セントロメア局在タンパク遺伝子のノックアウト細胞
【課題】染色体分配機構の解明、及びがん創薬の有用なモデル細胞になり得る、セントロメアに局在するタンパク遺伝子のノックアウト細胞の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるか、又は特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるか、又は特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セントロメアに局在するタンパク質の遺伝子のノックアウト細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物が生命を維持するためには、全ゲノム情報を包括する構造体である染色体は安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期で染色体の複製と分配が正確に行われる。染色体の複製・分配といった基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体分配機構の解明は、がん化の制御につながると考えられる。
【０００３】
細胞分裂時に両極から伸びた紡錘体が染色体の特殊構造を捕まえて、娘細胞へ分配することで染色体分配はおこる。その際、紡錘体が捕らえる染色体の特殊構造はセントロメア（動原体）と呼ばれている。従って、セントロメアは染色体分配に重要な働きを担っている。また、がん細胞のように過剰な分裂を行う細胞では、セントロメアを構成するあるタンパク質が過剰に発現していることが報告されている（非特許文献１）。ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉは染色体分配に関わるセントロメア構成タンパク質であり、ＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ｉが結合していることは報告されている（非特許文献２）。ただし、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉは、染色体分配において未同定のタンパク質と作用して巨大複合体として機能すると予想されている（非特許文献３）。他のセントロメアタンパク質と同様に未同定のセントロメアタンパク質は、がん細胞で過剰に発現していることが予想される。したがって、未同定のセントロメアタンパク質は、制がん薬剤のターゲットになる可能性を秘めている。また、当該未同定のセントロメアタンパク質の機能解明やがん研究のためには、当該タンパク質遺伝子をノックアウトした細胞が必要になる。
【非特許文献１】Tomonaga et al., Cancer Res., 63, 3511-3516, 2003
【非特許文献２】Nishihashi et al., Dev. Cell, 2, 463-476, 2002
【非特許文献３】Fukagawa, Exp. Cell Res., 296, 21-27, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、セントロメアに局在し、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合して染色体分配を制御しており、制がん薬剤のターゲットとして有用な新規タンパク質を見出し、そのタンパク質遺伝子のノックアウト細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、がん細胞の増殖制御を目指してセントロメアを構成するタンパク質について研究を行い、特にＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに注目し、これに結合するタンパク質を探索してきた。その結果、今般、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、セントロメアへ局在し染色体分配を制御する機能を有する５種のタンパク質を見出した。そして、さらに研究してきたところ、そのうちの２種のタンパク質遺伝子をノックアウトした細胞の取得に成功し、それらの細胞が増殖はするが、その増殖時間が遅くなっており、染色体分配の機能解明及びがん創薬の有用なモデル細胞になり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐは、セントロメアを構成するタンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する性質を有することから、染色体の分配に深く関与しているタンパク質である。そして、本発明のノックアウト細胞は、細胞増殖が遅くなっており、細胞のがん化のメカニズム解明や染色体分配機能解明に有用なモデル細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、配列番号１又は２のアミノ酸からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質である。ここで配列番号１がＣＥＮＰ−Ｏのアミノ酸配列、配列番号２がＣＥＮＰ−Ｐのアミノ酸配列である。ここで、上記１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上である。
【０００９】
また、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子としては、前記タンパク質をコードするものであれば制限されないが、例えば配列番号６又は７の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号６又は７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件である。
【００１０】
配列番号１又は２のアミノ酸配列及び配列番号６又は７の塩基配列は、ニワトリ由来のタンパク質及びそれをコードする遺伝子である。しかし、前記の如く１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有する限り、ヒトを含む哺乳類由来のタンパク質も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００１１】
セントロメアに局在するタンパク質の同定は、生化学的手法や遺伝学的手法を用いることで数多く試みられている。しかしながら、存在量の少なさや抽出技術の困難さから、新しくセントロメアタンパク質を同定したという成功例は数少ない。また、既存のセントロメアタンパク質にタグをつけたタンパク質を細胞内で大量発現させて、結合タンパク質を同定する試みが最近さかんに行われている。しかしながら、大量発現することで、そのタンパク質がセントロメア以外の場所に局在し、セントロメアに局在するセントロメアタンパク質同定がうまくいかないなど技術的な問題点が数多くあった。
【００１２】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、例えばニワトリＤＴ４０細胞を用いて、以下の如くして分離できる。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞内では、相同組み換えが高頻度でおこるために遺伝子改変を効率的に行うことができる。セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉの発現を１００％タグ付きの融合タンパク質に置き換えた細胞株を樹立した。この細胞株では、タグ付きのＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉがセントロメア以外に局在してしまうという前記問題点が克服できていた。そこでこれらの細胞株を用いてクロマチン画分を調製し、抗タグ抗体を用いた免疫沈降法によりＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉと結合するタンパク質を同定した。得られたペプチド配列をもとにｃＤＮＡクローニングすることにより、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなる２種類のタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐ得られる。
【００１３】
得られたＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、これをＧＦＰ融合タンパク質等の標識タンパク質として細胞内で発現させれば、細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが確認できる。
【００１４】
かくして得られたＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐ及びこれらの遺伝子は、アミノ酸配列又は塩基配列が判明したので、前記手段に限定されず、ペプチド合成等により製造することもでき、通常の遺伝子組み換え手段により製造できることは言うまでもない。
【００１５】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する。従って、染色体の分配に必須のタンパク質である。
【００１６】
本発明において、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させたとは、該遺伝子の遺伝子産物であるＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐが正常に産生されないようにしたことをいい、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐ自体が産生しない場合、及び一部を欠損するなどして機能を発現し得ないタンパク質を産生する場合が含まれる。
【００１７】
本発明のノックアウト細胞は、例えばＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐの遺伝子領域の一部又は全部を相同組み換え方法によって、染色体上の当該遺伝子を破壊することにより行なわれる。相同組み換えは、他の遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子との間に相同組み換えを行うことにより、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐの遺伝子の領域を細胞から欠失させることにより行うのが好ましい。
【００１８】
本発明のノックアウト細胞の樹立は、具体的には次の如くして行われる。ＣＥＮＰ−Ｏを例にして説明する。
宿主としては例えば、ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を用いることができる。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｏが２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行う。はじめに、薬剤耐性遺伝子、例えばヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入する。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｏの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｏのエキソン３からエキソン７がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｏの一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へもう一つの薬剤耐性遺伝子、例えばピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトを導入して２遺伝子座も完全に破壊する。ノックアウト株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素で消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写する。フィルターをラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択する。
【００１９】
かくして得られるノックアウト細胞は、いずれも細胞増殖は行うが、野生型に比べると遅延している。倍加時間は、野生型で約９時間であったのに対し、１０〜１１時間であった。従って、ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐはいずれも染色体の分配に必須ではあるが、細胞増殖に必須ではないことが判明した。従って、本発明のノックアウト細胞は、がん治療薬のスクリーニングモデル細胞として、また染色体分配の機構解明に有用である。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２１】
（１）細胞内のＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉタンパク質の全てをタグ付き融合タンパク質に置換された細胞株の確立
ＣＥＮＰ−Ｈ遺伝子あるいはＣＥＮＰ−Ｉ遺伝子のゲノム領域と相同性のある約１０Kbのゲノム配列をプラスミドベクターｐＢＳへクローン化する。そのプラスミドへクローン化されたゲノム領域へ薬剤耐性遺伝子(ヒスチジノール耐性遺伝子あるいはピューロマイシン耐性遺伝子)を挿入したプラスミドを構築する (ノックアウトコンストラクト)。エレクトロポーレーション法(５５０Ｖ、２５マイクロＦ)を用いて、制限酵素ＮｏｔＩで切断されたノックアウトコンストラクトをＤＴ４０細胞へ導入して、ノックコンストラクトとゲノム領域が置換したニワトリＤＴ４０細胞株（ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株）を樹立する。相同組み換えの有無は、サザンハイブリダイゼーションで確認できる。平行して、ＣＭＶプローモーターの下流でＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現するプラスミドベクターを構築する(ＦＬＡＧタグ融合ベクター)。ＦＬＡＧタグ融合ベクターをエレクトロポーレーション法を用いて、ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株へ導入した。これらの細胞株では、野生型のＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がノックアウトされて、ＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現しているため、細胞内の全てのＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質に置き換わっている。
【００２２】
（２）ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐの分離
（１）で得た細胞を大量培養して間期の細胞を集めた。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、遠心分離によって核を調製する。核を緩衝液Ａ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／１５０mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ）に懸濁した後、超音波破砕し、遠心分離によってＤＮＡを含む画分を調製した。ＤＮＡを含む画分に最終濃度３mMのCaCl2を添加し、さらにマイクロコッカル・ヌクレアーゼを加えて４℃１時間反応させ、ＤＮＡを切断することによって、ＤＮＡに結合しているタンパク質を可溶化した。ＫＣｌ及びＮＰ−４０をそれぞれ最終濃度３００mM及び０．１％になるよう添加し、続いて抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを添加して４℃３時間撹拌した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを遠心分離によって回収し、緩衝液Ｂ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／３００mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ／０．１％ ＮＰ−４０）を用いて洗浄した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンに０．１Ｍ Glycine pH２．５溶液を添加して１分間静置した後、遠心分離によって溶液を回収した。溶液に等量の２０％トリクロロ酢酸及び５倍量のアセトンを添加し、−２０℃で２時間静置し、遠心分離によってタンパク質を回収した。
【００２３】
（３）タンパク質の同定
回収されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、銀染色で検出し、ゲルを切り出して質量分析を行うことで各タンパク質の部分アミノ酸配列を決定した。各タンパク質の部分アミノ酸配列は、以下の通りである。
【００２４】
（ＣＥＮＰ−Ｏ）Asp Gly Gly Gly Arg Met Pro Ala Ala Pro Leu Ala Gln Gly Lys Val Glu Arg
【００２５】
（ＣＥＮＰ−３５）Lys Gln Trp Thr Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Tyr Lys Phe Ser Ser Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Met Leu Gly Val Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg
【００２６】
（ＣＥＮＰ−Ｐ）Lys Ala Glu Leu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Leu Ser Phe Leu Val Lys Phe Thr Gly Ile Gln Ile Thr Ser His Ser Lys Lys Thr Leu Glu Lys Thr Gly Asn Arg
【００２７】
（ＣＥＮＰ−３０）Arg Asn Pro Glu Leu Ile Ser Thr Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys
【００２８】
（ＣＥＮＰ−１７）Asn Val Gln Ala Ser Leu Ala Tyr Val Asp Val Arg Phe Phe Leu Gly Lys Val Cys Phe Leu Val Thr Gly Val Gly Arg Ala Asn Asn Cys Ser Val Glu Met
【００２９】
ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞を大量培養し、クロマチン画分を調製した。抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いてタンパク複合体を免疫沈降し、銀染色によってタンパクを検出した。得られた結果を図１に示す。コントロール実験として、野生型のＤＴ４０細胞(wt)を大量培養し、クロマチン画分を調製して抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降実験を行った。ここで、検出されるタンパク質は、抗体の非特異的吸着により沈降されるタンパク質である。ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞で、特異的に沈降され、コントロール実験で沈降される5本のバンドに着目して、それらをＣＥＮＰ−Ｉ、ＣＥＮＰ−Ｈ、ＣＥＮＰ−Ｏ、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−Ｐ、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７と命名した。
ＣＥＮＰ−Ｏ、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−Ｐ、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７の各タンパクは、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと特異的に結合することから、これらが構成的にセントロメアに局在するタンパク複合体であると考えられた。ＣＥＮＰ−ＨをＣＥＮＰ−Ｈ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルとＣＥＮＰ−ＩをＣＥＮＰ−Ｉ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルで共通に見られる５本のバンドを切り出して部分的アミノ酸配列を決定した。
【００３０】
（４）得られた部分アミノ酸配列をもとにプローブを調製し、ニワトリ胚由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーングした。各種タンパク質に関して複数種類のｃＤＮＡクローンを得て、得られたすべてのｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。その結果すべての 種類のタンパク質に関して開始コドンと予想されるＡＴＧが見いだされ、完全長のｃＤＮＡの塩基配列が決定できた。（ＣＥＮＰ−Ｏが配列番号１及び６、ＣＥＮＰ−Ｐが配列番号２及び７、ＣＥＮＰ−３５が配列番号３及び８、ＣＥＮＰ−３０が配列番号４及び９、ＣＥＮＰ−１７が配列番号５及び１０にそれぞれ対応する）。それらのｃＤＮＡを参考にプライマーを設計して、ＰＣＲ反応を行いストップコドンをとり除いたｃＤＮＡを得て、その断片をｐＥＧＦＰＮ１(クローンテック社)のＢａｍＨＩサイトへクローン化した。それぞれのプラスミドは、ストップコドンが取り除かれてＧＦＰのコード領域と融合している(ＧＦＰ融合発現プラスミド)。ＧＦＰ融合発現プラスミドをＤＴ４０野生型細胞あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−ＲＦＰ発現細胞(セントロメア領域が赤で標識されている細胞)へ導入して、ＧＦＰ融合タンパク質としてそれぞれのタンパク質を安定に発現させた。それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の安定発現細胞を集めて、ＰＢＳで洗浄後、サイトスピン法によってスライドグラス上に貼付けた。スライドグラスを３％パラホルムアルデヒドに１５分間浸透させ、細胞を固定した。細胞をＰＢＳでリンスした後０．３マイクロg/mLのＤＡＰＩで細胞核及び染色体を染色した。作成したスライドグラスを蛍光顕微鏡へ供してＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を緑チャンネルで観察した。細胞形態によって、細胞分裂期の細胞と間期の細胞の区別が可能となる。５種類すべてのタンパク質がＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと同様に細胞周期を通じて点状のドットとして観察された。ＣＥＮＰ−Ｈと局在をともにすることから、すべてのタンパク質が細胞周期を通じてセントロメアへ局在していることが確認できた（図２〜図６）。
【００３１】
（５）ＣＥＮＰ−Ｏノックアウト細胞
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Ｏの遺伝子領域の一部を欠損させたプラスミドコンストラクトと薬剤耐性遺伝子を結合させたノックアウトコンストラクトを細胞へ導入して、当該遺伝子領域と相同組み換え法によって、ノックアウトコンストラクトと遺伝子領域を置換させて遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３２】
ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｏが２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行った。はじめに、図７に示すヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入した。このノックアウトコンストラクトは、ＣＥＮＰ−Ｏのゲノム領域をクローン化した後、エキソン３からエキソン７の部分を取り除き、ｈｉｓＤ遺伝子を挿入して構築したものである。このノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。1mg/mlのヒスティディノールに耐性を示すクローンを拾い、全ゲノムDNAを抽出して、下(図8の1st)で示すサザンハイブリダアーゼーションで組み換えを同定する。ＣＥＮＰ−Ｏの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｏのエキソン３からエキソン７がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｏの一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入する。O.5μg/mlのピユーロマイシンに耐性を示すクローンを拾う。２遺伝子座目の破壊を調べるために、ノックアウト候補株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図１でしめすｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズする。0.5XSSC-0.5%SDS溶液中65度でフィルターを洗浄してオートラジオグラフィーをとって、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約１２ｋｂにバンドがでる（図８のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）が、ＣＥＮＰ−Ｏの１遺伝子座の遺伝子領域が破壊されていると１２ｋｂに加えて約９ｋｂ（図８の１ｓｔ）のバンドをしめす。さらにノックアウト株では、野生型ででる１２ｋｂのバンドは消失して１０ｋｂと９ｋｂのバンドパターンが得られる（図８の２ｎｄ）。この遺伝子型を有する細胞が目的のノックアウト細胞株である（＃３１−２４−１）。
【００３３】
得られたＣＥＮＰ−Ｏのノックアウト細胞と野生型の細胞でＣＥＮＰ−Ｏの量をウエスタンブロット法にて測定した（図９）。１０の５条個の細胞を集めて、4%SDSに溶解して超音波破砕した。全細胞タンパク質をSDS-電気泳動に供し、泳動後ゲルをニトロセルロースフィルターへ移した。フィルターをスキムミルクでブロック後抗CENP-O抗体と1時間以上インキュベートした。HRPラベルした抗ウサギ抗体でタンパク質を検出した。その結果、ノックアウト細胞ではＣＥＮＰ−Ｏタンパク質が検出できなかった。これにより、ＣＥＮＰ−Ｏのノックアウトが確認できた。また、細胞増殖は行うがノックアウト細胞の増殖は野生型のそれに比べると遅延した（図１０）。倍加時間は、野生型で約９時間であったのに対して１０−１１時間程度であった（図１１）。倍加時間の測定を行うためには、適当時間の培養後細胞をトリパンブルーで染色することによって細胞数をカウントした。
【００３４】
（６）ＣＥＮＰ−Ｐノックアウト細胞
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Pの遺伝子領域の一部を欠損させたプラスミドコンストラクトと薬剤耐性遺伝子を結合させたノックアウトコンストラクトを細胞へ導入して、当該遺伝子領域と相同組み換え法によって、ノックアウトコンストラクトと遺伝子領域を置換させて遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３５】
ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｐが２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行った。はじめに、図１２に示すヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入した。このノックアウトコンストラクトは、ＣＥＮＰ−Pのゲノム領域をクローン化した後、エキソン2からエキソン4の部分を取り除き、ｈｉｓＤ遺伝子を挿入して構築したものである。このノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。1mg/mlのヒスティディノールに耐性を示すクローンを拾い、全ゲノムDNAを抽出して、下(図13の1st)で示すサザンハイブリダアーゼーションで組み換えを同定する。ＣＥＮＰ−Pの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Pのエキソン2からエキソン4がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Pの一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入する。O.5μg/mlのピユーロマイシンに耐性を示すクローンを拾う。２遺伝子座目の破壊を調べるために、ノックアウト候補株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＥｃｏＲＶで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図１１でしめすｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズする。0.5XSSC-0.5%SDS溶液中65度でフィルターを洗浄してオートラジオグラフィーをとって、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約７．３ｋｂにバンドがでる（図１３のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）が、ＣＥＮＰ−Ｐの１遺伝子座の遺伝子領域が破壊されていると７．３ｋｂに加えて約１０．６ｋｂ（図１３の１ｓｔ）のバンドをしめす。さらにノックアウト株では、野生型ででる７．３ｋｂのバンドは消失して１０．６ｋｂと９．７ｋｂのバンドパターンが得られる（図１３の２ｎｄ）。この遺伝子型を有する細胞が目的のノックアウト細胞株である（ＸＰ５−１）。
【００３６】
得られたＣＥＮＰ−Ｐのノックアウト細胞と野生型の細胞でＣＥＮＰ−Ｐの量をウエスタンブロット法にて測定した（図１４）。１０の５条個の細胞を集めて、4%SDSに溶解して超音波破砕した。全細胞タンパク質をSDS-電気泳動に供し、泳動後ゲルをニトロセルロースフィルターへ移した。フィルターをスキムミルクでブロック後抗CENP-P抗体と1時間以上インキュベートした。HRPラベルした抗ウサギ抗体でタンパク質を検出した。その結果、ノックアウト細胞ではＣＥＮＰ−Pタンパク質が検出できなかった。これにより、ＣＥＮＰ−Pのノックアウトが確認できた。また、細胞増殖は行うがノックアウト細胞の増殖は野生型のそれに比べると遅延した。その結果、ノックアウト細胞ではＣＥＮＰ−Ｐタンパク質が検出できなかった。これにより、ＣＥＮＰ−Ｐのノックアウトが確認できた。また、細胞増殖は行うがノックアウト細胞の増殖は野生型のそれに比べると遅延した（図１５）。倍加時間は、野生型で約９時間であったのに対して１０−１１時間程度であった（図１６）。倍加時間の測定を行うためには、適当時間の培養後細胞をトリパンブルーで染色することによって細胞数をカウントした。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパク質を発現する細胞から得られた抽出液を、抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫複合体を免疫沈降させた結果を示す図である。図中、ＷＴは野生株細胞を示す。
【図２】ＣＥＮＰ−Ｏの細胞内局在を示す図である。ａ、ｂはＭ期、ｃは間期であり、ＣＥＮＰ−Ｏは緑、ＤＡＰＩは青に染色されており、細胞核及び染色体を示している。
【図３】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)、ＣＥＮＰ−３５及びＣＥＮＰ−Ｈの細胞内局在を示す図である。
【図４】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)、ＣＥＮＰ−Ｐ及びＣＥＮＰ−Ｈの細胞内局在を示す図である。
【図５】ＣＥＮＰ−３０の細胞内局在を示す図である。ＣＥＮＰ−３０は緑、ＤＡＰＩ(細胞核)は青に染色されている。
【図６】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)及びＣＥＮＰ−１７の細胞内局在を示す図である。ＣＥＮＰ−１７は緑、ＤＡＰＩは青に染色されている。
【図７】ＤＴ−４０細胞のＣＥＮＰ−Ｏ遺伝子ノックアウトコンストラクトを示す図である。
【図８】ノックアウト細胞選択のためのハイブリダイズ結果を示す図である。
【図９】ノックアウト細胞がＣＥＮＰ−Ｏを産生していないことを示す図である。
【図１０】ＣＥＮＰ−Ｏノックアウト細胞の増殖速度を示す図である。
【図１１】ＣＥＮＰ−Ｏノックアウト細胞の倍加時間を示す図である。
【図１２】ＤＴ−４０細胞のＣＥＮＰ−Ｐ遺伝子ノックアウトコンストラクトを示す図である。
【図１３】ノックアウト細胞選択のためのハイブリダイズ結果を示す図である。
【図１４】ノックアウト細胞がＣＥＮＰ−Ｐを産生していないことを示す図である。
【図１５】ＣＥＮＰ−Ｐノックアウト細胞の増殖速度を示す図である。
【図１６】ＣＥＮＰ−Ｐノックアウト細胞の倍加時間を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セントロメアに局在するタンパク質の遺伝子のノックアウト細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物が生命を維持するためには、全ゲノム情報を包括する構造体である染色体は安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期で染色体の複製と分配が正確に行われる。染色体の複製・分配といった基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体分配機構の解明は、がん化の制御につながると考えられる。
【０００３】
細胞分裂時に両極から伸びた紡錘体が染色体の特殊構造を捕まえて、娘細胞へ分配することで染色体分配はおこる。その際、紡錘体が捕らえる染色体の特殊構造はセントロメア（動原体）と呼ばれている。従って、セントロメアは染色体分配に重要な働きを担っている。また、がん細胞のように過剰な分裂を行う細胞では、セントロメアを構成するあるタンパク質が過剰に発現していることが報告されている（非特許文献１）。ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉは染色体分配に関わるセントロメア構成タンパク質であり、ＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ｉが結合していることは報告されている（非特許文献２）。ただし、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉは、染色体分配において未同定のタンパク質と作用して巨大複合体として機能すると予想されている（非特許文献３）。他のセントロメアタンパク質と同様に未同定のセントロメアタンパク質は、がん細胞で過剰に発現していることが予想される。したがって、未同定のセントロメアタンパク質は、制がん薬剤のターゲットになる可能性を秘めている。また、当該未同定のセントロメアタンパク質の機能解明やがん研究のためには、当該タンパク質遺伝子をノックアウトした細胞が必要になる。
【非特許文献１】Tomonaga et al., Cancer Res., 63, 3511-3516, 2003
【非特許文献２】Nishihashi et al., Dev. Cell, 2, 463-476, 2002
【非特許文献３】Fukagawa, Exp. Cell Res., 296, 21-27, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、セントロメアに局在し、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合して染色体分配を制御しており、制がん薬剤のターゲットとして有用な新規タンパク質を見出し、そのタンパク質遺伝子のノックアウト細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、がん細胞の増殖制御を目指してセントロメアを構成するタンパク質について研究を行い、特にＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに注目し、これに結合するタンパク質を探索してきた。その結果、今般、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、セントロメアへ局在し染色体分配を制御する機能を有する５種のタンパク質を見出した。そして、さらに研究してきたところ、そのうちの２種のタンパク質遺伝子をノックアウトした細胞の取得に成功し、それらの細胞が増殖はするが、その増殖時間が遅くなっており、染色体分配の機能解明及びがん創薬の有用なモデル細胞になり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐは、セントロメアを構成するタンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する性質を有することから、染色体の分配に深く関与しているタンパク質である。そして、本発明のノックアウト細胞は、細胞増殖が遅くなっており、細胞のがん化のメカニズム解明や染色体分配機能解明に有用なモデル細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、配列番号１又は２のアミノ酸からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質である。ここで配列番号１がＣＥＮＰ−Ｏのアミノ酸配列、配列番号２がＣＥＮＰ−Ｐのアミノ酸配列である。ここで、上記１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上である。
【０００９】
また、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子としては、前記タンパク質をコードするものであれば制限されないが、例えば配列番号６又は７の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号６又は７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件である。
【００１０】
配列番号１又は２のアミノ酸配列及び配列番号６又は７の塩基配列は、ニワトリ由来のタンパク質及びそれをコードする遺伝子である。しかし、前記の如く１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有する限り、ヒトを含む哺乳類由来のタンパク質も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００１１】
セントロメアに局在するタンパク質の同定は、生化学的手法や遺伝学的手法を用いることで数多く試みられている。しかしながら、存在量の少なさや抽出技術の困難さから、新しくセントロメアタンパク質を同定したという成功例は数少ない。また、既存のセントロメアタンパク質にタグをつけたタンパク質を細胞内で大量発現させて、結合タンパク質を同定する試みが最近さかんに行われている。しかしながら、大量発現することで、そのタンパク質がセントロメア以外の場所に局在し、セントロメアに局在するセントロメアタンパク質同定がうまくいかないなど技術的な問題点が数多くあった。
【００１２】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、例えばニワトリＤＴ４０細胞を用いて、以下の如くして分離できる。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞内では、相同組み換えが高頻度でおこるために遺伝子改変を効率的に行うことができる。セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉの発現を１００％タグ付きの融合タンパク質に置き換えた細胞株を樹立した。この細胞株では、タグ付きのＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉがセントロメア以外に局在してしまうという前記問題点が克服できていた。そこでこれらの細胞株を用いてクロマチン画分を調製し、抗タグ抗体を用いた免疫沈降法によりＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉと結合するタンパク質を同定した。得られたペプチド配列をもとにｃＤＮＡクローニングすることにより、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなる２種類のタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐ得られる。
【００１３】
得られたＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、これをＧＦＰ融合タンパク質等の標識タンパク質として細胞内で発現させれば、細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが確認できる。
【００１４】
かくして得られたＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐ及びこれらの遺伝子は、アミノ酸配列又は塩基配列が判明したので、前記手段に限定されず、ペプチド合成等により製造することもでき、通常の遺伝子組み換え手段により製造できることは言うまでもない。
【００１５】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐは、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する。従って、染色体の分配に必須のタンパク質である。
【００１６】
本発明において、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させたとは、該遺伝子の遺伝子産物であるＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐが正常に産生されないようにしたことをいい、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐ自体が産生しない場合、及び一部を欠損するなどして機能を発現し得ないタンパク質を産生する場合が含まれる。
【００１７】
本発明のノックアウト細胞は、例えばＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐの遺伝子領域の一部又は全部を相同組み換え方法によって、染色体上の当該遺伝子を破壊することにより行なわれる。相同組み換えは、他の遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子との間に相同組み換えを行うことにより、ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐの遺伝子の領域を細胞から欠失させることにより行うのが好ましい。
【００１８】
本発明のノックアウト細胞の樹立は、具体的には次の如くして行われる。ＣＥＮＰ−Ｏを例にして説明する。
宿主としては例えば、ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を用いることができる。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｏが２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行う。はじめに、薬剤耐性遺伝子、例えばヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入する。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｏの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｏのエキソン３からエキソン７がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｏの一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へもう一つの薬剤耐性遺伝子、例えばピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトを導入して２遺伝子座も完全に破壊する。ノックアウト株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素で消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写する。フィルターをラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択する。
【００１９】
かくして得られるノックアウト細胞は、いずれも細胞増殖は行うが、野生型に比べると遅延している。倍加時間は、野生型で約９時間であったのに対し、１０〜１１時間であった。従って、ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐはいずれも染色体の分配に必須ではあるが、細胞増殖に必須ではないことが判明した。従って、本発明のノックアウト細胞は、がん治療薬のスクリーニングモデル細胞として、また染色体分配の機構解明に有用である。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２１】
（１）細胞内のＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉタンパク質の全てをタグ付き融合タンパク質に置換された細胞株の確立
ＣＥＮＰ−Ｈ遺伝子あるいはＣＥＮＰ−Ｉ遺伝子のゲノム領域と相同性のある約１０Kbのゲノム配列をプラスミドベクターｐＢＳへクローン化する。そのプラスミドへクローン化されたゲノム領域へ薬剤耐性遺伝子(ヒスチジノール耐性遺伝子あるいはピューロマイシン耐性遺伝子)を挿入したプラスミドを構築する (ノックアウトコンストラクト)。エレクトロポーレーション法(５５０Ｖ、２５マイクロＦ)を用いて、制限酵素ＮｏｔＩで切断されたノックアウトコンストラクトをＤＴ４０細胞へ導入して、ノックコンストラクトとゲノム領域が置換したニワトリＤＴ４０細胞株（ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株）を樹立する。相同組み換えの有無は、サザンハイブリダイゼーションで確認できる。平行して、ＣＭＶプローモーターの下流でＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現するプラスミドベクターを構築する(ＦＬＡＧタグ融合ベクター)。ＦＬＡＧタグ融合ベクターをエレクトロポーレーション法を用いて、ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株へ導入した。これらの細胞株では、野生型のＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がノックアウトされて、ＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現しているため、細胞内の全てのＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質に置き換わっている。
【００２２】
（２）ＣＥＮＰ−Ｏ及びＣＥＮＰ−Ｐの分離
（１）で得た細胞を大量培養して間期の細胞を集めた。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、遠心分離によって核を調製する。核を緩衝液Ａ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／１５０mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ）に懸濁した後、超音波破砕し、遠心分離によってＤＮＡを含む画分を調製した。ＤＮＡを含む画分に最終濃度３mMのCaCl2を添加し、さらにマイクロコッカル・ヌクレアーゼを加えて４℃１時間反応させ、ＤＮＡを切断することによって、ＤＮＡに結合しているタンパク質を可溶化した。ＫＣｌ及びＮＰ−４０をそれぞれ最終濃度３００mM及び０．１％になるよう添加し、続いて抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを添加して４℃３時間撹拌した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを遠心分離によって回収し、緩衝液Ｂ（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ pH８．０／３００mM ＫＣｌ／１mM ＤＴＴ／０．１％ ＮＰ−４０）を用いて洗浄した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンに０．１Ｍ Glycine pH２．５溶液を添加して１分間静置した後、遠心分離によって溶液を回収した。溶液に等量の２０％トリクロロ酢酸及び５倍量のアセトンを添加し、−２０℃で２時間静置し、遠心分離によってタンパク質を回収した。
【００２３】
（３）タンパク質の同定
回収されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、銀染色で検出し、ゲルを切り出して質量分析を行うことで各タンパク質の部分アミノ酸配列を決定した。各タンパク質の部分アミノ酸配列は、以下の通りである。
【００２４】
（ＣＥＮＰ−Ｏ）Asp Gly Gly Gly Arg Met Pro Ala Ala Pro Leu Ala Gln Gly Lys Val Glu Arg
【００２５】
（ＣＥＮＰ−３５）Lys Gln Trp Thr Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Tyr Lys Phe Ser Ser Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Met Leu Gly Val Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg
【００２６】
（ＣＥＮＰ−Ｐ）Lys Ala Glu Leu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Leu Ser Phe Leu Val Lys Phe Thr Gly Ile Gln Ile Thr Ser His Ser Lys Lys Thr Leu Glu Lys Thr Gly Asn Arg
【００２７】
（ＣＥＮＰ−３０）Arg Asn Pro Glu Leu Ile Ser Thr Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys
【００２８】
（ＣＥＮＰ−１７）Asn Val Gln Ala Ser Leu Ala Tyr Val Asp Val Arg Phe Phe Leu Gly Lys Val Cys Phe Leu Val Thr Gly Val Gly Arg Ala Asn Asn Cys Ser Val Glu Met
【００２９】
ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞を大量培養し、クロマチン画分を調製した。抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いてタンパク複合体を免疫沈降し、銀染色によってタンパクを検出した。得られた結果を図１に示す。コントロール実験として、野生型のＤＴ４０細胞(wt)を大量培養し、クロマチン画分を調製して抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降実験を行った。ここで、検出されるタンパク質は、抗体の非特異的吸着により沈降されるタンパク質である。ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞で、特異的に沈降され、コントロール実験で沈降される5本のバンドに着目して、それらをＣＥＮＰ−Ｉ、ＣＥＮＰ−Ｈ、ＣＥＮＰ−Ｏ、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−Ｐ、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７と命名した。
ＣＥＮＰ−Ｏ、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−Ｐ、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７の各タンパクは、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと特異的に結合することから、これらが構成的にセントロメアに局在するタンパク複合体であると考えられた。ＣＥＮＰ−ＨをＣＥＮＰ−Ｈ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルとＣＥＮＰ−ＩをＣＥＮＰ−Ｉ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルで共通に見られる５本のバンドを切り出して部分的アミノ酸配列を決定した。
【００３０】
（４）得られた部分アミノ酸配列をもとにプローブを調製し、ニワトリ胚由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーングした。各種タンパク質に関して複数種類のｃＤＮＡクローンを得て、得られたすべてのｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。その結果すべての 種類のタンパク質に関して開始コドンと予想されるＡＴＧが見いだされ、完全長のｃＤＮＡの塩基配列が決定できた。（ＣＥＮＰ−Ｏが配列番号１及び６、ＣＥＮＰ−Ｐが配列番号２及び７、ＣＥＮＰ−３５が配列番号３及び８、ＣＥＮＰ−３０が配列番号４及び９、ＣＥＮＰ−１７が配列番号５及び１０にそれぞれ対応する）。それらのｃＤＮＡを参考にプライマーを設計して、ＰＣＲ反応を行いストップコドンをとり除いたｃＤＮＡを得て、その断片をｐＥＧＦＰＮ１(クローンテック社)のＢａｍＨＩサイトへクローン化した。それぞれのプラスミドは、ストップコドンが取り除かれてＧＦＰのコード領域と融合している(ＧＦＰ融合発現プラスミド)。ＧＦＰ融合発現プラスミドをＤＴ４０野生型細胞あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−ＲＦＰ発現細胞(セントロメア領域が赤で標識されている細胞)へ導入して、ＧＦＰ融合タンパク質としてそれぞれのタンパク質を安定に発現させた。それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の安定発現細胞を集めて、ＰＢＳで洗浄後、サイトスピン法によってスライドグラス上に貼付けた。スライドグラスを３％パラホルムアルデヒドに１５分間浸透させ、細胞を固定した。細胞をＰＢＳでリンスした後０．３マイクロg/mLのＤＡＰＩで細胞核及び染色体を染色した。作成したスライドグラスを蛍光顕微鏡へ供してＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を緑チャンネルで観察した。細胞形態によって、細胞分裂期の細胞と間期の細胞の区別が可能となる。５種類すべてのタンパク質がＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと同様に細胞周期を通じて点状のドットとして観察された。ＣＥＮＰ−Ｈと局在をともにすることから、すべてのタンパク質が細胞周期を通じてセントロメアへ局在していることが確認できた（図２〜図６）。
【００３１】
（５）ＣＥＮＰ−Ｏノックアウト細胞
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Ｏの遺伝子領域の一部を欠損させたプラスミドコンストラクトと薬剤耐性遺伝子を結合させたノックアウトコンストラクトを細胞へ導入して、当該遺伝子領域と相同組み換え法によって、ノックアウトコンストラクトと遺伝子領域を置換させて遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３２】
ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｏが２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行った。はじめに、図７に示すヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入した。このノックアウトコンストラクトは、ＣＥＮＰ−Ｏのゲノム領域をクローン化した後、エキソン３からエキソン７の部分を取り除き、ｈｉｓＤ遺伝子を挿入して構築したものである。このノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。1mg/mlのヒスティディノールに耐性を示すクローンを拾い、全ゲノムDNAを抽出して、下(図8の1st)で示すサザンハイブリダアーゼーションで組み換えを同定する。ＣＥＮＰ−Ｏの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｏのエキソン３からエキソン７がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｏの一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入する。O.5μg/mlのピユーロマイシンに耐性を示すクローンを拾う。２遺伝子座目の破壊を調べるために、ノックアウト候補株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図１でしめすｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズする。0.5XSSC-0.5%SDS溶液中65度でフィルターを洗浄してオートラジオグラフィーをとって、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約１２ｋｂにバンドがでる（図８のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）が、ＣＥＮＰ−Ｏの１遺伝子座の遺伝子領域が破壊されていると１２ｋｂに加えて約９ｋｂ（図８の１ｓｔ）のバンドをしめす。さらにノックアウト株では、野生型ででる１２ｋｂのバンドは消失して１０ｋｂと９ｋｂのバンドパターンが得られる（図８の２ｎｄ）。この遺伝子型を有する細胞が目的のノックアウト細胞株である（＃３１−２４−１）。
【００３３】
得られたＣＥＮＰ−Ｏのノックアウト細胞と野生型の細胞でＣＥＮＰ−Ｏの量をウエスタンブロット法にて測定した（図９）。１０の５条個の細胞を集めて、4%SDSに溶解して超音波破砕した。全細胞タンパク質をSDS-電気泳動に供し、泳動後ゲルをニトロセルロースフィルターへ移した。フィルターをスキムミルクでブロック後抗CENP-O抗体と1時間以上インキュベートした。HRPラベルした抗ウサギ抗体でタンパク質を検出した。その結果、ノックアウト細胞ではＣＥＮＰ−Ｏタンパク質が検出できなかった。これにより、ＣＥＮＰ−Ｏのノックアウトが確認できた。また、細胞増殖は行うがノックアウト細胞の増殖は野生型のそれに比べると遅延した（図１０）。倍加時間は、野生型で約９時間であったのに対して１０−１１時間程度であった（図１１）。倍加時間の測定を行うためには、適当時間の培養後細胞をトリパンブルーで染色することによって細胞数をカウントした。
【００３４】
（６）ＣＥＮＰ−Ｐノックアウト細胞
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Pの遺伝子領域の一部を欠損させたプラスミドコンストラクトと薬剤耐性遺伝子を結合させたノックアウトコンストラクトを細胞へ導入して、当該遺伝子領域と相同組み換え法によって、ノックアウトコンストラクトと遺伝子領域を置換させて遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３５】
ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｐが２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行った。はじめに、図１２に示すヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入した。このノックアウトコンストラクトは、ＣＥＮＰ−Pのゲノム領域をクローン化した後、エキソン2からエキソン4の部分を取り除き、ｈｉｓＤ遺伝子を挿入して構築したものである。このノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入した。1mg/mlのヒスティディノールに耐性を示すクローンを拾い、全ゲノムDNAを抽出して、下(図13の1st)で示すサザンハイブリダアーゼーションで組み換えを同定する。ＣＥＮＰ−Pの遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Pのエキソン2からエキソン4がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Pの一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトをエレクトロポーローション法(550V 25μF)によって、細胞へ導入する。O.5μg/mlのピユーロマイシンに耐性を示すクローンを拾う。２遺伝子座目の破壊を調べるために、ノックアウト候補株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＥｃｏＲＶで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図１１でしめすｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズする。0.5XSSC-0.5%SDS溶液中65度でフィルターを洗浄してオートラジオグラフィーをとって、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約７．３ｋｂにバンドがでる（図１３のｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）が、ＣＥＮＰ−Ｐの１遺伝子座の遺伝子領域が破壊されていると７．３ｋｂに加えて約１０．６ｋｂ（図１３の１ｓｔ）のバンドをしめす。さらにノックアウト株では、野生型ででる７．３ｋｂのバンドは消失して１０．６ｋｂと９．７ｋｂのバンドパターンが得られる（図１３の２ｎｄ）。この遺伝子型を有する細胞が目的のノックアウト細胞株である（ＸＰ５−１）。
【００３６】
得られたＣＥＮＰ−Ｐのノックアウト細胞と野生型の細胞でＣＥＮＰ−Ｐの量をウエスタンブロット法にて測定した（図１４）。１０の５条個の細胞を集めて、4%SDSに溶解して超音波破砕した。全細胞タンパク質をSDS-電気泳動に供し、泳動後ゲルをニトロセルロースフィルターへ移した。フィルターをスキムミルクでブロック後抗CENP-P抗体と1時間以上インキュベートした。HRPラベルした抗ウサギ抗体でタンパク質を検出した。その結果、ノックアウト細胞ではＣＥＮＰ−Pタンパク質が検出できなかった。これにより、ＣＥＮＰ−Pのノックアウトが確認できた。また、細胞増殖は行うがノックアウト細胞の増殖は野生型のそれに比べると遅延した。その結果、ノックアウト細胞ではＣＥＮＰ−Ｐタンパク質が検出できなかった。これにより、ＣＥＮＰ−Ｐのノックアウトが確認できた。また、細胞増殖は行うがノックアウト細胞の増殖は野生型のそれに比べると遅延した（図１５）。倍加時間は、野生型で約９時間であったのに対して１０−１１時間程度であった（図１６）。倍加時間の測定を行うためには、適当時間の培養後細胞をトリパンブルーで染色することによって細胞数をカウントした。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパク質を発現する細胞から得られた抽出液を、抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫複合体を免疫沈降させた結果を示す図である。図中、ＷＴは野生株細胞を示す。
【図２】ＣＥＮＰ−Ｏの細胞内局在を示す図である。ａ、ｂはＭ期、ｃは間期であり、ＣＥＮＰ−Ｏは緑、ＤＡＰＩは青に染色されており、細胞核及び染色体を示している。
【図３】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)、ＣＥＮＰ−３５及びＣＥＮＰ−Ｈの細胞内局在を示す図である。
【図４】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)、ＣＥＮＰ−Ｐ及びＣＥＮＰ−Ｈの細胞内局在を示す図である。
【図５】ＣＥＮＰ−３０の細胞内局在を示す図である。ＣＥＮＰ−３０は緑、ＤＡＰＩ(細胞核)は青に染色されている。
【図６】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)及びＣＥＮＰ−１７の細胞内局在を示す図である。ＣＥＮＰ−１７は緑、ＤＡＰＩは青に染色されている。
【図７】ＤＴ−４０細胞のＣＥＮＰ−Ｏ遺伝子ノックアウトコンストラクトを示す図である。
【図８】ノックアウト細胞選択のためのハイブリダイズ結果を示す図である。
【図９】ノックアウト細胞がＣＥＮＰ−Ｏを産生していないことを示す図である。
【図１０】ＣＥＮＰ−Ｏノックアウト細胞の増殖速度を示す図である。
【図１１】ＣＥＮＰ−Ｏノックアウト細胞の倍加時間を示す図である。
【図１２】ＤＴ−４０細胞のＣＥＮＰ−Ｐ遺伝子ノックアウトコンストラクトを示す図である。
【図１３】ノックアウト細胞選択のためのハイブリダイズ結果を示す図である。
【図１４】ノックアウト細胞がＣＥＮＰ−Ｐを産生していないことを示す図である。
【図１５】ＣＥＮＰ−Ｐノックアウト細胞の増殖速度を示す図である。
【図１６】ＣＥＮＰ−Ｐノックアウト細胞の倍加時間を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞。
【請求項２】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子のいずれかの部位を欠失させるか、又はいずれかの部位を他の遺伝子と置換することにより該遺伝子の機能を欠損させたものである請求項１記載の細胞。
【請求項３】
他の遺伝子が薬剤耐性遺伝子である請求項１又は２記載の細胞。
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞。
【請求項２】
ＣＥＮＰ−Ｏ又はＣＥＮＰ−Ｐをコードする遺伝子のいずれかの部位を欠失させるか、又はいずれかの部位を他の遺伝子と置換することにより該遺伝子の機能を欠損させたものである請求項１記載の細胞。
【請求項３】
他の遺伝子が薬剤耐性遺伝子である請求項１又は２記載の細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００７−１９５４２９（Ｐ２００７−１９５４２９Ａ）
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６０７９（Ｐ２００６−１６０７９）
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【出願人】（５０４２０２４７２）大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 (119)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【出願人】（５０４２０２４７２）大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 (119)
【Ｆターム（参考）】
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