉部において酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記標識用酵素が含まれていないと判定とする請求項７記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項１１】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されないときは、前記試料溶液に検出用試薬が含まれていないと判定とする請求項７記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項１】
凹部が形成された光学的に透明な板を支持体に載せて前記板と前記支持体との間に流路を形成し、前記流路の一端に検体を含む測定溶液を順次注排液するための注排水口と他端に排気口とを設けたバイオセンサ−において、
前記測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と、
前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置したバイオセンサ−。
【請求項２】
さらに、
前記測定溶液に含まれる標識抗ＩｇＥ抗体を捕捉するためのＩｇＥ抗体捕捉部と、
前記測定溶液に含まれる標識用酵素を捕捉するための標識蛋白捕捉部と、
前記測定溶液に含まれる検出試薬を捕捉するための標識酵素捕捉部と、を前記流路中の前記注排水口側から前記排気口との間の前記支持体表面に配置した請求項１に記載のバイオセンサ−。
【請求項３】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部は、前記標識抗ＩｇＥ抗体と結合しないものである請求項２に記載のバイオセンサ−。
【請求項４】
前記検体は、全血又は血漿又は血清とする請求項１に記載のバイオセンサ−。
【請求項５】
前記標識用酵素は、ルシフェラ−ゼ又はペルオキシダ−ゼ又はアルカリホスファタ−ゼ又はグルコ−スオキシダ−ゼ又はグルコ−ス−６−燐酸脱水素酵素又はβ−ガラクトシダ−ゼからなる請求項１または２に記載のバイオセンサ−。
【請求項６】
前記測定溶液の基質は、ルシフェリン＋ＡＴＰ＋マグネシウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、ブロモクロロインドリル燐酸／ニトロブル−テトラゾリウム塩（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）、燐酸ナフト−ルＡＳ−ＴＲ／ファストレッドＲＣ、フクシン、β−Ｄ−グルコ−ス＋ＨＲＰ＋３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、グルコ−ス−６−燐酸＋ＮＡＤＰ、２，２‘−アジノジ(３−エチルベンゾチアゾリソ６−スルホン酸)アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’−５，５‘−テトラメルベンチジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾル（ＡＥＣ）、４−クロロ−１−ナフト−ル（４Ｃ１Ｎ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｏ−ＮＰＧ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ルミノ−ル、チラミン、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸の何れかからなる請求項２に記載のバイオセンサ−。
【請求項７】
検体を含む測定溶液に含まれるＩｇＥ抗体を捕捉するための抗ＩｇＥ抗体捕捉部と前記ＩｇＥ抗体の中の特定のＩｇＥ抗体を捕捉するためのアレルゲン捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識抗ＩｇＥ抗体を捕捉するためのＩｇＥ抗体捕捉部と前記測定溶液に含まれる標識用酵素を捕捉するための標識蛋白捕捉部と前記測定溶液に含まれる検出試薬を捕捉するための標識酵素捕捉部とを有する免疫反応系に、
検体を含む複数の試料溶液を順次注入し免疫反応させた後、
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性が検出されず、かつ前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記検体が含まれていないと判定とするサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項８】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性を検出したときは、
前記アレルゲン捕捉部の酵素活性を検出して被検体中の特定の前記ＩｇＥ量として算出する請求項７に記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項９】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記ＩｇＥ抗体捕捉部にて酵素活性が検出されず、かつ前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記標識抗ＩｇＥ抗体が含まれていないと判定とする請求項７記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項１０】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部の全てに酵素活性が検出されず、かつ標識酵素捕捉部において酵素活性が検出されるときは、前記試料溶液に前記標識用酵素が含まれていないと判定とする請求項７記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【請求項１１】
前記抗ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記ＩｇＥ抗体捕捉部及び前記標識蛋白捕捉部及び標識酵素捕捉部の全てに酵素活性が検出されないときは、前記試料溶液に検出用試薬が含まれていないと判定とする請求項７記載のサンドイッチイムノアッセイ法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−２２５７２６（Ｐ２０１２−２２５７２６Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９２７０３（Ｐ２０１１−９２７０３）
【出願日】平成２３年４月１９日（２０１１．４．１９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、２１年度、および２２年度独立行政法人科学技術振興機構産学イノベーション加速事業「先端計測分析技術・機器開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１９日（２０１１．４．１９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、２１年度、および２２年度独立行政法人科学技術振興機構産学イノベーション加速事業「先端計測分析技術・機器開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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