スフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法
【課題】スフェロイドを短時間で形成でき、スフェロイドのサイズや形状の制御が容易であり、また、特別な装置が不要なスフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法の提供。
【解決手段】ガドリニウム化合物を配合した培養液中で細胞が培養される培養容器と、磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加する磁場印加手段と、を備えるスフェロイド作製装置。
【解決手段】ガドリニウム化合物を配合した培養液中で細胞が培養される培養容器と、磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加する磁場印加手段と、を備えるスフェロイド作製装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体細胞を増殖させて種々の用途に利用することが多くの分野で行われている。例えば、肝細胞は、薬物・毒物試験や人工肝臓の原材料などとして用いられているため、肝細胞を効率よく培養することが要請されている。しかしながら、肝細胞は、血液細胞などの他の生体細胞よりも外界に対する感受性が高く、生体外に取り出すと、すぐにその機能を消失するという問題がある。そのため、より生体内に近い培養形態であるスフェロイド（球状組織体）を形成させた状態で肝細胞を培養するスフェロイド培養法が注目されている。
スフェロイドは、細胞が多数凝集し形成された球状の細胞塊であり、スフェロイドの状態で培養すること、即ち、スフェロイド培養は、より生体に近い環境となるため、従来の単層培養に比べ、生体細胞、特に肝細胞を用いた場合に、細胞の機能維持が長期にわたり（１ヶ月以上）可能となる。
【０００３】
スフェロイドを作製するための方法としては、たとえば、懸滴培養、細胞非接着表面での培養、マイクロウェル内での培養、回転培養、足場を利用した三次元培養、温度応答性ポリマーによる細胞シートの作製、遠心力や超音波、電場・磁場による凝集などがある（非特許文献１）。
【０００４】
スフェロイドの作製法としては、また、碁盤目状またはハニカム状のセルが連続した細胞培養構造体での培養もある（特許文献１）。
【０００５】
また、磁場で細胞を凝集させてスフェロイドを作製するときは、細胞に磁性粒子を取り込ませたものを磁場でハンドリングすることが行われている（非特許文献２）。
【０００６】
【非特許文献１】R. Lin and H. Chang, "Recent advances in three-dimensional multicellularspheroid culture for biomedical research," Biotechnology Journal, vol. 3, 2008, pp 1172-1184.
【特許文献１】国際公開第２００７／０９７１２１パンフレット
【非特許文献２】Glauco R, Souza, et al, "Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation" Nature Biotechnology, vol. 5, April, 2010, pp291-296
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、懸滴培養は、特別な装置は不要であるものの、操作が煩雑であり、スフェロイドの大量生産が困難であるという問題がある。
【０００８】
また、細胞非接着表面での培養は、スフェロイドのサイズや形状の制御が困難であり、得られるスフェロイドのサイズや形状のバラツキが大きいという問題がある。
【０００９】
マイクロウェル内での培養や細胞培養構造体での培養は、スフェロイドのサイズや形状の制御が容易であるという特長はあるものの、培養に使用するマイクロウェルや細胞培養構造体の作製に微細加工が必要であるという問題点がある。
【００１０】
回転培養は、専用の装置を必要とするうえ、得られるスフェロイドのサイズや形状のバラツキが大きいという問題があり、また、スフェロイドを構成する細胞に培養中に剪断応力が作用し、この剪断応力のために細胞が破壊される可能性がある。
【００１１】
足場を利用した三次元培養には、専用の足場を予め作製する必要があるという問題がある。
【００１２】
温度応答性ポリマーによる細胞シートの作製には、細胞を予め温度応答性ポリマーにグラフトさせる必要があるという問題がある。
【００１３】
遠心力や超音波、電場で細胞を凝集させる方法には、遠心力や超音波、電場が細胞にどのような影響を及ぼすか不明であるという問題がある。磁場により細胞を凝集させる場合においても、超電導磁石によって強力な磁場を印加した場合には、細胞に好ましくない影響が及ぼされる可能性があると考えられる。
【００１４】
更に、細胞に磁性粒子を取り込ませたものを磁場でハンドリングして凝集させてスフェロイドを作製する方法には、スフェロイド作製後、細胞に磁性微粒子が残存するため、得られるスフェロイドは組織工学技術への応用に不向きである。
【００１５】
本発明は、上記問題を解決すべく成されたもので、スフェロイドを短時間で形成できる上、スフェロイドのサイズや形状の制御が容易であり、また、特別な装置が不要なスフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
請求項１に記載の発明は、培養液の磁化率を増大させ得る磁化率増大化合物を含有する培養液中で細胞が培養される培養容器と、磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加する磁場印加手段と、を備えるスフェロイド作製装置に関する。
【００１７】
前記スフェロイド作製装置においては、前記培養容器には、磁場勾配を有する磁場が印加される。
【００１８】
そして、培養液には、磁化率増大化合物が含有されている。ここで、磁化率増大化合物とは、磁化率が高く、且つ培養液に可溶な化合物である。このような磁化率増大化合物を培養液中に含有させることにより、培養液全体の磁化率χｍが増大するから細胞は相対的に反磁性を有するようになる。したがって、磁場印加手段として非常に大きな磁気力場を必要とすることなく、磁気アルキメデス効果により、磁場印加手段としてネオジム磁石などの通常の永久磁石を用いた場合においても、培養液中の細胞は、磁場印加手段からの磁場によって、磁束密度が周囲よりも低い領域に移動してスフェロイドを形成する。
【００１９】
請求項２に記載の発明は、前記磁化率増大化合物がガドリニウム化合物である請求項１記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２０】
前記すファロイド作製装置においては、磁化率増大化合物として細胞毒性の特に低いガドリニウム化合物を使用している。
【００２１】
請求項３に記載の発明は、前記培養容器が皿状容器であり、前記磁場印加手段が、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石である請求項１に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２２】
前記スフェロイド作製装置においては、磁石と磁石との間の角の領域の磁束密度がそれ以外の領域の磁束密度よりも小さくなる。したがって、培養液中の細胞は、磁石と磁石との間の角の磁束密度の低い領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００２３】
請求項４に記載の発明は、前記培養容器が皿状容器であり、前記磁場印加手段が、前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、前記磁石と前記培養容器との間に配置され、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、を有する請求項１に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２４】
強磁性体は、皿状容器を形成するガラスやプラスチックスのような材質、および空気と比較して透磁率が高い。したがって、磁束密度は、前記強磁性体の板状体の部分では高く、板状体に形成された孔の部分では低くなる。
【００２５】
したがって、前記板状体の孔の間の部分から前記孔に向かって磁束密度が低下するような磁場勾配が形成されるから、培養液中の細胞は、前記孔の領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００２６】
請求項５に記載の発明は、前記培養容器が有底円筒状容器であり、前記磁場印加手段が、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石である請求項１に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２７】
前記スフェロイド作製装置においては、前記円筒状磁石によって、前記有底円筒状容器の外側から中心部に向かって磁束密度が低下するような磁場勾配が形成される。
【００２８】
したがって、前記有底円筒状容器中の細胞は、磁束密度の低い前記有底円筒状容器の中心部に移動して前記有底円筒状容器の軸線に沿った紐状のスフェロイドを形成する。
【００２９】
請求項６に記載の発明は、前記培養液に含まれるガドリニウム化合物はガドリニウム錯体である請求項２〜５の何れか１項に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００３０】
前記スフェロイド作製装置において前記培養液に含まれるガドリニウム化合物として使用されるガドリニウム錯体は細胞毒性が低いという特長を有する。
【００３１】
請求項７に記載の発明は、磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加した状態で、前記培養容器内で、磁化率増大化合物を含有する培養液を用いて細胞を培養するスフェロイド作製方法に関する。
【００３２】
前記スフェロイド作製方法においては、磁場印加手段によって磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加しつつ、前記培養容器内で細胞を培養する。
【００３３】
一方、培養液として磁化率増大化合物を含有したものを用いるから、培養液全体の磁化率χｍが増大する。
【００３４】
したがって、培養液中の細胞は相対的に反磁性となるから、磁束密度が周囲よりも低い領域に移動し、スフェロイドを形成する。
【００３５】
請求項８に記載の発明は、前記磁化率増大化合物としてガドリニウム化合物を使用する請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００３６】
前記スフェロイド作製方法においては、磁化率増大化合物として細胞毒性の特に低いガドリニウム化合物を使用している。
【００３７】
請求項９に記載の発明は、前記培養容器として皿状容器を用い、前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石を用いる請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００３８】
前記スフェロイド作製方法においては、請求項３のところで述べたのと同様の理由により、培養液中の細胞は磁石と磁石との間の角の磁束密度の低い領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００３９】
請求項１０に記載の発明は、前記培養容器として皿状容器を用い、前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、前記磁石と前記培養容器との間に位置し、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、を用いる請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００４０】
前記スフェロイド作製方法においては、請求項３のところで述べたのと同様の理由により、培養液中の細胞は強磁性体の板状体の孔が形成された領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００４１】
請求項１１に記載の発明は、前記培養容器として有底円筒状容器を用い、前記磁場印加手段として、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石を用いた請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００４２】
前記スフェロイド作製方法においては、請求項４のところで述べたのと同様の理由により、前記有底円筒状容器中の細胞は、前記有底円筒状容器の中心部に移動して前記有底円筒状容器の軸線に沿った紐状のスフェロイドを形成する。
【００４３】
請求項１２に記載の発明は、前記有底円筒状容器の中心線上に、前記細胞の培養温度ではゲルであり、前記培養温度よりも高い温度または低い温度ではゾルとなる温度感受性物質からなる芯材を配置して前記細胞を培養する細胞を培養する請求項１１に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００４４】
前記スフェロイド作製方法においては、前記細胞の培養時には前記芯材はゲルであるから、前記細胞は、前記芯材の表面に凝縮した状態で増殖する。前記細胞が増殖し、所定のサイズ、形状のスフェロイドが得られたら、前記培養液を昇温、または降温させることにより、前記芯材はゾルに変化して培養液中に流れ去る。これにより、管状のスフェロイドが得られる。
【発明の効果】
【００４５】
以上説明したように本発明のスフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法によれば、磁場勾配のみで細胞をハンドリングできるから、培養しようとする細胞を磁性微粒子でマーキングしたり、前記細胞に磁性微粒子を取り込ませたりする必要がないので、組織技術に向いたスフェロイドまたは細胞塊が得られる。また、装置が培養容器と永久磁石とから構成できるから、安価に装置を構成できる。更に、第１の細胞からスフェロイドを作製後、第１の細胞とは異なる第２の細胞を播種することにより、複数種の細胞からなるスフェロイドを容易に形成できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１において（Ａ）は、実施形態１に係るスフェロイド作製装置の構成を示す断面図であり、（Ｂ）は、前記スフェロイド作製装置を上方から見た平面図である。
【図２】図２において（Ａ）は、実施形態２に係るスフェロイド作製装置の構成を示す断面図であり、（Ｂ）は、前記スフェロイド作製装置を上方から見た平面図である。
【図３】図３において、（Ａ）および（Ｂ）は、夫々実施形態１および実施形態２に係るスフェロイド作製装置において、磁石によって培養ディッシュ内に生じる磁束の密度と、培養ディッシュ内においてスフェロイドが生成する領域との関係を示す説明図である。
【図４】図４は、実施形態３に係るスフェロイド作製装置の構成を示す断面図である。
【図５】図５は、実施形態３に係るスフェロイド作製装置において磁石が形成する磁束Ｈの分布状態を示す説明図である。
【図６】図６は、実施形態３に係るスフェロイド作製装置において、ガラス管の軸線に沿って芯材を配置して管状のスフェロイドを形成するところを示す断面図である。
【図７】図７は、本発明の実施例１にかかるスフェロイドの顕微鏡写真像である。
【図８】図８は、本発明の実施例３にかかるＧｄ−ＤＴＰＡの細胞毒性の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
１．実施形態１
以下、本発明のスフェロイド作製装置の一例について図面を用いて詳細に説明する。
実施形態１に係るスフェロイド作製装置１００は、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、皿状の培養容器の一例としての培養ディッシュ１と、培養ディッシュ１の下側に平面視で格子状に配設された一群の磁石２とを有する。磁石２は、本発明における磁場印加手段の一例である。
【００４８】
磁石２は、Ｎ極とＳ極とが交互に並ぶように配置されている。磁石２としては、ネオジム磁石などの希土類磁石が使用される。
【００４９】
一方、培養ディッシュ１には、培養液の磁化率を増大させる磁化率増大化合物を含有する培養液が収容されている。
培養に用いられる培養液としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｅｍ−α、ＲＰＭＩ１６４０等を挙げることができる。培養液には、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知の血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０ｖ／ｖ％とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
【００５０】
磁化率増大化合物は、培養液の磁化率を増大させ得る化合物であれば、本発明に適用可能である。なお、「培養液の磁化率を増大させ得る」とは、化合物の添加後において、添加対象となる培養液の磁化率が、添加前の磁化率よりも増大することを意味する。
このような磁化率増大化合物としては、鉄化合物、マンガン化合物並びに、ガドリニウム化合物、テルビウム化合物、ジスプロシウム化合物及びホルミウム化合物などのランタニド化合物などの強磁性の化合物を挙げることができる。これらの化合物は、細胞毒性を緩和する観点から、キレート化合物との錯体を形成していることが好ましい。キレート化合物としては、ジエチレントリアミンテトラ酢酸（ＤＴＰＡ）や１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）を挙げることができる。
【００５１】
磁化率増大化合物としては、例えば、塩化第一鉄、塩化マンガン、ガドリニウム錯体、テルビウム錯体などを挙げることができる。中でも、細胞毒性等の観点からガドリニウム化合物であることが好ましく、ガドリニウムとキレート化合物との錯体、例えば、ＤＴＰＡでキレート化された３価ガドリニウム（Ｇｄ（III））（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）又はＤＯＴＡでキレート化された３価ガドリニウム（Ｇｄ（III））（Ｇｄ−ＤＯＴＡ）がより好ましい。これらの磁化率増大化合物の使用濃度は、用いられる強磁性体化合物によって異なるが、例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡの場合には、４ｍＭ〜４０ｍＭであることが好ましく、細胞毒性の観点から４ｍＭ〜１５ｍＭであることがより好ましい。
【００５２】
本発明における適用可能な細胞としては、特に制限はなく、肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚、脂肪等から採取される初代細胞や、各種の因子を導入して得られた初期化したマウスｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells、人工多能性幹細胞）、未分化な幹細胞、胚由来のＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell）、血管内皮細胞、樹立されている株化細胞、またはこれらに遺伝子操作等を施した細胞等であって、増殖可能な細胞を好ましく用いることができる。
【００５３】
以下、スフェロイド作製装置１００の作用について説明する。
【００５４】
上述のように、培養ディッシュ１の下方には磁石２が配設されているから、培養ディッシュ１中の細胞には、磁場による力Ｆｍと重力Ｆｇを合わせた力Ｆが作用する。力Ｆは、以下の式１：
【数１】
但し、上の式１において、χｐおよびχｍは夫々細胞および培養液の磁化率であり、Ｖは細胞の体積であり、μ０は真空での透磁率であり、Ｂは磁束密度であり、Ｂ・∇は磁場勾配であり、ρｐ、ρｍは夫々細胞および培養液の密度である。
【００５５】
そして、上述のように培養液はガドリニウム化合物であるＧｄ−ＤＴＰＡを含有しているから、培養液の磁化率χｍが増大する。これにより、細胞は相対的に反磁性体となるから、細胞に作用する力Ｆは負の値となり、細胞は磁束密度Ｂの低い領域に移動しようとする。
【００５６】
各磁石２にはＮ極からＳ極に向かう方向の磁力線が生じる。しかしながら、磁石２は、Ｎ極とＳ極とが隣り合うように格子状に配列されているから、各磁石２で生じた磁力線は、磁石２と磁石２との間の角の部分で互いに弱め合う。したがって、図３（Ａ）に示すように、磁石２の上方においては磁束密度Ｂが高くなり、磁石２と磁石２との間の角の部分では磁束密度Ｂが低くなる。
【００５７】
したがって、培養液中の細胞は、図３（Ａ）において矢印ａに示すように、磁束密度Ｂの低い領域である磁石２と磁石２との間の角の部分に移動する方向の力を受け、図１（Ａ）および（Ｂ）において円で示し、図３（Ａ）において二点鎖線で示すように磁石２と磁石２との間の角の領域に集まってスフェロイドを形成する。
【００５８】
次に、スフェロイド作製装置１００を用いてスフェロイドを作製する手順について説明する。
【００５９】
先ず、細胞種に応じた培養液にＧｄ−ＤＴＰＡを添加して、所定濃度のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培養液を調製し、培養ディッシュ１に収容する。
【００６０】
これと平行して、スフェロイドを形成しようとする細胞を例えば１０３〜１０６cell/mLの濃度で懸濁させた懸濁液を調製し、この懸濁液を培養ディッシュ１中の培養液に播種する。なお、細胞の播種密度は、細胞の種類等により適宜調整可能である。
【００６１】
この状態で重合することにより、培養ディッシュ１における磁石２の間の角の部分にスフェロイドが形成される。このスフェロイドの形成は数分もあれば充分であるが、培養を１〜７日間継続させてもよい。これにより、スフェロイドのサイズや形状が安定する。スフェロイドが形成された後は、培養ディッシュ１中の培養液を、Ｇｄ−ＤＴＰＡを含有しないものと交換して細胞培養を継続する。これにより、所定の直径を有する球状のスフェロイドが形成される。
【００６２】
スフェロイド作製装置１００においては、培養液にＧｄ−ＤＴＰＡを配合することにより、培養液そのものの磁化率χｍを増大させて細胞を相対的に反磁性体としているから、磁石２は、希土類磁石のような通常の永久磁石でよく、超電導磁石のような強力な磁石は不要である。
【００６３】
したがって、細胞をハンドリングするための磁石として超電導磁石を用いた場合と比較して構成が著しく簡略化されるとともに、細胞が極めて強力な磁場に曝されることがないから、強力な磁場に曝されることによる悪影響を回避できる。
【００６４】
また、スフェロイド作製装置１００においては、磁石２で形成される磁場勾配のみで細胞をハンドリングするから、大量の細胞を同時にハンドリングすることが極めて容易である。また、細胞を磁界によってハンドリングするために磁性微粒子でマーキングしたり、磁性微粒子を取り込ませたりする必要がないので、組織工学技術に向いたスフェロイドまたは細胞塊が得られる。
【００６５】
加えて、磁石２によって形成される磁場勾配の大きさや培養液中の細胞濃度を制御することにより、スフェロイドのサイズを精度よくコントロールできる。
【００６６】
更に、スフェロイドを作製後、他の細胞を播種することにより、複数種の細胞からなるスフェロイドを容易に形成できる
【００６７】
２．実施形態２
以下、本発明のスフェロイド作製装置の他の例について図面を用いて詳細に説明する。
実施形態２に係るスフェロイド作製装置１０２は、図２に示すように、培養ディッシュ１と、培養ディッシュ１を挟むように配設された２個の電磁石３Ｎ、３Ｓとを有する。電磁石３Ｎ、３Ｓは、本発明における磁場印加手段の一例である。電磁石３Ｎ、３Ｓは、磁極が相対向するように配設されている。
【００６８】
電磁石３Ｎと培養ディッシュ１との間には、強磁性体の板状体の一例である軟鋼板４が配設されている。軟鋼板４には、孔５が格子状に穿設されている。
【００６９】
また、電磁石３Ｎ、３Ｓの間隔が小さいほうが磁場勾配が大きくなるため、培養ディッシュ１としては、マイクロ流体チップなどの厚さ１ｍｍ以下のデバイスが好適に使用される。培養ディッシュ１としてこのようなデバイスを使用する場合、培養ディッシュ１の内面をＭＰＣポリマーやＰＴＦＥなどでコーティングして内面に細胞が接着しないようにすることが好ましい。
【００７０】
培養液、培養液に配合されるガドリニウム化合物、および培養液中で培養される細胞については実施形態１のところで述べたとおりである。
【００７１】
以下、スフェロイド作製装置１０２の作用について説明する。
【００７２】
スフェロイド作製装置１０２においても、培養ディッシュ１内部の細胞に作用する力については、実施形態１のところで説明したとおりであるから、細胞は磁束密度Ｂの低い領域に移動しようとする。
【００７３】
磁束Ｈは、電磁石３Ｎの磁極から電磁石３Ｓの磁束に向かって培養ディッシュ１を下方から上方に向かって通過する。
【００７４】
しかしながら、電磁石３Ｎと培養ディッシュ１との間には、孔５が格子状に穿設された軟鋼板４が配置されている。そして、軟鋼板４は強磁性体であるから、当然のことながら透磁率は空気よりも遥かに高い。
【００７５】
したがって、磁束Ｈは、軟鋼板４における孔５の穿設されていない部分を優先的に通過するから、図３（Ｂ）に示すように、磁束密度Ｂは軟鋼板４における孔５の無い部分では高く、孔５の穿設された部分では低くなる。
【００７６】
したがって、図３に示すように、細胞は、培養ディッシュ１における孔５に対応する位置に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００７７】
実施形態２に係るスフェロイド作製装置１０２は、実施形態１に係るスフェロイド作製装置の有する特長に加え、軟鋼板４に穿設する孔５の位置を設定することにより、培養ディッシュ１内部におけるスフェロイドを形成する位置を自由に設定できるという特長を有する。また、電磁石３Ｎ、３Ｓをｏｎ、ｏｆｆすることにより、培養ディッシュ１内部に形成されたスフェロイドを回収することが可能である。
【００７８】
３．実施形態３
以下、本発明のスフェロイド作製装置の更に別の例について図面を用いて詳細に説明する。実施形態３に係るスフェロイド作製装置１０４は、図４に示すように、有底円筒状の培養容器の一例としてのガラス管６と、ガラス管６を取り囲むように配設された円筒状磁石７と、を備える。
【００７９】
ガラス管６の内部には培養液が収容される。
【００８０】
一方、円筒状磁石７は、周方向に複数、例えば６個のセグメント７Ａに分割されている。但し、セグメント７Ａの分割個数は偶数であれば６個には限定されず、４個、８個、１０個、および１２個等、種々の個数が可能である。但し、実用性の点からは、分割個数は４個、６個、および８個が好ましい。
【００８１】
各セグメント７Ａは、図４に示すように内壁と外壁とで反対の極性となるように着磁されている。したがって、セグメント７Ａのうち、内壁がＮ極のものは外壁がＳ極に着磁され、内壁がＳ極のものは外壁がＮ極に着磁されている。
【００８２】
円筒状磁石７は、ガラス管６を取り囲むとともに、各セグメント７ＡのＳ極とＮ極とが交互にガラス管６に面するように配置されている。したがって、図５に示すように、円筒状磁石７の内壁には、互いに隣接する２個のセグメント７Ａ毎にＮ極からＳ極に向かう方向の磁束Ｈが生じる。
【００８３】
しかしながら、これらの磁束Ｈは互いに反発し合うから、ガラス管６の中心部に磁束密度Ｂの低い領域が形成される。したがって、図５に示すように、ガラス管６内に収容された培養液中の細胞は、ガラス管６の中心部に移動して紐状のスフェロイドを形成する。
【００８４】
なお、図６に示すように、細胞培養温度ではゾルであり、温度を変化させることによりゲルに変化する温度感受性物質からなる芯材をガラス管６の軸線に沿って配置した状態で細胞を培養すると、細胞は、芯材の周囲に凝集してスフェロイドを形成する。
【００８５】
本発明における温度感受性物質としては、細胞の培養温度付近でゲル状を形成できるものであればよく、このような物質としては種々のものが公知であり、当業者であれば、培養対象となる細胞の種類等に応じて、適宜選択できる。具体的にはポリアクリルアミド又はメタクリルアミド、ポリＮ−置換またはＮ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド又はメタクリルアミド、ポリアルキルビニルエーテル及びそれらの混合物より選ばれるホモポリマーもしくはコポリマーを主成分とするポリマーが挙げられ、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３２℃）並びに、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとポリオキシエチレンとのブロック共重合体等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えば、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル等が挙げられる。ＬＣＳＴとは、ゲル化転移温度である。
これらの温度感受性物質は、市販品としても入手可能であり、例えば、メビオールジェル（登録商標、株式会社池田理化）などが挙げられる。
【００８６】
得られたスフェロイドの形態が安定したら、芯材ごと他の培養液に移して温度を上昇させることにより、芯材はゾル化して培養液中に拡散し、後には管状のスフェロイドが残る。
【００８７】
スフェロイド作製装置１０４においては、このようにして管状のスフェロイドを形成することができる。
【００８８】
実施形態３に係るスフェロイド作製装置１０４は、実施形態１に係るスフェロイド作製装置の有する特長に加え、管状スフェロイドまたは紐状スフェロイド等、実施形態１に係るスフェロイド作製装置では作製できない形態のスフェロイドも容易に作製できるという特長を有する。
【実施例】
【００８９】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。
［実施例１］
１０ｍｍ×１０ｍｍのネオジウム磁石ブロックを、それぞれのＮ極Ｓ極が交互になるように並べ、直径１０ｍｍ培養ディッシュを、４つのネオジウム磁石ブロックの角部が位置する部位にディッシュの中心が位置するようにブロック上に載置して、本発明の実施形態１にかかるスフェロイド作製装置を得た。培養ディッシュに、２０ｍＭのＧＤ−ＤＴＰＡを含有する１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ補填ＤＭＥＤを所定量添加して、ＨＨ細胞株（ウシ頸動脈正常血管内皮細胞株）を１×１０４個／ｍＬの濃度で３ｍＬ播種した。
播種後、約３〜４分間、培養した結果を図７に示す。
図７に示されるように、ネオジウム磁石ブロックの角で囲まれた空隙に対応するディッシュ上に、スフェロイドが形成していることが確認できた。スフェロイドの直径は約４８０μｍであった。なお、図７中のバーは２０００μｍを示す。
【００９０】
［実施例２］
次に、本発明のスフェロイド作製装置で形成されたスフェロイドが、生細胞で構成されていることを以下のようにして確認した。
２４時間、通常の培養を行ったＨＨ細胞株を回収した後に、Ｃａｌｃｅｌｉｎ−ＡＭ染色液（同人化学社）を用いて細胞を染色した。
その後、実施例１で使用したものと同一のスフェロイド作製装置に対して、実施例１と同様にＨＨ細胞を播種した。播種後３〜４分で、４つのネオジウム磁石ブロックの角で囲まれた空隙に対応するディッシュ上に、スフェロイドが形成した。更に培養を継続し、培養１日後に、細胞を、蛍光顕微鏡により観察した。培養１日後のスフェロイドは、ほとんど、生細胞で構成されていることが確認できた。また、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、３次元合成画像及びその断面図を確認し、スフェロイド内部でも、細胞が生存していることが確認できた。
【００９１】
［実施例３］
付着性の細胞であるマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２（理研セルバンク）を用いて、Ｇｄ−ＤＴＰＡの毒性の評価を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞は、抗生物質を含有した１０％ＦＢＳ補填ＤＭＥＭを培養培地として培養したものを評価に用いた。９６ウェルプレートの各ウェルに５．０×１０３個となるように細胞を播種して、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ又は４０ｍＭの各濃度のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地を添加して、培養を開始した。１日後又は３日後に、精細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭにて蛍光染色した。染色された細胞を、倒立顕微鏡（ＩＸ−７１、オリンパス社）にて観察した。細胞の蛍光像を画像処理ソフトにて処理し、ウェルの底面に接着している細胞の面積に基づいて細胞毒性を評価した。結果を図８に示す。
【００９２】
図８に示されるように、培養１日後では、各濃度のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地で大きな差が認められず、いずれの濃度のＧｄ−ＤＴＰＡでも使用可能であることがわかった。
これに対して培養３日後では、１０ｍＭ以下のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地で、１日目と比較して細胞数が増加していることが示された。従って、３日間の培養を行う場合には、２０ｍＭ未満、特に、１０ｍＭ以下のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地を用いることが好ましいことがわかった。
【００９３】
［実施例４］
実施例３で用いたＣ２Ｃ１２細胞株を、実施例１で使用したスフェロイド作製装置を用いて実施例１と同様に培養を行った。播種密度は、ディッシュあたり、２．０×１０４個とし、培養液としては、２０ｍＭのＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培養液を用いた。培養開始直後から細胞が移動し始め、培養５分後には、直径約６００μｍのスフェロイドが確認できた。
【００９４】
このように、本発明によれば、スフェロイドを短時間で形成できる。
【符号の説明】
【００９５】
１ 培養ディッシュ
２ 磁石
３ 磁石
４ 軟鋼板
５ 孔
６ ガラス管
７ 円筒状磁石
７Ａ セグメント
１００ スフェロイド作製装置
１０２ スフェロイド作製装置
１０４ スフェロイド作製装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体細胞を増殖させて種々の用途に利用することが多くの分野で行われている。例えば、肝細胞は、薬物・毒物試験や人工肝臓の原材料などとして用いられているため、肝細胞を効率よく培養することが要請されている。しかしながら、肝細胞は、血液細胞などの他の生体細胞よりも外界に対する感受性が高く、生体外に取り出すと、すぐにその機能を消失するという問題がある。そのため、より生体内に近い培養形態であるスフェロイド（球状組織体）を形成させた状態で肝細胞を培養するスフェロイド培養法が注目されている。
スフェロイドは、細胞が多数凝集し形成された球状の細胞塊であり、スフェロイドの状態で培養すること、即ち、スフェロイド培養は、より生体に近い環境となるため、従来の単層培養に比べ、生体細胞、特に肝細胞を用いた場合に、細胞の機能維持が長期にわたり（１ヶ月以上）可能となる。
【０００３】
スフェロイドを作製するための方法としては、たとえば、懸滴培養、細胞非接着表面での培養、マイクロウェル内での培養、回転培養、足場を利用した三次元培養、温度応答性ポリマーによる細胞シートの作製、遠心力や超音波、電場・磁場による凝集などがある（非特許文献１）。
【０００４】
スフェロイドの作製法としては、また、碁盤目状またはハニカム状のセルが連続した細胞培養構造体での培養もある（特許文献１）。
【０００５】
また、磁場で細胞を凝集させてスフェロイドを作製するときは、細胞に磁性粒子を取り込ませたものを磁場でハンドリングすることが行われている（非特許文献２）。
【０００６】
【非特許文献１】R. Lin and H. Chang, "Recent advances in three-dimensional multicellularspheroid culture for biomedical research," Biotechnology Journal, vol. 3, 2008, pp 1172-1184.
【特許文献１】国際公開第２００７／０９７１２１パンフレット
【非特許文献２】Glauco R, Souza, et al, "Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation" Nature Biotechnology, vol. 5, April, 2010, pp291-296
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、懸滴培養は、特別な装置は不要であるものの、操作が煩雑であり、スフェロイドの大量生産が困難であるという問題がある。
【０００８】
また、細胞非接着表面での培養は、スフェロイドのサイズや形状の制御が困難であり、得られるスフェロイドのサイズや形状のバラツキが大きいという問題がある。
【０００９】
マイクロウェル内での培養や細胞培養構造体での培養は、スフェロイドのサイズや形状の制御が容易であるという特長はあるものの、培養に使用するマイクロウェルや細胞培養構造体の作製に微細加工が必要であるという問題点がある。
【００１０】
回転培養は、専用の装置を必要とするうえ、得られるスフェロイドのサイズや形状のバラツキが大きいという問題があり、また、スフェロイドを構成する細胞に培養中に剪断応力が作用し、この剪断応力のために細胞が破壊される可能性がある。
【００１１】
足場を利用した三次元培養には、専用の足場を予め作製する必要があるという問題がある。
【００１２】
温度応答性ポリマーによる細胞シートの作製には、細胞を予め温度応答性ポリマーにグラフトさせる必要があるという問題がある。
【００１３】
遠心力や超音波、電場で細胞を凝集させる方法には、遠心力や超音波、電場が細胞にどのような影響を及ぼすか不明であるという問題がある。磁場により細胞を凝集させる場合においても、超電導磁石によって強力な磁場を印加した場合には、細胞に好ましくない影響が及ぼされる可能性があると考えられる。
【００１４】
更に、細胞に磁性粒子を取り込ませたものを磁場でハンドリングして凝集させてスフェロイドを作製する方法には、スフェロイド作製後、細胞に磁性微粒子が残存するため、得られるスフェロイドは組織工学技術への応用に不向きである。
【００１５】
本発明は、上記問題を解決すべく成されたもので、スフェロイドを短時間で形成できる上、スフェロイドのサイズや形状の制御が容易であり、また、特別な装置が不要なスフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
請求項１に記載の発明は、培養液の磁化率を増大させ得る磁化率増大化合物を含有する培養液中で細胞が培養される培養容器と、磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加する磁場印加手段と、を備えるスフェロイド作製装置に関する。
【００１７】
前記スフェロイド作製装置においては、前記培養容器には、磁場勾配を有する磁場が印加される。
【００１８】
そして、培養液には、磁化率増大化合物が含有されている。ここで、磁化率増大化合物とは、磁化率が高く、且つ培養液に可溶な化合物である。このような磁化率増大化合物を培養液中に含有させることにより、培養液全体の磁化率χｍが増大するから細胞は相対的に反磁性を有するようになる。したがって、磁場印加手段として非常に大きな磁気力場を必要とすることなく、磁気アルキメデス効果により、磁場印加手段としてネオジム磁石などの通常の永久磁石を用いた場合においても、培養液中の細胞は、磁場印加手段からの磁場によって、磁束密度が周囲よりも低い領域に移動してスフェロイドを形成する。
【００１９】
請求項２に記載の発明は、前記磁化率増大化合物がガドリニウム化合物である請求項１記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２０】
前記すファロイド作製装置においては、磁化率増大化合物として細胞毒性の特に低いガドリニウム化合物を使用している。
【００２１】
請求項３に記載の発明は、前記培養容器が皿状容器であり、前記磁場印加手段が、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石である請求項１に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２２】
前記スフェロイド作製装置においては、磁石と磁石との間の角の領域の磁束密度がそれ以外の領域の磁束密度よりも小さくなる。したがって、培養液中の細胞は、磁石と磁石との間の角の磁束密度の低い領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００２３】
請求項４に記載の発明は、前記培養容器が皿状容器であり、前記磁場印加手段が、前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、前記磁石と前記培養容器との間に配置され、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、を有する請求項１に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２４】
強磁性体は、皿状容器を形成するガラスやプラスチックスのような材質、および空気と比較して透磁率が高い。したがって、磁束密度は、前記強磁性体の板状体の部分では高く、板状体に形成された孔の部分では低くなる。
【００２５】
したがって、前記板状体の孔の間の部分から前記孔に向かって磁束密度が低下するような磁場勾配が形成されるから、培養液中の細胞は、前記孔の領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００２６】
請求項５に記載の発明は、前記培養容器が有底円筒状容器であり、前記磁場印加手段が、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石である請求項１に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００２７】
前記スフェロイド作製装置においては、前記円筒状磁石によって、前記有底円筒状容器の外側から中心部に向かって磁束密度が低下するような磁場勾配が形成される。
【００２８】
したがって、前記有底円筒状容器中の細胞は、磁束密度の低い前記有底円筒状容器の中心部に移動して前記有底円筒状容器の軸線に沿った紐状のスフェロイドを形成する。
【００２９】
請求項６に記載の発明は、前記培養液に含まれるガドリニウム化合物はガドリニウム錯体である請求項２〜５の何れか１項に記載のスフェロイド作製装置に関する。
【００３０】
前記スフェロイド作製装置において前記培養液に含まれるガドリニウム化合物として使用されるガドリニウム錯体は細胞毒性が低いという特長を有する。
【００３１】
請求項７に記載の発明は、磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加した状態で、前記培養容器内で、磁化率増大化合物を含有する培養液を用いて細胞を培養するスフェロイド作製方法に関する。
【００３２】
前記スフェロイド作製方法においては、磁場印加手段によって磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加しつつ、前記培養容器内で細胞を培養する。
【００３３】
一方、培養液として磁化率増大化合物を含有したものを用いるから、培養液全体の磁化率χｍが増大する。
【００３４】
したがって、培養液中の細胞は相対的に反磁性となるから、磁束密度が周囲よりも低い領域に移動し、スフェロイドを形成する。
【００３５】
請求項８に記載の発明は、前記磁化率増大化合物としてガドリニウム化合物を使用する請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００３６】
前記スフェロイド作製方法においては、磁化率増大化合物として細胞毒性の特に低いガドリニウム化合物を使用している。
【００３７】
請求項９に記載の発明は、前記培養容器として皿状容器を用い、前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石を用いる請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００３８】
前記スフェロイド作製方法においては、請求項３のところで述べたのと同様の理由により、培養液中の細胞は磁石と磁石との間の角の磁束密度の低い領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００３９】
請求項１０に記載の発明は、前記培養容器として皿状容器を用い、前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、前記磁石と前記培養容器との間に位置し、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、を用いる請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００４０】
前記スフェロイド作製方法においては、請求項３のところで述べたのと同様の理由により、培養液中の細胞は強磁性体の板状体の孔が形成された領域に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００４１】
請求項１１に記載の発明は、前記培養容器として有底円筒状容器を用い、前記磁場印加手段として、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石を用いた請求項７に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００４２】
前記スフェロイド作製方法においては、請求項４のところで述べたのと同様の理由により、前記有底円筒状容器中の細胞は、前記有底円筒状容器の中心部に移動して前記有底円筒状容器の軸線に沿った紐状のスフェロイドを形成する。
【００４３】
請求項１２に記載の発明は、前記有底円筒状容器の中心線上に、前記細胞の培養温度ではゲルであり、前記培養温度よりも高い温度または低い温度ではゾルとなる温度感受性物質からなる芯材を配置して前記細胞を培養する細胞を培養する請求項１１に記載のスフェロイド作製方法に関する。
【００４４】
前記スフェロイド作製方法においては、前記細胞の培養時には前記芯材はゲルであるから、前記細胞は、前記芯材の表面に凝縮した状態で増殖する。前記細胞が増殖し、所定のサイズ、形状のスフェロイドが得られたら、前記培養液を昇温、または降温させることにより、前記芯材はゾルに変化して培養液中に流れ去る。これにより、管状のスフェロイドが得られる。
【発明の効果】
【００４５】
以上説明したように本発明のスフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法によれば、磁場勾配のみで細胞をハンドリングできるから、培養しようとする細胞を磁性微粒子でマーキングしたり、前記細胞に磁性微粒子を取り込ませたりする必要がないので、組織技術に向いたスフェロイドまたは細胞塊が得られる。また、装置が培養容器と永久磁石とから構成できるから、安価に装置を構成できる。更に、第１の細胞からスフェロイドを作製後、第１の細胞とは異なる第２の細胞を播種することにより、複数種の細胞からなるスフェロイドを容易に形成できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１において（Ａ）は、実施形態１に係るスフェロイド作製装置の構成を示す断面図であり、（Ｂ）は、前記スフェロイド作製装置を上方から見た平面図である。
【図２】図２において（Ａ）は、実施形態２に係るスフェロイド作製装置の構成を示す断面図であり、（Ｂ）は、前記スフェロイド作製装置を上方から見た平面図である。
【図３】図３において、（Ａ）および（Ｂ）は、夫々実施形態１および実施形態２に係るスフェロイド作製装置において、磁石によって培養ディッシュ内に生じる磁束の密度と、培養ディッシュ内においてスフェロイドが生成する領域との関係を示す説明図である。
【図４】図４は、実施形態３に係るスフェロイド作製装置の構成を示す断面図である。
【図５】図５は、実施形態３に係るスフェロイド作製装置において磁石が形成する磁束Ｈの分布状態を示す説明図である。
【図６】図６は、実施形態３に係るスフェロイド作製装置において、ガラス管の軸線に沿って芯材を配置して管状のスフェロイドを形成するところを示す断面図である。
【図７】図７は、本発明の実施例１にかかるスフェロイドの顕微鏡写真像である。
【図８】図８は、本発明の実施例３にかかるＧｄ−ＤＴＰＡの細胞毒性の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
１．実施形態１
以下、本発明のスフェロイド作製装置の一例について図面を用いて詳細に説明する。
実施形態１に係るスフェロイド作製装置１００は、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、皿状の培養容器の一例としての培養ディッシュ１と、培養ディッシュ１の下側に平面視で格子状に配設された一群の磁石２とを有する。磁石２は、本発明における磁場印加手段の一例である。
【００４８】
磁石２は、Ｎ極とＳ極とが交互に並ぶように配置されている。磁石２としては、ネオジム磁石などの希土類磁石が使用される。
【００４９】
一方、培養ディッシュ１には、培養液の磁化率を増大させる磁化率増大化合物を含有する培養液が収容されている。
培養に用いられる培養液としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｅｍ−α、ＲＰＭＩ１６４０等を挙げることができる。培養液には、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知の血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０ｖ／ｖ％とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
【００５０】
磁化率増大化合物は、培養液の磁化率を増大させ得る化合物であれば、本発明に適用可能である。なお、「培養液の磁化率を増大させ得る」とは、化合物の添加後において、添加対象となる培養液の磁化率が、添加前の磁化率よりも増大することを意味する。
このような磁化率増大化合物としては、鉄化合物、マンガン化合物並びに、ガドリニウム化合物、テルビウム化合物、ジスプロシウム化合物及びホルミウム化合物などのランタニド化合物などの強磁性の化合物を挙げることができる。これらの化合物は、細胞毒性を緩和する観点から、キレート化合物との錯体を形成していることが好ましい。キレート化合物としては、ジエチレントリアミンテトラ酢酸（ＤＴＰＡ）や１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）を挙げることができる。
【００５１】
磁化率増大化合物としては、例えば、塩化第一鉄、塩化マンガン、ガドリニウム錯体、テルビウム錯体などを挙げることができる。中でも、細胞毒性等の観点からガドリニウム化合物であることが好ましく、ガドリニウムとキレート化合物との錯体、例えば、ＤＴＰＡでキレート化された３価ガドリニウム（Ｇｄ（III））（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）又はＤＯＴＡでキレート化された３価ガドリニウム（Ｇｄ（III））（Ｇｄ−ＤＯＴＡ）がより好ましい。これらの磁化率増大化合物の使用濃度は、用いられる強磁性体化合物によって異なるが、例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡの場合には、４ｍＭ〜４０ｍＭであることが好ましく、細胞毒性の観点から４ｍＭ〜１５ｍＭであることがより好ましい。
【００５２】
本発明における適用可能な細胞としては、特に制限はなく、肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚、脂肪等から採取される初代細胞や、各種の因子を導入して得られた初期化したマウスｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells、人工多能性幹細胞）、未分化な幹細胞、胚由来のＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell）、血管内皮細胞、樹立されている株化細胞、またはこれらに遺伝子操作等を施した細胞等であって、増殖可能な細胞を好ましく用いることができる。
【００５３】
以下、スフェロイド作製装置１００の作用について説明する。
【００５４】
上述のように、培養ディッシュ１の下方には磁石２が配設されているから、培養ディッシュ１中の細胞には、磁場による力Ｆｍと重力Ｆｇを合わせた力Ｆが作用する。力Ｆは、以下の式１：
【数１】
但し、上の式１において、χｐおよびχｍは夫々細胞および培養液の磁化率であり、Ｖは細胞の体積であり、μ０は真空での透磁率であり、Ｂは磁束密度であり、Ｂ・∇は磁場勾配であり、ρｐ、ρｍは夫々細胞および培養液の密度である。
【００５５】
そして、上述のように培養液はガドリニウム化合物であるＧｄ−ＤＴＰＡを含有しているから、培養液の磁化率χｍが増大する。これにより、細胞は相対的に反磁性体となるから、細胞に作用する力Ｆは負の値となり、細胞は磁束密度Ｂの低い領域に移動しようとする。
【００５６】
各磁石２にはＮ極からＳ極に向かう方向の磁力線が生じる。しかしながら、磁石２は、Ｎ極とＳ極とが隣り合うように格子状に配列されているから、各磁石２で生じた磁力線は、磁石２と磁石２との間の角の部分で互いに弱め合う。したがって、図３（Ａ）に示すように、磁石２の上方においては磁束密度Ｂが高くなり、磁石２と磁石２との間の角の部分では磁束密度Ｂが低くなる。
【００５７】
したがって、培養液中の細胞は、図３（Ａ）において矢印ａに示すように、磁束密度Ｂの低い領域である磁石２と磁石２との間の角の部分に移動する方向の力を受け、図１（Ａ）および（Ｂ）において円で示し、図３（Ａ）において二点鎖線で示すように磁石２と磁石２との間の角の領域に集まってスフェロイドを形成する。
【００５８】
次に、スフェロイド作製装置１００を用いてスフェロイドを作製する手順について説明する。
【００５９】
先ず、細胞種に応じた培養液にＧｄ−ＤＴＰＡを添加して、所定濃度のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培養液を調製し、培養ディッシュ１に収容する。
【００６０】
これと平行して、スフェロイドを形成しようとする細胞を例えば１０３〜１０６cell/mLの濃度で懸濁させた懸濁液を調製し、この懸濁液を培養ディッシュ１中の培養液に播種する。なお、細胞の播種密度は、細胞の種類等により適宜調整可能である。
【００６１】
この状態で重合することにより、培養ディッシュ１における磁石２の間の角の部分にスフェロイドが形成される。このスフェロイドの形成は数分もあれば充分であるが、培養を１〜７日間継続させてもよい。これにより、スフェロイドのサイズや形状が安定する。スフェロイドが形成された後は、培養ディッシュ１中の培養液を、Ｇｄ−ＤＴＰＡを含有しないものと交換して細胞培養を継続する。これにより、所定の直径を有する球状のスフェロイドが形成される。
【００６２】
スフェロイド作製装置１００においては、培養液にＧｄ−ＤＴＰＡを配合することにより、培養液そのものの磁化率χｍを増大させて細胞を相対的に反磁性体としているから、磁石２は、希土類磁石のような通常の永久磁石でよく、超電導磁石のような強力な磁石は不要である。
【００６３】
したがって、細胞をハンドリングするための磁石として超電導磁石を用いた場合と比較して構成が著しく簡略化されるとともに、細胞が極めて強力な磁場に曝されることがないから、強力な磁場に曝されることによる悪影響を回避できる。
【００６４】
また、スフェロイド作製装置１００においては、磁石２で形成される磁場勾配のみで細胞をハンドリングするから、大量の細胞を同時にハンドリングすることが極めて容易である。また、細胞を磁界によってハンドリングするために磁性微粒子でマーキングしたり、磁性微粒子を取り込ませたりする必要がないので、組織工学技術に向いたスフェロイドまたは細胞塊が得られる。
【００６５】
加えて、磁石２によって形成される磁場勾配の大きさや培養液中の細胞濃度を制御することにより、スフェロイドのサイズを精度よくコントロールできる。
【００６６】
更に、スフェロイドを作製後、他の細胞を播種することにより、複数種の細胞からなるスフェロイドを容易に形成できる
【００６７】
２．実施形態２
以下、本発明のスフェロイド作製装置の他の例について図面を用いて詳細に説明する。
実施形態２に係るスフェロイド作製装置１０２は、図２に示すように、培養ディッシュ１と、培養ディッシュ１を挟むように配設された２個の電磁石３Ｎ、３Ｓとを有する。電磁石３Ｎ、３Ｓは、本発明における磁場印加手段の一例である。電磁石３Ｎ、３Ｓは、磁極が相対向するように配設されている。
【００６８】
電磁石３Ｎと培養ディッシュ１との間には、強磁性体の板状体の一例である軟鋼板４が配設されている。軟鋼板４には、孔５が格子状に穿設されている。
【００６９】
また、電磁石３Ｎ、３Ｓの間隔が小さいほうが磁場勾配が大きくなるため、培養ディッシュ１としては、マイクロ流体チップなどの厚さ１ｍｍ以下のデバイスが好適に使用される。培養ディッシュ１としてこのようなデバイスを使用する場合、培養ディッシュ１の内面をＭＰＣポリマーやＰＴＦＥなどでコーティングして内面に細胞が接着しないようにすることが好ましい。
【００７０】
培養液、培養液に配合されるガドリニウム化合物、および培養液中で培養される細胞については実施形態１のところで述べたとおりである。
【００７１】
以下、スフェロイド作製装置１０２の作用について説明する。
【００７２】
スフェロイド作製装置１０２においても、培養ディッシュ１内部の細胞に作用する力については、実施形態１のところで説明したとおりであるから、細胞は磁束密度Ｂの低い領域に移動しようとする。
【００７３】
磁束Ｈは、電磁石３Ｎの磁極から電磁石３Ｓの磁束に向かって培養ディッシュ１を下方から上方に向かって通過する。
【００７４】
しかしながら、電磁石３Ｎと培養ディッシュ１との間には、孔５が格子状に穿設された軟鋼板４が配置されている。そして、軟鋼板４は強磁性体であるから、当然のことながら透磁率は空気よりも遥かに高い。
【００７５】
したがって、磁束Ｈは、軟鋼板４における孔５の穿設されていない部分を優先的に通過するから、図３（Ｂ）に示すように、磁束密度Ｂは軟鋼板４における孔５の無い部分では高く、孔５の穿設された部分では低くなる。
【００７６】
したがって、図３に示すように、細胞は、培養ディッシュ１における孔５に対応する位置に向かって移動してスフェロイドを形成する。
【００７７】
実施形態２に係るスフェロイド作製装置１０２は、実施形態１に係るスフェロイド作製装置の有する特長に加え、軟鋼板４に穿設する孔５の位置を設定することにより、培養ディッシュ１内部におけるスフェロイドを形成する位置を自由に設定できるという特長を有する。また、電磁石３Ｎ、３Ｓをｏｎ、ｏｆｆすることにより、培養ディッシュ１内部に形成されたスフェロイドを回収することが可能である。
【００７８】
３．実施形態３
以下、本発明のスフェロイド作製装置の更に別の例について図面を用いて詳細に説明する。実施形態３に係るスフェロイド作製装置１０４は、図４に示すように、有底円筒状の培養容器の一例としてのガラス管６と、ガラス管６を取り囲むように配設された円筒状磁石７と、を備える。
【００７９】
ガラス管６の内部には培養液が収容される。
【００８０】
一方、円筒状磁石７は、周方向に複数、例えば６個のセグメント７Ａに分割されている。但し、セグメント７Ａの分割個数は偶数であれば６個には限定されず、４個、８個、１０個、および１２個等、種々の個数が可能である。但し、実用性の点からは、分割個数は４個、６個、および８個が好ましい。
【００８１】
各セグメント７Ａは、図４に示すように内壁と外壁とで反対の極性となるように着磁されている。したがって、セグメント７Ａのうち、内壁がＮ極のものは外壁がＳ極に着磁され、内壁がＳ極のものは外壁がＮ極に着磁されている。
【００８２】
円筒状磁石７は、ガラス管６を取り囲むとともに、各セグメント７ＡのＳ極とＮ極とが交互にガラス管６に面するように配置されている。したがって、図５に示すように、円筒状磁石７の内壁には、互いに隣接する２個のセグメント７Ａ毎にＮ極からＳ極に向かう方向の磁束Ｈが生じる。
【００８３】
しかしながら、これらの磁束Ｈは互いに反発し合うから、ガラス管６の中心部に磁束密度Ｂの低い領域が形成される。したがって、図５に示すように、ガラス管６内に収容された培養液中の細胞は、ガラス管６の中心部に移動して紐状のスフェロイドを形成する。
【００８４】
なお、図６に示すように、細胞培養温度ではゾルであり、温度を変化させることによりゲルに変化する温度感受性物質からなる芯材をガラス管６の軸線に沿って配置した状態で細胞を培養すると、細胞は、芯材の周囲に凝集してスフェロイドを形成する。
【００８５】
本発明における温度感受性物質としては、細胞の培養温度付近でゲル状を形成できるものであればよく、このような物質としては種々のものが公知であり、当業者であれば、培養対象となる細胞の種類等に応じて、適宜選択できる。具体的にはポリアクリルアミド又はメタクリルアミド、ポリＮ−置換またはＮ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド又はメタクリルアミド、ポリアルキルビニルエーテル及びそれらの混合物より選ばれるホモポリマーもしくはコポリマーを主成分とするポリマーが挙げられ、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３２℃）並びに、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとポリオキシエチレンとのブロック共重合体等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えば、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル等が挙げられる。ＬＣＳＴとは、ゲル化転移温度である。
これらの温度感受性物質は、市販品としても入手可能であり、例えば、メビオールジェル（登録商標、株式会社池田理化）などが挙げられる。
【００８６】
得られたスフェロイドの形態が安定したら、芯材ごと他の培養液に移して温度を上昇させることにより、芯材はゾル化して培養液中に拡散し、後には管状のスフェロイドが残る。
【００８７】
スフェロイド作製装置１０４においては、このようにして管状のスフェロイドを形成することができる。
【００８８】
実施形態３に係るスフェロイド作製装置１０４は、実施形態１に係るスフェロイド作製装置の有する特長に加え、管状スフェロイドまたは紐状スフェロイド等、実施形態１に係るスフェロイド作製装置では作製できない形態のスフェロイドも容易に作製できるという特長を有する。
【実施例】
【００８９】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。
［実施例１］
１０ｍｍ×１０ｍｍのネオジウム磁石ブロックを、それぞれのＮ極Ｓ極が交互になるように並べ、直径１０ｍｍ培養ディッシュを、４つのネオジウム磁石ブロックの角部が位置する部位にディッシュの中心が位置するようにブロック上に載置して、本発明の実施形態１にかかるスフェロイド作製装置を得た。培養ディッシュに、２０ｍＭのＧＤ−ＤＴＰＡを含有する１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ補填ＤＭＥＤを所定量添加して、ＨＨ細胞株（ウシ頸動脈正常血管内皮細胞株）を１×１０４個／ｍＬの濃度で３ｍＬ播種した。
播種後、約３〜４分間、培養した結果を図７に示す。
図７に示されるように、ネオジウム磁石ブロックの角で囲まれた空隙に対応するディッシュ上に、スフェロイドが形成していることが確認できた。スフェロイドの直径は約４８０μｍであった。なお、図７中のバーは２０００μｍを示す。
【００９０】
［実施例２］
次に、本発明のスフェロイド作製装置で形成されたスフェロイドが、生細胞で構成されていることを以下のようにして確認した。
２４時間、通常の培養を行ったＨＨ細胞株を回収した後に、Ｃａｌｃｅｌｉｎ−ＡＭ染色液（同人化学社）を用いて細胞を染色した。
その後、実施例１で使用したものと同一のスフェロイド作製装置に対して、実施例１と同様にＨＨ細胞を播種した。播種後３〜４分で、４つのネオジウム磁石ブロックの角で囲まれた空隙に対応するディッシュ上に、スフェロイドが形成した。更に培養を継続し、培養１日後に、細胞を、蛍光顕微鏡により観察した。培養１日後のスフェロイドは、ほとんど、生細胞で構成されていることが確認できた。また、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、３次元合成画像及びその断面図を確認し、スフェロイド内部でも、細胞が生存していることが確認できた。
【００９１】
［実施例３］
付着性の細胞であるマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２（理研セルバンク）を用いて、Ｇｄ−ＤＴＰＡの毒性の評価を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞は、抗生物質を含有した１０％ＦＢＳ補填ＤＭＥＭを培養培地として培養したものを評価に用いた。９６ウェルプレートの各ウェルに５．０×１０３個となるように細胞を播種して、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ又は４０ｍＭの各濃度のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地を添加して、培養を開始した。１日後又は３日後に、精細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭにて蛍光染色した。染色された細胞を、倒立顕微鏡（ＩＸ−７１、オリンパス社）にて観察した。細胞の蛍光像を画像処理ソフトにて処理し、ウェルの底面に接着している細胞の面積に基づいて細胞毒性を評価した。結果を図８に示す。
【００９２】
図８に示されるように、培養１日後では、各濃度のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地で大きな差が認められず、いずれの濃度のＧｄ−ＤＴＰＡでも使用可能であることがわかった。
これに対して培養３日後では、１０ｍＭ以下のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地で、１日目と比較して細胞数が増加していることが示された。従って、３日間の培養を行う場合には、２０ｍＭ未満、特に、１０ｍＭ以下のＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培地を用いることが好ましいことがわかった。
【００９３】
［実施例４］
実施例３で用いたＣ２Ｃ１２細胞株を、実施例１で使用したスフェロイド作製装置を用いて実施例１と同様に培養を行った。播種密度は、ディッシュあたり、２．０×１０４個とし、培養液としては、２０ｍＭのＧｄ−ＤＴＰＡを含有する培養液を用いた。培養開始直後から細胞が移動し始め、培養５分後には、直径約６００μｍのスフェロイドが確認できた。
【００９４】
このように、本発明によれば、スフェロイドを短時間で形成できる。
【符号の説明】
【００９５】
１ 培養ディッシュ
２ 磁石
３ 磁石
４ 軟鋼板
５ 孔
６ ガラス管
７ 円筒状磁石
７Ａ セグメント
１００ スフェロイド作製装置
１０２ スフェロイド作製装置
１０４ スフェロイド作製装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液の磁化率を増大させ得る磁化率増大化合物を含有する培養液中で細胞が培養される培養容器と、
磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加する磁場印加手段と、
を備えるスフェロイド作製装置。
【請求項２】
前記磁化率増大化合物はガドリニウム化合物である請求項１記載のスフェロイド作製装置。
【請求項３】
前記培養容器は皿状容器であり、
前記磁場印加手段は、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石である
請求項１に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項４】
前記培養容器は皿状容器であり、
前記磁場印加手段は、
前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、
前記磁石と前記培養容器との間に配置され、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、
を有している請求項１に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項５】
前記培養容器は有底円筒状容器であり、
前記磁場印加手段は、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石である
請求項１に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項６】
前記ガドリニウム化合物はガドリニウム錯体である請求項２〜５の何れか１項に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項７】
磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加した状態で、磁化率増大化合物を含有する培養液を用いて、前記培養容器内で細胞を培養するスフェロイド作製方法。
【請求項８】
前記磁化率増大化合物としてガドリニウム化合物を使用する請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項９】
前記培養容器として皿状容器を用い、
前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石を用いる
請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１０】
前記培養容器として皿状容器を用い、
前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、前記磁石と前記培養容器との間に位置し、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、を用いる
請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１１】
前記培養容器として有底円筒状容器を用い、
前記磁場印加手段として、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石を用いた
請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１２】
前記有底円筒状容器の中心線上に、前記細胞の培養温度ではゲルであり、前記培養温度よりも高い温度または低い温度ではゾルとなる温度感受性物質からなる芯材を配置して前記細胞を培養する請求項１１に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１】
培養液の磁化率を増大させ得る磁化率増大化合物を含有する培養液中で細胞が培養される培養容器と、
磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加する磁場印加手段と、
を備えるスフェロイド作製装置。
【請求項２】
前記磁化率増大化合物はガドリニウム化合物である請求項１記載のスフェロイド作製装置。
【請求項３】
前記培養容器は皿状容器であり、
前記磁場印加手段は、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石である
請求項１に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項４】
前記培養容器は皿状容器であり、
前記磁場印加手段は、
前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、
前記磁石と前記培養容器との間に配置され、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、
を有している請求項１に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項５】
前記培養容器は有底円筒状容器であり、
前記磁場印加手段は、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石である
請求項１に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項６】
前記ガドリニウム化合物はガドリニウム錯体である請求項２〜５の何れか１項に記載のスフェロイド作製装置。
【請求項７】
磁場勾配を有する磁場を培養容器に印加した状態で、磁化率増大化合物を含有する培養液を用いて、前記培養容器内で細胞を培養するスフェロイド作製方法。
【請求項８】
前記磁化率増大化合物としてガドリニウム化合物を使用する請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項９】
前記培養容器として皿状容器を用い、
前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極とＳ極とが交互に前記皿状容器に向かって配置されるように格子状に並べられた複数の磁石を用いる
請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１０】
前記培養容器として皿状容器を用い、
前記磁場印加手段として、前記皿状容器の下方に、Ｎ極またはＳ極が前記皿状容器に向かって配置された磁石と、前記磁石と前記培養容器との間に位置し、複数の孔が形成された強磁性体の板状体と、を用いる
請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１１】
前記培養容器として有底円筒状容器を用い、
前記磁場印加手段として、周方向に沿って複数のセグメントに分割され、前記有底円筒状容器を取り囲むとともに、各セグメントのＳ極とＮ極とが交互に前記有底円筒状容器に面するように配置されている円筒状磁石を用いた
請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１２】
前記有底円筒状容器の中心線上に、前記細胞の培養温度ではゲルであり、前記培養温度よりも高い温度または低い温度ではゾルとなる温度感受性物質からなる芯材を配置して前記細胞を培養する請求項１１に記載のスフェロイド作製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−６５５５５（Ｐ２０１２−６５５５５Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１０８７６（Ｐ２０１０−２１０８７６）
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
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