シグナル増幅マイクロスフェア、単ステップ及びマルチステップ分析増幅手順におけるそれらの使用並びにそれらの製造方法
本発明は、タンパク質シグナル前駆体分子、またはシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアに関し、前記シグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、担体タンパク質との結合を維持する。さらにマイクロスフェアの調製方法は、タンパク質分子を溶液中のマトリクス形成体と混合するステップと、混合物に還元剤を添加するステップと、還元剤を除去するステップと、タンパク質分子のマイクロスフェアを残してマトリクス形成体を除去するステップとを含む。さらに増幅サイクル手順を含むシグナル増幅を行うマイクロスフェアを用いた生物検定法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体タンパク質分子及びシグナル前駆体分子を有するタンパク質マイクロスフェアと、それらの製造方法に関し、さらにサンプル中の標的種の検出のためのそのようなマイクロスフェアのインビトロの生物検定（バイオアッセイ）における使用に関する。本発明はまた、光学的、磁気的、電気化学的または化学的方法を含むが、これらに限定されない検出技術を用いてインビトロの生物検定の感度レベルを向上させる方法に関する。検定方法、直接的かつ強力なシーケンシャルシグナル増幅法、及び種々のテストキットもまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
本発明のタンパク質マイクロスフェアの生物検定分野における応用において、タンパク質マイクロスフェアは、試料中の標的分子を特異的に認識しかつ結合する表面親和性分子を担持する。酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、免疫凝集アッセイ、または、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは遺伝子検定等の生物検定は周知であり、研究、人間及び家畜の診断分野、法医学的診断、環境分析、食物分析、並びに、大気中若しくは水中における危険物質の生物テロ防御における分析物の検出に重要な役割を果たしている。
【０００３】
生物検定は、少なくとも１つの標識生体分子と、検出対象の分析物（標的）との相互作用に基づく。標識は、相互作用を"視覚化"する手段である。多様な種類の標識が知られており、上述の種々の技術に対してそれらの名称を付与している。すなわち、ＥＬＩＳＡにおける酵素、ＲＩＡにおける放射性アイソトープ、ＦＩＡにおける蛍光物質、または、ウェスタン、サザン若しくはノーザンブロットにおける特定の標識である。
【０００４】
生物検定における最も重要な要請は、分析特異性と分析感度である。分析特異性は、親和性分子すなわち生体認識分子により決定される。例えば、抗体のその抗原（分析物）に対する結合部位の適合性、あるいは、２つの相補的核酸鎖のハイブリダイゼーションである。生物検定の分析感度も、その標的種との生体相互作用の親和性定数により、生体認識分子による影響を受ける。標識は、標識と親和性分子の間で生じた反応を示すマーカーとして機能し、種々の技術により測定可能である。
（i）色素の吸収若しくは蛍光体により放射された蛍光、発光体若しくは化学発光化合物により放射された発光の計測、または、凝集ラテックス粒子の光散乱による混濁度の計測による光学的測定
（ii）放射性同位体の計測による放射能測定
（iii）化学伝達物質または電子活性物質の計測による電気化学的測定
（iv）磁力の計測による磁気的測定
（iv）質量変化の計測による圧電的測定
【０００５】
放射性同位体を標識として用いた放射免疫測定法は、未だに、最も感度のある方法と見られている。この非常に強力な技術は、１９５９年にYalowとBersonにより紹介され、分析化学、診断学及び薬学における新時代を象徴した。それにもかかわらず、この技術は、使用される放射性同位体故に人間及び環境を汚染するリスクを完全には排除できないという欠点がある。
【０００６】
一方、非放射能法が発達してきて、匹敵する分析感度に到達する目標をもって改良されてきた。蛍光、発光及び吸収スペクトロスコピーに基づく光学的方法の重要性は、継続的に強化されてきており、なお成長し続けている。
【０００７】
ＥＬＩＳＡ技術は、シグナルを増幅するために酵素をマーカーとして用いる。生物検定が実行されると、分析物とプローブの生物相互作用が、酵素マーカー分子による大量の色素分子の生成によって増幅される。グルコースオキシダーゼ（GOD，EC 1.1.3.4）、アルカリホスフォターゼ（AP, EC 3.1.3.1）またはパーオキシダーゼ（POD, EC 1.11.1.7）等の酵素は、基質分子の１秒当たりの代謝回転数がそれぞれ２０００、５０００及び１００００で使用可能である。ＥＬＩＳＡ技術の欠点は、手順に含まれるステップが極めて多いことと、基質培養に長時間を要することである。
【０００８】
蛍光法もまた、長年生物検定に採用されてきており、高い関心が持たれ続けている。全ての蛍光をベースとする技術は、良好な感度と１０−８〜１０−１８Ｍの低い検出限界を確保している。例えば"時間分解蛍光法"、化学及び生物発光法、またはドナー分子とアクセプタ分子の間のエネルギー転換に基づく技術等の特殊な技術では、１０−１５〜１０−１８Ｍの検出限界に達することができる。
【０００９】
従来知られている蛍光免疫測定法は、反応性の官能性リンカー基をもつ低分子量蛍光標識（非特許文献１、２、３）と、蛍光性の色素着色粒子（特許文献１、２、３）または蛍光体添加(スパイク)デンドリマー（特許文献４）を用いる。
【００１０】
免疫測定法におけるシグナル増幅のためにマーカー負荷リポソームを用いることも知られている（特許文献５、６、７）。実際には、これらの方法の感度は、溶液形態にてリポソーム中に導入できるマーカー物質の量により制限される。標識リポソームを用いる更なる欠点は、リポソームの安定性の限界である。
【００１１】
上述の通り、生物検定の進展においては、非常に高い分析感度を実現することが重要であり、分析物濃度の所与の変化に対するシグナル応答の大きさ（キャリブレーション曲線の勾配）として規定される。免疫化学的定量においては、サンドイッチタイプ測定であれ競合タイプ測定であれ、分析感度は、濃度領域に依存する。
【００１２】
分析感度に影響を及ぼす別の２つの要因は、定量に必要なサンプル量と、結果を得る全体の反応時間である。サンプル量が多くなるほど、かかる全体反応時間も長くなり、検出可能かつ測定可能な分析物の濃度は低くなる。しかしながら、多くの実際の状況では、（例えば薬学的研究において）入手可能な十分なサンプル量がないか、または、（例えばミルク中の抗生物質残渣や空気中の生物テロ防御物質等）その成分が非常に大量のサンプル中に分散している。従って、入手可能な少量のサンプル中の非常に微量の物質を検出しかつ／または定量すること、あるいは、大量のサンプル体積中に非常に低濃度で分散した物質を検出しかつ／または定量することが、重要な挑戦となる。
【００１３】
結論として、適用される技術は、特に非常に低い濃度領域において高い分析感度を備えていなければならない。
【００１４】
非常に低い濃度領域における種々の既知の技術の分析感度を客観的に比較できるように、ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institute(臨床・検査標準協会）及び／またはＮＣＣＬＳ（米国臨床検査標準委員会））が３項目：ブランク上限（Limit of Bland（ＬｏＢ））、検出限界（Limit of Detection(ＬｏＤ)及び定量限界（Limit of Qantitation（ＬｏＱ）)を用いた分析感度を規定している。これらのパラメータのデータが評価され、種々の技術の間の比較に用いられる。
【００１５】
高分析感度を実現するために、シグナル増幅に効果のある異なる生体標識システムが開発された。例えば、酵素生体標識、有機微小結晶生体標識及び金コロイド標識等である。
【００１６】
酵素生体標識システムにおいては、酵素分子が光学的または電気化学的特性により基質を生成物に変換する。例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼによる高い代謝回転数により、あるいは、例えばアルカリホスファターゼによる非常に大きな線形酵素反応により、増幅を実現する膨大な量の生成物（シグナル）を生成することができる。
【００１７】
別の手法は、検定感度を向上させる検出シグナルを増幅するための、いわゆる"酵素サイクリング"技術である。
【００１８】
シグナル生成物質の固体粒子を用いた新しいクラスの標識は、特許文献８に開示されている。各固体粒子中に存在する億万個のシグナル生成分子は、"スーパーノバ効果"を生成するための遊離試薬に曝されると即座に遊離されることが可能である。
【００１９】
酵素システムのシグナル増幅原理は、バルク相中に遊離されているシグナルを生成するための酵素基質の変換に基づいている。固体粒子システムのシグナル増幅原理は、膨大なシグナル分子の反応チャンバのバルク相中での生成及び遊離に基づいている。しかしながら、バルク相へのシグナル分子の遊離は、シグナル分子濃度の部分的な希釈を生じて分析感度を劣化させる。
【００２０】
さらに、金コロイド標識を用いたシグナル増幅生物検定が知られている。非特許文献４は、金コロイドとそれに続く銀強化に基づくシグナル増幅法を報告している。それによれば、金コロイドが金粒子表面上への銀（Ｉ）の還元を促進することにより、多量の銀金属が金コロイド標識上に堆積することとなる。銀強化手法は、１リットル当たり５ナノモルまでの低い濃度のオリゴヌクレオチドを検出可能である。
【００２１】
増幅生物検定のための金コロイドを用いた別の手法は、金コロイドの生物親和性誘起凝集に基づいている。それは、裸眼で観察可能な赤色から青色への色変化を生じる。生物親和性誘起凝集の手法は、１リットル当たり１０フェムトモルの濃度レベルまでのオリゴヌクレオチドを検出可能である。金コロイド標識のシグナル増幅の原理は、集中した小体積中へのシグナル分子の蓄積すなわち凝集に基づいている。上述した標識システムのシグナル増幅性能と比較することにより、固体担体（例えば側方流装置）上の集中領域におけるシグナル分子蓄積（別の親和性分子による固定）による金コロイド増幅システムは、高い分析感度を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許第4,837,168号明細書
【特許文献２】米国特許第6,013,531号明細書
【特許文献３】国際公開WO95/08772公報
【特許文献４】独国特許第197 03 718号明細書
【特許文献５】米国特許第5,756,362号明細書
【特許文献６】米国特許第4,874,710号明細書
【特許文献７】米国特許第4,703,017号明細書
【特許文献８】欧州特許出願公開第1309867号公報
【００２３】
【非特許文献１】SOUTHWICK, P. L., et al., Cytometry, 11, pp. 418-430, 1990
【非特許文献２】MUJUMDAR, R. B., et al., Chemistry, 4, pp. 105-111, 1993
【非特許文献３】MUJUMDAR, R. B., et al., Cytometry, 10, pp. 11-19, 1989
【非特許文献４】T. Andrew Taton, Chad A. Mirkin, Robert L. Letsinger, "Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes", Science, 289(8) 1757-1760, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の一実施例は、優れた分析感度と、低検出限界と、さらに任意であるが、その手順を順次適用する繰り返しサイクル増幅によるシグナル検出の増強とを確保する、サンプル中の標的分子を検出するための方法を提供する。この手法は、既知の方法とは全く異なる。
【００２５】
本発明の別の実施例は、研究分野及び診断分野における標的分子の光学的、電気化学的または化学的検出のための種々のテストキットを提供する。
【００２６】
本発明の更に別の実施例は、生物検定において信頼性をもって調製可能でありかつ広範に適用可能である標識生体分子を提供する。それらは、好適には、人間及び動物の診断分野、法医学診断、環境分析、食物分析、生物テロ防御スクリーニング、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ゲノムの研究及び診断において適用可能なものである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
＜用語の定義＞
・親和性分子／生体認識分子
親和性分子は、それらの構造により若しくはそれらのポアサイズによりまたはそれらの電荷により、所定の親和力（アフィニティ定数／アビディティー定数）をもって特異的に別の物質を認識しかつ結合する物質である。
【００２８】
非常に多くの種々の親和性分子が存在する。それらには、所定の薬品クラスの物質と共に一般的に用いられるもの（例えば、ＩｇＧ抗体に対するタンパク質Ａ／Ｇ）、あるいは、唯一の物質に対する非常に特異的なもの（例えば、抗原に対する抗体、別のシーケンスに対するＤＮＡシーケンス、または、ビオチンに対するアビジン、基質に対する所定の酵素）がある。
【００２９】
・担体タンパク質（キャリアタンパク質）
担体タンパク質は、細胞内のＳ−Ｓ（硫黄−硫黄）結合を切断して分子間及び分子内のＳ−Ｓ結合の自己組織化形成を行わせることにより、主としてスポンジ状のマイクロカプセルの形態で関与する。分子間Ｓ−Ｓ結合は、タンパク質マイクロスフェアの構造整合性を担保する。
【００３０】
使用可能な担体タンパク質の例として、次のものが含まれる。
− 繊維状タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質等）
− 球状タンパク質
− 血清及び血漿から分離可能である血液タンパク質（例えば、ヘモタンパク質、輸送タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等）
− リポタンパク質
− 糖タンパク質
− 免疫系タンパク質（例えば、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、抗原等）
− 組換えタンパク質
− 遺伝子改変タンパク質
− 化学修飾タンパク質
− 合成タンパク質
− 種々のタンパク質の混合
− 栄養タンパク質（例えば、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質等）
− 酵素
− リボザイム
一般的に、人間、動物及び植物由来の含硫タンパク質、または、含硫ペプチド（合成ペプチドを含む）のいずれも使用できる。
【００３１】
・シグナル増幅
物理化学的に測定可能なシグナルを生じる２またはそれ以上の物質／反応パートナーの間の全ての反応である。
多くの場合、免疫化学的反応及びハイブリダイゼーション反応におけるシグナルは非常に弱く、測定が解析可能な結果を生じるに先立ってこのシグナルの増幅を行わなければならない。
【００３２】
増幅は、種々の方法及び技術により行うことができる。
【００３３】
本発明は、シグナル増幅マイクロスフェアを用いた単ステップ及びマルチステップの増幅手順の双方を提供する。マルチステップ増幅手順の一つでは、少なくとも１サイクルの増幅において、標的分子の特異的認識及びそれとの結合のために、シグナル生成有機物質の固体粒子を包含しかつ表面親和性分子を担持するカプセルを使用してもよい。特許文献８に開示されたタイプのものであり、特許文献８の開示をここに引用することにより包含する。
【００３４】
・マイクロスフェア
本発明のマイクロスフェアは、固体境界を有しておらず、その内部に延びる孔を備えたスポンジボールのようなものである。マイクロスフェアは、共有結合的に互いに結合するタンパク質分子のネットワークである。
【００３５】
マイクロスフェアは、沈殿したてのテンプレートにおける吸着性結合または共沈により、及び、分子内Ｓ−Ｓ結合の切断により形成される。得られた遊離したチオール基は、その後、新たな分子間及び分子内Ｓ−Ｓ結合を形成可能であり、分子間Ｓ−Ｓ結合はマイクロスフェア形成に寄与する。マイクロスフェアは、均一構造を有しており、特許文献８に開示されたような積層技術により形成されるカプセルのような層構造ではない。
【００３６】
マイクロスフェアは、１０nm〜１mmの間の、好適には４００nm〜１０μmの直径を有する。これらの境界値は、少なくとも部分的にはマイクロメートル領域の外側にあるが、簡便さのために、ここでの"マイクロスフェア"という用語は、本発明によるタンパク質分子のネットワークから形成された個々の粒子のことを称するために用いることとする。
【００３７】
・シグナル増幅マイクロスフェア
シグナル増幅マイクロスフェアは、担体タンパク質と、シグナル前駆体分子と、親和性分子とからなる。
シグナル増幅マイクロスフェアは、その表面上に、検出対象の物質（標的すなわち分析物）に対する特異的結合特性を備えている。
【００３８】
・マトリクス形成体
マトリクス形成体は、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ、オリゴ糖またはデキストリン等の多糖類などの材料である。共沈によりマイクロスフェアテンプレートを形成するために、担体タンパク質及び／またはシグナル前駆体分子と混合される。
【００３９】
・還元剤
還元剤は、マイクロスフェアテンプレート中のタンパク質分子内の分子内ジスルフィド結合を切断する材料であり、還元剤の例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
【００４０】
・マトリクス除去剤
マトリクス除去剤は、タンパク質マイクロスフェアを残してマイクロスフェアテンプレートからマトリクス形成体を除去するために用いられるキレート剤（ＥＤＴＡ）、酸または塩基等の材料である。
【００４１】
・シグナル前駆体分子
シグナル前駆体分子は、１または複数の他の試薬と反応したとき、測定可能なシグナルを生じる分子である。シグナル前駆体分子は、直接的または間接的なタイプが可能である。直接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子自体が、検出されるシグナルを生成するための活性化に応じて変化させられる。間接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子が、活性化に応じて別の種と反応し、この別の種が、検出されるシグナルを生成する要因となる。シグナル前駆体分子は、低分子量シグナル前駆体分子でも、高分子量シグナル前駆体分子でもよい。
【００４２】
・低分子量シグナル前駆体分子
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びその誘導体、発光体及びその誘導体、色素及びその誘導体、接合団、または、レドックスメディエーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００４３】
・高分子量シグナル前駆体分子
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００４４】
開始反応を介して測定可能なシグナルを生じる多様な化学薬品クラスからの非常に多くの多様な物質がある。測定可能なシグナルは、次のものに基づく。
− 蛍光分析
− 発光分析
− 紫外光、可視光、近赤外領域における色変化
− 酸化還元電位における変化
− 錯体形成または沈殿の間における質量の変化
【００４５】
・標的分子
この用語は、"分析物"と同意語である。この用語は、免疫測定等の分析手順において同定される物質すなわち化学成分を意味する。
【００４６】
＜発明の詳細な説明＞
第１の態様において、本発明は、シグナル前駆体分子と結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを提供する。シグナル前駆体分子は、担体タンパク質との結合を維持しつつ測定可能なシグナルを生成するために活性化可能である。
【００４７】
一実施例においては、マイクロスフェアがハイブリッド粒子またはヘテロ粒子であり、これは担体タンパク質とシグナル前駆体分子が異なることを意味する。別の実施例では、マイクロスフェアがホモ粒子であり、これは担体タンパク質とシグナル前駆体が同じであること意味する。
【００４８】
上述したように、シグナル前駆体分子は直接的または間接的なタイプとすることができる。直接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子自体が、検出されるシグナルを生成するために活性化に応じて変化させられる。間接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子は活性化に応じて別の種と反応し、この別の種が、検出されるシグナルを生成可能である。
【００４９】
好適には担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。このタンパク質は、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロットを含む生化学の応用に広く用いられている。これは良好な安定性を備えており、かつ、畜産業の副生成物としてウシ血液から大量のものを容易に精製できるため低コストにて入手可能である。
【００５０】
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００５１】
好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。
【００５２】
別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。
【００５３】
最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。
【００５４】
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００５５】
好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。
【００５６】
別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。
【００５７】
最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【００５８】
上述したマイクロスフェアは、１０nm〜１mmの範囲の、好適には４００nm〜１０μmの範囲の寸法を有する。マイクロスフェアの構造は、好適には実質的に均質である。すなわち、マイクロスフェアを形成する材料は実質的に均一に分散しており、粒子の本体全体に亘って実質的に均一な密度及び多孔度を有する。
【００５９】
マイクロスフェアは、微少なスポンジ又は綿毛ボールに似ており、認識できる境界を有してはいるが、境界を規定する硬い外殻をもつカプセルではない。
【００６０】
溶液中の標的に結合するためにマイクロスフェアが親和性分子と結合したとき、それらの親和性分子はマイクロスフェアに付着することになる。マイクロスフェアは親和性分子を有する、すなわち、親和性分子がマイクロスフェアの表面に直接に又はリンカー分子を介して接合されるか又は結合される、あるいは、吸着により結合または付着される。リンカー分子としては、限定しないが、例えばアビジン、ストレプタビジン、NeutrAvidin（商標）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン又は低分子量クロスリンカー等の生体分子を含む。しかしながら、幾つかの親和性分子は、マイクロスフェアの内部に拡散して、特別な場合にはそこでも付着することとなる。もちろん、このような拡散の程度は、親和性分子とマイクロスフェアの孔サイズの相対的寸法に依存することとなる。
【００６１】
マイクロスフェアに付着される親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【００６２】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【００６３】
第２の態様において、本発明は、本明細書で定義したマイクロスフェアの製造方法を提供する。マイクロスフェアはシグナル前駆体分子と結合した担体タンパク質を有する。シグナル前駆体分子は、検出可能なシグナルを生成するために、担体タンパク質との結合を維持しつつ活性化可能である。この方法は、担体タンパク質及びシグナル前駆体分子をマトリクス形成体と溶液中、好適には水溶液中で撹拌により混合し、小分子の還元剤を撹拌により添加し、小分子の還元剤を除去するために洗浄し、マトリクス除去剤を撹拌により添加し、かつ、マトリクス形成体を除去してシグナル前駆体分子と結合した担体タンパク質のマイクロスフェアを残すために洗浄するものである。
【００６４】
この方法は、水性試剤と共に水溶液中で、好適には室温にて行われることが好ましい。混合の好適方法は、磁気スターラーを用いた撹拌である。
【００６５】
マトリクス形成体の機能は、マイクロスフェアテンプレート中にタンパク質分子を補足することである。マトリクス形成体は、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ、または、オリゴ糖またはデキストラン等の多糖類とすることができる。カルシウムカーボネートは、好適には、担体タンパク質とシグナル前駆体分子と塩化カルシウムの混合溶液に、炭酸ナトリウム溶液を添加することにより形成される。
【００６６】
マイクロスフェアの大きさは、撹拌速度を制御することにより制御可能である。マイクロスフェアの密度は、担体タンパク質、シグナル前駆体分子、マトリクス形成体及び還元剤の相対的割合を調整することにより制御可能である。
【００６７】
前述の通り、マイクロスフェアは、ハイブリッド粒子でもよく、その場合、担体タンパク質とシグナル前駆体分子が異なってもよい。別の例として、担体タンパク質及びシグナル前駆体分子が同じでもよい。さらに、シグナル前駆体が、上述したように直接的でも間接的でもよい。
【００６８】
好適には、担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。
【００６９】
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００７０】
好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。
【００７１】
別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。
【００７２】
最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。
【００７３】
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００７４】
好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。
【００７５】
別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。
【００７６】
最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【００７７】
マイクロスフェアの製造方法は、さらに、親和性分子をマイクロスフェアの表面に付着させることを含む。親和性分子は、例えばファンデルワールス力、水素結合または静電相互作用によりマイクロスフェアの外面に接合させられる。あるいは、親和性分子が、直接に又はリンカー分子を介してマイクロスフェアの外面に共有結合させられる。間接的に結合する場合、リンカー分子としては、限定しないが、例えばアビジン、ストレプタビジン、NeutrAvidin（商標）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン又は低分子量クロスリンカー等の生体分子を含む。親和性分子は、マトリクス除去剤を添加するステップに先立って反応混合物に添加してもよい。
【００７８】
典型的な親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【００７９】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【００８０】
第３の態様において、本発明は、シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法であって、そのシグナル前駆体分子は担体タンパク質との結合を維持しつつ検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、そのマイクロスフェアは特異的認識のための親和性分子を表面上に有しかつその表面上で標的分子に結合する方法を提供する。その方法は、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持（インキュベーション）し、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有しないマイクロスフェアから分離し、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理し、かつ、
（ｄ）シグナルを検出または定量することを含む。
【００８１】
このようにして生成されるシグナルは、直接的にまたは間接的に、試料中の標的分子の量に関係する。さらに、シグナル前駆体分子がマイクロスフェア内で結合したままであり溶液中に解放されていないので、シグナルは局所化している。よって、シグナルの希釈がない。逆に、恒温保持ステップ中に形成される親和性分子と標的分子との各複合体に対して、活性化ステップ中に多数のシグナル前駆体分子が活性化されるので、シグナルは増幅される。
【００８２】
好適には、担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。
【００８３】
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００８４】
好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。
【００８５】
別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。
【００８６】
最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。
【００８７】
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００８８】
好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。
【００８９】
別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。
【００９０】
最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【００９１】
親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【００９２】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【００９３】
マイクロスフェアの特に好適な形態は、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、かつ、シグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセイン二酢酸マレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）から選択されたものである。展開剤は、活性化ステップ中にこれらのフルオレセイン誘導体を"活性化"するために、例えばアルカリ性試薬による化学反応またはエステル分解酵素による生化学反応により、それらをフルオレセインに変換し、それにより検出可能なシグナルを生成するために適切なものである。別の例として、活性化ステップは、マイクロウェーブ加熱等の物理的手段により行ってもよい。
【００９４】
第４の態様として、本発明は、第１のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するための別のシグナル増幅方法であって、その第１のシグナル前駆体分子は担体タンパク質との結合を維持しつつ検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、そのマイクロスフェアは特異的認識のための親和性分子を表面上に有しかつその表面上で標的分子に結合する方法を提供する。その方法は、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持し、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有しないマイクロスフェアから分離し、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、それらのマイクロスフェアを分解して第１のシグナル前駆体分子を遊離させるために遊離剤により処理し、かつ、
（ｄ）遊離された第１のシグナル前駆体分子を、その遊離された第１のシグナル前駆体分子に対して親和性をもつ第２の親和性分子により官能基化された別のバッチのマイクロスフェアにより処理し、その別のバッチのマイクロスフェアは第２のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有し、その第２のシグナル前駆体分子は担体タンパク質との結合を維持しつつ検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、
（ｅ）第２の親和性分子と第１のシグナル前駆体分子との複合体を表面に有するマイクロスフェアを、第２の親和性分子と第１のシグナル前駆体分子との複合体を表面に有しないマイクロスフェアから分離し、
（ｆ）分離した、第２の親和性分子と第１のシグナル前駆体分子との複合体を表面に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成する第２のシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理し、
（ｇ）シグナルを検出又は定量することを含む。
【００９５】
このように生成されたシグナルは、試料中の標的分子の量に関係する。シグナルは、２段階で数倍に増幅される。なぜなら、恒温保持ステップ（ａ）の間に形成された親和性分子と標的分子との各複合体については、ステップ（ｃ）で遊離された多数の第１のシグナル前駆体分子が存在し、それらは、第１のシグナル前駆体分子に対する親和性をもつように官能基化された別のバッチのマイクロスフェアとともに恒温保持されるからである。遊離された多数の第１のシグナル前駆体分子は、別のマイクロスフェアとの複合体を形成し、そして、遊離された第１のシグナル前駆体分子を複合体を形成しなかったマイクロスフェアを除去した後、多数の第２のシグナル前駆体分子を活性化するために活性化剤が添加され、複合化したマイクロスフェアの各々がシグナルを生成する。
【００９６】
このシグナル前駆体分子の遊離及び再複合化のサイクルは、極めて大きな増幅度を得るために多数回繰り返すことができるという点で有用である。言い換えるならば、ステップ（ｃ）〜（ｅ）は、ステップ（ｆ）及び（ｇ）を行う前に１回〜ｎ回繰り返すことができる。ｎは正の整数である。その場合、少なくとも最後の繰り返しサイクルにおけるシグナル前駆体分子が、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である。
【００９７】
標的分子は一次分析物となる。第１のシグナル前駆体分子は二次分析物となり、第２のシグナル前駆体分子は三次分析物となる。以下同様に続く。
【００９８】
変形例では、最後の繰り返しサイクルにおけるシグナル前駆体分子のみが、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であることが必要である。それより前のサイクルで遊離されるシグナル前駆体分子は、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である必要はなく、それらはアビジン等の分子に結合可能であるが、シグナル前駆体分子としてみなされない。なぜなら、それらは最終的にシグナルを導出する反応の連鎖の重要な部分だからである。
【００９９】
アビジンとビオチンのように、よく理解されかつ広く用いられる組合せを前駆体分子−親和性分子の対として用いることにより、特にこの方法のより後ろの段階においてすなわち検出され又は同定される特定の標的に適合させるために最初の標的分子と親和性分子の組合せが選択された後に用いることにより、この増幅プロセスに高い信頼度と確実性をもたせることができる。
【０１００】
最後の増幅ステップにおいて、最終のシグナル前駆体分子が最終のマイクロスフェア内で結合したままであり溶液中に遊離されていない場合は、シグナルが局所化されてもいてもよい。このことは、シグナルの希釈を最小とする。
【０１０１】
その一方、最終のシグナル前駆体分子をそれらの非遊離状態において検出することは重要ではない。遊離している場合は、それらを溶液中で検出することもできる。あるいは、別の増幅ステップを誘起させることもできる。例えば、高い代謝回転数をもつ酵素が最終のシグナル前駆体分子である場合、その酵素を蛍光又は発光のために基板上で作用させてもよい。別の例では、最終のシグナル前駆体分子としてカプセル化したＦＤＡを用いてもよい。水溶性の水酸化ナトリウム等の展開剤の添加により、ＦＤＡは解離し、加水分解しかつ多数のフルオレセイン分子を遊離することにより、増幅された蛍光シグナルをもたらす。
【０１０２】
好適には、少なくとも恒温保持ステップ（ａ）で用いられるマイクロスフェアについて、担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。
【０１０３】
同様に、少なくとも恒温保持ステップ（ａ）で用いられるマイクロスフェアについて、シグナル前駆体分子が、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【０１０４】
少なくとも恒温保持ステップ（ａ）で用いられるマイクロスフェアについて、親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【０１０５】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【０１０６】
マイクロスフェアの特に好適な形態は、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、かつ、シグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセイン二酢酸マレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）から選択されたものである。展開剤は、活性化ステップ中にこれらのフルオレセイン誘導体を"活性化"するために、例えばアルカリ性試薬による化学反応またはエステル分解酵素による生化学反応により、それらをフルオレセインに変換し、それにより検出可能なシグナルを生成するために適切なものである。
【０１０７】
マイクロスフェアを分解してシグナル前駆体分子を遊離させる化学遊離剤は、低分子の還元剤でもよい。それらはマイクロスフェアのＳ−Ｓ結合（分子間及び分子内）を切断するために有効である。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、特に好適な遊離剤である。マイクロスフェアの分解はまた、音波、高温、光照射、又はｐＨ変化により行ってもよい。
【０１０８】
以下、本発明を、図面を例示としてのみ参照しつつ説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、本発明によるマイクロスフェアの製造技術を示した概略図である。
【図２】図２は、本発明の第１の態様におけるタンパク室マイクロスフェアの位相差顕微鏡写真である。
【図３】図３は、多孔度の異なるタンパク質マイクロスフェアの走査電子顕微鏡画像であり、上段の画像は22,000倍、下段の像は150,000倍を示している。
【図４】図４は、サンドイッチ生物検定におけるシグナルの蓄積及び局所化の作用原理を示した概略図である。
【図５】図５は、Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇ−α−ＭＩｇＧ）により官能基化されたＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアにおける固相サンドイッチ蛍光免疫測定の概略図である。
【図６】図６は、増幅サイクルの原理を示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
図１（ａ）は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、担体タンパク質及びシグナル前駆体分子の混合溶液を含む第１容器１００と、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）の溶液を含む第２容器２００とを示している。２つの容器の内容物は、即座に混合されることにより、タンパク質と例えばＢＳＡ−ＦＤＡであるシグナル前駆体分子とが、共沈によって、支持する炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）マイクロスフェアテンプレート３００内にトラップされる。
【０１１１】
図１（ｂ）は、次のステップで生じる事象を示している。トラップされたタンパク質と
シグナル前駆体分子をもつＣａＣＯ３マイクロスフェアテンプレート３００は、還元剤のジチオスレイトール（ＤＴＴ）により処理されることにより、タンパク質分子内の分子内ジスルフィド(Ｓ−Ｓ)結合の切断を生じる。その後、ＤＴＴは、何度も洗浄ステップを繰り返して除去される。新たな分子間及び分子内ジスルフィド結合が、タンパク質分子の間で形成される。新たに形成された分子間ジスルフィド結合は、シグナル前駆体分子も包含するマイクロスフェア２０中へのタンパク質分子の組み込みに寄与する。化学クロスリンカーの使用を必要とせずに、ＣａＣＯ３マイクロスフェアテンプレート材料は除去され、タンパク質／シグナル前駆体分子マイクロスフェア２０を残す。
【０１１２】
図２は、上記の手順に従って調製されたタンパク質マイクロスフェアの位相差顕微鏡写真である。マイクロスフェアは、大きさが均一にそろっており、平均からの偏りはほとんどない。さらに、マイクロスフェアが同じ表面電荷をもっていることにより、互いに付着しないことが重要である。互いに付着しないことは、図中に明確に示されている。さらに、大きさの分布が狭いことは、定量分析において重要である。
【０１１３】
図３は、濃度０．０１〜１mMの範囲のＤＴＴを用いて１５〜６０分間で調製されたＢＳＡマイクロスフェアのＳＥＭ顕微鏡画像を示している。得られたマイクロスフェアは直径がほぼ同程度であり、ＤＴＴ濃度が低下するにつれてマイクロスフェアの表面の粗さ及び孔の大きさが増している。
【０１１４】
より高いＤＴＴ濃度では、ＢＳＡ分子内の分子内ジスルフィド結合切断の度合いが多くなった。すなわち、タンパク質分子内の遊離したチオール基の数が増した。洗浄（繰り返し洗浄ステップを適用）によりＤＴＴを除去した後、ＢＳＡ分子内の遊離したチオール基は、新たな分子間及び分子内ジスルフィド結合を形成するために自己凝集させられた。分子間ジスルフィド結合は、タンパク質マイクロスフェアの形成に寄与し、マイクロスフェアは炭酸カルシウムテンプレートの除去後にも維持された。
【０１１５】
低濃度のＤＴＴを用いて調製されたマイクロスフェアは、分子間ジスルフィド結合の数が少なく、従って孔が多かった。
【０１１６】
図４は、本発明のマイクロスフェアを用いたサンドイッチ生物検定におけるシグナルの蓄積及び局所化の作用原理を示した概略図である。
【０１１７】
図４（ａ）では、表面に親和性分子５０を有する固体支持体１０が示されている。マイクロスフェア２０は、ここでは、シグナル前駆体分子４０に結合した担体タンパク質３０を包含するやや平たい円で示されている。これは概略図であって、図示の目的のみでマイクロスフェアに実線による境界を付与している点に注意されたい。さらに、担体タンパク質分子間のＳ−Ｓ結合（及び担体タンパク質分子とシグナル前駆体分子間の結合）のラインは、明確とするために省略している。実際には、マイクロスフェアは、明確な境界をもつカプセルではない。むしろそれは、その内部に延びかつ、均一に分布した互いに結合する担体タンパク質とシグナル前駆体分子により形成された多孔を有する小さなスポンジボールのようなものである。
【０１１８】
マイクロスフェア２０は、その表面上に付着する親和性分子５０を有する。
【０１１９】
標的分子すなわち分析物６０は、固体支持体１０条の親和性分子５０の１つのと、マイクロスフェア上の親和性分子５０の１つの間に挟まれ（サンドイッチされ）ている。固体支持体１０は、膜、マイクロタイタープレートの穴、磁気ビーズでもよく、またはより一般的には、免疫学的測定又はハイブリダイゼーション測定において用いられるいずれの固相プラットフォームでもよい。
【０１２０】
図４（ｂ）には、同じマイクロスフェア２０が示されており、２つの親和性分子５０の間の標的分子６０の"サンドイッチを介して固体支持体１０にまだ付着したままである。しかしながら、この図では、マイクロスフェア２０は、展開剤による処理後のものを示されており、小さな太陽の記号で示されるシグナル分子４０＊を有する。以前のこの箇所には、菱形で示されたシグナル前駆体分子４０を有していた。
【０１２１】
要するに、図４（ａ）はマイクロスフェアのスイッチオフを示し、一方、図４（ｂ）はマイクロスフェアのスイッチオンを示す。
【０１２２】
図示の目的のみのために、図４では、固体支持体１０上とマイクロスフェア２０の表面上に同じタイプの親和性分子５０を示している。しかしながら、ほとんどの実際の状況では、２つの親和性分子は、ポリクロナル抗体が用いられる場合か標的分析物が反復エピトープである場合を除いて同じではないであろう。
【０１２３】
実際に、多くのマイクロスフェア生体標識は、生物検定における個々の標的分析物に対して、その分析物（標的）の大きさ及びマイクロスフェアの大きさによって、特異的に結合するであろう。免疫学的測定においては、マイクロスフェア生体標識は、抗原標的分子のエピトープに対して特異的に結合することになる。ハイブリダイゼーション測定においては、マイクロスフェア生体標識は、特定のＤＮＡシーケンス標的分析物に対して結合することになる。
【０１２４】
展開剤の添加により、生体標識内の何百万ものシグナルを生成する前駆体分子が、高い蛍光性分子に変換し、それらの生体標識は局所化されたシグナルを点灯させかつ生成する。
【０１２５】
図５は、Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ）により官能基化されたＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアにおける固相サンドイッチ蛍光免疫測定を概略的に示している。
【０１２６】
図５（ａ）では、恒温保持ステップが示され、Ｇｔ−α−ＭＩｇＧが固体支持体に付着させられる。図５（ｂ）のステップでは、固体支持体上に結合したＧｔ−α−ＭＩｇＧが、標的種すなわち分析物、ＭＩｇＧを含む溶液に曝される。標的種は、結合したＧｔ−α−ＭＩｇＧにより捕捉される。洗浄ステップ（図示せず）により、捕捉されなかった標的種を除去する。図５（ｃ）のステップでは、表面上の親和性分子としてＧｔ−α−ＭＩｇＧにより官能基化されたＢＳＡ−ＦＤＡから形成されたマイクロスフェアを用いて、捕捉された標的種を処理することによりサンドイッチ測定が行われる。更なる洗浄ステップ（図示せず）において、捕捉された標的種に結合しなかったマイクロスフェアを洗浄除去する。図５（ｄ）のステップでは、展開剤が添加され、ＦＤＡがフルオレセインに加水分解されて、視覚化可能な局所化されたシグナルを生成する。
【０１２７】
図６は、増幅サイクルの原理を概略的に示している。
【０１２８】
図６（ａ）は、標的に相補的な核酸３０とマイクロスフェア２０’に接合した親和性分子５０’との間のサンドイッチハイブリダイゼーションにより、一端が固体支持体１０’に付着し他端がマイクロスフェア２０’に付着した１つの捕捉分子６０を示している。概略的に、捕捉分子６０は、標的に相補的な核酸３０及びマイクロスフェア２０’に接合した親和性分子５０’に対してハイブリダイズした標的核酸として示されている。
【０１２９】
図６（ｂ）は、マイクロスフェアを分解させる遊離剤による処理後のマイクロスフェアを示している。この図では、マイクロスフェアがちょうど分解し始めて、多数の二次分析物４０’（Ｘ）を溶液中に遊離している。二次分析物は、例えばアビジンでもよい。
【０１３０】
図６（ｃ）は、親和性分子５０”により異なる固体支持体１０”上に捕捉された二次分析物４０’を示している。二次分析物４０’がアビジンである例では、親和性分子５０”がアルブミン１２”に結合されるビオチンでもよい。この態様では、それは固体支持体１０”に付着することとなる。捕捉された二次分析物４０’は、固体支持体１０”に間接的に結合した親和性分子５０”と、別のマイクロスフェア２０”に結合した別の親和性分子５０”との間にサンドイッチされる。
【０１３１】
図６（ｄ）は、マイクロスフェア２０”を分解させる遊離剤による処理後のマイクロスフェア２０”を示している。この図では、マイクロスフェアはちょうど分解し始めて、多数の三次分析物４０”を遊離している。このように、１つの標的分子６０が、２回の増幅サイクル後には何十億もの三次分析物を生成可能である。必要であれば、更なる増幅サイクルを実行可能である。
【０１３２】
ここで、種々の実施例を参照して本発明を説明するが、これらに限定されないことを理解されたい。
【０１３３】
［実施例１］
［ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの調製］
・ステップ１：ＢＳＡフレームワークの形成
ＢＳＡ（１０mg／mL）を含む塩化カルシウム溶液（０．５mol／L）を、炭酸ナトリウム溶液（０．５mol／L）と速やかに混合した。
炭酸カルシウムが形成されるが、ほとんどわずかしか溶解しないため、炭酸カルシウムマトリクスのコア／内部にＢＳＡをトラップした。炭酸カルシウムは、ＢＳＡをトラップするためのテンプレートとして機能する。
【０１３４】
次のステップにて、ＢＳＡの分子内Ｓ−Ｓ結合の切断及び新たなＢＳＡ分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を行った。
【０１３５】
各ステップでは、数回の洗浄及び遠心分離のサイクルを行った。
【０１３６】
得られたＢＳＡ担持炭酸カルシウムマイクロスフェアを、ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液とともに１５〜６０分間、室温にて恒温保持した。続いて、ＢＳＡ担持炭酸カルシウムマイクロスフェアを、遠心分離（２０００rpm、２分間）と再分散のサイクルにより、緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５回洗浄した。
【０１３７】
ＤＴＴの添加により、ＢＳＡ中の分子内Ｓ−Ｓ結合の還元／切断を生じさせる一方、これらの洗浄ステップにおけるＤＴＴの除去によりＢＳＡ分子間の新たな分子内及び分子間のＳ−Ｓ結合を形成させてタンパク質をともに保持しかつマイクロスフェアを形成した。
【０１３８】
・ステップ２：ＢＳＡフレームワーク−マトリクスに対するシグナル分子の結合
再懸濁した炭酸カルシウム含有マイクロスフェアに対して、フルオレセイン二酢酸−５−イソチオシアネート（１mg/mL）を添加し、反応混合物を室温にて１時間恒温保持することにより、ＢＳＡアミノ基とフルオレセイン二酢酸のチオシアネートとの間に共有結合を形成させた。
【０１３９】
・ステップ３：ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの官能基化
シグナル分子を担持するマイクロスフェアに対するGoat-Anti-Mouse抗体の結合を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて行った。
【０１４０】
・ステップ３．１：親和性分子の溶液の調製
Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ）を含有する溶液を、ｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝液中にそれぞれ２mM及び５mMである１−エチル−３(３−ジメチルアミノプロピル)カーボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）に添加した。この溶液を、振動させつつ室温にて１５分間反応させた。
【０１４１】
・ステップ３．２：抗体によるマイクロスフェアの官能基化
１５分間の恒温保持の後、Goat-Anti-Mouse IgGを結合するために活性化された親和性分子の溶液を、予洗浄したＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの懸濁液に添加し、そして、混合物を振動させつつ室温にて２時間反応させた。ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアに結合した親和性分子の溶液を、１８００rpmにて２分間遠心分離した。
【０１４２】
・ステップ４：炭酸カルシウムテンプレートの除去
１０mLの０．２MのＥＤＴＡを、ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの懸濁液に添加し、全体を５分間撹拌した。ＥＤＴＡ処理によりマイクロスフェアから炭酸カルシウムマトリクスを除去した。その後、反応混合物は、室温にて２分間３０００rpmで遠心分離に供した。上澄液が除去され、抗体官能基化ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアペレットが、２mLのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中にて再懸濁した。
【０１４３】
［実施例２］
［アルギン酸カルシウムマトリクス形成体を用いたＢＳＡフレームワークの形成］
ＢＳＡ（１０mg／mL）を含む塩化カルシウム溶液（０．５mol／L）を、アルギン酸ナトリウム溶液（０．５mol／L）と速やかに混合した。
【０１４４】
アルギン酸カルシウムが形成されるが、ほとんどわずかしか溶解しないため、アルギン酸カルシウムマトリクスのコア／内部にＢＳＡをトラップした。アルギン酸カルシウムは、ＢＳＡをトラップするためのテンプレートとして機能した。
【０１４５】
次のステップにて、ＢＳＡ分子内Ｓ−Ｓ結合の切断及び新たなＢＳＡ分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を行った。
【０１４６】
各ステップでは、数回の洗浄及び遠心分離のサイクルを行った。
【０１４７】
得られたＢＳＡ担持アルギン酸カルシウムマイクロスフェアを、ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液とともに１５〜６０分間、室温にて恒温保持した。続いて、ＢＳＡ担持アルギン酸カルシウムマイクロスフェアを、遠心分離（２０００rpm、２分間）と再分散のサイクルにより、緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５回洗浄した。
【０１４８】
ＤＴＴの添加により、ＢＳＡ中の分子内Ｓ−Ｓ結合を還元／切断させる一方、これらの洗浄ステップ中におけるＤＴＴの除去によりＢＳＡ分子間に新たな分子内及び分子間Ｓ−Ｓ結合が生じて、タンパク質をともに保持しかつマイクロスフェアを形成した。
【０１４９】
［実施例３］
［マウス−ＩｇＧの同定のためのサンドイッチタイプ測定］
マウスＩｇＧの同定を、サンドイッチタイプ測定において行った。同定の間、マウスＩｇＧは、２つの抗体の間に特異的に結合した。ポリクロナルgoat抗体を用いたので、これらの抗体は同じものとした。固相（例えば、マイクロタイタープレートの穴）は、Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ）抗体により吸着性をもつようにコーティングした。第２の抗体は、Goat-Anti-Mouse であり、ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアに結合させた。この実施例は、図５に概略的に示されている。
【０１５０】
１００μLのＧｔ−α−ＭＩｇＧ（２ng／μLのコーティング緩衝液）をマイクロタイタープレートに移し、４℃にて一晩恒温保持した。その後、マイクロタイタープレートを、洗浄緩衝剤（１０mM ＰＢＳ、０．１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ、０．５％(ｗ／ｖ)Tween 20(Tweenは商標)）により３回洗浄した。その後、穴を、３００μLのポストコーティング溶液（ＰＣＳ）により３７℃にて３０分間ブロッキングした。異なる濃度（１〜１００μg／L）の１００μLのＭＩｇＧを、各穴にそれぞれ添加し、３７℃にて１時間恒温保持した。非結合ＭＩｇＧを洗い流した後、Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ−｛ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェア｝の懸濁液を穴に投入した（１００μL／穴）。そして、マイクロタイタープレートを再び３７℃にて１時間恒温保持した。恒温保持後、過剰なＧｔ−α−ＭＩｇＧ−｛ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェア｝を洗浄緩衝剤により洗い流した。その後、１００μLの一定分量の遊離溶液を各穴に添加し、これらの穴を蛍光強度について測定した。
【０１５１】
［実施例４］
［アビジンマイクロスフェアの調製］
実施例４は、担体タンパク質と親和性結合する分子とが１つの同じ分子の場合である。
【０１５２】
・ステップ１：アビジンフレームワークの形成
アビジン（１０mg／mL）を含む塩化カルシウム溶液（０．５mol／L）を、炭酸ナトリウム溶液（０．５mol／L）と速やかに混合した。
【０１５３】
炭酸カルシウムが形成されるが、ほとんどわずかしか溶解しないので沈殿し、形成された結晶表面上にアビジンを引き寄せ／吸着した。炭酸カルシウムは、アビジンの沈殿のためのテンプレートとして機能した。
【０１５４】
次のステップは、アビジンの分子内Ｓ−Ｓ結合の切断及び分子間Ｓ−Ｓ結合の形成によるアビジンの架橋である。
【０１５５】
各ステップでは、数回の洗浄及び遠心分離のサイクルを行った。
【０１５６】
得られたアビジン担持炭酸カルシウムマイクロスフェアは、ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度範囲のジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液により室温にて１５〜６０分間恒温保持した。続いて、アビジン担持炭酸カルシウムマイクロスフェアを、遠心分離（２０００rpm、２分間）と再分散のサイクルにより、緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５回洗浄した。
【０１５７】
ＤＴＴの添加により、アビジンの分子内Ｓ−Ｓ結合を還元／切断させる一方、これらの洗浄ステップ中のＤＴＴの除去によってアビジン分子間の分子内及び分子間Ｓ−Ｓ結合を生じさせることにより、タンパク質をともに保持しかつマイクロスフェアを形成する。タンパク質中の還元したＳＨ結合は、新たな分子内及び分子間Ｓ−Ｓ結合の自己組織化形成を行う。
【０１５８】
・ステップ２：シグナル分子の官能基化
これは、マイクロスフェアに対する親和性分子の共有結合のために、親和性結合する分子を存在させずに、遊離アミノ基、ＳＨ及びカルボキシル基をもつアビジンに対して特定の検出分子（親和性分子）を結合させることにより行う。
【０１５９】
アビジン含有マイクロスフェアの官能基化手順の詳細については、上述の実施例２を参照されたい。
【０１６０】
官能基化手順は、ストレプトアビジン又はNeutrAvidin（商標）等の脱グリコシルアビジンを用いると非常に簡易である。なぜなら、これらは、標的（分析物）認識分子すなわち親和性分子に対して直接結合するからである。ストレプトアビジン又はNeutrAvidin（商標）が用いられた場合、通常ビオンチン化された親和性分子、例えばビオチン化抗体が、ストレオプトアビジンのビオチンに対する強い結合力（Ｋが約１０１６）によりストレプトアビジン又はNeutrAvidin（商標）に対して直接結合される。ゆえに、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた化学結合は必要ない。
【０１６１】
・ステップ３：マイクロスフェアからの炭酸カルシウムの分離
これは、アビジンマイクロスフェアの懸濁液に対するＥＤＴＡ（０．２mol／L）の添加により行った。この手順後、アビジンシグナル前駆体マイクロスフェアが調製された。
【０１６２】
上述の実施例１のように、炭酸カルシウムを除去するステップは、官能基化ステップの前に行うこともできる。
【０１６３】
［実施例５］
［固相直接測定（倍増幅システム、ＤＮＡ測定モデル、しかる後のビオチン／アビジンモデル）］
これは、担体タンパク質及び親和性結合分子が１つで同じ分子である場合の例であり、新たなシグナル増幅サイクリング技術におけるその有用性を示す。この例は、図６に概略的に示されている。
【０１６４】
ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）のＤＮＡの同定を、サンドイッチタイプ測定において行った。ＨＰＶの同定中、ＤＮＡ鎖が、ビオチン化されたその相補的核酸に対して特異的にハイブリダイズした。その後、このハイブリダイゼーション生成物を、NeutrAvidin（商標）から調製されたマイクロスフェアと反応させた。アビジンマイクロスフェアを分解させる遊離剤を添加して、アビジンを溶液中に遊離させた。その後、遊離したアビジンを、後工程の固相直接測定における分析物として処理した。
【０１６５】
・ステップ１：固相直接測定Ａ（ＨＰＶ ＤＮＡモデル）
１００μLのＨＰＶプローブ（ＨＰＶ１６)を、マイクロタイタープレートの穴に移し、４℃にて一晩恒温保持した。その後、マイクロタイタープレートを３００μLの洗浄緩衝剤を用いて５回洗浄した。その後、穴を、３００μLのブロッキング溶液により３７℃にて３０分間ブロッキングした。その後、マイクロタイタープレートを３００μLの洗浄緩衝剤を用いて５回洗浄した。異なる希釈における、３０μLの１MのＮａＯＨ及び５０μLのＰＣＲ(ビオチン化ＨＰＶ−ウィルス−ＤＮＡ)生成物を、各穴にそれぞれ添加し、室温にて１０分間静置させた。その後、５０μLの中和緩衝剤を添加し、湿潤箱中で６５℃にて３０分間恒温保持した。その後、マイクロタイタープレートを３００μLの洗浄緩衝剤を用いて５回洗浄した。１００μLのアビジンマイクロスフェアを、各穴にそれぞれ添加し、３７℃にて３０分間恒温保持した。恒温保持後、プレートを取り出し、ＤＮＡ洗浄緩衝剤により５回洗浄した。ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度範囲の１２０μLのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を、各穴に添加し、室温にて１５〜６０分間静置した。ＤＴＴの添加により、アビジンの分子間Ｓ−Ｓ結合の還元／切断が生じて、マイクロスフェアが分解し、アビジンを溶液中に遊離させた。遊離したアビジン分子は、後工程の固相測定（ビオチン／アビジンモデル）のための分析物（"二次分析物"）となった。
【０１６６】
・ステップ２：固相直接測定Ｂ（ビオチン／アビジンモデル）
１００μLのＢＳＡ−ビオチン（２ng／μLのコーティング緩衝剤）を、Nunc Maxisorp 96-wellマイクロプレート（NuncはNunc Internationa, Rochester, NYの商標）上に直接コーティングし、０．１mol／Lカーボネート緩衝剤（ｐＨ９．６）中で４℃にて一晩保持した。洗浄緩衝剤（１０mM ＰＢＳ、０．１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ、０．５％(ｗ／ｖ)Tween−20（Tweenは商標））により３回濯いだ後、各穴を３００μLの１．０％ＢＳＡ溶液で３７℃にて半時間ブロッキングした。その後、マイクロプレートは４回洗浄され、"二次分析物"（アビジン）の対応する溶液を、各穴に投入した（１００μL／穴）。その後、このマイクロプレートを、再び３７℃にて１時間恒温保持した。非結合の二次分析物を洗い流した後、ビオチンＦＤＡマイクロスフェア懸濁液を、穴に投入し（１００μL／穴）、そしてマイクロプレートを、再び３７℃にて１時間恒温保持した。恒温保持後、過剰なビオチン−ＦＤＡマイクロスフェアを洗浄緩衝剤により洗い流した。その後、蛍光強度の測定のために、一定分量である１００μLの展開剤を各穴に投入した。
【０１６７】
上述から明らかなように、本発明は、多目的に利用でき有用である。このシステムは、簡単な化学／生化学と、常に穏やかな条件を利用する。調製時間は長くなく、かつ、増幅方式において、ＰＣＴに必要とされるような高度な技能を必要とせずに何倍もの増幅が得られる。
【０１６８】
マイクロスフェア技術は、限定はしないが、フロースルー装置、ミクロ流体装置及び側方流動装置を含む非常に多様な検出フォーマットに適用可能である。さらに、それは、ビーズ、磁気及び非磁気の双方、並びにマイクロタイターとともに用いることが可能である。
【０１６９】
別の応用では、免疫化学、組織学並びに、ウェスタン、サザン及びノーザンブロットにおけるシグナル分子の利用の分野があり、細胞構造の検出またはこれまで例えばＦＩＴＣ標識親和性分子が限られた分析感度でしか作用しなかったために検出不能であった更なる領域における検出のために応用される。
【０１７０】
本発明のシグナルマイクロスフェアの利用は、免疫化学、組織学及び検出技術の全ての多様な形態における新たな可能性を開くものである。旧式の検出原理を、数桁の大きさで極めて容易に改善することが可能である。
【０１７１】
このようにして、本発明はさらに、試料中の標的分子の検出及び／又は同定のための種々のテストキットを提供することができる。そのテストキットは、シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質をもつマイクロスフェアを有し、そのシグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、担体タンパク質との結合を維持する。そのマイクロスフェアは、標的分子の特異的認識及び標的分子に対する結合のために表面に親和性分子を担持するように構成されている。
【０１７２】
別のテストキットの様式ではさらに、マイクロスフェアの表面に結合するために適するように親和性分子を改変する試剤と、マイクロスフェアと親和性分子の間の結合反応を生じさせる試剤とを有する。
【０１７３】
別のテストキットの様式では、側方流動装置、フロースルー装置又は試験紙装置等の試験装置を有してもよく、それらの試験装置は、分析される流体試料が装置の吸収材の一端に添加されるタイプのものである。流体は、毛管力により他端へと浸透していく。任意であるが、他端に配置された吸引パッドにより浸透を促進してもよい。マイクロスフェア（シグナル生成物質を含む）により標識化された検出体抗体は、試験装置の始点にて過剰に、緩く結合させられる。
【０１７４】
シグナル生成物質は、蛍光色素、可視色素、生体発光若しくは化学発光材料、磁気材料、又は酵素とすることができる。
【０１７５】
試料からの抗原は、検出体抗体と相互作用して、マイクロスフェアとともに運ばれつつ装置の他端へと浸透していく。サンドイッチは、吸引パッド近傍の指標領域（ドット又はストライプ）における捕捉抗体により形成される。ここでは、捕捉抗体は、吸着材料に対して強固に結合しているので、浸透できない。
【０１７６】
試料中に分析物がより多く存在するほど、サンドイッチ構造がより多く形成され、より多くのマイクロスフェアが指標領域において結合する。シグナル生成物質は、シグナル前駆体分子の構造によって、種々の手順により活性化可能である。例えば、シグナル前駆体として用いられるＦＤＡについては、装置全体をアルカリ活性化溶液中に浸すか、または、アルカリ活性化剤を指標領域上に落とすことが可能である。
【０１７７】
（マイクロスフェアにより標識化された）検出体抗体の一部は、指標領域に結合せずに浸透し続ける。指標領域の後に配置された制御領域は、固相反応が適切に作用しているか否かを示す。
【０１７８】
サンドイッチ状の固相／膜をベースとする技術は、競合する測定原理を用いた低分子量物質について改変可能である。
【０１７９】
特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明に対して多様な改変を行ってもよい。
【符号の説明】
【０１８０】
１０、１０’、１０” 固体支持体
２０、２０’ マイクロスフェア
３０ 担体タンパク質
４０、４０’、４０” シグナル前駆体分子
５０、５０’、５０” 親和性分子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体タンパク質分子及びシグナル前駆体分子を有するタンパク質マイクロスフェアと、それらの製造方法に関し、さらにサンプル中の標的種の検出のためのそのようなマイクロスフェアのインビトロの生物検定（バイオアッセイ）における使用に関する。本発明はまた、光学的、磁気的、電気化学的または化学的方法を含むが、これらに限定されない検出技術を用いてインビトロの生物検定の感度レベルを向上させる方法に関する。検定方法、直接的かつ強力なシーケンシャルシグナル増幅法、及び種々のテストキットもまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
本発明のタンパク質マイクロスフェアの生物検定分野における応用において、タンパク質マイクロスフェアは、試料中の標的分子を特異的に認識しかつ結合する表面親和性分子を担持する。酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、免疫凝集アッセイ、または、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは遺伝子検定等の生物検定は周知であり、研究、人間及び家畜の診断分野、法医学的診断、環境分析、食物分析、並びに、大気中若しくは水中における危険物質の生物テロ防御における分析物の検出に重要な役割を果たしている。
【０００３】
生物検定は、少なくとも１つの標識生体分子と、検出対象の分析物（標的）との相互作用に基づく。標識は、相互作用を"視覚化"する手段である。多様な種類の標識が知られており、上述の種々の技術に対してそれらの名称を付与している。すなわち、ＥＬＩＳＡにおける酵素、ＲＩＡにおける放射性アイソトープ、ＦＩＡにおける蛍光物質、または、ウェスタン、サザン若しくはノーザンブロットにおける特定の標識である。
【０００４】
生物検定における最も重要な要請は、分析特異性と分析感度である。分析特異性は、親和性分子すなわち生体認識分子により決定される。例えば、抗体のその抗原（分析物）に対する結合部位の適合性、あるいは、２つの相補的核酸鎖のハイブリダイゼーションである。生物検定の分析感度も、その標的種との生体相互作用の親和性定数により、生体認識分子による影響を受ける。標識は、標識と親和性分子の間で生じた反応を示すマーカーとして機能し、種々の技術により測定可能である。
（i）色素の吸収若しくは蛍光体により放射された蛍光、発光体若しくは化学発光化合物により放射された発光の計測、または、凝集ラテックス粒子の光散乱による混濁度の計測による光学的測定
（ii）放射性同位体の計測による放射能測定
（iii）化学伝達物質または電子活性物質の計測による電気化学的測定
（iv）磁力の計測による磁気的測定
（iv）質量変化の計測による圧電的測定
【０００５】
放射性同位体を標識として用いた放射免疫測定法は、未だに、最も感度のある方法と見られている。この非常に強力な技術は、１９５９年にYalowとBersonにより紹介され、分析化学、診断学及び薬学における新時代を象徴した。それにもかかわらず、この技術は、使用される放射性同位体故に人間及び環境を汚染するリスクを完全には排除できないという欠点がある。
【０００６】
一方、非放射能法が発達してきて、匹敵する分析感度に到達する目標をもって改良されてきた。蛍光、発光及び吸収スペクトロスコピーに基づく光学的方法の重要性は、継続的に強化されてきており、なお成長し続けている。
【０００７】
ＥＬＩＳＡ技術は、シグナルを増幅するために酵素をマーカーとして用いる。生物検定が実行されると、分析物とプローブの生物相互作用が、酵素マーカー分子による大量の色素分子の生成によって増幅される。グルコースオキシダーゼ（GOD，EC 1.1.3.4）、アルカリホスフォターゼ（AP, EC 3.1.3.1）またはパーオキシダーゼ（POD, EC 1.11.1.7）等の酵素は、基質分子の１秒当たりの代謝回転数がそれぞれ２０００、５０００及び１００００で使用可能である。ＥＬＩＳＡ技術の欠点は、手順に含まれるステップが極めて多いことと、基質培養に長時間を要することである。
【０００８】
蛍光法もまた、長年生物検定に採用されてきており、高い関心が持たれ続けている。全ての蛍光をベースとする技術は、良好な感度と１０−８〜１０−１８Ｍの低い検出限界を確保している。例えば"時間分解蛍光法"、化学及び生物発光法、またはドナー分子とアクセプタ分子の間のエネルギー転換に基づく技術等の特殊な技術では、１０−１５〜１０−１８Ｍの検出限界に達することができる。
【０００９】
従来知られている蛍光免疫測定法は、反応性の官能性リンカー基をもつ低分子量蛍光標識（非特許文献１、２、３）と、蛍光性の色素着色粒子（特許文献１、２、３）または蛍光体添加(スパイク)デンドリマー（特許文献４）を用いる。
【００１０】
免疫測定法におけるシグナル増幅のためにマーカー負荷リポソームを用いることも知られている（特許文献５、６、７）。実際には、これらの方法の感度は、溶液形態にてリポソーム中に導入できるマーカー物質の量により制限される。標識リポソームを用いる更なる欠点は、リポソームの安定性の限界である。
【００１１】
上述の通り、生物検定の進展においては、非常に高い分析感度を実現することが重要であり、分析物濃度の所与の変化に対するシグナル応答の大きさ（キャリブレーション曲線の勾配）として規定される。免疫化学的定量においては、サンドイッチタイプ測定であれ競合タイプ測定であれ、分析感度は、濃度領域に依存する。
【００１２】
分析感度に影響を及ぼす別の２つの要因は、定量に必要なサンプル量と、結果を得る全体の反応時間である。サンプル量が多くなるほど、かかる全体反応時間も長くなり、検出可能かつ測定可能な分析物の濃度は低くなる。しかしながら、多くの実際の状況では、（例えば薬学的研究において）入手可能な十分なサンプル量がないか、または、（例えばミルク中の抗生物質残渣や空気中の生物テロ防御物質等）その成分が非常に大量のサンプル中に分散している。従って、入手可能な少量のサンプル中の非常に微量の物質を検出しかつ／または定量すること、あるいは、大量のサンプル体積中に非常に低濃度で分散した物質を検出しかつ／または定量することが、重要な挑戦となる。
【００１３】
結論として、適用される技術は、特に非常に低い濃度領域において高い分析感度を備えていなければならない。
【００１４】
非常に低い濃度領域における種々の既知の技術の分析感度を客観的に比較できるように、ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institute(臨床・検査標準協会）及び／またはＮＣＣＬＳ（米国臨床検査標準委員会））が３項目：ブランク上限（Limit of Bland（ＬｏＢ））、検出限界（Limit of Detection(ＬｏＤ)及び定量限界（Limit of Qantitation（ＬｏＱ）)を用いた分析感度を規定している。これらのパラメータのデータが評価され、種々の技術の間の比較に用いられる。
【００１５】
高分析感度を実現するために、シグナル増幅に効果のある異なる生体標識システムが開発された。例えば、酵素生体標識、有機微小結晶生体標識及び金コロイド標識等である。
【００１６】
酵素生体標識システムにおいては、酵素分子が光学的または電気化学的特性により基質を生成物に変換する。例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼによる高い代謝回転数により、あるいは、例えばアルカリホスファターゼによる非常に大きな線形酵素反応により、増幅を実現する膨大な量の生成物（シグナル）を生成することができる。
【００１７】
別の手法は、検定感度を向上させる検出シグナルを増幅するための、いわゆる"酵素サイクリング"技術である。
【００１８】
シグナル生成物質の固体粒子を用いた新しいクラスの標識は、特許文献８に開示されている。各固体粒子中に存在する億万個のシグナル生成分子は、"スーパーノバ効果"を生成するための遊離試薬に曝されると即座に遊離されることが可能である。
【００１９】
酵素システムのシグナル増幅原理は、バルク相中に遊離されているシグナルを生成するための酵素基質の変換に基づいている。固体粒子システムのシグナル増幅原理は、膨大なシグナル分子の反応チャンバのバルク相中での生成及び遊離に基づいている。しかしながら、バルク相へのシグナル分子の遊離は、シグナル分子濃度の部分的な希釈を生じて分析感度を劣化させる。
【００２０】
さらに、金コロイド標識を用いたシグナル増幅生物検定が知られている。非特許文献４は、金コロイドとそれに続く銀強化に基づくシグナル増幅法を報告している。それによれば、金コロイドが金粒子表面上への銀（Ｉ）の還元を促進することにより、多量の銀金属が金コロイド標識上に堆積することとなる。銀強化手法は、１リットル当たり５ナノモルまでの低い濃度のオリゴヌクレオチドを検出可能である。
【００２１】
増幅生物検定のための金コロイドを用いた別の手法は、金コロイドの生物親和性誘起凝集に基づいている。それは、裸眼で観察可能な赤色から青色への色変化を生じる。生物親和性誘起凝集の手法は、１リットル当たり１０フェムトモルの濃度レベルまでのオリゴヌクレオチドを検出可能である。金コロイド標識のシグナル増幅の原理は、集中した小体積中へのシグナル分子の蓄積すなわち凝集に基づいている。上述した標識システムのシグナル増幅性能と比較することにより、固体担体（例えば側方流装置）上の集中領域におけるシグナル分子蓄積（別の親和性分子による固定）による金コロイド増幅システムは、高い分析感度を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許第4,837,168号明細書
【特許文献２】米国特許第6,013,531号明細書
【特許文献３】国際公開WO95/08772公報
【特許文献４】独国特許第197 03 718号明細書
【特許文献５】米国特許第5,756,362号明細書
【特許文献６】米国特許第4,874,710号明細書
【特許文献７】米国特許第4,703,017号明細書
【特許文献８】欧州特許出願公開第1309867号公報
【００２３】
【非特許文献１】SOUTHWICK, P. L., et al., Cytometry, 11, pp. 418-430, 1990
【非特許文献２】MUJUMDAR, R. B., et al., Chemistry, 4, pp. 105-111, 1993
【非特許文献３】MUJUMDAR, R. B., et al., Cytometry, 10, pp. 11-19, 1989
【非特許文献４】T. Andrew Taton, Chad A. Mirkin, Robert L. Letsinger, "Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes", Science, 289(8) 1757-1760, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の一実施例は、優れた分析感度と、低検出限界と、さらに任意であるが、その手順を順次適用する繰り返しサイクル増幅によるシグナル検出の増強とを確保する、サンプル中の標的分子を検出するための方法を提供する。この手法は、既知の方法とは全く異なる。
【００２５】
本発明の別の実施例は、研究分野及び診断分野における標的分子の光学的、電気化学的または化学的検出のための種々のテストキットを提供する。
【００２６】
本発明の更に別の実施例は、生物検定において信頼性をもって調製可能でありかつ広範に適用可能である標識生体分子を提供する。それらは、好適には、人間及び動物の診断分野、法医学診断、環境分析、食物分析、生物テロ防御スクリーニング、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ゲノムの研究及び診断において適用可能なものである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
＜用語の定義＞
・親和性分子／生体認識分子
親和性分子は、それらの構造により若しくはそれらのポアサイズによりまたはそれらの電荷により、所定の親和力（アフィニティ定数／アビディティー定数）をもって特異的に別の物質を認識しかつ結合する物質である。
【００２８】
非常に多くの種々の親和性分子が存在する。それらには、所定の薬品クラスの物質と共に一般的に用いられるもの（例えば、ＩｇＧ抗体に対するタンパク質Ａ／Ｇ）、あるいは、唯一の物質に対する非常に特異的なもの（例えば、抗原に対する抗体、別のシーケンスに対するＤＮＡシーケンス、または、ビオチンに対するアビジン、基質に対する所定の酵素）がある。
【００２９】
・担体タンパク質（キャリアタンパク質）
担体タンパク質は、細胞内のＳ−Ｓ（硫黄−硫黄）結合を切断して分子間及び分子内のＳ−Ｓ結合の自己組織化形成を行わせることにより、主としてスポンジ状のマイクロカプセルの形態で関与する。分子間Ｓ−Ｓ結合は、タンパク質マイクロスフェアの構造整合性を担保する。
【００３０】
使用可能な担体タンパク質の例として、次のものが含まれる。
− 繊維状タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質等）
− 球状タンパク質
− 血清及び血漿から分離可能である血液タンパク質（例えば、ヘモタンパク質、輸送タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等）
− リポタンパク質
− 糖タンパク質
− 免疫系タンパク質（例えば、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、抗原等）
− 組換えタンパク質
− 遺伝子改変タンパク質
− 化学修飾タンパク質
− 合成タンパク質
− 種々のタンパク質の混合
− 栄養タンパク質（例えば、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質等）
− 酵素
− リボザイム
一般的に、人間、動物及び植物由来の含硫タンパク質、または、含硫ペプチド（合成ペプチドを含む）のいずれも使用できる。
【００３１】
・シグナル増幅
物理化学的に測定可能なシグナルを生じる２またはそれ以上の物質／反応パートナーの間の全ての反応である。
多くの場合、免疫化学的反応及びハイブリダイゼーション反応におけるシグナルは非常に弱く、測定が解析可能な結果を生じるに先立ってこのシグナルの増幅を行わなければならない。
【００３２】
増幅は、種々の方法及び技術により行うことができる。
【００３３】
本発明は、シグナル増幅マイクロスフェアを用いた単ステップ及びマルチステップの増幅手順の双方を提供する。マルチステップ増幅手順の一つでは、少なくとも１サイクルの増幅において、標的分子の特異的認識及びそれとの結合のために、シグナル生成有機物質の固体粒子を包含しかつ表面親和性分子を担持するカプセルを使用してもよい。特許文献８に開示されたタイプのものであり、特許文献８の開示をここに引用することにより包含する。
【００３４】
・マイクロスフェア
本発明のマイクロスフェアは、固体境界を有しておらず、その内部に延びる孔を備えたスポンジボールのようなものである。マイクロスフェアは、共有結合的に互いに結合するタンパク質分子のネットワークである。
【００３５】
マイクロスフェアは、沈殿したてのテンプレートにおける吸着性結合または共沈により、及び、分子内Ｓ−Ｓ結合の切断により形成される。得られた遊離したチオール基は、その後、新たな分子間及び分子内Ｓ−Ｓ結合を形成可能であり、分子間Ｓ−Ｓ結合はマイクロスフェア形成に寄与する。マイクロスフェアは、均一構造を有しており、特許文献８に開示されたような積層技術により形成されるカプセルのような層構造ではない。
【００３６】
マイクロスフェアは、１０nm〜１mmの間の、好適には４００nm〜１０μmの直径を有する。これらの境界値は、少なくとも部分的にはマイクロメートル領域の外側にあるが、簡便さのために、ここでの"マイクロスフェア"という用語は、本発明によるタンパク質分子のネットワークから形成された個々の粒子のことを称するために用いることとする。
【００３７】
・シグナル増幅マイクロスフェア
シグナル増幅マイクロスフェアは、担体タンパク質と、シグナル前駆体分子と、親和性分子とからなる。
シグナル増幅マイクロスフェアは、その表面上に、検出対象の物質（標的すなわち分析物）に対する特異的結合特性を備えている。
【００３８】
・マトリクス形成体
マトリクス形成体は、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ、オリゴ糖またはデキストリン等の多糖類などの材料である。共沈によりマイクロスフェアテンプレートを形成するために、担体タンパク質及び／またはシグナル前駆体分子と混合される。
【００３９】
・還元剤
還元剤は、マイクロスフェアテンプレート中のタンパク質分子内の分子内ジスルフィド結合を切断する材料であり、還元剤の例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
【００４０】
・マトリクス除去剤
マトリクス除去剤は、タンパク質マイクロスフェアを残してマイクロスフェアテンプレートからマトリクス形成体を除去するために用いられるキレート剤（ＥＤＴＡ）、酸または塩基等の材料である。
【００４１】
・シグナル前駆体分子
シグナル前駆体分子は、１または複数の他の試薬と反応したとき、測定可能なシグナルを生じる分子である。シグナル前駆体分子は、直接的または間接的なタイプが可能である。直接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子自体が、検出されるシグナルを生成するための活性化に応じて変化させられる。間接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子が、活性化に応じて別の種と反応し、この別の種が、検出されるシグナルを生成する要因となる。シグナル前駆体分子は、低分子量シグナル前駆体分子でも、高分子量シグナル前駆体分子でもよい。
【００４２】
・低分子量シグナル前駆体分子
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びその誘導体、発光体及びその誘導体、色素及びその誘導体、接合団、または、レドックスメディエーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００４３】
・高分子量シグナル前駆体分子
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００４４】
開始反応を介して測定可能なシグナルを生じる多様な化学薬品クラスからの非常に多くの多様な物質がある。測定可能なシグナルは、次のものに基づく。
− 蛍光分析
− 発光分析
− 紫外光、可視光、近赤外領域における色変化
− 酸化還元電位における変化
− 錯体形成または沈殿の間における質量の変化
【００４５】
・標的分子
この用語は、"分析物"と同意語である。この用語は、免疫測定等の分析手順において同定される物質すなわち化学成分を意味する。
【００４６】
＜発明の詳細な説明＞
第１の態様において、本発明は、シグナル前駆体分子と結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを提供する。シグナル前駆体分子は、担体タンパク質との結合を維持しつつ測定可能なシグナルを生成するために活性化可能である。
【００４７】
一実施例においては、マイクロスフェアがハイブリッド粒子またはヘテロ粒子であり、これは担体タンパク質とシグナル前駆体分子が異なることを意味する。別の実施例では、マイクロスフェアがホモ粒子であり、これは担体タンパク質とシグナル前駆体が同じであること意味する。
【００４８】
上述したように、シグナル前駆体分子は直接的または間接的なタイプとすることができる。直接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子自体が、検出されるシグナルを生成するために活性化に応じて変化させられる。間接シグナル前駆体の場合、シグナル前駆体分子は活性化に応じて別の種と反応し、この別の種が、検出されるシグナルを生成可能である。
【００４９】
好適には担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。このタンパク質は、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロットを含む生化学の応用に広く用いられている。これは良好な安定性を備えており、かつ、畜産業の副生成物としてウシ血液から大量のものを容易に精製できるため低コストにて入手可能である。
【００５０】
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００５１】
好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。
【００５２】
別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。
【００５３】
最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。
【００５４】
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００５５】
好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。
【００５６】
別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。
【００５７】
最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【００５８】
上述したマイクロスフェアは、１０nm〜１mmの範囲の、好適には４００nm〜１０μmの範囲の寸法を有する。マイクロスフェアの構造は、好適には実質的に均質である。すなわち、マイクロスフェアを形成する材料は実質的に均一に分散しており、粒子の本体全体に亘って実質的に均一な密度及び多孔度を有する。
【００５９】
マイクロスフェアは、微少なスポンジ又は綿毛ボールに似ており、認識できる境界を有してはいるが、境界を規定する硬い外殻をもつカプセルではない。
【００６０】
溶液中の標的に結合するためにマイクロスフェアが親和性分子と結合したとき、それらの親和性分子はマイクロスフェアに付着することになる。マイクロスフェアは親和性分子を有する、すなわち、親和性分子がマイクロスフェアの表面に直接に又はリンカー分子を介して接合されるか又は結合される、あるいは、吸着により結合または付着される。リンカー分子としては、限定しないが、例えばアビジン、ストレプタビジン、NeutrAvidin（商標）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン又は低分子量クロスリンカー等の生体分子を含む。しかしながら、幾つかの親和性分子は、マイクロスフェアの内部に拡散して、特別な場合にはそこでも付着することとなる。もちろん、このような拡散の程度は、親和性分子とマイクロスフェアの孔サイズの相対的寸法に依存することとなる。
【００６１】
マイクロスフェアに付着される親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【００６２】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【００６３】
第２の態様において、本発明は、本明細書で定義したマイクロスフェアの製造方法を提供する。マイクロスフェアはシグナル前駆体分子と結合した担体タンパク質を有する。シグナル前駆体分子は、検出可能なシグナルを生成するために、担体タンパク質との結合を維持しつつ活性化可能である。この方法は、担体タンパク質及びシグナル前駆体分子をマトリクス形成体と溶液中、好適には水溶液中で撹拌により混合し、小分子の還元剤を撹拌により添加し、小分子の還元剤を除去するために洗浄し、マトリクス除去剤を撹拌により添加し、かつ、マトリクス形成体を除去してシグナル前駆体分子と結合した担体タンパク質のマイクロスフェアを残すために洗浄するものである。
【００６４】
この方法は、水性試剤と共に水溶液中で、好適には室温にて行われることが好ましい。混合の好適方法は、磁気スターラーを用いた撹拌である。
【００６５】
マトリクス形成体の機能は、マイクロスフェアテンプレート中にタンパク質分子を補足することである。マトリクス形成体は、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ、または、オリゴ糖またはデキストラン等の多糖類とすることができる。カルシウムカーボネートは、好適には、担体タンパク質とシグナル前駆体分子と塩化カルシウムの混合溶液に、炭酸ナトリウム溶液を添加することにより形成される。
【００６６】
マイクロスフェアの大きさは、撹拌速度を制御することにより制御可能である。マイクロスフェアの密度は、担体タンパク質、シグナル前駆体分子、マトリクス形成体及び還元剤の相対的割合を調整することにより制御可能である。
【００６７】
前述の通り、マイクロスフェアは、ハイブリッド粒子でもよく、その場合、担体タンパク質とシグナル前駆体分子が異なってもよい。別の例として、担体タンパク質及びシグナル前駆体分子が同じでもよい。さらに、シグナル前駆体が、上述したように直接的でも間接的でもよい。
【００６８】
好適には、担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。
【００６９】
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００７０】
好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。
【００７１】
別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。
【００７２】
最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。
【００７３】
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００７４】
好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。
【００７５】
別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。
【００７６】
最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【００７７】
マイクロスフェアの製造方法は、さらに、親和性分子をマイクロスフェアの表面に付着させることを含む。親和性分子は、例えばファンデルワールス力、水素結合または静電相互作用によりマイクロスフェアの外面に接合させられる。あるいは、親和性分子が、直接に又はリンカー分子を介してマイクロスフェアの外面に共有結合させられる。間接的に結合する場合、リンカー分子としては、限定しないが、例えばアビジン、ストレプタビジン、NeutrAvidin（商標）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン又は低分子量クロスリンカー等の生体分子を含む。親和性分子は、マトリクス除去剤を添加するステップに先立って反応混合物に添加してもよい。
【００７８】
典型的な親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【００７９】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【００８０】
第３の態様において、本発明は、シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法であって、そのシグナル前駆体分子は担体タンパク質との結合を維持しつつ検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、そのマイクロスフェアは特異的認識のための親和性分子を表面上に有しかつその表面上で標的分子に結合する方法を提供する。その方法は、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持（インキュベーション）し、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有しないマイクロスフェアから分離し、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理し、かつ、
（ｄ）シグナルを検出または定量することを含む。
【００８１】
このようにして生成されるシグナルは、直接的にまたは間接的に、試料中の標的分子の量に関係する。さらに、シグナル前駆体分子がマイクロスフェア内で結合したままであり溶液中に解放されていないので、シグナルは局所化している。よって、シグナルの希釈がない。逆に、恒温保持ステップ中に形成される親和性分子と標的分子との各複合体に対して、活性化ステップ中に多数のシグナル前駆体分子が活性化されるので、シグナルは増幅される。
【００８２】
好適には、担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。
【００８３】
シグナル前駆体分子は、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。
【００８４】
好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。
【００８５】
別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。
【００８６】
最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。
【００８７】
高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。
【００８８】
好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。
【００８９】
別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。
【００９０】
最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【００９１】
親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【００９２】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【００９３】
マイクロスフェアの特に好適な形態は、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、かつ、シグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセイン二酢酸マレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）から選択されたものである。展開剤は、活性化ステップ中にこれらのフルオレセイン誘導体を"活性化"するために、例えばアルカリ性試薬による化学反応またはエステル分解酵素による生化学反応により、それらをフルオレセインに変換し、それにより検出可能なシグナルを生成するために適切なものである。別の例として、活性化ステップは、マイクロウェーブ加熱等の物理的手段により行ってもよい。
【００９４】
第４の態様として、本発明は、第１のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するための別のシグナル増幅方法であって、その第１のシグナル前駆体分子は担体タンパク質との結合を維持しつつ検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、そのマイクロスフェアは特異的認識のための親和性分子を表面上に有しかつその表面上で標的分子に結合する方法を提供する。その方法は、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持し、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有しないマイクロスフェアから分離し、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面に有するマイクロスフェアを、それらのマイクロスフェアを分解して第１のシグナル前駆体分子を遊離させるために遊離剤により処理し、かつ、
（ｄ）遊離された第１のシグナル前駆体分子を、その遊離された第１のシグナル前駆体分子に対して親和性をもつ第２の親和性分子により官能基化された別のバッチのマイクロスフェアにより処理し、その別のバッチのマイクロスフェアは第２のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有し、その第２のシグナル前駆体分子は担体タンパク質との結合を維持しつつ検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、
（ｅ）第２の親和性分子と第１のシグナル前駆体分子との複合体を表面に有するマイクロスフェアを、第２の親和性分子と第１のシグナル前駆体分子との複合体を表面に有しないマイクロスフェアから分離し、
（ｆ）分離した、第２の親和性分子と第１のシグナル前駆体分子との複合体を表面に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成する第２のシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理し、
（ｇ）シグナルを検出又は定量することを含む。
【００９５】
このように生成されたシグナルは、試料中の標的分子の量に関係する。シグナルは、２段階で数倍に増幅される。なぜなら、恒温保持ステップ（ａ）の間に形成された親和性分子と標的分子との各複合体については、ステップ（ｃ）で遊離された多数の第１のシグナル前駆体分子が存在し、それらは、第１のシグナル前駆体分子に対する親和性をもつように官能基化された別のバッチのマイクロスフェアとともに恒温保持されるからである。遊離された多数の第１のシグナル前駆体分子は、別のマイクロスフェアとの複合体を形成し、そして、遊離された第１のシグナル前駆体分子を複合体を形成しなかったマイクロスフェアを除去した後、多数の第２のシグナル前駆体分子を活性化するために活性化剤が添加され、複合化したマイクロスフェアの各々がシグナルを生成する。
【００９６】
このシグナル前駆体分子の遊離及び再複合化のサイクルは、極めて大きな増幅度を得るために多数回繰り返すことができるという点で有用である。言い換えるならば、ステップ（ｃ）〜（ｅ）は、ステップ（ｆ）及び（ｇ）を行う前に１回〜ｎ回繰り返すことができる。ｎは正の整数である。その場合、少なくとも最後の繰り返しサイクルにおけるシグナル前駆体分子が、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である。
【００９７】
標的分子は一次分析物となる。第１のシグナル前駆体分子は二次分析物となり、第２のシグナル前駆体分子は三次分析物となる。以下同様に続く。
【００９８】
変形例では、最後の繰り返しサイクルにおけるシグナル前駆体分子のみが、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であることが必要である。それより前のサイクルで遊離されるシグナル前駆体分子は、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である必要はなく、それらはアビジン等の分子に結合可能であるが、シグナル前駆体分子としてみなされない。なぜなら、それらは最終的にシグナルを導出する反応の連鎖の重要な部分だからである。
【００９９】
アビジンとビオチンのように、よく理解されかつ広く用いられる組合せを前駆体分子−親和性分子の対として用いることにより、特にこの方法のより後ろの段階においてすなわち検出され又は同定される特定の標的に適合させるために最初の標的分子と親和性分子の組合せが選択された後に用いることにより、この増幅プロセスに高い信頼度と確実性をもたせることができる。
【０１００】
最後の増幅ステップにおいて、最終のシグナル前駆体分子が最終のマイクロスフェア内で結合したままであり溶液中に遊離されていない場合は、シグナルが局所化されてもいてもよい。このことは、シグナルの希釈を最小とする。
【０１０１】
その一方、最終のシグナル前駆体分子をそれらの非遊離状態において検出することは重要ではない。遊離している場合は、それらを溶液中で検出することもできる。あるいは、別の増幅ステップを誘起させることもできる。例えば、高い代謝回転数をもつ酵素が最終のシグナル前駆体分子である場合、その酵素を蛍光又は発光のために基板上で作用させてもよい。別の例では、最終のシグナル前駆体分子としてカプセル化したＦＤＡを用いてもよい。水溶性の水酸化ナトリウム等の展開剤の添加により、ＦＤＡは解離し、加水分解しかつ多数のフルオレセイン分子を遊離することにより、増幅された蛍光シグナルをもたらす。
【０１０２】
好適には、少なくとも恒温保持ステップ（ａ）で用いられるマイクロスフェアについて、担体タンパク質が、限定しないが細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、限定しないがヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；限定しないがモノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される。さらに好適には、担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン等の血液中を循環するタンパク質である。
【０１０３】
同様に、少なくとも恒温保持ステップ（ａ）で用いられるマイクロスフェアについて、シグナル前駆体分子が、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、接合団、または、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質とすることができる。好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体である。別の例として、低分子量シグナル前駆体分子は、ピラゾロン、アントラキノン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質等の色素としてもよい。最も好適には、低分子量シグナル前駆体分子は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）等のフルオレセイン誘導体である。高分子量タンパク質シグナル前駆体分子は、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質及びリボザイムからなる群から選択された高分子量物質；または、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、組換えタンパク質、レクチン、アビジン、リポタンパク質及び糖タンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択されたペプチドまたはタンパク質とすることができるが、これらに限定するものではない。好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、ペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の親和性分子である。別の例として、高分子量シグナル前駆体分子は、パーオキシダーゼ、酸化還元酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び、タランスフェラーゼ等の酵素とすることができる。最も好適には、高分子量シグナル前駆体分子は、アビジン及びNeutr Avidin（商標）である。
【０１０４】
少なくとも恒温保持ステップ（ａ）で用いられるマイクロスフェアについて、親和性分子は、特定のペプチド及びタンパク質、核酸鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物等の生体認識分子でもよい。
【０１０５】
ペプチドまたはタンパク質は、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部でもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部でもよい。炭水化物の例としては、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部でもよい。低分子量リガンドは、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンでもよい。
【０１０６】
マイクロスフェアの特に好適な形態は、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、かつ、シグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセイン二酢酸マレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）から選択されたものである。展開剤は、活性化ステップ中にこれらのフルオレセイン誘導体を"活性化"するために、例えばアルカリ性試薬による化学反応またはエステル分解酵素による生化学反応により、それらをフルオレセインに変換し、それにより検出可能なシグナルを生成するために適切なものである。
【０１０７】
マイクロスフェアを分解してシグナル前駆体分子を遊離させる化学遊離剤は、低分子の還元剤でもよい。それらはマイクロスフェアのＳ−Ｓ結合（分子間及び分子内）を切断するために有効である。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、特に好適な遊離剤である。マイクロスフェアの分解はまた、音波、高温、光照射、又はｐＨ変化により行ってもよい。
【０１０８】
以下、本発明を、図面を例示としてのみ参照しつつ説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、本発明によるマイクロスフェアの製造技術を示した概略図である。
【図２】図２は、本発明の第１の態様におけるタンパク室マイクロスフェアの位相差顕微鏡写真である。
【図３】図３は、多孔度の異なるタンパク質マイクロスフェアの走査電子顕微鏡画像であり、上段の画像は22,000倍、下段の像は150,000倍を示している。
【図４】図４は、サンドイッチ生物検定におけるシグナルの蓄積及び局所化の作用原理を示した概略図である。
【図５】図５は、Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇ−α−ＭＩｇＧ）により官能基化されたＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアにおける固相サンドイッチ蛍光免疫測定の概略図である。
【図６】図６は、増幅サイクルの原理を示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
図１（ａ）は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、担体タンパク質及びシグナル前駆体分子の混合溶液を含む第１容器１００と、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）の溶液を含む第２容器２００とを示している。２つの容器の内容物は、即座に混合されることにより、タンパク質と例えばＢＳＡ−ＦＤＡであるシグナル前駆体分子とが、共沈によって、支持する炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）マイクロスフェアテンプレート３００内にトラップされる。
【０１１１】
図１（ｂ）は、次のステップで生じる事象を示している。トラップされたタンパク質と
シグナル前駆体分子をもつＣａＣＯ３マイクロスフェアテンプレート３００は、還元剤のジチオスレイトール（ＤＴＴ）により処理されることにより、タンパク質分子内の分子内ジスルフィド(Ｓ−Ｓ)結合の切断を生じる。その後、ＤＴＴは、何度も洗浄ステップを繰り返して除去される。新たな分子間及び分子内ジスルフィド結合が、タンパク質分子の間で形成される。新たに形成された分子間ジスルフィド結合は、シグナル前駆体分子も包含するマイクロスフェア２０中へのタンパク質分子の組み込みに寄与する。化学クロスリンカーの使用を必要とせずに、ＣａＣＯ３マイクロスフェアテンプレート材料は除去され、タンパク質／シグナル前駆体分子マイクロスフェア２０を残す。
【０１１２】
図２は、上記の手順に従って調製されたタンパク質マイクロスフェアの位相差顕微鏡写真である。マイクロスフェアは、大きさが均一にそろっており、平均からの偏りはほとんどない。さらに、マイクロスフェアが同じ表面電荷をもっていることにより、互いに付着しないことが重要である。互いに付着しないことは、図中に明確に示されている。さらに、大きさの分布が狭いことは、定量分析において重要である。
【０１１３】
図３は、濃度０．０１〜１mMの範囲のＤＴＴを用いて１５〜６０分間で調製されたＢＳＡマイクロスフェアのＳＥＭ顕微鏡画像を示している。得られたマイクロスフェアは直径がほぼ同程度であり、ＤＴＴ濃度が低下するにつれてマイクロスフェアの表面の粗さ及び孔の大きさが増している。
【０１１４】
より高いＤＴＴ濃度では、ＢＳＡ分子内の分子内ジスルフィド結合切断の度合いが多くなった。すなわち、タンパク質分子内の遊離したチオール基の数が増した。洗浄（繰り返し洗浄ステップを適用）によりＤＴＴを除去した後、ＢＳＡ分子内の遊離したチオール基は、新たな分子間及び分子内ジスルフィド結合を形成するために自己凝集させられた。分子間ジスルフィド結合は、タンパク質マイクロスフェアの形成に寄与し、マイクロスフェアは炭酸カルシウムテンプレートの除去後にも維持された。
【０１１５】
低濃度のＤＴＴを用いて調製されたマイクロスフェアは、分子間ジスルフィド結合の数が少なく、従って孔が多かった。
【０１１６】
図４は、本発明のマイクロスフェアを用いたサンドイッチ生物検定におけるシグナルの蓄積及び局所化の作用原理を示した概略図である。
【０１１７】
図４（ａ）では、表面に親和性分子５０を有する固体支持体１０が示されている。マイクロスフェア２０は、ここでは、シグナル前駆体分子４０に結合した担体タンパク質３０を包含するやや平たい円で示されている。これは概略図であって、図示の目的のみでマイクロスフェアに実線による境界を付与している点に注意されたい。さらに、担体タンパク質分子間のＳ−Ｓ結合（及び担体タンパク質分子とシグナル前駆体分子間の結合）のラインは、明確とするために省略している。実際には、マイクロスフェアは、明確な境界をもつカプセルではない。むしろそれは、その内部に延びかつ、均一に分布した互いに結合する担体タンパク質とシグナル前駆体分子により形成された多孔を有する小さなスポンジボールのようなものである。
【０１１８】
マイクロスフェア２０は、その表面上に付着する親和性分子５０を有する。
【０１１９】
標的分子すなわち分析物６０は、固体支持体１０条の親和性分子５０の１つのと、マイクロスフェア上の親和性分子５０の１つの間に挟まれ（サンドイッチされ）ている。固体支持体１０は、膜、マイクロタイタープレートの穴、磁気ビーズでもよく、またはより一般的には、免疫学的測定又はハイブリダイゼーション測定において用いられるいずれの固相プラットフォームでもよい。
【０１２０】
図４（ｂ）には、同じマイクロスフェア２０が示されており、２つの親和性分子５０の間の標的分子６０の"サンドイッチを介して固体支持体１０にまだ付着したままである。しかしながら、この図では、マイクロスフェア２０は、展開剤による処理後のものを示されており、小さな太陽の記号で示されるシグナル分子４０＊を有する。以前のこの箇所には、菱形で示されたシグナル前駆体分子４０を有していた。
【０１２１】
要するに、図４（ａ）はマイクロスフェアのスイッチオフを示し、一方、図４（ｂ）はマイクロスフェアのスイッチオンを示す。
【０１２２】
図示の目的のみのために、図４では、固体支持体１０上とマイクロスフェア２０の表面上に同じタイプの親和性分子５０を示している。しかしながら、ほとんどの実際の状況では、２つの親和性分子は、ポリクロナル抗体が用いられる場合か標的分析物が反復エピトープである場合を除いて同じではないであろう。
【０１２３】
実際に、多くのマイクロスフェア生体標識は、生物検定における個々の標的分析物に対して、その分析物（標的）の大きさ及びマイクロスフェアの大きさによって、特異的に結合するであろう。免疫学的測定においては、マイクロスフェア生体標識は、抗原標的分子のエピトープに対して特異的に結合することになる。ハイブリダイゼーション測定においては、マイクロスフェア生体標識は、特定のＤＮＡシーケンス標的分析物に対して結合することになる。
【０１２４】
展開剤の添加により、生体標識内の何百万ものシグナルを生成する前駆体分子が、高い蛍光性分子に変換し、それらの生体標識は局所化されたシグナルを点灯させかつ生成する。
【０１２５】
図５は、Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ）により官能基化されたＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアにおける固相サンドイッチ蛍光免疫測定を概略的に示している。
【０１２６】
図５（ａ）では、恒温保持ステップが示され、Ｇｔ−α−ＭＩｇＧが固体支持体に付着させられる。図５（ｂ）のステップでは、固体支持体上に結合したＧｔ−α−ＭＩｇＧが、標的種すなわち分析物、ＭＩｇＧを含む溶液に曝される。標的種は、結合したＧｔ−α−ＭＩｇＧにより捕捉される。洗浄ステップ（図示せず）により、捕捉されなかった標的種を除去する。図５（ｃ）のステップでは、表面上の親和性分子としてＧｔ−α−ＭＩｇＧにより官能基化されたＢＳＡ−ＦＤＡから形成されたマイクロスフェアを用いて、捕捉された標的種を処理することによりサンドイッチ測定が行われる。更なる洗浄ステップ（図示せず）において、捕捉された標的種に結合しなかったマイクロスフェアを洗浄除去する。図５（ｄ）のステップでは、展開剤が添加され、ＦＤＡがフルオレセインに加水分解されて、視覚化可能な局所化されたシグナルを生成する。
【０１２７】
図６は、増幅サイクルの原理を概略的に示している。
【０１２８】
図６（ａ）は、標的に相補的な核酸３０とマイクロスフェア２０’に接合した親和性分子５０’との間のサンドイッチハイブリダイゼーションにより、一端が固体支持体１０’に付着し他端がマイクロスフェア２０’に付着した１つの捕捉分子６０を示している。概略的に、捕捉分子６０は、標的に相補的な核酸３０及びマイクロスフェア２０’に接合した親和性分子５０’に対してハイブリダイズした標的核酸として示されている。
【０１２９】
図６（ｂ）は、マイクロスフェアを分解させる遊離剤による処理後のマイクロスフェアを示している。この図では、マイクロスフェアがちょうど分解し始めて、多数の二次分析物４０’（Ｘ）を溶液中に遊離している。二次分析物は、例えばアビジンでもよい。
【０１３０】
図６（ｃ）は、親和性分子５０”により異なる固体支持体１０”上に捕捉された二次分析物４０’を示している。二次分析物４０’がアビジンである例では、親和性分子５０”がアルブミン１２”に結合されるビオチンでもよい。この態様では、それは固体支持体１０”に付着することとなる。捕捉された二次分析物４０’は、固体支持体１０”に間接的に結合した親和性分子５０”と、別のマイクロスフェア２０”に結合した別の親和性分子５０”との間にサンドイッチされる。
【０１３１】
図６（ｄ）は、マイクロスフェア２０”を分解させる遊離剤による処理後のマイクロスフェア２０”を示している。この図では、マイクロスフェアはちょうど分解し始めて、多数の三次分析物４０”を遊離している。このように、１つの標的分子６０が、２回の増幅サイクル後には何十億もの三次分析物を生成可能である。必要であれば、更なる増幅サイクルを実行可能である。
【０１３２】
ここで、種々の実施例を参照して本発明を説明するが、これらに限定されないことを理解されたい。
【０１３３】
［実施例１］
［ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの調製］
・ステップ１：ＢＳＡフレームワークの形成
ＢＳＡ（１０mg／mL）を含む塩化カルシウム溶液（０．５mol／L）を、炭酸ナトリウム溶液（０．５mol／L）と速やかに混合した。
炭酸カルシウムが形成されるが、ほとんどわずかしか溶解しないため、炭酸カルシウムマトリクスのコア／内部にＢＳＡをトラップした。炭酸カルシウムは、ＢＳＡをトラップするためのテンプレートとして機能する。
【０１３４】
次のステップにて、ＢＳＡの分子内Ｓ−Ｓ結合の切断及び新たなＢＳＡ分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を行った。
【０１３５】
各ステップでは、数回の洗浄及び遠心分離のサイクルを行った。
【０１３６】
得られたＢＳＡ担持炭酸カルシウムマイクロスフェアを、ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液とともに１５〜６０分間、室温にて恒温保持した。続いて、ＢＳＡ担持炭酸カルシウムマイクロスフェアを、遠心分離（２０００rpm、２分間）と再分散のサイクルにより、緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５回洗浄した。
【０１３７】
ＤＴＴの添加により、ＢＳＡ中の分子内Ｓ−Ｓ結合の還元／切断を生じさせる一方、これらの洗浄ステップにおけるＤＴＴの除去によりＢＳＡ分子間の新たな分子内及び分子間のＳ−Ｓ結合を形成させてタンパク質をともに保持しかつマイクロスフェアを形成した。
【０１３８】
・ステップ２：ＢＳＡフレームワーク−マトリクスに対するシグナル分子の結合
再懸濁した炭酸カルシウム含有マイクロスフェアに対して、フルオレセイン二酢酸−５−イソチオシアネート（１mg/mL）を添加し、反応混合物を室温にて１時間恒温保持することにより、ＢＳＡアミノ基とフルオレセイン二酢酸のチオシアネートとの間に共有結合を形成させた。
【０１３９】
・ステップ３：ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの官能基化
シグナル分子を担持するマイクロスフェアに対するGoat-Anti-Mouse抗体の結合を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて行った。
【０１４０】
・ステップ３．１：親和性分子の溶液の調製
Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ）を含有する溶液を、ｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝液中にそれぞれ２mM及び５mMである１−エチル−３(３−ジメチルアミノプロピル)カーボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）に添加した。この溶液を、振動させつつ室温にて１５分間反応させた。
【０１４１】
・ステップ３．２：抗体によるマイクロスフェアの官能基化
１５分間の恒温保持の後、Goat-Anti-Mouse IgGを結合するために活性化された親和性分子の溶液を、予洗浄したＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの懸濁液に添加し、そして、混合物を振動させつつ室温にて２時間反応させた。ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアに結合した親和性分子の溶液を、１８００rpmにて２分間遠心分離した。
【０１４２】
・ステップ４：炭酸カルシウムテンプレートの除去
１０mLの０．２MのＥＤＴＡを、ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアの懸濁液に添加し、全体を５分間撹拌した。ＥＤＴＡ処理によりマイクロスフェアから炭酸カルシウムマトリクスを除去した。その後、反応混合物は、室温にて２分間３０００rpmで遠心分離に供した。上澄液が除去され、抗体官能基化ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアペレットが、２mLのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中にて再懸濁した。
【０１４３】
［実施例２］
［アルギン酸カルシウムマトリクス形成体を用いたＢＳＡフレームワークの形成］
ＢＳＡ（１０mg／mL）を含む塩化カルシウム溶液（０．５mol／L）を、アルギン酸ナトリウム溶液（０．５mol／L）と速やかに混合した。
【０１４４】
アルギン酸カルシウムが形成されるが、ほとんどわずかしか溶解しないため、アルギン酸カルシウムマトリクスのコア／内部にＢＳＡをトラップした。アルギン酸カルシウムは、ＢＳＡをトラップするためのテンプレートとして機能した。
【０１４５】
次のステップにて、ＢＳＡ分子内Ｓ−Ｓ結合の切断及び新たなＢＳＡ分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を行った。
【０１４６】
各ステップでは、数回の洗浄及び遠心分離のサイクルを行った。
【０１４７】
得られたＢＳＡ担持アルギン酸カルシウムマイクロスフェアを、ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液とともに１５〜６０分間、室温にて恒温保持した。続いて、ＢＳＡ担持アルギン酸カルシウムマイクロスフェアを、遠心分離（２０００rpm、２分間）と再分散のサイクルにより、緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５回洗浄した。
【０１４８】
ＤＴＴの添加により、ＢＳＡ中の分子内Ｓ−Ｓ結合を還元／切断させる一方、これらの洗浄ステップ中におけるＤＴＴの除去によりＢＳＡ分子間に新たな分子内及び分子間Ｓ−Ｓ結合が生じて、タンパク質をともに保持しかつマイクロスフェアを形成した。
【０１４９】
［実施例３］
［マウス−ＩｇＧの同定のためのサンドイッチタイプ測定］
マウスＩｇＧの同定を、サンドイッチタイプ測定において行った。同定の間、マウスＩｇＧは、２つの抗体の間に特異的に結合した。ポリクロナルgoat抗体を用いたので、これらの抗体は同じものとした。固相（例えば、マイクロタイタープレートの穴）は、Goat-Anti-Mouse IgG（Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ）抗体により吸着性をもつようにコーティングした。第２の抗体は、Goat-Anti-Mouse であり、ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェアに結合させた。この実施例は、図５に概略的に示されている。
【０１５０】
１００μLのＧｔ−α−ＭＩｇＧ（２ng／μLのコーティング緩衝液）をマイクロタイタープレートに移し、４℃にて一晩恒温保持した。その後、マイクロタイタープレートを、洗浄緩衝剤（１０mM ＰＢＳ、０．１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ、０．５％(ｗ／ｖ)Tween 20(Tweenは商標)）により３回洗浄した。その後、穴を、３００μLのポストコーティング溶液（ＰＣＳ）により３７℃にて３０分間ブロッキングした。異なる濃度（１〜１００μg／L）の１００μLのＭＩｇＧを、各穴にそれぞれ添加し、３７℃にて１時間恒温保持した。非結合ＭＩｇＧを洗い流した後、Ｇｔ−α−ＭＩｇＧ−｛ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェア｝の懸濁液を穴に投入した（１００μL／穴）。そして、マイクロタイタープレートを再び３７℃にて１時間恒温保持した。恒温保持後、過剰なＧｔ−α−ＭＩｇＧ−｛ＢＳＡ−ＦＤＡマイクロスフェア｝を洗浄緩衝剤により洗い流した。その後、１００μLの一定分量の遊離溶液を各穴に添加し、これらの穴を蛍光強度について測定した。
【０１５１】
［実施例４］
［アビジンマイクロスフェアの調製］
実施例４は、担体タンパク質と親和性結合する分子とが１つの同じ分子の場合である。
【０１５２】
・ステップ１：アビジンフレームワークの形成
アビジン（１０mg／mL）を含む塩化カルシウム溶液（０．５mol／L）を、炭酸ナトリウム溶液（０．５mol／L）と速やかに混合した。
【０１５３】
炭酸カルシウムが形成されるが、ほとんどわずかしか溶解しないので沈殿し、形成された結晶表面上にアビジンを引き寄せ／吸着した。炭酸カルシウムは、アビジンの沈殿のためのテンプレートとして機能した。
【０１５４】
次のステップは、アビジンの分子内Ｓ−Ｓ結合の切断及び分子間Ｓ−Ｓ結合の形成によるアビジンの架橋である。
【０１５５】
各ステップでは、数回の洗浄及び遠心分離のサイクルを行った。
【０１５６】
得られたアビジン担持炭酸カルシウムマイクロスフェアは、ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度範囲のジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液により室温にて１５〜６０分間恒温保持した。続いて、アビジン担持炭酸カルシウムマイクロスフェアを、遠心分離（２０００rpm、２分間）と再分散のサイクルにより、緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて５回洗浄した。
【０１５７】
ＤＴＴの添加により、アビジンの分子内Ｓ−Ｓ結合を還元／切断させる一方、これらの洗浄ステップ中のＤＴＴの除去によってアビジン分子間の分子内及び分子間Ｓ−Ｓ結合を生じさせることにより、タンパク質をともに保持しかつマイクロスフェアを形成する。タンパク質中の還元したＳＨ結合は、新たな分子内及び分子間Ｓ−Ｓ結合の自己組織化形成を行う。
【０１５８】
・ステップ２：シグナル分子の官能基化
これは、マイクロスフェアに対する親和性分子の共有結合のために、親和性結合する分子を存在させずに、遊離アミノ基、ＳＨ及びカルボキシル基をもつアビジンに対して特定の検出分子（親和性分子）を結合させることにより行う。
【０１５９】
アビジン含有マイクロスフェアの官能基化手順の詳細については、上述の実施例２を参照されたい。
【０１６０】
官能基化手順は、ストレプトアビジン又はNeutrAvidin（商標）等の脱グリコシルアビジンを用いると非常に簡易である。なぜなら、これらは、標的（分析物）認識分子すなわち親和性分子に対して直接結合するからである。ストレプトアビジン又はNeutrAvidin（商標）が用いられた場合、通常ビオンチン化された親和性分子、例えばビオチン化抗体が、ストレオプトアビジンのビオチンに対する強い結合力（Ｋが約１０１６）によりストレプトアビジン又はNeutrAvidin（商標）に対して直接結合される。ゆえに、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた化学結合は必要ない。
【０１６１】
・ステップ３：マイクロスフェアからの炭酸カルシウムの分離
これは、アビジンマイクロスフェアの懸濁液に対するＥＤＴＡ（０．２mol／L）の添加により行った。この手順後、アビジンシグナル前駆体マイクロスフェアが調製された。
【０１６２】
上述の実施例１のように、炭酸カルシウムを除去するステップは、官能基化ステップの前に行うこともできる。
【０１６３】
［実施例５］
［固相直接測定（倍増幅システム、ＤＮＡ測定モデル、しかる後のビオチン／アビジンモデル）］
これは、担体タンパク質及び親和性結合分子が１つで同じ分子である場合の例であり、新たなシグナル増幅サイクリング技術におけるその有用性を示す。この例は、図６に概略的に示されている。
【０１６４】
ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）のＤＮＡの同定を、サンドイッチタイプ測定において行った。ＨＰＶの同定中、ＤＮＡ鎖が、ビオチン化されたその相補的核酸に対して特異的にハイブリダイズした。その後、このハイブリダイゼーション生成物を、NeutrAvidin（商標）から調製されたマイクロスフェアと反応させた。アビジンマイクロスフェアを分解させる遊離剤を添加して、アビジンを溶液中に遊離させた。その後、遊離したアビジンを、後工程の固相直接測定における分析物として処理した。
【０１６５】
・ステップ１：固相直接測定Ａ（ＨＰＶ ＤＮＡモデル）
１００μLのＨＰＶプローブ（ＨＰＶ１６)を、マイクロタイタープレートの穴に移し、４℃にて一晩恒温保持した。その後、マイクロタイタープレートを３００μLの洗浄緩衝剤を用いて５回洗浄した。その後、穴を、３００μLのブロッキング溶液により３７℃にて３０分間ブロッキングした。その後、マイクロタイタープレートを３００μLの洗浄緩衝剤を用いて５回洗浄した。異なる希釈における、３０μLの１MのＮａＯＨ及び５０μLのＰＣＲ(ビオチン化ＨＰＶ−ウィルス−ＤＮＡ)生成物を、各穴にそれぞれ添加し、室温にて１０分間静置させた。その後、５０μLの中和緩衝剤を添加し、湿潤箱中で６５℃にて３０分間恒温保持した。その後、マイクロタイタープレートを３００μLの洗浄緩衝剤を用いて５回洗浄した。１００μLのアビジンマイクロスフェアを、各穴にそれぞれ添加し、３７℃にて３０分間恒温保持した。恒温保持後、プレートを取り出し、ＤＮＡ洗浄緩衝剤により５回洗浄した。ｐＨ７．５の０．０１〜１mMの濃度範囲の１２０μLのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を、各穴に添加し、室温にて１５〜６０分間静置した。ＤＴＴの添加により、アビジンの分子間Ｓ−Ｓ結合の還元／切断が生じて、マイクロスフェアが分解し、アビジンを溶液中に遊離させた。遊離したアビジン分子は、後工程の固相測定（ビオチン／アビジンモデル）のための分析物（"二次分析物"）となった。
【０１６６】
・ステップ２：固相直接測定Ｂ（ビオチン／アビジンモデル）
１００μLのＢＳＡ−ビオチン（２ng／μLのコーティング緩衝剤）を、Nunc Maxisorp 96-wellマイクロプレート（NuncはNunc Internationa, Rochester, NYの商標）上に直接コーティングし、０．１mol／Lカーボネート緩衝剤（ｐＨ９．６）中で４℃にて一晩保持した。洗浄緩衝剤（１０mM ＰＢＳ、０．１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ、０．５％(ｗ／ｖ)Tween−20（Tweenは商標））により３回濯いだ後、各穴を３００μLの１．０％ＢＳＡ溶液で３７℃にて半時間ブロッキングした。その後、マイクロプレートは４回洗浄され、"二次分析物"（アビジン）の対応する溶液を、各穴に投入した（１００μL／穴）。その後、このマイクロプレートを、再び３７℃にて１時間恒温保持した。非結合の二次分析物を洗い流した後、ビオチンＦＤＡマイクロスフェア懸濁液を、穴に投入し（１００μL／穴）、そしてマイクロプレートを、再び３７℃にて１時間恒温保持した。恒温保持後、過剰なビオチン−ＦＤＡマイクロスフェアを洗浄緩衝剤により洗い流した。その後、蛍光強度の測定のために、一定分量である１００μLの展開剤を各穴に投入した。
【０１６７】
上述から明らかなように、本発明は、多目的に利用でき有用である。このシステムは、簡単な化学／生化学と、常に穏やかな条件を利用する。調製時間は長くなく、かつ、増幅方式において、ＰＣＴに必要とされるような高度な技能を必要とせずに何倍もの増幅が得られる。
【０１６８】
マイクロスフェア技術は、限定はしないが、フロースルー装置、ミクロ流体装置及び側方流動装置を含む非常に多様な検出フォーマットに適用可能である。さらに、それは、ビーズ、磁気及び非磁気の双方、並びにマイクロタイターとともに用いることが可能である。
【０１６９】
別の応用では、免疫化学、組織学並びに、ウェスタン、サザン及びノーザンブロットにおけるシグナル分子の利用の分野があり、細胞構造の検出またはこれまで例えばＦＩＴＣ標識親和性分子が限られた分析感度でしか作用しなかったために検出不能であった更なる領域における検出のために応用される。
【０１７０】
本発明のシグナルマイクロスフェアの利用は、免疫化学、組織学及び検出技術の全ての多様な形態における新たな可能性を開くものである。旧式の検出原理を、数桁の大きさで極めて容易に改善することが可能である。
【０１７１】
このようにして、本発明はさらに、試料中の標的分子の検出及び／又は同定のための種々のテストキットを提供することができる。そのテストキットは、シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質をもつマイクロスフェアを有し、そのシグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、担体タンパク質との結合を維持する。そのマイクロスフェアは、標的分子の特異的認識及び標的分子に対する結合のために表面に親和性分子を担持するように構成されている。
【０１７２】
別のテストキットの様式ではさらに、マイクロスフェアの表面に結合するために適するように親和性分子を改変する試剤と、マイクロスフェアと親和性分子の間の結合反応を生じさせる試剤とを有する。
【０１７３】
別のテストキットの様式では、側方流動装置、フロースルー装置又は試験紙装置等の試験装置を有してもよく、それらの試験装置は、分析される流体試料が装置の吸収材の一端に添加されるタイプのものである。流体は、毛管力により他端へと浸透していく。任意であるが、他端に配置された吸引パッドにより浸透を促進してもよい。マイクロスフェア（シグナル生成物質を含む）により標識化された検出体抗体は、試験装置の始点にて過剰に、緩く結合させられる。
【０１７４】
シグナル生成物質は、蛍光色素、可視色素、生体発光若しくは化学発光材料、磁気材料、又は酵素とすることができる。
【０１７５】
試料からの抗原は、検出体抗体と相互作用して、マイクロスフェアとともに運ばれつつ装置の他端へと浸透していく。サンドイッチは、吸引パッド近傍の指標領域（ドット又はストライプ）における捕捉抗体により形成される。ここでは、捕捉抗体は、吸着材料に対して強固に結合しているので、浸透できない。
【０１７６】
試料中に分析物がより多く存在するほど、サンドイッチ構造がより多く形成され、より多くのマイクロスフェアが指標領域において結合する。シグナル生成物質は、シグナル前駆体分子の構造によって、種々の手順により活性化可能である。例えば、シグナル前駆体として用いられるＦＤＡについては、装置全体をアルカリ活性化溶液中に浸すか、または、アルカリ活性化剤を指標領域上に落とすことが可能である。
【０１７７】
（マイクロスフェアにより標識化された）検出体抗体の一部は、指標領域に結合せずに浸透し続ける。指標領域の後に配置された制御領域は、固相反応が適切に作用しているか否かを示す。
【０１７８】
サンドイッチ状の固相／膜をベースとする技術は、競合する測定原理を用いた低分子量物質について改変可能である。
【０１７９】
特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明に対して多様な改変を行ってもよい。
【符号の説明】
【０１８０】
１０、１０’、１０” 固体支持体
２０、２０’ マイクロスフェア
３０ 担体タンパク質
４０、４０’、４０” シグナル前駆体分子
５０、５０’、５０” 親和性分子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）タンパク質シグナル前駆体分子、または、
（ｉｉ）シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質のいずれかを有するマイクロスフェアであって、
前記マイクロスフェアは、タンパク質分子間の分子間結合を具備し、
前記マイクロスフェアは、
溶液中でタンパク質分子をマトリクス形成体と混合し、
混合物に還元剤を添加し、
還元剤を除去し、
マトリクス除去剤を添加し、かつ、
タンパク質分子のマイクロスフェアを残してマトリクスを除去する方法により形成される、マイクロスフェア。
【請求項２】
前記タンパク質シグナル前駆体分子が、標的に対して結合するための親和性分子である、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項３】
標的に対して結合するために、表面上に親和性分子をさらに有する、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項４】
前記シグナル前駆体分子が、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記マイクロスフェア内で結合を維持する、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項５】
前記担体タンパク質が、細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、ヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項６】
前記担体タンパク質が血液タンパク質である、請求項５に記載のマイクロスフェア。
【請求項７】
前記担体タンパク質がウシ血清アルブミンである、請求項５または６に記載のマイクロスフェア。
【請求項８】
前記シグナル前駆体分子が、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、酵素基質、接合団、若しくは、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質、または、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択された高分子量物質である、請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項９】
前記シグナル前駆体分子が蛍光体である、請求項８に記載のマイクロスフェア。
【請求項１０】
前記蛍光体が、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体からなる群から選択される、請求項８に記載のマイクロスフェア。
【請求項１１】
前記蛍光体が、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）からなる群から選択される、請求項１０に記載のマイクロスフェア。
【請求項１２】
前記シグナル前駆体分子が、色素である、請求項８に記載のマイクロスフェア。
【請求項１３】
前記色素が、シアニン、ピラゾロン、アントラキノン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質からなる群から選択される、請求項１２に記載のマイクロスフェア。
【請求項１４】
前記親和性分子が生体認識分子である、請求項２若しくは３または請求項２若しくは３に従属する請求項４〜１３のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項１５】
前記親和性分子が、ペプチド及びタンパク質、核酸の鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載のマイクロスフェア。
【請求項１６】
前記ペプチドまたはタンパク質が、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部からなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項１７】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部からなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項１８】
前記炭水化物が、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部からなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項１９】
前記低分子量のリガンドが、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンからなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２０】
前記親和性分子が、前記マイクロスフェアに対して直接またはリンカー分子を介して接合または結合する、請求項３に従属する請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２１】
前記親和性分子が、物理的吸着により前記マイクロスフェアに対して接合する、請求項３に従属する請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２２】
前記リンカー分子が、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシルアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチンまたは低分子量クロスリンカーである、請求項２１に記載のマイクロスフェア。
【請求項２３】
１０nm〜１mmの範囲の大きさである、請求項１〜２２のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項２４】
４００nm〜１０μmの範囲の大きさである、請求項２３に記載のマイクロスフェア。
【請求項２５】
前記タンパク質が担体タンパク質であり、前記マイクロスフェアが前記担体タンパク質に対してシグナル前駆体分子を結合させることにより形成されている、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項２６】
前記担体タンパク質及び前記シグナル前駆体分子が、共有結合、物理的吸着またはリンカー分子を介して結合している、請求項２５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２７】
前記担体タンパク質が、請求項５〜７のいずれかに規定された担体タンパク質である、請求項２５または２６に記載のマイクロスフェア。
【請求項２８】
前記シグナル前駆体分子が、請求項８〜１３のいずれかに規定されたものである、請求項２５〜２７のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項２９】
さらに、前記マイクロスフェアの表面に対して親和性分子を付着させるステップにより調製される請求項２５〜２８のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３０】
前記親和性分子が、物理的吸着または直接的な化学結合により前記マイクロスフェアに対して接合または結合している、請求項２９に記載のマイクロスフェア。
【請求項３１】
前記親和性分子が、リンカー分子を介して前記マイクロスフェアに対して接合または結合している、請求項２９に記載のマイクロスフェア。
【請求項３２】
前記リンカー分子が、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシルアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチンまたは低分子量クロスリンカーである、請求項３１に記載のマイクロスフェア。
【請求項３３】
前記親和性分子が、請求項１４〜１９のいずれかに規定されたものである、請求項２９〜３２のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３４】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ及びオリゴ糖または多糖類からなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３５】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウムである、請求項３４に記載のマイクロスフェア。
【請求項３６】
前記炭酸カルシウムが、炭酸ナトリウム溶液を、タンパク質と塩化カルシウム溶液の混合物に添加することにより形成される、請求項３５に記載のマイクロスフェア。
【請求項３７】
前記マトリクス除去剤が、キレート剤、ＥＤＴＡ、酸または塩基から選択される、請求項１〜３６のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３８】
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項１〜３６のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３９】
タンパク質分子をマトリクス形成体の溶液と混合するステップと、
前記混合物に還元剤を添加するステップと、
前記還元剤を除去するステップと、
前記マトリクスを除去してタンパク質分子のマイクロスフェアを残すステップと、を含む
タンパク質マイクロスフェアの調製方法。
【請求項４０】
前記マトリクスは、高温処理またはｐＨ変化から選択される物理的手段により除去される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マトリクスを除去するステップが、マトリクス除去剤を添加することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記マトリクス除去剤が、キレート剤、ＥＤＴＡ、酸又は塩基から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ及びオリゴ糖または多糖類から選択される、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウムである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記炭酸カルシウムが、タンパク質と塩化カルシウムの混合溶液に対して炭酸ナトリウム溶液を添加することにより形成される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質分子が、溶液中の標的に結合するための親和性分子である、請求項３９〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記タンパク質が、担体タンパク質であり、前記方法がさらに、シグナル前駆体分子を前記担体タンパク質に結合させることを含む、請求項３９〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記担体タンパク質及び前記シグナル前駆体分子が、共有結合、物理的吸着またはリンカー分子を介して結合されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記担体タンパク質が請求項５〜７のいずれかに規定されたものである、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記シグナル前駆体分子が請求項８〜１３のいずれかに規定されたものである、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
マイクロスフェアの表面に対して親和性分子を付着させるステップをさらに有する、請求項４８〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記親和性分子は、物理的吸着または直接的な化学結合により前記マイクロスフェアに対して接合または結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記親和性分子をリンカー分子を介してマイクロスフェアに対して接合または結合させることを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記リンカー分子が、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシルアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチンまたは低分子量クロスリンカーからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記親和性分子が請求項１４〜１９のいずれかに規定されたものである、請求項４７または５２〜５５のいずれかに記載された方法。
【請求項５７】
シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出する方法であって、前記シグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記担体タンパク質との結合を維持し、かつ前記マイクロスフェアはその表面上に前記標的分子を特異的に認識して前記標的分子に結合するための親和性分子を有しており、
（ａ）前記標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持するステップと、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するべく前記シグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理するステップと、
（ｄ）前記シグナルを検出または定量するステップと、を含む
標的分子の検出方法。
【請求項５８】
前記マイクロスフェアが請求項３または請求項３に依存する請求項４〜２４のいずれかに規定されたものである、請求項５７の方法。
【請求項５９】
前記担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、かつ、前記シグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）である、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記展開剤が塩基またはエステル分解酵素である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有する第１のマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法であって、前記シグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記担体タンパク質との結合を維持し、かつ前記マイクロスフェアはその表面上に前記標的分子を特異的に認識して前記標的分子に結合するための親和性分子を有しており、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持するステップと、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを分解して前記シグナル前駆体分子を遊離させるために処理するステップと、
（ｄ）前記遊離したシグナル前駆体分子に対して親和性をもつ別の親和性分子により官能基化され別のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有しかつ前記別のシグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記担体タンパク質との結合を維持している第２のマイクロスフェアにより、前記遊離したシグナル前駆体分子を処理するステップと、
（ｅ）別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｆ）分離した、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するべく前記別のシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理するステップと、
（ｇ）前記シグナルを検出または定量するステップと、を含む
シグナル増幅方法。
【請求項６２】
前記ステップ（ｆ）及び（ｇ）を行う前に、前記ステップ（ｃ）〜（ｅ）までを１回〜ｎ回（ｎは正の整数）繰り返すことをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有する第１のマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法であって、前記マイクロスフェアはその表面上に前記標的分子を特異的に認識して前記標的分子に結合するための親和性分子を有しており、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持するステップと、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを分解して前記シグナル前駆体分子を遊離させるために処理するステップと、
（ｄ）前記シグナル前駆体分子に対して親和性をもつ別の親和性分子により官能基化され別のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有する別のマイクロスフェアにより、前記遊離したシグナル前駆体分子を処理するステップと、
（ｅ）別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｆ）分離した、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するべく前記別のシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理するステップと、
（ｇ）前記シグナルを検出または定量するステップと、を含む
シグナル増幅方法。
【請求項６４】
前記ステップ（ｆ）及び（ｇ）を行う前に、前記ステップ（ｃ）〜（ｅ）までを１回〜ｎ回（ｎは正の整数）繰り返し、少なくとも最終繰り返しサイクルにおける前記シグナル前駆体分子が、検出可能なシグナルを生成するべく活性化可能である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記マイクロスフェアの分解が、化学的手段、物理的手段または熱的手段により行われる、請求項６１〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記マイクロスフェアの分解が、前記マイクロスフェアの分子間結合を切断する遊離剤を用いた化学的手段により行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記遊離剤が、マイクロスフェアのタンパク質分子間の分子間Ｓ−Ｓ結合を切断する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記遊離剤が、低分子還元剤である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記遊離剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記マイクロスフェアの分解が、音波、加熱、光照射、または、ｐＨ変化により行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも前記第１のマイクロスフェアが、請求項３または請求項３に従属する請求項４〜２４のいずれかに規定されているものである、請求項６１〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記増幅のサイクルのうちの少なくとも１つが、シグナル生成有機物質の固体粒子を包含しかつ標的分子を特異的に認識して結合する表面親和性分子を担持するカプセルを用いる、請求項６１〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも最終のマイクロスフェアにおいて、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でありかつシグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）である、請求項６２及び６４〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記展開剤が、塩基またはエステル分解酵素である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
試料中の標的分子の検出用のキットであって、請求項１または請求項４〜１３のいずれかに記載のマイクロスフェアを有し、前記シグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、前記マイクロスフェアは標的分子を特異的に認識して結合するための表面親和性分子を担持するように構成されている、検出用キット。
【請求項７６】
親和性分子がマイクロスフェアの表面に結合できるように親和性分子を修飾するための試薬と、マイクロスフェアと親和性分子の間の結合反応を行わせる試薬とをさらに有する、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
膜、マイクロタイタープレート、ビーズ、チューブ及びスライドからなる群から選択される固体基板を有する、請求項７５または７６に記載のキット。
【請求項７８】
シグナル前駆体分子が、蛍光色素、可視光色素、生物発光若しくは化学発光材料、磁気材料、または、酵素を含む、請求項７５〜７７のいずれかに記載のキット。
【請求項７９】
標的物質について、人間及び動物の診断分野、法医学診断、環境分析、食物分析、生物テロ防御スクリーニングにおける試料中の１または複数の標的分子の検出及び／または同定のための分析手順における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８０】
異成分からなる固相膜測定における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８１】
免疫組織化学における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８２】
特定のタンパク質領域、ＤＮＡ及びＲＮＡシーケンスの存在の視覚化のための、ウエスタン、ノーザン及びサザンブロット及びドット技術における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８３】
分析感度の増幅のための、請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８４】
実質的に図３に示された請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項８５】
実質的に実施例１に記載された請求項３９に記載のマイクロスフェアの調製方法。
【請求項８６】
実質的に図４及び図５に示された請求項５７に記載の、試料中の１または複数の標的分子の検出方法。
【請求項８７】
実質的に図６に示された請求項６１または６３に記載の、試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法。
【請求項１】
（ｉ）タンパク質シグナル前駆体分子、または、
（ｉｉ）シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質のいずれかを有するマイクロスフェアであって、
前記マイクロスフェアは、タンパク質分子間の分子間結合を具備し、
前記マイクロスフェアは、
溶液中でタンパク質分子をマトリクス形成体と混合し、
混合物に還元剤を添加し、
還元剤を除去し、
マトリクス除去剤を添加し、かつ、
タンパク質分子のマイクロスフェアを残してマトリクスを除去する方法により形成される、マイクロスフェア。
【請求項２】
前記タンパク質シグナル前駆体分子が、標的に対して結合するための親和性分子である、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項３】
標的に対して結合するために、表面上に親和性分子をさらに有する、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項４】
前記シグナル前駆体分子が、検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記マイクロスフェア内で結合を維持する、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項５】
前記担体タンパク質が、細胞骨格タンパク質若しくは細胞外マトリクスタンパク質を含む繊維状タンパク質；または、ヘモタンパク質、細胞吸着タンパク質を含む球状タンパク質若しくは血液タンパク質；モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体、栄養貯蔵／輸送タンパク質、シャペロンタンパク質若しくは酵素を含む輸送タンパク質、成長因子、レセプタータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫系タンパク質；または、遺伝子改変タンパク質；または、組換えタンパク質若しくは化学修飾タンパク質及び合成タンパク質から選択される、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項６】
前記担体タンパク質が血液タンパク質である、請求項５に記載のマイクロスフェア。
【請求項７】
前記担体タンパク質がウシ血清アルブミンである、請求項５または６に記載のマイクロスフェア。
【請求項８】
前記シグナル前駆体分子が、蛍光体及びそれらの誘導体、発光体及びそれらの誘導体、色素及びそれらの誘導体、酵素基質、接合団、若しくは、レドックスメディテーターから選択された酸化還元活性物質、電極活性物質からなる群から選択された低分子量物質、または、酵素及びそれらの前駆体、生物発光性及び蛍光発光性のタンパク質、核酸、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択された高分子量物質である、請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項９】
前記シグナル前駆体分子が蛍光体である、請求項８に記載のマイクロスフェア。
【請求項１０】
前記蛍光体が、フロオレセイン、シアニン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、ジアゾ色素ベースの蛍光物質、並びに、蛍光芳香族低分子及びヘテロ芳香族低分子等の蛍光体からなる群から選択される、請求項８に記載のマイクロスフェア。
【請求項１１】
前記蛍光体が、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、フルオレセイン二酢酸イソチオシアネート（ＦＤＡ−イソチオシアネート）またはフルオレセインマレイミド（ＦＤＡ−マレイミド）からなる群から選択される、請求項１０に記載のマイクロスフェア。
【請求項１２】
前記シグナル前駆体分子が、色素である、請求項８に記載のマイクロスフェア。
【請求項１３】
前記色素が、シアニン、ピラゾロン、アントラキノン、カーボシアニン、ローダミン、キサンテン、カロテノイド並びにジアゾ及びモノアゾ、オキサジン、インジゴイド、または、リボフラビンをベースとする染料物質からなる群から選択される、請求項１２に記載のマイクロスフェア。
【請求項１４】
前記親和性分子が生体認識分子である、請求項２若しくは３または請求項２若しくは３に従属する請求項４〜１３のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項１５】
前記親和性分子が、ペプチド及びタンパク質、核酸の鎖、炭水化物、低分子量かつ分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）をもつリガンド、または、これらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載のマイクロスフェア。
【請求項１６】
前記ペプチドまたはタンパク質が、モノクロナル抗体及びポリクロナル抗体を含む抗体、レセプター、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びアレルゲンまたはその一部からなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項１７】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー及びその一部からなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項１８】
前記炭水化物が、単糖、オリゴ糖、及び多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部からなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項１９】
前記低分子量のリガンドが、ビオチンまたはビオチン誘導体、ステロイドまたはホルモン、補因子または補酵素、活性化因子、抑制因子、酵素の擬基質または接合団基、ドラッグ、アレルゲンまたはハプテンからなる群から選択される、請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２０】
前記親和性分子が、前記マイクロスフェアに対して直接またはリンカー分子を介して接合または結合する、請求項３に従属する請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２１】
前記親和性分子が、物理的吸着により前記マイクロスフェアに対して接合する、請求項３に従属する請求項１５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２２】
前記リンカー分子が、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシルアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチンまたは低分子量クロスリンカーである、請求項２１に記載のマイクロスフェア。
【請求項２３】
１０nm〜１mmの範囲の大きさである、請求項１〜２２のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項２４】
４００nm〜１０μmの範囲の大きさである、請求項２３に記載のマイクロスフェア。
【請求項２５】
前記タンパク質が担体タンパク質であり、前記マイクロスフェアが前記担体タンパク質に対してシグナル前駆体分子を結合させることにより形成されている、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項２６】
前記担体タンパク質及び前記シグナル前駆体分子が、共有結合、物理的吸着またはリンカー分子を介して結合している、請求項２５に記載のマイクロスフェア。
【請求項２７】
前記担体タンパク質が、請求項５〜７のいずれかに規定された担体タンパク質である、請求項２５または２６に記載のマイクロスフェア。
【請求項２８】
前記シグナル前駆体分子が、請求項８〜１３のいずれかに規定されたものである、請求項２５〜２７のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項２９】
さらに、前記マイクロスフェアの表面に対して親和性分子を付着させるステップにより調製される請求項２５〜２８のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３０】
前記親和性分子が、物理的吸着または直接的な化学結合により前記マイクロスフェアに対して接合または結合している、請求項２９に記載のマイクロスフェア。
【請求項３１】
前記親和性分子が、リンカー分子を介して前記マイクロスフェアに対して接合または結合している、請求項２９に記載のマイクロスフェア。
【請求項３２】
前記リンカー分子が、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシルアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチンまたは低分子量クロスリンカーである、請求項３１に記載のマイクロスフェア。
【請求項３３】
前記親和性分子が、請求項１４〜１９のいずれかに規定されたものである、請求項２９〜３２のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３４】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ及びオリゴ糖または多糖類からなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３５】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウムである、請求項３４に記載のマイクロスフェア。
【請求項３６】
前記炭酸カルシウムが、炭酸ナトリウム溶液を、タンパク質と塩化カルシウム溶液の混合物に添加することにより形成される、請求項３５に記載のマイクロスフェア。
【請求項３７】
前記マトリクス除去剤が、キレート剤、ＥＤＴＡ、酸または塩基から選択される、請求項１〜３６のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３８】
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項１〜３６のいずれかに記載のマイクロスフェア。
【請求項３９】
タンパク質分子をマトリクス形成体の溶液と混合するステップと、
前記混合物に還元剤を添加するステップと、
前記還元剤を除去するステップと、
前記マトリクスを除去してタンパク質分子のマイクロスフェアを残すステップと、を含む
タンパク質マイクロスフェアの調製方法。
【請求項４０】
前記マトリクスは、高温処理またはｐＨ変化から選択される物理的手段により除去される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マトリクスを除去するステップが、マトリクス除去剤を添加することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記マトリクス除去剤が、キレート剤、ＥＤＴＡ、酸又は塩基から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、多孔性シリカ及びオリゴ糖または多糖類から選択される、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記マトリクス形成体が、炭酸カルシウムである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記炭酸カルシウムが、タンパク質と塩化カルシウムの混合溶液に対して炭酸ナトリウム溶液を添加することにより形成される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質分子が、溶液中の標的に結合するための親和性分子である、請求項３９〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記タンパク質が、担体タンパク質であり、前記方法がさらに、シグナル前駆体分子を前記担体タンパク質に結合させることを含む、請求項３９〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記担体タンパク質及び前記シグナル前駆体分子が、共有結合、物理的吸着またはリンカー分子を介して結合されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記担体タンパク質が請求項５〜７のいずれかに規定されたものである、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記シグナル前駆体分子が請求項８〜１３のいずれかに規定されたものである、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
マイクロスフェアの表面に対して親和性分子を付着させるステップをさらに有する、請求項４８〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記親和性分子は、物理的吸着または直接的な化学結合により前記マイクロスフェアに対して接合または結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記親和性分子をリンカー分子を介してマイクロスフェアに対して接合または結合させることを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記リンカー分子が、アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシルアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチンまたは低分子量クロスリンカーからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記親和性分子が請求項１４〜１９のいずれかに規定されたものである、請求項４７または５２〜５５のいずれかに記載された方法。
【請求項５７】
シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有するマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出する方法であって、前記シグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記担体タンパク質との結合を維持し、かつ前記マイクロスフェアはその表面上に前記標的分子を特異的に認識して前記標的分子に結合するための親和性分子を有しており、
（ａ）前記標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持するステップと、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するべく前記シグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理するステップと、
（ｄ）前記シグナルを検出または定量するステップと、を含む
標的分子の検出方法。
【請求項５８】
前記マイクロスフェアが請求項３または請求項３に依存する請求項４〜２４のいずれかに規定されたものである、請求項５７の方法。
【請求項５９】
前記担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、かつ、前記シグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）である、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記展開剤が塩基またはエステル分解酵素である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有する第１のマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法であって、前記シグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記担体タンパク質との結合を維持し、かつ前記マイクロスフェアはその表面上に前記標的分子を特異的に認識して前記標的分子に結合するための親和性分子を有しており、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持するステップと、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを分解して前記シグナル前駆体分子を遊離させるために処理するステップと、
（ｄ）前記遊離したシグナル前駆体分子に対して親和性をもつ別の親和性分子により官能基化され別のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有しかつ前記別のシグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能である一方、前記担体タンパク質との結合を維持している第２のマイクロスフェアにより、前記遊離したシグナル前駆体分子を処理するステップと、
（ｅ）別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｆ）分離した、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するべく前記別のシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理するステップと、
（ｇ）前記シグナルを検出または定量するステップと、を含む
シグナル増幅方法。
【請求項６２】
前記ステップ（ｆ）及び（ｇ）を行う前に、前記ステップ（ｃ）〜（ｅ）までを１回〜ｎ回（ｎは正の整数）繰り返すことをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
シグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有する第１のマイクロスフェアを用いて試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法であって、前記マイクロスフェアはその表面上に前記標的分子を特異的に認識して前記標的分子に結合するための親和性分子を有しており、
（ａ）標的分子を前記マイクロスフェアとともに恒温保持するステップと、
（ｂ）親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｃ）分離した、親和性分子と標的分子の複合体を表面上に有するマイクロスフェアを分解して前記シグナル前駆体分子を遊離させるために処理するステップと、
（ｄ）前記シグナル前駆体分子に対して親和性をもつ別の親和性分子により官能基化され別のシグナル前駆体分子に結合した担体タンパク質を有する別のマイクロスフェアにより、前記遊離したシグナル前駆体分子を処理するステップと、
（ｅ）別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有しないマイクロスフェアから分離するステップと、
（ｆ）分離した、別の親和性分子とシグナル前駆体分子との複合体を表面上に有するマイクロスフェアを、シグナルを生成するべく前記別のシグナル前駆体分子を活性化するために展開剤により処理するステップと、
（ｇ）前記シグナルを検出または定量するステップと、を含む
シグナル増幅方法。
【請求項６４】
前記ステップ（ｆ）及び（ｇ）を行う前に、前記ステップ（ｃ）〜（ｅ）までを１回〜ｎ回（ｎは正の整数）繰り返し、少なくとも最終繰り返しサイクルにおける前記シグナル前駆体分子が、検出可能なシグナルを生成するべく活性化可能である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記マイクロスフェアの分解が、化学的手段、物理的手段または熱的手段により行われる、請求項６１〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記マイクロスフェアの分解が、前記マイクロスフェアの分子間結合を切断する遊離剤を用いた化学的手段により行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記遊離剤が、マイクロスフェアのタンパク質分子間の分子間Ｓ−Ｓ結合を切断する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記遊離剤が、低分子還元剤である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記遊離剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記マイクロスフェアの分解が、音波、加熱、光照射、または、ｐＨ変化により行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも前記第１のマイクロスフェアが、請求項３または請求項３に従属する請求項４〜２４のいずれかに規定されているものである、請求項６１〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記増幅のサイクルのうちの少なくとも１つが、シグナル生成有機物質の固体粒子を包含しかつ標的分子を特異的に認識して結合する表面親和性分子を担持するカプセルを用いる、請求項６１〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも最終のマイクロスフェアにおいて、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でありかつシグナル前駆体分子がフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）である、請求項６２及び６４〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記展開剤が、塩基またはエステル分解酵素である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
試料中の標的分子の検出用のキットであって、請求項１または請求項４〜１３のいずれかに記載のマイクロスフェアを有し、前記シグナル前駆体分子は検出可能なシグナルを生成するために活性化可能であり、前記マイクロスフェアは標的分子を特異的に認識して結合するための表面親和性分子を担持するように構成されている、検出用キット。
【請求項７６】
親和性分子がマイクロスフェアの表面に結合できるように親和性分子を修飾するための試薬と、マイクロスフェアと親和性分子の間の結合反応を行わせる試薬とをさらに有する、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
膜、マイクロタイタープレート、ビーズ、チューブ及びスライドからなる群から選択される固体基板を有する、請求項７５または７６に記載のキット。
【請求項７８】
シグナル前駆体分子が、蛍光色素、可視光色素、生物発光若しくは化学発光材料、磁気材料、または、酵素を含む、請求項７５〜７７のいずれかに記載のキット。
【請求項７９】
標的物質について、人間及び動物の診断分野、法医学診断、環境分析、食物分析、生物テロ防御スクリーニングにおける試料中の１または複数の標的分子の検出及び／または同定のための分析手順における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８０】
異成分からなる固相膜測定における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８１】
免疫組織化学における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８２】
特定のタンパク質領域、ＤＮＡ及びＲＮＡシーケンスの存在の視覚化のための、ウエスタン、ノーザン及びサザンブロット及びドット技術における請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８３】
分析感度の増幅のための、請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロスフェアの使用。
【請求項８４】
実質的に図３に示された請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項８５】
実質的に実施例１に記載された請求項３９に記載のマイクロスフェアの調製方法。
【請求項８６】
実質的に図４及び図５に示された請求項５７に記載の、試料中の１または複数の標的分子の検出方法。
【請求項８７】
実質的に図６に示された請求項６１または６３に記載の、試料中の１または複数の標的分子を検出するためのシグナル増幅方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２９６４４（Ｐ２０１２−５２９６４４Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１４５３１（Ｐ２０１２−５１４５３１）
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１１４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４２９６０
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５１１２９０９７２）スーパーノヴァ・ダイアグノスティクス、インコーポレイティド (2)
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１１４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４２９６０
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５１１２９０９７２）スーパーノヴァ・ダイアグノスティクス、インコーポレイティド (2)
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