セミカルバジド又はカルボヒドラジドの存在下における（３−ヒドロキシ）プロピオンアルデヒドの発酵による製造方法
本発明の主題は、アルデヒド並びにその酸化−及び還元生成物の製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明の主題は、アルデヒド並びにその酸化−及び還元生成物の製造方法である。
【０００２】
背景技術
アルデヒドを酵素によって製造する方法は、文献中にしばしば記載されている。
例えば、WO2009001304は、１３−ヒドロペルオキシド−リアーゼの協力下での多不飽和脂肪酸からのアルデヒドの製造方法を記載する。
３−メチルブタナールの獲得のための生化学的経路は、Smit et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 81, 987-999に記載されている。
メタノール−オキシダーゼ及びカタラーゼ（ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、カンジダ（Candida）、又はトルロプシス（Torulopsis）由来）を用いた、アルコールからのアルデヒドの製造はUS5783429に説明されている。キシレン−又はアルカンモノオキシゲナーゼの適用下では、WO2001031047によれば芳香族アルデヒド誘導体が獲得される。
【０００３】
３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）は、アクリル酸、ポリマー及びプラスチックの工業的製造のための重要なモノマーへと、並びに、同様に有用なアクリル酸エステルへと反応させられる。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから誘導可能である更なる有用な生成物は、１，３−プロパンジオール（還元により）、３−ヒドロキシプロピオン酸（酸化により）及びアクロレイン（脱水により）である。従来市販の供給源が３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドのために提供されていないので、グリセリンからの、特にロイテリンの形にある３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの製造が集中的に研究される。
【０００４】
８０年代の終わりに既に、Talarico及びDobrogosz, Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33, 674-679は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いてグリセリンから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを発酵により製造することを記載する。
Ｏ2制限の使用下の類似の方法はUS5413960に記載されている。
【０００５】
DK180099は、グリセリンの連続的供給及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）DSM12246の使用を伴う方法を開示する。
【０００６】
Doleyres et al . , Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Sep ; 68 (4) :467-74は、様々な成長条件下のＬ．ロイテリATCC 53608中の３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの製造方法を記載し、かつ、この生体触媒の繰り返した使用が強力に減少する活性のために可能でないことを示す。
【０００７】
CN1778935は、セミカルバジドの存在下のクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）DSM2026を用いたグリセリン溶液の一工程発酵を記載する。
【０００８】
US4962027は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）NRRL B-4011による好気的二工程発酵における３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの製造方法を記載し、その際、第一工程においてまず細胞マス及びグリセリン−デヒドラターゼを産生し、第二工程においてセミカルバジドの存在下でグリセリンを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと反応させる。
【０００９】
EP1669457は、（特に）Ｋ．ニューモニエを用いて、補酵素Ｂ12の添加下で、細胞／基質比を高めることによって３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドをほぼ定量的な収率においてバイオテクノロジーによる製造を記載する。
【００１０】
全ての記載の方法は、収率及び変換率が低い点で共通している。さらに、記載の方法においては、常に、生体触媒の提供のための多くの手間が必要であり、これは次いで短い耐用時間しか示さず、すなわち、引き続き短時間だけしか使用できない。
【００１１】
本発明の課題は、したがって、背景技術の記載の欠点を克服する方法を提供することであった。
【００１２】
発明の詳細な説明
意外なことに、以下に記載の方法は本発明により課せられた課題を解決できることが見出された。
【００１３】
本発明の主題は、したがって、
次の方法工程
Ａ）好ましくは水溶液のビシナールジオールとヒドロ−リアーゼとを接触させる工程、
Ｂ）方法工程Ａ）において形成されたアルデヒド及びヒドロ−リアーゼを分離する工程、
Ｃ）方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いて、方法工程Ａ）及びＢ）を少なくとも１回繰り返す工程、及び場合によって
Ｄ）形成されたアルデヒドを単離する工程
を含むアルデヒドの製造方法であって、
アルデヒドと結合を形成する化合物の存在下で実施することを特徴とする製造方法である。
【００１４】
本発明の更なる主題は、前述の方法により得られたアルデヒドの酸化−及び還元生成物の製造方法である。
【００１５】
本発明の方法の利点は、使用されるアルコールに対するアルデヒドに関するほぼ定量的な収率、生体触媒として使用されるヒドロ−リアーゼの長い耐用時間及びその反復可能性である。これによって、連続方法の方式が可能になる。
本発明の方法の更なる利点は、形成されたアルデヒドに対して、生体触媒として使用されるヒドロ−リアーゼの副活性、例えばアルデヒドのアルコールへの更なる還元の抑制の必要がないことである。
本発明の更なる利点は、本発明の方法が、大部分が酸素の排除下又は減少下で作業できる手段を提供することにあり、これによって、例えば生成物の、腐食及び不所望な酸化が減少されることができ、より簡易な装置構造が可能になり、かつ、エネルギーが節約されることができ、並びに、バイオテクノロジー反応器のガス曝露の他の知られている問題、例えば泡形成が抑制されることができる。
【００１６】
本発明の関連において「アルデヒド」との概念下では、同様に、アルデヒドの水和物及びダイマー、並びに、これら化合物の混合物が理解され、並びに３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの場合には例えばロイトリンである。全ての記載のパーセント（％）は、他のことが記載されていない限りは、質量パーセントである。
【００１７】
ヒドロ−リアーゼとしては、本発明の方法においては、ＥＣクラス４．２．１．Ｘに列記されている酵素が使用されることができる。
ここでは特に、補酵素Ｂ12に依存しないで活性がある、すなわち、補酵素Ｂ12又はこの物質のための代替物質／類似物、例えばコリノイド、コバラミンの存在なしでもヒドロ−リアーゼ活性を有するヒドロ−リアーゼが、本発明の方法にとっては好ましい。このようなヒドロ−リアーゼの例示的な代表物は、WO200814864から認識できる。
【００１８】
本発明の方法において好ましく使用されるヒドロ−リアーゼは、グリセリン−デヒドラターゼ又はジオール−デヒドラターゼ並びにプロパンジオール−デヒドラターゼ（EC 4.2.1.30, EC 4.2.1.28）である。この関連において、特に、属クレブシエラ（Klebsiella）、シトロバクター（Citrobacter）、クロストリジウム（Clostridium）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、エンテロバクター（Enterobacter）、カロラマトール（Caloramator）、サルモネラ（Salmonella）及びリステリア（Listeria）の群から選択される微生物から単離可能なグリセリン−デヒドラターゼ、特に好ましくは種クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、シトロバクター・ニューモニエ（Citrobacter pneumoniae）、クロストリジウム・パスツリアナム（Clostridium pasteurianum）、ラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）、クロストバクター・インテルメディウム（Citrobacter intermedium）、ラクトバチラス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチラス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、クロストリジウム・パスツリアヌム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）、カロラマトール・ビテルベンシス（Caloramator viterbensis）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）及びリステリア・イノキュア（Listeria innocua）の群から選択される微生物から選択されるグリセリン−デヒドラターゼが本発明の方法において使用される。
【００１９】
使用されるグリセリン−デヒドラターゼは好ましくは、pduC, pduD, pduE, pddA, pddB, pddC, dhaB, dhaC, dhaE及びラクトバチラス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ATCC55730からのgldABC遺伝子からなる群から選択される遺伝子によりコードされる。好ましくは、さらに、WO-A-2004/056963に記載のグリセリン−デヒドラターゼ変異体SHGDH22の使用であり、これはWO2004056963において開示された配列番号３２２を有する。グリセリン−デヒドラターゼのためのこれらの及び更なる適した遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、"Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes"（ＫＥＧＧデータバンク）、National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA)のNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータバンク、又はEuropean Molecular Biologies Laboratoriesのヌクレオチド配列データバンクから取り出すことができる。
【００２０】
ジオール−デヒドラターゼと関連して、本方法において特に属クレブシエラ（Klebsiella）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、ラクトバチラス（Lactobacillus）、サルモネラ（Salmonella）、シトロバクター（Citrobacter）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、ブルセラ（Brucella）及びフソバクテリウム（Fusobacterium）の群から選択される微生物から単離可能な、特に好ましくは種クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）、クロストリジウム・グリコリクム（Clostridium glycolicum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）及びリステリア・イノキュア（Listeria innocua）の群から選択される微生物から単離可能なジオール−デヒドラターゼを使用することが好ましいことがある。
【００２１】
プロパンジオール−デヒドラターゼと関連して、本方法において特に属シトロバクター（Citrobacter）、クロストリジウム（Clostridium）、クレブシエラ（Klebsiella）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）及びサルモネラ（Salmonella）の群から選択された微生物から単離可能な、特に好ましくは種クロストバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、クロストリジウム・グルコリカム（Clostridium glycolicum）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、プロピオニバクテリウム・フロデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）及びサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の群から選択された微生物から単離可能なプロパンジオール−デヒドラターゼを使用することが好ましいことがある。
【００２２】
本発明の方法において使用されるヒドロ−リアーゼが、ビタミンＢ12依存性酵素である場合には、方法工程Ａ）をグリセロール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼ（Reaktivase）−活性又はジオール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼ−活性を有する酵素又は酵素複合体の存在下で実施することが好ましいことがあり、というのも、ヒドロ−リアーゼは、場合によってはこのビタミンの結合により不活化されることがあるからである。このようなリアクティバーゼは例えばMori et al . , J. Biol. Chem. 272:32034 (1997)に記載されている。好ましくは、相応するヒドロ−リアーゼが単離される生物から単離されるリアクティバーゼが使用される。適したジオール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（GenBank番号: AAC15871, AF017781; GenBank番号: AAC15872, AF017781）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）（GenBank番号: AAB84105, AF026270; GenBank番号: AAD39008, AF026270）及びラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）（GenBank番号: CAD01092, AJ297723; GenBank番号: CAD01093, AJ297723）から、適したグリセロール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼはクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）（WO2008137403参照）から知られている。
本発明により本方法において使用されるヒドロ−リアーゼは、当業者に知られている全ての入手形態で使用できる。したがって、使用されるヒドロ−リアーゼは単離された酵素として、例えば組み換え発現系から単離されたものとして、又は酵素複合体の成分として使用できる。好ましく使用されるのは、完全細胞リアクター（Ganzzellreaktor）の形態にあるヒドロリアーゼであり、すなわち、このヒドロ−リアーゼは生物学的細胞、好ましくはヒドロ−リアーゼを発現する細胞中に存在する。
【００２３】
このヒドロ−リアーゼを有する細胞は、ヒドロ−リアーゼを既に野生型として発現するか、又はこの種類はヒドロ−リアーゼの活性をこの遺伝子工学的変更によって初めて有するように遺伝子工学的に変更されていることができる。野生型ヒドロ−リアーゼ含有細胞として、本発明の方法においては、ヒドロ−リアーゼが単離可能である微生物として上述した細胞が使用できる。
【００２４】
適したヒドロ−リアーゼを含有し、かつ、本発明の方法において使用できる遺伝子工学的に変更した細胞は、例えばWO2008148640に記載され、この開示は本願では明示的に取り込まれる。
【００２５】
さらに、細胞がアルデヒドから副生成物を還元により形成する傾向、特に発生するアルデヒドが相応するアルコールへ還元する傾向を、この細胞の相応する遺伝子工学的改変により減少させることが好ましいことができる。例えば、本発明の方法で製造すべきアルデヒド３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの場合には、その野生型に比較して酵素Ｅ1（これは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールへと還元できる）の減少した活性を有する細胞が使用されることができる。酵素Ｅ1（１，３−プロパンジオール−デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド−レダクターゼ、１，３−プロパンジオール：ＮＡＤ+−オキシドレダクターゼ又はプロパン−１，３−ジオール：ＮＡＤ+−１−オキシドレダクターゼ；EC 1.1.1.202）は、反応３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ（Ｐ）+を触媒作用する。このような酵素は、例えば、GenBank登録番号AP007281.1, EDX43365.1, BAG24545.1, ABQ82306.1, ABO43839.1, EEI08979.1, EEI 66346.1 , EEI73647.1, EEJ92522.1, EEI0 9194.1, EEI73500.1, ABQ83973.1又はBAG26138.1を有するタンパク質である。
【００２６】
この記載からは、本発明の方法において使用されるそれぞれのヒドロリアーゼ含有細胞について相応するオキシドレダクターゼが同定され、かつ、その活性はその野生型に比較して減少される。
【００２７】
使用される記載「酵素の減少した活性」は、好ましくは、少なくとも０．５倍、特に好ましくは少なくとも０．１倍、さらに好ましくは少なくとも０．０１倍、さらにいっそう好ましくは少なくとも０．００１倍、最も好ましくは少なくとも０．０００１倍減少した活性が理解される。所定の酵素の活性の減少は、例えば、狙いを定めたか又は指向していない突然変異によって、競合性又は非競合性阻害剤の添加によって、又は、所定の酵素の合成の減少のための当業者に知られている他の処置によって行われることができる。
【００２８】
狙いを定めた突然変異による酵素Ｅ1の活性の減少のためには、例えば、指向したノックアウトが考慮され、この場合に例えば目的遺伝子のプロモーター活性配列、目的遺伝子の活性（酵素の触媒作用機能のために必要な）領域、又は全目的遺伝子が欠失されるか、外来ＤＮＡで置換されるか、又は外来ＤＮＡで中断される。さらに、当業者には、遺伝子サイレンシングの様々な技術が知られており、これはアンチセンス−核酸又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介して特異的に個々の遺伝子の転写又は翻訳を減少するか又は完全に抑制すらする。この抑制は選択された系に応じて一過的に行われるか、誘導可能であるか又は構成的に存在することができる。同様に当業者には、狙いを定めて個々の点突然変異を目的遺伝子中に配置できる方法が知られている。さらに、当業者には、酵素Ｅ1の減少した活性を有する細胞を引き続き選択するために、指向していない突然変異を目的遺伝子中に配置できる方法が知られている。したがって、このような突然変異は、例えば遺伝材料の複製の際の天然の失敗率により又は物理的若しくは化学的害毒物、例えばＵＶ光、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホナート、含硝硫酸、ヒドロキシアミン又は４−ニトロキノリン−１−オキシドに対する細胞の曝露により、作動されることができる。
【００２９】
本発明により本方法において使用されるヒドロ−リアーゼ含有細胞は、生細胞又は死細胞であることができ、その際生細胞が好ましい。
ヒドロ−リアーゼとして使用される、生きている、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を本方法の間に、成長のために必要な物質を供給した適した培地中に維持することが好ましいことがある。但し、酸素の供給に関してはこれを制限することが好ましいことがあることが判明した。したがって、ヒドロ−リアーゼとして使用される、生きている、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を方法工程Ａ）において微嫌気（mikroanaerob）又は嫌気条件下で使用することが好ましい。微嫌気又は嫌気条件は好ましくは、ヒドロ−リアーゼとして使用される、生きている、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を取り囲む培地が溶解した酸素に関する含有量を、全培地に対して１ｍｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ未満、特に０．１ｍｇ／Ｌ未満を有することにより特徴付けられる。この条件は例えば、この細胞を取り囲む培地が付加的に空気又は酸素によってガス曝露（begasen）されない、すなわち、貫流されず、かつ場合によって付加的にこの反応バッチを取り囲む容器が十分に空気密に閉鎖されることにより達成されることができる。
【００３０】
方法工程Ｂ）において実施すべきアルデヒド及びヒドロ−リアーゼの分離を簡易に実施することができるためには、ヒドロ−リアーゼが担体に固定化していることが好ましい。ヒドロ−リアーゼが、遊離（frei）の、単離された酵素として使用される場合には、当業者には酵素固定化のための様々な方法が提供され、これは例えばエポキシド−活性化した担体材料に対するカップリング及び文献中に記載される方法であり、例えば次のものである：Mateo et al . Advances in the design of new epoxy Supports for enzyme immobilization-stabilization, Biochem Soc Trans. 2007 Dec;35(Pt 6) :1593-601及びBalcao et al . , Bioreactors with immobilized lipases: State of the art, Enzyme Microb Technol. 1996 May 1; 18 (6) : 392-416。
ヒドロ−リアーゼとしてヒドロ−リアーゼ活性を有する細胞が使用される場合には、細胞の固定化のために当業者に知れている方法が適用されることができ、これは例えばアルギン酸カルシウム法である。特にDE102007031689に記載の、シロキサンを基礎とする方法、並びに市販されているLentikat液体を用いた細胞の固定化はこの関連において特に適している。
【００３１】
本発明の方法において、方法工程Ａ）において置換及び非置換ビシナールジオールが使用されることができる；好ましくはこの置換基はカルボキシル−、アミノ−、エステル−、イソシアナート及びヒドロキシル基を含む群から選択されており、その際ＯＨが特に好ましい。本発明の方法においては好ましくは炭素−鎖長２〜２０個、特に２〜１２個、特に好ましくは２〜６個の炭素原子を有するビシナールジオールが使用される。好ましい、本発明の方法において使用されるビシナールジオールには、特に糖及び糖アルコールであって３〜６個の炭素原子を有するもの、例えばソルビトールが属する；特に好ましくはこの関連において１，２−プロパンジオール、エチレングリコール及びグリセリンである。
特にグリセリンは本発明の方法においてビシナールジオールとして使用され、このため、得られるアルデヒドは３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドである。グリセリンの他に特に１，２−プロパンジオールも使用され、その際プロパナールがアルデヒドとして得られる。このアルデヒドは、進んで行われる（bereitwillig）引き続く不均化によりｎ−プロパノール及びプロピオン酸へと変換されることができる。
ビシナールジオールは方法工程Ａ）において、全反応混合物に対して、濃度範囲０．０１質量％〜５０質量％、好ましくは０．２質量％〜２０質量％で使用される。
【００３２】
方法工程Ｂ）において、方法工程Ａ）において形成されるアルデヒド及びヒドロ−リアーゼが分離される。
特に担体に固定されたヒドロ−リアーゼの分離は、この場合に、当業者に知られた分離方法、例えば遠心分離を用いて行われる。方法工程Ａ）においてヒドロ−リアーゼとしてヒドロ−リアーゼ含有細胞が使用された場合に考えられるのは、例えば適したフィルターを用いた、例えば２０〜２００ｋＤａの範囲にある排除サイズを有するフィルターを用いた、アルデヒドからの細胞の分離である。遠心分離、適した沈殿装置又はこれら装置の組み合わせの使用も考えられ、その際、細胞の少なくとも一部をまず沈殿により分離し、引き続き細胞を部分的に取り除いたアルデヒドを限外濾過又は遠心分離装置に供給することが特に好ましい。
【００３３】
このようにして分離された細胞は、これが複数の相次いで実施される分離工程において得られた場合には、場合によって精製され、かつ直接的に方法工程Ａ）に再度供給されることができる。しかし、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を方法工程Ａ）の新たな実施前にさらに洗浄することが好ましいことが判明でき、その際、この洗浄は好ましくは既に、方法工程Ａ）において使用されたのと同じ培地を用いて行われる。
特に好ましくは、この洗浄は方法工程Ａ）において使用される培地を用いて、グルコースの付加的な添加下で行われる；これによって、好ましい方式で本来のバイオトランスフォーメーションの間にアルデヒドから誘導される副生成物の形成を抑制できる。
細胞の洗浄のためにこれらは例えば適した容積にある方法工程Ａ）において使用される培地中に再懸濁され、引き続き前記した分離方法により、特に濾過、沈殿又は遠心分離により、又はこの処置の組み合わせによりこの培地が取り除かれることができる。類似の洗浄過程は同様に担体に固定化したヒドロ−リアーゼに対して使用可能である。
【００３４】
同様に、方法工程Ｂ）において行うべきアルデヒド及びヒドロ−リアーゼの分離は、アルデヒドと結合を形成する化合物が担体に固定化されていることにより容易化されることができる。例えば、ここではヒドロゲンスルフィットを負荷したイオン交換樹脂、例えばAmberlite(R) CG400又はAmberlite(R) IRA400 (Rohm and Haas)が考慮される。
【００３５】
生体触媒を新たに新規なビシナールジオールを用いてアルデヒドの製造に利用するために、方法工程Ａ）及びＢ）を分離されたヒドロ−リアーゼを用いて少なくとも１回繰り返すことが本発明に必須である。
【００３６】
本発明の方法の好ましい代替的な一実施態様において、方法工程Ａ）、Ｂ）及びＣ）は連続的に実施される。これは様々な経路で実現可能である：
ヒドロ−リアーゼは固定相として固定化して存在し、かつ、ビシナールポリオール及びアルデヒドと結合を形成する化合物を含有する培地はこの固定化されたヒドロ−リアーゼを貫流し、かつ方法工程Ａ）によりこれと接触させられる。この発生したアルデヒドは移動相として固定相から分離され、このことは方法工程Ｂ）におけるアルデヒド及びヒドロリアーゼの分離に相応する。この連続的にヒドロ−リアーゼに対して新規に与えられるビシナールジオールは、方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いた方法工程Ａ）及びＢ）の繰り返しに相応する。
代替的に、アルデヒドと結合を形成する化合物は固定相として固定化して存在できる。ビシナールポリオール及びヒドロ−リアーゼは培地中に含有されており、したがって、方法工程Ａ）により接触させられ、かつ、固定化した、アルデヒドと結合を形成する化合物を貫流し、その際、この形成されたアルデヒドは固定相に残存する。ヒドロ−リアーゼは固定相を離れ、このことは方法工程Ｂ）におけるアルデヒド及びヒドロ−リアーゼの分離に相応し、かつ、例えばループ型反応器の形で新たに新規のビシナールジオールと一緒に固定相に与えられる。
連続的に運転される本発明の方法の更なる一態様は、アルデヒドと結合を形成する化合物もヒドロ−リアーゼも固定化して固定相として存在するように構成されている。ビシナールポリオール含有培地は固定相を貫流し、したがって、ヒドロ−リアーゼと方法工程Ａ）により接触する。この形成されるアルデヒドはアルデヒドと結合を形成する化合物により固定相に結合し、したがって、方法工程Ｂ）に応じてヒドロ−リアーゼから分離されている。この連続的に固定相に対して新規に与えられるビシナールジオールは、方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いた方法工程Ａ）及びＢ）の繰り返しに相応する。
【００３７】
課せられた課題を解決するために、本発明の方法の間にアルデヒドと結合を形成する化合物が存在しなくてはならない。
アルデヒドと形成される結合は、化学結合の全ての知られた形態であることができ、例えば共有結合又はイオン結合、いわゆる弱い結合、例えば水素架橋結合又は静電相互作用により引き起こされる結合である。
好ましくは、アルデヒドと結合を形成する化合物はアルデヒドと共有結合を形成する。アルデヒドと結合を形成する化合物は多官能性であってよく、すなわち、化合物１分子あたり１より多くの結合がアルデヒドに対して形成されてよい。
適した、アルデヒドと結合を形成する化合物は、例えばヒドラジド、アミン、ヒドラジン、尿素化合物、ヒドロキシアミン、アルコール、メルカプタン、ヒドロゲン−スルフィット、スルフィット、メタビスルフィット及びピロスルフィットであり、その際、本発明の方法において好ましくはセミカルバジド［CAS 57-56-7］、カルボヒドラジド［CAS 497-18-7］及び亜硫酸ナトリウム［CAS 7757-83-7］が使用される。
【００３８】
これは溶液中に遊離して、しかしまた担体に固定化しても使用されることができ、好ましくはこの関連において固定化していない、溶解した化合物であり、というのも、これはより効率的及びより迅速にアルデヒドと結合でき、したがって、不所望な副生成物を抑制できるからである。
本発明の方法が細胞を用いて実施される場合には、本発明により好ましくは、アルデヒドと結合を形成する化合物は細胞を取り囲む培地中へ添加される。
アルデヒドと結合を形成する化合物の混合物も使用できる。
本発明の方法においてビシナールジオール及びアルデヒドと結合を形成する化合物の官能基をモル比少なくとも１：１、好ましくは１：１．２、特に少なくとも１：１．５で使用することが好ましい。
【００３９】
本発明の方法の方法工程Ｄ）において、形成されるアルデヒドは単離されることができ、その際単離のために、複雑な組成物からの低分子量物質の単離のために当業者に知られている全ての方法が考慮される。ここで例示的に、適した溶媒を用いた沈殿、適した溶媒を用いた抽出、複合体化、例えばシクロデキストリン又はシクロデキストリン−誘導体を用いた複合体化、結晶化、クロマトグラフィ法を用いた精製又は単離、又は容易に分離可能な誘導体へのアルデヒドの移行が挙げられる。方法工程Ｄ）における単離の一部は、アルデヒドと結合を形成する化合物を再度アルデヒドから分離することであってもよい。
【００４０】
これは、当該結合に応じて、当業者に自体公知の方法により達成される。したがって、例えばアルデヒドとセミカルバジド又はカルボヒドラジドの間の結合は酸によって開裂されることができる；アルデヒド及びアルデヒドと結合する化合物並びにAmberlite(R) CG400又はAmberlite(R) IRA400からの複合体は例えば塩濃度を高める（例えば１ＭのＮａＣｌ又はＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3（０．１５Ｍ／０．０７５Ｍ）からの系）ことにより分離されることができる。さらに、アルデヒドと、アルデヒドと結合する化合物との間の結合は熱処理により解離されることがある。
【００４１】
導入部で挙げた課題の解決のためには、以下の方法工程を含む、アルデヒドの酸化−又は還元生成物の製造方法も更に寄与する：
Ｉ）前記した、ビシナールジオールからのアルデヒドの製造方法を用いたアルデヒドを提供する工程、
ＩＩ）還元、酸化、不均化又は脱水により、場合によっては不飽和還元−又は酸化中間生成物を獲得しつつ、前記アルデヒドを化学反応又は生体触媒反応する工程、及び場合によって
ＩＩＩ）還元、酸化又は付加により、前記方法工程ＩＩ）において得られる還元−又は酸化中間生成物を更なる化学反応又は生体触媒反応する工程。
アルデヒドの酸化−又は還元生成物は、化合物、例えば場合によって不飽和カルボン酸、カルボン酸誘導体、アミン、イソシアナート、アセタール、ニトリル及びオキシムを含む。
【００４２】
方法工程ＩＩ）の還元−又は酸化中間生成物は、したがって既に、アルデヒドの所望の還元−又は酸化生成物であってよい。
【００４３】
まず、方法工程Ｉ）においてアルデヒドを前記のアルデヒド製造方法を用いて提供し、その際、これは場合によって、この方法との関連において前述したように、精製されていてよい。
方法工程ＩＩ）においてアルデヒドは次いで、還元、酸化、不均化又は脱水によって還元−又は酸化中間生成物を獲得しつつ、化学的又は生体触媒的に変換されることができ、特に、方法工程Ｉ）において得られるアルデヒドが３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドである場合には、１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）（還元）、アクロレイン（脱水）又は３−ヒドロキシプロピオン酸（酸化）を獲得しつつ、変換されることができる。この場合に、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドのアクロレインへの反応についての詳細は特に、Journal of the Chemical Society, 1950, 490-498頁においてHall及びSternにより記載され、その一方で３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドからの１，３−プロパンジオールの製造についての詳細は特にUS 5,334,778から取り出すことができる。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドからの３−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、再度、特にUS 6,852,517に記載されている。方法工程Ｉ）において得られるアルデヒドが１，２−プロパンジオールからのプロパナールである場合には、次いで、１−プロパノール及びプロピオン酸が、プロパナールの進んで行われる不均化によりバイオトランスフォーメーション培地中で発生することができる（Sriramulu, D. D.; Liang, M. ; Hernandez-Romero, D.; Raux-Deery, E.; Lunsdorf, H.; Parsons, J. B.; Warren, M. J. & Prentice, M. B. J. Bacteriol. , 2008, 190, 4559-4567）。
【００４４】
場合によって、方法工程ＩＩ）において得られる還元−又は酸化中間生成物は更なる方法工程ＩＩＩ）において化学的に又は微生物学的に還元、酸化又は付加によりさらにいっそう反応させられることができる。特にここで方法工程ＩＩ）において得られるアクロレインの、酸化によるアクリル酸への反応が考慮され、これは次いで場合によってなお更なる方法工程ＩＶ）においてラジカルによりアクリル酸を基礎とするポリマーの形成下で反応させられることができる。ここで特に、適した架橋剤の存在下での、吸水性ポリアクリラートの形成下での場合によって部分中和されたアクリル酸のラジカル重合が考慮され、これは「Superabsorber」と呼ばれることもある。アクロレインのアクリル酸への化学的酸化及びこのようにして得られるアクリル酸の引き続くラジカル重合は特にWO-A-2006/136336に記載されている。
さらに、方法工程ＩＩ）において得られるアクロレインの、酸化的エステル化によるアクリル酸エステルへの反応が同様に考慮され、これは次いで場合によってなお更なる方法工程ＩＶ）においてラジカルによりアクリル酸エステルを基礎とするポリマーの形成下で反応させられることができる。
【００４５】
上で説明した刊行物により、本発明の方法から得られるアルデヒドの好ましい還元−又は酸化生成物は、したがって、物質１，３−プロパンジオール、１−プロパノール、アクロレイン、３−ヒドロキシプロピオン酸、プロピオン酸、アクリル酸、アクリル酸エステル及びアクリル酸又はアクリル酸エステルを基礎とするポリマーであり、その際、方法工程Ｉ）において得られるアルデヒドは３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドである。
【００４６】
以下に記載の実施例においては、本発明は例示的に記載され、この場合に、その適用範囲が全体的な発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである本発明は実施例に挙げられた実施形態が限定されることはない。以下の図面は本発明の構成要素である：
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、バイオトランスフォーメーションサイクルの経過における、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際のグリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過を示す図である。
【図２】図２は、７回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのセミカルバジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際のグリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過を示す図である。
【図３】図３は、７回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのセミカルバジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際の３ＨＰＡの蓄積収量を示す図である。
【図４】図４は、１０回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのカルボヒドラジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際のグリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過を示す図である。
【図５】図５は、１０回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのカルボヒドラジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際の３ＨＰＡの蓄積収量を示す図である。
【図６】図６は、Ｌ．ロイテリ細胞を用いたグリセリン又は１，２−プロパンジオールのバイオトランスフォーメーションの際のグリセリン及び１，２−プロパンジオールの濃度の時間経過を示す図である。
【図７】図７は、スルフィットの添加なしの固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセロールの７つの相次いだバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の経過を示す図である。
【図８】図８は、亜硫酸水素ナトリウムの添加ありの固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセロールの７つの相次いだバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の経過（本発明による）を示す図である。
【図９】図９は、野生型Ｌ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンのバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の時間経過を示す図である。
【図１０】図１０は、遺伝子工学的に改変されたＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンのバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の時間経過を示す図である。
【００４８】
実施例：
実施例１：ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の培養
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の培養を、２０ｍＭグリセリン添加を有する嫌気化したＭＲＳ培地（DeMan, Rogosa及びSharpeによるラクトバチラスのための培地）（MRSG20）中で、閉鎖した適した容器中で８０ｒｐｍで行った。この培地ＭＲＳＧ２０（組成［１リットルあたりの記載］；１０ｇ プロテオースペプトンＮｒ．３（Roth）、８ｇのウシ抽出物（Roth）、４ｇの酵母抽出物（VWR）、１．５ｍＬのグリセリン（Roth）、１ｍＬのＴｗｅｅｎ８０（Roth）、４０ｍＬの塩溶液［１０ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム（Roth）、２５０ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム−三水和物（Roth）、１００ｇ／Ｌのクエン酸水素二アンモニウム（Roth）、１０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム−七水和物（Roth）、２．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン−四水和物（Roth）］）を、嫌気化及びオートクレーブ処理（２０分、１２１℃で）後に、２５ｍＬのグルコース−溶液（４ｍｏｌ／ｌ）と混合した。
予備培養物１（５０ｍＬ）のために、凍結培養物（Kryo-Kultur）を使用した。このために、さらに６％（ｗ／ｖ）のスキムミルク粉末及び１０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含有するＭＲＳ培地中のＬ．ロイテリSD2112を−８０℃で貯蔵した。ストック培養物の製造のために、オーバーナイト培養物（１０ｍＬ ＭＲＳ培地）を１：１でこのストック溶液と混合する。この予備培養物を１％の接種材料として使用し、かつ３３℃でインキュベーションした。１５時間後にこのバッチから第２の予備培養物（５０ｍＬ）１％で接種し、９時間３７℃でインキュベーションした。これは再度、主培養物（２回、１Ｌ）のために１％の接種材料として用いた。１５時間後に３３℃でこの細胞を回収した。
このために２リットルを遠心分離処理（４０００ｇ；２０℃；１０分）し、この上清を捨て、この両方の生じるペレットを１リットルの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＰ；Ｋ2ＨＰＯ4＋ＫＨ2ＰＯ4（Roth））中でｐＨ７で再懸濁した。新たな遠心分離を同じ条件下で行った。この上清を新たに捨て、細胞ペレットを０．１Ｍ ＫＰＰ中でｐＨ７で１ｇ対１ｍｌの比で再懸濁し、Ｎ2下で貯蔵した。この懸濁液を引き続く固定化のために利用した。
【００４９】
実施例２：ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の固定化
固定化のために実施例１に記載の細胞懸濁液２０ｍＬを〜３５℃で温度処理したLentikat-Liquid(R) (GeniaLab)と混合し、このLentikatをLentiKat(R)-Printer (GeniaLab)を用いて製造し、かつ残留湿分２８％に乾燥させた。LentiKat-Stabilizer(R) (GeniaLab)中での再膨潤（Rueckquellung）後に、この固定物を少なくとも２時間無酸素雰囲気中で３００ｒｐｍでLentikats の安定化のためにLentiKat-Stabilizer(R)中で撹拌した。この分離され、かつ２回０．１Ｍ ＫＰＰを用いてｐＨ７で洗浄した固定物を３％で１５時間にわたり３３℃で固定してＭＲＳＧ２０中で完全充填した１Ｌフラスコ中でガス交換のための手段を用いて再生した。培地からの固定物の分離後に（好気条件）これを２回０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）で洗浄した。
【００５０】
実施例３：ＨＰＬＣを基礎とする、グリセリン及び１，３−プロパンジオールの定量化
グリセリン及び１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）の定量化のために各１ｍｌの細胞懸濁液中でバイオマスを遠心分離（１０分、１６１００ｇ、４℃）により分離し、かつ、４０μｌの培養物上清を、９μｍの粒径を有するAminex HPX-87H 300 x 7.8 mm分離カラム（Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen）を備えたShimadzu-HPLCシステム（オートサンプラー SIL-10AT, ポンプLC-10AT, 脱気機DGU-3A, 屈折率検出器RID-10A, ＵＶ検出器SPD-10A, 炉CTO-10A, コントローラーSCA-10A-VP）の使用下で、かつ予備カラム（HPX-87H, 30 x 4.6 mm）の使用下で分析した。分析すべき物質をアイソクラティックに５ｍＭ硫酸からの移動相を用いて０．６ｍｌ／分２０分の流速で４０℃で溶出した。この同定を、参照物質の滞留時間との比較により行った（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim）。この培養物上清中の化合物の濃度をピーク表面積の比較を介して、前もって外部標準を用いて作成した校正直線を用いて計算した。
【００５１】
実施例４：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いたグリセリンから３ＨＰＡへの反応（比較例）
実施例２に応じて製造した、Ｌ．ロイテリで負荷した固定物を１０％（２０ｇ、１リットルあたり２ｇの乾燥細胞の濃度に相応）でバイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵器（全容積５００ｍｌ）中で２００ｍｌの反応緩衝液を用いて使用した。後者のものは、嫌気化され、かつ、３５℃で予備温度処理された０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）からなった。一定のｐＨ値７に調節及び一定の温度３５℃に調節した後に、この反応を８ｍＬの９８％グリセリン（Roth, 反応混合物中の５００ｍＭの濃度に相応）の添加によって開始させた。このサンプリングを１時間にわたり１０分毎、引き続き２時間にわたり３０分毎行った。グリセリン及び副生成物の濃度をＨＰＬＣを用いて実施例３に応じて測定した。
３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの定量化を、Doleyres et al.による比色分析試験を用いて行った（Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process with Lactobacillus reuteri, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68, 2005, 467-474頁）。
〜１００分の反応時間後に、遊離な細胞の場合も、また同様に固定化した細胞の場合も、グリセリンの変換はもはや観察されることができなかった。
グリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過は図１に挙げられている。バイオトランスフォーメーションの間に１．２９ｇの３ＨＰＡが発生した。この反応混合物を細胞又は固定物から分離し、別個に４℃で貯蔵した。グリセリンから３ＨＰＡ及び副生成物への反応は、前記した分析に応じて行い、〜２５％であった。細胞又は固定物の再使用の場合にはグリセリンから３ＨＰＡへの変換は確認されることができなかった。
【００５２】
実施例５：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用い、かつセミカルバジドの存在下におけるグリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例２に応じて製造した、Ｌ．ロイテリで負荷した固定物を１０％（２０ｇ、１リットルあたり２ｇの乾燥細胞の濃度に相応）でバイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵器（全容積５００ｍｌ）中で２００ｍｌの反応緩衝液を用いて使用した。これは、０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）並びに５００ｍＭセミカルバジドからなり、かつ、嫌気化されており、並びに、３５℃の反応温度に予備温度調節されていた。一定のｐＨ値７及び一定の温度３５℃に調節した後に、この反応を８ｍＬの９８％グリセリン（Roth;反応混合物中５００ｍＭの濃度に相応）の添加によって開始させた。この反応混合物からのサンプルの取り出し及び分析を実施例４に記載のように行った。
１５０分間の反応時間後に、この反応培地を固定物から分離し、新たに嫌気化した、予備温度調節した反応培地（０．１Ｍ、ＫＰＰ ｐＨ７、５００ｍＭのセミカルバジドを有する）を添加した。前記したように、更なるバイオトランスフォーメーションサイクルを実施した。全部で７つの相次ぐサイクルを固定物の中間貯蔵なしに実施した。グリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯについての濃度経過は図２に挙げられている；図３は、３ＨＰＡに関する蓄積収量を示す。グリセリンから３ＨＰＡへの反応を捕捉物質としてのセミカルバジドを用いて、前記した分析に応じて行い、最初の５サイクルにおいては〜５５％までだけであった；更なる２サイクルにおいてこの収量は連続的に減少した。
【００５３】
実施例６：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用い、かつカルボヒドラジドの存在下におけるグリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例２に応じて製造した、Ｌ．ロイテリで負荷した固定物を１０％（２０ｇ、１リットルあたり２ｇの乾燥細胞の濃度に相応）でバイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵器（全容積５００ｍｌ）中で２００ｍｌの反応緩衝液を用いて使用した。これは、０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）並びに５２０ｍＭカルボヒドラジドからなり、かつ、嫌気化されており、並びに、３５℃の反応温度に予備温度調節されていた。一定のｐＨ値７及び一定の温度３５℃に調節した後に、この反応を８ｍＬの９８％グリセリン（Roth;反応混合物中の５００ｍＭの濃度に相応）の添加によって開始させた。この反応混合物からのサンプルの取り出し及び分析を実施例４に記載のように行った。
１８０分間の反応時間後に、この反応培地を固定物から分離し、新たに嫌気化した、予備温度調節した反応培地（０．１Ｍ、ＫＰＰ ｐＨ７、５２０ｍＭのカルボヒドラジドを有する）を添加した。前記したように、更なるバイオトランスフォーメーションサイクルを実施した。全部で１０回の相次ぐサイクルが固定物の中間貯蔵なしに実施された；グリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯについての濃度経過は図４に挙げられている；図５は、３ＨＰＡに関する蓄積収量を示す。
グリセリンから３ＨＰＡ及び副生成物への反応を捕捉物質としてのカルボヒドラジドを用いて、前記した分析に応じて行い、全１０サイクルにおいて〜９５％であった。
【００５４】
実施例７：遊離のラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いた、硫黄含有化合物の存在下におけるグリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例１に応じて製造した細胞を、１０００ミリモーラーのグリセリン溶液中に懸濁し、この結果全細胞濃度２．２×１０10ＣＦＵ／ｍｌが生じた。硫黄含有化合物（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム又はピロ亜硫酸ナトリウム；それぞれ終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌでもって反応溶液中にある）の添加後に、この懸濁液を１２０分間インキュベーションし、その際、この混合物を連続的な窒素流の導通により酸素不含に維持した。第１表に列記される、１２０分の進行後に生じる３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度並びに細胞生存率は、硫黄含有化合物の添加による達成可能な３ＨＰＡ濃度の向上並びに細胞生存率の減少の低下を説明する。
第１表
【表１】
【００５５】
実施例８：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いた、カルボヒドラジドの存在下での１，２−プロパンジオール又はグリセリンからプロパナール又は３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの反応、本発明による
実施例１に応じて製造した細胞を、それぞれ５００ミリモーラーのグリセリン溶液又は５００ミリモーラーの１，２−プロパンジオール溶液中に懸濁し、この結果全細胞濃度２．２×１０10ＣＦＵ／ｍｌが生じた。反応溶液中１００ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度を有するカルボヒドラジドの添加後に、この懸濁液を１２０分間インキュベーションし、その際、この混合物を連続的な窒素流の導通により酸素不含に維持した。図６に説明される、グリセリン及び１，２−プロパンジオールの濃度経過は、この両方の物質の等価なトランスフォーメーションを説明する。
【００５６】
実施例９：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）細胞を用いた、硫黄含有化合物の存在下及びグルコールの洗浄溶液への添加下の、グリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例２に応じて製造された、Ｌ．ロイテリで負荷された固定物を、２０％（４ｍＬ）バイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵機中で２０ｍＬの反応溶液と共に使用した。これは、８０ｍｍｏｌ／Ｌグリセリンを含有し、かつ、３０℃への温度調節後に一定のｐＨ値５に調節された（比較例及び本発明による実施例）。本発明によるバッチ中にはこの反応溶液は更に亜硫酸水素ナトリウム（５０ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度に応じて）が添加された。バイオトランスフォーメーションサイクル（３０分）の経過後にこの固定物を濾別し、３０分間の期間にわたりＭＲＳＧ２０（実施例１参照）中で再生し、新たに、記載のように反応溶液中で使用する。この記載の方式では、全部で７回のグリセリンの反応が実施される。ヒドロゲンスルフィットの添加なしに各トランスフォーメーション工程において１０ｍｍｏｌ／Ｌの１，３−ＰＤＯが形成される（図７）一方で、亜硫酸水素ナトリウムの添加の場合には１，３−ＰＤＯ−濃度の減少が観察されることができる（図８）。
【００５７】
実施例１０：遊離の、遺伝子工学的に改変されていないか又は改変されているラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いた、グリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
野生型細胞又は、オキシドレダクターゼ遺伝子の欠失により産出された細胞を２５０ミリモーラーのグリセリン溶液中に懸濁し、この結果、そのつど１．２×１０10ＣＦＵ／ｍｌの全細胞濃度が生じた。１２０分のバイオトランスフォーメーションの過程における濃度経過が示すように、Ｌ．ロイテリ野生型の使用の場合には２０分間のバイオトランスフォーメーションの後に形成される３ＨＰＡは１，３−ＰＤＯの形成のために分解され（図９）、その一方で３ＨＰＡから１，３−ＰＤＯへの変換はオキシドレダクターゼ−遺伝子の欠失により産出した細胞の使用の場合には妨げられる（図１０）。
【００５８】
実施例１１：３ＨＰＡ含有発酵搬出物からのアクロレインの製造、本発明による
実施例４−６に応じて得られる発酵−搬出物から、酸性触媒作用を通じて高められた温度でアクロレインを獲得することができた。このために、発酵搬出物の一部を比１：１００で水で希釈し、３部の３７％塩酸と混合し、０．５ｈ３７℃でインキュベーションした。この場合に形成されるアクロレインはＤＬ−トリプトファン−溶液（Fluka、０．０１ｍｏｌ／Ｌトリプトファン、０．０５ｍｏｌ／Ｌ塩酸中）の添加及び３７℃（０．５ｈ）の新たなインキュベーション後に、着色アダクトを形成し、これは比色分析によって５６０ｎｍでのその吸収により定量化されることができた。
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明の主題は、アルデヒド並びにその酸化−及び還元生成物の製造方法である。
【０００２】
背景技術
アルデヒドを酵素によって製造する方法は、文献中にしばしば記載されている。
例えば、WO2009001304は、１３−ヒドロペルオキシド−リアーゼの協力下での多不飽和脂肪酸からのアルデヒドの製造方法を記載する。
３−メチルブタナールの獲得のための生化学的経路は、Smit et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 81, 987-999に記載されている。
メタノール−オキシダーゼ及びカタラーゼ（ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、カンジダ（Candida）、又はトルロプシス（Torulopsis）由来）を用いた、アルコールからのアルデヒドの製造はUS5783429に説明されている。キシレン−又はアルカンモノオキシゲナーゼの適用下では、WO2001031047によれば芳香族アルデヒド誘導体が獲得される。
【０００３】
３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）は、アクリル酸、ポリマー及びプラスチックの工業的製造のための重要なモノマーへと、並びに、同様に有用なアクリル酸エステルへと反応させられる。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから誘導可能である更なる有用な生成物は、１，３−プロパンジオール（還元により）、３−ヒドロキシプロピオン酸（酸化により）及びアクロレイン（脱水により）である。従来市販の供給源が３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドのために提供されていないので、グリセリンからの、特にロイテリンの形にある３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの製造が集中的に研究される。
【０００４】
８０年代の終わりに既に、Talarico及びDobrogosz, Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33, 674-679は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いてグリセリンから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを発酵により製造することを記載する。
Ｏ2制限の使用下の類似の方法はUS5413960に記載されている。
【０００５】
DK180099は、グリセリンの連続的供給及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）DSM12246の使用を伴う方法を開示する。
【０００６】
Doleyres et al . , Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Sep ; 68 (4) :467-74は、様々な成長条件下のＬ．ロイテリATCC 53608中の３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの製造方法を記載し、かつ、この生体触媒の繰り返した使用が強力に減少する活性のために可能でないことを示す。
【０００７】
CN1778935は、セミカルバジドの存在下のクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）DSM2026を用いたグリセリン溶液の一工程発酵を記載する。
【０００８】
US4962027は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）NRRL B-4011による好気的二工程発酵における３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの製造方法を記載し、その際、第一工程においてまず細胞マス及びグリセリン−デヒドラターゼを産生し、第二工程においてセミカルバジドの存在下でグリセリンを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと反応させる。
【０００９】
EP1669457は、（特に）Ｋ．ニューモニエを用いて、補酵素Ｂ12の添加下で、細胞／基質比を高めることによって３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドをほぼ定量的な収率においてバイオテクノロジーによる製造を記載する。
【００１０】
全ての記載の方法は、収率及び変換率が低い点で共通している。さらに、記載の方法においては、常に、生体触媒の提供のための多くの手間が必要であり、これは次いで短い耐用時間しか示さず、すなわち、引き続き短時間だけしか使用できない。
【００１１】
本発明の課題は、したがって、背景技術の記載の欠点を克服する方法を提供することであった。
【００１２】
発明の詳細な説明
意外なことに、以下に記載の方法は本発明により課せられた課題を解決できることが見出された。
【００１３】
本発明の主題は、したがって、
次の方法工程
Ａ）好ましくは水溶液のビシナールジオールとヒドロ−リアーゼとを接触させる工程、
Ｂ）方法工程Ａ）において形成されたアルデヒド及びヒドロ−リアーゼを分離する工程、
Ｃ）方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いて、方法工程Ａ）及びＢ）を少なくとも１回繰り返す工程、及び場合によって
Ｄ）形成されたアルデヒドを単離する工程
を含むアルデヒドの製造方法であって、
アルデヒドと結合を形成する化合物の存在下で実施することを特徴とする製造方法である。
【００１４】
本発明の更なる主題は、前述の方法により得られたアルデヒドの酸化−及び還元生成物の製造方法である。
【００１５】
本発明の方法の利点は、使用されるアルコールに対するアルデヒドに関するほぼ定量的な収率、生体触媒として使用されるヒドロ−リアーゼの長い耐用時間及びその反復可能性である。これによって、連続方法の方式が可能になる。
本発明の方法の更なる利点は、形成されたアルデヒドに対して、生体触媒として使用されるヒドロ−リアーゼの副活性、例えばアルデヒドのアルコールへの更なる還元の抑制の必要がないことである。
本発明の更なる利点は、本発明の方法が、大部分が酸素の排除下又は減少下で作業できる手段を提供することにあり、これによって、例えば生成物の、腐食及び不所望な酸化が減少されることができ、より簡易な装置構造が可能になり、かつ、エネルギーが節約されることができ、並びに、バイオテクノロジー反応器のガス曝露の他の知られている問題、例えば泡形成が抑制されることができる。
【００１６】
本発明の関連において「アルデヒド」との概念下では、同様に、アルデヒドの水和物及びダイマー、並びに、これら化合物の混合物が理解され、並びに３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの場合には例えばロイトリンである。全ての記載のパーセント（％）は、他のことが記載されていない限りは、質量パーセントである。
【００１７】
ヒドロ−リアーゼとしては、本発明の方法においては、ＥＣクラス４．２．１．Ｘに列記されている酵素が使用されることができる。
ここでは特に、補酵素Ｂ12に依存しないで活性がある、すなわち、補酵素Ｂ12又はこの物質のための代替物質／類似物、例えばコリノイド、コバラミンの存在なしでもヒドロ−リアーゼ活性を有するヒドロ−リアーゼが、本発明の方法にとっては好ましい。このようなヒドロ−リアーゼの例示的な代表物は、WO200814864から認識できる。
【００１８】
本発明の方法において好ましく使用されるヒドロ−リアーゼは、グリセリン−デヒドラターゼ又はジオール−デヒドラターゼ並びにプロパンジオール−デヒドラターゼ（EC 4.2.1.30, EC 4.2.1.28）である。この関連において、特に、属クレブシエラ（Klebsiella）、シトロバクター（Citrobacter）、クロストリジウム（Clostridium）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、エンテロバクター（Enterobacter）、カロラマトール（Caloramator）、サルモネラ（Salmonella）及びリステリア（Listeria）の群から選択される微生物から単離可能なグリセリン−デヒドラターゼ、特に好ましくは種クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、シトロバクター・ニューモニエ（Citrobacter pneumoniae）、クロストリジウム・パスツリアナム（Clostridium pasteurianum）、ラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）、クロストバクター・インテルメディウム（Citrobacter intermedium）、ラクトバチラス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチラス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、クロストリジウム・パスツリアヌム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）、カロラマトール・ビテルベンシス（Caloramator viterbensis）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）及びリステリア・イノキュア（Listeria innocua）の群から選択される微生物から選択されるグリセリン−デヒドラターゼが本発明の方法において使用される。
【００１９】
使用されるグリセリン−デヒドラターゼは好ましくは、pduC, pduD, pduE, pddA, pddB, pddC, dhaB, dhaC, dhaE及びラクトバチラス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ATCC55730からのgldABC遺伝子からなる群から選択される遺伝子によりコードされる。好ましくは、さらに、WO-A-2004/056963に記載のグリセリン−デヒドラターゼ変異体SHGDH22の使用であり、これはWO2004056963において開示された配列番号３２２を有する。グリセリン−デヒドラターゼのためのこれらの及び更なる適した遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、"Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes"（ＫＥＧＧデータバンク）、National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA)のNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータバンク、又はEuropean Molecular Biologies Laboratoriesのヌクレオチド配列データバンクから取り出すことができる。
【００２０】
ジオール−デヒドラターゼと関連して、本方法において特に属クレブシエラ（Klebsiella）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、ラクトバチラス（Lactobacillus）、サルモネラ（Salmonella）、シトロバクター（Citrobacter）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、ブルセラ（Brucella）及びフソバクテリウム（Fusobacterium）の群から選択される微生物から単離可能な、特に好ましくは種クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）、クロストリジウム・グリコリクム（Clostridium glycolicum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）及びリステリア・イノキュア（Listeria innocua）の群から選択される微生物から単離可能なジオール−デヒドラターゼを使用することが好ましいことがある。
【００２１】
プロパンジオール−デヒドラターゼと関連して、本方法において特に属シトロバクター（Citrobacter）、クロストリジウム（Clostridium）、クレブシエラ（Klebsiella）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）及びサルモネラ（Salmonella）の群から選択された微生物から単離可能な、特に好ましくは種クロストバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、クロストリジウム・グルコリカム（Clostridium glycolicum）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、プロピオニバクテリウム・フロデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）及びサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の群から選択された微生物から単離可能なプロパンジオール−デヒドラターゼを使用することが好ましいことがある。
【００２２】
本発明の方法において使用されるヒドロ−リアーゼが、ビタミンＢ12依存性酵素である場合には、方法工程Ａ）をグリセロール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼ（Reaktivase）−活性又はジオール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼ−活性を有する酵素又は酵素複合体の存在下で実施することが好ましいことがあり、というのも、ヒドロ−リアーゼは、場合によってはこのビタミンの結合により不活化されることがあるからである。このようなリアクティバーゼは例えばMori et al . , J. Biol. Chem. 272:32034 (1997)に記載されている。好ましくは、相応するヒドロ−リアーゼが単離される生物から単離されるリアクティバーゼが使用される。適したジオール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（GenBank番号: AAC15871, AF017781; GenBank番号: AAC15872, AF017781）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）（GenBank番号: AAB84105, AF026270; GenBank番号: AAD39008, AF026270）及びラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）（GenBank番号: CAD01092, AJ297723; GenBank番号: CAD01093, AJ297723）から、適したグリセロール−デヒドラターゼ−リアクティバーゼはクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）（WO2008137403参照）から知られている。
本発明により本方法において使用されるヒドロ−リアーゼは、当業者に知られている全ての入手形態で使用できる。したがって、使用されるヒドロ−リアーゼは単離された酵素として、例えば組み換え発現系から単離されたものとして、又は酵素複合体の成分として使用できる。好ましく使用されるのは、完全細胞リアクター（Ganzzellreaktor）の形態にあるヒドロリアーゼであり、すなわち、このヒドロ−リアーゼは生物学的細胞、好ましくはヒドロ−リアーゼを発現する細胞中に存在する。
【００２３】
このヒドロ−リアーゼを有する細胞は、ヒドロ−リアーゼを既に野生型として発現するか、又はこの種類はヒドロ−リアーゼの活性をこの遺伝子工学的変更によって初めて有するように遺伝子工学的に変更されていることができる。野生型ヒドロ−リアーゼ含有細胞として、本発明の方法においては、ヒドロ−リアーゼが単離可能である微生物として上述した細胞が使用できる。
【００２４】
適したヒドロ−リアーゼを含有し、かつ、本発明の方法において使用できる遺伝子工学的に変更した細胞は、例えばWO2008148640に記載され、この開示は本願では明示的に取り込まれる。
【００２５】
さらに、細胞がアルデヒドから副生成物を還元により形成する傾向、特に発生するアルデヒドが相応するアルコールへ還元する傾向を、この細胞の相応する遺伝子工学的改変により減少させることが好ましいことができる。例えば、本発明の方法で製造すべきアルデヒド３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの場合には、その野生型に比較して酵素Ｅ1（これは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールへと還元できる）の減少した活性を有する細胞が使用されることができる。酵素Ｅ1（１，３−プロパンジオール−デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド−レダクターゼ、１，３−プロパンジオール：ＮＡＤ+−オキシドレダクターゼ又はプロパン−１，３−ジオール：ＮＡＤ+−１−オキシドレダクターゼ；EC 1.1.1.202）は、反応３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ（Ｐ）+を触媒作用する。このような酵素は、例えば、GenBank登録番号AP007281.1, EDX43365.1, BAG24545.1, ABQ82306.1, ABO43839.1, EEI08979.1, EEI 66346.1 , EEI73647.1, EEJ92522.1, EEI0 9194.1, EEI73500.1, ABQ83973.1又はBAG26138.1を有するタンパク質である。
【００２６】
この記載からは、本発明の方法において使用されるそれぞれのヒドロリアーゼ含有細胞について相応するオキシドレダクターゼが同定され、かつ、その活性はその野生型に比較して減少される。
【００２７】
使用される記載「酵素の減少した活性」は、好ましくは、少なくとも０．５倍、特に好ましくは少なくとも０．１倍、さらに好ましくは少なくとも０．０１倍、さらにいっそう好ましくは少なくとも０．００１倍、最も好ましくは少なくとも０．０００１倍減少した活性が理解される。所定の酵素の活性の減少は、例えば、狙いを定めたか又は指向していない突然変異によって、競合性又は非競合性阻害剤の添加によって、又は、所定の酵素の合成の減少のための当業者に知られている他の処置によって行われることができる。
【００２８】
狙いを定めた突然変異による酵素Ｅ1の活性の減少のためには、例えば、指向したノックアウトが考慮され、この場合に例えば目的遺伝子のプロモーター活性配列、目的遺伝子の活性（酵素の触媒作用機能のために必要な）領域、又は全目的遺伝子が欠失されるか、外来ＤＮＡで置換されるか、又は外来ＤＮＡで中断される。さらに、当業者には、遺伝子サイレンシングの様々な技術が知られており、これはアンチセンス−核酸又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介して特異的に個々の遺伝子の転写又は翻訳を減少するか又は完全に抑制すらする。この抑制は選択された系に応じて一過的に行われるか、誘導可能であるか又は構成的に存在することができる。同様に当業者には、狙いを定めて個々の点突然変異を目的遺伝子中に配置できる方法が知られている。さらに、当業者には、酵素Ｅ1の減少した活性を有する細胞を引き続き選択するために、指向していない突然変異を目的遺伝子中に配置できる方法が知られている。したがって、このような突然変異は、例えば遺伝材料の複製の際の天然の失敗率により又は物理的若しくは化学的害毒物、例えばＵＶ光、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホナート、含硝硫酸、ヒドロキシアミン又は４−ニトロキノリン−１−オキシドに対する細胞の曝露により、作動されることができる。
【００２９】
本発明により本方法において使用されるヒドロ−リアーゼ含有細胞は、生細胞又は死細胞であることができ、その際生細胞が好ましい。
ヒドロ−リアーゼとして使用される、生きている、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を本方法の間に、成長のために必要な物質を供給した適した培地中に維持することが好ましいことがある。但し、酸素の供給に関してはこれを制限することが好ましいことがあることが判明した。したがって、ヒドロ−リアーゼとして使用される、生きている、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を方法工程Ａ）において微嫌気（mikroanaerob）又は嫌気条件下で使用することが好ましい。微嫌気又は嫌気条件は好ましくは、ヒドロ−リアーゼとして使用される、生きている、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を取り囲む培地が溶解した酸素に関する含有量を、全培地に対して１ｍｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ未満、特に０．１ｍｇ／Ｌ未満を有することにより特徴付けられる。この条件は例えば、この細胞を取り囲む培地が付加的に空気又は酸素によってガス曝露（begasen）されない、すなわち、貫流されず、かつ場合によって付加的にこの反応バッチを取り囲む容器が十分に空気密に閉鎖されることにより達成されることができる。
【００３０】
方法工程Ｂ）において実施すべきアルデヒド及びヒドロ−リアーゼの分離を簡易に実施することができるためには、ヒドロ−リアーゼが担体に固定化していることが好ましい。ヒドロ−リアーゼが、遊離（frei）の、単離された酵素として使用される場合には、当業者には酵素固定化のための様々な方法が提供され、これは例えばエポキシド−活性化した担体材料に対するカップリング及び文献中に記載される方法であり、例えば次のものである：Mateo et al . Advances in the design of new epoxy Supports for enzyme immobilization-stabilization, Biochem Soc Trans. 2007 Dec;35(Pt 6) :1593-601及びBalcao et al . , Bioreactors with immobilized lipases: State of the art, Enzyme Microb Technol. 1996 May 1; 18 (6) : 392-416。
ヒドロ−リアーゼとしてヒドロ−リアーゼ活性を有する細胞が使用される場合には、細胞の固定化のために当業者に知れている方法が適用されることができ、これは例えばアルギン酸カルシウム法である。特にDE102007031689に記載の、シロキサンを基礎とする方法、並びに市販されているLentikat液体を用いた細胞の固定化はこの関連において特に適している。
【００３１】
本発明の方法において、方法工程Ａ）において置換及び非置換ビシナールジオールが使用されることができる；好ましくはこの置換基はカルボキシル−、アミノ−、エステル−、イソシアナート及びヒドロキシル基を含む群から選択されており、その際ＯＨが特に好ましい。本発明の方法においては好ましくは炭素−鎖長２〜２０個、特に２〜１２個、特に好ましくは２〜６個の炭素原子を有するビシナールジオールが使用される。好ましい、本発明の方法において使用されるビシナールジオールには、特に糖及び糖アルコールであって３〜６個の炭素原子を有するもの、例えばソルビトールが属する；特に好ましくはこの関連において１，２−プロパンジオール、エチレングリコール及びグリセリンである。
特にグリセリンは本発明の方法においてビシナールジオールとして使用され、このため、得られるアルデヒドは３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドである。グリセリンの他に特に１，２−プロパンジオールも使用され、その際プロパナールがアルデヒドとして得られる。このアルデヒドは、進んで行われる（bereitwillig）引き続く不均化によりｎ−プロパノール及びプロピオン酸へと変換されることができる。
ビシナールジオールは方法工程Ａ）において、全反応混合物に対して、濃度範囲０．０１質量％〜５０質量％、好ましくは０．２質量％〜２０質量％で使用される。
【００３２】
方法工程Ｂ）において、方法工程Ａ）において形成されるアルデヒド及びヒドロ−リアーゼが分離される。
特に担体に固定されたヒドロ−リアーゼの分離は、この場合に、当業者に知られた分離方法、例えば遠心分離を用いて行われる。方法工程Ａ）においてヒドロ−リアーゼとしてヒドロ−リアーゼ含有細胞が使用された場合に考えられるのは、例えば適したフィルターを用いた、例えば２０〜２００ｋＤａの範囲にある排除サイズを有するフィルターを用いた、アルデヒドからの細胞の分離である。遠心分離、適した沈殿装置又はこれら装置の組み合わせの使用も考えられ、その際、細胞の少なくとも一部をまず沈殿により分離し、引き続き細胞を部分的に取り除いたアルデヒドを限外濾過又は遠心分離装置に供給することが特に好ましい。
【００３３】
このようにして分離された細胞は、これが複数の相次いで実施される分離工程において得られた場合には、場合によって精製され、かつ直接的に方法工程Ａ）に再度供給されることができる。しかし、ヒドロ−リアーゼ含有細胞を方法工程Ａ）の新たな実施前にさらに洗浄することが好ましいことが判明でき、その際、この洗浄は好ましくは既に、方法工程Ａ）において使用されたのと同じ培地を用いて行われる。
特に好ましくは、この洗浄は方法工程Ａ）において使用される培地を用いて、グルコースの付加的な添加下で行われる；これによって、好ましい方式で本来のバイオトランスフォーメーションの間にアルデヒドから誘導される副生成物の形成を抑制できる。
細胞の洗浄のためにこれらは例えば適した容積にある方法工程Ａ）において使用される培地中に再懸濁され、引き続き前記した分離方法により、特に濾過、沈殿又は遠心分離により、又はこの処置の組み合わせによりこの培地が取り除かれることができる。類似の洗浄過程は同様に担体に固定化したヒドロ−リアーゼに対して使用可能である。
【００３４】
同様に、方法工程Ｂ）において行うべきアルデヒド及びヒドロ−リアーゼの分離は、アルデヒドと結合を形成する化合物が担体に固定化されていることにより容易化されることができる。例えば、ここではヒドロゲンスルフィットを負荷したイオン交換樹脂、例えばAmberlite(R) CG400又はAmberlite(R) IRA400 (Rohm and Haas)が考慮される。
【００３５】
生体触媒を新たに新規なビシナールジオールを用いてアルデヒドの製造に利用するために、方法工程Ａ）及びＢ）を分離されたヒドロ−リアーゼを用いて少なくとも１回繰り返すことが本発明に必須である。
【００３６】
本発明の方法の好ましい代替的な一実施態様において、方法工程Ａ）、Ｂ）及びＣ）は連続的に実施される。これは様々な経路で実現可能である：
ヒドロ−リアーゼは固定相として固定化して存在し、かつ、ビシナールポリオール及びアルデヒドと結合を形成する化合物を含有する培地はこの固定化されたヒドロ−リアーゼを貫流し、かつ方法工程Ａ）によりこれと接触させられる。この発生したアルデヒドは移動相として固定相から分離され、このことは方法工程Ｂ）におけるアルデヒド及びヒドロリアーゼの分離に相応する。この連続的にヒドロ−リアーゼに対して新規に与えられるビシナールジオールは、方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いた方法工程Ａ）及びＢ）の繰り返しに相応する。
代替的に、アルデヒドと結合を形成する化合物は固定相として固定化して存在できる。ビシナールポリオール及びヒドロ−リアーゼは培地中に含有されており、したがって、方法工程Ａ）により接触させられ、かつ、固定化した、アルデヒドと結合を形成する化合物を貫流し、その際、この形成されたアルデヒドは固定相に残存する。ヒドロ−リアーゼは固定相を離れ、このことは方法工程Ｂ）におけるアルデヒド及びヒドロ−リアーゼの分離に相応し、かつ、例えばループ型反応器の形で新たに新規のビシナールジオールと一緒に固定相に与えられる。
連続的に運転される本発明の方法の更なる一態様は、アルデヒドと結合を形成する化合物もヒドロ−リアーゼも固定化して固定相として存在するように構成されている。ビシナールポリオール含有培地は固定相を貫流し、したがって、ヒドロ−リアーゼと方法工程Ａ）により接触する。この形成されるアルデヒドはアルデヒドと結合を形成する化合物により固定相に結合し、したがって、方法工程Ｂ）に応じてヒドロ−リアーゼから分離されている。この連続的に固定相に対して新規に与えられるビシナールジオールは、方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いた方法工程Ａ）及びＢ）の繰り返しに相応する。
【００３７】
課せられた課題を解決するために、本発明の方法の間にアルデヒドと結合を形成する化合物が存在しなくてはならない。
アルデヒドと形成される結合は、化学結合の全ての知られた形態であることができ、例えば共有結合又はイオン結合、いわゆる弱い結合、例えば水素架橋結合又は静電相互作用により引き起こされる結合である。
好ましくは、アルデヒドと結合を形成する化合物はアルデヒドと共有結合を形成する。アルデヒドと結合を形成する化合物は多官能性であってよく、すなわち、化合物１分子あたり１より多くの結合がアルデヒドに対して形成されてよい。
適した、アルデヒドと結合を形成する化合物は、例えばヒドラジド、アミン、ヒドラジン、尿素化合物、ヒドロキシアミン、アルコール、メルカプタン、ヒドロゲン−スルフィット、スルフィット、メタビスルフィット及びピロスルフィットであり、その際、本発明の方法において好ましくはセミカルバジド［CAS 57-56-7］、カルボヒドラジド［CAS 497-18-7］及び亜硫酸ナトリウム［CAS 7757-83-7］が使用される。
【００３８】
これは溶液中に遊離して、しかしまた担体に固定化しても使用されることができ、好ましくはこの関連において固定化していない、溶解した化合物であり、というのも、これはより効率的及びより迅速にアルデヒドと結合でき、したがって、不所望な副生成物を抑制できるからである。
本発明の方法が細胞を用いて実施される場合には、本発明により好ましくは、アルデヒドと結合を形成する化合物は細胞を取り囲む培地中へ添加される。
アルデヒドと結合を形成する化合物の混合物も使用できる。
本発明の方法においてビシナールジオール及びアルデヒドと結合を形成する化合物の官能基をモル比少なくとも１：１、好ましくは１：１．２、特に少なくとも１：１．５で使用することが好ましい。
【００３９】
本発明の方法の方法工程Ｄ）において、形成されるアルデヒドは単離されることができ、その際単離のために、複雑な組成物からの低分子量物質の単離のために当業者に知られている全ての方法が考慮される。ここで例示的に、適した溶媒を用いた沈殿、適した溶媒を用いた抽出、複合体化、例えばシクロデキストリン又はシクロデキストリン−誘導体を用いた複合体化、結晶化、クロマトグラフィ法を用いた精製又は単離、又は容易に分離可能な誘導体へのアルデヒドの移行が挙げられる。方法工程Ｄ）における単離の一部は、アルデヒドと結合を形成する化合物を再度アルデヒドから分離することであってもよい。
【００４０】
これは、当該結合に応じて、当業者に自体公知の方法により達成される。したがって、例えばアルデヒドとセミカルバジド又はカルボヒドラジドの間の結合は酸によって開裂されることができる；アルデヒド及びアルデヒドと結合する化合物並びにAmberlite(R) CG400又はAmberlite(R) IRA400からの複合体は例えば塩濃度を高める（例えば１ＭのＮａＣｌ又はＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3（０．１５Ｍ／０．０７５Ｍ）からの系）ことにより分離されることができる。さらに、アルデヒドと、アルデヒドと結合する化合物との間の結合は熱処理により解離されることがある。
【００４１】
導入部で挙げた課題の解決のためには、以下の方法工程を含む、アルデヒドの酸化−又は還元生成物の製造方法も更に寄与する：
Ｉ）前記した、ビシナールジオールからのアルデヒドの製造方法を用いたアルデヒドを提供する工程、
ＩＩ）還元、酸化、不均化又は脱水により、場合によっては不飽和還元−又は酸化中間生成物を獲得しつつ、前記アルデヒドを化学反応又は生体触媒反応する工程、及び場合によって
ＩＩＩ）還元、酸化又は付加により、前記方法工程ＩＩ）において得られる還元−又は酸化中間生成物を更なる化学反応又は生体触媒反応する工程。
アルデヒドの酸化−又は還元生成物は、化合物、例えば場合によって不飽和カルボン酸、カルボン酸誘導体、アミン、イソシアナート、アセタール、ニトリル及びオキシムを含む。
【００４２】
方法工程ＩＩ）の還元−又は酸化中間生成物は、したがって既に、アルデヒドの所望の還元−又は酸化生成物であってよい。
【００４３】
まず、方法工程Ｉ）においてアルデヒドを前記のアルデヒド製造方法を用いて提供し、その際、これは場合によって、この方法との関連において前述したように、精製されていてよい。
方法工程ＩＩ）においてアルデヒドは次いで、還元、酸化、不均化又は脱水によって還元−又は酸化中間生成物を獲得しつつ、化学的又は生体触媒的に変換されることができ、特に、方法工程Ｉ）において得られるアルデヒドが３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドである場合には、１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）（還元）、アクロレイン（脱水）又は３−ヒドロキシプロピオン酸（酸化）を獲得しつつ、変換されることができる。この場合に、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドのアクロレインへの反応についての詳細は特に、Journal of the Chemical Society, 1950, 490-498頁においてHall及びSternにより記載され、その一方で３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドからの１，３−プロパンジオールの製造についての詳細は特にUS 5,334,778から取り出すことができる。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドからの３−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、再度、特にUS 6,852,517に記載されている。方法工程Ｉ）において得られるアルデヒドが１，２−プロパンジオールからのプロパナールである場合には、次いで、１−プロパノール及びプロピオン酸が、プロパナールの進んで行われる不均化によりバイオトランスフォーメーション培地中で発生することができる（Sriramulu, D. D.; Liang, M. ; Hernandez-Romero, D.; Raux-Deery, E.; Lunsdorf, H.; Parsons, J. B.; Warren, M. J. & Prentice, M. B. J. Bacteriol. , 2008, 190, 4559-4567）。
【００４４】
場合によって、方法工程ＩＩ）において得られる還元−又は酸化中間生成物は更なる方法工程ＩＩＩ）において化学的に又は微生物学的に還元、酸化又は付加によりさらにいっそう反応させられることができる。特にここで方法工程ＩＩ）において得られるアクロレインの、酸化によるアクリル酸への反応が考慮され、これは次いで場合によってなお更なる方法工程ＩＶ）においてラジカルによりアクリル酸を基礎とするポリマーの形成下で反応させられることができる。ここで特に、適した架橋剤の存在下での、吸水性ポリアクリラートの形成下での場合によって部分中和されたアクリル酸のラジカル重合が考慮され、これは「Superabsorber」と呼ばれることもある。アクロレインのアクリル酸への化学的酸化及びこのようにして得られるアクリル酸の引き続くラジカル重合は特にWO-A-2006/136336に記載されている。
さらに、方法工程ＩＩ）において得られるアクロレインの、酸化的エステル化によるアクリル酸エステルへの反応が同様に考慮され、これは次いで場合によってなお更なる方法工程ＩＶ）においてラジカルによりアクリル酸エステルを基礎とするポリマーの形成下で反応させられることができる。
【００４５】
上で説明した刊行物により、本発明の方法から得られるアルデヒドの好ましい還元−又は酸化生成物は、したがって、物質１，３−プロパンジオール、１−プロパノール、アクロレイン、３−ヒドロキシプロピオン酸、プロピオン酸、アクリル酸、アクリル酸エステル及びアクリル酸又はアクリル酸エステルを基礎とするポリマーであり、その際、方法工程Ｉ）において得られるアルデヒドは３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドである。
【００４６】
以下に記載の実施例においては、本発明は例示的に記載され、この場合に、その適用範囲が全体的な発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである本発明は実施例に挙げられた実施形態が限定されることはない。以下の図面は本発明の構成要素である：
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、バイオトランスフォーメーションサイクルの経過における、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際のグリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過を示す図である。
【図２】図２は、７回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのセミカルバジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際のグリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過を示す図である。
【図３】図３は、７回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのセミカルバジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際の３ＨＰＡの蓄積収量を示す図である。
【図４】図４は、１０回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのカルボヒドラジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際のグリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過を示す図である。
【図５】図５は、１０回のバイオトランスフォーメーションサイクルの経過における及び捕捉物質としてのカルボヒドラジドの存在下での、固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンの反応の際の３ＨＰＡの蓄積収量を示す図である。
【図６】図６は、Ｌ．ロイテリ細胞を用いたグリセリン又は１，２−プロパンジオールのバイオトランスフォーメーションの際のグリセリン及び１，２−プロパンジオールの濃度の時間経過を示す図である。
【図７】図７は、スルフィットの添加なしの固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセロールの７つの相次いだバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の経過を示す図である。
【図８】図８は、亜硫酸水素ナトリウムの添加ありの固定化したＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセロールの７つの相次いだバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の経過（本発明による）を示す図である。
【図９】図９は、野生型Ｌ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンのバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の時間経過を示す図である。
【図１０】図１０は、遺伝子工学的に改変されたＬ．ロイテリ細胞を用いたグリセリンのバイオトランスフォーメーションの際の３ＨＰＡ、グリセリン及び１，３−ＰＤＯの濃度の時間経過を示す図である。
【００４８】
実施例：
実施例１：ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の培養
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の培養を、２０ｍＭグリセリン添加を有する嫌気化したＭＲＳ培地（DeMan, Rogosa及びSharpeによるラクトバチラスのための培地）（MRSG20）中で、閉鎖した適した容器中で８０ｒｐｍで行った。この培地ＭＲＳＧ２０（組成［１リットルあたりの記載］；１０ｇ プロテオースペプトンＮｒ．３（Roth）、８ｇのウシ抽出物（Roth）、４ｇの酵母抽出物（VWR）、１．５ｍＬのグリセリン（Roth）、１ｍＬのＴｗｅｅｎ８０（Roth）、４０ｍＬの塩溶液［１０ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム（Roth）、２５０ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム−三水和物（Roth）、１００ｇ／Ｌのクエン酸水素二アンモニウム（Roth）、１０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム−七水和物（Roth）、２．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン−四水和物（Roth）］）を、嫌気化及びオートクレーブ処理（２０分、１２１℃で）後に、２５ｍＬのグルコース−溶液（４ｍｏｌ／ｌ）と混合した。
予備培養物１（５０ｍＬ）のために、凍結培養物（Kryo-Kultur）を使用した。このために、さらに６％（ｗ／ｖ）のスキムミルク粉末及び１０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含有するＭＲＳ培地中のＬ．ロイテリSD2112を−８０℃で貯蔵した。ストック培養物の製造のために、オーバーナイト培養物（１０ｍＬ ＭＲＳ培地）を１：１でこのストック溶液と混合する。この予備培養物を１％の接種材料として使用し、かつ３３℃でインキュベーションした。１５時間後にこのバッチから第２の予備培養物（５０ｍＬ）１％で接種し、９時間３７℃でインキュベーションした。これは再度、主培養物（２回、１Ｌ）のために１％の接種材料として用いた。１５時間後に３３℃でこの細胞を回収した。
このために２リットルを遠心分離処理（４０００ｇ；２０℃；１０分）し、この上清を捨て、この両方の生じるペレットを１リットルの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＰ；Ｋ2ＨＰＯ4＋ＫＨ2ＰＯ4（Roth））中でｐＨ７で再懸濁した。新たな遠心分離を同じ条件下で行った。この上清を新たに捨て、細胞ペレットを０．１Ｍ ＫＰＰ中でｐＨ７で１ｇ対１ｍｌの比で再懸濁し、Ｎ2下で貯蔵した。この懸濁液を引き続く固定化のために利用した。
【００４９】
実施例２：ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の固定化
固定化のために実施例１に記載の細胞懸濁液２０ｍＬを〜３５℃で温度処理したLentikat-Liquid(R) (GeniaLab)と混合し、このLentikatをLentiKat(R)-Printer (GeniaLab)を用いて製造し、かつ残留湿分２８％に乾燥させた。LentiKat-Stabilizer(R) (GeniaLab)中での再膨潤（Rueckquellung）後に、この固定物を少なくとも２時間無酸素雰囲気中で３００ｒｐｍでLentikats の安定化のためにLentiKat-Stabilizer(R)中で撹拌した。この分離され、かつ２回０．１Ｍ ＫＰＰを用いてｐＨ７で洗浄した固定物を３％で１５時間にわたり３３℃で固定してＭＲＳＧ２０中で完全充填した１Ｌフラスコ中でガス交換のための手段を用いて再生した。培地からの固定物の分離後に（好気条件）これを２回０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）で洗浄した。
【００５０】
実施例３：ＨＰＬＣを基礎とする、グリセリン及び１，３−プロパンジオールの定量化
グリセリン及び１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）の定量化のために各１ｍｌの細胞懸濁液中でバイオマスを遠心分離（１０分、１６１００ｇ、４℃）により分離し、かつ、４０μｌの培養物上清を、９μｍの粒径を有するAminex HPX-87H 300 x 7.8 mm分離カラム（Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen）を備えたShimadzu-HPLCシステム（オートサンプラー SIL-10AT, ポンプLC-10AT, 脱気機DGU-3A, 屈折率検出器RID-10A, ＵＶ検出器SPD-10A, 炉CTO-10A, コントローラーSCA-10A-VP）の使用下で、かつ予備カラム（HPX-87H, 30 x 4.6 mm）の使用下で分析した。分析すべき物質をアイソクラティックに５ｍＭ硫酸からの移動相を用いて０．６ｍｌ／分２０分の流速で４０℃で溶出した。この同定を、参照物質の滞留時間との比較により行った（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim）。この培養物上清中の化合物の濃度をピーク表面積の比較を介して、前もって外部標準を用いて作成した校正直線を用いて計算した。
【００５１】
実施例４：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いたグリセリンから３ＨＰＡへの反応（比較例）
実施例２に応じて製造した、Ｌ．ロイテリで負荷した固定物を１０％（２０ｇ、１リットルあたり２ｇの乾燥細胞の濃度に相応）でバイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵器（全容積５００ｍｌ）中で２００ｍｌの反応緩衝液を用いて使用した。後者のものは、嫌気化され、かつ、３５℃で予備温度処理された０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）からなった。一定のｐＨ値７に調節及び一定の温度３５℃に調節した後に、この反応を８ｍＬの９８％グリセリン（Roth, 反応混合物中の５００ｍＭの濃度に相応）の添加によって開始させた。このサンプリングを１時間にわたり１０分毎、引き続き２時間にわたり３０分毎行った。グリセリン及び副生成物の濃度をＨＰＬＣを用いて実施例３に応じて測定した。
３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの定量化を、Doleyres et al.による比色分析試験を用いて行った（Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process with Lactobacillus reuteri, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68, 2005, 467-474頁）。
〜１００分の反応時間後に、遊離な細胞の場合も、また同様に固定化した細胞の場合も、グリセリンの変換はもはや観察されることができなかった。
グリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度経過は図１に挙げられている。バイオトランスフォーメーションの間に１．２９ｇの３ＨＰＡが発生した。この反応混合物を細胞又は固定物から分離し、別個に４℃で貯蔵した。グリセリンから３ＨＰＡ及び副生成物への反応は、前記した分析に応じて行い、〜２５％であった。細胞又は固定物の再使用の場合にはグリセリンから３ＨＰＡへの変換は確認されることができなかった。
【００５２】
実施例５：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用い、かつセミカルバジドの存在下におけるグリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例２に応じて製造した、Ｌ．ロイテリで負荷した固定物を１０％（２０ｇ、１リットルあたり２ｇの乾燥細胞の濃度に相応）でバイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵器（全容積５００ｍｌ）中で２００ｍｌの反応緩衝液を用いて使用した。これは、０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）並びに５００ｍＭセミカルバジドからなり、かつ、嫌気化されており、並びに、３５℃の反応温度に予備温度調節されていた。一定のｐＨ値７及び一定の温度３５℃に調節した後に、この反応を８ｍＬの９８％グリセリン（Roth;反応混合物中５００ｍＭの濃度に相応）の添加によって開始させた。この反応混合物からのサンプルの取り出し及び分析を実施例４に記載のように行った。
１５０分間の反応時間後に、この反応培地を固定物から分離し、新たに嫌気化した、予備温度調節した反応培地（０．１Ｍ、ＫＰＰ ｐＨ７、５００ｍＭのセミカルバジドを有する）を添加した。前記したように、更なるバイオトランスフォーメーションサイクルを実施した。全部で７つの相次ぐサイクルを固定物の中間貯蔵なしに実施した。グリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯについての濃度経過は図２に挙げられている；図３は、３ＨＰＡに関する蓄積収量を示す。グリセリンから３ＨＰＡへの反応を捕捉物質としてのセミカルバジドを用いて、前記した分析に応じて行い、最初の５サイクルにおいては〜５５％までだけであった；更なる２サイクルにおいてこの収量は連続的に減少した。
【００５３】
実施例６：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用い、かつカルボヒドラジドの存在下におけるグリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例２に応じて製造した、Ｌ．ロイテリで負荷した固定物を１０％（２０ｇ、１リットルあたり２ｇの乾燥細胞の濃度に相応）でバイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵器（全容積５００ｍｌ）中で２００ｍｌの反応緩衝液を用いて使用した。これは、０．１Ｍ ＫＰＰ（ｐＨ７）並びに５２０ｍＭカルボヒドラジドからなり、かつ、嫌気化されており、並びに、３５℃の反応温度に予備温度調節されていた。一定のｐＨ値７及び一定の温度３５℃に調節した後に、この反応を８ｍＬの９８％グリセリン（Roth;反応混合物中の５００ｍＭの濃度に相応）の添加によって開始させた。この反応混合物からのサンプルの取り出し及び分析を実施例４に記載のように行った。
１８０分間の反応時間後に、この反応培地を固定物から分離し、新たに嫌気化した、予備温度調節した反応培地（０．１Ｍ、ＫＰＰ ｐＨ７、５２０ｍＭのカルボヒドラジドを有する）を添加した。前記したように、更なるバイオトランスフォーメーションサイクルを実施した。全部で１０回の相次ぐサイクルが固定物の中間貯蔵なしに実施された；グリセリン、３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯについての濃度経過は図４に挙げられている；図５は、３ＨＰＡに関する蓄積収量を示す。
グリセリンから３ＨＰＡ及び副生成物への反応を捕捉物質としてのカルボヒドラジドを用いて、前記した分析に応じて行い、全１０サイクルにおいて〜９５％であった。
【００５４】
実施例７：遊離のラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いた、硫黄含有化合物の存在下におけるグリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例１に応じて製造した細胞を、１０００ミリモーラーのグリセリン溶液中に懸濁し、この結果全細胞濃度２．２×１０10ＣＦＵ／ｍｌが生じた。硫黄含有化合物（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム又はピロ亜硫酸ナトリウム；それぞれ終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌでもって反応溶液中にある）の添加後に、この懸濁液を１２０分間インキュベーションし、その際、この混合物を連続的な窒素流の導通により酸素不含に維持した。第１表に列記される、１２０分の進行後に生じる３ＨＰＡ及び１，３−ＰＤＯの濃度並びに細胞生存率は、硫黄含有化合物の添加による達成可能な３ＨＰＡ濃度の向上並びに細胞生存率の減少の低下を説明する。
第１表
【表１】
【００５５】
実施例８：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いた、カルボヒドラジドの存在下での１，２−プロパンジオール又はグリセリンからプロパナール又は３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの反応、本発明による
実施例１に応じて製造した細胞を、それぞれ５００ミリモーラーのグリセリン溶液又は５００ミリモーラーの１，２−プロパンジオール溶液中に懸濁し、この結果全細胞濃度２．２×１０10ＣＦＵ／ｍｌが生じた。反応溶液中１００ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度を有するカルボヒドラジドの添加後に、この懸濁液を１２０分間インキュベーションし、その際、この混合物を連続的な窒素流の導通により酸素不含に維持した。図６に説明される、グリセリン及び１，２−プロパンジオールの濃度経過は、この両方の物質の等価なトランスフォーメーションを説明する。
【００５６】
実施例９：固定化したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）細胞を用いた、硫黄含有化合物の存在下及びグルコールの洗浄溶液への添加下の、グリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
実施例２に応じて製造された、Ｌ．ロイテリで負荷された固定物を、２０％（４ｍＬ）バイオトランスフォーメーションにおいてガラス発酵機中で２０ｍＬの反応溶液と共に使用した。これは、８０ｍｍｏｌ／Ｌグリセリンを含有し、かつ、３０℃への温度調節後に一定のｐＨ値５に調節された（比較例及び本発明による実施例）。本発明によるバッチ中にはこの反応溶液は更に亜硫酸水素ナトリウム（５０ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度に応じて）が添加された。バイオトランスフォーメーションサイクル（３０分）の経過後にこの固定物を濾別し、３０分間の期間にわたりＭＲＳＧ２０（実施例１参照）中で再生し、新たに、記載のように反応溶液中で使用する。この記載の方式では、全部で７回のグリセリンの反応が実施される。ヒドロゲンスルフィットの添加なしに各トランスフォーメーション工程において１０ｍｍｏｌ／Ｌの１，３−ＰＤＯが形成される（図７）一方で、亜硫酸水素ナトリウムの添加の場合には１，３−ＰＤＯ−濃度の減少が観察されることができる（図８）。
【００５７】
実施例１０：遊離の、遺伝子工学的に改変されていないか又は改変されているラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を用いた、グリセリンから３ＨＰＡへの反応、本発明による
野生型細胞又は、オキシドレダクターゼ遺伝子の欠失により産出された細胞を２５０ミリモーラーのグリセリン溶液中に懸濁し、この結果、そのつど１．２×１０10ＣＦＵ／ｍｌの全細胞濃度が生じた。１２０分のバイオトランスフォーメーションの過程における濃度経過が示すように、Ｌ．ロイテリ野生型の使用の場合には２０分間のバイオトランスフォーメーションの後に形成される３ＨＰＡは１，３−ＰＤＯの形成のために分解され（図９）、その一方で３ＨＰＡから１，３−ＰＤＯへの変換はオキシドレダクターゼ−遺伝子の欠失により産出した細胞の使用の場合には妨げられる（図１０）。
【００５８】
実施例１１：３ＨＰＡ含有発酵搬出物からのアクロレインの製造、本発明による
実施例４−６に応じて得られる発酵−搬出物から、酸性触媒作用を通じて高められた温度でアクロレインを獲得することができた。このために、発酵搬出物の一部を比１：１００で水で希釈し、３部の３７％塩酸と混合し、０．５ｈ３７℃でインキュベーションした。この場合に形成されるアクロレインはＤＬ−トリプトファン−溶液（Fluka、０．０１ｍｏｌ／Ｌトリプトファン、０．０５ｍｏｌ／Ｌ塩酸中）の添加及び３７℃（０．５ｈ）の新たなインキュベーション後に、着色アダクトを形成し、これは比色分析によって５６０ｎｍでのその吸収により定量化されることができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の方法工程
Ａ）ビシナールジオールとヒドロ−リアーゼとを接触させる工程、
Ｂ）方法工程Ａ）において形成されたアルデヒド及びヒドロ−リアーゼを分離する工程、
Ｃ）方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いて方法工程Ａ）及びＢ）を少なくとも１回繰り返す工程、及び場合によって
Ｄ）形成されたアルデヒドを単離する工程
を含むアルデヒドの製造方法であって、
アルデヒドと結合を形成する化合物の存在下で実施することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
方法工程Ａ）におけるヒドロ−リアーゼがグリセリン−デヒドラターゼであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法工程Ａ）において使用されるヒドロ−リアーゼが担体に固定化されていることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
方法工程Ａ）においてヒドロ−リアーゼとしてヒドロ−リアーゼ活性を有する細胞を使用することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
細胞が、その野生型に対して減少した活性のオキシドレダクターゼを有し、これがアルデヒドを還元することができることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
方法工程Ａ）においてビシナルジオールがグリセリン又は１，２−プロパンジオールであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
方法工程Ａ）におけるビシナールジオールが、全反応混合物に対して、０．０１質量％〜５０質量％、好ましくは０．２質量％〜２０質量％の濃度範囲において使用されることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
方法工程Ａ）、Ｂ）及びＣ）を連続的に実施することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
アルデヒドと結合を形成する化合物としてセミカルバジド［CAS 57-56-7］、カルボヒドラジド［CAS 497-18-7］又は亜硫酸ナトリウム［CAS 7757-83-7］を使用することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
本発明による方法においてビシナールジオール及びアルデヒドと結合を形成する化合物の官能基をモル比少なくとも１：１、好ましくは少なくとも１：１．２、特に少なくとも１：１．５で使用することを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
方法工程：
Ｉ）請求項１から１０のいずれか１項記載の方法によりアルデヒドを提供する工程、
ＩＩ）還元、酸化、不均化又は脱水により、場合によって不飽和の還元−又は酸化中間生成物を獲得しつつ、前記アルデヒドを化学反応又は生体触媒反応させる工程、及び場合によって
ＩＩＩ）還元、酸化又は付加により、前記方法工程ＩＩ）において得られる還元−又は酸化中間生成物を更なる化学反応又は生体触媒反応させる工程
を含む、アルデヒドの酸化−又は還元生成物の製造方法。
【請求項１】
次の方法工程
Ａ）ビシナールジオールとヒドロ−リアーゼとを接触させる工程、
Ｂ）方法工程Ａ）において形成されたアルデヒド及びヒドロ−リアーゼを分離する工程、
Ｃ）方法工程Ｂ）から得られたヒドロ−リアーゼを用いて方法工程Ａ）及びＢ）を少なくとも１回繰り返す工程、及び場合によって
Ｄ）形成されたアルデヒドを単離する工程
を含むアルデヒドの製造方法であって、
アルデヒドと結合を形成する化合物の存在下で実施することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
方法工程Ａ）におけるヒドロ−リアーゼがグリセリン−デヒドラターゼであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法工程Ａ）において使用されるヒドロ−リアーゼが担体に固定化されていることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
方法工程Ａ）においてヒドロ−リアーゼとしてヒドロ−リアーゼ活性を有する細胞を使用することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
細胞が、その野生型に対して減少した活性のオキシドレダクターゼを有し、これがアルデヒドを還元することができることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
方法工程Ａ）においてビシナルジオールがグリセリン又は１，２−プロパンジオールであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
方法工程Ａ）におけるビシナールジオールが、全反応混合物に対して、０．０１質量％〜５０質量％、好ましくは０．２質量％〜２０質量％の濃度範囲において使用されることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
方法工程Ａ）、Ｂ）及びＣ）を連続的に実施することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
アルデヒドと結合を形成する化合物としてセミカルバジド［CAS 57-56-7］、カルボヒドラジド［CAS 497-18-7］又は亜硫酸ナトリウム［CAS 7757-83-7］を使用することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
本発明による方法においてビシナールジオール及びアルデヒドと結合を形成する化合物の官能基をモル比少なくとも１：１、好ましくは少なくとも１：１．２、特に少なくとも１：１．５で使用することを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
方法工程：
Ｉ）請求項１から１０のいずれか１項記載の方法によりアルデヒドを提供する工程、
ＩＩ）還元、酸化、不均化又は脱水により、場合によって不飽和の還元−又は酸化中間生成物を獲得しつつ、前記アルデヒドを化学反応又は生体触媒反応させる工程、及び場合によって
ＩＩＩ）還元、酸化又は付加により、前記方法工程ＩＩ）において得られる還元−又は酸化中間生成物を更なる化学反応又は生体触媒反応させる工程
を含む、アルデヒドの酸化−又は還元生成物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５２５８２４（Ｐ２０１２−５２５８２４Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０８９８７（Ｐ２０１２−５０８９８７）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５６８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２７９７０
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５６８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２７９７０
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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