ステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する新植物
【課題】 ステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子、新品種に属する植物、この植物体の乾燥葉から得られる甘味料および甘味料の製造方法を提供する。
【解決手段】 ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子、新植物、この植物の乾燥葉から製造される甘味料および甘味料の製造方法。
【解決手段】 ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子、新植物、この植物の乾燥葉から製造される甘味料および甘味料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高いレバウディオサイドＡの含有率を示す葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子、種子栽培が可能なステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物およびそれから得られる甘味料、甘味料の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Ｓtevia Ｒebaudiana Ｂertoni)という。ステビアは砂糖の３００倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。
【０００３】ステビアの甘味成分としては、ステビオサイド(Ｃ38Ｈ60Ｏ18、分子量８０４)、レバウディオサイドＡ(Ｃ44Ｈ70Ｏ23、分子量９６６)、レバウディオサイドＣ、Ｄ、Ｅ、ズルコサイドＡ等が知られている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステビオサイド(ＳＴ)が主成分でレバウディオサイドＡ(ＲＡ)の含有量はステビオサイドの１０分の３〜４程度、レバウディオサイドＣの含量はそれよりやや少ないが、品種によってはレバウディオサイドＡ、及びＣを含まないもの、更にレバウディオサイドＣを主成分とするものなど種々である。
【０００４】渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも甘みの質は非常に微妙である。ステビオサイドは砂糖の３００倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工業界で用いられている。その甘味は比較的砂糖に似ているが、苦み等の不快味が後味に残るという欠点がある。それゆえステビオサイドを多量に含むことは甘味料として好ましいことではない。これに対して、レバウディオサイドＡは良質の甘味質とステビオサイドの１.３倍〜１.５倍の甘味度を有する。
【０００５】本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返し品種改良を行い、ステビオサイド（ＳＴ）に対してレバウディオサイドＡ（ＲＡ）が高い含有比率を示すステビア品種を得、これらの植物から甘味成分を抽出しステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比の高い優れた甘味料を製造してきた（特開昭５９−０４５８４８号および特開昭６１−２０２６６７号）。
【０００６】しかし、これらの品種の種子から栽培された植物はレバウディオサイドＡの含有比率が低下する。例えば、甘味成分比ＳＴ：ＲＡ＝１：４の品種の種子から栽培された植物はＳＴ：ＲＡ＝１：１〜１.５程度の成分比に低下する。従って、レバウディオサイドＡの高含有比を保つ為には挿し木育苗に頼らなければならなかった。さらに、ステビア・レバウディアナ・ベルトニーは自家不和合性であり、収穫された種子は常に発芽するとは限らない。すなわち、発芽率が非常に低い。これらの理由により、レバウディオサイドＡを高い比率で含有するステビアはこれまで挿し木増殖されてきており、当業者は種子によって栽培することを考えなかった。
【０００７】しかし、挿し木育苗は母木から得られる挿穂の数が限られる為に母木の大量確保、一時(いっとき)に大量育苗が困難という欠点がある。本発明者らは、これらの欠点を改良するために、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの高い含有比を維持しながら、かつ種子栽培が可能なステビア属の新品種の開発を鋭意行ってきた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そして、レバウディオサイドＡを高い比率で含む遺伝子を有し、かつ種子増殖によりこの遺伝子を次の世代に優勢に伝達し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーを選抜固定して本発明を完成した。従って、本発明の第１の態様は、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子である。そして、本発明の第２の態様であるこの栽培用種子から栽培された植物体の葉は甘味料の製造に用いられる。
【０００９】本発明の第３の態様は、種子による栽培が可能である、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む、ステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物である。
【００１０】本発明の第４の態様は、このステビア・レバウディアナ・ベルトニー新品種に属する植物の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料である。
【００１１】本発明の第５の態様は、このステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する新植物の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料の製造方法である。
【００１２】本発明のステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物は下記の表１に記載のプロトコルに従って育成された。なお、親植物であるＳＦ３品種の種子は発明者が所有しており、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて分譲が保証されている。
【表１】
【００１３】本発明の新品種に属する植物の育成特開昭６１−２０２６６７号に記載のＳＦ３間での交配より得られた種子より２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含む株(ＳＦ３級)を選抜し、更に交配・選抜を繰り返し、２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含む株(ＳＦ３級)のみによる交配の結果、セプトリア菌に対する耐病性が優れている株ＳＦ５−１（１０３号）および甘味成分含量が優れている株ＳＦ５−２号（１０９号）を選抜した。１０３、１０９号から得られた種子を用いて栽培することにより、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する株が８割以上得られ、ほぼ安定した。なお、ＳＦ３と１０３号並びに１０９号を用いて交配させたが、ＳＦ３に結実した種子を用いての栽培では安定した成分比率を持った株は得られなかった。
【００１４】
【発明の実施の形態】
ステビア栽培方法播種床を準備し、下部は水捌けの良い細かな土、または砂を入れ、少量の肥料分を加えると更に良い。上部には１０メッシュ程度のより細かな土、またはＳＳサイズのバーミキュライトなどを重ねた後、十分に散水して湿らせる。播種床の温度は播種するまでに２０℃〜２５℃に保っておく。種子は冠毛をつけた状態でも良いが、土との密着性を高めるために冠毛を取り除いた方が望ましい。
【００１５】種子は水に一昼夜浸けた後、分散性を高めるために１０メッシュ程度のできるだけ細かな土、またはＳＳサイズのバーミキュライト(Vermiculite、旭工業(株))などと混合して撒く。播種した後十分散水して種子を落ち着かせた後、直射日光を避けるために寒冷沙で被覆し、表面の湿度を保ち、発芽させる。発芽までの日数は７〜１４日要するが、発芽が遅い場合、あるいは温度が低い場合はそれ以上にかかることもある。
【００１６】発芽が終了するまでの間は温度管理、水分管理には十分注意が必要である。発芽後、徐々に日光を当て、必要に応じて希釈した液体肥料を与える。仮植する場合には苗が２〜３cm程度になった時仮植する。播種床として育苗ポット、育苗トレーなどを用いた場合は仮植する必要はない。
【００１７】苗が１０cm前後に成長した時点で圃場に移植する。圃場は予め施肥すると共に植え付け本数に応じた畝を作っておく。１ヘクタール当たりの植え付け本数は１０〜１５万本程度が望ましいが、必要に応じて増減しても良い。
【００１８】施肥量は圃場の肥沃度により異なるが一応の目安として１ヘクタール当たりチッソ、リンサン、カリの各成分２００Ｋg程度である。移植後、十分に散水し、根と土の密着を助けると共に、移植痛みを少なくする。低緯度地域においては成育期間の早期に開花する場合があるが、着蕾し、開花現象が見られた場合には摘心を行う。成育期間中は除草、水分管理すると共に、必要に応じて追肥を行い、高温多湿の時期には殺菌剤の散布を行う。
【００１９】丈が３０cm程度以上に成長した以降に着蕾、開花が見られた時は下葉を３〜５対を残して収穫する。収穫後、葉を分離し、又は草型のまま天日乾燥、または熱風乾燥する。葉部分は枝、茎と分け、葉部分は乾燥葉として甘味料原料とする。
【００２０】試料調製乾燥葉２０ｇを１０〜２０倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ）２０mlを充填したカラム、及び陰イオン交換樹脂（デュライトＡ−４）２０mlを充填したカラムにゆっくりと通し、通過液を吸着樹脂（アンバーライトＸＡＤ−２）１００mlを充填したカラムに通して、甘味成分を吸着させ、十分水洗後、水をきりメタノール３００mlで甘味成分を溶離する。溶離液を減圧下で濃縮し、更に減圧乾燥して淡黄色の粉末を得る。
【００２１】分析方法１）高速液体クロマトグラフィー法甘味料粉末を溶離液に溶解してカラムに入れる。
カラム充填剤 リクロソルブＮＨ2 ５μ流速 １.５ml／min溶離液 アセトニトリル：水＝８０：２０測定波長 ２１０nm２）薄層クロマトグラフィー法甘味料粉末を水に溶解して薄層プレートにおく。
測定機種 島津クロマトスキャナー９１０型薄層プレート メルク社シリカゲル６０Ｆ２５４展開溶媒 クロロホルム：メタノール：水＝３０：２０：４発色剤 ５０％硫酸測定法 反射ジグザクスキャンニング法測定波長 ３５０nmスキャンスピード ２０mm／分
【００２２】本発明の甘味料は上記の試料調製に記載と同様にして製造することができ、乾燥葉からの収率は約１２〜１３％である。本発明で用いられる陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂は通常知られているものでよく、また、含水溶媒としては、メタノール、エタールなどの含水溶媒を用いることができる。
【００２３】本発明の甘味料は、適当量のデキストリン、デンプン、ブドウ糖などの通常用いられる希釈剤など添加剤とともに用いることができる。本発明の甘味料は食品、飲料、医薬などに任意の量で添加することができる。
【００２４】
【実施例】
実施例１ＳＦ４の作出および分析１９９４年２月末に守田化学工業株式会社新見工場内のビニールハウスに電熱線を敷いた播種床を準備し、下部は細かい土、砂と化成肥料（チッソ、リンサン、カリ各８％）を土１ｌ当たり２ｇ混合し、５cmの厚さに入れ、上部には１０メッシュの篩を通した土とＳＳサイズのバーミキュライトを１対１に混合した土を３cmの厚さに覆土した後、十分に散水して湿らせ、温度は２０℃〜２５℃に保った。１９９３年度ＳＦ３から採取した種子を冠毛を取り除いた後、水に一昼夜浸け、ＳＳサイズのバーミキュライトと混合して蒔いた。播種した後、十分散水して種子を落ち着かせた後、直射日光を避けるために寒冷沙で被覆し、播種床の湿度、温度を保った。播種後１４日目から徐々に日光を当て、播種３週間目に５００倍希釈した液体肥料を与えた。
【００２５】苗が２〜３cm程度になった時に育苗箱に上記播種床と同様な土を入れ、４cm間隔で１５００本仮植し、ビニールトンネルにて保温した。苗が１０cm前後に成長した５月初旬に２５×３０cm間隔で圃場に移植した。圃場は予め６０cm幅の畝を作り、上記化学肥料を１０アール当たり２５０kg施肥した。移植後、十分に散水し、成育期間中は除草作業、水分管理すると共に、６月中旬に追肥を１０アール当たり４０kg行った。梅雨期間は２週間ごとに殺菌剤ダイセン(クミアイ化学、ＭＡＮＳＥＮ)、オーソサイド(武田園芸資材(株)、ＣＡＰＴＡＮ)の１０００倍希釈液を散布した。７月２０日以降に成育の良好な株９００本を選び、下葉を５対残して刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。
【００２６】薄層クロマトグラフィー法によりステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：２.５４以上の甘味成分比を有する株は２１％あったが、その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は５.７％であり、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：１.４３であることが判明した。
【００２７】ステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：２.５４以上の甘味成分比を有する株の内、４月中旬に挿し木し、５月初旬に同様に移植したＳＦ３と同程度の生育、収量を有する株５本を選択しＳＦ４とした。
【００２８】実施例２ＳＦ５−１およびＳＦ５−２の作出および分析１９９４年７月末に上記ＳＦ４株５本から挿し木により各２０本ずつ増殖し、ビニールハウス内にて成育させた後、ＳＦ４を交配させ、１１月初旬以降にＳＦ４から種子２０００粒を得た。１９９５年にＳＦ４から得られた種子１５００粒を上記と同様に播種、栽培し、得られた苗１２００本から７月２０日以降に成育の良好な株６５０本を選び、下葉を５対残し、刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。
【００２９】薄層クロマトグラフィー法によりステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：２.５４以上の甘味成分比を有する株のみを選択した。得られた株は３９％であったが、その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は６.５％で有り、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：１.２１であった。ステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の中で特に生育、収量、耐病性の優れた株を２本選択し、ＳＦ５−１（１０３号、耐病性）およびＳＦ５−２（１０９号、甘味成分収量）とした。
【００３０】実施例３ＳＦ６−１の作出および分析ＳＦ５−１、ＳＦ５−２を７月末より挿し木により２５本ずつ増殖し、ビニールハウス内にて成育させた後、１１月初旬以降にＳＦ５−１×ＳＦ５−２を交配し、種子を採種した。ＳＦ５−１×ＳＦ５−２より得られた種子を１９９６年に上記と同様に播種、栽培し得られた株６００本から９月１３日に下葉を５対残し刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。ＳＦ３と同様な甘味成分比を有する株は７９％得られた。その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は６５％であり、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：３であった。
【００３１】実施例４ＳＦ６−２の作出および分析ＳＦ５−１、ＳＦ５−２を７月末より挿し木により２５本ずつ増殖し、ビニールハウス内にて成育させた後、１１月初旬以降にＳＦ３×（ＳＦ５−１並びにＳＦ５−２）を交配し、種子を採種した。ＳＦ３×（ＳＦ５−１並びにＳＦ５−２）より得られた種子を１９９６年に上記と同様に播種、栽培し、得られた株６００本から９月１３日に下葉を５対残し刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。
【００３２】ＳＦ３と同様な甘味成分比を有する株は４９％得られた。その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は１２％であり、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：２.１７であった。
【００３３】実施例１〜４の植物の作出および分析結果を表２にまとめた。
【表２】
（ ）内の比は、ステビオサイド：レバウディオサイドＡ（ＳＴ：ＲＡ）の比であり、（平均 ）内の比は、圃場内に栽培されている当代雑種植物全体のＳＴ：ＲＡの比である。
【００３４】実施例５ＳＦ５−１×ＳＦ５−２のＳＦ５−１株に結実した種子（＝ＳＦ６−Ｉ）から得られた１１５株の乾燥葉、ＳＦ５−１×ＳＦ５−２のＳＦ５−２株に結実した種子から得られた１３１株の乾燥葉（ＳＦ６−II）およびＳＦ３×（ＳＦ５−１並びにＳＦ５−２）のＳＦ３株に結実した種子（＝ＳＦ６−III）から得られた９９株の乾燥葉、をそれぞれ粉砕混合し、各５０ｇを用いて試料とし、高速液体クロマトグラフィー法にて甘味成分含量を測定した。測定結果は次のとおりである。
【表３】
ＳＴ ＲＡ ＲＣ ＳＴ：ＲＡＳＦ６−Ｉ株 ３.６％ １２.７％ １.６％ １：３.５３ＳＦ６−II株 ４.１％ １０.５％ １.５％ １：２.５６ＳＦ６−III株 ３.６％ ７.８％ １.４％ １：２.１６
【００３５】以上の結果からＳＦ５はレバウディオサイドＡを高含有する遺伝因子を有しており、レバウディオサイドＡを高含有する遺伝因子の弱いＳＦ３との交配でも高レバウディオサイドＡを優勢的に遺伝することができることがわかった。ＳＦ５−１とＳＦ５−２を交配して得られたＳＦ−６全体のＳＴ：ＲＡの平均値は１：３であり、種子栽培により得られたステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する植物のみから、ステビオサイド：レバウディオサイドＡが１：２.５４以上である甘味料を製造することができることになる。ＳＦ６以後もＳＴ：ＲＡが１：２.５４以上の品種を選別し、自殖により品種が固定され得る、すなわち、得られた種子は同様な遺伝因子を遺伝する。
【００３６】実施例６甘味料の製造乾燥葉４０ｇを１０〜２０倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ）４０mlを充填したカラム、及び陰イオン交換樹脂（デュライトＡ−４）４０mlを充填したカラムにゆっくりと通し、通過液を吸着樹脂（アンバーライトＸＡＤ−２）２００mlを充填したカラムに通して、甘味成分を吸着させ、十分水洗後、水をきりメタノール６００mlで甘味成分を溶離する。溶離液を減圧下で濃縮し、更に減圧乾燥して淡黄色の粉末５.０ｇ（１２.５％）を得た。
【００３７】実施例７甘味料組成物の調製実施例６で得られた粉末５.０ｇとデキストリン５.０ｇを混合して甘味料組成物を調製した。
【００３８】
【発明の効果】本願発明により、母木から得られる挿穂の数が限られる為に母木の大量確保の必要性、煩雑な挿芽および挿芽からの挿穂の調製、従って、一時(いっとき)に大量育苗が困難などの挿し木育苗の欠点を、本発明の新植物の播種によって克服することができ、栽培作業およびコストの著しい削減を可能にする。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高いレバウディオサイドＡの含有率を示す葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子、種子栽培が可能なステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物およびそれから得られる甘味料、甘味料の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Ｓtevia Ｒebaudiana Ｂertoni)という。ステビアは砂糖の３００倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。
【０００３】ステビアの甘味成分としては、ステビオサイド(Ｃ38Ｈ60Ｏ18、分子量８０４)、レバウディオサイドＡ(Ｃ44Ｈ70Ｏ23、分子量９６６)、レバウディオサイドＣ、Ｄ、Ｅ、ズルコサイドＡ等が知られている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステビオサイド(ＳＴ)が主成分でレバウディオサイドＡ(ＲＡ)の含有量はステビオサイドの１０分の３〜４程度、レバウディオサイドＣの含量はそれよりやや少ないが、品種によってはレバウディオサイドＡ、及びＣを含まないもの、更にレバウディオサイドＣを主成分とするものなど種々である。
【０００４】渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも甘みの質は非常に微妙である。ステビオサイドは砂糖の３００倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工業界で用いられている。その甘味は比較的砂糖に似ているが、苦み等の不快味が後味に残るという欠点がある。それゆえステビオサイドを多量に含むことは甘味料として好ましいことではない。これに対して、レバウディオサイドＡは良質の甘味質とステビオサイドの１.３倍〜１.５倍の甘味度を有する。
【０００５】本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返し品種改良を行い、ステビオサイド（ＳＴ）に対してレバウディオサイドＡ（ＲＡ）が高い含有比率を示すステビア品種を得、これらの植物から甘味成分を抽出しステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比の高い優れた甘味料を製造してきた（特開昭５９−０４５８４８号および特開昭６１−２０２６６７号）。
【０００６】しかし、これらの品種の種子から栽培された植物はレバウディオサイドＡの含有比率が低下する。例えば、甘味成分比ＳＴ：ＲＡ＝１：４の品種の種子から栽培された植物はＳＴ：ＲＡ＝１：１〜１.５程度の成分比に低下する。従って、レバウディオサイドＡの高含有比を保つ為には挿し木育苗に頼らなければならなかった。さらに、ステビア・レバウディアナ・ベルトニーは自家不和合性であり、収穫された種子は常に発芽するとは限らない。すなわち、発芽率が非常に低い。これらの理由により、レバウディオサイドＡを高い比率で含有するステビアはこれまで挿し木増殖されてきており、当業者は種子によって栽培することを考えなかった。
【０００７】しかし、挿し木育苗は母木から得られる挿穂の数が限られる為に母木の大量確保、一時(いっとき)に大量育苗が困難という欠点がある。本発明者らは、これらの欠点を改良するために、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの高い含有比を維持しながら、かつ種子栽培が可能なステビア属の新品種の開発を鋭意行ってきた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そして、レバウディオサイドＡを高い比率で含む遺伝子を有し、かつ種子増殖によりこの遺伝子を次の世代に優勢に伝達し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーを選抜固定して本発明を完成した。従って、本発明の第１の態様は、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子である。そして、本発明の第２の態様であるこの栽培用種子から栽培された植物体の葉は甘味料の製造に用いられる。
【０００９】本発明の第３の態様は、種子による栽培が可能である、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む、ステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物である。
【００１０】本発明の第４の態様は、このステビア・レバウディアナ・ベルトニー新品種に属する植物の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料である。
【００１１】本発明の第５の態様は、このステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する新植物の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料の製造方法である。
【００１２】本発明のステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物は下記の表１に記載のプロトコルに従って育成された。なお、親植物であるＳＦ３品種の種子は発明者が所有しており、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて分譲が保証されている。
【表１】
【００１３】本発明の新品種に属する植物の育成特開昭６１−２０２６６７号に記載のＳＦ３間での交配より得られた種子より２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含む株(ＳＦ３級)を選抜し、更に交配・選抜を繰り返し、２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含む株(ＳＦ３級)のみによる交配の結果、セプトリア菌に対する耐病性が優れている株ＳＦ５−１（１０３号）および甘味成分含量が優れている株ＳＦ５−２号（１０９号）を選抜した。１０３、１０９号から得られた種子を用いて栽培することにより、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する株が８割以上得られ、ほぼ安定した。なお、ＳＦ３と１０３号並びに１０９号を用いて交配させたが、ＳＦ３に結実した種子を用いての栽培では安定した成分比率を持った株は得られなかった。
【００１４】
【発明の実施の形態】
ステビア栽培方法播種床を準備し、下部は水捌けの良い細かな土、または砂を入れ、少量の肥料分を加えると更に良い。上部には１０メッシュ程度のより細かな土、またはＳＳサイズのバーミキュライトなどを重ねた後、十分に散水して湿らせる。播種床の温度は播種するまでに２０℃〜２５℃に保っておく。種子は冠毛をつけた状態でも良いが、土との密着性を高めるために冠毛を取り除いた方が望ましい。
【００１５】種子は水に一昼夜浸けた後、分散性を高めるために１０メッシュ程度のできるだけ細かな土、またはＳＳサイズのバーミキュライト(Vermiculite、旭工業(株))などと混合して撒く。播種した後十分散水して種子を落ち着かせた後、直射日光を避けるために寒冷沙で被覆し、表面の湿度を保ち、発芽させる。発芽までの日数は７〜１４日要するが、発芽が遅い場合、あるいは温度が低い場合はそれ以上にかかることもある。
【００１６】発芽が終了するまでの間は温度管理、水分管理には十分注意が必要である。発芽後、徐々に日光を当て、必要に応じて希釈した液体肥料を与える。仮植する場合には苗が２〜３cm程度になった時仮植する。播種床として育苗ポット、育苗トレーなどを用いた場合は仮植する必要はない。
【００１７】苗が１０cm前後に成長した時点で圃場に移植する。圃場は予め施肥すると共に植え付け本数に応じた畝を作っておく。１ヘクタール当たりの植え付け本数は１０〜１５万本程度が望ましいが、必要に応じて増減しても良い。
【００１８】施肥量は圃場の肥沃度により異なるが一応の目安として１ヘクタール当たりチッソ、リンサン、カリの各成分２００Ｋg程度である。移植後、十分に散水し、根と土の密着を助けると共に、移植痛みを少なくする。低緯度地域においては成育期間の早期に開花する場合があるが、着蕾し、開花現象が見られた場合には摘心を行う。成育期間中は除草、水分管理すると共に、必要に応じて追肥を行い、高温多湿の時期には殺菌剤の散布を行う。
【００１９】丈が３０cm程度以上に成長した以降に着蕾、開花が見られた時は下葉を３〜５対を残して収穫する。収穫後、葉を分離し、又は草型のまま天日乾燥、または熱風乾燥する。葉部分は枝、茎と分け、葉部分は乾燥葉として甘味料原料とする。
【００２０】試料調製乾燥葉２０ｇを１０〜２０倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ）２０mlを充填したカラム、及び陰イオン交換樹脂（デュライトＡ−４）２０mlを充填したカラムにゆっくりと通し、通過液を吸着樹脂（アンバーライトＸＡＤ−２）１００mlを充填したカラムに通して、甘味成分を吸着させ、十分水洗後、水をきりメタノール３００mlで甘味成分を溶離する。溶離液を減圧下で濃縮し、更に減圧乾燥して淡黄色の粉末を得る。
【００２１】分析方法１）高速液体クロマトグラフィー法甘味料粉末を溶離液に溶解してカラムに入れる。
カラム充填剤 リクロソルブＮＨ2 ５μ流速 １.５ml／min溶離液 アセトニトリル：水＝８０：２０測定波長 ２１０nm２）薄層クロマトグラフィー法甘味料粉末を水に溶解して薄層プレートにおく。
測定機種 島津クロマトスキャナー９１０型薄層プレート メルク社シリカゲル６０Ｆ２５４展開溶媒 クロロホルム：メタノール：水＝３０：２０：４発色剤 ５０％硫酸測定法 反射ジグザクスキャンニング法測定波長 ３５０nmスキャンスピード ２０mm／分
【００２２】本発明の甘味料は上記の試料調製に記載と同様にして製造することができ、乾燥葉からの収率は約１２〜１３％である。本発明で用いられる陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂は通常知られているものでよく、また、含水溶媒としては、メタノール、エタールなどの含水溶媒を用いることができる。
【００２３】本発明の甘味料は、適当量のデキストリン、デンプン、ブドウ糖などの通常用いられる希釈剤など添加剤とともに用いることができる。本発明の甘味料は食品、飲料、医薬などに任意の量で添加することができる。
【００２４】
【実施例】
実施例１ＳＦ４の作出および分析１９９４年２月末に守田化学工業株式会社新見工場内のビニールハウスに電熱線を敷いた播種床を準備し、下部は細かい土、砂と化成肥料（チッソ、リンサン、カリ各８％）を土１ｌ当たり２ｇ混合し、５cmの厚さに入れ、上部には１０メッシュの篩を通した土とＳＳサイズのバーミキュライトを１対１に混合した土を３cmの厚さに覆土した後、十分に散水して湿らせ、温度は２０℃〜２５℃に保った。１９９３年度ＳＦ３から採取した種子を冠毛を取り除いた後、水に一昼夜浸け、ＳＳサイズのバーミキュライトと混合して蒔いた。播種した後、十分散水して種子を落ち着かせた後、直射日光を避けるために寒冷沙で被覆し、播種床の湿度、温度を保った。播種後１４日目から徐々に日光を当て、播種３週間目に５００倍希釈した液体肥料を与えた。
【００２５】苗が２〜３cm程度になった時に育苗箱に上記播種床と同様な土を入れ、４cm間隔で１５００本仮植し、ビニールトンネルにて保温した。苗が１０cm前後に成長した５月初旬に２５×３０cm間隔で圃場に移植した。圃場は予め６０cm幅の畝を作り、上記化学肥料を１０アール当たり２５０kg施肥した。移植後、十分に散水し、成育期間中は除草作業、水分管理すると共に、６月中旬に追肥を１０アール当たり４０kg行った。梅雨期間は２週間ごとに殺菌剤ダイセン(クミアイ化学、ＭＡＮＳＥＮ)、オーソサイド(武田園芸資材(株)、ＣＡＰＴＡＮ)の１０００倍希釈液を散布した。７月２０日以降に成育の良好な株９００本を選び、下葉を５対残して刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。
【００２６】薄層クロマトグラフィー法によりステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：２.５４以上の甘味成分比を有する株は２１％あったが、その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は５.７％であり、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：１.４３であることが判明した。
【００２７】ステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：２.５４以上の甘味成分比を有する株の内、４月中旬に挿し木し、５月初旬に同様に移植したＳＦ３と同程度の生育、収量を有する株５本を選択しＳＦ４とした。
【００２８】実施例２ＳＦ５−１およびＳＦ５−２の作出および分析１９９４年７月末に上記ＳＦ４株５本から挿し木により各２０本ずつ増殖し、ビニールハウス内にて成育させた後、ＳＦ４を交配させ、１１月初旬以降にＳＦ４から種子２０００粒を得た。１９９５年にＳＦ４から得られた種子１５００粒を上記と同様に播種、栽培し、得られた苗１２００本から７月２０日以降に成育の良好な株６５０本を選び、下葉を５対残し、刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。
【００２９】薄層クロマトグラフィー法によりステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：２.５４以上の甘味成分比を有する株のみを選択した。得られた株は３９％であったが、その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は６.５％で有り、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：１.２１であった。ステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の中で特に生育、収量、耐病性の優れた株を２本選択し、ＳＦ５−１（１０３号、耐病性）およびＳＦ５−２（１０９号、甘味成分収量）とした。
【００３０】実施例３ＳＦ６−１の作出および分析ＳＦ５−１、ＳＦ５−２を７月末より挿し木により２５本ずつ増殖し、ビニールハウス内にて成育させた後、１１月初旬以降にＳＦ５−１×ＳＦ５−２を交配し、種子を採種した。ＳＦ５−１×ＳＦ５−２より得られた種子を１９９６年に上記と同様に播種、栽培し得られた株６００本から９月１３日に下葉を５対残し刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。ＳＦ３と同様な甘味成分比を有する株は７９％得られた。その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は６５％であり、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：３であった。
【００３１】実施例４ＳＦ６−２の作出および分析ＳＦ５−１、ＳＦ５−２を７月末より挿し木により２５本ずつ増殖し、ビニールハウス内にて成育させた後、１１月初旬以降にＳＦ３×（ＳＦ５−１並びにＳＦ５−２）を交配し、種子を採種した。ＳＦ３×（ＳＦ５−１並びにＳＦ５−２）より得られた種子を１９９６年に上記と同様に播種、栽培し、得られた株６００本から９月１３日に下葉を５対残し刈り取り、葉を分離した後、天日乾燥し、乾燥葉は薄層クロマトグラフィー法により分析した。
【００３２】ＳＦ３と同様な甘味成分比を有する株は４９％得られた。その中でステビオサイド：レバウディオサイドＡ＝１以下：３以上の株の割合は１２％であり、得られた乾燥葉の平均的なステビオサイド：レバウディオサイドＡの比は１：２.１７であった。
【００３３】実施例１〜４の植物の作出および分析結果を表２にまとめた。
【表２】
（ ）内の比は、ステビオサイド：レバウディオサイドＡ（ＳＴ：ＲＡ）の比であり、（平均 ）内の比は、圃場内に栽培されている当代雑種植物全体のＳＴ：ＲＡの比である。
【００３４】実施例５ＳＦ５−１×ＳＦ５−２のＳＦ５−１株に結実した種子（＝ＳＦ６−Ｉ）から得られた１１５株の乾燥葉、ＳＦ５−１×ＳＦ５−２のＳＦ５−２株に結実した種子から得られた１３１株の乾燥葉（ＳＦ６−II）およびＳＦ３×（ＳＦ５−１並びにＳＦ５−２）のＳＦ３株に結実した種子（＝ＳＦ６−III）から得られた９９株の乾燥葉、をそれぞれ粉砕混合し、各５０ｇを用いて試料とし、高速液体クロマトグラフィー法にて甘味成分含量を測定した。測定結果は次のとおりである。
【表３】
ＳＴ ＲＡ ＲＣ ＳＴ：ＲＡＳＦ６−Ｉ株 ３.６％ １２.７％ １.６％ １：３.５３ＳＦ６−II株 ４.１％ １０.５％ １.５％ １：２.５６ＳＦ６−III株 ３.６％ ７.８％ １.４％ １：２.１６
【００３５】以上の結果からＳＦ５はレバウディオサイドＡを高含有する遺伝因子を有しており、レバウディオサイドＡを高含有する遺伝因子の弱いＳＦ３との交配でも高レバウディオサイドＡを優勢的に遺伝することができることがわかった。ＳＦ５−１とＳＦ５−２を交配して得られたＳＦ−６全体のＳＴ：ＲＡの平均値は１：３であり、種子栽培により得られたステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する植物のみから、ステビオサイド：レバウディオサイドＡが１：２.５４以上である甘味料を製造することができることになる。ＳＦ６以後もＳＴ：ＲＡが１：２.５４以上の品種を選別し、自殖により品種が固定され得る、すなわち、得られた種子は同様な遺伝因子を遺伝する。
【００３６】実施例６甘味料の製造乾燥葉４０ｇを１０〜２０倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ）４０mlを充填したカラム、及び陰イオン交換樹脂（デュライトＡ−４）４０mlを充填したカラムにゆっくりと通し、通過液を吸着樹脂（アンバーライトＸＡＤ−２）２００mlを充填したカラムに通して、甘味成分を吸着させ、十分水洗後、水をきりメタノール６００mlで甘味成分を溶離する。溶離液を減圧下で濃縮し、更に減圧乾燥して淡黄色の粉末５.０ｇ（１２.５％）を得た。
【００３７】実施例７甘味料組成物の調製実施例６で得られた粉末５.０ｇとデキストリン５.０ｇを混合して甘味料組成物を調製した。
【００３８】
【発明の効果】本願発明により、母木から得られる挿穂の数が限られる為に母木の大量確保の必要性、煩雑な挿芽および挿芽からの挿穂の調製、従って、一時(いっとき)に大量育苗が困難などの挿し木育苗の欠点を、本発明の新植物の播種によって克服することができ、栽培作業およびコストの著しい削減を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子。
【請求項２】 請求項１記載の栽培用種子から栽培された植物体。
【請求項３】 ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含み、種子による栽培が可能である、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー新品種に属する植物。
【請求項４】 請求項２記載の植物体の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料。
【請求項５】 請求項２記載の植物体の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料の製造方法。
【請求項１】 ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含む葉を生育し得るステビア・レバウディアナ・ベルトニーの新品種に属する植物の栽培用種子。
【請求項２】 請求項１記載の栽培用種子から栽培された植物体。
【請求項３】 ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを２.５６倍以上含み、種子による栽培が可能である、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー新品種に属する植物。
【請求項４】 請求項２記載の植物体の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料。
【請求項５】 請求項２記載の植物体の乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた抽出液から甘味成分を分離採取することを特徴とする、ステビオサイドに対して２.５６倍以上のレバウディオサイドＡを含有する甘味料の製造方法。
【公開番号】特開平１０−２７１９２８
【公開日】平成１０年（１９９８）１０月１３日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１０−１１２０５
【出願日】平成１０年（１９９８）１月２３日
【出願人】（３９００００６９７）守田化学工業株式会社 (3)
【公開日】平成１０年（１９９８）１０月１３日
【国際特許分類】
【出願日】平成１０年（１９９８）１月２３日
【出願人】（３９００００６９７）守田化学工業株式会社 (3)
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