ソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法
【課題】複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する手法。
【解決手段】基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、該ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアルを含む溶液を導入し基板を得、続いて第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して基板を得る工程と、係る凍結乾燥した第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板上に第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、第２のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、基板上に第２のマイクロアレイを形成する工程と及び前記第１及び第２のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを形成させる。
【解決手段】基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、該ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアルを含む溶液を導入し基板を得、続いて第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して基板を得る工程と、係る凍結乾燥した第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板上に第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、第２のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、基板上に第２のマイクロアレイを形成する工程と及び前記第１及び第２のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを形成させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法に関する。特に本発明は、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを、同一基板上に作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療・診断の分野又は分子細胞生物学研究の分野において、タンパク質、DNA（デオキシリボ核酸）又は細胞などの解析、機能評価又はそれらの相互作用解析を、より定量的で再現性よく、かつ迅速に測定・観察する方法・装置が求められてきている。そのひとつの技術として、ガラスなどの基板上に、ソフトマテリアルのアレイを、マイクロメートルからナノメートルスケールで作製する様々な技術が提案されている。ここで「ソフトマテリアル」とは、生物由来又は非生物由来であってもよく、小さな分子が種々の形でつながった（又は集合した）高分子、ゲル、ゴム、コロイド、ミセル、液晶、及び種々の生体高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、タンパク質、糖質、糖タンパク等）を広く意味する。
【０００３】
係る技術の一つとして、ポリパラキシリレン樹脂（poly(para-xylylene)）をパターニングすることでステンシル（型抜き）とし、ソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する手法が注目を集めている。非特許文献１には、基板上に真空蒸着したポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成して、ステンシルとしてそのステンシル上にソフトマテリアルを注入して、その後ポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がして、基板上にソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する技術が開示されている（いわゆる「ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法」）。しかし非特許文献１には、基板上に１種類のソフトマテリアルを汎用的かつスケーラブルにマイクロアレイ化する技術は開示されているが、異なる複数種類のソフトマテリアルを、同一基板上にアレイ化する技術は開示されていない。
【０００４】
一方、ポリパラキシリレン樹脂を利用する技術であって、複数種類のソフトマテリアルを基板上にマイクロアレイ化する技術もいくつか知られている。
【０００５】
例えば、非特許文献２には、基板上に真空蒸着したポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上に複数種類のソフトマテリアルをインクジェットプリント式に吐出してポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がして、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。しかしこの技術では、ソフトマテリアルを吐出可能な高性能スポッターが追加専用機器として必要となるだけでなく、スポット間隔がスポッターの性能に依存するという問題がある。すなわちスポッターの性能に依存して、異なる種類のソフトマテリアル間のコンタミネーション（意図しない混合）を避けるためには異なる種類のソフトマテリアルをアレイ化するスポット間隔が制限されるという問題がある。
【０００６】
また、非特許文献３には、基板上に真空蒸着した２層のポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上にソフトマテリアルを注入して２層のポリパラキシリレン樹脂を基板から順々に１枚ずつ引き剥がすことで、異なる複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。しかしこの技術では、異なる種類のソフトマテリアル間でコンタミネーションが生じる可能性を排除できないという問題がある。
【０００７】
さらに、非特許文献４には、基板上に真空蒸着した１層のポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上に複数のマイクロ流路を形成し、流路毎に異なる種類のソフトマテリアルを注入してポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がすことで、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。この技術はコンタミネーションを生じる可能性は少ないが、マイクロアレイの各スポットにマイクロ流路を接続する方法であるため、異なる種類のソフトマテリアルをアレイ化するスポット間隔を望ましい大きさにできず、さらに大面積のアレイを作製することも難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】B. Ilic, et al., "Topographical Patterning of Chemically Sensitive Biological Materials Using a Polymer-Based Dry Lift Off," Biomedical Microdevices, vol.2, pp.317-322, 2000.
【非特許文献２】C. P. Tan, et al., "Nanoscale Resolution, Multicomponent Biomolecular Arrays Generated by Aligned Printing with Parylene Peel-Off," Nano Letters, vol.10, pp.719-725, 2010.
【非特許文献３】K. Kuribayashi, et al., "Sequential Parylene Lift-Off Process for Selective Patterning of Biological Materials," Proc. IEEE MEMS'07, pp.501-504, 2007.
【非特許文献４】K. Atsuta, et al., "A Parylene Lift-Off Process with Microfluidic Channels for Selective Protein Patterning," Journal of Micromechanics and Microengineering, vol.17, pp.496-500, 2007.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を用いてソフトマテリアルの小間隔のマイクロアレイを作製する方法であって、同一基板上に、複数種類のソフトマテリアルをコンタミネーションさせることなく、汎用的かつスケーラブルに、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法、を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記従来技術の問題点のない、複数種類のソフトマテリアルを同一基板上にマイクロアレイ化するための方法を鋭意追求した結果、(i)（例えば、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により得られた）基板上のソフトマテリアルを、（凍結乾燥などにより）変性させることなく脱水することにより、その基板に対して通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法が適用でき、さらに(ii)ソフトマテリアル上に堆積したポリパラキシリレン樹脂が、ソフトマテリアルの固定状態・構造・機能を損なうことなく、スムーズに基板から引き剥がすことができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、基板上に、第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、前記第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がして、前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する又は第２のソフトマテリアルを凍結乾燥することで、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法である。
【００１２】
さらに、本発明の方法を繰り返すことにより、望ましい種類の異なるソフトマテリアルのマイクロアレイが製造される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により、同一基板上に、複数種類のソフトマテリアルを、コンタミネーションさせることなく、汎用的かつスケーラブルに、スポッターを用いることなく、小さな間隔のマイクロアレイを作製することができる。また、本発明によるマイクロアレイ作製手順を繰り返すことで、２種類のソフトマテリアルに限らず、２種類以上のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製することができる。さらに、凍結乾燥させたソフトマテリアルを固定化したマイクロアレイ基板は、室温または低温で長期保存・配送することができ、使用者が当該基板を使用する際に緩衝溶液を導入するだけで容易に使用することができる。
【００１４】
以下、図面を参照して、本発明の良好な実施の形態を説明するが、本発明はこれらの実施態様に制限されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１は、本発明方法を概念的に示す図である。本発明に係る、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法は、いわゆる従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を利用するものであり、これまで知られているポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法又はその種々の応用方法を含む。本発明の方法は、通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法の条件、材料、装置、反応条件等について特に限定されることはない。
【００１６】
図１に示される通り、本発明の方法はまず、基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第１層目のポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、第１のマイクロアレイが形成された（固定化された）基板を得る工程を含む。係る工程は、従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を適用する工程であり、得られる基板は、その上に第１のマイクロアレイが形成された（固定化された）ものである。ここで本発明においては、パターン化された個々のマイクロアレイの形状、個々のソフトマテリアルの大きさ、及び個々のソフトマテリアル間の距離等（以下「形状等」とする）については、特に制限はなく、従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により設計可能な形状等にすることができる。通常、マイクロメータサイズ、又はナノメータサイズに設計することが容易である。
【００１７】
前記導入された第１のソフトマテリアルは通常、水溶液又は適当な溶液の形で基板上に固定されている。また、導入方法には特に制限はなく、第１のソフトマテリアルの水溶液又は適当な溶媒の溶液を基板の上に一部又は全体に導入して基板表面にソフトマテリアルを固定する。その後、固定されなかった余分のソフトマテリアルの水溶液等を洗い流すことができる。基板表面には特にソフトマテリアルとの結合を促進する修飾は必要ないが、場合により、ソフトマテリアルとの結合を強くする処理がなされていてもよい。
【００１８】
本発明の方法は続いて、前記得られた第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、凍結乾燥した第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板を得る工程を有するものである。本発明においては、基板に固定された第１のソフトマテリアルを凍結乾燥するものであるが、本発明においては「凍結乾燥」には広く「基板上のソフトマテリアルから、当該ソフトマテリアルの構造や機能が非可逆的に変性しないように水分を除去して乾燥する」ことを意味する。従って、冷却の有無、スクロースやトレハロースなどの凍結緩衝剤の有無、真空操作の有無等、凍結乾燥される基板上のソフトマテリアルにより適宜選択することができる。また「凍結乾燥」は、基板上のソフトマテリアルの全部又は一部、又は基板ごと行うことも可能である。
【００１９】
本発明の方法は続いて、前記得られた、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板を用いて、再び当該基板上に第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第２層目のポリパラキシリレン樹脂に第２のマイクロパターンを形成する。ここで第２層目のポリパラキシリレン樹脂蒸着は、基板上に固定され凍結乾燥された、第１のソフトマテリアルの表面も含めて蒸着させる。係る蒸着は、ポリパラキシリレン樹脂蒸着の通常の条件で可能であり、以下説明するが、しかも蒸着によっても第１のソフトマテリアルの表面のみならず内部についても変性等の損傷が見られない。これは基板上に固定された第１のソフトマテリアルが十分乾燥されていることによると考えられる。さらに、第２層目のポリパラキシリレン樹脂に第２のマイクロパターンを形成することも既に上で説明した通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法の条件がそのまま適用することができる。ここで第２層目のポリパラキシリレン樹脂に形成する第２のマイクロパターンは、基板の同一面に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを設けるものであるから、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所の基板上に形成される。
【００２０】
本発明の方法はさらに、得られた第２層目のポリパラキシリレン樹脂の第２のマイクロパターンに第２のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、基板上に第２のマイクロアレイを形成する（固定化する）。この工程は上の第１のソフトマテリアルを含む溶液の導入と同じ方法でよい。
【００２１】
ここで、第１及び第２の２種類の異なるソフトマテリアルによるマイクロアレイの製造を意図する場合、前記得られた第２のマイクロアレイが形成された（固定化された）基板から、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がすことにより、基板の同一面上に、第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイが製造できる。ここで、第１のソフトマテリアルは乾燥した状態であり、第２のソフトマテリアルは溶液（濡れた）の状態である。
必要に応じて、全体を再度凍結乾燥して第１及び第２のソフトマテリアルを乾燥した状態にするか、又は緩衝溶液等を注入して第１及び第２のソフトマテリアルを濡れた状態とすることができる。全体を凍結乾燥させることで、室温または低温で保存を行うことが可能となる。
【００２２】
図１には連続した矢印で示されているが、本発明は、上で説明した第１及び第２のソフトマテリアルによるマイクロアレイだけでなく、必要ならば、さらにこれを繰り返すこととで、３種類以上の異なるソフトマテリアルが同一基板表面に設けられたマイクロアレイが製造可能である。
【００２３】
また上で、第２層目のポリパラキシリレン樹脂蒸着の対象となるものとして、第１のソフトマテリアルが固定され凍結乾燥された基板で第１のポリパラキシリレン層を保持するものであると説明したが、本発明においてはこれに限定されない。
【００２４】
第１のソフトマテリアルを導入して基板に固定した後、第１のポリパラキシリレン層を引き剥がしたものを凍結乾燥したもの、及び第１のソフトマテリアルを導入して基板に固定した後、凍結乾燥し、その後第１のポリパラキシリレン層を引き剥がしたものも対象となる。
【００２５】
以下本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００２６】
[マイクロアレイの作製方法]
図２は実施例で行った作製方法の手順を詳細に示したものである。図２を参照しながら説明する。
【００２７】
まず、基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を真空蒸着する（図２ａ）。
【００２８】
ここで、基板はソフトマテリアルを固定可能とし、かつポリパラキシリレン蒸着条件に耐える材質であればよい。例えばガラス、シリコンやプラスチックなどが挙げられる。マイクロアレイを使用する際、測定等の目的で光透過性であることが好ましい場合、光透過性であるガラスが好ましい。また、基板の表面にソフトマテリアルを固定する方法は特に制限されないが、必要な場合、より強い固定を得るため、基板表面に、固定化を促進する処理を施すことも可能である。
【００２９】
また、蒸着するポリパラキシリレン樹脂の種類も特に限定されるものではないが、ここではパリレンＣ（日本パリレン合同会社）を例として説明を進める。他の種類のパリレンＮやパリレンＤ、パリレンＨＴも又は必要に応じて適宜選択することができる。（いずれも日本パリレン合同会社にて入手可能）。ポリパラキシリレン樹脂の蒸着厚さは特に限定されず、後の工程でソフトマテリアルが十分導入される構造を有するパターンが形成される厚さであればよい。具体的には、２μm以下であれば望ましい。ここでは、１μｍの厚さで蒸着することを例にして説明を進める。
【００３０】
次に、蒸着したポリパラキシリレン樹脂上に、フォトレジストを積層する（図２ｂ）。フォトレジストとして、ここではＳ１８１８（Shipley Far East Ltd.）を例として説明を進めるが、特にこれに限定されない。また積層方法についても特に限定はなく通常の例えばスピンコートによる方法が好ましい。
【００３１】
続いて、第１のマイクロパターンを描画したガラスフォトマスクを介して紫外線照射によるフォトリソグラフィを行い（図２ｃ）、さらにフォトレジストの現像を行う（図２ｄ）。現像液は、使用したフォトレジストとの組み合わせで選択することができ、例えばＳ１８１８をフォトレジストとした場合は、ＮＭＤ−３（東京応化工業株式会社から入手可能）を現像液として利用できる。
【００３２】
その後、酸素プラズマによるドライエッチングを行い、ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを描画する（図２ｅ）。ここでは、紫外線照射によるフォトリソグラフィや酸素プラズマによるドライエッチングを例として説明したが、これに限定されず、例えば電子線ビームによるリソグラフィであっても良い。
【００３３】
続いて、アセトンとイソプロピルアルコールを使って残存するフォトレジストを洗い流してガラス基板上に第１のマイクロパターンを形成させる（図２ｆ）。
【００３４】
続いて、第１のソフトマテリアルを導入するために、マイクロパターン化された第１層目のポリパラキシリレン樹脂上にフローセルを作製する（図２ｇ）。ここではフローセルは、例えばシリコンゴムシートをスペーサとして用い、カバーガラスで挟んで作製する。マイクロアレイを作製したい第１のソフトマテリアルを含む溶液をフローセル内に注入し、露出させたガラス基板表面上に第１のマイクロアレイを導入・形成する。ここでは、例として、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）修飾）を第１のソフトマテリアルとして順に積層するものとする。
【００３５】
第１のソフトマテリアル導入後、フローセル内の溶液を塩を含まない溶液、例えば超純水や蒸留水に置換する。これによりフローセルに残存する、又は基板上に固定されない遊離の第１のソフトマテリアルが完全に洗い流される。
【００３６】
その後、フローセルを含む基板を丸ごと（そのまま）凍結乾燥装置を用いて凍結乾燥を行う（図２ｈ）。さらに、第１のソフトマテリアルを含む溶液を完全に乾燥させた後、フローセルを解体する（図２ｈ'）。ここで、フローセルを解体してからフローセルを含まない基板丸ごと凍結乾燥を行っても良い。
【００３７】
続いて、凍結乾燥を行った基板上に、第２層目のポリパラキシリレン樹脂を第１層と同様の条件・手順で、例えば１μmの厚さで真空蒸着、積層し（図２ｉ）、次いでＳ１８１８などのフォトレジストをスピンコートして積層する（図２ｊ）。
【００３８】
ここで、フォトレジストのベイク条件は、凍結乾燥した第１のソフトマテリアルの性質（例えば熱感受性等）を考慮して、高温で短時間（例えば１００℃で１分間）としても良いし、低温で長時間（例えば３５℃で３時間）又はそれらを組み合わせる条件を選択できる。
【００３９】
その後、第２のマイクロパターンを描画したガラスフォトマスクを介して紫外線照射によるフォトリソグラフィを行い（図２ｋ）、ＮＭＤ−３を使ってフォトレジストの現像を行う（図２ｌ）。
【００４０】
その後、酸素プラズマによるドライエッチングを行い、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に描画する（図２ｍ）。第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させるドライエッチング条件は特に限定はなく、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂の厚さに応じて、例えばエッチング時間を調節することで容易に選択することができる。
【００４１】
アセトンとイソプロピルアルコールを使って残存するフォトレジストを洗い流すことで、ガラス基板表面に第２のマイクロパターンが形成される（図２ｎ）。
【００４２】
次に第１層目と同様の条件で、マイクロパターン化された第２層目のポリパラキシリレン樹脂上にフローセルを作製する（図２ｏ）。
【００４３】
そして、マイクロアレイを作製したい第２のソフトマテリアルを含む溶液をフローセル内に注入し、露出させたガラス基板表面上に第２のマイクロアレイを形成する。ここでは、例として、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）修飾）を第２のソフトマテリアルとして順に積層するものとする。ここで、第１のソフトマテリアルのパターニングを行った場所は、第２層目のポリパラキシリレン樹脂によって覆われているため、第１のソフトマテリアルと第２のソフトマテリアルとのコンタミネーションは完全に阻止される。その後、フローセルを解体する（図２ｏ'）。
【００４４】
さらに、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がす（図２ｐ）。第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂は、例えばピンセット等で一部分を引き剥がすことで同時に容易に引き剥がされる。
【００４５】
最後に基板上にフローセルを作製し（図２ｑ）、緩衝溶液を注入することで凍結乾燥された第１のソフトマテリアルが再溶解し、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイが作製される。
[作製したマイクロアレイの評価]
図３は、上記手順にて作製されたマイクロアレイの蛍光顕微鏡観察結果の例を示す。図３から次のことが明らかである。（ｉ）まず、ガラス基板上に2種類の異なるソフトマテリアルが、以下の種々の処理に対しても十分な程度に固定されていること。(ii)さらに、2種類の異なるソフトマテリアル（それぞれ複数のタンパク質の機能を組み合わせて構築された標識化タンパク質）が変性を受けずに機能を発揮すること。（ｉｉｉ）2種類の異なるソフトマテリアルのコンタミネーションがないこと。すなわち、第１のソフトマテリアルとしてのＦＩＴＣ修飾一本鎖ＤＮＡと、第２のソフトマテリアルとしてのＴＭＲ修飾一本鎖ＤＮＡとが、コンタミネーションすることなく同一基板上にマイクロアレイ化されていることが分かる。（ｉｖ）アレイ化がマイクロスケールであり、かつアレイを形成するスポット間の間隔が十分明確に分離されている。
【００４６】
ただし今回の図３の例では、マイクロメートルスケールでのアレイ化の条件・装置を用いてマイクロメートルスケールでのアレイ化を目的としたものを示したが、必要ならば通常のナノメートルスケールでのアレイ化を目的とする条件・装置、例えば電子線ビームによるリソグラフィなどを行えば、ナノメートルスケールでのアレイ化も可能である。
【００４７】
図４は、本発明によるマイクロアレイ化された一本鎖ＤＮＡ（ソフトマテリアル）が、二本鎖形成能を保持しているかを検証する実験を行った結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【００４８】
この実験では、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ修飾、塩基配列Ａ）を第１のソフトマテリアルとして順に積層しており、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ修飾、塩基配列Ｂ）を第２のソフトマテリアルとして順に積層している。そのマイクロアレイ作製結果はＦＩＴＣの蛍光フィルタを通じて観察され（図４ａ）、ＴＭＲの蛍光フィルタを通じては観察されないことを確認した（図４ｂ）。
【００４９】
図４から、凍結乾燥の過程を経る本発明の方法によるマイクロアレイ化された一本鎖ＤＮＡは、その二本鎖形成能が保持されていることを確認され、変性等を受けていないことが分かる。すなわち、凍結乾燥の過程を経た塩基配列Ａの一本鎖ＤＮＡの相補鎖（５μＭのコレステロール修飾一本鎖ＤＮＡ、２３塩基長、蛍光色素ＴＭＲ修飾、塩基配列?）を注入すると、塩基配列Ａの一本鎖ＤＮＡが固定化されているスポットにのみ特異的に相補鎖が結合し（図４ｃ）、凍結乾燥の過程を経た一本鎖ＤＮＡの二本鎖形成能が保持されていることを確認した。
【００５０】
図５は、本発明によるマイクロアレイ化されたタンパク質が、その機能性を保持しているか検証実験を行った結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【００５１】
ここでは、機能性タンパク質の例として、モータータンパク質であるキネシンを用いた。すなわち、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、５ｍｇ／ｍＬのカゼイン、蛍光色素ＴＭＲを標識した１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、１００μｇ/ｍＬのビオチン化キネシンを第１および第２のソフトマテリアルとして順に積層し、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がすことでキネシンのマイクロアレイを作製した。そして、キネシンのスポット外のガラス基板表面は、５ｍｇ／ｍＬのカゼインでコーティングを行い、非特異的な吸着を抑制した。ここで、蛍光色素ＴＭＲを標識した微小管を投入すると、キネシンが固定化されているスポットにおいてのみ特異的に微小管が着地し、微小管のマイクロアレイが形成された（図５ａ）。
【００５２】
続いて、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を含む緩衝溶液を注入すると、キネシン上に着地した微小管の滑走運動が開始され、微小管がスポット外まで滑走すると、キネシンとの結合が無くなり、溶液中に浮遊して顕微鏡の焦点から外れて観察されなくなる現象が確認された（図５ｂ）。
【００５３】
図５から、本発明の製造工程で凍結乾燥処理を行って得られるソフトマテリアル（キネシン）は、微小管と結合する能力を保持し、しかもガラス基板上で微小管を滑走運動させる活性を有することを示している。
【００５４】
以上説明したように、本発明によるマイクロアレイ作製方法は、ＤＮＡやタンパク質に適用可能であることが分かる。ただし、本発明はＤＮＡやタンパク質に限定されず、ＲＮＡ（リボ核酸）や脂質、マイクロビーズなど、マイクロアレイ化が可能であれば、どんなソフトマテリアルであっても良い。
【００５５】
さらに、本発明の製造方法では、ソフトマテリアルを凍結乾燥する工程を有するが、これは本発明が凍結乾燥されにくいソフトマテリアルへの適用を除外するものではない。例えば脂質二分子膜カプセルであるリポソームや細胞など、ソフトマテリアルの中には、凍結乾燥に適さないものもあるが、これらの表面を一本鎖ＤＮＡやビオチン、抗体などで化学修飾することで、マイクロアレイを作製することも可能である。リポソームや細胞表面をＤＮＡ修飾する方法は例えば以下参考文献１、２に、ビオチン化修飾する方法は参考文献３に、抗体修飾する方法は参考文献４に各々開示されている。つまり、本発明によるマイクロアレイ作製方法にて、一本鎖ＤＮＡやタンパク質のマイクロアレイを予め形成しておけば、ＤＮＡの二本鎖形成反応、ビオチン−アビジン結合、抗原抗体結合などを利用して、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がした後でもリポソームや細胞を特異的にマイクロアレイ化することができる。
参考文献：
１ S. Hiyama, et al., "Biomolecular-motor-based autonomous delivery of lipid vesicles as nano- or microscale reactors on a chip," Lab on a Chip, vol.10, pp.2741-2748, 2010.
２ S. C. Hsiao, et al., "Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns," Langmuir, vol.25, pp.6985-6991, 2009.
３ D. Stamou, et al., "Self-assembled microarrays of attoliter molecular vessels," Angewandte Chemie International Edition, vol.42, pp.5580-5583, 2003.
４ A. Ito, et al., "Magnetite nanoparticle-loaded anti-HER2 immuno-liposomes for combination of antibody therapy with hyperthermia," Cancer Letters, vol.212, pp.167-175, 2004.
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の概念図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の手順詳細を示した図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の手順詳細を示した図である。
【図３】異なる塩基配列と蛍光色素を有する一本鎖ＤＮＡのマイクロアレイ作製結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【図４】凍結乾燥した一本鎖ＤＮＡの二本鎖形成能の検証結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【図５】凍結乾燥したモータータンパク質キネシンの活性の検証結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法に関する。特に本発明は、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを、同一基板上に作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療・診断の分野又は分子細胞生物学研究の分野において、タンパク質、DNA（デオキシリボ核酸）又は細胞などの解析、機能評価又はそれらの相互作用解析を、より定量的で再現性よく、かつ迅速に測定・観察する方法・装置が求められてきている。そのひとつの技術として、ガラスなどの基板上に、ソフトマテリアルのアレイを、マイクロメートルからナノメートルスケールで作製する様々な技術が提案されている。ここで「ソフトマテリアル」とは、生物由来又は非生物由来であってもよく、小さな分子が種々の形でつながった（又は集合した）高分子、ゲル、ゴム、コロイド、ミセル、液晶、及び種々の生体高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、タンパク質、糖質、糖タンパク等）を広く意味する。
【０００３】
係る技術の一つとして、ポリパラキシリレン樹脂（poly(para-xylylene)）をパターニングすることでステンシル（型抜き）とし、ソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する手法が注目を集めている。非特許文献１には、基板上に真空蒸着したポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成して、ステンシルとしてそのステンシル上にソフトマテリアルを注入して、その後ポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がして、基板上にソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する技術が開示されている（いわゆる「ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法」）。しかし非特許文献１には、基板上に１種類のソフトマテリアルを汎用的かつスケーラブルにマイクロアレイ化する技術は開示されているが、異なる複数種類のソフトマテリアルを、同一基板上にアレイ化する技術は開示されていない。
【０００４】
一方、ポリパラキシリレン樹脂を利用する技術であって、複数種類のソフトマテリアルを基板上にマイクロアレイ化する技術もいくつか知られている。
【０００５】
例えば、非特許文献２には、基板上に真空蒸着したポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上に複数種類のソフトマテリアルをインクジェットプリント式に吐出してポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がして、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。しかしこの技術では、ソフトマテリアルを吐出可能な高性能スポッターが追加専用機器として必要となるだけでなく、スポット間隔がスポッターの性能に依存するという問題がある。すなわちスポッターの性能に依存して、異なる種類のソフトマテリアル間のコンタミネーション（意図しない混合）を避けるためには異なる種類のソフトマテリアルをアレイ化するスポット間隔が制限されるという問題がある。
【０００６】
また、非特許文献３には、基板上に真空蒸着した２層のポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上にソフトマテリアルを注入して２層のポリパラキシリレン樹脂を基板から順々に１枚ずつ引き剥がすことで、異なる複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。しかしこの技術では、異なる種類のソフトマテリアル間でコンタミネーションが生じる可能性を排除できないという問題がある。
【０００７】
さらに、非特許文献４には、基板上に真空蒸着した１層のポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上に複数のマイクロ流路を形成し、流路毎に異なる種類のソフトマテリアルを注入してポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がすことで、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。この技術はコンタミネーションを生じる可能性は少ないが、マイクロアレイの各スポットにマイクロ流路を接続する方法であるため、異なる種類のソフトマテリアルをアレイ化するスポット間隔を望ましい大きさにできず、さらに大面積のアレイを作製することも難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】B. Ilic, et al., "Topographical Patterning of Chemically Sensitive Biological Materials Using a Polymer-Based Dry Lift Off," Biomedical Microdevices, vol.2, pp.317-322, 2000.
【非特許文献２】C. P. Tan, et al., "Nanoscale Resolution, Multicomponent Biomolecular Arrays Generated by Aligned Printing with Parylene Peel-Off," Nano Letters, vol.10, pp.719-725, 2010.
【非特許文献３】K. Kuribayashi, et al., "Sequential Parylene Lift-Off Process for Selective Patterning of Biological Materials," Proc. IEEE MEMS'07, pp.501-504, 2007.
【非特許文献４】K. Atsuta, et al., "A Parylene Lift-Off Process with Microfluidic Channels for Selective Protein Patterning," Journal of Micromechanics and Microengineering, vol.17, pp.496-500, 2007.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を用いてソフトマテリアルの小間隔のマイクロアレイを作製する方法であって、同一基板上に、複数種類のソフトマテリアルをコンタミネーションさせることなく、汎用的かつスケーラブルに、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法、を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記従来技術の問題点のない、複数種類のソフトマテリアルを同一基板上にマイクロアレイ化するための方法を鋭意追求した結果、(i)（例えば、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により得られた）基板上のソフトマテリアルを、（凍結乾燥などにより）変性させることなく脱水することにより、その基板に対して通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法が適用でき、さらに(ii)ソフトマテリアル上に堆積したポリパラキシリレン樹脂が、ソフトマテリアルの固定状態・構造・機能を損なうことなく、スムーズに基板から引き剥がすことができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、基板上に、第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、前記第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がして、前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する又は第２のソフトマテリアルを凍結乾燥することで、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法である。
【００１２】
さらに、本発明の方法を繰り返すことにより、望ましい種類の異なるソフトマテリアルのマイクロアレイが製造される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により、同一基板上に、複数種類のソフトマテリアルを、コンタミネーションさせることなく、汎用的かつスケーラブルに、スポッターを用いることなく、小さな間隔のマイクロアレイを作製することができる。また、本発明によるマイクロアレイ作製手順を繰り返すことで、２種類のソフトマテリアルに限らず、２種類以上のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製することができる。さらに、凍結乾燥させたソフトマテリアルを固定化したマイクロアレイ基板は、室温または低温で長期保存・配送することができ、使用者が当該基板を使用する際に緩衝溶液を導入するだけで容易に使用することができる。
【００１４】
以下、図面を参照して、本発明の良好な実施の形態を説明するが、本発明はこれらの実施態様に制限されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１は、本発明方法を概念的に示す図である。本発明に係る、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法は、いわゆる従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を利用するものであり、これまで知られているポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法又はその種々の応用方法を含む。本発明の方法は、通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法の条件、材料、装置、反応条件等について特に限定されることはない。
【００１６】
図１に示される通り、本発明の方法はまず、基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第１層目のポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、第１のマイクロアレイが形成された（固定化された）基板を得る工程を含む。係る工程は、従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を適用する工程であり、得られる基板は、その上に第１のマイクロアレイが形成された（固定化された）ものである。ここで本発明においては、パターン化された個々のマイクロアレイの形状、個々のソフトマテリアルの大きさ、及び個々のソフトマテリアル間の距離等（以下「形状等」とする）については、特に制限はなく、従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により設計可能な形状等にすることができる。通常、マイクロメータサイズ、又はナノメータサイズに設計することが容易である。
【００１７】
前記導入された第１のソフトマテリアルは通常、水溶液又は適当な溶液の形で基板上に固定されている。また、導入方法には特に制限はなく、第１のソフトマテリアルの水溶液又は適当な溶媒の溶液を基板の上に一部又は全体に導入して基板表面にソフトマテリアルを固定する。その後、固定されなかった余分のソフトマテリアルの水溶液等を洗い流すことができる。基板表面には特にソフトマテリアルとの結合を促進する修飾は必要ないが、場合により、ソフトマテリアルとの結合を強くする処理がなされていてもよい。
【００１８】
本発明の方法は続いて、前記得られた第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、凍結乾燥した第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板を得る工程を有するものである。本発明においては、基板に固定された第１のソフトマテリアルを凍結乾燥するものであるが、本発明においては「凍結乾燥」には広く「基板上のソフトマテリアルから、当該ソフトマテリアルの構造や機能が非可逆的に変性しないように水分を除去して乾燥する」ことを意味する。従って、冷却の有無、スクロースやトレハロースなどの凍結緩衝剤の有無、真空操作の有無等、凍結乾燥される基板上のソフトマテリアルにより適宜選択することができる。また「凍結乾燥」は、基板上のソフトマテリアルの全部又は一部、又は基板ごと行うことも可能である。
【００１９】
本発明の方法は続いて、前記得られた、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板を用いて、再び当該基板上に第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第２層目のポリパラキシリレン樹脂に第２のマイクロパターンを形成する。ここで第２層目のポリパラキシリレン樹脂蒸着は、基板上に固定され凍結乾燥された、第１のソフトマテリアルの表面も含めて蒸着させる。係る蒸着は、ポリパラキシリレン樹脂蒸着の通常の条件で可能であり、以下説明するが、しかも蒸着によっても第１のソフトマテリアルの表面のみならず内部についても変性等の損傷が見られない。これは基板上に固定された第１のソフトマテリアルが十分乾燥されていることによると考えられる。さらに、第２層目のポリパラキシリレン樹脂に第２のマイクロパターンを形成することも既に上で説明した通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法の条件がそのまま適用することができる。ここで第２層目のポリパラキシリレン樹脂に形成する第２のマイクロパターンは、基板の同一面に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを設けるものであるから、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所の基板上に形成される。
【００２０】
本発明の方法はさらに、得られた第２層目のポリパラキシリレン樹脂の第２のマイクロパターンに第２のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、基板上に第２のマイクロアレイを形成する（固定化する）。この工程は上の第１のソフトマテリアルを含む溶液の導入と同じ方法でよい。
【００２１】
ここで、第１及び第２の２種類の異なるソフトマテリアルによるマイクロアレイの製造を意図する場合、前記得られた第２のマイクロアレイが形成された（固定化された）基板から、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がすことにより、基板の同一面上に、第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイが製造できる。ここで、第１のソフトマテリアルは乾燥した状態であり、第２のソフトマテリアルは溶液（濡れた）の状態である。
必要に応じて、全体を再度凍結乾燥して第１及び第２のソフトマテリアルを乾燥した状態にするか、又は緩衝溶液等を注入して第１及び第２のソフトマテリアルを濡れた状態とすることができる。全体を凍結乾燥させることで、室温または低温で保存を行うことが可能となる。
【００２２】
図１には連続した矢印で示されているが、本発明は、上で説明した第１及び第２のソフトマテリアルによるマイクロアレイだけでなく、必要ならば、さらにこれを繰り返すこととで、３種類以上の異なるソフトマテリアルが同一基板表面に設けられたマイクロアレイが製造可能である。
【００２３】
また上で、第２層目のポリパラキシリレン樹脂蒸着の対象となるものとして、第１のソフトマテリアルが固定され凍結乾燥された基板で第１のポリパラキシリレン層を保持するものであると説明したが、本発明においてはこれに限定されない。
【００２４】
第１のソフトマテリアルを導入して基板に固定した後、第１のポリパラキシリレン層を引き剥がしたものを凍結乾燥したもの、及び第１のソフトマテリアルを導入して基板に固定した後、凍結乾燥し、その後第１のポリパラキシリレン層を引き剥がしたものも対象となる。
【００２５】
以下本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００２６】
[マイクロアレイの作製方法]
図２は実施例で行った作製方法の手順を詳細に示したものである。図２を参照しながら説明する。
【００２７】
まず、基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を真空蒸着する（図２ａ）。
【００２８】
ここで、基板はソフトマテリアルを固定可能とし、かつポリパラキシリレン蒸着条件に耐える材質であればよい。例えばガラス、シリコンやプラスチックなどが挙げられる。マイクロアレイを使用する際、測定等の目的で光透過性であることが好ましい場合、光透過性であるガラスが好ましい。また、基板の表面にソフトマテリアルを固定する方法は特に制限されないが、必要な場合、より強い固定を得るため、基板表面に、固定化を促進する処理を施すことも可能である。
【００２９】
また、蒸着するポリパラキシリレン樹脂の種類も特に限定されるものではないが、ここではパリレンＣ（日本パリレン合同会社）を例として説明を進める。他の種類のパリレンＮやパリレンＤ、パリレンＨＴも又は必要に応じて適宜選択することができる。（いずれも日本パリレン合同会社にて入手可能）。ポリパラキシリレン樹脂の蒸着厚さは特に限定されず、後の工程でソフトマテリアルが十分導入される構造を有するパターンが形成される厚さであればよい。具体的には、２μm以下であれば望ましい。ここでは、１μｍの厚さで蒸着することを例にして説明を進める。
【００３０】
次に、蒸着したポリパラキシリレン樹脂上に、フォトレジストを積層する（図２ｂ）。フォトレジストとして、ここではＳ１８１８（Shipley Far East Ltd.）を例として説明を進めるが、特にこれに限定されない。また積層方法についても特に限定はなく通常の例えばスピンコートによる方法が好ましい。
【００３１】
続いて、第１のマイクロパターンを描画したガラスフォトマスクを介して紫外線照射によるフォトリソグラフィを行い（図２ｃ）、さらにフォトレジストの現像を行う（図２ｄ）。現像液は、使用したフォトレジストとの組み合わせで選択することができ、例えばＳ１８１８をフォトレジストとした場合は、ＮＭＤ−３（東京応化工業株式会社から入手可能）を現像液として利用できる。
【００３２】
その後、酸素プラズマによるドライエッチングを行い、ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを描画する（図２ｅ）。ここでは、紫外線照射によるフォトリソグラフィや酸素プラズマによるドライエッチングを例として説明したが、これに限定されず、例えば電子線ビームによるリソグラフィであっても良い。
【００３３】
続いて、アセトンとイソプロピルアルコールを使って残存するフォトレジストを洗い流してガラス基板上に第１のマイクロパターンを形成させる（図２ｆ）。
【００３４】
続いて、第１のソフトマテリアルを導入するために、マイクロパターン化された第１層目のポリパラキシリレン樹脂上にフローセルを作製する（図２ｇ）。ここではフローセルは、例えばシリコンゴムシートをスペーサとして用い、カバーガラスで挟んで作製する。マイクロアレイを作製したい第１のソフトマテリアルを含む溶液をフローセル内に注入し、露出させたガラス基板表面上に第１のマイクロアレイを導入・形成する。ここでは、例として、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）修飾）を第１のソフトマテリアルとして順に積層するものとする。
【００３５】
第１のソフトマテリアル導入後、フローセル内の溶液を塩を含まない溶液、例えば超純水や蒸留水に置換する。これによりフローセルに残存する、又は基板上に固定されない遊離の第１のソフトマテリアルが完全に洗い流される。
【００３６】
その後、フローセルを含む基板を丸ごと（そのまま）凍結乾燥装置を用いて凍結乾燥を行う（図２ｈ）。さらに、第１のソフトマテリアルを含む溶液を完全に乾燥させた後、フローセルを解体する（図２ｈ'）。ここで、フローセルを解体してからフローセルを含まない基板丸ごと凍結乾燥を行っても良い。
【００３７】
続いて、凍結乾燥を行った基板上に、第２層目のポリパラキシリレン樹脂を第１層と同様の条件・手順で、例えば１μmの厚さで真空蒸着、積層し（図２ｉ）、次いでＳ１８１８などのフォトレジストをスピンコートして積層する（図２ｊ）。
【００３８】
ここで、フォトレジストのベイク条件は、凍結乾燥した第１のソフトマテリアルの性質（例えば熱感受性等）を考慮して、高温で短時間（例えば１００℃で１分間）としても良いし、低温で長時間（例えば３５℃で３時間）又はそれらを組み合わせる条件を選択できる。
【００３９】
その後、第２のマイクロパターンを描画したガラスフォトマスクを介して紫外線照射によるフォトリソグラフィを行い（図２ｋ）、ＮＭＤ−３を使ってフォトレジストの現像を行う（図２ｌ）。
【００４０】
その後、酸素プラズマによるドライエッチングを行い、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に描画する（図２ｍ）。第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させるドライエッチング条件は特に限定はなく、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂の厚さに応じて、例えばエッチング時間を調節することで容易に選択することができる。
【００４１】
アセトンとイソプロピルアルコールを使って残存するフォトレジストを洗い流すことで、ガラス基板表面に第２のマイクロパターンが形成される（図２ｎ）。
【００４２】
次に第１層目と同様の条件で、マイクロパターン化された第２層目のポリパラキシリレン樹脂上にフローセルを作製する（図２ｏ）。
【００４３】
そして、マイクロアレイを作製したい第２のソフトマテリアルを含む溶液をフローセル内に注入し、露出させたガラス基板表面上に第２のマイクロアレイを形成する。ここでは、例として、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）修飾）を第２のソフトマテリアルとして順に積層するものとする。ここで、第１のソフトマテリアルのパターニングを行った場所は、第２層目のポリパラキシリレン樹脂によって覆われているため、第１のソフトマテリアルと第２のソフトマテリアルとのコンタミネーションは完全に阻止される。その後、フローセルを解体する（図２ｏ'）。
【００４４】
さらに、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がす（図２ｐ）。第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂は、例えばピンセット等で一部分を引き剥がすことで同時に容易に引き剥がされる。
【００４５】
最後に基板上にフローセルを作製し（図２ｑ）、緩衝溶液を注入することで凍結乾燥された第１のソフトマテリアルが再溶解し、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイが作製される。
[作製したマイクロアレイの評価]
図３は、上記手順にて作製されたマイクロアレイの蛍光顕微鏡観察結果の例を示す。図３から次のことが明らかである。（ｉ）まず、ガラス基板上に2種類の異なるソフトマテリアルが、以下の種々の処理に対しても十分な程度に固定されていること。(ii)さらに、2種類の異なるソフトマテリアル（それぞれ複数のタンパク質の機能を組み合わせて構築された標識化タンパク質）が変性を受けずに機能を発揮すること。（ｉｉｉ）2種類の異なるソフトマテリアルのコンタミネーションがないこと。すなわち、第１のソフトマテリアルとしてのＦＩＴＣ修飾一本鎖ＤＮＡと、第２のソフトマテリアルとしてのＴＭＲ修飾一本鎖ＤＮＡとが、コンタミネーションすることなく同一基板上にマイクロアレイ化されていることが分かる。（ｉｖ）アレイ化がマイクロスケールであり、かつアレイを形成するスポット間の間隔が十分明確に分離されている。
【００４６】
ただし今回の図３の例では、マイクロメートルスケールでのアレイ化の条件・装置を用いてマイクロメートルスケールでのアレイ化を目的としたものを示したが、必要ならば通常のナノメートルスケールでのアレイ化を目的とする条件・装置、例えば電子線ビームによるリソグラフィなどを行えば、ナノメートルスケールでのアレイ化も可能である。
【００４７】
図４は、本発明によるマイクロアレイ化された一本鎖ＤＮＡ（ソフトマテリアル）が、二本鎖形成能を保持しているかを検証する実験を行った結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【００４８】
この実験では、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ修飾、塩基配列Ａ）を第１のソフトマテリアルとして順に積層しており、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ修飾、塩基配列Ｂ）を第２のソフトマテリアルとして順に積層している。そのマイクロアレイ作製結果はＦＩＴＣの蛍光フィルタを通じて観察され（図４ａ）、ＴＭＲの蛍光フィルタを通じては観察されないことを確認した（図４ｂ）。
【００４９】
図４から、凍結乾燥の過程を経る本発明の方法によるマイクロアレイ化された一本鎖ＤＮＡは、その二本鎖形成能が保持されていることを確認され、変性等を受けていないことが分かる。すなわち、凍結乾燥の過程を経た塩基配列Ａの一本鎖ＤＮＡの相補鎖（５μＭのコレステロール修飾一本鎖ＤＮＡ、２３塩基長、蛍光色素ＴＭＲ修飾、塩基配列?）を注入すると、塩基配列Ａの一本鎖ＤＮＡが固定化されているスポットにのみ特異的に相補鎖が結合し（図４ｃ）、凍結乾燥の過程を経た一本鎖ＤＮＡの二本鎖形成能が保持されていることを確認した。
【００５０】
図５は、本発明によるマイクロアレイ化されたタンパク質が、その機能性を保持しているか検証実験を行った結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【００５１】
ここでは、機能性タンパク質の例として、モータータンパク質であるキネシンを用いた。すなわち、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、５ｍｇ／ｍＬのカゼイン、蛍光色素ＴＭＲを標識した１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、１００μｇ/ｍＬのビオチン化キネシンを第１および第２のソフトマテリアルとして順に積層し、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がすことでキネシンのマイクロアレイを作製した。そして、キネシンのスポット外のガラス基板表面は、５ｍｇ／ｍＬのカゼインでコーティングを行い、非特異的な吸着を抑制した。ここで、蛍光色素ＴＭＲを標識した微小管を投入すると、キネシンが固定化されているスポットにおいてのみ特異的に微小管が着地し、微小管のマイクロアレイが形成された（図５ａ）。
【００５２】
続いて、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を含む緩衝溶液を注入すると、キネシン上に着地した微小管の滑走運動が開始され、微小管がスポット外まで滑走すると、キネシンとの結合が無くなり、溶液中に浮遊して顕微鏡の焦点から外れて観察されなくなる現象が確認された（図５ｂ）。
【００５３】
図５から、本発明の製造工程で凍結乾燥処理を行って得られるソフトマテリアル（キネシン）は、微小管と結合する能力を保持し、しかもガラス基板上で微小管を滑走運動させる活性を有することを示している。
【００５４】
以上説明したように、本発明によるマイクロアレイ作製方法は、ＤＮＡやタンパク質に適用可能であることが分かる。ただし、本発明はＤＮＡやタンパク質に限定されず、ＲＮＡ（リボ核酸）や脂質、マイクロビーズなど、マイクロアレイ化が可能であれば、どんなソフトマテリアルであっても良い。
【００５５】
さらに、本発明の製造方法では、ソフトマテリアルを凍結乾燥する工程を有するが、これは本発明が凍結乾燥されにくいソフトマテリアルへの適用を除外するものではない。例えば脂質二分子膜カプセルであるリポソームや細胞など、ソフトマテリアルの中には、凍結乾燥に適さないものもあるが、これらの表面を一本鎖ＤＮＡやビオチン、抗体などで化学修飾することで、マイクロアレイを作製することも可能である。リポソームや細胞表面をＤＮＡ修飾する方法は例えば以下参考文献１、２に、ビオチン化修飾する方法は参考文献３に、抗体修飾する方法は参考文献４に各々開示されている。つまり、本発明によるマイクロアレイ作製方法にて、一本鎖ＤＮＡやタンパク質のマイクロアレイを予め形成しておけば、ＤＮＡの二本鎖形成反応、ビオチン−アビジン結合、抗原抗体結合などを利用して、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がした後でもリポソームや細胞を特異的にマイクロアレイ化することができる。
参考文献：
１ S. Hiyama, et al., "Biomolecular-motor-based autonomous delivery of lipid vesicles as nano- or microscale reactors on a chip," Lab on a Chip, vol.10, pp.2741-2748, 2010.
２ S. C. Hsiao, et al., "Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns," Langmuir, vol.25, pp.6985-6991, 2009.
３ D. Stamou, et al., "Self-assembled microarrays of attoliter molecular vessels," Angewandte Chemie International Edition, vol.42, pp.5580-5583, 2003.
４ A. Ito, et al., "Magnetite nanoparticle-loaded anti-HER2 immuno-liposomes for combination of antibody therapy with hyperthermia," Cancer Letters, vol.212, pp.167-175, 2004.
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の概念図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の手順詳細を示した図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の手順詳細を示した図である。
【図３】異なる塩基配列と蛍光色素を有する一本鎖ＤＮＡのマイクロアレイ作製結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【図４】凍結乾燥した一本鎖ＤＮＡの二本鎖形成能の検証結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【図５】凍結乾燥したモータータンパク質キネシンの活性の検証結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
基板上に、
第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
前記第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、
第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がして、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項２】
複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
基板上に、
第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
前記第１のマイクロアレイを形成した基板から、前記第１層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がし、
第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂に、第１のマイクロパターンとは異なる場所に第２のマイクロパターンを形成し、
第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項３】
複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
基板上に、
第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１のマイクロアレイを形成した基板から、前記第１層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がし、
前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂に、第１のマイクロパターンとは異なる場所に第２のマイクロパターンを形成し、
第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法であってさらに、
前記第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に、第３層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して、第３のマイクロパターンを形成し、第３のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、前記第３層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、同一基板上に第１、第２及び第３のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１、第２及び第３のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝液を導入して前記第１及第２のソフトマテリアを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法であって、最後のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、前記基板表面上に最後のマイクロアレイを形成した後、使用まで室温又は低温で保存するために、全てのマイクロアレイを形成した基板ごと凍結乾燥する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項１】
複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
基板上に、
第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
前記第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、
第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がして、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項２】
複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
基板上に、
第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
前記第１のマイクロアレイを形成した基板から、前記第１層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がし、
第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂に、第１のマイクロパターンとは異なる場所に第２のマイクロパターンを形成し、
第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項３】
複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
基板上に、
第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１のマイクロアレイを形成した基板から、前記第１層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がし、
前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂に、第１のマイクロパターンとは異なる場所に第２のマイクロパターンを形成し、
第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法であってさらに、
前記第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に、第３層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して、第３のマイクロパターンを形成し、第３のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、前記第３層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、同一基板上に第１、第２及び第３のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１、第２及び第３のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝液を導入して前記第１及第２のソフトマテリアを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法であって、最後のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、前記基板表面上に最後のマイクロアレイを形成した後、使用まで室温又は低温で保存するために、全てのマイクロアレイを形成した基板ごと凍結乾燥する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２０２９６８（Ｐ２０１２−２０２９６８Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７０９３４（Ｐ２０１１−７０９３４）
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（３９２０２６６９３）株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモ (5,876)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（３９２０２６６９３）株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモ (5,876)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]