タンパク質の分泌産生システム
本発明は、低温の培養温度においてもネイティブな構造のタンパク質を、高い効率で産生させることができるタンパク質産生システムを提供することを目的とする。 本発明は、α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）タンパク質を利用する分泌システム中のタンパク質の変異体をコードする遺伝子、及びこれを含む種々のベクターを活用して、宿主内で目的タンパク質とともに発現させることにより、低温の培養温度において既存の分泌発現法と比較しても高い効率でネイティブな構造のタンパク質を産生することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野において組換体微生物により組換えタンパク質を調製するために有用な分泌産生システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、宿主として大腸菌を用いた外来の異種タンパク質（以下、目的タンパク質という）の生産方法には、菌体内発現法と分泌発現法とがある。
【０００３】
前者の菌体内発現法は、目的タンパク質の構造遺伝子を挿入した組換え発現ベクターをバクテリア等の宿主細胞内に導入し、目的タンパク質を発現、蓄積させ、その後菌体を回収、溶解し、得られた菌体の粗抽出液から目的タンパク質を精製する方法である。この菌体内発現法では、一般的に目的タンパク質の生産効率は高いが、発現させたタンパク質が凝集して菌体内で不溶化しやすい為に、目的タンパク質の回収後に可溶化してリホールディングさせる操作や、菌体内の他のタンパク質（プロテアーゼや他の夾雑物）を分離する操作を必要とし、天然における正しい立体構造をもった目的タンパク質、即ち本来の活性を有するネイティブな構造を持った目的タンパク質を得るためには、大変な手間がかかる。また、可溶化操作などの精製処理において、発現した目的タンパク質を１００パーセントの確率でネイティブな構造にリホールディングさせる事は通常、不可能である。そのため、菌体内における目的タンパク質の発現量に比べ、精製等の処理によって最終的に回収されるネイティブ構造の目的タンパク質量がかなり少ない場合も多々ある。時には、目的タンパク質の生産効率が低いと云われている分泌発現法と対比して、最終的な回収効率が同等か、それ以下という場合もある。
【０００４】
また、当該菌体内発現法は、成熟型タンパク質のＮ末端にメチオニン残基が付加される場合が多々ある。この場合、前記Ｎ末端にメチオニン残基が無いタンパク質を得るためには、Ｎ末端のメチオニン残基を人為的にペプチダーゼで切断する操作が要求されることもある。
【０００５】
このように菌体内発現法は、一連の処理操作が煩雑で時間が掛る割には、ネイティブな構造の目的タンパク質の回収率が悪く、近年、目的タンパク質の大量生産には向かないとされている。
【０００６】
そこで、近年、これら菌体内発現法の問題解決手段として、分泌発現法が注目されている。この分泌発現法においては、発現された目的タンパク質がペリプラズム層又は菌体外へ分泌されるので、上記した菌体内発現法に比べて目的タンパク質の精製が簡便であるという利点がある。特に、菌体外へ分泌される系では、培養液のみを回収し濃縮することによって、目的タンパク質を比較的簡単に回収することができるので、目的タンパクの精製がより簡便になっている。
【０００７】
この分泌発現法は、更に、目的タンパク質をネイティブな構造で生産できる可能性が高い点、及び培養上清中にプロテアーゼや他の夾雑物が少なく精製が容易である点において、目的タンパク質の生産方法として注目されている。
【０００８】
この分泌発現法は、菌体外又はペリプラズム層へ分泌させるために、「シグナル配列」を目的タンパク質と融合させて発現させるベクターを用いることを特徴とする。前記シグナル配列としては、例えば、溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）のＣ末端配列（以下、ＨｌｙＡシグナル配列という場合もある）、エンテロトキシン（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）の発現に関与しているＡサブユニットとＢサブユニットのＮ末端配列、ＯｍｐＡシグナル配列、ＯｍｐＦシグナル配列、ＰｈｏＡシグナル配列等が挙げられる（非特許文献１）。因みに、組換えベクターとしては、ＣｏｌＥ１オリジンをもつｐＢＲ３２２誘導体等の一般的に用いられるプラスミド由来の組換え発現ベクター等が用いられている。
【０００９】
先に列挙したシグナル配列の中でも、特にＨｌｙＡシグナル配列を用いた分泌生産方法は、基本的にＨｌｙＡシグナル配列に結合する目的タンパク質の大きさに依存せず、分泌の過程で適切なＳ−Ｓ結合を形成させることができることから、目的タンパク質をネイティブな構造で可溶性画分中に発現することが出来る分泌発現系として非常に有用と考えられている。
【００１０】
このＨｌｙＡシグナル配列を用いた分泌生産方法は、元々、尿路病原性大腸菌が産生する溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の分泌に使われるグラム陰性菌Ｔｙｐｅ Ｉ分泌システム（非特許文献２参照）を利用したものであり、シグナル配列を含むＨｌｙＡ、ＨｌｙＡの菌体外輸送に関わるアデノシントリホスタファーゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するタンパク質ＨｌｙＢ、ペリプラズムタンパク質ＨｌｙＤ、および外膜タンパク質ＴｏｌＣを必要とするが、グラム陰性菌における一般的なペリプラズムタンパク質の分泌に関わるＳｅｃ経路は必要としない。ＨｌｙＡのＣ末端の約６０位から２１８位までのアミノ酸は分泌シグナルを形成しており、それ自体の毒性がないことから、外来タンパク質と融合させ菌体外へ分泌させる例がいくつか報告されている（非特許文献３、４参照）。
【００１１】
ところで、分泌発現法においては、より効率的な分泌生産が可能な宿主株の検討も盛んに行われており、中でもグラム陽性菌の枯草菌は、タンパク質の分泌能が高く、各種産業用酵素の供給源として利用されている。しかしながら、枯草菌は多種多様なプロテアーゼを有するという問題がある。このため、宿主株自体の改良が必要であり、種々研究・開発が行われている。しかしながら問題が十分に解消した宿主株は未だ得られていないのが現状である。
【非特許文献１】ステーダー・ジェイ・エーら（Ｓｔａｄｅｒ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１８５：１６６−８７，１９９０
【非特許文献２】ジェンチェフ・アイら（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．トレンズ・イン・マイクロバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１０：３９−４５，２００２
【非特許文献３】ツシャッシェル・ビー・ディーら（Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ Ｂ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，）Ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ ＩＩｅＢ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｙ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ．ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１４：７６５−９，１９９６．
【非特許文献４】シェルボー・シーら（Ｃｈｅｒｖａｕｘ Ｃ．ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐａｔｈｗａｙ．モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．）２４９：２３７−４５，１９９５．
【非特許文献５】ブライト・エムエーら（Ｂｌｉｇｈｔ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４６８−７４，１９９４
【非特許文献６】ゲンチェフ・アイら（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：３９−４５，２００２
【非特許文献７】ヘス・ジェイら（Ｈｅｓｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｒｉｎｅ ｌｉｓｔｅｒｉｏｓｉｓ ｂｙ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｔｈａｔ ｓｅｃｒｅｔｅｓ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｓｏｍａｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９９７ Ａｐｒ；６５（４）：１２８６−９２．
【非特許文献８】スプレング・エスら（Ｓｐｒｅｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；３１（５）：１５９６−８
【非特許文献９】ハツソン・ジェイ・エスら（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．，）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８５：５８７９−８３，１９８８、Ｗｈｉｔｌｏｗ Ｍ ａｎｄ Ｆｉｌｐｕｌａ Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２，９７
【非特許文献１０】イマイら（Ｉｍａｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ，）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２７８５，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記した大腸菌を用いた分泌発現法では、最適培養温度である３７℃で菌体を培養することにより、菌体が持つ目的タンパク質の発現能及び分泌能を最大限引き出し、目的タンパク質を分泌生産させる。しかしながら、およそ３０℃以下の低温で菌体を培養した場合、目的タンパク質の発現能は低下し、分泌能の効率も著しく悪く、菌体内発現法で生産させる場合に比べて著しく生産効率が低い。従って、既存の分泌発現系は、低温下でのタンパク質の大量生産に適切であるとは言えない。
【００１３】
即ち、既存の分泌発現法は、たとえ菌体を最適な培養温度（大腸菌においては３７℃）で培養しても、菌体内発現法に比べて遺伝子の発現効率が悪く、生産効率が低いことが多い。従って、場合によっては、目的タンパク質の大量生産に適切な手法であるとは言えず、例えば、ヘモリシンの発現に機能しているＨｌｙＡを用いた分泌発現系でも、これまでの報告ではペリプラズム分泌系と同等の産生レベル（総蛋白の２−５％）であり、菌体内発現系と比較して発現量が絶対的に少なかった（非特許文献５）。
【００１４】
また、例え発現効率自体は低くても、発現させた目的タンパク質が可溶性画分に回収できればメリットはあるが、従来の方法ではおよそ３０℃以下の低温で培養した場合には、３７℃で培養した場合に比べ、更に分泌の効率が低下する。つまり、目的タンパク質を可溶性画分中に回収する目的で、菌体をおよそ３０℃以下の低温で培養し分泌発現を促す場合、発現及び分泌レベルは共に著しく低下する。
【００１５】
一方で、タンパク質の調製法として、３０℃以下の低温で発現させる方法も一般的に行われている。この理由の１つとしては、菌体内における目的タンパク質の発現効率を敢えて下げることにより、目的タンパク質を含む封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の発生を抑制することが出来るからである。即ち、ネイティブな構造の目的タンパク質を、可溶化区分において回収できる。また他の理由としては、低温で発現させることにより、宿主由来のタンパク質の生合成も抑制され、プロテアーゼ活性も低下するため、目的タンパク質を高効率で得ることが期待できるからである。このような理由から、およそ３０℃以下の低温でも高効率で目的タンパク質を産生可能な分泌生産システムが求められている。
【００１６】
本願発明の目的は、既存の分泌発現法と対比して、低温の培養温度でも目的タンパク質を高い効率で産生させることができる、タンパク質の分泌系生産システムを提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、宿主としてグラム陰性菌、特に大腸菌を用いたＨｌｙＡ分泌システムにおいて、低温で分泌能が向上する新規の変異タンパク質ＨｌｙＢ’を用いることにより、低温培養において目的タンパク質の分泌を高効率にて実現するシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上述のような課題を解決するために、鋭意研究を行った結果、尿路病原性大腸菌が産生する溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の分泌に使われるグラム陰性菌Ｔｙｐｅ Ｉ分泌システム（非特許文献６）を改変することにより、低温培養において目的タンパク質の分泌を高効率に実現するシステムが得られることを見出し、本願発明を完成した。
【００１９】
即ち、本発明は、以下に挙げる技術を提供する：
（１）配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列；又は
配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加され尚且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００２０】
（２）前記のＡＴＰａｓｅ活性が、α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の蛋白輸送に関わるアデノシントリホスファターゼ活性である（１）に記載のタンパク質。
【００２１】
（３）前記欠失、挿入、置換若しくは付加が、配列番号５０に示されるアミノ酸配列の、アミノ酸番号４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における欠失、挿入、置換又は付加である、（１）に記載のタンパク質。
【００２２】
（４）（１）乃至（３）の何れか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【００２３】
（５）配列番号４若しくは配列番号５に示される塩基配列、又はこれらの塩基配列がコードするアミノ酸配列と同一のアミノ酸をコードする塩基配列を含む遺伝子。
【００２４】
（６）（４）又は（５）に記載の遺伝子が、所定の宿主において発現可能に挿入された発現ベクター。
【００２５】
（７）プロモーター配列；及び当該プロモーター配列の制御下に、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む、（６）に記載の発現ベクター。
【００２６】
（８）前記プロモーターと同一又は別種類のプロモーター制御下の領域であって、前記の目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列をコードする塩基配列の挿入部位とは別個の部位に、（４）に記載の遺伝子を発現可能なように挿入した、（７）に記載の発現ベクター。。
【００２７】
（９）更に、配列番号１９に記載の塩基配列、又は配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、（６）〜（８）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００２８】
（１０）配列番号１８のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加され、尚且つ宿主内で発現後ペリプラズムに移行して、変異タンパク質ＨｌｙＢ’、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質とともに、ＨｌｙＡシグナル配列が融合した目的タンパク質を菌体外に輸送する輸送孔を形成するタンパク質（当該輸送孔を形成する機能を有するアミノ酸配列）をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、（６）〜（８）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００２９】
（１１）前記プロモーターが、トリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターとの雑種プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターからなる群より選択されるいずれか１種のプロモーターである、（７）〜（１０）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００３０】
（１２）前記ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片が、配列番号３に示されるアミノ酸配列の６０〜２１８番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含み、尚且つ目的タンパク質をコードする塩基配列の３’側に付加されている、（７）〜（１１）の何れか一つ記載の発現ベクター。
【００３１】
（１３）前記の発現ベクターが、プラスミドベクター、又はファージベクターである、（６）〜（１２）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００３２】
（１４）（６）に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
（６）に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列並びにタンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
（６）に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターと、タンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
（６）乃至（１３）の何れか一項に記載の発現ベクターの群から選択されるいずれか一つの発現ベクター又は発現ベクターの組合わせ
を宿主に導入してなる、形質転換体。
【００３３】
（１５）前記宿主がグラム陰性菌である、（１４）に記載の形質転換体。
【００３４】
（１６）（１４）に記載の形質転換体を所定の条件で培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
【００３５】
（１７）更に、前記培養工程後の培養液より宿主細胞を除去する工程；及び適宜、宿主細胞除去後の培養液からタンパク質を精製する工程；を有する、（１６）に記載のタンパク質の生産方法。
【００３６】
（１８）前記形質転換体を培養する温度が、３０℃以下である、（１６）又は（１７）に記載のタンパク質の生産方法。
【００３７】
（１９）前記形質転換体を培養する温度が、１９℃以上、３０℃以下である、（１６）又は（１７）に記載のタンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【００３８】
本願発明によれば、既存の分泌発現法と対比して、低温の培養温度でもネイティブな構造のタンパク質を効率良く産生する分泌系生産システムを実現することができる。
【００３９】
更に、グラム陰性菌、特に大腸菌を用いたＨｌｙＡ分泌システムにおいて、低温で分泌能が向上する新規の変異タンパク質ＨｌｙＢ’を用いることにより、低温培養において、目的タンパク質を高効率に分泌可能な分泌系生産システムを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤを示す図である。
【図２】ｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８を示す図である。
【図３】Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲに用いた各プライマーの位置関係を示す図である。
【図４】サチライシンＥによるスキムミルク分解を示す図である。
【図５】各変異株における変異箇所を示す図である。
【図６】各変異体におけるＨＳＡ１４−１ｓｃＦｖの分泌量を示す図である。
【図７】各変異株における変異箇所を示す図である。
【図８】ｐＧＥＭ−ＮｄＥ５２の作成を示す図である。
【図９】各変異体におけるＨＳＡ１４−１ｓｃＦｖの分泌活性を示す図である。
【図１０】各温度におけるＨＳＡ１４−１ｓｃＦｖの分泌量を示す図である。
【図１１】ｃ−ｍｙｃ及びＰＴＥＮの分泌を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、ＨｌｙＡの分泌に使われるグラム陰性菌Ｔｙｐｅ Ｉ分泌システム（ＨｌｙＡ分泌システム）を構成するタンパク質ＨｌｙＢの変異タンパク質（以下、本願においては、タンパク質ＨｌｙＢについての変異タンパク質を総称して「変異タンパク質ＨｌｙＢ’」と呼び、これをコードする遺伝子を総称して「変異遺伝子ＨｌｙＢ’」と呼び、そしてこの変異タンパク質ＨｌｙＢ’を発現する菌株を総称して「変異体ＨｌｙＢ’」と呼ぶ）、及び変異タンパク質ＨｌｙＢ’を用いたＨｌｙＡ分泌システムによる目的タンパク質の産生方法である。
【００４２】
変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列；又は配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加され尚且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００４３】
配列番号１に示したアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、野生型タンパク質ＨｌｙＢ（配列番号５０にアミノ酸配列を示す）のＮ末端から４４８番目のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換されたタンパク質である（図７；１０４Ｆ参照）。
【００４４】
配列番号２に示したアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、野生型タンパク質ＨｌｙＢの６５４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）からセリン（Ｓｅｒ）に置換されたタンパク質である（図５；１２９、表２参照）。
【００４５】
また、配列番号１に示したアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’とは、配列番号１に示したアミノ酸配列における４４８位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）以外のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加され、且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有しているタンパク質である。例えば、複数個のアミノ酸が置換された例としては、図７に示したＡＥ１０４（配列番号６）及びＡＥ１０４Ｂ〜１０４Ｄ（配列番号８〜１０）が挙げられる。これらの変異タンパク質は、後述するＨｌｙＡ分泌システムによる目的タンパク質の生産方法において好適に使用することができる。これら具体例の変異タンパク質においては、タンパク質ＨｌｙＢのアミノ酸配列において１〜４個のアミノ酸残基が置換されているが、上記したＡＴＰａｓｅ活性を有している限り、ＡＴＰａｓｅ活性部位以外の部位における変異（欠失、挿入、置換又は付加）、及びＡＴＰａｓｅ活性部位の変異であってＡＴＰａｓｅ活性を保持している変異（欠失、挿入、置換又は付加）の双方が含まれる。また、これらの変異においては、ＡＴＰａｓｅ活性を保持する限り、５個以上のアミノ酸残基の変異（欠失、挿入、置換又は付加）であってもよい。
【００４６】
更に、配列番号２に示したアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’とは、配列番号２に示したアミノ酸配列における６５４位のセリン（Ｓｅｒ）以外のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加され、且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有しているペプチドである。この変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、上記したＡＴＰａｓｅ活性を有している限り、ＡＴＰａｓｅ活性部位以外の部位における変異（欠失、挿入、置換又は付加）、及びＡＴＰａｓｅ活性部位の変異であってＡＴＰａｓｅ活性を保持している変異（欠失、挿入、置換又は付加）の双方が含まれる。
【００４７】
このような変異タンパク質ＨｌｙＢ’としては、上記のＡＴＰａｓｅ活性がα−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の蛋白輸送に関わるアデノシントリホスファターゼ活性である変異タンパク質ＨｌｙＢ’が挙げられる。具体的には野生型遺伝子ＨｌｙＢのアミノ酸４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における欠失、挿入、置換又は付加を有するものを挙げることができる。より好ましくは、野生型遺伝子ＨｌｙＢのアミノ酸４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における置換を有するものである。
【００４８】
本発明は、上記した変異タンパク質ＨｌｙＢ’のアミノ酸配列をコードする、変異遺伝子ＨｌｙＢ’をも提供する。これら本願発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’の具体的配列は、本発明者らが溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の分泌産生する尿路病原性大腸菌から採取したｈｌｙＢ−ｈｌｙＤオペロン遺伝子に変異を導入して得た変異体の一部をなすものである（例えば配列番号４、１２〜１７）。
【００４９】
本発明の変異タンパク質ＨｌｙＢ’のアミノ酸配列をコードする本発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’の具体的な配列としては例えば配列番号４及び配列番号５に示されるものであるが、これら以外にも、本発明の変異タンパク質ＨｌｙＢ’のアミノ酸配列をコードする、その他の塩基配列を有するものも含まれる。
【００５０】
本発明は、本発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’が、所定の宿主において発現可能に挿入された発現ベクターをも提供する。
【００５１】
上記した発現ベクターは、目的のタンパク質をＨｌｙＡシグナルと連結したものを発現する別個のベクターと、同一の宿主に共形質転換することにより、当該所定タンパク質の効率的な分泌に利用することが可能である。
【００５２】
さらに、本発明の分泌システムは、上記のような共形質転換により構築される分泌システムに限定されるものではない。本願発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’とＨｌｙＡシグナル配列に目的タンパク質を結合した融合タンパク質をコードする塩基配列とを同一発現ベクターに組込み、同発現ベクターを宿主に導入することによっても、目的タンパク質の分泌システムを構築することが可能である。この場合、同一の発現ベクターに組込まれた変異遺伝子ＨｌｙＢ’とＨｌｙＡシグナル配列に目的タンパク質を結合した融合タンパク質をコードする塩基配列とは、同一プロモーター制御下の領域に組込んでもよいし、又は、前記変異遺伝子ＨｌｙＢ’と前記融合タンパク質をコードする塩基配列とをそれぞれ別のプロモーター制御下の領域に組込んでもよい。
【００５３】
ここでプロモーターとしては、グラム陰性菌、特に大腸菌内で外来タンパク質の発現に利用される種々のものを挙げることができる。具体例としてはトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターとの雑種プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターを挙げることができる。
【００５４】
本発明のタンパク質分泌産生システムの一態様においては、上記した本発明の発現ベクターに、更に、配列番号１９に記載の塩基配列、又は配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含めることができる。遺伝子ＨｌｙＤとしては、これらの配列番号１９に記載の塩基配列、及び配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するもの以外にも、配列番号１８のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加され、尚且つグラム陰性菌のペリプラズムに移行して、更に変異タンパク質ＨｌｙＢ’、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質とともに、ＨｌｙＡシグナル配列が融合した目的タンパク質を輸送する輸送孔を形成する機能を有するアミノ酸配列をコードしているものを利用することができる。このような変異としては、例えばタンパク質ＨｌｙＤの４１位のアミノ酸が、フェニルアラニンからチロシンに置換されたものを挙げることができる。
【００５５】
タンパク質ＨｌｙＤを変異タンパク質ＨｌｙＢ’と同一プロモーターにより発現する場合には、変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤとを同一コドン読取り枠で結合したｈｌｙＢ’−ｈｌｙＤオペロンを作成し、同ｈｌｙＢ’−ｈｌｙＤオペロンを発現ベクターのプロモーター制御下に導入する。変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤとを同一の発現ベクターのそれぞれ異ったプロモーター制御下の領域に組込み、変異タンパク質ＨｌｙＢ’とタンパク質ＨｌｙＤとをそれぞれ異なるプロモーターの制御下で発現させることもできる。また、別々のオリジンをもつ発現ベクター上に変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤを別々組み込み、別々に発現させることもできる。更に、変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤとをそれぞれ菌体内のゲノムＤＮＡに挿入（インテグレート）させ、変異タンパク質ＨｌｙＢ’とタンパク質ＨｌｙＤとをそれぞれ発現せることも可能である。勿論、上記したｈｌｙＢ’−ｈｌｙＤオペロンを菌体内のゲノムＤＮＡに挿入（インテグレート）させ、変異タンパク質ＨｌｙＢ’とタンパク質ＨｌｙＤとを発現させてもよい。
【００５６】
本発明の発現ベクターにおいては、上記ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片は、配列番号３に示されるアミノ酸配列のＣ末端６０〜２１８番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含み、尚且つ目的タンパク質をコードする塩基配列の３’側に付加することができる。
【００５７】
上記（６）〜（８）に記載の発現ベクターとしては、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ビブリオ菌、セラチア菌、緑膿菌などのグラム陰性菌の内から選択される菌体内で発現可能なものが使用される。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他サルモネラ菌、赤痢菌、ビブリオ菌、セラチア菌および緑膿菌については、組換えベクターｐＧＤ４が代表的に挙げられる（非特許文献７）。これら組換え発現ベクターのプロモーターとしては、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターの雑種プロモーターや、天然もしくは変異型（ｌａｃＵＶ５）のｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、その他、常に転写活性の高い恒常的に発現しているプロモーターも使用可能である。更に、低温下で発現が誘導されるコールドショックプロモーターや、テトラサイクリン誘導性プロモーター等も好適に利用することができる。
【００５８】
以上に説明した、変異タンパク質ＨｌｙＢ’の発現ベクターを導入した宿主であるグラム陰性菌、特に大腸菌においては、少なくともおよそ３０℃以下の低温下で高い膜輸送能が可能となり、ＨｌｙＡシグナル配列と目的タンパク質との融合タンパク質を菌体内から菌体外へ分泌することができる。
【００５９】
本発明においては、発現・分泌されたＨｌｙＡシグナル配列と目的タンパク質との融合タンパク質を、その精製後において、ＨｌｙＡシグナル配列と目的タンパク質とに切断できるように、ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片の、例えば５’末端と目的タンパク質をコードする構造遺伝子の、例えば３’末端との間にプロテアーゼの認識配列をコードするＤＮＡ断片を介しておくことも可能である。前記認識配列とプロテアーゼは、公知のものを利用すればよい。例えば、認識配列としてＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４２）を付加した場合にはファクターＸａで切断すればよいし、エンテロキナーゼとその認識配列としてＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号４３）を付加した場合にはエンテロキナーゼにより切断すればよい。因みに、ＨｌｙＡシグナル配列は、他のシグナル配列、例えばＯｍｐＡシグナル配列などと同様にタグ配列を付加することもできる。
【００６０】
本発明の発現ベクターを導入する宿主には、上述したようにタンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質を外膜に有するグラム陰性菌を使用することができる。例えば、大腸菌、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＬ７２０７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ５４１Ｔｙ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ビブリオ菌（Ｖｉｖｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が好適に使用できる。因みに、上記サルモネラ菌、赤痢菌、ビブリオ菌、セラチア菌及び緑膿菌に関しては、大腸菌のＨｌｙＡ分泌システムが機能することが確認されている（非特許文献８）。更に、より好ましくはおよそ３０℃以下の低温で生育可能なグラム陰性菌を用いる。
【００６１】
なお、上記した宿主への発現ベクターの導入は、種々の公知の方法により実施される。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法などが挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００６２】
本発明は、上記したＨｌｙＢ’（変異タンパク質、変異遺伝子、形質転換体）を利用したＨｌｙＡ分泌システムによるタンパク質生産方法をも提供する。
【００６３】
本発明のタンパク質生産方法においては、ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片の、例えば５’末端に所望の目的タンパク質をコードする構造遺伝子の３’末端を結合したＤＮＡ断片と、変異タンパク質ＨｌｙＢ’をコードする構造遺伝子と、適宜タンパク質ＨｌｙＤをコードする構造遺伝子とを、発現ベクターを介して、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質を外膜に有するグラム陰性菌へ導入することにより、例えばおよそ３０℃以下の低温培養時においても、培地への目的タンパク質の高い分泌能を発揮させ、高い生産効率で目的タンパク質を生産することができる。
【００６４】
本発明のタンパク質の生産方法に於いては、例えば、ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片の５’末端に所望の目的タンパク質をコードする構造遺伝子をインフレーム且つ発現可能に挿入した組換え発現ベクターと、変異タンパク質ＨｌｙＢ’をコードする構造遺伝子及びタンパク質ＨｌｙＤをコードする構造遺伝子とを挿入された組換え発現ベクターとを、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質を外膜に有する宿主細胞へ導入し、これを所定の条件で培養することにより行う。
【００６５】
本発明のタンパク質生産方法においては、変異遺伝子ＨｌｙＢ’が宿主内で発現することにより、１９℃〜３０℃、より好適には２３℃〜３０℃の温度領域において、高いタンパク質の分泌生産能を示す。また、目的タンパク質の種類によっては、当該宿主の通常の培養温度（例えば３７℃）においても、高いタンパク質分泌能を有するものもある（図１１（Ｂ）参照）。
【００６６】
次に発現させた目的タンパク質とＨｌｙＡシグナル配列との融合タンパクの抽出・精製法に関しては、既存のタンパク質抽出・精製法を適応することができる。抽出法としては、培養液を限外ろ過することによって該融合タンパク質を濃縮し、その濃縮液から通常の塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法を適応することができる。精製法としては、上述の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法などの手法を組み合わせて行うことができる。特に該融合タンパクに含まれるＨｌｙＡシグナル配列の一部を認識する抗体を結合させたアフィニティーカラムによって効率的に精製することも可能である。
【００６７】
なお、融合タンパクの形状で精製された該融合タンパク質は、先に述べたように目的タンパク質とＨｌｙＡシグナル配列との間（融合部分）にプロテアーゼの認識配列の部分を予め挿入した場合には、前記認識配列に特異的なプロテアーゼを用いて切断でき、よりネイティブな構造を有する目的タンパク質を得ることが可能である。切断の結果得られる目的タンパク質は、上記の各種クロマトグラフィー法を用いてＨｌｙＡシグナル配列と分離し、さらに精製することが可能である。
【００６８】
なお、上述した本発明にかかるタンパク質の分泌生産システムによれば、既存の分泌発現法と対比して、３０℃以下の培養温度でもネイティブな構造の蛋白質を高い効率で産生させることができる。
【００６９】
宿主細胞として特に、大腸菌等のグラム陰性菌を用いたＨｌｙＡ分泌システムによる分泌発現法においては、ＨｌｙＢ’（変異タンパク質、変異遺伝子、形質転換体）を用いることにより、およそ３０℃以下の温度で培養した場合にネイティブな構造の目的タンパク質を、既存のＨｌｙＡ分泌システムと比べて数倍〜数十倍の高い効率で産生することができる。
【００７０】
また、本発明のタンパク質生産システムによれば、可溶性のタンパク質のみならず、後述するＰＴＥＮのような不溶性のタンパク質もネイティブな構造で生産することができる。
【００７１】
以上には、本発明の好適な実施形態を示したが、本発明の要旨を逸脱することなく、種々の変形変更が可能である。
例えば、宿主であるグラム陰性菌に導入する発現ベクターに、上記ＨｌｙＡシグナル配列を融合した目的タンパク質の発現にかかる発現ベクターと、上記変異タンパク質ＨｌｙＢ’及びタンパク質ＨｌｙＤの発現にかかる発現ベクターとの２種類の発現ベクターに代えて、前記目的タンパク質の発現系と変異タンパク質ＨｌｙＢ’及びタンパク質ＨｌｙＤの発現系とを同時に保持する発現ベクターを作成し導入したグラム陰性菌を使用しても、本発明を好適に実施することができる。
【００７２】
また、例えば大腸菌Ｊ９６株のゲノムＤＮＡ中におけるｈｌｙＡ及びｈｌｙＢ遺伝子をノックアウトした大腸菌株を作成し、該大腸菌株を宿主として使用した場合、上記ＨｌｙＡシグナル配列を融合した目的タンパク質にかかる発現ベクターと、変異タンパク質ＨｌｙＢ’のみを発現可能な発現ベクターとを前記大腸菌株へ導入することにより、本発明を好適に実施できる。勿論、前記目的タンパク質の発現系と変異タンパク質ＨｌｙＢ’の発現系とを同時に保持する発現ベクターを作成し、前記大腸菌株へ導入しても好適に実施することができる。
【実施例１】
【００７３】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
遺伝子のクローニング
ＨｌｙＡのシグナル配列（Ｃ末端２１８アミノ酸、以下ＨｌｙＡ２１８と記す）、サチライシンＥ、ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードする遺伝子断片は全て後述するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。反応系は全て５０μｌとし、ＰＣＲのポリメラーゼはＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。ＰＣＲ反応後、増幅断片を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから切り出し後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片を該当する制限酵素で消化後、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用い精製した。これを同様に制限酵素処理したプラスミドベクターとＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）を用い、室温にて５分間ライゲーションさせた後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンもしくはクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。挿入遺伝子の確認は、各コロニーから培養し調製した組換えプラスミドの一部をそれぞれの組換えに用いた制限酵素で消化し、電気泳動をすることで行った。また、クローニングした遺伝子断片は全てＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、ＡＢＩ３１００シークエンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により塩基配列を確認した。以下、クローニングの手順を個別に示す。
【００７４】
ｈｌｙＢ−ｈｌｙＤ遺伝子断片はｈｌｙＢの開始コドンを除いた５’末端にＢａｍＨＩ部位、ｈｌｙＤの３’末端にＳｐｈＩ部位を持つようにＨＢＢａＦ１プライマー（配列番号２０）およびＨＤＳｐＲプライマー（配列番号２１）を用いて、大腸菌Ｊ９６株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って増幅した。ＰＣＲ反応は、９５℃２分ののち、９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃４分を２５サイクル行った。増幅した遺伝子断片をｐＳＴＶ２８（ＴＡＫＡＲＡ社）のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤを得た（図１）。
【００７５】
サチライシンＥとＨｌｙＡ２１８の融合タンパクの発現ベクターは以下のように構築した。すなわち、サチライシンＥはシグナル配列を含まない２６〜３８１番目のアミノ酸をコードする遺伝子断片を、５’末端（開始コドンＧＴＧから７４番目のＴ）にＮｃｏＩ部位、３’末端にＳａｃＩ部位を持つようにプライマーＳｕｂＮｃＦ（配列番号２２）およびプライマーＳｕｂＸｈＲ（配列番号２３）を用いて枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８；ＥＭＧ５１の染色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は９５℃２分ののち、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を２５サイクル行った。一方、５’末端にＳａｃＩ部位、３’末端にＳａｌＩ部位を持つＨｌｙＡ２１８遺伝子断片をプライマーＨｌｙＡ２１８−ＳｃＦ（配列番号２４）およびプライマーＨＡＳＬＲ（配列番号２５）を用いて大腸菌Ｊ９６株の染色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い増幅した。ＰＣＲ反応はサチライシンＥの場合と同様に行った。これらサチライシンＥおよびＨｌｙＡ２１８の遺伝子断片をＴｒｃＨｉｓ２Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８を得た（図２）。ＰＣＲに使用したプライマーの配列を以下に示す。
【００７６】
プライマー一覧
ＨＢＢａＦ１：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧ−３’（配列番号２０）
ＨＤＳｐＲ：５’−ＴＧＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＣＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２１）
ＳｕｂＮｃＦ：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡ−３’（配列番号２２）
ＳｕｂＸｈＲ：５’−ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＧＴ−３’（配列番号２３）
ＨｌｙＡ２１８−ＳｃＦ：５’−ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号２４）
ＨＡＳＬＲ：５’−ＴＧＡＡＴＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号２５）
【実施例２】
【００７７】
ランダム変異の導入
ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子へのランダム変異の導入は、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によってランダム変異を導入するＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い、付属のマニュアルに従い行った。すなわち、０．５ｎｇから５０ｎｇのｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤを鋳型にして順方向プライマーＢａｍ−Ｆ（配列番号２６）および逆方向プライマーＢｓｐ−Ｒ（配列番号２７）、順方向プライマーＢｓｐ−Ｆ（配列番号２８）および逆方向プライマーＳｐｈ−Ｒ（配列番号２９）、もしくは順方向プライマーＡＬ−Ｆ（配列番号３０）および逆方向プライマーＥ５２−Ｒ（配列番号３１）の組み合わせで、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃１分ののち、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル行った。これらのＰＣＲ産物をそれぞれｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤ内のそれぞれＢａｍＨＩ−ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＨＩ−ＳｐｈＩ、もしくはＡｐａＬＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片と組換えた遺伝子ライブラリーを作製した。使用したプライマーの配列を以下に示す。各プライマーと遺伝子の位置関係を図３に示した。
【００７８】
プライマー一覧
Ｂａｍ−Ｆ：５’−ＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号２６）
Ｂｓｐ−Ｒ：５’−ＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号２７）
Ｂｓｐ−Ｆ：５’−ＧＣＧＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＧＴＧＣＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号２８）
Ｓｐｈ−Ｒ：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２９）
ＡＬ−Ｆ：５’−ＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣ−３’（配列番号３０）
Ｅ５２−Ｒ：５’−ＴＡＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号３１）
【実施例３】
【００７９】
変異体のスクリーニングと変異体の同定
上記実施例２で作成した各遺伝子ライブラリーをそれぞれｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８であらかじめ形質転換した大腸菌ＪＭ１０９に導入し、２％ スキムミルク、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールおよび０．４ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて２３℃で５〜７日培養し、サチライシンのプロテアーゼ活性によってコロニーの周囲に現れるスキムミルク分解を示すクリアーゾーンの大きさから分泌能を測定した。
【００８０】
上記スクリーニングの結果、プライマーＡＬ−ＦおよびＥ５２−Ｒの組み合わせによって作製した約４，５００クローンの中から野生型に比べ分泌活性の高い変異株を２株（ＡＥ１０４株，ＡＥ１２９株）取得した。これら変異株におけるサチライシンの分泌の様子を図４に示した。
【００８１】
続いて、これら変異株におけるサチライシンＥの分泌活性を定量化する試験を行った。すなわち、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。波長６６０ｎｍにおける吸光度が０．２〜０．３となったときにＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭとなるように添加し、２３℃にて４８時間培養した後、上清を回収した。培養上清をＬＢ培地で適宜希釈し、その１００μＬと基質である０．１３ｍＭのＮ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（ＡＡＰＦ；ＳＩＧＭＡ社）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）の溶液とを混合し、３７℃にて２〜６時間静置した後、波長４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度を元に野生株のサチライシン酵素活性を１とした場合のこれら変異株の酵素活性を下記表１に示した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
次に、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株が有する変異型ｈｌｙＢ−Ｄの発現プラスミドを抽出し、ｐＡＥ１０４，ｐＡＥ１２９とした。これら変異型プラスミドについて変異箇所を確かめるため、ＡｐａＬＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片の塩基配列を決定した。その結果、ｐＡＥ１０４では７つの点変異が確認され、うち５箇所でアミノ酸置換が起こっていた。一方、ｐＡＥ１２９では１箇所の点変異によってアミノ酸置換が起こっていた。これらの変異部位を図５および表２に示した。
【００８４】
【表２】
【実施例４】
【００８５】
一本鎖抗体の分泌試験
ＡＥ１０４株、ＡＥ１２９株において任意の融合タンパクの分泌能が向上するかどうかを確かめるため、ヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡと略す）に対する一本鎖抗体（非特許文献９）（ＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖ）をモデルタンパク質として分泌能を調べた。
【００８６】
ＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖ遺伝子は抗ＨＳＡ抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて精製し、リコンビナント抗体発現システムキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてマニュアルに従いｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ部位にＮｏｔＩ部位の下流に位置するＥ ｔａｇとインフレームになるようクローニングした。これをＰＣＲの鋳型とし、ＮｃｏＩ部位を含むセンスプライマー
ＨＳＡ−ＮｃＦ１：５’−ＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号３２）
およびＳａｃＩ部位を含むアンチセンスプライマー
ＨＳＡ−ＳｃＲ１：５’−ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＡＣＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号３３）
を用いてｓｃＦｖ−Ｅ ｔａｇ融合遺伝子を増幅した。これをＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切断後、ｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８のサチライシンＥをコードするＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片と組み換え、ｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とした。
【００８７】
ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤ、ｐＡＥ１０４、もしくはｐＡＥ１２９をそれぞれｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。これら形質転換体をそれぞれ野生型、ＡＥ１０４株、ＡＥ１２９株とし、以下に記すＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性の測定を行った。
【００８８】
上記大腸菌の各クローン（野生型、ＡＥ１０４株、ＡＥ１２９株）をそれぞれ培養し、波長６６０ｎｍにおける吸光度が０．２〜０．３となったときにＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭとなるように添加し、３７℃または３０℃で５時間、もしくは２３℃にて２４時間培養した後、上清を回収し、以下に示すＥＬＩＳＡを行った。
【００８９】
ヒト血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社）を１０μｇ／ｍＬとなるよう０．１Ｎ ＮａＨＣＯ３に溶解し、９６ウェルのマキシソーププレート（ＮａｌｇｅＮｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩吸着させた。プレートを逆さにし溶液を除いた後、２％スキムミルクを含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を２００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以下ＴＢＳ−Ｔとする）でプレートを３回洗浄した後、ＬＢ培地で適宜希釈した培養上清を１００μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄したのち、マレイミド法（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ Ｐ ａｎｄ Ｐａｒｉｋｈ Ｉ．Ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ ｆｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｕｓｅ ｏｆ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１１，２２９１−２２９９，１９７２）によりアルカリフォスファターゼ標識した抗Ｅ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の２０００倍希釈液を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて基質液を１００μＬ／ウェル加え、室温で５分間発色反応を行った。最後に０．４Ｎ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加え反応を停止させた後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、濃度測定のスタンダードとしては大腸菌により発現、精製したＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖ抗体を用いた。
【００９０】
ＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。野生型は温度の低下と共にｓｃＦｖの分泌量が著しく低下した。ＡＥ１２９株も同様に温度の低下と共に分泌量が低下したが、野生型と比べて２３℃および３０℃での分泌活性はそれぞれ７倍および３．５倍高かった。一方、ＡＥ１０４株は３７℃では野生型に比べ分泌活性が低いものの、２３℃および３０℃での分泌活性はそれぞれ４０倍および４．１倍高いことが確認された。
【００９１】
以上より、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株が有する変異は少なくとも２３℃から３０℃の範囲において任意のＨｌｙＡ融合タンパクの発現を向上させるものであると言える。
【実施例５】
【００９２】
他の大腸菌株における一本鎖抗体の分泌試験
上記変異が示す表現型が大腸菌ＪＭ１０９のみならず他の菌株においても普遍的に見られるかどうかを確かめるため、例として大腸菌ＨＢ２１５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて一本鎖抗体の分泌試験を行った。
【００９３】
ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤ、ｐＡＥ１０４、もしくはｐＡＥ１２９をそれぞれｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＨＢ２１５１に導入し、上記〔実施例４〕と同様にＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌を行った。その結果、下記［表３］に示すように２３℃において野生型に比べＡＥ１０４株では２５倍、ＡＥ１２９株では１１倍、３０℃においてＡＥ１０４株は野生型の３．７倍、ＡＥ１２９株は２．３倍分泌活性が高いことが確認された。したがって、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株が有する変異は任意の大腸菌においてＨｌｙＡ融合タンパクの発現を向上させるものであると言える。
【００９４】
【表３】
【実施例６】
【００９５】
ＡＥ１０４株における分泌向上に必要な変異部位の決定
ＡＥ１０４株において分泌能の向上に関わるアミノ酸残基を同定するため、組換えによりｐＡＥ１０４Ａを、後述する部位特異的変異法により変異型プラスミドｐＡＥ１０４Ｂ，ｐＡＥ１０４Ｃ，ｐＡＥ１０４ＤおよびｐＡＥ１０４Ｅを作製した。これら変異型プラスミドの変異箇所を図７に示した。
ｐＡＥ１０４ＡについてはｐＡＥ１０４のＢｓｐＨＩ−ＳｐｈＩ断片（１８２９ｂｐ）をｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤの同部位に組み込み、作製した。
【００９６】
部位特異的変異はＩｍａｉらの方法（非特許文献１０）に従いＰＣＲにより行った。ＰＣＲの鋳型にはｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤのＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片（１２４７ｂｐ）をｐＧＥＭ５Ｚ−ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の同部位に組み込んだプラスミドｐＧＥＭ−ＮｄＥ５２（図８）を２ｎｇ用いた。ｐＡＥ１０４Ｂ，ｐＡＥ１０４Ｃ，ｐＡＥ１０４ＤおよびｐＡＥ１０４Ｅの作製に用いたプライマーの組み合わせはそれぞれＢＤ１８１４−３７（配列番号３４）−ＢＤ１８１３−１７９１（配列番号３５），ＢＤ２０５０−７５（配列番号３６）−ＢＤ２０４９−２０（配列番号３７），ＢＤ２１１９−４９（配列番号３８）−ＢＤ２１１８−０８４（配列番号３９）およびＢＤ２２６８−４２（配列番号４０）−ＢＤ２２６９−９４（配列番号４１）である。以下に配列を示す。
【００９７】
プライマー一覧
ＢＤ１８１４−３７：５’−ＧＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＧＴ−３’（配列番号３４）
ＢＤ１８１３−１７９１：５’−ＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴ−３’（配列番号３５）
ＢＤ２０５０−７５：５’−ＴＧＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３６）
ＢＤ２０４９−２０：５’−ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＴＧ−３’（配列番号３７）
ＢＤ２１１９−４９：５’−ＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧ−３’（配列番号３８）
ＢＤ２１１８−０８４：５’−ＴＧＴＡＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＴＣＣＧＧ−３’（配列番号３９）
ＢＤ２２６８−４２：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＣＣ−３’（配列番号４０）
ＢＤ２２６９−９４：５’−ＣＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＴＣＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＧ−３’（配列番号４１）
【００９８】
ＰＣＲ反応は９５℃２分ののち、９５℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃４分３０秒を２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供しＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、付属の溶出バッファ（ＥＢ）４５μｌで溶出した。このうち１μｌを用いてＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）に付属の２ｘバッファ５μｌとＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ０．５μｌ、さらにＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）０．５μｌの存在下、反応系１０μｌで３７℃、３０分間カイネーションとライゲーションを同時に行った。反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドを回収したのち、変異箇所を含むＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片の塩基配列を確認した。続いてＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片を切り出し精製したのち、ｐＡＥ１０４のＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ部位に移し替え、変異型プラスミドを作製した。
【００９９】
ｐＡＥ１０４Ａ，ｐＡＥ１０４Ｂ，ｐＡＥ１０４Ｃ，ｐＡＥ１０４ＤおよびｐＡＥ１０４ＥをそれぞれｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。これら形質転換体をそれぞれＡＥ１０４Ａ，ＡＥ１０４Ｂ，ＡＥ１０４Ｃ，ＡＥ１０４ＤならびにＡＥ１２９株とし、上記〔実施例４〕と同様にＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性を測定した。図９はＡＥ１０４株における分泌活性を１００％とした場合の各変異体における相対値を示したものである。図９に示すようにＡＥ１０４Ａ株のみ野生型と同レベルまで活性が下がり、ＡＥ１０４Ｂ株，ＡＥ１０４Ｃ株，ＡＥ１０４Ｄ株およびＡＥ１０４Ｅ株はＡＥ１０４株と同等の活性を保っていることが確認された。以上のことから、ＨｌｙＢのＮ末端から４４８番目のロイシンのフェニルアラニンへの置換が高分泌活性に重要であることが示唆された。
【０１００】
次に、ＡＥ１０４株における変異型ＨｌｙＢのＮ末端から４４８番目のフェニルアラニンが高分泌活性に重要であることを確認するため、このフェニルアラニンが唯一の変異アミノ酸である変異型プラスミドｐＡＥ１０４Ｆを、ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤのＢｓｐＨＩ−ＳｐｈＩ断片（１８２９ｂｐ）をｐＡＥ１０４の同部位に組み込むことによって作製した。
【０１０１】
ｐＡＥ１０４ＦをｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。この形質転換体をＡＥ１０４Ｆとし、上記実施例４と同様にＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性を測定した。その結果、図９に示すようにＡＥ１０４Ｆ株におけるＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性はＡＥ１０４株と同等レベルであったことから、ＡＥ１０４株においては変異型ＨｌｙＢのＮ末端から４４８番目のフェニルアラニンが分泌活性に重要なアミノ酸残基であることが確かめられた。
【実施例７】
【０１０２】
ＡＥ１０４Ｆ株における至適培養温度の検討
ＡＥ１０４Ｆ株についてタンパク質発現の至適温度を確かめるため、１９℃、２３℃および２７℃におけるＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌量を上記〔実施例４〕と同様に測定した。比較コントロールとして、ＡＥ１０４株を用いた。波長６６０ｎｍにおける吸光度から１９℃では４１時間、２３℃では２４時間、２７℃では１７時間後において増殖は定常期の状態であった。図１０に示すように、ＡＥ１０４株，ＡＥ１０４Ｆ株ともに２３℃と２７℃では同等の発現レベルを示した一方、１９℃では発現レベルは明らかに低下した。これらの結果と上記〔実施例４〕に示した結果から、ＡＥ１０４Ｆ株を用いたＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの発現の至適温度帯は２３℃から２７℃であると言える。
【実施例８】
【０１０３】
ＡＥ１０４Ｆを用いた細胞内蛋白の発現効果
細胞外蛋白のみならず細胞内蛋白質がＡＥ１０４Ｆにおいて効率的に分泌されるかどうかを確かめるため、例としてヒト由来のがん遺伝子ｃ−Ｍｙｃ（配列番号４８／ＧｅｎｅＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｖ００５６８）およびがん抑制遺伝子ＰＴＥＮ（配列番号４９／ＧｅｎｅＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ０００３１４）についてｐＡＥ１０４Ｆを用いて低温での分泌試験を行った。ＨｌｙＡシグナルを付加したｃ−ＭｙｃおよびＰＴＥＮの発現ベクターについては以下に示すように構築を行った。すなわち、ｃ−Ｍｙｃについては当該遺伝子を有するｃＤＮＡ断片を用いてＮｃｏＩ部位を含むセンスプライマー
Ｍｙｃ−ＮｃＦ：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡ−３’（配列番号４４）
およびＮｏｔＩ部位を含むアンチセンスプライマー
Ｍｙｃ−ＮｔＲ：５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＧＡＧＴＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＴ−３’（配列番号４５）
を用いてＰＣＲを行い、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断後、Ｅ ｔａｇを挟んだ融合遺伝子となるようｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８のＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖをコードするＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片と組み換え、ｐＭｙｃ−ＨｌｙＡ２１８を作製した。ｐＭｙｃ−ＨｌｙＡ２１８において、発現するタンパク質はｃ−Ｍｙｃ−Ｅ ｔａｇ−ＨｌｙＡ２１８の融合タンパク質である。ＰＴＥＮに関してもｃ−Ｍｙｃと同様に当該遺伝子を有するｃＤＮＡ断片を用いてＮｃｏＩ部位を含むセンスプライマー
ＰＴＥＮ−ＮｃＦ：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＴ−３’（配列番号４６）
およびＮｏｔＩ部位を含むアンチセンスプライマー
ＰＴＥＮ−ＮｔＲ：５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号４７）
を用いてＰＣＲを行い、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断後、ｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８のＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖをコードするＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片と組み換え、ｐＰＴＥＮ−ＨｌｙＡ２１８を作製した。
【０１０４】
ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤもしくはｐＡＥ１０４ＦをｐＭｙｃ−ＨｌｙＡ２１８もしくはｐＰＴＥＮ−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。これら形質転換体を３７℃で培養し、波長６６０ｎｍにおける吸光度が０．２〜０．３となったときにＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭとなるよう添加し、３７℃で５時間、もしくは２３℃で２４時間培養した後、４／１０００ＯＤ６６０ユニット相当の上清を用いて常法に従いウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングの１次抗体には抗Ｅ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の２０００倍希釈液を、２次抗体にはＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＺＹＭＥＤ社）の１０００倍希釈液を使用した。検出にはＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ Ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を使用した。
【０１０５】
結果を図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）に示す。ｃ−Ｍｙｃに関しては野生型では２３℃および３７℃ともに検出できず、可溶性蛋白として培地中に分泌されていないことが示唆された。一方、ＡＥ１０４Ｆでは２３℃において培地中に検出できたことから、ＡＥ１０４Ｆを用いたｃ−Ｍｙｃの低温での発現が有効であることが確認された。ＰＴＥＮに関しては野生型では３７℃においてのみ検出されたが、分泌レベルは低かった。ＡＥ１０４Ｆでは２３℃において３７℃における野生型の発現レベルと同等以上であったが、３７℃において僅かに分解物が見られるものの多量の分泌が確認された。したがって、ＰＴＥＮの場合は３７℃で発現させることで分泌効率を高めることができる。以上の結果から、細胞内蛋白もＡＥ１０４Ｆによって効率的に分泌できることがわかった。また、蛋白質の種類によっては３７℃でより効率的な分泌発現を行えることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野において組換体微生物により組換えタンパク質を調製するために有用な分泌産生システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、宿主として大腸菌を用いた外来の異種タンパク質（以下、目的タンパク質という）の生産方法には、菌体内発現法と分泌発現法とがある。
【０００３】
前者の菌体内発現法は、目的タンパク質の構造遺伝子を挿入した組換え発現ベクターをバクテリア等の宿主細胞内に導入し、目的タンパク質を発現、蓄積させ、その後菌体を回収、溶解し、得られた菌体の粗抽出液から目的タンパク質を精製する方法である。この菌体内発現法では、一般的に目的タンパク質の生産効率は高いが、発現させたタンパク質が凝集して菌体内で不溶化しやすい為に、目的タンパク質の回収後に可溶化してリホールディングさせる操作や、菌体内の他のタンパク質（プロテアーゼや他の夾雑物）を分離する操作を必要とし、天然における正しい立体構造をもった目的タンパク質、即ち本来の活性を有するネイティブな構造を持った目的タンパク質を得るためには、大変な手間がかかる。また、可溶化操作などの精製処理において、発現した目的タンパク質を１００パーセントの確率でネイティブな構造にリホールディングさせる事は通常、不可能である。そのため、菌体内における目的タンパク質の発現量に比べ、精製等の処理によって最終的に回収されるネイティブ構造の目的タンパク質量がかなり少ない場合も多々ある。時には、目的タンパク質の生産効率が低いと云われている分泌発現法と対比して、最終的な回収効率が同等か、それ以下という場合もある。
【０００４】
また、当該菌体内発現法は、成熟型タンパク質のＮ末端にメチオニン残基が付加される場合が多々ある。この場合、前記Ｎ末端にメチオニン残基が無いタンパク質を得るためには、Ｎ末端のメチオニン残基を人為的にペプチダーゼで切断する操作が要求されることもある。
【０００５】
このように菌体内発現法は、一連の処理操作が煩雑で時間が掛る割には、ネイティブな構造の目的タンパク質の回収率が悪く、近年、目的タンパク質の大量生産には向かないとされている。
【０００６】
そこで、近年、これら菌体内発現法の問題解決手段として、分泌発現法が注目されている。この分泌発現法においては、発現された目的タンパク質がペリプラズム層又は菌体外へ分泌されるので、上記した菌体内発現法に比べて目的タンパク質の精製が簡便であるという利点がある。特に、菌体外へ分泌される系では、培養液のみを回収し濃縮することによって、目的タンパク質を比較的簡単に回収することができるので、目的タンパクの精製がより簡便になっている。
【０００７】
この分泌発現法は、更に、目的タンパク質をネイティブな構造で生産できる可能性が高い点、及び培養上清中にプロテアーゼや他の夾雑物が少なく精製が容易である点において、目的タンパク質の生産方法として注目されている。
【０００８】
この分泌発現法は、菌体外又はペリプラズム層へ分泌させるために、「シグナル配列」を目的タンパク質と融合させて発現させるベクターを用いることを特徴とする。前記シグナル配列としては、例えば、溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）のＣ末端配列（以下、ＨｌｙＡシグナル配列という場合もある）、エンテロトキシン（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）の発現に関与しているＡサブユニットとＢサブユニットのＮ末端配列、ＯｍｐＡシグナル配列、ＯｍｐＦシグナル配列、ＰｈｏＡシグナル配列等が挙げられる（非特許文献１）。因みに、組換えベクターとしては、ＣｏｌＥ１オリジンをもつｐＢＲ３２２誘導体等の一般的に用いられるプラスミド由来の組換え発現ベクター等が用いられている。
【０００９】
先に列挙したシグナル配列の中でも、特にＨｌｙＡシグナル配列を用いた分泌生産方法は、基本的にＨｌｙＡシグナル配列に結合する目的タンパク質の大きさに依存せず、分泌の過程で適切なＳ−Ｓ結合を形成させることができることから、目的タンパク質をネイティブな構造で可溶性画分中に発現することが出来る分泌発現系として非常に有用と考えられている。
【００１０】
このＨｌｙＡシグナル配列を用いた分泌生産方法は、元々、尿路病原性大腸菌が産生する溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の分泌に使われるグラム陰性菌Ｔｙｐｅ Ｉ分泌システム（非特許文献２参照）を利用したものであり、シグナル配列を含むＨｌｙＡ、ＨｌｙＡの菌体外輸送に関わるアデノシントリホスタファーゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するタンパク質ＨｌｙＢ、ペリプラズムタンパク質ＨｌｙＤ、および外膜タンパク質ＴｏｌＣを必要とするが、グラム陰性菌における一般的なペリプラズムタンパク質の分泌に関わるＳｅｃ経路は必要としない。ＨｌｙＡのＣ末端の約６０位から２１８位までのアミノ酸は分泌シグナルを形成しており、それ自体の毒性がないことから、外来タンパク質と融合させ菌体外へ分泌させる例がいくつか報告されている（非特許文献３、４参照）。
【００１１】
ところで、分泌発現法においては、より効率的な分泌生産が可能な宿主株の検討も盛んに行われており、中でもグラム陽性菌の枯草菌は、タンパク質の分泌能が高く、各種産業用酵素の供給源として利用されている。しかしながら、枯草菌は多種多様なプロテアーゼを有するという問題がある。このため、宿主株自体の改良が必要であり、種々研究・開発が行われている。しかしながら問題が十分に解消した宿主株は未だ得られていないのが現状である。
【非特許文献１】ステーダー・ジェイ・エーら（Ｓｔａｄｅｒ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１８５：１６６−８７，１９９０
【非特許文献２】ジェンチェフ・アイら（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．トレンズ・イン・マイクロバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１０：３９−４５，２００２
【非特許文献３】ツシャッシェル・ビー・ディーら（Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ Ｂ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，）Ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ ＩＩｅＢ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｙ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ．ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１４：７６５−９，１９９６．
【非特許文献４】シェルボー・シーら（Ｃｈｅｒｖａｕｘ Ｃ．ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐａｔｈｗａｙ．モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．）２４９：２３７−４５，１９９５．
【非特許文献５】ブライト・エムエーら（Ｂｌｉｇｈｔ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４６８−７４，１９９４
【非特許文献６】ゲンチェフ・アイら（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：３９−４５，２００２
【非特許文献７】ヘス・ジェイら（Ｈｅｓｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｒｉｎｅ ｌｉｓｔｅｒｉｏｓｉｓ ｂｙ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｔｈａｔ ｓｅｃｒｅｔｅｓ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｓｏｍａｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９９７ Ａｐｒ；６５（４）：１２８６−９２．
【非特許文献８】スプレング・エスら（Ｓｐｒｅｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；３１（５）：１５９６−８
【非特許文献９】ハツソン・ジェイ・エスら（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．，）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８５：５８７９−８３，１９８８、Ｗｈｉｔｌｏｗ Ｍ ａｎｄ Ｆｉｌｐｕｌａ Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２，９７
【非特許文献１０】イマイら（Ｉｍａｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ，）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２７８５，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記した大腸菌を用いた分泌発現法では、最適培養温度である３７℃で菌体を培養することにより、菌体が持つ目的タンパク質の発現能及び分泌能を最大限引き出し、目的タンパク質を分泌生産させる。しかしながら、およそ３０℃以下の低温で菌体を培養した場合、目的タンパク質の発現能は低下し、分泌能の効率も著しく悪く、菌体内発現法で生産させる場合に比べて著しく生産効率が低い。従って、既存の分泌発現系は、低温下でのタンパク質の大量生産に適切であるとは言えない。
【００１３】
即ち、既存の分泌発現法は、たとえ菌体を最適な培養温度（大腸菌においては３７℃）で培養しても、菌体内発現法に比べて遺伝子の発現効率が悪く、生産効率が低いことが多い。従って、場合によっては、目的タンパク質の大量生産に適切な手法であるとは言えず、例えば、ヘモリシンの発現に機能しているＨｌｙＡを用いた分泌発現系でも、これまでの報告ではペリプラズム分泌系と同等の産生レベル（総蛋白の２−５％）であり、菌体内発現系と比較して発現量が絶対的に少なかった（非特許文献５）。
【００１４】
また、例え発現効率自体は低くても、発現させた目的タンパク質が可溶性画分に回収できればメリットはあるが、従来の方法ではおよそ３０℃以下の低温で培養した場合には、３７℃で培養した場合に比べ、更に分泌の効率が低下する。つまり、目的タンパク質を可溶性画分中に回収する目的で、菌体をおよそ３０℃以下の低温で培養し分泌発現を促す場合、発現及び分泌レベルは共に著しく低下する。
【００１５】
一方で、タンパク質の調製法として、３０℃以下の低温で発現させる方法も一般的に行われている。この理由の１つとしては、菌体内における目的タンパク質の発現効率を敢えて下げることにより、目的タンパク質を含む封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の発生を抑制することが出来るからである。即ち、ネイティブな構造の目的タンパク質を、可溶化区分において回収できる。また他の理由としては、低温で発現させることにより、宿主由来のタンパク質の生合成も抑制され、プロテアーゼ活性も低下するため、目的タンパク質を高効率で得ることが期待できるからである。このような理由から、およそ３０℃以下の低温でも高効率で目的タンパク質を産生可能な分泌生産システムが求められている。
【００１６】
本願発明の目的は、既存の分泌発現法と対比して、低温の培養温度でも目的タンパク質を高い効率で産生させることができる、タンパク質の分泌系生産システムを提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、宿主としてグラム陰性菌、特に大腸菌を用いたＨｌｙＡ分泌システムにおいて、低温で分泌能が向上する新規の変異タンパク質ＨｌｙＢ’を用いることにより、低温培養において目的タンパク質の分泌を高効率にて実現するシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上述のような課題を解決するために、鋭意研究を行った結果、尿路病原性大腸菌が産生する溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の分泌に使われるグラム陰性菌Ｔｙｐｅ Ｉ分泌システム（非特許文献６）を改変することにより、低温培養において目的タンパク質の分泌を高効率に実現するシステムが得られることを見出し、本願発明を完成した。
【００１９】
即ち、本発明は、以下に挙げる技術を提供する：
（１）配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列；又は
配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加され尚且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００２０】
（２）前記のＡＴＰａｓｅ活性が、α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の蛋白輸送に関わるアデノシントリホスファターゼ活性である（１）に記載のタンパク質。
【００２１】
（３）前記欠失、挿入、置換若しくは付加が、配列番号５０に示されるアミノ酸配列の、アミノ酸番号４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における欠失、挿入、置換又は付加である、（１）に記載のタンパク質。
【００２２】
（４）（１）乃至（３）の何れか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【００２３】
（５）配列番号４若しくは配列番号５に示される塩基配列、又はこれらの塩基配列がコードするアミノ酸配列と同一のアミノ酸をコードする塩基配列を含む遺伝子。
【００２４】
（６）（４）又は（５）に記載の遺伝子が、所定の宿主において発現可能に挿入された発現ベクター。
【００２５】
（７）プロモーター配列；及び当該プロモーター配列の制御下に、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む、（６）に記載の発現ベクター。
【００２６】
（８）前記プロモーターと同一又は別種類のプロモーター制御下の領域であって、前記の目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列をコードする塩基配列の挿入部位とは別個の部位に、（４）に記載の遺伝子を発現可能なように挿入した、（７）に記載の発現ベクター。。
【００２７】
（９）更に、配列番号１９に記載の塩基配列、又は配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、（６）〜（８）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００２８】
（１０）配列番号１８のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加され、尚且つ宿主内で発現後ペリプラズムに移行して、変異タンパク質ＨｌｙＢ’、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質とともに、ＨｌｙＡシグナル配列が融合した目的タンパク質を菌体外に輸送する輸送孔を形成するタンパク質（当該輸送孔を形成する機能を有するアミノ酸配列）をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、（６）〜（８）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００２９】
（１１）前記プロモーターが、トリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターとの雑種プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターからなる群より選択されるいずれか１種のプロモーターである、（７）〜（１０）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００３０】
（１２）前記ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片が、配列番号３に示されるアミノ酸配列の６０〜２１８番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含み、尚且つ目的タンパク質をコードする塩基配列の３’側に付加されている、（７）〜（１１）の何れか一つ記載の発現ベクター。
【００３１】
（１３）前記の発現ベクターが、プラスミドベクター、又はファージベクターである、（６）〜（１２）の何れか一つに記載の発現ベクター。
【００３２】
（１４）（６）に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
（６）に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列並びにタンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
（６）に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターと、タンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
（６）乃至（１３）の何れか一項に記載の発現ベクターの群から選択されるいずれか一つの発現ベクター又は発現ベクターの組合わせ
を宿主に導入してなる、形質転換体。
【００３３】
（１５）前記宿主がグラム陰性菌である、（１４）に記載の形質転換体。
【００３４】
（１６）（１４）に記載の形質転換体を所定の条件で培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
【００３５】
（１７）更に、前記培養工程後の培養液より宿主細胞を除去する工程；及び適宜、宿主細胞除去後の培養液からタンパク質を精製する工程；を有する、（１６）に記載のタンパク質の生産方法。
【００３６】
（１８）前記形質転換体を培養する温度が、３０℃以下である、（１６）又は（１７）に記載のタンパク質の生産方法。
【００３７】
（１９）前記形質転換体を培養する温度が、１９℃以上、３０℃以下である、（１６）又は（１７）に記載のタンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【００３８】
本願発明によれば、既存の分泌発現法と対比して、低温の培養温度でもネイティブな構造のタンパク質を効率良く産生する分泌系生産システムを実現することができる。
【００３９】
更に、グラム陰性菌、特に大腸菌を用いたＨｌｙＡ分泌システムにおいて、低温で分泌能が向上する新規の変異タンパク質ＨｌｙＢ’を用いることにより、低温培養において、目的タンパク質を高効率に分泌可能な分泌系生産システムを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤを示す図である。
【図２】ｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８を示す図である。
【図３】Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲに用いた各プライマーの位置関係を示す図である。
【図４】サチライシンＥによるスキムミルク分解を示す図である。
【図５】各変異株における変異箇所を示す図である。
【図６】各変異体におけるＨＳＡ１４−１ｓｃＦｖの分泌量を示す図である。
【図７】各変異株における変異箇所を示す図である。
【図８】ｐＧＥＭ−ＮｄＥ５２の作成を示す図である。
【図９】各変異体におけるＨＳＡ１４−１ｓｃＦｖの分泌活性を示す図である。
【図１０】各温度におけるＨＳＡ１４−１ｓｃＦｖの分泌量を示す図である。
【図１１】ｃ−ｍｙｃ及びＰＴＥＮの分泌を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、ＨｌｙＡの分泌に使われるグラム陰性菌Ｔｙｐｅ Ｉ分泌システム（ＨｌｙＡ分泌システム）を構成するタンパク質ＨｌｙＢの変異タンパク質（以下、本願においては、タンパク質ＨｌｙＢについての変異タンパク質を総称して「変異タンパク質ＨｌｙＢ’」と呼び、これをコードする遺伝子を総称して「変異遺伝子ＨｌｙＢ’」と呼び、そしてこの変異タンパク質ＨｌｙＢ’を発現する菌株を総称して「変異体ＨｌｙＢ’」と呼ぶ）、及び変異タンパク質ＨｌｙＢ’を用いたＨｌｙＡ分泌システムによる目的タンパク質の産生方法である。
【００４２】
変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列；又は配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加され尚且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００４３】
配列番号１に示したアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、野生型タンパク質ＨｌｙＢ（配列番号５０にアミノ酸配列を示す）のＮ末端から４４８番目のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換されたタンパク質である（図７；１０４Ｆ参照）。
【００４４】
配列番号２に示したアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、野生型タンパク質ＨｌｙＢの６５４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）からセリン（Ｓｅｒ）に置換されたタンパク質である（図５；１２９、表２参照）。
【００４５】
また、配列番号１に示したアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’とは、配列番号１に示したアミノ酸配列における４４８位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）以外のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加され、且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有しているタンパク質である。例えば、複数個のアミノ酸が置換された例としては、図７に示したＡＥ１０４（配列番号６）及びＡＥ１０４Ｂ〜１０４Ｄ（配列番号８〜１０）が挙げられる。これらの変異タンパク質は、後述するＨｌｙＡ分泌システムによる目的タンパク質の生産方法において好適に使用することができる。これら具体例の変異タンパク質においては、タンパク質ＨｌｙＢのアミノ酸配列において１〜４個のアミノ酸残基が置換されているが、上記したＡＴＰａｓｅ活性を有している限り、ＡＴＰａｓｅ活性部位以外の部位における変異（欠失、挿入、置換又は付加）、及びＡＴＰａｓｅ活性部位の変異であってＡＴＰａｓｅ活性を保持している変異（欠失、挿入、置換又は付加）の双方が含まれる。また、これらの変異においては、ＡＴＰａｓｅ活性を保持する限り、５個以上のアミノ酸残基の変異（欠失、挿入、置換又は付加）であってもよい。
【００４６】
更に、配列番号２に示したアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質ＨｌｙＢ’とは、配列番号２に示したアミノ酸配列における６５４位のセリン（Ｓｅｒ）以外のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加され、且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有しているペプチドである。この変異タンパク質ＨｌｙＢ’は、上記したＡＴＰａｓｅ活性を有している限り、ＡＴＰａｓｅ活性部位以外の部位における変異（欠失、挿入、置換又は付加）、及びＡＴＰａｓｅ活性部位の変異であってＡＴＰａｓｅ活性を保持している変異（欠失、挿入、置換又は付加）の双方が含まれる。
【００４７】
このような変異タンパク質ＨｌｙＢ’としては、上記のＡＴＰａｓｅ活性がα−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の蛋白輸送に関わるアデノシントリホスファターゼ活性である変異タンパク質ＨｌｙＢ’が挙げられる。具体的には野生型遺伝子ＨｌｙＢのアミノ酸４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における欠失、挿入、置換又は付加を有するものを挙げることができる。より好ましくは、野生型遺伝子ＨｌｙＢのアミノ酸４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における置換を有するものである。
【００４８】
本発明は、上記した変異タンパク質ＨｌｙＢ’のアミノ酸配列をコードする、変異遺伝子ＨｌｙＢ’をも提供する。これら本願発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’の具体的配列は、本発明者らが溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の分泌産生する尿路病原性大腸菌から採取したｈｌｙＢ−ｈｌｙＤオペロン遺伝子に変異を導入して得た変異体の一部をなすものである（例えば配列番号４、１２〜１７）。
【００４９】
本発明の変異タンパク質ＨｌｙＢ’のアミノ酸配列をコードする本発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’の具体的な配列としては例えば配列番号４及び配列番号５に示されるものであるが、これら以外にも、本発明の変異タンパク質ＨｌｙＢ’のアミノ酸配列をコードする、その他の塩基配列を有するものも含まれる。
【００５０】
本発明は、本発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’が、所定の宿主において発現可能に挿入された発現ベクターをも提供する。
【００５１】
上記した発現ベクターは、目的のタンパク質をＨｌｙＡシグナルと連結したものを発現する別個のベクターと、同一の宿主に共形質転換することにより、当該所定タンパク質の効率的な分泌に利用することが可能である。
【００５２】
さらに、本発明の分泌システムは、上記のような共形質転換により構築される分泌システムに限定されるものではない。本願発明の変異遺伝子ＨｌｙＢ’とＨｌｙＡシグナル配列に目的タンパク質を結合した融合タンパク質をコードする塩基配列とを同一発現ベクターに組込み、同発現ベクターを宿主に導入することによっても、目的タンパク質の分泌システムを構築することが可能である。この場合、同一の発現ベクターに組込まれた変異遺伝子ＨｌｙＢ’とＨｌｙＡシグナル配列に目的タンパク質を結合した融合タンパク質をコードする塩基配列とは、同一プロモーター制御下の領域に組込んでもよいし、又は、前記変異遺伝子ＨｌｙＢ’と前記融合タンパク質をコードする塩基配列とをそれぞれ別のプロモーター制御下の領域に組込んでもよい。
【００５３】
ここでプロモーターとしては、グラム陰性菌、特に大腸菌内で外来タンパク質の発現に利用される種々のものを挙げることができる。具体例としてはトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターとの雑種プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターを挙げることができる。
【００５４】
本発明のタンパク質分泌産生システムの一態様においては、上記した本発明の発現ベクターに、更に、配列番号１９に記載の塩基配列、又は配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含めることができる。遺伝子ＨｌｙＤとしては、これらの配列番号１９に記載の塩基配列、及び配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するもの以外にも、配列番号１８のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加され、尚且つグラム陰性菌のペリプラズムに移行して、更に変異タンパク質ＨｌｙＢ’、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質とともに、ＨｌｙＡシグナル配列が融合した目的タンパク質を輸送する輸送孔を形成する機能を有するアミノ酸配列をコードしているものを利用することができる。このような変異としては、例えばタンパク質ＨｌｙＤの４１位のアミノ酸が、フェニルアラニンからチロシンに置換されたものを挙げることができる。
【００５５】
タンパク質ＨｌｙＤを変異タンパク質ＨｌｙＢ’と同一プロモーターにより発現する場合には、変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤとを同一コドン読取り枠で結合したｈｌｙＢ’−ｈｌｙＤオペロンを作成し、同ｈｌｙＢ’−ｈｌｙＤオペロンを発現ベクターのプロモーター制御下に導入する。変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤとを同一の発現ベクターのそれぞれ異ったプロモーター制御下の領域に組込み、変異タンパク質ＨｌｙＢ’とタンパク質ＨｌｙＤとをそれぞれ異なるプロモーターの制御下で発現させることもできる。また、別々のオリジンをもつ発現ベクター上に変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤを別々組み込み、別々に発現させることもできる。更に、変異遺伝子ＨｌｙＢ’と遺伝子ＨｌｙＤとをそれぞれ菌体内のゲノムＤＮＡに挿入（インテグレート）させ、変異タンパク質ＨｌｙＢ’とタンパク質ＨｌｙＤとをそれぞれ発現せることも可能である。勿論、上記したｈｌｙＢ’−ｈｌｙＤオペロンを菌体内のゲノムＤＮＡに挿入（インテグレート）させ、変異タンパク質ＨｌｙＢ’とタンパク質ＨｌｙＤとを発現させてもよい。
【００５６】
本発明の発現ベクターにおいては、上記ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片は、配列番号３に示されるアミノ酸配列のＣ末端６０〜２１８番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含み、尚且つ目的タンパク質をコードする塩基配列の３’側に付加することができる。
【００５７】
上記（６）〜（８）に記載の発現ベクターとしては、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ビブリオ菌、セラチア菌、緑膿菌などのグラム陰性菌の内から選択される菌体内で発現可能なものが使用される。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他サルモネラ菌、赤痢菌、ビブリオ菌、セラチア菌および緑膿菌については、組換えベクターｐＧＤ４が代表的に挙げられる（非特許文献７）。これら組換え発現ベクターのプロモーターとしては、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターの雑種プロモーターや、天然もしくは変異型（ｌａｃＵＶ５）のｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、その他、常に転写活性の高い恒常的に発現しているプロモーターも使用可能である。更に、低温下で発現が誘導されるコールドショックプロモーターや、テトラサイクリン誘導性プロモーター等も好適に利用することができる。
【００５８】
以上に説明した、変異タンパク質ＨｌｙＢ’の発現ベクターを導入した宿主であるグラム陰性菌、特に大腸菌においては、少なくともおよそ３０℃以下の低温下で高い膜輸送能が可能となり、ＨｌｙＡシグナル配列と目的タンパク質との融合タンパク質を菌体内から菌体外へ分泌することができる。
【００５９】
本発明においては、発現・分泌されたＨｌｙＡシグナル配列と目的タンパク質との融合タンパク質を、その精製後において、ＨｌｙＡシグナル配列と目的タンパク質とに切断できるように、ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片の、例えば５’末端と目的タンパク質をコードする構造遺伝子の、例えば３’末端との間にプロテアーゼの認識配列をコードするＤＮＡ断片を介しておくことも可能である。前記認識配列とプロテアーゼは、公知のものを利用すればよい。例えば、認識配列としてＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４２）を付加した場合にはファクターＸａで切断すればよいし、エンテロキナーゼとその認識配列としてＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号４３）を付加した場合にはエンテロキナーゼにより切断すればよい。因みに、ＨｌｙＡシグナル配列は、他のシグナル配列、例えばＯｍｐＡシグナル配列などと同様にタグ配列を付加することもできる。
【００６０】
本発明の発現ベクターを導入する宿主には、上述したようにタンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質を外膜に有するグラム陰性菌を使用することができる。例えば、大腸菌、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＳＬ７２０７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ５４１Ｔｙ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ビブリオ菌（Ｖｉｖｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が好適に使用できる。因みに、上記サルモネラ菌、赤痢菌、ビブリオ菌、セラチア菌及び緑膿菌に関しては、大腸菌のＨｌｙＡ分泌システムが機能することが確認されている（非特許文献８）。更に、より好ましくはおよそ３０℃以下の低温で生育可能なグラム陰性菌を用いる。
【００６１】
なお、上記した宿主への発現ベクターの導入は、種々の公知の方法により実施される。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法などが挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００６２】
本発明は、上記したＨｌｙＢ’（変異タンパク質、変異遺伝子、形質転換体）を利用したＨｌｙＡ分泌システムによるタンパク質生産方法をも提供する。
【００６３】
本発明のタンパク質生産方法においては、ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片の、例えば５’末端に所望の目的タンパク質をコードする構造遺伝子の３’末端を結合したＤＮＡ断片と、変異タンパク質ＨｌｙＢ’をコードする構造遺伝子と、適宜タンパク質ＨｌｙＤをコードする構造遺伝子とを、発現ベクターを介して、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質を外膜に有するグラム陰性菌へ導入することにより、例えばおよそ３０℃以下の低温培養時においても、培地への目的タンパク質の高い分泌能を発揮させ、高い生産効率で目的タンパク質を生産することができる。
【００６４】
本発明のタンパク質の生産方法に於いては、例えば、ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片の５’末端に所望の目的タンパク質をコードする構造遺伝子をインフレーム且つ発現可能に挿入した組換え発現ベクターと、変異タンパク質ＨｌｙＢ’をコードする構造遺伝子及びタンパク質ＨｌｙＤをコードする構造遺伝子とを挿入された組換え発現ベクターとを、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質を外膜に有する宿主細胞へ導入し、これを所定の条件で培養することにより行う。
【００６５】
本発明のタンパク質生産方法においては、変異遺伝子ＨｌｙＢ’が宿主内で発現することにより、１９℃〜３０℃、より好適には２３℃〜３０℃の温度領域において、高いタンパク質の分泌生産能を示す。また、目的タンパク質の種類によっては、当該宿主の通常の培養温度（例えば３７℃）においても、高いタンパク質分泌能を有するものもある（図１１（Ｂ）参照）。
【００６６】
次に発現させた目的タンパク質とＨｌｙＡシグナル配列との融合タンパクの抽出・精製法に関しては、既存のタンパク質抽出・精製法を適応することができる。抽出法としては、培養液を限外ろ過することによって該融合タンパク質を濃縮し、その濃縮液から通常の塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法を適応することができる。精製法としては、上述の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法などの手法を組み合わせて行うことができる。特に該融合タンパクに含まれるＨｌｙＡシグナル配列の一部を認識する抗体を結合させたアフィニティーカラムによって効率的に精製することも可能である。
【００６７】
なお、融合タンパクの形状で精製された該融合タンパク質は、先に述べたように目的タンパク質とＨｌｙＡシグナル配列との間（融合部分）にプロテアーゼの認識配列の部分を予め挿入した場合には、前記認識配列に特異的なプロテアーゼを用いて切断でき、よりネイティブな構造を有する目的タンパク質を得ることが可能である。切断の結果得られる目的タンパク質は、上記の各種クロマトグラフィー法を用いてＨｌｙＡシグナル配列と分離し、さらに精製することが可能である。
【００６８】
なお、上述した本発明にかかるタンパク質の分泌生産システムによれば、既存の分泌発現法と対比して、３０℃以下の培養温度でもネイティブな構造の蛋白質を高い効率で産生させることができる。
【００６９】
宿主細胞として特に、大腸菌等のグラム陰性菌を用いたＨｌｙＡ分泌システムによる分泌発現法においては、ＨｌｙＢ’（変異タンパク質、変異遺伝子、形質転換体）を用いることにより、およそ３０℃以下の温度で培養した場合にネイティブな構造の目的タンパク質を、既存のＨｌｙＡ分泌システムと比べて数倍〜数十倍の高い効率で産生することができる。
【００７０】
また、本発明のタンパク質生産システムによれば、可溶性のタンパク質のみならず、後述するＰＴＥＮのような不溶性のタンパク質もネイティブな構造で生産することができる。
【００７１】
以上には、本発明の好適な実施形態を示したが、本発明の要旨を逸脱することなく、種々の変形変更が可能である。
例えば、宿主であるグラム陰性菌に導入する発現ベクターに、上記ＨｌｙＡシグナル配列を融合した目的タンパク質の発現にかかる発現ベクターと、上記変異タンパク質ＨｌｙＢ’及びタンパク質ＨｌｙＤの発現にかかる発現ベクターとの２種類の発現ベクターに代えて、前記目的タンパク質の発現系と変異タンパク質ＨｌｙＢ’及びタンパク質ＨｌｙＤの発現系とを同時に保持する発現ベクターを作成し導入したグラム陰性菌を使用しても、本発明を好適に実施することができる。
【００７２】
また、例えば大腸菌Ｊ９６株のゲノムＤＮＡ中におけるｈｌｙＡ及びｈｌｙＢ遺伝子をノックアウトした大腸菌株を作成し、該大腸菌株を宿主として使用した場合、上記ＨｌｙＡシグナル配列を融合した目的タンパク質にかかる発現ベクターと、変異タンパク質ＨｌｙＢ’のみを発現可能な発現ベクターとを前記大腸菌株へ導入することにより、本発明を好適に実施できる。勿論、前記目的タンパク質の発現系と変異タンパク質ＨｌｙＢ’の発現系とを同時に保持する発現ベクターを作成し、前記大腸菌株へ導入しても好適に実施することができる。
【実施例１】
【００７３】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
遺伝子のクローニング
ＨｌｙＡのシグナル配列（Ｃ末端２１８アミノ酸、以下ＨｌｙＡ２１８と記す）、サチライシンＥ、ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤをコードする遺伝子断片は全て後述するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。反応系は全て５０μｌとし、ＰＣＲのポリメラーゼはＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。ＰＣＲ反応後、増幅断片を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから切り出し後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片を該当する制限酵素で消化後、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用い精製した。これを同様に制限酵素処理したプラスミドベクターとＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）を用い、室温にて５分間ライゲーションさせた後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンもしくはクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。挿入遺伝子の確認は、各コロニーから培養し調製した組換えプラスミドの一部をそれぞれの組換えに用いた制限酵素で消化し、電気泳動をすることで行った。また、クローニングした遺伝子断片は全てＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、ＡＢＩ３１００シークエンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により塩基配列を確認した。以下、クローニングの手順を個別に示す。
【００７４】
ｈｌｙＢ−ｈｌｙＤ遺伝子断片はｈｌｙＢの開始コドンを除いた５’末端にＢａｍＨＩ部位、ｈｌｙＤの３’末端にＳｐｈＩ部位を持つようにＨＢＢａＦ１プライマー（配列番号２０）およびＨＤＳｐＲプライマー（配列番号２１）を用いて、大腸菌Ｊ９６株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って増幅した。ＰＣＲ反応は、９５℃２分ののち、９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃４分を２５サイクル行った。増幅した遺伝子断片をｐＳＴＶ２８（ＴＡＫＡＲＡ社）のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤを得た（図１）。
【００７５】
サチライシンＥとＨｌｙＡ２１８の融合タンパクの発現ベクターは以下のように構築した。すなわち、サチライシンＥはシグナル配列を含まない２６〜３８１番目のアミノ酸をコードする遺伝子断片を、５’末端（開始コドンＧＴＧから７４番目のＴ）にＮｃｏＩ部位、３’末端にＳａｃＩ部位を持つようにプライマーＳｕｂＮｃＦ（配列番号２２）およびプライマーＳｕｂＸｈＲ（配列番号２３）を用いて枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８；ＥＭＧ５１の染色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は９５℃２分ののち、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を２５サイクル行った。一方、５’末端にＳａｃＩ部位、３’末端にＳａｌＩ部位を持つＨｌｙＡ２１８遺伝子断片をプライマーＨｌｙＡ２１８−ＳｃＦ（配列番号２４）およびプライマーＨＡＳＬＲ（配列番号２５）を用いて大腸菌Ｊ９６株の染色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い増幅した。ＰＣＲ反応はサチライシンＥの場合と同様に行った。これらサチライシンＥおよびＨｌｙＡ２１８の遺伝子断片をＴｒｃＨｉｓ２Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８を得た（図２）。ＰＣＲに使用したプライマーの配列を以下に示す。
【００７６】
プライマー一覧
ＨＢＢａＦ１：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧ−３’（配列番号２０）
ＨＤＳｐＲ：５’−ＴＧＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＣＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２１）
ＳｕｂＮｃＦ：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡ−３’（配列番号２２）
ＳｕｂＸｈＲ：５’−ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＧＴ−３’（配列番号２３）
ＨｌｙＡ２１８−ＳｃＦ：５’−ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号２４）
ＨＡＳＬＲ：５’−ＴＧＡＡＴＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号２５）
【実施例２】
【００７７】
ランダム変異の導入
ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子へのランダム変異の導入は、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によってランダム変異を導入するＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い、付属のマニュアルに従い行った。すなわち、０．５ｎｇから５０ｎｇのｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤを鋳型にして順方向プライマーＢａｍ−Ｆ（配列番号２６）および逆方向プライマーＢｓｐ−Ｒ（配列番号２７）、順方向プライマーＢｓｐ−Ｆ（配列番号２８）および逆方向プライマーＳｐｈ−Ｒ（配列番号２９）、もしくは順方向プライマーＡＬ−Ｆ（配列番号３０）および逆方向プライマーＥ５２−Ｒ（配列番号３１）の組み合わせで、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃１分ののち、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル行った。これらのＰＣＲ産物をそれぞれｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤ内のそれぞれＢａｍＨＩ−ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＨＩ−ＳｐｈＩ、もしくはＡｐａＬＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片と組換えた遺伝子ライブラリーを作製した。使用したプライマーの配列を以下に示す。各プライマーと遺伝子の位置関係を図３に示した。
【００７８】
プライマー一覧
Ｂａｍ−Ｆ：５’−ＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号２６）
Ｂｓｐ−Ｒ：５’−ＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号２７）
Ｂｓｐ−Ｆ：５’−ＧＣＧＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＧＴＧＣＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号２８）
Ｓｐｈ−Ｒ：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２９）
ＡＬ−Ｆ：５’−ＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣ−３’（配列番号３０）
Ｅ５２−Ｒ：５’−ＴＡＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号３１）
【実施例３】
【００７９】
変異体のスクリーニングと変異体の同定
上記実施例２で作成した各遺伝子ライブラリーをそれぞれｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８であらかじめ形質転換した大腸菌ＪＭ１０９に導入し、２％ スキムミルク、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールおよび０．４ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて２３℃で５〜７日培養し、サチライシンのプロテアーゼ活性によってコロニーの周囲に現れるスキムミルク分解を示すクリアーゾーンの大きさから分泌能を測定した。
【００８０】
上記スクリーニングの結果、プライマーＡＬ−ＦおよびＥ５２−Ｒの組み合わせによって作製した約４，５００クローンの中から野生型に比べ分泌活性の高い変異株を２株（ＡＥ１０４株，ＡＥ１２９株）取得した。これら変異株におけるサチライシンの分泌の様子を図４に示した。
【００８１】
続いて、これら変異株におけるサチライシンＥの分泌活性を定量化する試験を行った。すなわち、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株を１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。波長６６０ｎｍにおける吸光度が０．２〜０．３となったときにＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭとなるように添加し、２３℃にて４８時間培養した後、上清を回収した。培養上清をＬＢ培地で適宜希釈し、その１００μＬと基質である０．１３ｍＭのＮ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（ＡＡＰＦ；ＳＩＧＭＡ社）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．５）の溶液とを混合し、３７℃にて２〜６時間静置した後、波長４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度を元に野生株のサチライシン酵素活性を１とした場合のこれら変異株の酵素活性を下記表１に示した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
次に、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株が有する変異型ｈｌｙＢ−Ｄの発現プラスミドを抽出し、ｐＡＥ１０４，ｐＡＥ１２９とした。これら変異型プラスミドについて変異箇所を確かめるため、ＡｐａＬＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片の塩基配列を決定した。その結果、ｐＡＥ１０４では７つの点変異が確認され、うち５箇所でアミノ酸置換が起こっていた。一方、ｐＡＥ１２９では１箇所の点変異によってアミノ酸置換が起こっていた。これらの変異部位を図５および表２に示した。
【００８４】
【表２】
【実施例４】
【００８５】
一本鎖抗体の分泌試験
ＡＥ１０４株、ＡＥ１２９株において任意の融合タンパクの分泌能が向上するかどうかを確かめるため、ヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡと略す）に対する一本鎖抗体（非特許文献９）（ＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖ）をモデルタンパク質として分泌能を調べた。
【００８６】
ＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖ遺伝子は抗ＨＳＡ抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて精製し、リコンビナント抗体発現システムキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてマニュアルに従いｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ部位にＮｏｔＩ部位の下流に位置するＥ ｔａｇとインフレームになるようクローニングした。これをＰＣＲの鋳型とし、ＮｃｏＩ部位を含むセンスプライマー
ＨＳＡ−ＮｃＦ１：５’−ＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号３２）
およびＳａｃＩ部位を含むアンチセンスプライマー
ＨＳＡ−ＳｃＲ１：５’−ＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＡＣＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号３３）
を用いてｓｃＦｖ−Ｅ ｔａｇ融合遺伝子を増幅した。これをＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切断後、ｐＳｕｂ−ＨｌｙＡ２１８のサチライシンＥをコードするＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片と組み換え、ｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とした。
【００８７】
ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤ、ｐＡＥ１０４、もしくはｐＡＥ１２９をそれぞれｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。これら形質転換体をそれぞれ野生型、ＡＥ１０４株、ＡＥ１２９株とし、以下に記すＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性の測定を行った。
【００８８】
上記大腸菌の各クローン（野生型、ＡＥ１０４株、ＡＥ１２９株）をそれぞれ培養し、波長６６０ｎｍにおける吸光度が０．２〜０．３となったときにＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭとなるように添加し、３７℃または３０℃で５時間、もしくは２３℃にて２４時間培養した後、上清を回収し、以下に示すＥＬＩＳＡを行った。
【００８９】
ヒト血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社）を１０μｇ／ｍＬとなるよう０．１Ｎ ＮａＨＣＯ３に溶解し、９６ウェルのマキシソーププレート（ＮａｌｇｅＮｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩吸着させた。プレートを逆さにし溶液を除いた後、２％スキムミルクを含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を２００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以下ＴＢＳ−Ｔとする）でプレートを３回洗浄した後、ＬＢ培地で適宜希釈した培養上清を１００μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄したのち、マレイミド法（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ Ｐ ａｎｄ Ｐａｒｉｋｈ Ｉ．Ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ ｆｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｕｓｅ ｏｆ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１１，２２９１−２２９９，１９７２）によりアルカリフォスファターゼ標識した抗Ｅ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の２０００倍希釈液を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて基質液を１００μＬ／ウェル加え、室温で５分間発色反応を行った。最後に０．４Ｎ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加え反応を停止させた後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、濃度測定のスタンダードとしては大腸菌により発現、精製したＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖ抗体を用いた。
【００９０】
ＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。野生型は温度の低下と共にｓｃＦｖの分泌量が著しく低下した。ＡＥ１２９株も同様に温度の低下と共に分泌量が低下したが、野生型と比べて２３℃および３０℃での分泌活性はそれぞれ７倍および３．５倍高かった。一方、ＡＥ１０４株は３７℃では野生型に比べ分泌活性が低いものの、２３℃および３０℃での分泌活性はそれぞれ４０倍および４．１倍高いことが確認された。
【００９１】
以上より、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株が有する変異は少なくとも２３℃から３０℃の範囲において任意のＨｌｙＡ融合タンパクの発現を向上させるものであると言える。
【実施例５】
【００９２】
他の大腸菌株における一本鎖抗体の分泌試験
上記変異が示す表現型が大腸菌ＪＭ１０９のみならず他の菌株においても普遍的に見られるかどうかを確かめるため、例として大腸菌ＨＢ２１５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて一本鎖抗体の分泌試験を行った。
【００９３】
ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤ、ｐＡＥ１０４、もしくはｐＡＥ１２９をそれぞれｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＨＢ２１５１に導入し、上記〔実施例４〕と同様にＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌を行った。その結果、下記［表３］に示すように２３℃において野生型に比べＡＥ１０４株では２５倍、ＡＥ１２９株では１１倍、３０℃においてＡＥ１０４株は野生型の３．７倍、ＡＥ１２９株は２．３倍分泌活性が高いことが確認された。したがって、ＡＥ１０４株およびＡＥ１２９株が有する変異は任意の大腸菌においてＨｌｙＡ融合タンパクの発現を向上させるものであると言える。
【００９４】
【表３】
【実施例６】
【００９５】
ＡＥ１０４株における分泌向上に必要な変異部位の決定
ＡＥ１０４株において分泌能の向上に関わるアミノ酸残基を同定するため、組換えによりｐＡＥ１０４Ａを、後述する部位特異的変異法により変異型プラスミドｐＡＥ１０４Ｂ，ｐＡＥ１０４Ｃ，ｐＡＥ１０４ＤおよびｐＡＥ１０４Ｅを作製した。これら変異型プラスミドの変異箇所を図７に示した。
ｐＡＥ１０４ＡについてはｐＡＥ１０４のＢｓｐＨＩ−ＳｐｈＩ断片（１８２９ｂｐ）をｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤの同部位に組み込み、作製した。
【００９６】
部位特異的変異はＩｍａｉらの方法（非特許文献１０）に従いＰＣＲにより行った。ＰＣＲの鋳型にはｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤのＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片（１２４７ｂｐ）をｐＧＥＭ５Ｚ−ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の同部位に組み込んだプラスミドｐＧＥＭ−ＮｄＥ５２（図８）を２ｎｇ用いた。ｐＡＥ１０４Ｂ，ｐＡＥ１０４Ｃ，ｐＡＥ１０４ＤおよびｐＡＥ１０４Ｅの作製に用いたプライマーの組み合わせはそれぞれＢＤ１８１４−３７（配列番号３４）−ＢＤ１８１３−１７９１（配列番号３５），ＢＤ２０５０−７５（配列番号３６）−ＢＤ２０４９−２０（配列番号３７），ＢＤ２１１９−４９（配列番号３８）−ＢＤ２１１８−０８４（配列番号３９）およびＢＤ２２６８−４２（配列番号４０）−ＢＤ２２６９−９４（配列番号４１）である。以下に配列を示す。
【００９７】
プライマー一覧
ＢＤ１８１４−３７：５’−ＧＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＧＴ−３’（配列番号３４）
ＢＤ１８１３−１７９１：５’−ＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴ−３’（配列番号３５）
ＢＤ２０５０−７５：５’−ＴＧＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３６）
ＢＤ２０４９−２０：５’−ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＴＧ−３’（配列番号３７）
ＢＤ２１１９−４９：５’−ＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧ−３’（配列番号３８）
ＢＤ２１１８−０８４：５’−ＴＧＴＡＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＴＣＣＧＧ−３’（配列番号３９）
ＢＤ２２６８−４２：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＣＣ−３’（配列番号４０）
ＢＤ２２６９−９４：５’−ＣＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＴＣＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＧ−３’（配列番号４１）
【００９８】
ＰＣＲ反応は９５℃２分ののち、９５℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃４分３０秒を２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供しＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、付属の溶出バッファ（ＥＢ）４５μｌで溶出した。このうち１μｌを用いてＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）に付属の２ｘバッファ５μｌとＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ０．５μｌ、さらにＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）０．５μｌの存在下、反応系１０μｌで３７℃、３０分間カイネーションとライゲーションを同時に行った。反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドを回収したのち、変異箇所を含むＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片の塩基配列を確認した。続いてＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ断片を切り出し精製したのち、ｐＡＥ１０４のＮｄｅＩ−Ｅｃｏ５２Ｉ部位に移し替え、変異型プラスミドを作製した。
【００９９】
ｐＡＥ１０４Ａ，ｐＡＥ１０４Ｂ，ｐＡＥ１０４Ｃ，ｐＡＥ１０４ＤおよびｐＡＥ１０４ＥをそれぞれｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。これら形質転換体をそれぞれＡＥ１０４Ａ，ＡＥ１０４Ｂ，ＡＥ１０４Ｃ，ＡＥ１０４ＤならびにＡＥ１２９株とし、上記〔実施例４〕と同様にＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性を測定した。図９はＡＥ１０４株における分泌活性を１００％とした場合の各変異体における相対値を示したものである。図９に示すようにＡＥ１０４Ａ株のみ野生型と同レベルまで活性が下がり、ＡＥ１０４Ｂ株，ＡＥ１０４Ｃ株，ＡＥ１０４Ｄ株およびＡＥ１０４Ｅ株はＡＥ１０４株と同等の活性を保っていることが確認された。以上のことから、ＨｌｙＢのＮ末端から４４８番目のロイシンのフェニルアラニンへの置換が高分泌活性に重要であることが示唆された。
【０１００】
次に、ＡＥ１０４株における変異型ＨｌｙＢのＮ末端から４４８番目のフェニルアラニンが高分泌活性に重要であることを確認するため、このフェニルアラニンが唯一の変異アミノ酸である変異型プラスミドｐＡＥ１０４Ｆを、ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤのＢｓｐＨＩ−ＳｐｈＩ断片（１８２９ｂｐ）をｐＡＥ１０４の同部位に組み込むことによって作製した。
【０１０１】
ｐＡＥ１０４ＦをｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。この形質転換体をＡＥ１０４Ｆとし、上記実施例４と同様にＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性を測定した。その結果、図９に示すようにＡＥ１０４Ｆ株におけるＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌活性はＡＥ１０４株と同等レベルであったことから、ＡＥ１０４株においては変異型ＨｌｙＢのＮ末端から４４８番目のフェニルアラニンが分泌活性に重要なアミノ酸残基であることが確かめられた。
【実施例７】
【０１０２】
ＡＥ１０４Ｆ株における至適培養温度の検討
ＡＥ１０４Ｆ株についてタンパク質発現の至適温度を確かめるため、１９℃、２３℃および２７℃におけるＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの分泌量を上記〔実施例４〕と同様に測定した。比較コントロールとして、ＡＥ１０４株を用いた。波長６６０ｎｍにおける吸光度から１９℃では４１時間、２３℃では２４時間、２７℃では１７時間後において増殖は定常期の状態であった。図１０に示すように、ＡＥ１０４株，ＡＥ１０４Ｆ株ともに２３℃と２７℃では同等の発現レベルを示した一方、１９℃では発現レベルは明らかに低下した。これらの結果と上記〔実施例４〕に示した結果から、ＡＥ１０４Ｆ株を用いたＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖの発現の至適温度帯は２３℃から２７℃であると言える。
【実施例８】
【０１０３】
ＡＥ１０４Ｆを用いた細胞内蛋白の発現効果
細胞外蛋白のみならず細胞内蛋白質がＡＥ１０４Ｆにおいて効率的に分泌されるかどうかを確かめるため、例としてヒト由来のがん遺伝子ｃ−Ｍｙｃ（配列番号４８／ＧｅｎｅＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｖ００５６８）およびがん抑制遺伝子ＰＴＥＮ（配列番号４９／ＧｅｎｅＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ０００３１４）についてｐＡＥ１０４Ｆを用いて低温での分泌試験を行った。ＨｌｙＡシグナルを付加したｃ−ＭｙｃおよびＰＴＥＮの発現ベクターについては以下に示すように構築を行った。すなわち、ｃ−Ｍｙｃについては当該遺伝子を有するｃＤＮＡ断片を用いてＮｃｏＩ部位を含むセンスプライマー
Ｍｙｃ−ＮｃＦ：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡ−３’（配列番号４４）
およびＮｏｔＩ部位を含むアンチセンスプライマー
Ｍｙｃ−ＮｔＲ：５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＧＡＧＴＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＴ−３’（配列番号４５）
を用いてＰＣＲを行い、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断後、Ｅ ｔａｇを挟んだ融合遺伝子となるようｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８のＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖをコードするＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片と組み換え、ｐＭｙｃ−ＨｌｙＡ２１８を作製した。ｐＭｙｃ−ＨｌｙＡ２１８において、発現するタンパク質はｃ−Ｍｙｃ−Ｅ ｔａｇ−ＨｌｙＡ２１８の融合タンパク質である。ＰＴＥＮに関してもｃ−Ｍｙｃと同様に当該遺伝子を有するｃＤＮＡ断片を用いてＮｃｏＩ部位を含むセンスプライマー
ＰＴＥＮ−ＮｃＦ：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＴ−３’（配列番号４６）
およびＮｏｔＩ部位を含むアンチセンスプライマー
ＰＴＥＮ−ＮｔＲ：５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号４７）
を用いてＰＣＲを行い、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断後、ｐＨＳＡ１４−１−ＨｌｙＡ２１８のＨＳＡ１４−１ ｓｃＦｖをコードするＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片と組み換え、ｐＰＴＥＮ−ＨｌｙＡ２１８を作製した。
【０１０４】
ｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤもしくはｐＡＥ１０４ＦをｐＭｙｃ−ＨｌｙＡ２１８もしくはｐＰＴＥＮ−ＨｌｙＡ２１８とともに大腸菌ＪＭ１０９に導入した。これら形質転換体を３７℃で培養し、波長６６０ｎｍにおける吸光度が０．２〜０．３となったときにＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭとなるよう添加し、３７℃で５時間、もしくは２３℃で２４時間培養した後、４／１０００ＯＤ６６０ユニット相当の上清を用いて常法に従いウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングの１次抗体には抗Ｅ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の２０００倍希釈液を、２次抗体にはＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＺＹＭＥＤ社）の１０００倍希釈液を使用した。検出にはＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ Ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を使用した。
【０１０５】
結果を図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）に示す。ｃ−Ｍｙｃに関しては野生型では２３℃および３７℃ともに検出できず、可溶性蛋白として培地中に分泌されていないことが示唆された。一方、ＡＥ１０４Ｆでは２３℃において培地中に検出できたことから、ＡＥ１０４Ｆを用いたｃ−Ｍｙｃの低温での発現が有効であることが確認された。ＰＴＥＮに関しては野生型では３７℃においてのみ検出されたが、分泌レベルは低かった。ＡＥ１０４Ｆでは２３℃において３７℃における野生型の発現レベルと同等以上であったが、３７℃において僅かに分解物が見られるものの多量の分泌が確認された。したがって、ＰＴＥＮの場合は３７℃で発現させることで分泌効率を高めることができる。以上の結果から、細胞内蛋白もＡＥ１０４Ｆによって効率的に分泌できることがわかった。また、蛋白質の種類によっては３７℃でより効率的な分泌発現を行えることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列；又は配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加され尚且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
前記のＡＴＰａｓｅ活性が、α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の蛋白輸送に関わるアデノシントリホスファターゼ活性である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記欠失、挿入、置換若しくは付加が、配列番号５０に示されるアミノ酸配列の、アミノ酸番号４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における欠失、挿入、置換又は付加である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号４若しくは配列番号５に示される塩基配列、又はこれらの塩基配列がコードするアミノ酸配列と同一のアミノ酸をコードする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の遺伝子が、所定の宿主において発現可能に挿入された発現ベクター。
【請求項７】
プロモーター配列；及び当該プロモーター配列の制御下に、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記プロモーターと同一又は別種類のプロモーター制御下の領域であって、前記の目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列をコードする塩基配列の挿入部位とは別個の部位に、請求項４に記載の遺伝子を発現可能なように挿入した、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
配列番号１９に記載の塩基配列、又は配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、請求項６乃至８の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号１８のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加され、尚且つ宿主内で発現後ペリプラズムに移行して、変異タンパク質ＨｌｙＢ’、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質とともに、ＨｌｙＡシグナル配列が融合した目的タンパク質を菌体外に輸送する輸送孔を形成するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、請求項６乃至８の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが、トリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターとの雑種プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターからなる群より選択される１のプロモーターである、請求項７乃至１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片が、配列番号３に示されるアミノ酸配列の６０〜２１８番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含み、尚且つ目的タンパク質をコードする塩基配列の３’側に付加されている、請求項７乃至１１の何れか一項記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記発現ベクターが、プラスミドベクター、又はファージベクターである、請求項６乃至１２の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項６に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
請求項６に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列並びにタンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
請求項６に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターと、タンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
請求項６乃至１３の何れか一項に記載の発現ベクターの群から選択されるいずれか一つの発現ベクター又は発現ベクターの組合わせ
を宿主に導入してなる、形質転換体。
【請求項１５】
前記宿主がグラム陰性菌である、請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１４に記載の形質転換体を所定の条件で培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
【請求項１７】
前記培養工程後の培養液より宿主細胞を除去する工程；及び
適宜、宿主細胞除去後の培養液からタンパク質を精製する工程；
を有する、請求項１６に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１８】
前記形質転換体を培養する温度が、３０℃以下である、請求項１６又は１７に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１９】
前記形質転換体を培養する温度が、１９℃以上、３０℃以下である、請求項１６又は１７に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列；又は配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加され尚且つアデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
前記のＡＴＰａｓｅ活性が、α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の蛋白輸送に関わるアデノシントリホスファターゼ活性である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記欠失、挿入、置換若しくは付加が、配列番号５０に示されるアミノ酸配列の、アミノ酸番号４４８位、６０４位、６５４位、６８２位、及び７０５位からなる群より選択される少なくとも１の部位における欠失、挿入、置換又は付加である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号４若しくは配列番号５に示される塩基配列、又はこれらの塩基配列がコードするアミノ酸配列と同一のアミノ酸をコードする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の遺伝子が、所定の宿主において発現可能に挿入された発現ベクター。
【請求項７】
プロモーター配列；及び当該プロモーター配列の制御下に、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記プロモーターと同一又は別種類のプロモーター制御下の領域であって、前記の目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列をコードする塩基配列の挿入部位とは別個の部位に、請求項４に記載の遺伝子を発現可能なように挿入した、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
配列番号１９に記載の塩基配列、又は配列番号１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、請求項６乃至８の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号１８のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加され、尚且つ宿主内で発現後ペリプラズムに移行して、変異タンパク質ＨｌｙＢ’、タンパク質ＴｏｌＣ又はＴｏｌＣ様タンパク質とともに、ＨｌｙＡシグナル配列が融合した目的タンパク質を菌体外に輸送する輸送孔を形成するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子ＨｌｙＤを発現可能なように含む、請求項６乃至８の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが、トリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、トリプトファンプロモーターとｌａｃプロモーターとの雑種プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターからなる群より選択される１のプロモーターである、請求項７乃至１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ＨｌｙＡシグナル配列をコードするＤＮＡ断片が、配列番号３に示されるアミノ酸配列の６０〜２１８番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含み、尚且つ目的タンパク質をコードする塩基配列の３’側に付加されている、請求項７乃至１１の何れか一項記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記発現ベクターが、プラスミドベクター、又はファージベクターである、請求項６乃至１２の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項６に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
請求項６に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列並びにタンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
請求項６に記載の発現ベクターと、目的タンパク質及びＨｌｙＡシグナル配列を同一の読み取り枠にコードする塩基配列を含む発現ベクターと、タンパク質ＨｌｙＤをコードする塩基配列を含む発現ベクターとの組合わせ；
請求項６乃至１３の何れか一項に記載の発現ベクターの群から選択されるいずれか一つの発現ベクター又は発現ベクターの組合わせ
を宿主に導入してなる、形質転換体。
【請求項１５】
前記宿主がグラム陰性菌である、請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１４に記載の形質転換体を所定の条件で培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
【請求項１７】
前記培養工程後の培養液より宿主細胞を除去する工程；及び
適宜、宿主細胞除去後の培養液からタンパク質を精製する工程；
を有する、請求項１６に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１８】
前記形質転換体を培養する温度が、３０℃以下である、請求項１６又は１７に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１９】
前記形質転換体を培養する温度が、１９℃以上、３０℃以下である、請求項１６又は１７に記載のタンパク質の生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９８２３
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５６６７（Ｐ２００５−５１５６６７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７２７９
【国際出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【出願人】（３０６００８７２４）富士レビオ株式会社 (55)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７２７９
【国際出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【出願人】（３０６００８７２４）富士レビオ株式会社 (55)
【Ｆターム（参考）】
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