タテジマフジツボ幼生の着生を誘起するタンパク質
【課題】タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起することのできるタンパク質、及び当該タンパク質を用いたタテジマフジツボ幼生用誘引剤、更にはタテジマフジツボ幼生の誘引方法を提供する。
【解決手段】タテジマフジツボの成体の抽出物から得らる、特定な配列からなるアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質。当該タンパク質は海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示した。
【解決手段】タテジマフジツボの成体の抽出物から得らる、特定な配列からなるアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質。当該タンパク質は海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起するタンパク質に関する。さらに詳述すると、本発明は、タテジマフジツボの付着期幼生の着生を誘起するフェロモン様タンパク質と、このタンパク質を利用したタテジマフジツボ幼生用誘引剤、誘引基材及び誘引方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フジツボは、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へ付着することにより損害を引き起こす代表的な汚損生物である。例えば、火力・原子力発電所の冷却水路系にフジツボが付着すると、冷却水の流量が流動抵抗の増大により低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボが付着したり、剥がれたフジツボが詰まることにより管壁が腐食される。そこで、各発電所では、付着したフジツボを機械的に除去したり、フジツボの付着を抑制するための様々な防除対策を実施している。例えば、防汚塗料を冷却水路系や復水器管等に塗布したり、あるいは塩素を注入することによって、フジツボ幼生の付着の抑制が図られている（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、防汚塗料や塩素を使用する方法では、フジツボ幼生の付着を十分に防ぐことができてないのが現状である。しかも、防汚塗料や塩素の使用は、環境に対し悪影響を及ぼす虞がある。
【０００４】
そこで、フジツボ類の着生に影響を与えている要因の一つである着生誘起フェロモンを利用することによって、環境に悪影響を及ぼすことなく、フジツボ類の付着を防止する技術が提案されている（非特許文献２）。この付着防止技術は、基盤等に吸着することによってタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する、７６，８８および９９ｋＤａのサブユニットからなる糖鎖結合型タンパク質複合体（以下、ＳＩＰＣと呼ぶ）を利用することによってタテジマフジツボ幼生の付着を制御するものである。
【０００５】
ＳＩＰＣを表面に吸着させた基盤等を海水中に配置することによって、この基盤の表面近傍でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起し、基盤の表面に付着させることができる。したがって、タテジマフジツボ幼生の着生域を変更させて、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へのタテジマフジツボ幼生の付着を抑えることができる。
【非特許文献１】坂口 勇(2003). 発電所の汚損生物対策技術の展望. Sessile Organisms 20(1), 15-19.
【非特許文献２】K.Matsumura, M.Nagano and N.Fusetani(1998). Purification of a larval settlement-inducing protein complex(SIPC) of the barnacle, Balanus amphitrite. J. Exp. Zool.,281,12-20.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＩＰＣは、基盤等に吸着した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示すことから、ＳＩＰＣは基盤に吸着させて用いることが必須条件となる。したがって、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起し得る範囲は基盤表面の近傍に制限される。
【０００７】
しかしながら、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起し得る範囲が基盤表面の近傍に制限されると、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生の着生を十分に誘起できない問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起することのできるタンパク質を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の位置に誘引することのできる誘引剤、誘引基材及び誘引方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するため、本願発明者が鋭意研究を行ったところ、タテジマフジツボ成体の抽出物に含まれている複数のタンパク質のうち、ある特定のアミノ酸配列と分子量とを有するタンパク質が、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示すことを知見した。また、このタンパク質の濃度勾配を海水中に形成した際のタテジマフジツボ幼生の挙動について調べたところ、この濃度勾配の高濃度側にタテジマフジツボ幼生を誘引できることを知見した。これらの知見に基づき、本発明に至った。
【００１１】
かかる知見に基づく請求項１記載のタンパク質は、タテジマフジツボ（Bａｌａｎｕｓ ａｍｐｈｉｔｒｉｔｅ）の成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質である。
【００１２】
このタンパク質は、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を有する新規タンパク質である。
【００１３】
請求項２記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤は、請求項１記載のタンパク質が基盤表面または担体に担持されているものである。また、請求項３記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤は、請求項１記載のタンパク質が固形状に成形されているものである。
【００１４】
請求項２及び３記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤によると、誘引剤を海水中に配置したときに、誘引剤からタンパク質が徐々に溶出して広範囲に拡散し、タテジマフジツボ幼生の着生が広範囲に誘起される。また、誘引剤からタンパク質が徐々に溶出することによって、誘引剤と中心としたタンパク質の濃度勾配が形成され、誘引剤の周辺にタテジマフジツボ幼生が誘引される。
【００１５】
請求項４記載のタテジマフジツボ幼生用誘引基材は、請求項１記載のタンパク質が基材表面に付着されているものである。
【００１６】
請求項４記載のタテジマフジツボ幼生用誘引基材によると、誘引基材を海水中に配置したときに、誘引基材の表面からタンパク質が徐々に溶出して広範囲に拡散し、タテジマフジツボ幼生の着生が広範囲に誘起される。また、誘引剤からタンパク質が徐々に溶出することによって、誘引基材を中心としたタンパク質の濃度勾配が形成され、誘引基材にタテジマフジツボ幼生が誘引される。
【００１７】
請求項５記載のタテジマフジツボ幼生の誘引方法は、請求項１記載のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給し、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配を形成するようにしている。したがって、海水中の広範囲にタンパク質が拡散してタテジマフジツボ幼生の着生が広範囲に誘起され、タンパク質濃度が高濃度の誘引対象領域にタテジマフジツボ幼生が誘引される。
【発明の効果】
【００１８】
請求項１記載のタンパク質によれば、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示すので、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起することが可能となる。
【００１９】
請求項２及び３記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤によれば、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起して、誘引剤の周辺に誘引することができる。したがって、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の位置に誘引することが可能となる。
【００２０】
請求項４記載のタテジマフジツボ幼生用誘引基材によれば、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起して、誘引基材に誘引することができる。したがって、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の位置に誘引することが可能となる。
【００２１】
請求項５記載のタテジマフジツボ幼生の誘引方法によれば、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配を形成するようにしているので、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起して、誘引対象領域に誘引することができる。したがって、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の誘引対象領域に誘引することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２３】
本発明のタンパク質は、タテジマフジツボ成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質である。
【００２４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有しているタンパク質と一致ないしは類似するタンパク質は、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪタンパク質データベース上には存在しない。このことから、本発明のタンパク質は新規タンパク質である。
【００２５】
また、本発明のタンパク質の分子量は３２ｋＤａであり、非特許文献２において開示されている糖鎖結合型タンパク質複合体のサブユニット（分子量７６，８８及び９８ｋＤａのタンパク質）とは、その分子量を異にしている。尚、３２ｋＤａという分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量を意味している。
【００２６】
本発明のタンパク質は、タテジマフジツボ成体抽出物をタンパク質濃縮処理した後、カラムクロマトグラフィーを利用してタンパク質精製を行うことで得られる。
【００２７】
タテジマフジツボ成体抽出物は、タテジマフジツボ成体の全組織をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中でホモジナイズした後、遠心分離により上清を回収することにより得られる。このタテジマフジツボ成体抽出物には、本発明のタンパク質を含む複数のタンパク質が混在している。
【００２８】
タンパク質濃縮は、例えば硫酸アンモニウムを用いた塩析処理により行うことができる。
【００２９】
カラムクロマトグラフィーは、ゲルろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの順で行う。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液にはＮａＣｌ溶液を用いればよい。また、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの溶出液にはＫＨ２ＰＯ４溶液を用いればよい。
【００３０】
ゲルろ過に用いるゲル粒子としては、例えば東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｆを用いることができるが、これに限定されるものではなく、このゲル粒子と同一または類似の性質・機能を有するものを用いることができる。
【００３１】
陰イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍを用いることができるが、これに限定されるものではなく、このカラムと同一または類似の性質・機能を有するものを用いることができる。
【００３２】
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えばバイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製のＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｐａｔｉｔｅ，ＴｙｐｅＩＩ，４０μｍを用いることができるが、これに限定されるものではなく、このカラムと同一または類似の性質・機能を有するものを用いることができる。
【００３３】
図１〜図３に各カラムクロマトグラフィーからのタンパク質溶出パターンと本発明のタンパク質を含むフラクション（図中の斜線領域）を示す。カラムクロマトグラフィー操作によって、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質を単離することができる。
【００３４】
本発明のタンパク質は、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示す、タテジマフジツボ幼生に対する拡散性の着生誘起フェロモン様タンパク質である。したがって、非特許文献２において開示されている糖鎖結合型タンパク質複合体ＳＩＰＣのように、基盤等に吸着させて用いる必要がなく、海水中に分散させることによって、海水中の広範囲にタンパク質を拡散させ、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起することができる。
【００３５】
ここで、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起する本発明のタンパク質の濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍＬであるが、１．０μｇ／ｍＬ以上とすることが好ましい。０．１μｇ／ｍＬ未満とすると、タテジマフジツボ幼生の着生を十分に誘起できない。１．０μｇ／ｍＬ以上とすることで、約７０％以上のタテジマフジツボ幼生の着生を誘起することができる。タンパク質濃度の上限値については、特に限定されないが、１０μｇ／ｍＬで８０％程度のタテジマフジツボ幼生の着生を誘起することができることが確認されたことから、１．０μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬとすることで、タテジマフジツボ幼生の着生を十分に誘起することができ、好ましい。
【００３６】
また、本発明のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給し、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配を形成することによって、誘引対象領域にタテジマフジツボ幼生を誘引することができる。
【００３７】
本発明のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給することによって、誘引対象領域からタンパク質が海水中に拡散し、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配が形成される。つまり、誘引対象領域を高濃度側とし、誘引対象領域から離れるに従ってタンパク質濃度が低下する濃度勾配が形成される。したがって、海水中の広範囲に拡散されたタンパク質によってタテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起し、タンパク質の濃度勾配の高濃度側である誘引対象領域に誘引することができる。この作用を利用することによって、タテジマフジツボ幼生を、海水中の広い範囲から所望の位置に誘引することができる。誘引したタテジマフジツボ幼生は、誘引対象領域にタテジマフジツボ幼生が着生し得る基盤や網などの着生用部材を配置し、これに付着させて捕捉することができる。
【００３８】
本発明のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給する方法としては、例えば、本発明のタンパク質の水溶液を送液ポンプを用いて誘引対象領域に送液する方法や、本発明のタンパク質を透過させ得る孔径の限外濾過膜等を備える密閉容器の中に本発明のタンパク質の水溶液を収容し、限外濾過膜から徐々にタンパク質を通過させて供給する方法が挙げられる。
【００３９】
また、本発明のタンパク質を担体に担持させて誘引剤とし、この誘引剤を誘引対象領域に配置するようにしてもよい。
【００４０】
担体としては、本発明のタンパク質を担持でき、本発明のタンパク質の海水中への溶出を阻害することがなく、且つタテジマフジツボ幼生の着生の誘起を阻害することのないものを用いることができる。例えば、アガロース、コラーゲン、フィブリン、アルブミン、カゼイン、セルロースファイバー、セルローストリアセタート、寒天、アルギン酸カルシウム、カラギーナン等の天然高分子や、ポリアクリルアミド、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリル酸、ポリビニルクロリド、γ−メチルポリグルタミン酸、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、ポリジメチルアクリルアミド、ポリウレタン、光硬化性樹脂（ポリビニルアルコール誘導体、ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリブタジエン誘導体等）等の合成高分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
また、本発明のタンパク質を固形状に成形して誘引剤とし、この誘引剤を誘引対象領域に配置するようにしてもよい。
【００４２】
固形状の誘引剤は、例えば、本発明のタンパク質をバインダー材料等と混合して加圧成形することにより得ることができるが、固形状の誘引剤の製造方法はこの方法に限定されるものではない。
【００４３】
また、本発明のタンパク質を基材の表面に付着させて誘引基材とし、この誘引基材を誘引対象領域に配置するようにしてもよい。この場合、基材の材質がタテジマフジツボ幼生を着生し得る材質であれば、誘引対象領域に着生用部材を配置しなくても、誘引基材自体にタテジマフジツボ幼生を捕捉できる。
【００４４】
基材としては、本発明のタンパク質に対し、ある程度の吸着性と溶出性を有するもの、即ち、本発明のタンパク質を一定時間その表面に保持し、誘引対象領域に配置することにより表面に保持されている本発明のタンパク質が徐々に溶出される基材を用いればよい。具体的には、コンクリート、スレート等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
このように、タテジマフジツボ幼生を所望の誘引対象領域に誘引することによって、タテジマフジツボ幼生の着生域を変更させることができ、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へのタテジマフジツボ幼生の付着を抑えることができる。また、本発明は、タテジマフジツボを積極的に捕獲することを目的として用いることもできる。この際、例えば、タテジマフジツボ幼生を基材に付着させ、基材のみを溶解させることで、タテジマフジツボ幼生を基材から剥がす手間を省くことができる。また、タテジマフジツボ幼生を基材に付着させ、成体まで成長させた後に、基材を溶解して成体を得るようにしてもよい。つまり、本発明を利用してタテジマフジツボ幼生を基材に付着させることで、タテジマフジツボを所望の成長段階で得ることができる。これにより、タテジマフジツボの産業上の要請、例えば、養殖海産魚への餌料等の原料としての供給が容易になる。
【００４６】
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、誘引対象領域に配置する着生用基材の表面に、基盤等に吸着することによってタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する、７６，８８および９９ｋＤａのサブユニットからなる糖鎖結合型タンパク質複合体ＳＩＰＣ（非特許文献２参照）を吸着させるようにしてもよい。この場合には、誘引対象領域に誘引されたタテジマフジツボ幼生を、着生用基材によってさらに誘引することができ、タテジマフジツボ幼生を効果的に誘引・捕捉することが可能となる。
【００４７】
また、本発明のタテジマフジツボ幼生の誘引方法を、付着時期の予測技術に利用するようにしてもよい。例えば、本発明のタテジマフジツボ幼生の誘引方法を利用して特定海域で誘引されるタテジマフジツボ幼生の個体数変動の経時変化をモニタリングし、個体数変動の経時変化と海洋構築物等への付着時期との関係を示すデータを蓄積することによって、付着時期の予測を行うことができる。
【００４８】
また、本発明のタンパク質は、タテジマフジツボ幼生の着生を特異的に誘起する機能を示すことから、形態分類学上の差異のみを頼りに種判定を行うことが極めて困難であるフジツボ幼生の種判定技術にも利用することができる。
【実施例】
【００４９】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
（１．タンパク質の精製）
タテジマフジツボ成体の全組織に対し、１．５倍量（ｗ／ｖ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ, ｐＨ７．５）を加えてホモジナイズした後、遠心分離により上清を回収した。次に、回収した上清に硫酸アンモニウム溶液（７０重量％）を加えて塩析し、回収した上清のタンパク質を濃縮させた。
【００５１】
次に、カラムクロマトグラフィーを用いて、タンパク質の精製を行い、分子量３２ｋＤａのタンパク質を得た。カラムクロマトグラフィーは、以下に示す（Ａ）〜（Ｃ）の順で行った。
（Ａ）ゲルろ過
（Ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィー
（Ｃ）ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
【００５２】
ゲルろ過は、ゲル粒子として東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｆを用いて行った。ゲルろ過におけるタンパク質溶出パターンを図１に示す。斜線で示した領域（３３ｍＬ〜６３ｍＬ）のタンパク質溶出液をフラクションとして分取した。
【００５３】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、カラムとして東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍを用い、溶出液としてＮａＣｌ溶液を用いて行った。陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを図２に示す。斜線で示した領域（１６０ｍＬ〜１８５ｍＬ）のタンパク質溶出液をフラクションとして分取した。尚、図２における破線は、溶出液として用いたＮａＣｌ溶液の濃度（右縦軸，単位ｍＭ）の勾配を表している。
【００５４】
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーは、カラムとしてバイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製のＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｐａｔｉｔｅ，ＴｙｐｅＩＩ，４０μｍを用い、溶出液としてＫＨ２ＰＯ４溶液を用いて行った。ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを図３に示す。斜線で示した領域（１２０ｍＬ〜１４５ｍＬ）のタンパク質溶出液をフラクションとして分取した。尚、図３における破線は、溶出液として用いたＫＨ２ＰＯ４溶液の濃度（右縦軸，単位ｍＭ）の勾配を表している。
【００５５】
上記カラムクロマトグラフィーにより精製したタンパク質の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した結果を図４に示す。図４において、左側の電気泳動結果は分子量マーカーを示し、右側の電気泳動結果は上記カラムクロマトグラフィーにより精製したタンパク質を示している。この測定結果から、精製したタンパク質の分子量が約３２ｋＤａであることが確認された。また、他の分子量のタンパク質は検出されなかった。このことから、上記カラムクロマトグラフィーを用いることにより、３２ｋＤａのタンパク質を高純度に精製できることが明らかとなった。
【００５６】
（２．着生誘起活性の確認）
上記方法で精製された３２ｋＤａのタンパク質（以下、単に精製タンパク質と呼ぶこともある。）のタテジマフジツボ幼生に対する着生誘起活性を確認する試験を実施した。
【００５７】
ポリスチレン製の２４穴プレートを用意し、以下の（Ａ）の条件の滅菌海水を２４穴のうちの６穴に１ｍＬずつ収容し、以下の（Ｂ）の条件の滅菌海水を別の６穴に１ｍＬずつ収容し、以下の（Ｃ）の条件の滅菌海水をさらに別の６穴に１ｍＬずつ収容し、以下の（Ｄ）の条件の滅菌海水を残りの６穴に１ｍＬずつ収容した。
（Ａ）精製タンパク質が含まれていない滅菌海水
（Ｂ）精製タンパク質濃度が０．１μｇ／ｍＬの滅菌海水
（Ｃ）精製タンパク質濃度が１．０μｇ／ｍＬの滅菌海水
（Ｄ）精製タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬの滅菌海水
【００５８】
各穴には、タテジマフジツボのキプリス幼生を７〜１０個体収容し、遮光した状態で且つ２５℃で静置した。そして、３時間経過後のキプリス幼生の状態を実体顕微鏡で観察し、各穴のプレート壁に付着した個体数とをカウントした。付着率は、以下に示す数式１により計算した。
［数式１］付着率（％）＝付着個体数／全個体数×１００
【００５９】
この試験を３回実施し、付着率の平均値を求めた。
【００６０】
試験結果を図５に示す。図５は、上記（Ａ）〜（Ｄ）の条件の滅菌海水に対するタテジマフジツボのキプリス幼生の付着率を示しており、付着率が高い程、精製タンパク質がキプリス幼生の着生誘起活性が高いことを意味している。この結果から、精製タンパク質濃度が０．１μｇ／ｍＬの滅菌海水を用いた場合には、精製タンパク質が含まれていない滅菌海水を用いた場合よりも若干付着率が増加する程度であったが、精製タンパク質濃度が１．０μｇ／ｍＬの滅菌海水を用いた場合には、精製タンパク質が含まれていない滅菌海水を用いた場合よりも付着率が３倍以上向上することが明らかとなった。さらに、精製タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬの滅菌海水を用いた場合には、精製タンパク質が含まれていない滅菌海水を用いた場合よりも付着率が４倍程度向上することが明らかとなった。
【００６１】
以上の結果から、本実施例で得られた精製タンパク質が、タテジマフジツボの付着期幼生であるキプリス幼生に対し、海水に溶解することによって着生誘起活性を示すことが明らかとなった。
【００６２】
そして、海水の精製タンパク質濃度を０．１μｇ／ｍＬ以上とすることでキプリス幼生の着生を誘起する効果が得られることが明らかとなった。この効果は、海水の精製タンパク質濃度を１．０μｇ／ｍＬとすることで大幅に向上し、１０μｇ／ｍＬとすることでさらに向上することが明らかとなった。
【００６３】
また、精製タンパク質を９０℃で１０分間加熱した後に同様の実験を行ったところ、精製タンパク質を加熱しない場合と同様の結果が得られることが確認された。このことから、このタンパク質は、加熱処理による失活（タンパク質変性）を起こすことがなく、使用環境温度による失活がほとんど起こらないことが明らかとなった。したがって、このタンパク質を実際に使用する環境の温度を気にすることなく使用することが可能であることがわかった。また、このタンパク質の耐熱性を利用して、このタンパク質の精製過程の単純化、即ち他のタンパク質を熱失活させることによって、このタンパク質を高純度に精製できる可能性が示唆された。
【００６４】
（３．精製タンパク質による誘引効果の確認）
精製タンパク質によるタテジマフジツボ幼生の誘引効果を検証した。
【００６５】
試験方法の概念図を図６に示す。直径１２ｃｍのガラスシャーレ（符号ａ）に滅菌海水（符号ｂ）を１００ｍＬとタテジマフジツボのキプリス幼生４３個体を収容した。そして、１％アガロース１ｍＬを円柱状に成形したアガロースゲルを２個（符号ｃ）と、１％アガロース１ｍＬに１０μｇの精製タンパク質を混合して円柱状に成形した精製タンパク質含有アガロースゲルを１個（符号ｄ）を準備し、これらのアガロースゲルをガラスシャーレの円周よりも若干内側に等間隔で配置した。
【００６６】
ガラスシャーレは遮光した状態で且つ２５℃で２４時間静置した後、ガラスシャーレ壁に付着しているキプリス幼生の個体数をカウントした。結果を図７に示す。図７において、アガロースゲル（符号ｃ及びｄ）以外の●が、キプリス幼生のガラスシャーレ壁への付着位置を示している。
【００６７】
ガラスシャーレ壁に付着したキプリス幼生は、４３個体のうち２７個体であった。また、付着個体のうちの８５％が精製タンパク質含有アガロースゲルｄを配置した近傍の領域に付着していることが確認された。
【００６８】
精製タンパク質含有アガロースゲルｄからは、精製タンパク質が徐々に溶出して滅菌海水中に広範囲に拡散し、このゲルを中心としたタンパク質の濃度勾配が形成される。即ち、この濃度勾配は、ゲル周辺を高濃度側として、ゲルから離れるに従ってタンパク質濃度が低下している。本実施例では、付着個体のうちの８５％がこのゲルを配置した近傍の領域に付着していたことから、広範囲に拡散した精製タンパク質の作用によってキプリス幼生の着生を広範囲に誘起し、精製タンパク質の濃度勾配の高濃度側の領域にタテジマフジツボ幼生を誘引できることが明らかとなった。
【００６９】
（４．アミノ酸配列の特定）
本実施例で得られた精製タンパク質について、Ｎ末端部分のアミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列は、精製タンパク質を還元ピリジルエチル化した後、株式会社島津製作所製のプロテインシーケンサＰＰＳＱ２１を用いたエドマン反応法により解析した。
【００７０】
その結果、Ｎ末端側の３３残基のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列であることが確認された。尚、一文字略号を用いた場合、このアミノ酸配列は以下のように表される。
（Ｈ）−ＥＰＱＰＧＶＰＳＴＰＱＬＡＧＶＬＴＮＬＹＲＲＦＬＨＴＶＡＰＫＱＬＮ
【００７１】
このアミノ酸配列について、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪタンパク質データベース上で検索したところ、一致ないしは類似する配列は存在しなかった。このことから、本実施例で得られた精製タンパク質は、配列未知の新規タンパク質であると考えられた。
【００７２】
以上の結果から、本実施例で得られた精製タンパク質、即ち、タテジマフジツボ成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質は、配列未知の新規タンパク質であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ゲルろ過におけるタンパク質溶出パターンを示す図である。
【図２】陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを示す図である。
【図３】ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを示す図である。
【図４】本発明のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した際の結果を示す図である。
【図５】着生誘起活性確認試験の結果を示す図である。
【図６】誘引効果確認試験の方法の概念を示す図ある。
【図７】誘引効果確認試験の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起するタンパク質に関する。さらに詳述すると、本発明は、タテジマフジツボの付着期幼生の着生を誘起するフェロモン様タンパク質と、このタンパク質を利用したタテジマフジツボ幼生用誘引剤、誘引基材及び誘引方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フジツボは、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へ付着することにより損害を引き起こす代表的な汚損生物である。例えば、火力・原子力発電所の冷却水路系にフジツボが付着すると、冷却水の流量が流動抵抗の増大により低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボが付着したり、剥がれたフジツボが詰まることにより管壁が腐食される。そこで、各発電所では、付着したフジツボを機械的に除去したり、フジツボの付着を抑制するための様々な防除対策を実施している。例えば、防汚塗料を冷却水路系や復水器管等に塗布したり、あるいは塩素を注入することによって、フジツボ幼生の付着の抑制が図られている（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、防汚塗料や塩素を使用する方法では、フジツボ幼生の付着を十分に防ぐことができてないのが現状である。しかも、防汚塗料や塩素の使用は、環境に対し悪影響を及ぼす虞がある。
【０００４】
そこで、フジツボ類の着生に影響を与えている要因の一つである着生誘起フェロモンを利用することによって、環境に悪影響を及ぼすことなく、フジツボ類の付着を防止する技術が提案されている（非特許文献２）。この付着防止技術は、基盤等に吸着することによってタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する、７６，８８および９９ｋＤａのサブユニットからなる糖鎖結合型タンパク質複合体（以下、ＳＩＰＣと呼ぶ）を利用することによってタテジマフジツボ幼生の付着を制御するものである。
【０００５】
ＳＩＰＣを表面に吸着させた基盤等を海水中に配置することによって、この基盤の表面近傍でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起し、基盤の表面に付着させることができる。したがって、タテジマフジツボ幼生の着生域を変更させて、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へのタテジマフジツボ幼生の付着を抑えることができる。
【非特許文献１】坂口 勇(2003). 発電所の汚損生物対策技術の展望. Sessile Organisms 20(1), 15-19.
【非特許文献２】K.Matsumura, M.Nagano and N.Fusetani(1998). Purification of a larval settlement-inducing protein complex(SIPC) of the barnacle, Balanus amphitrite. J. Exp. Zool.,281,12-20.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＩＰＣは、基盤等に吸着した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示すことから、ＳＩＰＣは基盤に吸着させて用いることが必須条件となる。したがって、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起し得る範囲は基盤表面の近傍に制限される。
【０００７】
しかしながら、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起し得る範囲が基盤表面の近傍に制限されると、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生の着生を十分に誘起できない問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起することのできるタンパク質を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の位置に誘引することのできる誘引剤、誘引基材及び誘引方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するため、本願発明者が鋭意研究を行ったところ、タテジマフジツボ成体の抽出物に含まれている複数のタンパク質のうち、ある特定のアミノ酸配列と分子量とを有するタンパク質が、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示すことを知見した。また、このタンパク質の濃度勾配を海水中に形成した際のタテジマフジツボ幼生の挙動について調べたところ、この濃度勾配の高濃度側にタテジマフジツボ幼生を誘引できることを知見した。これらの知見に基づき、本発明に至った。
【００１１】
かかる知見に基づく請求項１記載のタンパク質は、タテジマフジツボ（Bａｌａｎｕｓ ａｍｐｈｉｔｒｉｔｅ）の成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質である。
【００１２】
このタンパク質は、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を有する新規タンパク質である。
【００１３】
請求項２記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤は、請求項１記載のタンパク質が基盤表面または担体に担持されているものである。また、請求項３記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤は、請求項１記載のタンパク質が固形状に成形されているものである。
【００１４】
請求項２及び３記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤によると、誘引剤を海水中に配置したときに、誘引剤からタンパク質が徐々に溶出して広範囲に拡散し、タテジマフジツボ幼生の着生が広範囲に誘起される。また、誘引剤からタンパク質が徐々に溶出することによって、誘引剤と中心としたタンパク質の濃度勾配が形成され、誘引剤の周辺にタテジマフジツボ幼生が誘引される。
【００１５】
請求項４記載のタテジマフジツボ幼生用誘引基材は、請求項１記載のタンパク質が基材表面に付着されているものである。
【００１６】
請求項４記載のタテジマフジツボ幼生用誘引基材によると、誘引基材を海水中に配置したときに、誘引基材の表面からタンパク質が徐々に溶出して広範囲に拡散し、タテジマフジツボ幼生の着生が広範囲に誘起される。また、誘引剤からタンパク質が徐々に溶出することによって、誘引基材を中心としたタンパク質の濃度勾配が形成され、誘引基材にタテジマフジツボ幼生が誘引される。
【００１７】
請求項５記載のタテジマフジツボ幼生の誘引方法は、請求項１記載のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給し、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配を形成するようにしている。したがって、海水中の広範囲にタンパク質が拡散してタテジマフジツボ幼生の着生が広範囲に誘起され、タンパク質濃度が高濃度の誘引対象領域にタテジマフジツボ幼生が誘引される。
【発明の効果】
【００１８】
請求項１記載のタンパク質によれば、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示すので、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起することが可能となる。
【００１９】
請求項２及び３記載のタテジマフジツボ幼生用誘引剤によれば、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起して、誘引剤の周辺に誘引することができる。したがって、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の位置に誘引することが可能となる。
【００２０】
請求項４記載のタテジマフジツボ幼生用誘引基材によれば、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起して、誘引基材に誘引することができる。したがって、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の位置に誘引することが可能となる。
【００２１】
請求項５記載のタテジマフジツボ幼生の誘引方法によれば、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配を形成するようにしているので、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起して、誘引対象領域に誘引することができる。したがって、海水中に広範囲に存在しているタテジマフジツボ幼生を所望の誘引対象領域に誘引することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２３】
本発明のタンパク質は、タテジマフジツボ成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質である。
【００２４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有しているタンパク質と一致ないしは類似するタンパク質は、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪタンパク質データベース上には存在しない。このことから、本発明のタンパク質は新規タンパク質である。
【００２５】
また、本発明のタンパク質の分子量は３２ｋＤａであり、非特許文献２において開示されている糖鎖結合型タンパク質複合体のサブユニット（分子量７６，８８及び９８ｋＤａのタンパク質）とは、その分子量を異にしている。尚、３２ｋＤａという分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量を意味している。
【００２６】
本発明のタンパク質は、タテジマフジツボ成体抽出物をタンパク質濃縮処理した後、カラムクロマトグラフィーを利用してタンパク質精製を行うことで得られる。
【００２７】
タテジマフジツボ成体抽出物は、タテジマフジツボ成体の全組織をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中でホモジナイズした後、遠心分離により上清を回収することにより得られる。このタテジマフジツボ成体抽出物には、本発明のタンパク質を含む複数のタンパク質が混在している。
【００２８】
タンパク質濃縮は、例えば硫酸アンモニウムを用いた塩析処理により行うことができる。
【００２９】
カラムクロマトグラフィーは、ゲルろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの順で行う。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液にはＮａＣｌ溶液を用いればよい。また、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの溶出液にはＫＨ２ＰＯ４溶液を用いればよい。
【００３０】
ゲルろ過に用いるゲル粒子としては、例えば東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｆを用いることができるが、これに限定されるものではなく、このゲル粒子と同一または類似の性質・機能を有するものを用いることができる。
【００３１】
陰イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍを用いることができるが、これに限定されるものではなく、このカラムと同一または類似の性質・機能を有するものを用いることができる。
【００３２】
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えばバイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製のＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｐａｔｉｔｅ，ＴｙｐｅＩＩ，４０μｍを用いることができるが、これに限定されるものではなく、このカラムと同一または類似の性質・機能を有するものを用いることができる。
【００３３】
図１〜図３に各カラムクロマトグラフィーからのタンパク質溶出パターンと本発明のタンパク質を含むフラクション（図中の斜線領域）を示す。カラムクロマトグラフィー操作によって、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質を単離することができる。
【００３４】
本発明のタンパク質は、海水に溶解して分散した状態でタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する機能を示す、タテジマフジツボ幼生に対する拡散性の着生誘起フェロモン様タンパク質である。したがって、非特許文献２において開示されている糖鎖結合型タンパク質複合体ＳＩＰＣのように、基盤等に吸着させて用いる必要がなく、海水中に分散させることによって、海水中の広範囲にタンパク質を拡散させ、タテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起することができる。
【００３５】
ここで、タテジマフジツボ幼生の着生を誘起する本発明のタンパク質の濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍＬであるが、１．０μｇ／ｍＬ以上とすることが好ましい。０．１μｇ／ｍＬ未満とすると、タテジマフジツボ幼生の着生を十分に誘起できない。１．０μｇ／ｍＬ以上とすることで、約７０％以上のタテジマフジツボ幼生の着生を誘起することができる。タンパク質濃度の上限値については、特に限定されないが、１０μｇ／ｍＬで８０％程度のタテジマフジツボ幼生の着生を誘起することができることが確認されたことから、１．０μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬとすることで、タテジマフジツボ幼生の着生を十分に誘起することができ、好ましい。
【００３６】
また、本発明のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給し、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配を形成することによって、誘引対象領域にタテジマフジツボ幼生を誘引することができる。
【００３７】
本発明のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給することによって、誘引対象領域からタンパク質が海水中に拡散し、誘引対象領域を中心としたタンパク質の濃度勾配が形成される。つまり、誘引対象領域を高濃度側とし、誘引対象領域から離れるに従ってタンパク質濃度が低下する濃度勾配が形成される。したがって、海水中の広範囲に拡散されたタンパク質によってタテジマフジツボ幼生の着生を広範囲に誘起し、タンパク質の濃度勾配の高濃度側である誘引対象領域に誘引することができる。この作用を利用することによって、タテジマフジツボ幼生を、海水中の広い範囲から所望の位置に誘引することができる。誘引したタテジマフジツボ幼生は、誘引対象領域にタテジマフジツボ幼生が着生し得る基盤や網などの着生用部材を配置し、これに付着させて捕捉することができる。
【００３８】
本発明のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給する方法としては、例えば、本発明のタンパク質の水溶液を送液ポンプを用いて誘引対象領域に送液する方法や、本発明のタンパク質を透過させ得る孔径の限外濾過膜等を備える密閉容器の中に本発明のタンパク質の水溶液を収容し、限外濾過膜から徐々にタンパク質を通過させて供給する方法が挙げられる。
【００３９】
また、本発明のタンパク質を担体に担持させて誘引剤とし、この誘引剤を誘引対象領域に配置するようにしてもよい。
【００４０】
担体としては、本発明のタンパク質を担持でき、本発明のタンパク質の海水中への溶出を阻害することがなく、且つタテジマフジツボ幼生の着生の誘起を阻害することのないものを用いることができる。例えば、アガロース、コラーゲン、フィブリン、アルブミン、カゼイン、セルロースファイバー、セルローストリアセタート、寒天、アルギン酸カルシウム、カラギーナン等の天然高分子や、ポリアクリルアミド、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリル酸、ポリビニルクロリド、γ−メチルポリグルタミン酸、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、ポリジメチルアクリルアミド、ポリウレタン、光硬化性樹脂（ポリビニルアルコール誘導体、ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリブタジエン誘導体等）等の合成高分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
また、本発明のタンパク質を固形状に成形して誘引剤とし、この誘引剤を誘引対象領域に配置するようにしてもよい。
【００４２】
固形状の誘引剤は、例えば、本発明のタンパク質をバインダー材料等と混合して加圧成形することにより得ることができるが、固形状の誘引剤の製造方法はこの方法に限定されるものではない。
【００４３】
また、本発明のタンパク質を基材の表面に付着させて誘引基材とし、この誘引基材を誘引対象領域に配置するようにしてもよい。この場合、基材の材質がタテジマフジツボ幼生を着生し得る材質であれば、誘引対象領域に着生用部材を配置しなくても、誘引基材自体にタテジマフジツボ幼生を捕捉できる。
【００４４】
基材としては、本発明のタンパク質に対し、ある程度の吸着性と溶出性を有するもの、即ち、本発明のタンパク質を一定時間その表面に保持し、誘引対象領域に配置することにより表面に保持されている本発明のタンパク質が徐々に溶出される基材を用いればよい。具体的には、コンクリート、スレート等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
このように、タテジマフジツボ幼生を所望の誘引対象領域に誘引することによって、タテジマフジツボ幼生の着生域を変更させることができ、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へのタテジマフジツボ幼生の付着を抑えることができる。また、本発明は、タテジマフジツボを積極的に捕獲することを目的として用いることもできる。この際、例えば、タテジマフジツボ幼生を基材に付着させ、基材のみを溶解させることで、タテジマフジツボ幼生を基材から剥がす手間を省くことができる。また、タテジマフジツボ幼生を基材に付着させ、成体まで成長させた後に、基材を溶解して成体を得るようにしてもよい。つまり、本発明を利用してタテジマフジツボ幼生を基材に付着させることで、タテジマフジツボを所望の成長段階で得ることができる。これにより、タテジマフジツボの産業上の要請、例えば、養殖海産魚への餌料等の原料としての供給が容易になる。
【００４６】
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、誘引対象領域に配置する着生用基材の表面に、基盤等に吸着することによってタテジマフジツボ幼生の着生を誘起する、７６，８８および９９ｋＤａのサブユニットからなる糖鎖結合型タンパク質複合体ＳＩＰＣ（非特許文献２参照）を吸着させるようにしてもよい。この場合には、誘引対象領域に誘引されたタテジマフジツボ幼生を、着生用基材によってさらに誘引することができ、タテジマフジツボ幼生を効果的に誘引・捕捉することが可能となる。
【００４７】
また、本発明のタテジマフジツボ幼生の誘引方法を、付着時期の予測技術に利用するようにしてもよい。例えば、本発明のタテジマフジツボ幼生の誘引方法を利用して特定海域で誘引されるタテジマフジツボ幼生の個体数変動の経時変化をモニタリングし、個体数変動の経時変化と海洋構築物等への付着時期との関係を示すデータを蓄積することによって、付着時期の予測を行うことができる。
【００４８】
また、本発明のタンパク質は、タテジマフジツボ幼生の着生を特異的に誘起する機能を示すことから、形態分類学上の差異のみを頼りに種判定を行うことが極めて困難であるフジツボ幼生の種判定技術にも利用することができる。
【実施例】
【００４９】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
（１．タンパク質の精製）
タテジマフジツボ成体の全組織に対し、１．５倍量（ｗ／ｖ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ, ｐＨ７．５）を加えてホモジナイズした後、遠心分離により上清を回収した。次に、回収した上清に硫酸アンモニウム溶液（７０重量％）を加えて塩析し、回収した上清のタンパク質を濃縮させた。
【００５１】
次に、カラムクロマトグラフィーを用いて、タンパク質の精製を行い、分子量３２ｋＤａのタンパク質を得た。カラムクロマトグラフィーは、以下に示す（Ａ）〜（Ｃ）の順で行った。
（Ａ）ゲルろ過
（Ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィー
（Ｃ）ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
【００５２】
ゲルろ過は、ゲル粒子として東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｆを用いて行った。ゲルろ過におけるタンパク質溶出パターンを図１に示す。斜線で示した領域（３３ｍＬ〜６３ｍＬ）のタンパク質溶出液をフラクションとして分取した。
【００５３】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、カラムとして東ソー株式会社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍを用い、溶出液としてＮａＣｌ溶液を用いて行った。陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを図２に示す。斜線で示した領域（１６０ｍＬ〜１８５ｍＬ）のタンパク質溶出液をフラクションとして分取した。尚、図２における破線は、溶出液として用いたＮａＣｌ溶液の濃度（右縦軸，単位ｍＭ）の勾配を表している。
【００５４】
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーは、カラムとしてバイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製のＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｐａｔｉｔｅ，ＴｙｐｅＩＩ，４０μｍを用い、溶出液としてＫＨ２ＰＯ４溶液を用いて行った。ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを図３に示す。斜線で示した領域（１２０ｍＬ〜１４５ｍＬ）のタンパク質溶出液をフラクションとして分取した。尚、図３における破線は、溶出液として用いたＫＨ２ＰＯ４溶液の濃度（右縦軸，単位ｍＭ）の勾配を表している。
【００５５】
上記カラムクロマトグラフィーにより精製したタンパク質の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した結果を図４に示す。図４において、左側の電気泳動結果は分子量マーカーを示し、右側の電気泳動結果は上記カラムクロマトグラフィーにより精製したタンパク質を示している。この測定結果から、精製したタンパク質の分子量が約３２ｋＤａであることが確認された。また、他の分子量のタンパク質は検出されなかった。このことから、上記カラムクロマトグラフィーを用いることにより、３２ｋＤａのタンパク質を高純度に精製できることが明らかとなった。
【００５６】
（２．着生誘起活性の確認）
上記方法で精製された３２ｋＤａのタンパク質（以下、単に精製タンパク質と呼ぶこともある。）のタテジマフジツボ幼生に対する着生誘起活性を確認する試験を実施した。
【００５７】
ポリスチレン製の２４穴プレートを用意し、以下の（Ａ）の条件の滅菌海水を２４穴のうちの６穴に１ｍＬずつ収容し、以下の（Ｂ）の条件の滅菌海水を別の６穴に１ｍＬずつ収容し、以下の（Ｃ）の条件の滅菌海水をさらに別の６穴に１ｍＬずつ収容し、以下の（Ｄ）の条件の滅菌海水を残りの６穴に１ｍＬずつ収容した。
（Ａ）精製タンパク質が含まれていない滅菌海水
（Ｂ）精製タンパク質濃度が０．１μｇ／ｍＬの滅菌海水
（Ｃ）精製タンパク質濃度が１．０μｇ／ｍＬの滅菌海水
（Ｄ）精製タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬの滅菌海水
【００５８】
各穴には、タテジマフジツボのキプリス幼生を７〜１０個体収容し、遮光した状態で且つ２５℃で静置した。そして、３時間経過後のキプリス幼生の状態を実体顕微鏡で観察し、各穴のプレート壁に付着した個体数とをカウントした。付着率は、以下に示す数式１により計算した。
［数式１］付着率（％）＝付着個体数／全個体数×１００
【００５９】
この試験を３回実施し、付着率の平均値を求めた。
【００６０】
試験結果を図５に示す。図５は、上記（Ａ）〜（Ｄ）の条件の滅菌海水に対するタテジマフジツボのキプリス幼生の付着率を示しており、付着率が高い程、精製タンパク質がキプリス幼生の着生誘起活性が高いことを意味している。この結果から、精製タンパク質濃度が０．１μｇ／ｍＬの滅菌海水を用いた場合には、精製タンパク質が含まれていない滅菌海水を用いた場合よりも若干付着率が増加する程度であったが、精製タンパク質濃度が１．０μｇ／ｍＬの滅菌海水を用いた場合には、精製タンパク質が含まれていない滅菌海水を用いた場合よりも付着率が３倍以上向上することが明らかとなった。さらに、精製タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬの滅菌海水を用いた場合には、精製タンパク質が含まれていない滅菌海水を用いた場合よりも付着率が４倍程度向上することが明らかとなった。
【００６１】
以上の結果から、本実施例で得られた精製タンパク質が、タテジマフジツボの付着期幼生であるキプリス幼生に対し、海水に溶解することによって着生誘起活性を示すことが明らかとなった。
【００６２】
そして、海水の精製タンパク質濃度を０．１μｇ／ｍＬ以上とすることでキプリス幼生の着生を誘起する効果が得られることが明らかとなった。この効果は、海水の精製タンパク質濃度を１．０μｇ／ｍＬとすることで大幅に向上し、１０μｇ／ｍＬとすることでさらに向上することが明らかとなった。
【００６３】
また、精製タンパク質を９０℃で１０分間加熱した後に同様の実験を行ったところ、精製タンパク質を加熱しない場合と同様の結果が得られることが確認された。このことから、このタンパク質は、加熱処理による失活（タンパク質変性）を起こすことがなく、使用環境温度による失活がほとんど起こらないことが明らかとなった。したがって、このタンパク質を実際に使用する環境の温度を気にすることなく使用することが可能であることがわかった。また、このタンパク質の耐熱性を利用して、このタンパク質の精製過程の単純化、即ち他のタンパク質を熱失活させることによって、このタンパク質を高純度に精製できる可能性が示唆された。
【００６４】
（３．精製タンパク質による誘引効果の確認）
精製タンパク質によるタテジマフジツボ幼生の誘引効果を検証した。
【００６５】
試験方法の概念図を図６に示す。直径１２ｃｍのガラスシャーレ（符号ａ）に滅菌海水（符号ｂ）を１００ｍＬとタテジマフジツボのキプリス幼生４３個体を収容した。そして、１％アガロース１ｍＬを円柱状に成形したアガロースゲルを２個（符号ｃ）と、１％アガロース１ｍＬに１０μｇの精製タンパク質を混合して円柱状に成形した精製タンパク質含有アガロースゲルを１個（符号ｄ）を準備し、これらのアガロースゲルをガラスシャーレの円周よりも若干内側に等間隔で配置した。
【００６６】
ガラスシャーレは遮光した状態で且つ２５℃で２４時間静置した後、ガラスシャーレ壁に付着しているキプリス幼生の個体数をカウントした。結果を図７に示す。図７において、アガロースゲル（符号ｃ及びｄ）以外の●が、キプリス幼生のガラスシャーレ壁への付着位置を示している。
【００６７】
ガラスシャーレ壁に付着したキプリス幼生は、４３個体のうち２７個体であった。また、付着個体のうちの８５％が精製タンパク質含有アガロースゲルｄを配置した近傍の領域に付着していることが確認された。
【００６８】
精製タンパク質含有アガロースゲルｄからは、精製タンパク質が徐々に溶出して滅菌海水中に広範囲に拡散し、このゲルを中心としたタンパク質の濃度勾配が形成される。即ち、この濃度勾配は、ゲル周辺を高濃度側として、ゲルから離れるに従ってタンパク質濃度が低下している。本実施例では、付着個体のうちの８５％がこのゲルを配置した近傍の領域に付着していたことから、広範囲に拡散した精製タンパク質の作用によってキプリス幼生の着生を広範囲に誘起し、精製タンパク質の濃度勾配の高濃度側の領域にタテジマフジツボ幼生を誘引できることが明らかとなった。
【００６９】
（４．アミノ酸配列の特定）
本実施例で得られた精製タンパク質について、Ｎ末端部分のアミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列は、精製タンパク質を還元ピリジルエチル化した後、株式会社島津製作所製のプロテインシーケンサＰＰＳＱ２１を用いたエドマン反応法により解析した。
【００７０】
その結果、Ｎ末端側の３３残基のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列であることが確認された。尚、一文字略号を用いた場合、このアミノ酸配列は以下のように表される。
（Ｈ）−ＥＰＱＰＧＶＰＳＴＰＱＬＡＧＶＬＴＮＬＹＲＲＦＬＨＴＶＡＰＫＱＬＮ
【００７１】
このアミノ酸配列について、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪタンパク質データベース上で検索したところ、一致ないしは類似する配列は存在しなかった。このことから、本実施例で得られた精製タンパク質は、配列未知の新規タンパク質であると考えられた。
【００７２】
以上の結果から、本実施例で得られた精製タンパク質、即ち、タテジマフジツボ成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有するタンパク質は、配列未知の新規タンパク質であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ゲルろ過におけるタンパク質溶出パターンを示す図である。
【図２】陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを示す図である。
【図３】ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出パターンを示す図である。
【図４】本発明のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した際の結果を示す図である。
【図５】着生誘起活性確認試験の結果を示す図である。
【図６】誘引効果確認試験の方法の概念を示す図ある。
【図７】誘引効果確認試験の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タテジマフジツボ成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質が担体に担持されているタテジマフジツボ幼生用誘引剤。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質が固形状に成形されているタテジマフジツボ幼生用誘引剤。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質が基材表面に付着されているタテジマフジツボ幼生用誘引基材。
【請求項５】
請求項１記載のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給し、前記誘引対象領域を中心とした前記タンパク質の濃度勾配を形成することを特徴とするタテジマフジツボ幼生の誘引方法。
【請求項１】
タテジマフジツボ成体の抽出物から得られ、配列番号１に記載のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、且つ３２ｋＤａの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質が担体に担持されているタテジマフジツボ幼生用誘引剤。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質が固形状に成形されているタテジマフジツボ幼生用誘引剤。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質が基材表面に付着されているタテジマフジツボ幼生用誘引基材。
【請求項５】
請求項１記載のタンパク質をタテジマフジツボ幼生の誘引対象領域に持続的に供給し、前記誘引対象領域を中心とした前記タンパク質の濃度勾配を形成することを特徴とするタテジマフジツボ幼生の誘引方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図４】
【図６】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図４】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１５５２９５（Ｐ２００９−１５５２９５Ａ）
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３７３８８（Ｐ２００７−３３７３８８）
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年９月２５日 ２００７（平成１９）年度日本水産学会秋季大会、国立大学法人 北海道大学大学院水産科学研究院発行の「２００７年（平成１９年）度日本水産学会秋季大会（日本農学大会水産部会） 講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年９月２５日 ２００７（平成１９）年度日本水産学会秋季大会、国立大学法人 北海道大学大学院水産科学研究院発行の「２００７年（平成１９年）度日本水産学会秋季大会（日本農学大会水産部会） 講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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