タンパク質の高発現システム
【課題】酵母、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞壁タンパク質遺伝子（ＳＥＤ１）のプロモーター領域をデリーション解析することにより、より強力なプロモーターを構築するタンパク質の高発現システムを提供する。
【解決手段】全長１０６３塩基であったＳＥＤ１プロモーターを８００塩基までデリーションすることにより、プロモーター活性が大幅に増大したプロモーターを提供する。また、８００塩基までデリーションしたＳＥＤ１プロモーターの下流につないだ任意の目的とするタンパク質やその代謝物を、大量に取得することが可能となる融合遺伝子ＤＮＡを提供する。
【解決手段】全長１０６３塩基であったＳＥＤ１プロモーターを８００塩基までデリーションすることにより、プロモーター活性が大幅に増大したプロモーターを提供する。また、８００塩基までデリーションしたＳＥＤ１プロモーターの下流につないだ任意の目的とするタンパク質やその代謝物を、大量に取得することが可能となる融合遺伝子ＤＮＡを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の細胞壁タンパク質をコードするＳＥＤ１遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部をプロモーターとして利用する同種又は異種遺伝子の遺伝子発現システムに関する。さらに詳細には、ＳＥＤ１プロモーターのデリーション解析により、ＳＥＤ１プロモーターのシスエレメントを探索した。本発明は、同種又は異種遺伝子を酵母で培養環境に関わらず大量に発現させるシステムの構築に関するもので、有用タンパク質やその代謝物の安定した高生産を可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子組み換え技術の発展と共に、高等生物の有用タンパク質を大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。ここで大腸菌を宿主としてヒト等の真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖修飾されない等の問題が生じる。一方、酵母は形質転換体の取得が極めて容易で、その培養も安価かつ簡単である。さらに糖鎖修飾も可能なことから、細胞生物学のモデル生物として、また高等真核生物のタンパク質を発現する際の宿主として広く利用されている。また酵母（Saccharomyces cerevisiae）は、パン・清酒・味噌等、発酵食品に深く関与する微生物であり、その産業利用における安全性も非常に高いことが予想される。
【０００３】
酵母を宿主とした時のタンパク質発現用プロモーターとしては、構成的発現を促すＡＤＨ１プロモーターやＰＧＫ１プロモーター、特定成分をトリガーに発現を誘導するＣＵＰ１プロモーター（トリガー成分：銅イオン）ＧＡＬ１プロモーター（トリガー成分：ガラクトース）が、現在使用されている。上記プロモーターは、実験室レベルのごく一般的な培養条件（ＹＰＤ培地等）におけるプロモーター活性は検証されているものの、酵母に様々なストレス（熱・浸透圧・エタノール等）を与え得る産業的培養において十分なプロモーター活性を発揮できるかについてはあまり検討されていない。
【０００４】
そこで、本発明者らは一般的な培養条件でのプロモーター活性はもとより、各種ストレス環境においても安定したプロモーター活性を有する塩基配列を検索することで、酵母を宿主とし有用タンパク質を発現させる際に極めて汎用性の高いプロモーターを開発することにした。
まず本発明者らはＤＮＡマイクロアレイを用いて、清酒醪における酵母の全遺伝子について経時的な発現量を定量し、網羅的なプロモーター検索を実施した。ここでヒットしたプロモーターについて詳細な転写活性を調べる方法としては、対象プロモーターの下流域にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の酵素活性をプロモーター発現の指標とする方法を採用した。そして各種遺伝子のプロモーターについて検討した結果、好適なプロモーターを発見し、さらに研究の結果、遺伝子高発現システムの創製に成功した。
本発明に係る高発現プロモーターを検索するために、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社の酵母用ＤＮＡマイクロアレイ「ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓ」を用いた。具体的には以下の操作を行なった。一般的な配合で仕込んだ清酒醪から経時的に酵母ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを鋳型に放射ラベル化したｃＤＮＡプローブを作製したのち、ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓとハイブリダイズさせた。各遺伝子のスポット強度を定量し、データポイント約３０万点にのぼる酵母遺伝子発現データベースを構築した。
【０００５】
上記データベースを網羅的に検索した結果、発明者らは清酒醪において極めて発現が活発である遺伝子ＳＥＤ１を見出した。ＳＥＤ１は酵母の細胞壁タンパク質をコードする遺伝子である。これは新規知見であり、発現が極めて活発であることからＳＥＤ１の上流域には実用性に富んだ強力なプロモーター活性があるとの新規着想を得たので、その領域について詳細な解析を行なった。その結果、ＳＥＤ１プロモーターには強力なプロモーター活性があることを見出した。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２６５１７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＳＥＤ１プロモーターを改変して、さらに強力なプロモーターを構築することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
プロモーターを改変する手段として、ＳＥＤ１プロモーターのデリーション解析をすることによって、それぞれのプロモーター発現強度を測定し、より強力なプロモーターを構築することとした。以下、発明の内容を詳細に説明する。
まず、プロモーター解析を行うについては、ＳＥＤ１プロモーターの下流域にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプロモーター発現の指標とする方法を採用した。
【０００９】
詳細なプロモーター活性の検討にはプロモーター解析プラスミドｐＲＳ４０６−ｌａｃＺ（図１）を用いた。このプラスミドはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社の酵母シャトルベクターｐＲＳ４０６をベースに、本発明者らが大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を組み込んだものである。ｌａｃＺの上流域（例えばＳｍａＩサイト）にＳＥＤ１プロモーター領域あるいはその一部分を挿入し、構築したプラスミドを清酒酵母 協会７号（本菌株は日本醸造協会から販売されている）の栄養要求性株に形質転換し、導入プラスミドが宿主染色体のｕｒａ３位に１コピー組み込まれた形質転換体を選択した。そしてこれら形質転換体の細胞破砕上清のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。
その結果、ＳＥＤ１プロモーターを−８００塩基まで欠失させた場合、元の−１０６３塩基までのＳＥＤ１プロモーター活性に対して、９時間培養では活性に変化がないが、２４時間培養の場合では、２倍以上のβ−ガラクトシダーゼ活性が得られた。従って、−１０６３塩基から−８００塩基の間に後期抑制因子があると考えられた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、上記のように、−８００塩基まで欠失させるように改変されたＳＥＤ１プロモーター領域を利用することにより、各種遺伝子を効率的に発現することが可能となり、目的とするタンパク質やその代謝物を大量に得ることができる。
【実施例１】
【００１１】
プロモーター領域のデリーション解析
特願２００２−６９１９８（特開２００３−２６５１７７）において、本発明者らはＳＥＤ１プロモーターが強力なプロモーター活性を持つことを明らかにした。本発明において、１０６３塩基のプロモーターのうち、シスエレメントを究明すべく、デリーション解析を行い、より強力なプロモーターを探索することにした。
元のプロモーターの長さが−１０６３塩基までであるＳＥＤ１プロモーターを、それぞれ−８００塩基まで、−６００塩基まで、−４００塩基まで、−２００塩基まで欠失したプロモーターを作成し、前述したプラスミドを構築した。構築したプラスミドを清酒酵母協会７号の栄養要求性株に形質転換し、導入プラスミドが宿主染色体のｕｒａ３位に１コピー組み込まれた形質転換体を選択した。そしてこれら形質転換体の細胞破砕上清のβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。
酵母培養時間９時間、２４時間の時点でそれぞれβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００１２】
【表１】
【００１３】
９時間培養では、−６００塩基までデリーションしても活性はほとんどかわらず、−４００塩基、−２００塩基までデリーションした場合に大幅に減少した。２４時間培養では、−８００塩基までデリーションすることにより、活性が大幅に増大した。しかし、−２００塩基までデリーションすると活性は大きく減少した。このことから、−１０６３塩基から−８００塩基の間に後期抑制因子があり、さらに−６００塩基から−４００塩基の間に前期活性因子があり、さらに−４００塩基から−２００塩基の間に後期活性因子があることが分かった。
【００１４】
これらのことから、９時間培養でも２４時間培養でも活性が最も強かった塩基を−８００までデリーションした改変ＳＥＤ１プロモーター（表１のＰｓｅｄ１（８００））を用いることにより、後期抑制因子を取り除くことができ、培養後期のプロモーター活性を大幅に増大させることができた。
【実施例２】
【００１５】
ジャーファーメンター培養での各プロモーターの活性
元の１０６３塩基のＳＥＤ１プロモーター、及び実施例１で得た８００塩基までデリーションしたＳＥＤ１プロモーターを用いて、実施例１と同じ方法で形質転換体に導入し、ジャーファーメンター培養で、４８時間までの培養を行った。そのβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を測定した。その結果を図２に示す。
【００１６】
その結果、元の１０６３塩基のＳＥＤ１プロモーターでは、２０時間から４８時間まで培養しても、ＬａｃＺ活性はほとんど上がらず、ＬａｃＺ活性は約１００００Ｕ／ｍｌから約１２０００Ｕ／ｍｌになっただけであり、これは後期抑制因子を持っているためと考えられた。それに対して、８００塩基までデリーションしたＳＥＤ１プロモーターでは後期抑制因子がなくなり、ＬａｃＺ活性は２０時間培養で約１００００Ｕ／ｍｌだったのが、４８時間培養後には約３５０００Ｕ／ｍｌにまで上昇し、さらに培養した場合、さらに上昇することが期待された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】プロモーター活性の検討に用いたプロモーター解析プラスミドｐＲＳ４０６−ｌａｃＺを示す図である。
【図２】ジャーファーメンター培養でのβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の細胞壁タンパク質をコードするＳＥＤ１遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部をプロモーターとして利用する同種又は異種遺伝子の遺伝子発現システムに関する。さらに詳細には、ＳＥＤ１プロモーターのデリーション解析により、ＳＥＤ１プロモーターのシスエレメントを探索した。本発明は、同種又は異種遺伝子を酵母で培養環境に関わらず大量に発現させるシステムの構築に関するもので、有用タンパク質やその代謝物の安定した高生産を可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子組み換え技術の発展と共に、高等生物の有用タンパク質を大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。ここで大腸菌を宿主としてヒト等の真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖修飾されない等の問題が生じる。一方、酵母は形質転換体の取得が極めて容易で、その培養も安価かつ簡単である。さらに糖鎖修飾も可能なことから、細胞生物学のモデル生物として、また高等真核生物のタンパク質を発現する際の宿主として広く利用されている。また酵母（Saccharomyces cerevisiae）は、パン・清酒・味噌等、発酵食品に深く関与する微生物であり、その産業利用における安全性も非常に高いことが予想される。
【０００３】
酵母を宿主とした時のタンパク質発現用プロモーターとしては、構成的発現を促すＡＤＨ１プロモーターやＰＧＫ１プロモーター、特定成分をトリガーに発現を誘導するＣＵＰ１プロモーター（トリガー成分：銅イオン）ＧＡＬ１プロモーター（トリガー成分：ガラクトース）が、現在使用されている。上記プロモーターは、実験室レベルのごく一般的な培養条件（ＹＰＤ培地等）におけるプロモーター活性は検証されているものの、酵母に様々なストレス（熱・浸透圧・エタノール等）を与え得る産業的培養において十分なプロモーター活性を発揮できるかについてはあまり検討されていない。
【０００４】
そこで、本発明者らは一般的な培養条件でのプロモーター活性はもとより、各種ストレス環境においても安定したプロモーター活性を有する塩基配列を検索することで、酵母を宿主とし有用タンパク質を発現させる際に極めて汎用性の高いプロモーターを開発することにした。
まず本発明者らはＤＮＡマイクロアレイを用いて、清酒醪における酵母の全遺伝子について経時的な発現量を定量し、網羅的なプロモーター検索を実施した。ここでヒットしたプロモーターについて詳細な転写活性を調べる方法としては、対象プロモーターの下流域にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の酵素活性をプロモーター発現の指標とする方法を採用した。そして各種遺伝子のプロモーターについて検討した結果、好適なプロモーターを発見し、さらに研究の結果、遺伝子高発現システムの創製に成功した。
本発明に係る高発現プロモーターを検索するために、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社の酵母用ＤＮＡマイクロアレイ「ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓ」を用いた。具体的には以下の操作を行なった。一般的な配合で仕込んだ清酒醪から経時的に酵母ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを鋳型に放射ラベル化したｃＤＮＡプローブを作製したのち、ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓとハイブリダイズさせた。各遺伝子のスポット強度を定量し、データポイント約３０万点にのぼる酵母遺伝子発現データベースを構築した。
【０００５】
上記データベースを網羅的に検索した結果、発明者らは清酒醪において極めて発現が活発である遺伝子ＳＥＤ１を見出した。ＳＥＤ１は酵母の細胞壁タンパク質をコードする遺伝子である。これは新規知見であり、発現が極めて活発であることからＳＥＤ１の上流域には実用性に富んだ強力なプロモーター活性があるとの新規着想を得たので、その領域について詳細な解析を行なった。その結果、ＳＥＤ１プロモーターには強力なプロモーター活性があることを見出した。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２６５１７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＳＥＤ１プロモーターを改変して、さらに強力なプロモーターを構築することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
プロモーターを改変する手段として、ＳＥＤ１プロモーターのデリーション解析をすることによって、それぞれのプロモーター発現強度を測定し、より強力なプロモーターを構築することとした。以下、発明の内容を詳細に説明する。
まず、プロモーター解析を行うについては、ＳＥＤ１プロモーターの下流域にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプロモーター発現の指標とする方法を採用した。
【０００９】
詳細なプロモーター活性の検討にはプロモーター解析プラスミドｐＲＳ４０６−ｌａｃＺ（図１）を用いた。このプラスミドはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社の酵母シャトルベクターｐＲＳ４０６をベースに、本発明者らが大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を組み込んだものである。ｌａｃＺの上流域（例えばＳｍａＩサイト）にＳＥＤ１プロモーター領域あるいはその一部分を挿入し、構築したプラスミドを清酒酵母 協会７号（本菌株は日本醸造協会から販売されている）の栄養要求性株に形質転換し、導入プラスミドが宿主染色体のｕｒａ３位に１コピー組み込まれた形質転換体を選択した。そしてこれら形質転換体の細胞破砕上清のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。
その結果、ＳＥＤ１プロモーターを−８００塩基まで欠失させた場合、元の−１０６３塩基までのＳＥＤ１プロモーター活性に対して、９時間培養では活性に変化がないが、２４時間培養の場合では、２倍以上のβ−ガラクトシダーゼ活性が得られた。従って、−１０６３塩基から−８００塩基の間に後期抑制因子があると考えられた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、上記のように、−８００塩基まで欠失させるように改変されたＳＥＤ１プロモーター領域を利用することにより、各種遺伝子を効率的に発現することが可能となり、目的とするタンパク質やその代謝物を大量に得ることができる。
【実施例１】
【００１１】
プロモーター領域のデリーション解析
特願２００２−６９１９８（特開２００３−２６５１７７）において、本発明者らはＳＥＤ１プロモーターが強力なプロモーター活性を持つことを明らかにした。本発明において、１０６３塩基のプロモーターのうち、シスエレメントを究明すべく、デリーション解析を行い、より強力なプロモーターを探索することにした。
元のプロモーターの長さが−１０６３塩基までであるＳＥＤ１プロモーターを、それぞれ−８００塩基まで、−６００塩基まで、−４００塩基まで、−２００塩基まで欠失したプロモーターを作成し、前述したプラスミドを構築した。構築したプラスミドを清酒酵母協会７号の栄養要求性株に形質転換し、導入プラスミドが宿主染色体のｕｒａ３位に１コピー組み込まれた形質転換体を選択した。そしてこれら形質転換体の細胞破砕上清のβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。
酵母培養時間９時間、２４時間の時点でそれぞれβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００１２】
【表１】
【００１３】
９時間培養では、−６００塩基までデリーションしても活性はほとんどかわらず、−４００塩基、−２００塩基までデリーションした場合に大幅に減少した。２４時間培養では、−８００塩基までデリーションすることにより、活性が大幅に増大した。しかし、−２００塩基までデリーションすると活性は大きく減少した。このことから、−１０６３塩基から−８００塩基の間に後期抑制因子があり、さらに−６００塩基から−４００塩基の間に前期活性因子があり、さらに−４００塩基から−２００塩基の間に後期活性因子があることが分かった。
【００１４】
これらのことから、９時間培養でも２４時間培養でも活性が最も強かった塩基を−８００までデリーションした改変ＳＥＤ１プロモーター（表１のＰｓｅｄ１（８００））を用いることにより、後期抑制因子を取り除くことができ、培養後期のプロモーター活性を大幅に増大させることができた。
【実施例２】
【００１５】
ジャーファーメンター培養での各プロモーターの活性
元の１０６３塩基のＳＥＤ１プロモーター、及び実施例１で得た８００塩基までデリーションしたＳＥＤ１プロモーターを用いて、実施例１と同じ方法で形質転換体に導入し、ジャーファーメンター培養で、４８時間までの培養を行った。そのβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を測定した。その結果を図２に示す。
【００１６】
その結果、元の１０６３塩基のＳＥＤ１プロモーターでは、２０時間から４８時間まで培養しても、ＬａｃＺ活性はほとんど上がらず、ＬａｃＺ活性は約１００００Ｕ／ｍｌから約１２０００Ｕ／ｍｌになっただけであり、これは後期抑制因子を持っているためと考えられた。それに対して、８００塩基までデリーションしたＳＥＤ１プロモーターでは後期抑制因子がなくなり、ＬａｃＺ活性は２０時間培養で約１００００Ｕ／ｍｌだったのが、４８時間培養後には約３５０００Ｕ／ｍｌにまで上昇し、さらに培養した場合、さらに上昇することが期待された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】プロモーター活性の検討に用いたプロモーター解析プラスミドｐＲＳ４０６−ｌａｃＺを示す図である。
【図２】ジャーファーメンター培養でのβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項３】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁タンパク質をコードするＳＥＤ１遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部をプロモーターとし、その下流に有用タンパク質遺伝子コード領域を遺伝子操作により結合せしめること、を特徴とする有用タンパク質遺伝子を高発現する融合遺伝子ＤＮＡを製造する方法
【請求項４】
プロモーターとして請求項１〜２のいずれか１項に記載のＤＮＡ又はプロモーターを使用すること、を特徴とする請求項３に記載の方法
【請求項５】
請求項３〜４のいずれか１項に記載の方法で製造してなる、有用タンパク質遺伝子を高発現する融合遺伝子のＤＮＡ
【請求項６】
請求項４に記載のＤＮＡを含んでなる組み換えプラスミドを酵母に移入してなる形質転換体
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とする有用タンパク質遺伝子の高発現方法
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項３】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁タンパク質をコードするＳＥＤ１遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部をプロモーターとし、その下流に有用タンパク質遺伝子コード領域を遺伝子操作により結合せしめること、を特徴とする有用タンパク質遺伝子を高発現する融合遺伝子ＤＮＡを製造する方法
【請求項４】
プロモーターとして請求項１〜２のいずれか１項に記載のＤＮＡ又はプロモーターを使用すること、を特徴とする請求項３に記載の方法
【請求項５】
請求項３〜４のいずれか１項に記載の方法で製造してなる、有用タンパク質遺伝子を高発現する融合遺伝子のＤＮＡ
【請求項６】
請求項４に記載のＤＮＡを含んでなる組み換えプラスミドを酵母に移入してなる形質転換体
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とする有用タンパク質遺伝子の高発現方法
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２０５３８（Ｐ２００７−２０５３８Ａ）
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２１１４５４（Ｐ２００５−２１１４５４）
【出願日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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