タンパク質断片の相補性アッセイのための蛍光タンパク質断片
【課題】蛍光タンパク質に基づくタンパク質断片の相補性アッセイ（ＰＣＡ）に適した性質を有する変異蛍光タンパク質を提供する。
【解決手段】蛍光タンパク質を切断するための方法、およびＰＣＡに望ましいスペクトル特性を有する突然変異断片を発生させるための方法。エクオレア、アネモニアおよびアントゾア種からの蛍光タンパク質に基づくアッセイおよび組成物。野生型タンパク質に比べて改善されたスペクトル的性質を有する突然変異の蛍光タンパク質の断片。
【解決手段】蛍光タンパク質を切断するための方法、およびＰＣＡに望ましいスペクトル特性を有する突然変異断片を発生させるための方法。エクオレア、アネモニアおよびアントゾア種からの蛍光タンパク質に基づくアッセイおよび組成物。野生型タンパク質に比べて改善されたスペクトル的性質を有する突然変異の蛍光タンパク質の断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条に基づき、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００３年４月９日に出願した「タンパク質断片の相補性アッセイのための蛍光タンパク質断片」という標題の米国特許仮出願第６０／４６１１３３号の優先権の利益を主張するものである。本出願は、２００３年１月２９日に出願した係続中の米国特許出願第１０／３５３０９０号の一部継続出願でもあり、同出願は２００２年５月２４日に出願した係続中の米国出願第１０／１５４７５８号の継続出願であり、同出願は２０００年２月７日に出願した米国特許出願第０９／４９９４６４号（現在の米国特許第６４２８９５１号）の継続出願であり、同出願は１９９８年２月２日に出願した米国特許出願第０９／０１７４１２号（現在の米国特許第６２７０９６４号）の継続出願である。
【０００２】
本発明は、一般に生物学、分子生物学、化学および生化学の分野に関する。具体的には本発明は、蛍光タンパク質に基づくタンパク質断片の相補性アッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ：ＰＣＡ）に関する。本発明は、適当な断片対の設計および創製のための方法、その断片の組成物、ならびにＰＣＡに適した組合せに関する。好ましい実施形態は、バイオテクノロジー応用に適した性質を有する突然変異の蛍光タンパク質断片を含む。
【背景技術】
【０００３】
天然蛍光タンパク質、生物発光タンパク質または燐光タンパク質の大きくなりつつあるリストには、エクオレア・ビクトリア（オワンクラゲ）（Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来ＧＦＰおよびますます数が増えている有用な性質を有するＧＦＰの配列変異体が含まれる。そのリストには、ディスコソマ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）由来赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）およびアネモニア（Ａｎｅｍｏｎｉａ）由来キンドリング（ｋｉｎｄｌｉｎｇ）蛍光タンパク質（ＫＦＰ１）も含まれる。これらのタンパク質は、コア・アミノ酸残基のエンド環化の結果としてすべてが高可視性の効率的に発光する内部蛍光団を発生できる自己触媒酵素である。蛍光タンパク質の別の共通特性は、シグナルが安定で、種に依存せず、シグナルの発生に基質または補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を何も必要としないことである。これらの蛍光タンパク質は構造が著しく類似しており、類似したタンパク質工学の原理を複数の種に応用することが可能である。
【０００４】
ＧＦＰの一アイソタイプ（「野生型ＧＦＰ」）の全長ＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を表１に示す。これらの配列は完全に記載されキャラクタリゼーションされた（例えばＴｓｉｅｎら、１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９〜５４４頁参照）。無傷タンパク質（図１および２Ｂ）はｐ−ヒドロキシベンジリデンイミダゾロン発色団から強い可視吸光および蛍光を発生し、その発色団はそのタンパク質自体の位置６５から６７のＳｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ配列の環化および酸化によって発生する。新たに合成された蛍光タンパク質ポリペプチドは、蛍光を発する前に正しく成熟する必要がある。成熟プロセスは２つのステップ、すなわち折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）および発色団の形成を伴う。まず、タンパク質は天然立体配座にフォールドし、次に内部トリペプチドが環化し酸化する。これに関して、蛍光タンパク質は環化反応を自己触媒し、反応の完了に分子状酸素のみを必要とする酵素である。
【０００５】
多様な有用突然変異体版の全長、野生型ＧＦＰが生み出され、「エクオレア蛍光タンパク質（ＡＦＰ）変異体」またはＡＦＰと名付けられた。これらの「突然変異の蛍光タンパク質」のスペクトル的性質の改良の結果として、これらのタンパク質は生物学およびバイオテクノロジー応用に広い応用性を有することが分かった。報告されたＧＦＰ変異体のいくつかを表２に示す。従来の慣例によって、（表２および本発明全体におけるような）突然変異の位置は野生型ＧＦＰの配列（表１）に対して表示される。これらのＡＦＰの多くは本来の野生型タンパク質よりもシグナル強度の点ではるかに改善した性質を示し、野生型タンパク質の５から３０倍の蛍光シグナルを発生する。ほぼすべての生物学応用および突然変異の蛍光タンパク質の基礎である強化（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）は、哺乳動物細胞に対して向上したコドン使用頻度を有する。
【０００６】
ＧＦＰから始まり、種々の色変異体をもたらす発色団部位での突然変異が創製された。発色団と接触している側鎖の突然変異はタンパク質の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）および明るさをさらに強化することが示された。スペクトル偏移を有し、３７℃でさらに迅速にフォールドする突然変異の組合せが創製され、細胞生物学応用のためにさらに明るいシグナルを生成した。最も一般的なスペクトル変異体には広く使われている黄色（ＹＦＰ／ＥＹＦＰ）変異体、シアン（ＣＦＰ／ＥＣＦＰ）変異体およびＢＦＰ変異体がある（Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、１９９８、「緑色蛍光タンパク質」、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６７：５０９〜５４４頁）。
【０００７】
独特の性質を有するＧＦＰの追加の突然変異体が創製された。これらには、ＣＦＰとＥＧＦＰとの中間の励起波長および発光波長を有する「ＣＧＦＰ」変異体がある（Ｊ．Ｚｈａｎｇら、２０００、「細胞生物学のための新規な蛍光プローブの創製」、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３：９０６〜９１８頁）。ＹＦＰ（ＹＦＰ−Ｑ６９Ｍ）の「シトリン（ｃｉｔｒｉｎｅ）」変異体は、以前のＹＦＰよりも低いｐＫａ、塩素陰イオンに対する無差別、以前のＹＦＰの２倍の光安定性、ならびに３７℃およびオルガネラにおけるずっと良好な発現を与える（Ｏ．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋら、２００１、「黄色蛍光タンパク質の環境感度の減少」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：２９１８８〜２９１９４頁）。
【０００８】
いくつかの種類のＹＦＰがランダム突然変異誘発を用いて創製された。これらの突然変異タンパク質はＥＹＦＰよりも３〜３０倍高い傾向強度を有す。これらにはいわゆるスーパーＥＹＦＰ（ＳＥＹＦＰ）（ＥＹＦＰ−Ｆ６４Ｌ／Ｍ１５３Ｔ／Ｖ１６３Ａ／Ｓ１７５Ｇ）および「Ｖｅｎｕｓ」（ＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ）（Ｔ．Ｎａｇａｉら、２００２、「細胞生物学的応用のための早く効率的な成熟を有する種々の黄色蛍光タンパク質」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８７〜９０頁）。Ｖｅｎｕｓは新規な突然変異Ｆ４６Ｌを含み、その突然変異は３７℃で突然変異の律速段階である発色団の酸化を大きく促進する。追加のＳＥＹＦＰ突然変異の結果として、Ｖｅｎｕｓ ＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌは折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）も十分であり、酸または高塩素陰イオン濃度の曝露に対して相対的に耐性である。
【０００９】
ＰＡ−ＧＦＰ（ＧＦＰ−Ｖ１６３Ａ／Ｔ２０３Ｈ）と名付けられたＧＦＰの光励起型は、４１３ｎｍ光の強光照射後に４８８ｎｍ光で励起した場合に蛍光が１００倍に増加し、好気条件で数日間安定であると報告された（Ｇ．Ｈ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＆ Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、「タンパク質と細胞の選択的な光標識のための光活性なＧＦＰ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８７３〜１８７７頁、２００２）。
【００１０】
【表１】
【００１１】
【表２】
【００１２】
【表３】
【００１３】
エクオレア・ビクトリア（オワンクラゲ）以外の種からの蛍光タンパク質も単離されキャラクタリゼーションされた。増加中のリストには、レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの緑色蛍光タンパク質およびサンゴである花虫類からの多数の蛍光タンパク質が含まれる。これらにはディスコソマからの赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）が含まれ（Ｍ．Ｖ．Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：９６９〜９７３頁）、そのタンパク質は結晶化され（Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：４６２〜４６７頁）、生物学のツールとして広い応用性が見出された。サンゴ蛍光タンパク質はエクオレアＧＦＰとわずか２６〜３０％の配列同一性しか有さないが、それらは構造的に著しく類似している。具体的には、サンゴ蛍光タンパク質はＧＦＰに最初に観察されたのと同じβカン（β−ｃａｎ）フォールドを共に有する。ＧＦＰで観察された主要な二次構造エレメントのすべてを、同一配置でサンゴタンパク質から容易に検出でき、カンの「キャップ」を形成するストレッチに著しい類似性が観察された。ＧＦＰにおける発色団形成に関与すると考えられる主要残基はサンゴタンパク質においても保存され、残基９６にアルギニン、残基６６にチロシンおよび残基６７にグリシンを含む。
【００１４】
様々な種間で蛍光タンパク質の構造が相同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）であることは、以前にＧＦＰに応用された遺伝子工学およびタンパク質工学の原理の多くをこれらの蛍光タンパク質にも応用して生物学的応用およびバイオテクノロジーのための望みの性質を有する変異体を創製できることを意味している。
【００１５】
以前に記載されたＧＦＰの緑色、黄色およびシアン変異体とスペクトルが別個であることから、高い量子収量を有する明るい橙赤色蛍光タンパク質を入手できることは生物学の研究に特に有用であろう。ＤｓＲｅｄとして一般的に知られているＤｒＦＰ５８３はＧＦＰと本質的に同一の発色団を有する２８ｋＤａのポリペプチドであり、その発色団は内部Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（残基６６〜６８）トリペプチドから自己触媒的に形成する。ＤｓＲｅｄはＡ．ビクトリアＧＦＰと構造的に著しく類似している。実際に、ＤｓＲｅｄの全体的なフォールドはＧＦＰと事実上同一であり、中心に同軸のヘリックスとバレル末端にアルファ・ヘリックスのキャップとを有するストランド１１本のわずかに不規則なベータ・バレル（βカンと記載）からなる。エクオレアＧＦＰとのサンゴ蛍光タンパク質の配列アラインメントを表４に示す。
【００１６】
多数の突然変異体版のＤｓＲｅｄは野生型タンパク質よりも発色団成熟が高速であることが今回記載されていた（Ｂ．Ｊ．ＢｅｖｉｓおよびＢ．Ｓ．Ｇｌｉｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８３〜８６頁、２００２）。重要なことに、ＤｓＲｅｄは最近単量体型に操作された（ｍＲＦＰ）（Ｒ．Ｅ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２００２年６月１１日、「単量体型赤色蛍光タンパク質（Ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（１２）：７８７７〜７８８２頁）。この単量体型はレポーターとして多量体タンパク質よりも有用である。ｍＲＦＰ１は単量体であり、シグナルはＤｓＲｅｄよりも１０倍を超えて速く成熟し、単量体タンパク質はＧＦＰの励起に適した波長で最小の発光しか有さない。
【００１７】
独特のＧＦＰ様色素タンパク質ａｓＣＰがイソギンチャクであるアネモニア・スルカータ（Ａｎｅｍｏｎｉａ ｓｕｌｃａｔａ）から最近発見された（Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．ら、２００３、「精密なｉｎ ｖｉｖｏ光標識用の蛍光タンパク質のキンドリング」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１、１９１〜１９４頁）。ａｓＣＰは初め非蛍光であるが、強い緑色光の照射に反応して５９５ｎｍで発光を有する明るい蛍光を発する（キンドル（ｋｉｎｄｌｅ）する）ようになる。キンドルしたａｓＣＰは、１０秒未満の半減期で緩和して最初の非蛍光状態に戻る。あるいは、青色光の短時間照射によって蛍光を直ちに完全に「消光」できる。非蛍光形から、キンドルしていないタンパク質よりも３０倍大きい蛍光強度を有する安定な明るい赤色蛍光形への独特な不可逆の光転換（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）可能な突然変異体（ａｓＣＰ Ａ１４８ＧまたはＫＦＰ１）が生み出された。細胞、オルガネラおよびタンパク質の移動を追跡するための精密なｉｎ ｖｉｖｏ光標識（ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌ）に、この「キンドリング蛍光タンパク質」を使用できる。
【００１８】
蛍光タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏおよびリアル・タイムで遺伝子発現およびタンパク質局在を監視するための有用なレポーターであることが証明された（Ｊ．Ｍ．Ｔａｖａｒｅら、２００１、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７０：２９７〜３０６頁；Ｔｈａｓｔｒｕｐら、米国特許第６５１８０２１号）。そのようなアッセイは、二元または高次のイベントに比べて個々のタンパク質に結びついている細胞イベントを測定する。生細胞におけるタンパク質動力学を分析するための生化学センサーの構築および革新的な融合構築体の創製を含めた、蛍光タンパク質の他の有用な応用が多数記載されている。二分子イベントの測定のために、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイまたはＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）アッセイが十分に記載された（Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ ＆ Ｒ．Ｔｓｉｅｎ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２７：４７２〜５００頁；Ｇ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎら、１９９８、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：２７０２〜２７１３頁）。ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰおよびＲＦＰは、他の使用からとりわけタンパク質−タンパク質相互作用を検出し、プロテアーゼ活性を監視し、かつカルシウム指示薬を創製するためのＦＲＥＴまたはＢＲＥＴアッセイに使用された。
【００１９】
上に言及したすべての応用が、機能的な全長（または実質的に全長）蛍光タンパク質（発光団）を目的タンパク質にタグ付けするのに頼っていることに留意することが重要である。上に引用した参照のいずれもが蛍光タンパク質の断片の組成物についても使用についても記載していない。
【００２０】
タンパク質断片の相補性アッセイ（ＰＣＡ）は生体分子および薬物相互作用の検出および定量のためのアッセイを構築するための一般法に相当する（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｊ．Ｎ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．およびＭｉｃｈｎｉｃｋ、Ｓ．Ｗ．１９９８、タンパク質断片の相補性アッセイ：タンパク質−タンパク質相互作用のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための一般戦略、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：３２〜１９頁；Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．２００２、タンパク質断片相補戦略を用いたタンパク質相互作用およびライブラリー・スクリーニング：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２５章、４４９〜４７５頁；Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ，Ｆ．Ｘ．、Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ，Ａ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、２０００、タンパク質断片相補戦略によるタンパク質−タンパク質相互作用の検出、第Ａ部および第Ｂ部、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：２０８〜２３０頁；Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ．、１９９７、タンパク質断片相補に基づくｉｎ ｖｉｖｏタンパク質−タンパク質相互作用の検出戦略」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０（別冊）：８９頁）。
【００２１】
ＰＣＡは、単量体酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質または燐光タンパク質のようなレポータータンパク質の断片のオリゴマー化介助性相補を伴う。二量体および多量体酵素もＰＣＡに使用できるが、単量体タンパク質が好ましい。Ｍｉｃｈｎｉｃｋら（米国特許第６２７０９６４号）が記載したように、ＰＣＡに適するタンパク質の理想的な性質は、１）相対的に低分子量の単量体のタンパク質または酵素であり、２）それについての構造および機能の情報に関する大規模な資料があり、３）そのタンパク質の再構成またはその酵素の活性に対する簡便なアッセイが存在し、かつ４）それについて真核細胞および原核細胞における過剰発現が実証されたものである。
【００２２】
米国特許第６２７０９６４号の図１はＰＣＡの概要を示している。タンパク質または酵素の遺伝子を２つ以上の断片に合理的に解体する。分子生物学の手法を用いて、選択された断片をサブクローニングし、相互作用することが公知であるか、またはそう考えられるどちらかのタンパク質をそれぞれの５’末端に融合させる。次に、細胞へのこれらのＤＮＡ構築体の同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を行う。断片相互に対する試験タンパク質（ｔｅｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の結合によって、断片からのプローブタンパク質または酵素の再集合が触媒され、一部のアッセイは再構築を観察する。融合した相互作用性タンパク質がタンパク質または酵素の再集合を触媒する場合にのみこれらのアッセイがうまく進むことを理解するのが重要である。すなわち、再構成したタンパク質または酵素活性の観察が融合タンパク質の相互作用の尺度でなければならない。
【００２３】
米国特許第６２７０９６４号は、蛍光シグナルを発することができる多数の有用レポーターについてＰＣＡの原理、方法および応用を教示している（表１参照）。この特許の実施例３はＰＣＡに適した多数の特異的レポーターを含むＰＣＡの様々な実施形態を記載している。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、蛍ルシフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＰＲＴ）、ジアホラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ブレオマイシン結合タンパク質、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールＮＡＤ＋オキシドレダクターゼおよびエクオレア緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）について詳細が記載された。米国特許第６２７０９６４号の表１はＰＣＡの基準に合致する他のレポーターの一層大きなリストを記載している。
【００２４】
米国特許第６２７０９６４号の実施例３にＧＦＰに基づくＰＣＡがその性質および利点を含めて記載された：「エクオレア・ビクトリア（オワンクラゲ）からのＧＦＰは遺伝子発現のための最も普及したタンパク質マーカーの１つになりつつある。これは低分子量、単量体のアミノ酸２３８個のタンパク質は、残基Ｓｅｒ６５とＧｌｙ６７との間のポリペプチド主鎖の自己触媒性環化およびＴｙｒ６６の結合の酸化から生じる内部発色団の存在が原因で本来蛍光性であることを理由とする。ＧＦＰ発色団は３９５ｎｍで最適に光を吸収し、４７０ｎｍで第２の最大吸収も有する。この二特異性吸収は、相対分布数が発色団の局所環境に依存している発色団の低エネルギー配座異性体が２つ存在することを示唆している。異性体化を排除する突然変異体Ｓｅｒ６５Ｔｈｒは野生型よりも４から６倍強い蛍光をもたらす。近年、ＧＦＰの構造が２つのグループによって解明され、ＧＦＰが構造に基づくＰＣＡ設計の候補となり、そのＰＣＡの開発を本発明者らは開始した。ＧＳＴアッセイと同様に、オリゴマー化ドメインとしてＧＣＮ４ロイシン・ジッパー形成配列を有する大腸菌を用いて本発明者らは初期の開発のすべてを行っている。広域スペクトルＵＶ光下で可視光観察を行うことによる蛍光の直接検出を用いる。本発明者らはＣＯＳ細胞において蛍光活性化セルソーティング」を用いた同時トランスフェクタントも選択してこの系を試験する。米国特許第６２７０９６４号、米国特許第６２９４３３０号および米国特許第６４２８９５１号の発行された請求項は、蛍光タンパク質以外に他のレポーターのクラスを含んでいる。ＰＣＡは多様なペプチド・ライブラリー（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：６８３〜６９０頁）およびｃＤＮＡまたは抗体ライブラリー（Ｅ．Ｍｏｅｓｓｎｅｒら、２００１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５〜１２２頁；Ｉ．Ｒｅｍｙら、公表のために投稿中）をスクリーニングするために、平行および逆平行ロイシン・ジッパー形成配列のようなタンパク質ドメインの会合定数を定量するために（Ｋ．Ｍ．Ａｒｎｄｔら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６２７〜６３９頁；Ｉ．Ｇｈｏｓｈら、２０００、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ１２２：５６５８〜５６５９頁）、薬物によって誘発されるタンパク質複合体の会合および解離を検出するために（Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５３９４〜５３９９頁）、リガンドが誘発する細胞受容体の活性化を測定するために（Ｉ．Ｒｅｍｙら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：９９０〜９９３頁）、生細胞における転写因子複合体を研究するために（Ｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７６９〜７７２頁、２００１）、リアルタイムでシグナル伝達経路のエレメントを定量するために（Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２００１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８：７６７８〜７６８３頁、２００１；Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：６１９〜６２２頁）、ならびにタンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置を正確に決定するために（Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２００１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：７６７８〜７６８３頁；Ｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９：７６９〜７７２頁；Ｃ．−Ｄ．Ｈｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ９：７８９〜７９８頁、２００２；Ｈ．Ｙｕら、公表のために投稿中）使用された。
【００２５】
ＰＣＡへのＧＦＰの使用を記載している本発明者らの発明の後に、Ｇｈｏｓｈら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １２２：５６５８〜５６５９頁、２０００；米国特許出願第２００２／０１４６７０１号）は、本来Ｍｉｃｈｎｉｃｋらによって提案された方法でＧＣＮ４ロイシン・ジッパーのオリゴマー化を研究するためにＧＦＰ ＰＣＡを使用した。彼らは細菌において逆平行ロイシン・ジッパー特異的にＧＦＰ断片が再集合することを示した。これらの研究には単一ＧＦＰ変異体が選択され、単一の切断部位が使用された。著者らは、Ｍｉｃｈｎｉｃｋら（例えば、米国特許第６２７０９６４号）に最初に記載された原理を超えた合理的設計に基づいて蛍光タンパク質を切断するための追加の原理または方法を開示しなかった。さらに、ロイシン・ジッパーの研究に使用された断片対以外にＧｈｏｓｈおよび共同研究者らはＰＣＡに有用な特定のアッセイ組成物を開示しなかった。
【００２６】
Ｈｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ９：７８９〜７９８頁、２００２）は、ＧＦＰの黄色変異体に基づくＰＣＡを記載し、そのアッセイではＹＦＰの断片が平行ロイシン・ジッパーまたはＲｅｌファミリー・タンパク質のどちらかに融合された。しかし、蛍光タンパク質および断片組成物を操作する追加の原理および方法は、Ｈｕおよび共同研究者らによって記載されなかった。さらに、従来技術は無傷蛍光タンパク質の性質に影響することが知られている突然変異がＰＣＡに使用されたポリペプチド断片に類似の性質を与えるかどうかの話題について記載していない。
【００２７】
蛍光タンパク質ＰＣＡはシグナルの発生を外部の補因子または基質に依存しないことから、これらのＰＣＡは細胞に基づくアッセイの構築に特に有用である。１組の蛍光タンパク質ＰＣＡは様々なスペクトル的性質を有する多数の有用なアッセイを可能にするであろう。例えば、高量子収量の蛍光タンパク質をＰＣＡ断片に操作することができ、それによって非常に低レベル発現するタンパク質間の複合体、または酵素とその基質との低親和性複合体のような細胞内の稀少イベントの検出が可能になる。さらに、赤色偏移した発光を有するＰＣＡは、緑色チャネルでしばしば起こる細胞の自己蛍光に関連する雑音に対して改良されたシグナルをもたらすと思われる。重要なことには異なる色を発生する断片を用いたＰＣＡを組み合わせることができ、それによって２、３、またはそれを超える細胞イベントの同時監視が可能になる（多色ＰＣＡ）。最後に迅速診断のための多色アレイを創製するために、蛍光タンパク質ＰＣＡを使用できる。例えば、異なる抗原に結合する抗体に基づく多色アレイは生物戦用物質の迅速同時検出を可能にするであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】米国特許出願第６０／４６１１３３号
【特許文献２】米国特許出願第１０／３５３０９０号
【特許文献３】米国特許出願第１０／１５４７５８号
【特許文献４】米国特許出願第０９／４９９４６４号
【特許文献５】米国特許第６４２８９５１号
【特許文献６】米国特許出願第０９／０１７４１２号
【特許文献７】米国特許第６２７０９６４号
【特許文献８】米国特許第６５１８０２１号
【特許文献９】米国特許第６２９４３３０号
【特許文献１０】米国特許出願第２００２／０１４６７０１号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、１９９８、「Ｔｈｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６７：５０９〜５４４頁
【非特許文献２】Ｊ．Ｚｈａｎｇら、２０００、「Ｃｒｅａｔｉｎｇ ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３：９０６〜９１８頁
【非特許文献３】Ｏ．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋら、２００１、「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：２９１８８〜２９１９４頁
【非特許文献４】Ｔ．Ｎａｇａｉら、２００２、「Ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｆａｓｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８７〜９０頁
【非特許文献５】Ｇ．Ｈ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＆ Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、「Ａ ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ＧＦＰ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８７３〜１８７７頁、２００２
【非特許文献６】Ｓａｗａｎｏ ＆ Ｍｉｙａｗａｋｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２８：Ｅ７８（２０００）
【非特許文献７】Ｍ．Ｖ．Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：９６９〜９７３頁
【非特許文献８】Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：４６２〜４６７頁
【非特許文献９】Ｂ．Ｊ．ＢｅｖｉｓおよびＢ．Ｓ．Ｇｌｉｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８３〜８６頁、２００２
【非特許文献１０】Ｒ．Ｅ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２００２年６月１１日、「Ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（１２）：７８７７〜７８８２頁
【非特許文献１１】Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．ら、２００３、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１、１９１〜１９４頁
【非特許文献１２】Ｊ．Ｍ．Ｔａｖａｒｅら、２００１、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７０：２９７〜３０６頁
【非特許文献１３】Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ ＆ Ｒ．Ｔｓｉｅｎ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２７：４７２〜５００頁
【非特許文献１４】Ｇ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎら、１９９８、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：２７０２〜２７１３頁
【非特許文献１５】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｊ．Ｎ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．およびＭｉｃｈｎｉｃｋ、Ｓ．Ｗ．１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：３２〜１９頁
【非特許文献１６】Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ第２５章、４４９〜４７５頁
【非特許文献１７】Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ，Ｆ．Ｘ．、Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ，Ａ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、２０００、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、第Ａ部および第Ｂ部、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：２０８〜２３０頁
【非特許文献１８】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ．、１９９７、Ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０（別冊）：８９頁）
【非特許文献１９】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：６８３〜６９０頁
【非特許文献２０】Ｅ．Ｍｏｅｓｓｎｅｒら、２００１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５〜１２２頁
【非特許文献２１】Ｉ．Ｒｅｍｙら、公表のために投稿中
【非特許文献２２】Ｋ．Ｍ．Ａｒｎｄｔら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６２７〜６３９頁
【非特許文献２３】Ｉ．Ｇｈｏｓｈら、２０００、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ１２２：５６５８〜５６５９頁
【非特許文献２４】Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５３９４〜５３９９頁
【非特許文献２５】Ｉ．Ｒｅｍｙら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：９９０〜９９３頁
【非特許文献２６】Ｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７６９〜７７２頁、２００１
【非特許文献２７】Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２００１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８：７６７８〜７６８３頁、２００１
【非特許文献２８】Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：６１９〜６２２頁
【非特許文献２９】Ｃ．−Ｄ．Ｈｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ９：７８９〜７９８頁、２００２
【非特許文献３０】Ｈ．Ｙｕら、公表のために投稿中
【非特許文献３１】Ｇｈｏｓｈら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １２２：５６５８〜５６５９頁、２０００
【非特許文献３２】Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２〜９５頁、１９９６
【非特許文献３３】Ｆ．Ｙａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２４６〜５１２１頁、１９９６
【非特許文献３４】Ｒ．Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３〜６４頁、１９９５
【非特許文献３５】ＭＭ Ｌｉｎｇ ＆ ＢＨ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９７、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４：１５７〜７８頁
【非特許文献３６】Ａ．Ｌ．Ｋｕｒｔｚｍａｎら、２００１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００１年８月；１２（４）：３６１〜７０頁
【非特許文献３７】ＳＷ Ｓａｎｔｏｒｏら、２００２、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２ ９９：４１８５〜９０頁
【非特許文献３８】Ｚ．Ｓｈａｏら、１９９６、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：５１３〜８頁
【非特許文献３９】Ｓ．Ｈａｒａｙａｍａ、１９９８、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８、１６：７６〜８２頁
【非特許文献４０】ＷＰ Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｇｅｎｅ １６４（１）：４９〜５３頁
【非特許文献４１】ＲＭ Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３、Ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０〜９頁
【非特許文献４２】Ｍ．ＫｉｔａｂａｔａｋｅおよびＨ．Ｉｎｏｋｕｃｈｉ、１９９３、Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ、Ｇｅｎｅ １２３：５９〜６１頁
【非特許文献４３】Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９０、Ｏｒｄｅｒｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ ｇａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８（１０）：２９６１〜６頁
【非特許文献４４】Ｗａｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ＧＦＰ ｈｏｍｏｌｏｇ ＤｓＲｅｄ、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ７、１１３３〜１１３８頁（２０００）
【非特許文献４５】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｆ．−Ｘ．Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１２１４１〜１２１４６頁
【非特許文献４６】Ｂ Ｐ．Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ１７３：３３〜３８頁
【非特許文献４７】Ｎ．Ｄ．Ｌａｋｉｎ ＆ Ｓ．Ｐ．Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７６４４〜７６５５頁、１９９９
【非特許文献４８】Ｂ．Ａ．Ｗｅｒｎｅｓｓ、Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ ＆ Ｐ，Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７６〜７９頁、１９９０
【非特許文献４９】Ｊ．Ｍ．Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ、Ｍ．Ｓｃｈｅｆｆｈｅｒ ＆ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５〜７８４頁、１９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明の目的は、ＰＣＡのための蛍光タンパク質断片および突然変異断片を設計および操作する（ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ための方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、ＰＣＡに有用な多数の断片対および組成物を記載することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、無傷蛍光タンパク質の任意の有用な配列変異体を操作してＰＣＡ断片にして多様なスペクトル的性質および物理的性質を有するアッセイを生み出すことができると教示することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、有用な性質を与える広範囲の突然変異を導入されたＰＣＡ断片の組成物を提供することである。
【００３４】
本発明のなおさらなる目的は、多色ＰＣＡを提供することである。
【００３５】
本発明の利点は、多様な応用のために有用な一連の性質を有する「デザイナー」ＰＣＡを創製できることである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明はタンパク質の相補的断片を含む組成物に関し、前記断片が会合した場合に光学的に検出できるシグナルを発生する。
【００３７】
本発明は蛍光タンパク質および突然変異の蛍光タンパク質から得られた断片にも関する。
【００３８】
本発明は、野生型タンパク質の対応する断片と少なくとも１アミノ酸異なる、突然変異の蛍光タンパク質の相補的断片も記載する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号２０から配列番号１０６７で構成される群から選択される相補的断片に関する。
【００４０】
本発明は、別個の分子にさらに融合している配列番号２０から配列番号１０６７から選択される組成物も記載する。
【００４１】
本発明は突然変異タンパク質の相補的断片を含む組成物も提供し、会合した場合に前記断片は光学的に検出できるシグナルを発生し、各断片は別個の分子に融合している。
【００４２】
本発明はさらに、光学的に検出できるタンパク質からの分離した断片の再集合を含む、分子相互作用の検出のためのタンパク質断片の相補性アッセイに関し、断片の再集合は各断片に融合している分子ドメインの相互作用によって作動され、断片の再集合は他の分子プロセスから独立しており、前記再集合は前記光学的に検出できるタンパク質の活性の再構成によって検出される。
【００４３】
本発明は生体分子相互作用を検出するための方法も提供し、前記方法は、（ａ）光学的に検出できる適切なタンパク質を選択する工程と、（ｂ）前記光学的に検出できるタンパク質がタンパク質機能を可逆的に喪失するように効果的に切断化する工程と、（ｃ）前記光学的に検出できるタンパク質の断片を別々に他の分子に融合または付着させる工程と、（ｄ）前記タンパク質の断片に融合または付着している分子の相互作用を通じて前記タンパク質断片を再会合させる工程と、（ｅ）結果として生じる光学シグナルを検出する工程とを含む。
【００４４】
本発明は、蛍光タンパク質に基づくタンパク質断片の相補性アッセイの設計および操作にも関する。エクオレア、アントゾア（Ａｎｔｈｏｚｏａ）およびアネモニア種から得られた蛍光タンパク質に基づいて、蛍光タンパク質を切断するための方法および特異的性質を有する突然変異断片を創製するための方法を記載する。最後に、緑色、黄色、シアン、青色または赤色シグナルを発生する有用な性質を有する突然変異を導入された多数の断片組成物および断片対を提供する。エクオレア蛍光タンパク質の非常に多数の突然変異体を用いて蛍光タンパク質ＰＣＡの詳細な実施例を示し、操作原理を実証し、全長タンパク質に有用な性質を与える突然変異が断片にも付与されうることを示す。本発明は多色ＰＣＡの構築のための方法および組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】エクオレア蛍光タンパク質を切断できる領域を示す図であり、直鎖配列に対して切断を行うことができる６つの代替ループ（星印）を示す図である。
【図１Ｂ】エクオレア蛍光タンパク質を切断できる領域を示す図であり、タンパク質の三次元構造に対する部位（矢印）の特異的アミノ酸残基を示し、切断部位でのアミノ酸残基を野生型ＧＦＰに対して付番した図である。
【図２】蛍光タンパク質断片の相補性アッセイの設計および創製のための戦略を描いた図である。
【図３】Ａ．ビクトリアの２つの変異体（ＧＦＰ ＰＣＡおよびＹＦＰ ＰＣＡ）に基づくＰＣＡで達成された相対蛍光強度を描写する、生細胞におけるＰＣＡの結果の顕微鏡写真を示す図であり、いくつかの異なるタンパク質−タンパク質複合体が一過性トランスフェクションの２４時間後に蛍光顕微鏡で評価されたことを示す図である。
【図４】図１ａおよび１ｂに描くようないくつかの代替断片化部位から発生した断片対に基づくＰＣＡを示す図である。
【図５】２つのアミノ酸だけ異なるＹＦＰ ＰＣＡの２つの配列変異体を比較して特異的突然変異が再集合した断片の蛍光強度を増強することを示す図であり、相補的断片に融合しているタンパク質はプロテインキナーゼであるＭＥＫおよびＥＲＫであることを示す図である。
【図６】ＹＦＰ断片の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）を増強する突然変異を有するスーパー強化ＰＣＡ（ａ欄）によって発生する明るいシグナルを非強化ＰＣＡ（ｂ欄）と比較して示した図であり、タンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置も蛍光顕微鏡で観察でき、個別のＹＦＰ断片は蛍光を発することができない（ｃおよびｄ）ことを示す図である。
【図７Ａ】最終ＰＣＡの蛍光強度を増強し、強烈蛍光ＰＣＡ（ＩＦＰ ＰＣＡ）を創製し、かつ少量（ナノグラムからサブナノグラム）のＤＮＡでタンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にするために断片に追加の突然変異を操作して導入する作用を示す図である。
【図７Ｂ】最終ＰＣＡの蛍光強度を増強し、強烈蛍光ＰＣＡ（ＩＦＰ ＰＣＡ）を創製し、かつ少量（ナノグラムからサブナノグラム）のＤＮＡでタンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にするために断片に追加の突然変異を操作して導入する作用を示す図である。
【図８】例えばｐ６５／ｐ５０について本明細書に示すようなサイトカインによる生細胞の刺激に応答したタンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置における変化を検出するために、蛍光タンパク質の突然変異断片に基づくＰＣＡをハイコンテント・アッセイにおいて使用できることを示す図である。
【図９】突然変異の蛍光タンパク質断片に基づくスペクトル偏移ＰＣＡがタンパク質−タンパク質相互作用の存在下で青色シグナルを発生することを実証する図である。
【図１０】蛍光タンパク質のＣ末端に対応する断片をタグ付けした単一融合タンパク質（この例ではｐ６５）が第一タンパク質と相互作用するタンパク質に融合しているレポーター断片のアミノ酸配列に応じて同一細胞において２つの異なる蛍光ＰＣＡを生み出すことができる多色ＰＣＡを実証する図であり、多色ＰＣＡは同一細胞内の異なるタンパク質−タンパク質複合体の検出および定量を可能にする図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
蛍光タンパク質は蛍光シグナルの発生に外部の基質またはプローブを必要としないことから、ＰＣＡに特に魅力的である。しかし、蛍光タンパク質の独特な構造、および蛍光シグナルの発生に活性発色団の内部形成を必要とすることから、蛍光タンパク質は設計にある種の難題を提起する。本発明は、以下に記載する蛍光タンパク質の切断のための設計基準を包含する。
【００４７】
図２に、蛍光タンパク質に基づくＰＣＡの創製に含まれるステップを記載する。第１ステップは蛍光タンパク質およびそれに対応するＤＮＡ配列の選択である。本発明の主題である設計原理に基づいて任意の蛍光タンパク質をＰＣＡに使用できる。蛍光タンパク質の選択は望みの波長、計装、および目的のアッセイに必要な感度に依存する。第１の実施例において、本発明者らは蛍光タンパク質をどの位置で切断するかを決定するために合理的設計を使用することを記載する。蛍光タンパク質は類似した構造を有するため、本発明者らはまずＡ．ビクトリアＧＦＰを例に設計原理を説明する。
【００４８】
ＧＦＰはαヘリックスを有する極めて珍しい特性をもつ、ストランド１１本のβバレル（樽）であり、αヘリックスはβバレルの中心軸を通るスレッドである（Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２〜９５頁、１９９６；Ｆ．Ｙａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２４６〜５１２１頁、１９９６；Ｒ．Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３〜６４頁、１９９５）。図１Ａはタンパク質の二次元像を示し、中心アルファ・ヘリックスに対してバレルのストランド１１本を示し、バレル末端のアミノ酸位置に番号を付けている。図１Ｂはフォールドしたタンパク質の三次元構造を示し、ループの特異的残基の位置を付記する（すべての番号は野生型ＧＦＰに対するものである）。発色団はαヘリックスに付着しβバレルの円筒の中心にほぼ完全に埋まっている。βバレルおよび軸ヘリックスを築くために一次配列のほぼすべてが使用されている。発色団は天然タンパク質ではＳｅｒ（Ｔｈｒ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙである残基６５〜６７から形成されたｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリノンである（１、２）。発色団は環の１−および２−の位置を介してペプチド主鎖に付着している４−（ｐ−ヒドロキシベンジリデン）イミダゾリジン−５−オンである。まず、ＧＦＰがほぼ天然の立体配座にフォールドし、次に残基６５のカルボニルにＧｌｙ６７のアミドが求核攻撃した後に脱水することによってイミダゾリノンが形成する。最後に、分子状酸素が残基６６のＣα−Ｃβ結合を脱水素し、その芳香族基をイミダゾリノンと結合させる（３）。
【００４９】
破壊されてはならない構造の明白な特性があることから、デフォルトでそのような領域の代替となるものを切断のために選択する。蛍光タンパク質ＰＣＡのための設計基準には以下がある。
【００５０】
（１）バレル構造を破壊しないように個別のストランドの最末端にあるβターンまたはループに切断を作る。切断に好ましい領域を図１Ａに示し、その領域に対応する特異的アミノ酸を図１Ｂの三次元構造に示す。
【００５１】
（２）発色団はβバレル深くに埋もれている。発色団の効率的な形成を保証し、かつ剛性の立体配座と独特のスペクトル特性を有するＧＦＰをもたらす他のアミノ酸の側鎖への配位との両方を維持するために発色団のコード配列を孤立させるのにこれが必要であると思われる。溶媒からの発色団の孤立は、βバレルに包埋することによって、そしてバレルの両端のバレル「キャッピング」構造によっても維持されている。これらのキャップには、（ａ）内部ヘリックスのＮ末端にあるキャップ：残基１９〜３０のストランド、残基１３３〜１４３のヘアピン、残基５０〜５７（これは内部ヘリックスのＮ末端である）、および（ｂ）内部ヘリックスのＣ末端にあるキャップ：残基１〜１０のヘリックス；残基７７〜９８のヘリックス；残基１９１〜１９７のストランドがある。これらの領域のいずれも破壊してはならない。
【００５２】
これらの基準に基づいて、ＧＦＰ構造の一次モデルに対して最適の切断領域を図１Ａに示す。アミノ酸残基３８〜４０（領域１）、アミノ酸１０１〜１０３（領域２）、アミノ酸１１４〜１１８（領域３）、アミノ酸１５４〜１６０（領域４）、アミノ酸１７１〜１７５（領域５）、またはアミノ酸１８８〜１９０（領域６）を含むループの１つに切断を行うことができる。これらの領域内のアミノ酸の１つに切断を行うことができる。上記および米国特許第６２７０９６４号に記載の設計基準に従う限り、切断が行われる正確な残基は、断片がフォールドし活性構造を再構成する能力に重大な影響を及ぼさずに指名されたループ内で変動しうることが当業者に明白である。設計原理を証明するために、上に挙げた領域から選択された３つの異なるアミノ酸でのＹＦＰの切断に基づくＰＣＡ構築の成功例（図４）を本発明者らは紹介する。
【００５３】
ＰＣＡのためのタンパク質の切断は、本発明に記載したようなポリペプチド鎖の合理的解体に一般に基づくが、当業者に周知である多数の他の操作アプローチを使用できる。例えば、最適な対を検索するために断片のライブラリーを生み出すために５’エキソヌクレアーゼの使用に基づく代替アプローチを本発明者らは以前に提案した（Ｍｉｃｈｎｉｃｋら、米国特許第６２７０９６４号）。
【００５４】
本発明において本発明者らは、目的の断片を増幅するためのＰＣＲを用いてＧＦＰについての全長ｃＤＮＡの断片を生み出した。あるいは、標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて、断片をコードするオリゴヌクレオチドを単純に合成できる。このアプローチはシアン蛍光タンパク質に基づくＰＣＡ（図９）を生み出すために採用された。好ましい実施形態において、生物学的応用および使用する計装に合った性質を有する蛍光タンパク質の突然変異断片が使用される。以下に詳細に記載するような突然変異断片を生み出すために、本発明者らは、再構成された場合に改変された蛍光性質または優れた折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）もしくは成熟速度および安定性を有する断片を得る目的でＧＦＰの部位特異的突然変異誘発を利用した。当業者に周知である多数のアプローチのうち任意のものによって部位特異的突然変異誘発を達成する（ＭＭ Ｌｉｎｇ ＆ ＢＨ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９７、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４：１５７〜７８頁）。そのような方法の選択された実施例が本明細書にもたらされているが、これらの実施例は本発明の実施を制限する意図はない。適当な方法には、ランダム突然変異誘発と定方向進化またはＤＮＡシャッフリングのスキームとの組合せ（Ａ．Ｌ．Ｋｕｒｔｚｍａｎら、２００１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００１年８月；１２（４）：３６１〜７０頁；ＳＷ Ｓａｎｔｏｒｏら、２００２、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２ ９９：４１８５〜９０頁；Ｚ．Ｓｈａｏら、１９９６、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：５１３〜８頁；Ｓ．Ｈａｒａｙａｒｎａ、１９９８、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８、１６：７６〜８２頁）、アセンブリーＰＣＲまたは遺伝子合成アプローチ（ＷＰ Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｇｅｎｅ １６４（１）：４９〜５３頁；ＲＭ Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３、Ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０〜９頁）、またはエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ分解消化による切断（Ｍ．ＫｉｔａｂａｔａｋｅおよびＨ．Ｉｎｏｋｕｃｈｉ、１９９３、Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ、Ｇｅｎｅ １２３：５９〜６１頁；Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９０、Ｏｒｄｅｒｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ ｇａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８（１０）：２９６１〜６頁）がありうる。特に強力な方法は多数の市販の突然変異誘発キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に例示されるような５’テンプレート介助長距離プラスミド重合に基づく。さらに、ＤＮＡシャフリングに基づく様々な形の定方向進化も完全に新規なＰＣＡを生み出すために使用できる。
【００５５】
蛍光タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片Ｆ１およびＦ２がいったん発生すると、適当な発現ベクター中で、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子と、それぞれの断片をフレーム内で個別に融合する。多様な標準発現ベクターまたは新規な発現ベクターを細胞の種類および望みの発現レベルに基づいて選択できる。そのようなベクターおよびそれらの特性は当業者に周知であろう。最適には、下の実施例１に記載するようなフレキシブル・リンカーを、蛍光タンパク質断片と目的遺伝子との間に融合して断片の相補を促進する。したがって、各発現ベクターは作動連結した目的遺伝子、フレキシブル・リンカー、および選択された蛍光タンパク質のＦ１またはＦ２のどちらかからなる融合タンパク質をコードする。図２に示すようにＦ１またはＦ２の一方を目的遺伝子に融合でき、融合の方向は目的遺伝子に対して５’または３’のどちらかでありうることから、４つの異なるＤＮＡ構築体が目的の任意の単一遺伝子に対して可能である。（蛍光タンパク質断片が構築体の５’末端に存在するならば開始メチオニン（ａｔｇコドン）が先頭になり、一方でその断片が構築体の３’末端に存在するならば、開始メチオニン（ａｔｇコドン）が目的遺伝子の先頭にくることに留意するべきである）。したがって、本発明は天然開始メチオニンを有するＦ１フラグメントだけではなく、構築体の３’末端にＦ１断片が存在すべき場合は開始メチオニンを除去するように修飾された同一Ｆ１断片にも及んでいる。同様に、本発明は自然には開始メチオニンで始まらないＦ２断片だけではなく、Ｆ２断片が構築体の５’末端に存在すべきである場合開始メチオニンを含むように修飾された同一のＦ２断片にも及ぶ。
【００５６】
タンパク質ＡおよびＢの対についてのＰＣＡを生み出すために、相補性蛍光タンパク質断片Ｆ１およびＦ２に別々に融合しているＡおよびＢをコードする構築体を細胞に同時トランスフェクトする。タンパク質ＡおよびＢが相互作用するならば、断片Ｆ１およびＦ２は極めて近接し、その状態でそれらの断片はフォールドして活性発色団を再構成できる。次に蛍光シグナルを、蛍光スペクトロスコピー、フロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ）、または顕微鏡観察を含めた多様な標準法によって測定できる。当業者に周知の計装を用いてこれらの方法のすべてを自動、ハイスループット形式で使用することができる。下に記載するように、２つ以上の構築体対を同時に使用することによって、新規の多色蛍光ＰＣＡを生み出すこともできる。最後に、ＤＮＡレベルでＰＣＡの操作および構築を実施した後、そのうえ細胞に融合タンパク質を生成させるのは得策であるが、必須ではない。例えば融合タンパク質を当業者に周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで作製できる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＣＡについては融合ポリペプチドをペプチド合成によって、または目的分子をコードするペプチド断片の連結によって合成的に生成させて蛍光タンパク質断片とのペプチド融合体を創製することが可能である。
【００５７】
様々な海洋生物由来蛍光タンパク質の間の構造相同性は、ＧＦＰについて記載されたのと同じ設計基準を最近記載されたディスコソマおよびアネモニアから蛍光タンパク質のような他の蛍光タンパク質に応用するのを可能にする。したがって、ＧＦＰ変異体以外に単量体化赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ由来）の断片および蛍光タンパク質ＫＦＰ１の断片に基づく追加のＰＣＡを提示する。ＫＦＰ１は、アネモニア・スルカータ（Ａｎｅｍｏｎｉａ ｓｕｌｃａｔａ）からの蛍光タンパク質「ａｓＣＰ」に基づいて特定波長で発色団に照射することによって一時的に活性化（キンドル）されうる。（Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｅｌｏｕｓｏｖら、２００３、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１、１９１〜１９４頁）。両方の場合で蛍光タンパク質はアミノ酸レベルでＧＦＰのホモログである。
【００５８】
本発明の主題である赤色偏移蛍光ＰＣＡは、緑色チャネルにおいて重大な自己蛍光が存在する生物学応用に特に有用である。例えば、赤色偏移ＰＣＡはフロー・ソーティングを用いたｃＤＮＡライブラリー・スクリーニングへの応用に特に有用であろう。この場合ＲＦＰのＰＣＡによって検出されるタンパク質−タンパク質複合体を発現する陽性細胞集団はバックグラウンド集団から転移し、陽性細胞のフロー・ソーティングが容易にできるようになる。
【００５９】
ディスコソマ由来ＤｓＲｅｄはＧＦＰの構造ホモログであることが実証された。ＤｓＲｅｄはＧＦＰと本質的に同一の発色団を有する２８ｋＤａのポリペプチドであり、発色団は内部Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（残基６６〜６８）トリペプチドから自己触媒的に形成する。ＤｓＲｅｄはＡ．ビクトリアＧＦＰに構造的に著しく類似している。実際、ＤｓＲｅｄの全体的なフォールドはＧＦＰと事実上同一であり、中心に同軸のヘリックスとバレル末端にアルファ・ヘリックスのキャップとを有する、ストランド１１本のわずかに不規則な（ベータ・カンとして記載される）ベータ・バレルからなる。本発明の主題である新規な断片は、ＲＦＰの構造の調査（Ｗａｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、「４分割ＧＦＰ相同ＤｓＲｅｄにおける赤色蛍光のための構造的基礎」、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ７、１１３３〜１１３８頁（２０００））およびＧＦＰの切断のために上記の合理的設計基準を用いることに直接基づく。Ａ．ビクトリアＧＦＰの配列とアラインメントを作成したｍＲＦＰ１のアミノ酸配列を表５に示し、その表に代替切断部位のアラインメントを示す。本発明は、以下の代替切断部位でのｍＲＦＰ１の切断によって発生した核酸配列およびポリペプチド断片を包含する：アミノ酸３８〜４０（領域１）；アミノ酸１００〜１０２（領域２）；アミノ酸１１３〜１１７（領域３）；アミノ酸１５２〜１５６（領域４）；アミノ酸１６７〜１７１（領域５）；アミノ酸１８２〜１８４（領域６）。グルタミン酸３９（Ｅ３９）、アスパラギン酸１０１（Ｄ１０１）、アスパラギン酸１１５（Ｄ１１５）、グルタミン酸１５３（Ｂ１５３）、アスパラギン酸１６９（Ｄ１６９）、またはリジン１８４（Ｋ１８４）について特異的アミノ酸残基の位置を示す。全長ｍＲＦＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列に対する切断部位を表６に示す。
【００６０】
【表４】
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
キンドリング蛍光タンパク質（ＫＦＰ１）に基づくＰＣＡも本発明の主題である。アネモニア・スルカータから得られた蛍光タンパク質の変異体であるＫＦＰ１の場合、代替切断部位は表７に示すようにＧＦＰに対するＫＦＰ１のアラインメントに基づく。表８はＫＦＰ１の全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対する切断部位を示す。
【００６４】
【表７】
【００６５】
【表８】
【００６６】
再集合した断片が、その断片が由来する無傷レポーターの活性を再創製できることがＰＣＡの特性である。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に基づくＰＣＡについては、再集合した断片は全長タンパク質に類似したやり方でメトトレキサートと結合でき（Ｉ．Ｒｅｍｙ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６：５３９４〜５３９９頁）、さらにＰＣＡに使用した場合、無傷ＤＨＦＲタンパク質の性質に影響する突然変異はＤＨＦＲ断片に対して類似した性質を与える（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｆ．−Ｘ．Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１２１４１〜１２１４６頁）。同様に、ＰＣＡに使用されたβ−ラクタマーゼ断片は無傷β−ラクタマーゼタンパク質に類似した反応速度でセファロスポリン基質を開裂でき、無傷タンパク質のモルテン・グロビュール（ｍｏｌｔｅｎ ｇｌｏｂｕｌｅ）構造を破壊する突然変異は再集合した断片の酵素的性質を向上させる（Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕ、Ｍ．Ｐｒｉｍｅａｕ、Ｌ．−Ｅ．Ｔｒｕｄｅａｕ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６１９〜６２２頁）。
【００６７】
蛍光タンパク質のスペクトル的性質がコア発色団に対するアミノ酸の方向および近接に決定的に依存することから、無傷蛍光タンパク質のスペクトル的性質に影響する突然変異が、タンパク質断片に操作されて導入された場合に同一の作用を有することは明白ではない。蛍光タンパク質のスペクトル的性質に影響する突然変異を、タンパク質断片の相補性アッセイに操作して導入できるならば、様々なスペクトル的性質を有する幅広い種類のＰＣＡを生み出すことが可能であろうと本発明者らは推論した。さらに、異なる色のＰＣＡを入手できることは生物学およびバイオテクノロジーにおける多様な応用のためのデザイナーＰＣＡの操作を可能にするであろう。
【００６８】
この原理を実証するために本発明者らはＡ．ビクトリア緑色蛍光タンパク質の数多くの変異体に基づくＰＣＡを創製し、哺乳動物細胞においてタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが知られているいくつかの異なるヒト遺伝子との融合構築体を創製することによってそれらのＰＣＡを試験した。最初の実施例において、緑色蛍光ＰＣＡ（ＧＦＰ ＰＣＡ）を創製するために強化緑色蛍光タンパク質（表３の「ＥＧＦＰ」）を切断することによってＰＣＡ用の断片を発生させた。次に、ＧＦＰ断片をさらに突然変異させて、表２において「１０Ｃ」と名付けた黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）変異体に対応する突然変異Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙを有する新規な断片を創製した。これは表３にあるように強化黄色蛍光タンパク質（「ＥＹＦＰ」）とも称される。無傷ＧＦＰではＳ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ突然変異の導入によってそれぞれ５１４ｎｍおよび５２７ｎｍの最大励起および最大発光を有するタンパク質が生じ、そのタンパク質では発光団は野生型ＧＦＰよりも４倍速く成熟し、細胞生物学応用のための明るいシグナルを発生する。本発明者らはこのＧＦＰ変異体をＰＣＡに使用できるかどうかを決定しようと努め、ヒト細胞において相互作用することが以前に報告された全長タンパク質に融合している断片を一過性に同時トランスフェクトした細胞における、ＧＦＰ ＰＣＡに対するこのＹＦＰ ＰＣＡの相対強度を評価しようと努めた。この分析を下の実施例１に詳細に記載する。
【００６９】
本発明の主題である多様な断片対の有用性を実証するために、本発明者らは図１Ｂに示した切断部位のうち３つを選択し、様々な遺伝子／断片方向（ＮＮ、ＮＣ、ＣＮおよびＣＣ）で公知の相互作用性タンパク質に融合しているＹＦＰ断片に基づいたＰＣＡを構築した。下に記載する実施例２において、異なる切断部位がバックグラウンドに対して良好なシグナルを有する代替ＰＣＡの構築に実際に使用できることを結果は示した。
【００７０】
突然変異断片に基づくＰＣＡの操作の２つのさらなる実施例において、生理学的温度で全長ＹＦＰの明るさを増強することが示された突然変異がＰＣＡ用の断片に操作されて導入された場合に類似した性質を与えるかを決定するために、本発明者らはＹＦＰ断片をさらに突然変異させた。まず、本発明者らは２つの追加の突然変異Ｓ６４ＬおよびＭ１５３ＴをＹＦＰ［１］に操作して導入した。Ｓ６４ＬおよびＭ１５３Ｔ突然変異の両方は全長緑色蛍光タンパク質（Ｔｓｉｅｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）を改善し、無傷全長タンパク質に強化した蛍光を与えた（Ｂ．Ｐ．Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ１７３：３３〜３８頁）。これらの突然変異はＳＥＹＦＰとして公知であるＹＦＰ変異体の構成要素である（表３参照）。下に詳細に示す実施例３において、本発明者らはＹＦＰ ＰＣＡと新規なＳＥＹＦＰ ＰＣＡとを直接比較した。
【００７１】
ＰＣＡ用の突然変異断片を操作する、なお別の実施例において、本発明者らはＳＥＹＦＰの断片１に突然変異Ｆ４６Ｌを導入し、本発明者らがＩＦＰ［１］と称した新規な断片を発生させた。本発明者らはＹＦＰの断片２に突然変異ＶＩ６３ＡおよびＳ１７５Ｇを導入し、新規な断片ＩＦＰ［２］を生み出した。これらの突然変異は、表３においてＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ（「Ｖｅｎｕｓ」）として知られているＹＦＰ変異体の構成要素である。結果は、蛍光タンパク質の突然変異断片を操作することによって高度強烈蛍光ＰＣＡ（ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｔｅｎｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＡ）（ＩＦＰ ＰＣＡ）を操作できることを実証している。
【００７２】
本発明の４番目の実施例において、本発明者らは突然変異ポリペプチド断片を創製することによって特定の望みのスペクトル的性質を有するＰＣＡを創製することが可能であることを実証した。青色領域へのスペクトル偏移を与える突然変異を有する断片を合成することによって、本発明者らはシアン蛍光ＰＣＡ（ＣＦＰ ＰＣＡ）を創製した。本発明は、遺伝子工学によって様々な強度およびシグナル成熟の特徴を有する緑色、黄色、青緑色、青色、シアン、橙赤色および赤色変異体を含めた広域スペクトルのＰＣＡを生み出すための断片を提供する。
【００７３】
本発明の最終実施例において、本発明者らは蛍光レポーターの単一断片が、その断片が対になる断片のアミノ酸配列に応じて同一細胞内で異なる蛍光色を発生する多色ＰＣＡを実証した。
【００７４】
［実施例１］
蛍光タンパク質断片の相補性アッセイの創製およびＰＣＡ用突然変異断片の発生
本発明者らは、Ａ．ビクトリアＧＦＰから開始し異なるスペクトル的性質を有する２つのＰＣＡを創製しようとした。まず、哺乳動物におけるコドン最適化版のＧＦＰ（ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＰＣＲによってＧＦＰ断片を発生させた。ＧＦＰ［１］はＧＦＰのアミノ酸１から１５８に対応し、ＧＦＰ［２］はＧＦＰのアミノ酸１５９から２３９に対応する。次に、ＰＣＲによりＧＦＰの断片１にＥＹＦＰ特異的突然変異Ｓ６５Ｇ、Ｓ７２Ａを、かつＧＦＰの断片２に突然変異Ｔ２０３Ｙを導入し、それぞれ断片ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］をもたらすことによってＧＦＰの黄色変異体（ＹＦＰ ＰＣＡ）をコードする断片を創製した。
【００７５】
断片ＧＦＰ［１］、ＧＦＰ［２］、ＹＦＰ［１］、およびＹＦＰ［２］を、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点（ｏｒｉＰ）を組み入れるように予め修飾された哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ｏｒｉＰはＨＥＫ２９３Ｅ細胞（２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなＥＢＮＡ１遺伝子を発現する細胞系中でこれらの修飾ベクターのエピソーム複製を可能にする。追加的に、これらのベクターはＳＶ４０の起点を依然保持し、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞系（例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＪｕｒｋａｔまたはＣＯＳ）中でも同じくエピソームの発現が可能である。
【００７６】
ＧＦＰ ＰＣＡに対する操作されたＹＦＰ ＰＣＡの活性および相対シグナル強度を試験するために、以前に哺乳動物細胞において相互作用することが示された３対のタンパク質についてＰＣＡが創製された。これらには腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の自己相互作用（Ｎ．Ｄ．Ｌａｋｉｎ ＆ Ｓ．Ｐ．Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７６４４〜７６５５頁、１９９９）、パピローマウイルスＥ６タンパク質とｐ５３との相互作用（Ｂ．Ａ．Ｗｅｒｎｅｓｓ、Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ ＆ Ｐ，Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７６〜７９頁、１９９０）、およびＥ６タンパク質と、Ｅ６およびｐ５３の相互作用を仲介するタンパク質であるＥ６ＡＰとの相互作用がある（Ｊ．Ｍ．Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ、Ｍ．Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ ＆ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５〜７８４頁、１９９３）。ｐ５３、Ｅ６およびＥ６ＡＰに対する完全コード配列を、配列が検証された全長ｃＤＮＡからのＰＣＲによって増幅した。生じたＰＣＲ産物を吸引ろ過（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＰＣＲ、Ａｍｉｃｏｎ）によって清浄にし、適当な制限酵素で分解消化して特異的クローニングを可能にし、アミノ酸１０個のペプチド（Ｇｌｙ．Ｇｌｙ．Ｇｌｙ．Ｇｌｙ．Ｓｅｒ）２（配列番号１９）をコードするフレキシブル・リンカーを介してＧＦＰ［１］、ＹＦＰ［１］、ＧＦＰ［２］またはＹＦＰ［２］の５’または３’末端の一方にフレーム内融合した。目的遺伝子とレポーター断片との間にフレキシブル・リンカーを使用することによって、融合の方向および配置が蛍光タンパク質断片を極めて近接させるのに最適であることが確実となる（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｆ．−Ｘ．Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１２１４１〜１２１４６頁）。対になった構築体の方向は以下のとおり：Ｆ１−リンカー−ｐ５３とＦ２−リンカー−ｐ５３、Ｆ１−リンカー−Ｅ６とＥ６ＡＰ−リンカー−Ｆ２、およびＦ１−リンカー−Ｅ６とＦ２−リンカー−ｐ５３のとおりであり、ここでＦ１およびＦ２はＧＦＰまたはＹＦＰどちらかの断片であった。組換え構築体からのＤＮＡを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＸロボット・ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州）で作動するＱｉａｇｅｎ Ｔｕｒｂｏ ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、チャッツワース、カリフォルニア州）を用いて単離した。単離したＤＮＡを定量し、次に濃度５０ｎｇ／μｌに対して基準化した。
【００７７】
トランスフェクションの２４時間前にＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、ポリリジンでコートした２４穴平板に蒔き（１穴あたり細胞２００００個）、次にＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を製造業者の勧めに従って用いてＤＮＡ０．５マイクログラムを同時トランスフェクトした。２４時間発現させた後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＨＹＱ−ＦＩＴＣフィルター・キューブを備えるニコンＴＥ−２０００顕微鏡で観察した（励起：４６０〜５００ｎｍ、発光：５０５〜５６０ｎｍ、ダイクロイック・ミラー：５０５ＬＰ）。ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで画像を獲得した。図３は、ｐ５３／ｐ５３、Ｅ６／Ｅ６ＡＰおよびＥ６／ｐ５３の相互作用についてのＧＦＰ ＰＣＡに対するＹＦＰ ＰＣＡの蛍光顕微鏡観察結果を示す。再構成されたＧＦＰまたはＹＦＰシグナルを明瞭に見ることができ、複合体の細胞内位置がそれらの公知の位置に一致することを決定できた。しかし、ＹＦＰ ＰＣＡのシグナルは３つのタンパク質−タンパク質複合体すべてについてＧＦＰ ＰＣＡシグナルよりも視覚的に明るく、全長タンパク質のシグナル強度を増強することが以前に示されたＹＦＰ突然変異が再集合した断片の強度の増強にも有効であったことが実証された。さらに、ＹＦＰ ＰＣＡの最大励起および最大発光は無傷蛍光タンパク質ＹＦＰ １０ｃとほぼ同等であり（表２）、これは相補的断片が折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）でき、無傷タンパク質から発生するのと同じ性質を実質的に有する発色団を発生できることを示唆している。
【００７８】
［実施例２］
蛍光タンパク質における代替切断部位
代替切断部位から発生する蛍光タンパク質断片（本発明の主題である）がＰＣＡで使用できることを実証するために、基本となる蛍光タンパク質ＰＣＡを黄色（ＹＦＰ）蛍光タンパク質について創製した（図４参照）。全長タンパク質（Ｐｄｋ２、１４−３−３σ、ならびにＮＦκＢヘテロ二量体の構成要素であるｐ５０およびｐ６５）をコードするｃＤＮＡを、相補性ＹＦＰ断片であるＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］のＮまたはＣ末端の一方に融合させた。これらの断片は、図１ａおよび図１ｂにＧｌｎ１５７、Ｌｙｓ１５８またはＡｓｐ１７３と示す位置での全長タンパク質の切断に対応する。ここで、表示されたアミノ酸残基はＹＦＰ［１］と称されるＮ末端レポーター断片のＣ末端を表す。１４−３−３／１４−３−３二量体の形成を、各ＰＣＡ断片対がタンパク質−タンパク質複合体の検出を可能にする能力を評価するために使用した。Ｐｄｋ２−ＹＦＰ［１］／Ｐｄｋ２−ＹＦＰ［２］をＰＣＡ陰性対照として使用した。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に各構築体対１００ｎｇを一過性トランスフェクトし、その４８時間後にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダーを用いて総蛍光を評価した。各棒線は３回の測定の平均蛍光を表し、誤差の棒線は９５％信頼限界を表す。モックトランスフェクトされた細胞（ＤＮＡおよび単一ＤＮＡ構築体を含まない）を黄色で示す。様々な断片の方向および組合せを試験した。それは、複合体形成の最適な検出が方向に依存するおそれがあるからである。この実施例において、Ｌｙｓ１５８およびＡｓｐ１７３の切断部位はすべての可能性のある断片の組合せからの１４−３−３／１４−３−３複合体の検出を可能にした。Ｇｌｎ１５６切断部位はＮＣおよびＣＣ方向の両方で１４−３−３／１４−３−３複合体の検出を可能にした。断片／遺伝子方向は以下のとおりであった：
ＮＮ＝１４−３−３−ＹＦＰ［１］／１４−３−３−ＹＦＰ［２］、
ＮＣ＝１４−３−３−ＹＦＰ［１］／ＹＦＰ［２］−１４−３−３、
ＣＮ＝ＹＦＰ［１］−１４−３−３／１４−３−３−ＹＦＰ［２］、
ＣＣ＝ＹＦＰ［１］−１４−３−３／ＹＦＰ［２］−１４−３−３）。
これらの結果は、本発明に組み込まれているタンパク質工学原理の有用性を実証し、様々な断片がＰＣＡに有用であることを示した。本発明の主題である組成物にはＰＣＡに有用な広範囲の突然変異を組み込まれた様々な断片対がある。
【００７９】
［実施例３］
生物学応用のためにＹＦＰ ＰＣＡよりも明るいシグナルを有するスーパー強化ＹＦＰ ＰＣＡ（ＳＥＹＦＰ−ＰＣＡ）および強烈蛍光ＰＣＡ（ＩＦＰ ＰＣＡ）を発生する突然変異断片
ＰＣＡのスペクトル的性質が突然変異断片を操作することによって影響されうることをさらに実証するために、本発明者らはまずＰＣＲで操作してＹＦＰ［１］にＳＥＹＦＰのＦ６４ＬおよびＭ１５３Ｔ突然変異を導入し、新規な断片ＳＥＹＦＰ［１］を創製した。実施例１に記載したようにサブクローニングを行った。プロテインキナーゼＭＥＫおよびＥＲＫと相互作用させるために融合構築体を上に記載するように調製した。配列決定により確認された各レポーター断片における特異的突然変異を付記し、表２および３のようにｗｔＧＦＰに対して示した。
【００８０】
蛍光強度の定量測定のために、トランスフェクションの２４時間前に９６穴ポリリジンコート平板の各穴にＨＥＫ２９３Ｅ細胞１５０００個を蒔いた。ＦｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬を用い、製造業者の勧める条件で各穴あたり総量１００ｎｇのＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。各融合構築体の量は各構築体５０ｎｇから各構築体わずか０．１ｎｇまで変動し、残りのＤＮＡを空の「担体」ベクターで供給した（例えば融合構築体ＤＮＡの総量２ｎｇに対して担体ＤＮＡ９８ｎｇまで）。すべてのトランスフェクションを３回実施した。トランスフェクションの２４時間または４８時間後に細胞を１：３００に希釈したＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）で１０分間染色してからダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で数回洗浄し、次に少量のハンクス緩衝塩類溶液少量を重層した。９０分間３７℃で温置した後に、各穴についての平均蛍光強度のデータをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で励起波長４８５ｎｍ、発光５２７ｎｍおよびカットオフ５１５ｎｍを用いて獲得した。各試料ＰＣＡについて、平均蛍光強度を３回の測定から計算した。蛍光の相対増加倍率を試験ＰＣＡの平均蛍光強度を陰性対照の平均蛍光強度に対して基準化することによって決定した。
【００８１】
図５に示すようにＭＥＫ／ＥＲＫタンパク質−タンパク質複合体を２つの蛍光ＰＣＡのどちらでも検出できた。しかし、ＹＦＰ［１］の代わりにＳＥＹＦＰ［１］（Ｆ６４ＬおよびＭ１５３Ｔ）を使用すると、シグナル強度は２から４倍増強した。この特定の突然変異ＹＦＰ ＰＣＡ（ヒストグラムの左側）で、わずか合計２ｎｇの「試験」ＤＮＡでバックグラウンドを超えるシグナルを容易に検出できた。さらに、ＹＦＰ ＰＣＡ（ヒストグラムの右側）用のＤＮＡ１０ｎｇはほとんど検出できるシグナルを与えなかったが、同量のＳＥＹＦＰ ＰＣＡ用のＤＮＡはバックグラウンドのほぼ４倍のシグナルを与えた（ヒストグラムの左側）。この実施例は、無傷タンパク質の強度を増強することが知られている突然変異が再集合した断片に類似した性質を与えることを実証している。
【００８２】
図６は、図５と同じＰＣＡの蛍光顕微鏡像を示し、ＳＥＹＦＰ［１］の追加の突然変異（ａ欄）が蛍光顕微鏡によって検出されるシグナル強度を増強し、タンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置の識別を改善できることを実証している。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に（担体ＤＮＡ９０ｎｇを加えた）各融合構築体５ｎｇをトランスフェクトした。露出時間２０ｍｓおよびＦＩＴＣフィルターセットを用いたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ−１自動画像獲得システムを用いて４８時間後に画像を獲得した。ＹＦＰ ＰＣＡ（ｂ欄）でもタンパク質−タンパク質複合体を容易に視覚化できたが、強度は低かった。
【００８３】
これらの構築体の断片１は無傷蛍光タンパク質において発色団を形成するアミノ酸の３つすべてを含むことから、本発明者らは単一突然変異断片ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］も試験し個別の断片が蛍光シグナルを発生できないことを確認した。図６のｃ欄およびｄ欄については、表示された突然変異を有する単一融合構築体からのＤＮＡ５０ｎｇをトランスフェクトした。左側の欄は蛍光像を、右側の欄は細胞のＤＡＰＩ染色を示し、撮像された視野に細胞が存在することを実証している。タンパク質Ｐｄｋ２との融合体として発現された断片単独のどちらも蛍光シグナルを与えなかった。６０００を超えるアッセイのその後の分析において、本発明者らが採用した実験条件では蛍光ＰＣＡシグナルの発生は相互作用する分子に依存することが分かった。本発明者らが蛍光分子をタンパク質にタグ付けしているのではないことを実証していることから、これは本発明の重要な特徴である。それどころか、本発明者らはそれ自体が蛍光を発しないポリペプチド断片でタンパク質をタグ付けしている。蛍光シグナルはレポーター断片が融合している分子の相互作用に反応した場合にのみ発生する。目的分子の相互作用によってレポーター断片は極めて近接し、断片が一緒にフォールドし蛍光シグナルを発生することのできる活性構造になることが可能になる。
【００８４】
図７ａおよび７ｂに、生物学応用にいっそう高い感度が可能になるさらに別の新規な突然変異の蛍光タンパク質ＰＣＡの創製を示す。表３においてＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ（Ｖｅｎｕｓ）と称するＹＦＰ変異体に基づいて突然変異を選択した。これらの突然変異は無傷タンパク質において蛍光シグナルの成熟を促進することが示されている（Ｔ．Ｎａｇａｉら、２００２、「Ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｆｕｌｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｆａｓｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８７〜９０頁）。ＰＣＲ突然変異誘発がＳＥＹＦＰ［１］に追加の突然変異Ｆ４６Ｌを、かつＹＦＰ［２］にＶ１６３ＡおよびＳ１７５Ｇを組み入れるために採用され、本発明者らがＩＦＰ［１］およびＩＦＰ［２］と称した新規な断片が生じた。
【００８５】
ＭＡＰキナーゼ・シグナル伝達タンパク質であるＭＥＫおよびＥＲＫの間でのタンパク質−タンパク質複合体の形成を、ＩＦＰ［１］のＮ末端にＭＥＫ１を融合させＩＦＰ［２］のＣ末端にＥＲＫを融合させることによる新規なＩＦＰ ＰＣＡで評価した。図７ａおよび７ｂに示すように、１穴あたり総ＤＮＡ１００ｎｇをトランスフェクトし、ＰＣＡに提供されるＤＮＡの量を１００ｎｇから１００ｐｇまで変動し、残りのＤＮＡを空の「担体」ベクターによって供するタイトレーション系列を実施した。４８時間後に蛍光画像をＨＹＱ−ＦＩＴＣフィルター・キューブを用いたＳＰニコン蛍光顕微鏡で獲得した（励起：４６０〜５００ｎｍ、発光：５０５〜５６０ｎｍ、ダイクロイック・ミラー：５０５ＬＰ）。ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで、表示された露出時間（ｍｓ）で画像を獲得した。ＭＥＫ／ＥＲＫ ＰＣＡの各希釈についての総蛍光も蛍光プレートリーダーで定量した。各希釈について３回の測定を行い、平均蛍光値を陰性対照ＰＣＡの平均蛍光に対して基準化し、図７ｂに示すように陰性対照からの増加倍率を決定した。ＹＦＰ断片への追加の突然変異の導入は、蛍光シグナルを大きく増強し、その蛍光シグナルは０．１ｎｇ（１００ｐｇ）のＤＮＡでも視覚化でき（図７ａ）、定量できた（図７ｂ）。ＩＦＰ ＰＣＡについてのＤＮＡレベルは陰性対照に比べて有意なシグナルを生成した（１．５倍の増加）。対照的に、同じ蛍光強度をＹＦＰ ＰＣＡで生成するには１０ｎｇのＤＮＡが必要であった。
【００８６】
タンパク質−タンパク質相互作用の細胞内位置を同定できることから、ハイコンテント・スクリーニング（ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能になる。例えばシグナル伝達経路内のタンパク質の輸送を観察できる。例えば、本発明者らはｐ６５／ｐ５０のＮＦκＢ転写複合体のサイトカイン誘導性移行を研究するために、上に記載したＩＦＰ ＰＣＡを用いたこのアプローチを使用した（図８）。このタンパク質−タンパク質複合体は腫瘍壊死因子に反応して生細胞の細胞質から核に移行する。一過性トランスフェクトした細胞においてｐ６５およびｐ５０を相補性突然変異断片ＩＦＰ［１］およびＩＦＰ［２］でそれぞれタグづけした場合、トランスフェクションの４８時間後に未刺激細胞の細胞質に主として蛍光シグナルを観察できる。ＴＮＦ反応性ＨＥＫ細胞をＴＮＦ−アルファで処理後３０分以内に蛍光タンパク質−タンパク質複合体は核に専ら移動する。
【００８７】
上の実施例は、ＰＣＡに特定の望みの性質を与えるために操作して突然変異を蛍光タンパク質断片に導入できることを実証している。従って、本発明者らは緑色蛍光タンパク質の以前に記載された突然変異を組み入れて、蛍光タンパク質の新規な断片を多数生み出した（表２および表３参照）。これらの突然変異は操作され、図１に示し上の明細に記載した部位で蛍光タンパク質が切断することによって発生した断片に導入された。追加的に、本発明者らはサンゴ蛍光タンパク質（表４）、ＤｓＲｅｄから得られた単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）（表５および表６）およびアネモニア・スルカータから得られたキンドリング蛍光タンパク質（ＫＦＰ１）（表７および表８）の相同切断部位で新規な断片を生み出した。新規な断片の配列を本発明の請求項の前の付表に示し、配列リストの配列番号２０〜１０６７として表す。これらの配列は請求された本発明の主題である。一般的な用語では本発明者らはこれらを「突然変異断片」と呼ぶ。本発明のために、「突然変異断片」は野生型ｃＤＮＡまたはタンパク質に対して１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸変化を有する蛍光タンパク質の断片である。
【００８８】
［実施例４］
スペクトル偏移ＰＣＡ
緑色蛍光シグナルおよび黄色蛍光シグナルを発生するＰＣＡの多数の例が上に記載され実証された。本明細書に記載された本発明は突然変異断片のアミノ酸配列に応じて多様なスペクトル的性質を発生するＰＣＡを可能にする。この原理をさらに実証するために、シアン蛍光タンパク質の断片に基づくＰＣＡを創製してタンパク質−タンパク質相互作用によって発生した青色蛍光を実証した（図９）。ＣＦＰの断片に対応する２つのオリゴヌクレオチドをＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ボセル、ワシントン州）で合成した。結果として生じた断片をＰＣＲで増幅して、ｐｃＤＮＡ３に基づく発現ベクターにクローニングするために制限部位および１０ａａのフレキシブル・リンカーを付着させ（ＥＣＦＰのａａ１〜１５８とコードする）ＣＦＰ［１］または（ＥＣＦＰのａａ１５９〜２３９をコードする）ＣＦＰ［２］を含むベクターをもたらす。ここでＣＦＰは表３にＥＣＦＰとして示したアミノ酸配列を有する。タンパク質Ｐｄｋ２および１４−３−３ａをそれぞれＣＦＰ［１］およびＣＦＰ［２］のＮ末端に融合させ、一方でＮＦκＢヘテロ二量体のｐ５０サブユニットおよびｐ６５サブユニットをＣＦＰ断片のＣ末端に融合させた。構築体対１４−３−３σ／１４−３−３σ、ｐ６５／ｐ５０およびＰｄｋ２／Ｐｄｋ２陰性対照をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクトし、４８時間後に蛍光顕微鏡観察を行った。蛍光画像を、Ｃｈｒｏｍａ ＣＦＰフィルター（励起：４２６〜４４６ｎｍ、発光：４６０〜５００ｎｍ、ダイクロイックミラー：４５５ＬＰ）を用いたＳＰニコン蛍光顕微鏡で獲得した。画像を図８に示すようにＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで露出時間１〜５秒で獲得した。結果は、無傷蛍光タンパク質においてスペクトル偏移を引き起こす突然変異を操作してＰＣＡ用の断片に導入して、生物学応用への有用性を有する青色蛍光シグナルを発生するＰＣＡを生じることができることを示す。
【００８９】
［実施例５］
多色ＰＣＡ
１組の蛍光タンパク質ＰＣＡを入手できることは、多様な生物学、バイオテクノロジー、創薬および診断応用のための多色ＰＣＡの構築を可能にする。そのような多色ＰＣＡ本発明の別の態様である。
【００９０】
例えば、２、３、４またはそれを超える二分子イベントを同時に検出するために「一般的」Ｆ２ポリペプチド断片を多数の異なるＦ１突然変異断片と組み合わせることができよう。Ｆ２によって相補された場合にＦ１が発色団の形成に必要なすべてのアミノ酸残基を含むというやり方で蛍光タンパク質を切断することによってこれを達成できる。次にＦ１の２つ以上の突然変異断片を創製する。例えば緑色、黄色、シアン、青色または赤色シグナルのいずれかを再構成できる突然変異Ｆ１断片を生み出すことができる。Ｆ２が分子Ａに融合しており、突然変異Ｆ１断片はそれぞれ分子Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに別々に融合しているならば、ＡとＢ、ＡとＣ、ＡとＤ、ＡとＥおよびＡとＦの相互作用を、断片の相補によって発生する蛍光シグナルを５つの異なる波長で試験することによってすべて同時に試験できる。
【００９１】
本発明者らは、モデル系としてＮＦκＢのｐ６５サブユニットがｐ５０サブユニットと、およびタンパク質ＩｋＢαとも複合体を形成できることを用いて生細胞における多色ＰＣＡの原理を実証した。休止細胞においてＩｋＢαはＮＦｋＢに結合し細胞質にその複合体を保有する。このように、ｐ６５はｐ５０およびＩκＢαとも細胞質タンパク質−タンパク質複合体を形成する。本発明者らはＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３つのＰＣＡ構築体ＣＦＰ［１］−ｐ５０、ＣＦＰ［２］−ｐ６５およびＩκＢα−ＹＦＰ［１］を同時トランスフェクトした。Ｃｈｒｏｍａ ＣＦＰフィルター（励起：４２６〜４４６ｎｍ、発光：４６０〜５００ｎｍ、ダイクロイックミラー：４５５ＬＰ）およびＦＩＴＣフィルター（励起：４６０〜５００ｎｍ、発光：５０５〜５６０ｎｍ、ダイクロイックミラー：５０５ＬＰ）を用いたＳＰニコン蛍光顕微鏡で蛍光画像を獲得した。ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで１６ビットモノクロ画像を獲得した。各ＰＣＡについてのＣＦＰおよびＦＩＴＣ画像を次に疑似着色し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてオーバーレイした。ｐ５０とｐ６５との間にタンパク質−タンパク質複合体が形成するならば、ＣＦＰ［１］断片はＣＦＰ［２］断片と相補して青色蛍光を生成するはずである。あるいは、ＩｋＢαとｐ６５との間にタンパク質−タンパク質複合体が形成するならば、ＹＦＰ［１］断片はＣＦＰ［２］断片と相補して黄色蛍光を生成するはずである。図１０に示すように、ｐ６５／ｐ５０（青色）複合体およびＩｋＢα／ｐ６５（黄色）複合体の両方を予想の通り細胞質から検出できた。明るい黄色（ほぼ白色）の細胞質染色パターンを示す細胞はｐ６５／ｐ５０複合体およびＩｋＢα／ｐ６５複合体の両方を発現している。多色ＰＣＡを構築できることによって、同一細胞内で多数の別個のタンパク質−タンパク質複合体を検出および定量することが可能になる。
【００９２】
蛍光タンパク質ＰＣＡの追加の応用
本発明の多数の実際的な応用には、生細胞、細胞溶解物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ形式におけるハイコンテント・アッセイおよびハイスループット・アッセイがある。本発明の応用にはアゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤による生細胞での経路活性化および経路「スイッチング」の検出がある。ある細胞内区画から別の区画へのタンパク質の移行または輸送を追跡できる。もしもタンパク質Ａが当初細胞膜にあるタンパク質Ｂに結合し黄色蛍光シグナルを発し、次に細胞核に移動してタンパク質Ｃに結合しシアン蛍光シグナルを発するならば、黄色対シアンの比を移行イベントの活性化の検出器として使用できる。さらに、診断およびナノテクノロジーにおいて蛍光タンパク質ＰＣＡの多数の応用がある。例えば、各突然変異Ｆ１断片を、異なる抗体との融合体として固相表面アレイに結合させることができ、これを試料中の特異的抗原の存在を検出するために使用できよう。多色ＰＣＡの応用には、生物戦物質の迅速多色診断がある。そのような多色ＰＣＡは本発明の主題である新規な突然変異断片によって可能となる。
【００９３】
組織培養平板、マイクロタイター平板、またはスライド形式を含めた多様な形式で細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ研究できる。ＰＣＡ構築体を保有する細胞をｉｎ ｖｉｖｏでも研究できる。例えば特定のＰＣＡを安定発現する適当な培養細胞を生動物中の腹水として増殖させるか、またはヌード・マウスに導入して腫瘍を形成させることができる。あるいは、ＰＣＡ構築体を保有するトランスジェニック・マウスを作製することができる。動物内のタンパク質−タンパク質複合体を次に例えばＸｅｎｏｇｅｎ（アラミダ、カリフォルニア州）またはＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって供給されるような動物全身画像化システムによって研究できる。本明細書に提示したすべてのＰＣＡ、ならびに様々な強烈黄色蛍光および赤色蛍光ＰＣＡはｉｎ ｖｉｖｏのＰＣＡに特に有用であろう。ｉｎ ｖｉｖｏのＰＣＡ応用には、動物による薬物の消費または注射に対してｉｎ ｖｉｖｏで反応するＰＣＡを生み出す能力がある。前臨床薬物開発への応用には、血液または尿を採取せずに生動物においてＡＤＭＥ研究（薬物の吸収、分布、代謝または排泄）を実施する能力がある。例えば、薬物が生動物の細胞内で特異的タンパク質−タンパク質複合体の増加または減少を引き起こすならば、薬物投与後の様々な時間に蛍光シグナルを獲得でき、それによって動物全身における薬物の薬物動態および薬物動力学的性質の推定が可能になる。
【００９４】
最後に、蛍光タンパク質の広範囲の相補性突然変異断片が入手できることから、ＰＣＡに特に有用な突然変異断片の組合せを経験的に試験することが可能になる。組合せに関するＰＣＡのこの特徴によって、薬物スクリーニング、ターゲット・バリデーション、ＡＤＭＥ、および診断応用に使用するための多様な色、強度、組合せおよび物理的性質を有する多数の新規なアッセイを生み出すことが可能になる。
【００９５】
以下の特許および刊行物のすべての内容は、そこに引用されている参照を含めて、すべての目的に対してその全体が参照により組み込まれ、それはそれぞれ個別の特許、特許出願または公報がそのように個別に表示されているのと同程度である。
【００９６】
米国特許第６２７０９６４号 Ｍｉｃｈｎｉｃｋら
米国特許第６２９４３３０号 Ｍｉｃｈｎｉｃｋら
米国特許第６４２８９５１号 Ｍｉｃｈｎｉｃｋら
米国特許第５８０４３８７号 Ｃｏｒｍａｃｋら
米国特許第５６２５０４８号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６０５４３２１号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６０２７８８１号 Ｐａｖｌａｋｉｓら
米国特許第６４６９１５４号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６０６６４７６号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６１７２１８８号 Ｔｈａｓｔｒｕｐら
米国特許第６９６８７３８号 Ａｎｄｅｒｓｏｎら
米国特許第６０９０９１９号 Ｃｏｒｍａｃｋら
米国特許第６１２４１２８号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６５１８０２１号 Ｔｈａｓｔｒｕｐら
【００９７】
Pelletier, J.N.、Remy, I.およびMichnick, S.W. 1998（タンパク質断片の相補性アッセイ：タンパク質−タンパク質相互作用のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための一般戦略）J. Biomolecular Techniques 10: 32〜19頁
Remy, I.、Pelletier, J.N.、Galarneau, A.およびMichnick, S.W.、2002（タンパク質断片相補戦略を用いたタンパク質相互作用およびライブラリー・スクリーニング）Protein-protein Interactions: A Molecular Cloning Manual、E.A. Golemis編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第25章、449〜475頁
Michnick, S.W.、Remy, I.、C.-Valois, F.X.、Vallee-Belisle, A.、Galarneau, A.およびPelletier, J.N.、2000（タンパク質断片相補戦略によるタンパク質−タンパク質相互作用の検出、第Ａ部および第Ｂ部）（John N. Abelson、Scott D. EmrおよびJeremy Thorner編）Methods in Enzymology、328: 208〜230頁
J. N. PelletierおよびS. W. Michnick.、1997（タンパク質断片相補に基づくｉｎ ｖｉｖｏタンパク質−タンパク質相互作用の検出戦略）Protein Engineering、10（増刊）: 89
I. Ghosh、A.D. HamiltonおよびL. Regan、2000、（逆平行ロイシン・ジッパー特異的タンパク質再集合：緑色蛍光タンパク質への応用）J. Am. Chem. Soc 122: 5658〜5659頁、2000
C.-D. Huら、2002（二分子蛍光相補を用いた生細胞におけるbZIPおよびRelファミリー・タンパク質間の相互作用の視覚化）Molecular Cell 9: 789〜798頁
Tsien, R.Y.、1998（緑色蛍光タンパク質）Annual Reviews of Biochemistry 67: 509〜544頁
Zhang J.、Campbell R.E.、Ting A.Y.およびTsien, R.T. (2000)（細胞生物学のための新しい蛍光プローブの創製）Nature Reviews 3: 906〜918頁
【００９８】
新規な断片の配列を以下の付表に示し、配列リストの配列番号２０〜１０６７として表し、これらの配列は請求された本発明の主題である。
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】
【０２２１】
【０２２２】
【０２２３】
【０２２４】
【０２２５】
【０２２６】
【０２２７】
【０２２８】
【０２２９】
【０２３０】
【０２３１】
【０２３２】
【０２３３】
【０２３４】
【０２３５】
【０２３６】
【０２３７】
【０２３８】
【０２３９】
【０２４０】
【０２４１】
【０２４２】
【０２４３】
【０２４４】
【０２４５】
【０２４６】
【０２４７】
【０２４８】
【０２４９】
【０２５０】
【０２５１】
【０２５２】
【０２５３】
【０２５４】
【０２５５】
【０２５６】
【０２５７】
【０２５８】
【０２５９】
【０２６０】
【０２６１】
【０２６２】
【０２６３】
【０２６４】
【０２６５】
【０２６６】
【０２６７】
【０２６８】
【０２６９】
【０２７０】
【０２７１】
【０２７２】
【０２７３】
【０２７４】
【０２７５】
【０２７６】
【０２７７】
【０２７８】
【０２７９】
【０２８０】
【０２８１】
【０２８２】
【０２８３】
【０２８４】
【０２８５】
【０２８６】
【０２８７】
【０２８８】
【０２８９】
【０２９０】
【０２９１】
【０２９２】
【０２９３】
【０２９４】
【０２９５】
【０２９６】
【０２９７】
【０２９８】
【０２９９】
【０３００】
【０３０１】
【０３０２】
【０３０３】
【０３０４】
【０３０５】
【０３０６】
【０３０７】
【０３０８】
【０３０９】
【０３１０】
【０３１１】
【０３１２】
【０３１３】
【０３１４】
【０３１５】
【０３１６】
【０３１７】
【０３１８】
【０３１９】
【０３２０】
【０３２１】
【０３２２】
【０３２３】
【０３２４】
【０３２５】
【０３２６】
【０３２７】
【０３２８】
【０３２９】
【０３３０】
【０３３１】
【０３３２】
【０３３３】
【０３３４】
【０３３５】
【０３３６】
【０３３７】
【０３３８】
【０３３９】
【０３４０】
【０３４１】
【０３４２】
【０３４３】
【０３４４】
【０３４５】
【０３４６】
【０３４７】
【０３４８】
【０３４９】
【０３５０】
【０３５１】
【０３５２】
【０３５３】
【０３５４】
【０３５５】
【０３５６】
【０３５７】
【０３５８】
【０３５９】
【０３６０】
【０３６１】
【０３６２】
【０３６３】
【０３６４】
【０３６５】
【０３６６】
【０３６７】
【０３６８】
【０３６９】
【０３７０】
【０３７１】
【０３７２】
【０３７３】
【０３７４】
【０３７５】
【０３７６】
【０３７７】
【０３７８】
【０３７９】
【０３８０】
【０３８１】
【０３８２】
【０３８３】
【０３８４】
【０３８５】
【０３８６】
【０３８７】
【０３８８】
【０３８９】
【０３９０】
【０３９１】
【０３９２】
【０３９３】
【０３９４】
【０３９５】
【０３９６】
【０３９７】
【０３９８】
【０３９９】
【０４００】
【０４０１】
【０４０２】
【０４０３】
【０４０４】
【０４０５】
【０４０６】
【０４０７】
【０４０８】
【０４０９】
【０４１０】
【０４１１】
【０４１２】
【０４１３】
【０４１４】
【０４１５】
【０４１６】
【０４１７】
【０４１８】
【０４１９】
【０４２０】
【０４２１】
【０４２２】
【０４２３】
【０４２４】
【０４２５】
【０４２６】
【０４２７】
【０４２８】
【０４２９】
【０４３０】
【０４３１】
【０４３２】
【０４３３】
【０４３４】
【０４３５】
【０４３６】
【０４３７】
【０４３８】
【０４３９】
【０４４０】
【０４４１】
【０４４２】
【０４４３】
【０４４４】
【０４４５】
【０４４６】
【０４４７】
【０４４８】
【０４４９】
【０４５０】
【０４５１】
【０４５２】
【０４５３】
【０４５４】
【０４５５】
【０４５６】
【０４５７】
【０４５８】
【０４５９】
【０４６０】
【０４６１】
【０４６２】
【０４６３】
【０４６４】
【０４６５】
【０４６６】
【０４６７】
【０４６８】
【０４６９】
【０４７０】
【０４７１】
【０４７２】
【０４７３】
【０４７４】
【０４７５】
【０４７６】
【０４７７】
【０４７８】
【０４７９】
【０４８０】
【０４８１】
【０４８２】
【０４８３】
【０４８４】
【０４８５】
【０４８６】
【０４８７】
【０４８８】
【０４８９】
【０４９０】
【０４９１】
【０４９２】
【０４９３】
【０４９４】
【０４９５】
【０４９６】
【０４９７】
【０４９８】
【０４９９】
【０５００】
【０５０１】
【０５０２】
【０５０３】
【０５０４】
【０５０５】
本発明の一部を形成する突然変異していない断片
［ａａはアミノ酸である］
ＧＦＰ Ｆ１：ｗｔ ＧＦＰ（配列番号２）のａａ残基１−３９
ＧＦＰ Ｆ２：ｗｔ ＧＦＰ（配列番号２）のａａ残基４０−２３８
ＹＦＰ Ｆ１Ａ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−４０
ＹＦＰ Ｆ２Ａ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基４１−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｂ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１０３
ＹＦＰ Ｆ２Ｂ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１０４−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｃ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１１７
ＹＦＰ Ｆ２Ｃ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１１８−２３９
ＹＦＰ Ｆ１ＤＸ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１５８
ＹＦＰ Ｆ２ＤＸ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１５９−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｄ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１５９
ＹＦＰ Ｆ２Ｄ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１６０−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｅ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１７４
ＹＦＰ Ｆ２Ｅ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１７５−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｆ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１９１
ＹＦＰ Ｆ２Ｆ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１９２−２３９
ＥＧＦＰＦＡ：ｗｔ ＥＧＦＰ（配列番号３）のａａ残基４１−２３９
ＲＦＰ Ｆ１Ａ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−３９
ＲＦＰ Ｆ２Ａ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基４０−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｂ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１０１
ＲＦＰ Ｆ２Ｂ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１０２−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｃ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１１５
ＲＦＰ Ｆ２Ｃ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１１６−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｄ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１５３
ＲＦＰ Ｆ２Ｄ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１５４−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｅ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１６９
ＲＦＰ Ｆ２Ｅ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１７０−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｆ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１８４
ＲＦＰ Ｆ２Ｆ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１８５−２２５
ＫＦＰ Ｆ１Ａ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−３６
ＫＦＰ Ｆ２Ａ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基３７−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｂ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−９８
ＫＦＰ Ｆ２Ｂ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基９９−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｃ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１５３
ＫＦＰ Ｆ２Ｃ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１５４−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｄ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１１２
ＫＦＰ Ｆ２Ｄ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１１３−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｅ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１６９
ＫＦＰ Ｆ２Ｅ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１７０−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｆ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１８６
ＫＦＰ Ｆ２Ｆ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１８７−２３２
【０５０６】
本明細書に開示された本発明の多数の形態が目下の好ましい実施形態を構成するが、他の多くの実施形態が可能であり、好ましい実施形態および他の可能性のある実施形態のさらなる詳細は限定として解釈すべきではない。本明細書に使用された用語は限定よりも記述に過ぎず、請求された本発明の精神または範囲から逸脱せずに様々な変更、多くの等価物を行えることが了承されている。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条に基づき、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００３年４月９日に出願した「タンパク質断片の相補性アッセイのための蛍光タンパク質断片」という標題の米国特許仮出願第６０／４６１１３３号の優先権の利益を主張するものである。本出願は、２００３年１月２９日に出願した係続中の米国特許出願第１０／３５３０９０号の一部継続出願でもあり、同出願は２００２年５月２４日に出願した係続中の米国出願第１０／１５４７５８号の継続出願であり、同出願は２０００年２月７日に出願した米国特許出願第０９／４９９４６４号（現在の米国特許第６４２８９５１号）の継続出願であり、同出願は１９９８年２月２日に出願した米国特許出願第０９／０１７４１２号（現在の米国特許第６２７０９６４号）の継続出願である。
【０００２】
本発明は、一般に生物学、分子生物学、化学および生化学の分野に関する。具体的には本発明は、蛍光タンパク質に基づくタンパク質断片の相補性アッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ：ＰＣＡ）に関する。本発明は、適当な断片対の設計および創製のための方法、その断片の組成物、ならびにＰＣＡに適した組合せに関する。好ましい実施形態は、バイオテクノロジー応用に適した性質を有する突然変異の蛍光タンパク質断片を含む。
【背景技術】
【０００３】
天然蛍光タンパク質、生物発光タンパク質または燐光タンパク質の大きくなりつつあるリストには、エクオレア・ビクトリア（オワンクラゲ）（Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来ＧＦＰおよびますます数が増えている有用な性質を有するＧＦＰの配列変異体が含まれる。そのリストには、ディスコソマ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）由来赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）およびアネモニア（Ａｎｅｍｏｎｉａ）由来キンドリング（ｋｉｎｄｌｉｎｇ）蛍光タンパク質（ＫＦＰ１）も含まれる。これらのタンパク質は、コア・アミノ酸残基のエンド環化の結果としてすべてが高可視性の効率的に発光する内部蛍光団を発生できる自己触媒酵素である。蛍光タンパク質の別の共通特性は、シグナルが安定で、種に依存せず、シグナルの発生に基質または補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を何も必要としないことである。これらの蛍光タンパク質は構造が著しく類似しており、類似したタンパク質工学の原理を複数の種に応用することが可能である。
【０００４】
ＧＦＰの一アイソタイプ（「野生型ＧＦＰ」）の全長ＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を表１に示す。これらの配列は完全に記載されキャラクタリゼーションされた（例えばＴｓｉｅｎら、１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９〜５４４頁参照）。無傷タンパク質（図１および２Ｂ）はｐ−ヒドロキシベンジリデンイミダゾロン発色団から強い可視吸光および蛍光を発生し、その発色団はそのタンパク質自体の位置６５から６７のＳｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ配列の環化および酸化によって発生する。新たに合成された蛍光タンパク質ポリペプチドは、蛍光を発する前に正しく成熟する必要がある。成熟プロセスは２つのステップ、すなわち折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）および発色団の形成を伴う。まず、タンパク質は天然立体配座にフォールドし、次に内部トリペプチドが環化し酸化する。これに関して、蛍光タンパク質は環化反応を自己触媒し、反応の完了に分子状酸素のみを必要とする酵素である。
【０００５】
多様な有用突然変異体版の全長、野生型ＧＦＰが生み出され、「エクオレア蛍光タンパク質（ＡＦＰ）変異体」またはＡＦＰと名付けられた。これらの「突然変異の蛍光タンパク質」のスペクトル的性質の改良の結果として、これらのタンパク質は生物学およびバイオテクノロジー応用に広い応用性を有することが分かった。報告されたＧＦＰ変異体のいくつかを表２に示す。従来の慣例によって、（表２および本発明全体におけるような）突然変異の位置は野生型ＧＦＰの配列（表１）に対して表示される。これらのＡＦＰの多くは本来の野生型タンパク質よりもシグナル強度の点ではるかに改善した性質を示し、野生型タンパク質の５から３０倍の蛍光シグナルを発生する。ほぼすべての生物学応用および突然変異の蛍光タンパク質の基礎である強化（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）は、哺乳動物細胞に対して向上したコドン使用頻度を有する。
【０００６】
ＧＦＰから始まり、種々の色変異体をもたらす発色団部位での突然変異が創製された。発色団と接触している側鎖の突然変異はタンパク質の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）および明るさをさらに強化することが示された。スペクトル偏移を有し、３７℃でさらに迅速にフォールドする突然変異の組合せが創製され、細胞生物学応用のためにさらに明るいシグナルを生成した。最も一般的なスペクトル変異体には広く使われている黄色（ＹＦＰ／ＥＹＦＰ）変異体、シアン（ＣＦＰ／ＥＣＦＰ）変異体およびＢＦＰ変異体がある（Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、１９９８、「緑色蛍光タンパク質」、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６７：５０９〜５４４頁）。
【０００７】
独特の性質を有するＧＦＰの追加の突然変異体が創製された。これらには、ＣＦＰとＥＧＦＰとの中間の励起波長および発光波長を有する「ＣＧＦＰ」変異体がある（Ｊ．Ｚｈａｎｇら、２０００、「細胞生物学のための新規な蛍光プローブの創製」、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３：９０６〜９１８頁）。ＹＦＰ（ＹＦＰ−Ｑ６９Ｍ）の「シトリン（ｃｉｔｒｉｎｅ）」変異体は、以前のＹＦＰよりも低いｐＫａ、塩素陰イオンに対する無差別、以前のＹＦＰの２倍の光安定性、ならびに３７℃およびオルガネラにおけるずっと良好な発現を与える（Ｏ．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋら、２００１、「黄色蛍光タンパク質の環境感度の減少」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：２９１８８〜２９１９４頁）。
【０００８】
いくつかの種類のＹＦＰがランダム突然変異誘発を用いて創製された。これらの突然変異タンパク質はＥＹＦＰよりも３〜３０倍高い傾向強度を有す。これらにはいわゆるスーパーＥＹＦＰ（ＳＥＹＦＰ）（ＥＹＦＰ−Ｆ６４Ｌ／Ｍ１５３Ｔ／Ｖ１６３Ａ／Ｓ１７５Ｇ）および「Ｖｅｎｕｓ」（ＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ）（Ｔ．Ｎａｇａｉら、２００２、「細胞生物学的応用のための早く効率的な成熟を有する種々の黄色蛍光タンパク質」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８７〜９０頁）。Ｖｅｎｕｓは新規な突然変異Ｆ４６Ｌを含み、その突然変異は３７℃で突然変異の律速段階である発色団の酸化を大きく促進する。追加のＳＥＹＦＰ突然変異の結果として、Ｖｅｎｕｓ ＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌは折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）も十分であり、酸または高塩素陰イオン濃度の曝露に対して相対的に耐性である。
【０００９】
ＰＡ−ＧＦＰ（ＧＦＰ−Ｖ１６３Ａ／Ｔ２０３Ｈ）と名付けられたＧＦＰの光励起型は、４１３ｎｍ光の強光照射後に４８８ｎｍ光で励起した場合に蛍光が１００倍に増加し、好気条件で数日間安定であると報告された（Ｇ．Ｈ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＆ Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、「タンパク質と細胞の選択的な光標識のための光活性なＧＦＰ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８７３〜１８７７頁、２００２）。
【００１０】
【表１】
【００１１】
【表２】
【００１２】
【表３】
【００１３】
エクオレア・ビクトリア（オワンクラゲ）以外の種からの蛍光タンパク質も単離されキャラクタリゼーションされた。増加中のリストには、レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの緑色蛍光タンパク質およびサンゴである花虫類からの多数の蛍光タンパク質が含まれる。これらにはディスコソマからの赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）が含まれ（Ｍ．Ｖ．Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：９６９〜９７３頁）、そのタンパク質は結晶化され（Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：４６２〜４６７頁）、生物学のツールとして広い応用性が見出された。サンゴ蛍光タンパク質はエクオレアＧＦＰとわずか２６〜３０％の配列同一性しか有さないが、それらは構造的に著しく類似している。具体的には、サンゴ蛍光タンパク質はＧＦＰに最初に観察されたのと同じβカン（β−ｃａｎ）フォールドを共に有する。ＧＦＰで観察された主要な二次構造エレメントのすべてを、同一配置でサンゴタンパク質から容易に検出でき、カンの「キャップ」を形成するストレッチに著しい類似性が観察された。ＧＦＰにおける発色団形成に関与すると考えられる主要残基はサンゴタンパク質においても保存され、残基９６にアルギニン、残基６６にチロシンおよび残基６７にグリシンを含む。
【００１４】
様々な種間で蛍光タンパク質の構造が相同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）であることは、以前にＧＦＰに応用された遺伝子工学およびタンパク質工学の原理の多くをこれらの蛍光タンパク質にも応用して生物学的応用およびバイオテクノロジーのための望みの性質を有する変異体を創製できることを意味している。
【００１５】
以前に記載されたＧＦＰの緑色、黄色およびシアン変異体とスペクトルが別個であることから、高い量子収量を有する明るい橙赤色蛍光タンパク質を入手できることは生物学の研究に特に有用であろう。ＤｓＲｅｄとして一般的に知られているＤｒＦＰ５８３はＧＦＰと本質的に同一の発色団を有する２８ｋＤａのポリペプチドであり、その発色団は内部Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（残基６６〜６８）トリペプチドから自己触媒的に形成する。ＤｓＲｅｄはＡ．ビクトリアＧＦＰと構造的に著しく類似している。実際に、ＤｓＲｅｄの全体的なフォールドはＧＦＰと事実上同一であり、中心に同軸のヘリックスとバレル末端にアルファ・ヘリックスのキャップとを有するストランド１１本のわずかに不規則なベータ・バレル（βカンと記載）からなる。エクオレアＧＦＰとのサンゴ蛍光タンパク質の配列アラインメントを表４に示す。
【００１６】
多数の突然変異体版のＤｓＲｅｄは野生型タンパク質よりも発色団成熟が高速であることが今回記載されていた（Ｂ．Ｊ．ＢｅｖｉｓおよびＢ．Ｓ．Ｇｌｉｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８３〜８６頁、２００２）。重要なことに、ＤｓＲｅｄは最近単量体型に操作された（ｍＲＦＰ）（Ｒ．Ｅ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２００２年６月１１日、「単量体型赤色蛍光タンパク質（Ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（１２）：７８７７〜７８８２頁）。この単量体型はレポーターとして多量体タンパク質よりも有用である。ｍＲＦＰ１は単量体であり、シグナルはＤｓＲｅｄよりも１０倍を超えて速く成熟し、単量体タンパク質はＧＦＰの励起に適した波長で最小の発光しか有さない。
【００１７】
独特のＧＦＰ様色素タンパク質ａｓＣＰがイソギンチャクであるアネモニア・スルカータ（Ａｎｅｍｏｎｉａ ｓｕｌｃａｔａ）から最近発見された（Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．ら、２００３、「精密なｉｎ ｖｉｖｏ光標識用の蛍光タンパク質のキンドリング」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１、１９１〜１９４頁）。ａｓＣＰは初め非蛍光であるが、強い緑色光の照射に反応して５９５ｎｍで発光を有する明るい蛍光を発する（キンドル（ｋｉｎｄｌｅ）する）ようになる。キンドルしたａｓＣＰは、１０秒未満の半減期で緩和して最初の非蛍光状態に戻る。あるいは、青色光の短時間照射によって蛍光を直ちに完全に「消光」できる。非蛍光形から、キンドルしていないタンパク質よりも３０倍大きい蛍光強度を有する安定な明るい赤色蛍光形への独特な不可逆の光転換（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）可能な突然変異体（ａｓＣＰ Ａ１４８ＧまたはＫＦＰ１）が生み出された。細胞、オルガネラおよびタンパク質の移動を追跡するための精密なｉｎ ｖｉｖｏ光標識（ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌ）に、この「キンドリング蛍光タンパク質」を使用できる。
【００１８】
蛍光タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏおよびリアル・タイムで遺伝子発現およびタンパク質局在を監視するための有用なレポーターであることが証明された（Ｊ．Ｍ．Ｔａｖａｒｅら、２００１、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７０：２９７〜３０６頁；Ｔｈａｓｔｒｕｐら、米国特許第６５１８０２１号）。そのようなアッセイは、二元または高次のイベントに比べて個々のタンパク質に結びついている細胞イベントを測定する。生細胞におけるタンパク質動力学を分析するための生化学センサーの構築および革新的な融合構築体の創製を含めた、蛍光タンパク質の他の有用な応用が多数記載されている。二分子イベントの測定のために、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイまたはＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）アッセイが十分に記載された（Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ ＆ Ｒ．Ｔｓｉｅｎ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２７：４７２〜５００頁；Ｇ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎら、１９９８、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：２７０２〜２７１３頁）。ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰおよびＲＦＰは、他の使用からとりわけタンパク質−タンパク質相互作用を検出し、プロテアーゼ活性を監視し、かつカルシウム指示薬を創製するためのＦＲＥＴまたはＢＲＥＴアッセイに使用された。
【００１９】
上に言及したすべての応用が、機能的な全長（または実質的に全長）蛍光タンパク質（発光団）を目的タンパク質にタグ付けするのに頼っていることに留意することが重要である。上に引用した参照のいずれもが蛍光タンパク質の断片の組成物についても使用についても記載していない。
【００２０】
タンパク質断片の相補性アッセイ（ＰＣＡ）は生体分子および薬物相互作用の検出および定量のためのアッセイを構築するための一般法に相当する（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｊ．Ｎ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．およびＭｉｃｈｎｉｃｋ、Ｓ．Ｗ．１９９８、タンパク質断片の相補性アッセイ：タンパク質−タンパク質相互作用のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための一般戦略、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：３２〜１９頁；Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．２００２、タンパク質断片相補戦略を用いたタンパク質相互作用およびライブラリー・スクリーニング：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２５章、４４９〜４７５頁；Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ，Ｆ．Ｘ．、Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ，Ａ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、２０００、タンパク質断片相補戦略によるタンパク質−タンパク質相互作用の検出、第Ａ部および第Ｂ部、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：２０８〜２３０頁；Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ．、１９９７、タンパク質断片相補に基づくｉｎ ｖｉｖｏタンパク質−タンパク質相互作用の検出戦略」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０（別冊）：８９頁）。
【００２１】
ＰＣＡは、単量体酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質または燐光タンパク質のようなレポータータンパク質の断片のオリゴマー化介助性相補を伴う。二量体および多量体酵素もＰＣＡに使用できるが、単量体タンパク質が好ましい。Ｍｉｃｈｎｉｃｋら（米国特許第６２７０９６４号）が記載したように、ＰＣＡに適するタンパク質の理想的な性質は、１）相対的に低分子量の単量体のタンパク質または酵素であり、２）それについての構造および機能の情報に関する大規模な資料があり、３）そのタンパク質の再構成またはその酵素の活性に対する簡便なアッセイが存在し、かつ４）それについて真核細胞および原核細胞における過剰発現が実証されたものである。
【００２２】
米国特許第６２７０９６４号の図１はＰＣＡの概要を示している。タンパク質または酵素の遺伝子を２つ以上の断片に合理的に解体する。分子生物学の手法を用いて、選択された断片をサブクローニングし、相互作用することが公知であるか、またはそう考えられるどちらかのタンパク質をそれぞれの５’末端に融合させる。次に、細胞へのこれらのＤＮＡ構築体の同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を行う。断片相互に対する試験タンパク質（ｔｅｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の結合によって、断片からのプローブタンパク質または酵素の再集合が触媒され、一部のアッセイは再構築を観察する。融合した相互作用性タンパク質がタンパク質または酵素の再集合を触媒する場合にのみこれらのアッセイがうまく進むことを理解するのが重要である。すなわち、再構成したタンパク質または酵素活性の観察が融合タンパク質の相互作用の尺度でなければならない。
【００２３】
米国特許第６２７０９６４号は、蛍光シグナルを発することができる多数の有用レポーターについてＰＣＡの原理、方法および応用を教示している（表１参照）。この特許の実施例３はＰＣＡに適した多数の特異的レポーターを含むＰＣＡの様々な実施形態を記載している。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、蛍ルシフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＰＲＴ）、ジアホラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ブレオマイシン結合タンパク質、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールＮＡＤ＋オキシドレダクターゼおよびエクオレア緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）について詳細が記載された。米国特許第６２７０９６４号の表１はＰＣＡの基準に合致する他のレポーターの一層大きなリストを記載している。
【００２４】
米国特許第６２７０９６４号の実施例３にＧＦＰに基づくＰＣＡがその性質および利点を含めて記載された：「エクオレア・ビクトリア（オワンクラゲ）からのＧＦＰは遺伝子発現のための最も普及したタンパク質マーカーの１つになりつつある。これは低分子量、単量体のアミノ酸２３８個のタンパク質は、残基Ｓｅｒ６５とＧｌｙ６７との間のポリペプチド主鎖の自己触媒性環化およびＴｙｒ６６の結合の酸化から生じる内部発色団の存在が原因で本来蛍光性であることを理由とする。ＧＦＰ発色団は３９５ｎｍで最適に光を吸収し、４７０ｎｍで第２の最大吸収も有する。この二特異性吸収は、相対分布数が発色団の局所環境に依存している発色団の低エネルギー配座異性体が２つ存在することを示唆している。異性体化を排除する突然変異体Ｓｅｒ６５Ｔｈｒは野生型よりも４から６倍強い蛍光をもたらす。近年、ＧＦＰの構造が２つのグループによって解明され、ＧＦＰが構造に基づくＰＣＡ設計の候補となり、そのＰＣＡの開発を本発明者らは開始した。ＧＳＴアッセイと同様に、オリゴマー化ドメインとしてＧＣＮ４ロイシン・ジッパー形成配列を有する大腸菌を用いて本発明者らは初期の開発のすべてを行っている。広域スペクトルＵＶ光下で可視光観察を行うことによる蛍光の直接検出を用いる。本発明者らはＣＯＳ細胞において蛍光活性化セルソーティング」を用いた同時トランスフェクタントも選択してこの系を試験する。米国特許第６２７０９６４号、米国特許第６２９４３３０号および米国特許第６４２８９５１号の発行された請求項は、蛍光タンパク質以外に他のレポーターのクラスを含んでいる。ＰＣＡは多様なペプチド・ライブラリー（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：６８３〜６９０頁）およびｃＤＮＡまたは抗体ライブラリー（Ｅ．Ｍｏｅｓｓｎｅｒら、２００１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５〜１２２頁；Ｉ．Ｒｅｍｙら、公表のために投稿中）をスクリーニングするために、平行および逆平行ロイシン・ジッパー形成配列のようなタンパク質ドメインの会合定数を定量するために（Ｋ．Ｍ．Ａｒｎｄｔら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６２７〜６３９頁；Ｉ．Ｇｈｏｓｈら、２０００、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ１２２：５６５８〜５６５９頁）、薬物によって誘発されるタンパク質複合体の会合および解離を検出するために（Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５３９４〜５３９９頁）、リガンドが誘発する細胞受容体の活性化を測定するために（Ｉ．Ｒｅｍｙら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：９９０〜９９３頁）、生細胞における転写因子複合体を研究するために（Ｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７６９〜７７２頁、２００１）、リアルタイムでシグナル伝達経路のエレメントを定量するために（Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２００１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８：７６７８〜７６８３頁、２００１；Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：６１９〜６２２頁）、ならびにタンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置を正確に決定するために（Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２００１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：７６７８〜７６８３頁；Ｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９：７６９〜７７２頁；Ｃ．−Ｄ．Ｈｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ９：７８９〜７９８頁、２００２；Ｈ．Ｙｕら、公表のために投稿中）使用された。
【００２５】
ＰＣＡへのＧＦＰの使用を記載している本発明者らの発明の後に、Ｇｈｏｓｈら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １２２：５６５８〜５６５９頁、２０００；米国特許出願第２００２／０１４６７０１号）は、本来Ｍｉｃｈｎｉｃｋらによって提案された方法でＧＣＮ４ロイシン・ジッパーのオリゴマー化を研究するためにＧＦＰ ＰＣＡを使用した。彼らは細菌において逆平行ロイシン・ジッパー特異的にＧＦＰ断片が再集合することを示した。これらの研究には単一ＧＦＰ変異体が選択され、単一の切断部位が使用された。著者らは、Ｍｉｃｈｎｉｃｋら（例えば、米国特許第６２７０９６４号）に最初に記載された原理を超えた合理的設計に基づいて蛍光タンパク質を切断するための追加の原理または方法を開示しなかった。さらに、ロイシン・ジッパーの研究に使用された断片対以外にＧｈｏｓｈおよび共同研究者らはＰＣＡに有用な特定のアッセイ組成物を開示しなかった。
【００２６】
Ｈｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ９：７８９〜７９８頁、２００２）は、ＧＦＰの黄色変異体に基づくＰＣＡを記載し、そのアッセイではＹＦＰの断片が平行ロイシン・ジッパーまたはＲｅｌファミリー・タンパク質のどちらかに融合された。しかし、蛍光タンパク質および断片組成物を操作する追加の原理および方法は、Ｈｕおよび共同研究者らによって記載されなかった。さらに、従来技術は無傷蛍光タンパク質の性質に影響することが知られている突然変異がＰＣＡに使用されたポリペプチド断片に類似の性質を与えるかどうかの話題について記載していない。
【００２７】
蛍光タンパク質ＰＣＡはシグナルの発生を外部の補因子または基質に依存しないことから、これらのＰＣＡは細胞に基づくアッセイの構築に特に有用である。１組の蛍光タンパク質ＰＣＡは様々なスペクトル的性質を有する多数の有用なアッセイを可能にするであろう。例えば、高量子収量の蛍光タンパク質をＰＣＡ断片に操作することができ、それによって非常に低レベル発現するタンパク質間の複合体、または酵素とその基質との低親和性複合体のような細胞内の稀少イベントの検出が可能になる。さらに、赤色偏移した発光を有するＰＣＡは、緑色チャネルでしばしば起こる細胞の自己蛍光に関連する雑音に対して改良されたシグナルをもたらすと思われる。重要なことには異なる色を発生する断片を用いたＰＣＡを組み合わせることができ、それによって２、３、またはそれを超える細胞イベントの同時監視が可能になる（多色ＰＣＡ）。最後に迅速診断のための多色アレイを創製するために、蛍光タンパク質ＰＣＡを使用できる。例えば、異なる抗原に結合する抗体に基づく多色アレイは生物戦用物質の迅速同時検出を可能にするであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】米国特許出願第６０／４６１１３３号
【特許文献２】米国特許出願第１０／３５３０９０号
【特許文献３】米国特許出願第１０／１５４７５８号
【特許文献４】米国特許出願第０９／４９９４６４号
【特許文献５】米国特許第６４２８９５１号
【特許文献６】米国特許出願第０９／０１７４１２号
【特許文献７】米国特許第６２７０９６４号
【特許文献８】米国特許第６５１８０２１号
【特許文献９】米国特許第６２９４３３０号
【特許文献１０】米国特許出願第２００２／０１４６７０１号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、１９９８、「Ｔｈｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６７：５０９〜５４４頁
【非特許文献２】Ｊ．Ｚｈａｎｇら、２０００、「Ｃｒｅａｔｉｎｇ ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３：９０６〜９１８頁
【非特許文献３】Ｏ．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋら、２００１、「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：２９１８８〜２９１９４頁
【非特許文献４】Ｔ．Ｎａｇａｉら、２００２、「Ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｆａｓｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８７〜９０頁
【非特許文献５】Ｇ．Ｈ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＆ Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、「Ａ ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ＧＦＰ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８７３〜１８７７頁、２００２
【非特許文献６】Ｓａｗａｎｏ ＆ Ｍｉｙａｗａｋｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２８：Ｅ７８（２０００）
【非特許文献７】Ｍ．Ｖ．Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：９６９〜９７３頁
【非特許文献８】Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：４６２〜４６７頁
【非特許文献９】Ｂ．Ｊ．ＢｅｖｉｓおよびＢ．Ｓ．Ｇｌｉｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８３〜８６頁、２００２
【非特許文献１０】Ｒ．Ｅ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２００２年６月１１日、「Ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（１２）：７８７７〜７８８２頁
【非特許文献１１】Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．ら、２００３、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１、１９１〜１９４頁
【非特許文献１２】Ｊ．Ｍ．Ｔａｖａｒｅら、２００１、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７０：２９７〜３０６頁
【非特許文献１３】Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ ＆ Ｒ．Ｔｓｉｅｎ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２７：４７２〜５００頁
【非特許文献１４】Ｇ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎら、１９９８、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：２７０２〜２７１３頁
【非特許文献１５】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｊ．Ｎ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．およびＭｉｃｈｎｉｃｋ、Ｓ．Ｗ．１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：３２〜１９頁
【非特許文献１６】Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ第２５章、４４９〜４７５頁
【非特許文献１７】Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．、Ｒｅｍｙ，Ｉ．、Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ，Ｆ．Ｘ．、Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ，Ａ．、Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．＆ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．、２０００、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、第Ａ部および第Ｂ部、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２８：２０８〜２３０頁
【非特許文献１８】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ．、１９９７、Ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０（別冊）：８９頁）
【非特許文献１９】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：６８３〜６９０頁
【非特許文献２０】Ｅ．Ｍｏｅｓｓｎｅｒら、２００１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５〜１２２頁
【非特許文献２１】Ｉ．Ｒｅｍｙら、公表のために投稿中
【非特許文献２２】Ｋ．Ｍ．Ａｒｎｄｔら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６２７〜６３９頁
【非特許文献２３】Ｉ．Ｇｈｏｓｈら、２０００、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ１２２：５６５８〜５６５９頁
【非特許文献２４】Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：５３９４〜５３９９頁
【非特許文献２５】Ｉ．Ｒｅｍｙら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：９９０〜９９３頁
【非特許文献２６】Ｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７６９〜７７２頁、２００１
【非特許文献２７】Ｉ．ＲｅｍｙおよびＳ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２００１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８：７６７８〜７６８３頁、２００１
【非特許文献２８】Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：６１９〜６２２頁
【非特許文献２９】Ｃ．−Ｄ．Ｈｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ９：７８９〜７９８頁、２００２
【非特許文献３０】Ｈ．Ｙｕら、公表のために投稿中
【非特許文献３１】Ｇｈｏｓｈら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １２２：５６５８〜５６５９頁、２０００
【非特許文献３２】Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２〜９５頁、１９９６
【非特許文献３３】Ｆ．Ｙａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２４６〜５１２１頁、１９９６
【非特許文献３４】Ｒ．Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３〜６４頁、１９９５
【非特許文献３５】ＭＭ Ｌｉｎｇ ＆ ＢＨ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９７、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４：１５７〜７８頁
【非特許文献３６】Ａ．Ｌ．Ｋｕｒｔｚｍａｎら、２００１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００１年８月；１２（４）：３６１〜７０頁
【非特許文献３７】ＳＷ Ｓａｎｔｏｒｏら、２００２、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２ ９９：４１８５〜９０頁
【非特許文献３８】Ｚ．Ｓｈａｏら、１９９６、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：５１３〜８頁
【非特許文献３９】Ｓ．Ｈａｒａｙａｍａ、１９９８、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８、１６：７６〜８２頁
【非特許文献４０】ＷＰ Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｇｅｎｅ １６４（１）：４９〜５３頁
【非特許文献４１】ＲＭ Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３、Ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０〜９頁
【非特許文献４２】Ｍ．ＫｉｔａｂａｔａｋｅおよびＨ．Ｉｎｏｋｕｃｈｉ、１９９３、Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ、Ｇｅｎｅ １２３：５９〜６１頁
【非特許文献４３】Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９０、Ｏｒｄｅｒｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ ｇａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８（１０）：２９６１〜６頁
【非特許文献４４】Ｗａｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ＧＦＰ ｈｏｍｏｌｏｇ ＤｓＲｅｄ、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ７、１１３３〜１１３８頁（２０００）
【非特許文献４５】Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｆ．−Ｘ．Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１２１４１〜１２１４６頁
【非特許文献４６】Ｂ Ｐ．Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ１７３：３３〜３８頁
【非特許文献４７】Ｎ．Ｄ．Ｌａｋｉｎ ＆ Ｓ．Ｐ．Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７６４４〜７６５５頁、１９９９
【非特許文献４８】Ｂ．Ａ．Ｗｅｒｎｅｓｓ、Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ ＆ Ｐ，Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７６〜７９頁、１９９０
【非特許文献４９】Ｊ．Ｍ．Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ、Ｍ．Ｓｃｈｅｆｆｈｅｒ ＆ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５〜７８４頁、１９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明の目的は、ＰＣＡのための蛍光タンパク質断片および突然変異断片を設計および操作する（ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ための方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、ＰＣＡに有用な多数の断片対および組成物を記載することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、無傷蛍光タンパク質の任意の有用な配列変異体を操作してＰＣＡ断片にして多様なスペクトル的性質および物理的性質を有するアッセイを生み出すことができると教示することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、有用な性質を与える広範囲の突然変異を導入されたＰＣＡ断片の組成物を提供することである。
【００３４】
本発明のなおさらなる目的は、多色ＰＣＡを提供することである。
【００３５】
本発明の利点は、多様な応用のために有用な一連の性質を有する「デザイナー」ＰＣＡを創製できることである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明はタンパク質の相補的断片を含む組成物に関し、前記断片が会合した場合に光学的に検出できるシグナルを発生する。
【００３７】
本発明は蛍光タンパク質および突然変異の蛍光タンパク質から得られた断片にも関する。
【００３８】
本発明は、野生型タンパク質の対応する断片と少なくとも１アミノ酸異なる、突然変異の蛍光タンパク質の相補的断片も記載する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号２０から配列番号１０６７で構成される群から選択される相補的断片に関する。
【００４０】
本発明は、別個の分子にさらに融合している配列番号２０から配列番号１０６７から選択される組成物も記載する。
【００４１】
本発明は突然変異タンパク質の相補的断片を含む組成物も提供し、会合した場合に前記断片は光学的に検出できるシグナルを発生し、各断片は別個の分子に融合している。
【００４２】
本発明はさらに、光学的に検出できるタンパク質からの分離した断片の再集合を含む、分子相互作用の検出のためのタンパク質断片の相補性アッセイに関し、断片の再集合は各断片に融合している分子ドメインの相互作用によって作動され、断片の再集合は他の分子プロセスから独立しており、前記再集合は前記光学的に検出できるタンパク質の活性の再構成によって検出される。
【００４３】
本発明は生体分子相互作用を検出するための方法も提供し、前記方法は、（ａ）光学的に検出できる適切なタンパク質を選択する工程と、（ｂ）前記光学的に検出できるタンパク質がタンパク質機能を可逆的に喪失するように効果的に切断化する工程と、（ｃ）前記光学的に検出できるタンパク質の断片を別々に他の分子に融合または付着させる工程と、（ｄ）前記タンパク質の断片に融合または付着している分子の相互作用を通じて前記タンパク質断片を再会合させる工程と、（ｅ）結果として生じる光学シグナルを検出する工程とを含む。
【００４４】
本発明は、蛍光タンパク質に基づくタンパク質断片の相補性アッセイの設計および操作にも関する。エクオレア、アントゾア（Ａｎｔｈｏｚｏａ）およびアネモニア種から得られた蛍光タンパク質に基づいて、蛍光タンパク質を切断するための方法および特異的性質を有する突然変異断片を創製するための方法を記載する。最後に、緑色、黄色、シアン、青色または赤色シグナルを発生する有用な性質を有する突然変異を導入された多数の断片組成物および断片対を提供する。エクオレア蛍光タンパク質の非常に多数の突然変異体を用いて蛍光タンパク質ＰＣＡの詳細な実施例を示し、操作原理を実証し、全長タンパク質に有用な性質を与える突然変異が断片にも付与されうることを示す。本発明は多色ＰＣＡの構築のための方法および組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】エクオレア蛍光タンパク質を切断できる領域を示す図であり、直鎖配列に対して切断を行うことができる６つの代替ループ（星印）を示す図である。
【図１Ｂ】エクオレア蛍光タンパク質を切断できる領域を示す図であり、タンパク質の三次元構造に対する部位（矢印）の特異的アミノ酸残基を示し、切断部位でのアミノ酸残基を野生型ＧＦＰに対して付番した図である。
【図２】蛍光タンパク質断片の相補性アッセイの設計および創製のための戦略を描いた図である。
【図３】Ａ．ビクトリアの２つの変異体（ＧＦＰ ＰＣＡおよびＹＦＰ ＰＣＡ）に基づくＰＣＡで達成された相対蛍光強度を描写する、生細胞におけるＰＣＡの結果の顕微鏡写真を示す図であり、いくつかの異なるタンパク質−タンパク質複合体が一過性トランスフェクションの２４時間後に蛍光顕微鏡で評価されたことを示す図である。
【図４】図１ａおよび１ｂに描くようないくつかの代替断片化部位から発生した断片対に基づくＰＣＡを示す図である。
【図５】２つのアミノ酸だけ異なるＹＦＰ ＰＣＡの２つの配列変異体を比較して特異的突然変異が再集合した断片の蛍光強度を増強することを示す図であり、相補的断片に融合しているタンパク質はプロテインキナーゼであるＭＥＫおよびＥＲＫであることを示す図である。
【図６】ＹＦＰ断片の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）を増強する突然変異を有するスーパー強化ＰＣＡ（ａ欄）によって発生する明るいシグナルを非強化ＰＣＡ（ｂ欄）と比較して示した図であり、タンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置も蛍光顕微鏡で観察でき、個別のＹＦＰ断片は蛍光を発することができない（ｃおよびｄ）ことを示す図である。
【図７Ａ】最終ＰＣＡの蛍光強度を増強し、強烈蛍光ＰＣＡ（ＩＦＰ ＰＣＡ）を創製し、かつ少量（ナノグラムからサブナノグラム）のＤＮＡでタンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にするために断片に追加の突然変異を操作して導入する作用を示す図である。
【図７Ｂ】最終ＰＣＡの蛍光強度を増強し、強烈蛍光ＰＣＡ（ＩＦＰ ＰＣＡ）を創製し、かつ少量（ナノグラムからサブナノグラム）のＤＮＡでタンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にするために断片に追加の突然変異を操作して導入する作用を示す図である。
【図８】例えばｐ６５／ｐ５０について本明細書に示すようなサイトカインによる生細胞の刺激に応答したタンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置における変化を検出するために、蛍光タンパク質の突然変異断片に基づくＰＣＡをハイコンテント・アッセイにおいて使用できることを示す図である。
【図９】突然変異の蛍光タンパク質断片に基づくスペクトル偏移ＰＣＡがタンパク質−タンパク質相互作用の存在下で青色シグナルを発生することを実証する図である。
【図１０】蛍光タンパク質のＣ末端に対応する断片をタグ付けした単一融合タンパク質（この例ではｐ６５）が第一タンパク質と相互作用するタンパク質に融合しているレポーター断片のアミノ酸配列に応じて同一細胞において２つの異なる蛍光ＰＣＡを生み出すことができる多色ＰＣＡを実証する図であり、多色ＰＣＡは同一細胞内の異なるタンパク質−タンパク質複合体の検出および定量を可能にする図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
蛍光タンパク質は蛍光シグナルの発生に外部の基質またはプローブを必要としないことから、ＰＣＡに特に魅力的である。しかし、蛍光タンパク質の独特な構造、および蛍光シグナルの発生に活性発色団の内部形成を必要とすることから、蛍光タンパク質は設計にある種の難題を提起する。本発明は、以下に記載する蛍光タンパク質の切断のための設計基準を包含する。
【００４７】
図２に、蛍光タンパク質に基づくＰＣＡの創製に含まれるステップを記載する。第１ステップは蛍光タンパク質およびそれに対応するＤＮＡ配列の選択である。本発明の主題である設計原理に基づいて任意の蛍光タンパク質をＰＣＡに使用できる。蛍光タンパク質の選択は望みの波長、計装、および目的のアッセイに必要な感度に依存する。第１の実施例において、本発明者らは蛍光タンパク質をどの位置で切断するかを決定するために合理的設計を使用することを記載する。蛍光タンパク質は類似した構造を有するため、本発明者らはまずＡ．ビクトリアＧＦＰを例に設計原理を説明する。
【００４８】
ＧＦＰはαヘリックスを有する極めて珍しい特性をもつ、ストランド１１本のβバレル（樽）であり、αヘリックスはβバレルの中心軸を通るスレッドである（Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２〜９５頁、１９９６；Ｆ．Ｙａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２４６〜５１２１頁、１９９６；Ｒ．Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３〜６４頁、１９９５）。図１Ａはタンパク質の二次元像を示し、中心アルファ・ヘリックスに対してバレルのストランド１１本を示し、バレル末端のアミノ酸位置に番号を付けている。図１Ｂはフォールドしたタンパク質の三次元構造を示し、ループの特異的残基の位置を付記する（すべての番号は野生型ＧＦＰに対するものである）。発色団はαヘリックスに付着しβバレルの円筒の中心にほぼ完全に埋まっている。βバレルおよび軸ヘリックスを築くために一次配列のほぼすべてが使用されている。発色団は天然タンパク質ではＳｅｒ（Ｔｈｒ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙである残基６５〜６７から形成されたｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリノンである（１、２）。発色団は環の１−および２−の位置を介してペプチド主鎖に付着している４−（ｐ−ヒドロキシベンジリデン）イミダゾリジン−５−オンである。まず、ＧＦＰがほぼ天然の立体配座にフォールドし、次に残基６５のカルボニルにＧｌｙ６７のアミドが求核攻撃した後に脱水することによってイミダゾリノンが形成する。最後に、分子状酸素が残基６６のＣα−Ｃβ結合を脱水素し、その芳香族基をイミダゾリノンと結合させる（３）。
【００４９】
破壊されてはならない構造の明白な特性があることから、デフォルトでそのような領域の代替となるものを切断のために選択する。蛍光タンパク質ＰＣＡのための設計基準には以下がある。
【００５０】
（１）バレル構造を破壊しないように個別のストランドの最末端にあるβターンまたはループに切断を作る。切断に好ましい領域を図１Ａに示し、その領域に対応する特異的アミノ酸を図１Ｂの三次元構造に示す。
【００５１】
（２）発色団はβバレル深くに埋もれている。発色団の効率的な形成を保証し、かつ剛性の立体配座と独特のスペクトル特性を有するＧＦＰをもたらす他のアミノ酸の側鎖への配位との両方を維持するために発色団のコード配列を孤立させるのにこれが必要であると思われる。溶媒からの発色団の孤立は、βバレルに包埋することによって、そしてバレルの両端のバレル「キャッピング」構造によっても維持されている。これらのキャップには、（ａ）内部ヘリックスのＮ末端にあるキャップ：残基１９〜３０のストランド、残基１３３〜１４３のヘアピン、残基５０〜５７（これは内部ヘリックスのＮ末端である）、および（ｂ）内部ヘリックスのＣ末端にあるキャップ：残基１〜１０のヘリックス；残基７７〜９８のヘリックス；残基１９１〜１９７のストランドがある。これらの領域のいずれも破壊してはならない。
【００５２】
これらの基準に基づいて、ＧＦＰ構造の一次モデルに対して最適の切断領域を図１Ａに示す。アミノ酸残基３８〜４０（領域１）、アミノ酸１０１〜１０３（領域２）、アミノ酸１１４〜１１８（領域３）、アミノ酸１５４〜１６０（領域４）、アミノ酸１７１〜１７５（領域５）、またはアミノ酸１８８〜１９０（領域６）を含むループの１つに切断を行うことができる。これらの領域内のアミノ酸の１つに切断を行うことができる。上記および米国特許第６２７０９６４号に記載の設計基準に従う限り、切断が行われる正確な残基は、断片がフォールドし活性構造を再構成する能力に重大な影響を及ぼさずに指名されたループ内で変動しうることが当業者に明白である。設計原理を証明するために、上に挙げた領域から選択された３つの異なるアミノ酸でのＹＦＰの切断に基づくＰＣＡ構築の成功例（図４）を本発明者らは紹介する。
【００５３】
ＰＣＡのためのタンパク質の切断は、本発明に記載したようなポリペプチド鎖の合理的解体に一般に基づくが、当業者に周知である多数の他の操作アプローチを使用できる。例えば、最適な対を検索するために断片のライブラリーを生み出すために５’エキソヌクレアーゼの使用に基づく代替アプローチを本発明者らは以前に提案した（Ｍｉｃｈｎｉｃｋら、米国特許第６２７０９６４号）。
【００５４】
本発明において本発明者らは、目的の断片を増幅するためのＰＣＲを用いてＧＦＰについての全長ｃＤＮＡの断片を生み出した。あるいは、標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて、断片をコードするオリゴヌクレオチドを単純に合成できる。このアプローチはシアン蛍光タンパク質に基づくＰＣＡ（図９）を生み出すために採用された。好ましい実施形態において、生物学的応用および使用する計装に合った性質を有する蛍光タンパク質の突然変異断片が使用される。以下に詳細に記載するような突然変異断片を生み出すために、本発明者らは、再構成された場合に改変された蛍光性質または優れた折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）もしくは成熟速度および安定性を有する断片を得る目的でＧＦＰの部位特異的突然変異誘発を利用した。当業者に周知である多数のアプローチのうち任意のものによって部位特異的突然変異誘発を達成する（ＭＭ Ｌｉｎｇ ＆ ＢＨ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９７、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４：１５７〜７８頁）。そのような方法の選択された実施例が本明細書にもたらされているが、これらの実施例は本発明の実施を制限する意図はない。適当な方法には、ランダム突然変異誘発と定方向進化またはＤＮＡシャッフリングのスキームとの組合せ（Ａ．Ｌ．Ｋｕｒｔｚｍａｎら、２００１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００１年８月；１２（４）：３６１〜７０頁；ＳＷ Ｓａｎｔｏｒｏら、２００２、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２ ９９：４１８５〜９０頁；Ｚ．Ｓｈａｏら、１９９６、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：５１３〜８頁；Ｓ．Ｈａｒａｙａｒｎａ、１９９８、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８、１６：７６〜８２頁）、アセンブリーＰＣＲまたは遺伝子合成アプローチ（ＷＰ Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｇｅｎｅ １６４（１）：４９〜５３頁；ＲＭ Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３、Ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０〜９頁）、またはエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ分解消化による切断（Ｍ．ＫｉｔａｂａｔａｋｅおよびＨ．Ｉｎｏｋｕｃｈｉ、１９９３、Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ、Ｇｅｎｅ １２３：５９〜６１頁；Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９０、Ｏｒｄｅｒｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ ｇａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８（１０）：２９６１〜６頁）がありうる。特に強力な方法は多数の市販の突然変異誘発キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に例示されるような５’テンプレート介助長距離プラスミド重合に基づく。さらに、ＤＮＡシャフリングに基づく様々な形の定方向進化も完全に新規なＰＣＡを生み出すために使用できる。
【００５５】
蛍光タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片Ｆ１およびＦ２がいったん発生すると、適当な発現ベクター中で、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子と、それぞれの断片をフレーム内で個別に融合する。多様な標準発現ベクターまたは新規な発現ベクターを細胞の種類および望みの発現レベルに基づいて選択できる。そのようなベクターおよびそれらの特性は当業者に周知であろう。最適には、下の実施例１に記載するようなフレキシブル・リンカーを、蛍光タンパク質断片と目的遺伝子との間に融合して断片の相補を促進する。したがって、各発現ベクターは作動連結した目的遺伝子、フレキシブル・リンカー、および選択された蛍光タンパク質のＦ１またはＦ２のどちらかからなる融合タンパク質をコードする。図２に示すようにＦ１またはＦ２の一方を目的遺伝子に融合でき、融合の方向は目的遺伝子に対して５’または３’のどちらかでありうることから、４つの異なるＤＮＡ構築体が目的の任意の単一遺伝子に対して可能である。（蛍光タンパク質断片が構築体の５’末端に存在するならば開始メチオニン（ａｔｇコドン）が先頭になり、一方でその断片が構築体の３’末端に存在するならば、開始メチオニン（ａｔｇコドン）が目的遺伝子の先頭にくることに留意するべきである）。したがって、本発明は天然開始メチオニンを有するＦ１フラグメントだけではなく、構築体の３’末端にＦ１断片が存在すべき場合は開始メチオニンを除去するように修飾された同一Ｆ１断片にも及んでいる。同様に、本発明は自然には開始メチオニンで始まらないＦ２断片だけではなく、Ｆ２断片が構築体の５’末端に存在すべきである場合開始メチオニンを含むように修飾された同一のＦ２断片にも及ぶ。
【００５６】
タンパク質ＡおよびＢの対についてのＰＣＡを生み出すために、相補性蛍光タンパク質断片Ｆ１およびＦ２に別々に融合しているＡおよびＢをコードする構築体を細胞に同時トランスフェクトする。タンパク質ＡおよびＢが相互作用するならば、断片Ｆ１およびＦ２は極めて近接し、その状態でそれらの断片はフォールドして活性発色団を再構成できる。次に蛍光シグナルを、蛍光スペクトロスコピー、フロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ）、または顕微鏡観察を含めた多様な標準法によって測定できる。当業者に周知の計装を用いてこれらの方法のすべてを自動、ハイスループット形式で使用することができる。下に記載するように、２つ以上の構築体対を同時に使用することによって、新規の多色蛍光ＰＣＡを生み出すこともできる。最後に、ＤＮＡレベルでＰＣＡの操作および構築を実施した後、そのうえ細胞に融合タンパク質を生成させるのは得策であるが、必須ではない。例えば融合タンパク質を当業者に周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで作製できる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＣＡについては融合ポリペプチドをペプチド合成によって、または目的分子をコードするペプチド断片の連結によって合成的に生成させて蛍光タンパク質断片とのペプチド融合体を創製することが可能である。
【００５７】
様々な海洋生物由来蛍光タンパク質の間の構造相同性は、ＧＦＰについて記載されたのと同じ設計基準を最近記載されたディスコソマおよびアネモニアから蛍光タンパク質のような他の蛍光タンパク質に応用するのを可能にする。したがって、ＧＦＰ変異体以外に単量体化赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ由来）の断片および蛍光タンパク質ＫＦＰ１の断片に基づく追加のＰＣＡを提示する。ＫＦＰ１は、アネモニア・スルカータ（Ａｎｅｍｏｎｉａ ｓｕｌｃａｔａ）からの蛍光タンパク質「ａｓＣＰ」に基づいて特定波長で発色団に照射することによって一時的に活性化（キンドル）されうる。（Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｅｌｏｕｓｏｖら、２００３、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１、１９１〜１９４頁）。両方の場合で蛍光タンパク質はアミノ酸レベルでＧＦＰのホモログである。
【００５８】
本発明の主題である赤色偏移蛍光ＰＣＡは、緑色チャネルにおいて重大な自己蛍光が存在する生物学応用に特に有用である。例えば、赤色偏移ＰＣＡはフロー・ソーティングを用いたｃＤＮＡライブラリー・スクリーニングへの応用に特に有用であろう。この場合ＲＦＰのＰＣＡによって検出されるタンパク質−タンパク質複合体を発現する陽性細胞集団はバックグラウンド集団から転移し、陽性細胞のフロー・ソーティングが容易にできるようになる。
【００５９】
ディスコソマ由来ＤｓＲｅｄはＧＦＰの構造ホモログであることが実証された。ＤｓＲｅｄはＧＦＰと本質的に同一の発色団を有する２８ｋＤａのポリペプチドであり、発色団は内部Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（残基６６〜６８）トリペプチドから自己触媒的に形成する。ＤｓＲｅｄはＡ．ビクトリアＧＦＰに構造的に著しく類似している。実際、ＤｓＲｅｄの全体的なフォールドはＧＦＰと事実上同一であり、中心に同軸のヘリックスとバレル末端にアルファ・ヘリックスのキャップとを有する、ストランド１１本のわずかに不規則な（ベータ・カンとして記載される）ベータ・バレルからなる。本発明の主題である新規な断片は、ＲＦＰの構造の調査（Ｗａｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、「４分割ＧＦＰ相同ＤｓＲｅｄにおける赤色蛍光のための構造的基礎」、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ７、１１３３〜１１３８頁（２０００））およびＧＦＰの切断のために上記の合理的設計基準を用いることに直接基づく。Ａ．ビクトリアＧＦＰの配列とアラインメントを作成したｍＲＦＰ１のアミノ酸配列を表５に示し、その表に代替切断部位のアラインメントを示す。本発明は、以下の代替切断部位でのｍＲＦＰ１の切断によって発生した核酸配列およびポリペプチド断片を包含する：アミノ酸３８〜４０（領域１）；アミノ酸１００〜１０２（領域２）；アミノ酸１１３〜１１７（領域３）；アミノ酸１５２〜１５６（領域４）；アミノ酸１６７〜１７１（領域５）；アミノ酸１８２〜１８４（領域６）。グルタミン酸３９（Ｅ３９）、アスパラギン酸１０１（Ｄ１０１）、アスパラギン酸１１５（Ｄ１１５）、グルタミン酸１５３（Ｂ１５３）、アスパラギン酸１６９（Ｄ１６９）、またはリジン１８４（Ｋ１８４）について特異的アミノ酸残基の位置を示す。全長ｍＲＦＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列に対する切断部位を表６に示す。
【００６０】
【表４】
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
キンドリング蛍光タンパク質（ＫＦＰ１）に基づくＰＣＡも本発明の主題である。アネモニア・スルカータから得られた蛍光タンパク質の変異体であるＫＦＰ１の場合、代替切断部位は表７に示すようにＧＦＰに対するＫＦＰ１のアラインメントに基づく。表８はＫＦＰ１の全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対する切断部位を示す。
【００６４】
【表７】
【００６５】
【表８】
【００６６】
再集合した断片が、その断片が由来する無傷レポーターの活性を再創製できることがＰＣＡの特性である。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に基づくＰＣＡについては、再集合した断片は全長タンパク質に類似したやり方でメトトレキサートと結合でき（Ｉ．Ｒｅｍｙ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６：５３９４〜５３９９頁）、さらにＰＣＡに使用した場合、無傷ＤＨＦＲタンパク質の性質に影響する突然変異はＤＨＦＲ断片に対して類似した性質を与える（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｆ．−Ｘ．Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１２１４１〜１２１４６頁）。同様に、ＰＣＡに使用されたβ−ラクタマーゼ断片は無傷β−ラクタマーゼタンパク質に類似した反応速度でセファロスポリン基質を開裂でき、無傷タンパク質のモルテン・グロビュール（ｍｏｌｔｅｎ ｇｌｏｂｕｌｅ）構造を破壊する突然変異は再集合した断片の酵素的性質を向上させる（Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕ、Ｍ．Ｐｒｉｍｅａｕ、Ｌ．−Ｅ．Ｔｒｕｄｅａｕ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６１９〜６２２頁）。
【００６７】
蛍光タンパク質のスペクトル的性質がコア発色団に対するアミノ酸の方向および近接に決定的に依存することから、無傷蛍光タンパク質のスペクトル的性質に影響する突然変異が、タンパク質断片に操作されて導入された場合に同一の作用を有することは明白ではない。蛍光タンパク質のスペクトル的性質に影響する突然変異を、タンパク質断片の相補性アッセイに操作して導入できるならば、様々なスペクトル的性質を有する幅広い種類のＰＣＡを生み出すことが可能であろうと本発明者らは推論した。さらに、異なる色のＰＣＡを入手できることは生物学およびバイオテクノロジーにおける多様な応用のためのデザイナーＰＣＡの操作を可能にするであろう。
【００６８】
この原理を実証するために本発明者らはＡ．ビクトリア緑色蛍光タンパク質の数多くの変異体に基づくＰＣＡを創製し、哺乳動物細胞においてタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが知られているいくつかの異なるヒト遺伝子との融合構築体を創製することによってそれらのＰＣＡを試験した。最初の実施例において、緑色蛍光ＰＣＡ（ＧＦＰ ＰＣＡ）を創製するために強化緑色蛍光タンパク質（表３の「ＥＧＦＰ」）を切断することによってＰＣＡ用の断片を発生させた。次に、ＧＦＰ断片をさらに突然変異させて、表２において「１０Ｃ」と名付けた黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）変異体に対応する突然変異Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙを有する新規な断片を創製した。これは表３にあるように強化黄色蛍光タンパク質（「ＥＹＦＰ」）とも称される。無傷ＧＦＰではＳ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ突然変異の導入によってそれぞれ５１４ｎｍおよび５２７ｎｍの最大励起および最大発光を有するタンパク質が生じ、そのタンパク質では発光団は野生型ＧＦＰよりも４倍速く成熟し、細胞生物学応用のための明るいシグナルを発生する。本発明者らはこのＧＦＰ変異体をＰＣＡに使用できるかどうかを決定しようと努め、ヒト細胞において相互作用することが以前に報告された全長タンパク質に融合している断片を一過性に同時トランスフェクトした細胞における、ＧＦＰ ＰＣＡに対するこのＹＦＰ ＰＣＡの相対強度を評価しようと努めた。この分析を下の実施例１に詳細に記載する。
【００６９】
本発明の主題である多様な断片対の有用性を実証するために、本発明者らは図１Ｂに示した切断部位のうち３つを選択し、様々な遺伝子／断片方向（ＮＮ、ＮＣ、ＣＮおよびＣＣ）で公知の相互作用性タンパク質に融合しているＹＦＰ断片に基づいたＰＣＡを構築した。下に記載する実施例２において、異なる切断部位がバックグラウンドに対して良好なシグナルを有する代替ＰＣＡの構築に実際に使用できることを結果は示した。
【００７０】
突然変異断片に基づくＰＣＡの操作の２つのさらなる実施例において、生理学的温度で全長ＹＦＰの明るさを増強することが示された突然変異がＰＣＡ用の断片に操作されて導入された場合に類似した性質を与えるかを決定するために、本発明者らはＹＦＰ断片をさらに突然変異させた。まず、本発明者らは２つの追加の突然変異Ｓ６４ＬおよびＭ１５３ＴをＹＦＰ［１］に操作して導入した。Ｓ６４ＬおよびＭ１５３Ｔ突然変異の両方は全長緑色蛍光タンパク質（Ｔｓｉｅｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）を改善し、無傷全長タンパク質に強化した蛍光を与えた（Ｂ．Ｐ．Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ１７３：３３〜３８頁）。これらの突然変異はＳＥＹＦＰとして公知であるＹＦＰ変異体の構成要素である（表３参照）。下に詳細に示す実施例３において、本発明者らはＹＦＰ ＰＣＡと新規なＳＥＹＦＰ ＰＣＡとを直接比較した。
【００７１】
ＰＣＡ用の突然変異断片を操作する、なお別の実施例において、本発明者らはＳＥＹＦＰの断片１に突然変異Ｆ４６Ｌを導入し、本発明者らがＩＦＰ［１］と称した新規な断片を発生させた。本発明者らはＹＦＰの断片２に突然変異ＶＩ６３ＡおよびＳ１７５Ｇを導入し、新規な断片ＩＦＰ［２］を生み出した。これらの突然変異は、表３においてＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ（「Ｖｅｎｕｓ」）として知られているＹＦＰ変異体の構成要素である。結果は、蛍光タンパク質の突然変異断片を操作することによって高度強烈蛍光ＰＣＡ（ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｔｅｎｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＡ）（ＩＦＰ ＰＣＡ）を操作できることを実証している。
【００７２】
本発明の４番目の実施例において、本発明者らは突然変異ポリペプチド断片を創製することによって特定の望みのスペクトル的性質を有するＰＣＡを創製することが可能であることを実証した。青色領域へのスペクトル偏移を与える突然変異を有する断片を合成することによって、本発明者らはシアン蛍光ＰＣＡ（ＣＦＰ ＰＣＡ）を創製した。本発明は、遺伝子工学によって様々な強度およびシグナル成熟の特徴を有する緑色、黄色、青緑色、青色、シアン、橙赤色および赤色変異体を含めた広域スペクトルのＰＣＡを生み出すための断片を提供する。
【００７３】
本発明の最終実施例において、本発明者らは蛍光レポーターの単一断片が、その断片が対になる断片のアミノ酸配列に応じて同一細胞内で異なる蛍光色を発生する多色ＰＣＡを実証した。
【００７４】
［実施例１］
蛍光タンパク質断片の相補性アッセイの創製およびＰＣＡ用突然変異断片の発生
本発明者らは、Ａ．ビクトリアＧＦＰから開始し異なるスペクトル的性質を有する２つのＰＣＡを創製しようとした。まず、哺乳動物におけるコドン最適化版のＧＦＰ（ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＰＣＲによってＧＦＰ断片を発生させた。ＧＦＰ［１］はＧＦＰのアミノ酸１から１５８に対応し、ＧＦＰ［２］はＧＦＰのアミノ酸１５９から２３９に対応する。次に、ＰＣＲによりＧＦＰの断片１にＥＹＦＰ特異的突然変異Ｓ６５Ｇ、Ｓ７２Ａを、かつＧＦＰの断片２に突然変異Ｔ２０３Ｙを導入し、それぞれ断片ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］をもたらすことによってＧＦＰの黄色変異体（ＹＦＰ ＰＣＡ）をコードする断片を創製した。
【００７５】
断片ＧＦＰ［１］、ＧＦＰ［２］、ＹＦＰ［１］、およびＹＦＰ［２］を、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点（ｏｒｉＰ）を組み入れるように予め修飾された哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ｏｒｉＰはＨＥＫ２９３Ｅ細胞（２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなＥＢＮＡ１遺伝子を発現する細胞系中でこれらの修飾ベクターのエピソーム複製を可能にする。追加的に、これらのベクターはＳＶ４０の起点を依然保持し、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞系（例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＪｕｒｋａｔまたはＣＯＳ）中でも同じくエピソームの発現が可能である。
【００７６】
ＧＦＰ ＰＣＡに対する操作されたＹＦＰ ＰＣＡの活性および相対シグナル強度を試験するために、以前に哺乳動物細胞において相互作用することが示された３対のタンパク質についてＰＣＡが創製された。これらには腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の自己相互作用（Ｎ．Ｄ．Ｌａｋｉｎ ＆ Ｓ．Ｐ．Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７６４４〜７６５５頁、１９９９）、パピローマウイルスＥ６タンパク質とｐ５３との相互作用（Ｂ．Ａ．Ｗｅｒｎｅｓｓ、Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ ＆ Ｐ，Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７６〜７９頁、１９９０）、およびＥ６タンパク質と、Ｅ６およびｐ５３の相互作用を仲介するタンパク質であるＥ６ＡＰとの相互作用がある（Ｊ．Ｍ．Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ、Ｍ．Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ ＆ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５〜７８４頁、１９９３）。ｐ５３、Ｅ６およびＥ６ＡＰに対する完全コード配列を、配列が検証された全長ｃＤＮＡからのＰＣＲによって増幅した。生じたＰＣＲ産物を吸引ろ過（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＰＣＲ、Ａｍｉｃｏｎ）によって清浄にし、適当な制限酵素で分解消化して特異的クローニングを可能にし、アミノ酸１０個のペプチド（Ｇｌｙ．Ｇｌｙ．Ｇｌｙ．Ｇｌｙ．Ｓｅｒ）２（配列番号１９）をコードするフレキシブル・リンカーを介してＧＦＰ［１］、ＹＦＰ［１］、ＧＦＰ［２］またはＹＦＰ［２］の５’または３’末端の一方にフレーム内融合した。目的遺伝子とレポーター断片との間にフレキシブル・リンカーを使用することによって、融合の方向および配置が蛍光タンパク質断片を極めて近接させるのに最適であることが確実となる（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｆ．−Ｘ．Ｃ．−Ｖａｌｏｉｓ ＆ Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１２１４１〜１２１４６頁）。対になった構築体の方向は以下のとおり：Ｆ１−リンカー−ｐ５３とＦ２−リンカー−ｐ５３、Ｆ１−リンカー−Ｅ６とＥ６ＡＰ−リンカー−Ｆ２、およびＦ１−リンカー−Ｅ６とＦ２−リンカー−ｐ５３のとおりであり、ここでＦ１およびＦ２はＧＦＰまたはＹＦＰどちらかの断片であった。組換え構築体からのＤＮＡを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＸロボット・ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州）で作動するＱｉａｇｅｎ Ｔｕｒｂｏ ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、チャッツワース、カリフォルニア州）を用いて単離した。単離したＤＮＡを定量し、次に濃度５０ｎｇ／μｌに対して基準化した。
【００７７】
トランスフェクションの２４時間前にＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、ポリリジンでコートした２４穴平板に蒔き（１穴あたり細胞２００００個）、次にＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を製造業者の勧めに従って用いてＤＮＡ０．５マイクログラムを同時トランスフェクトした。２４時間発現させた後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＨＹＱ−ＦＩＴＣフィルター・キューブを備えるニコンＴＥ−２０００顕微鏡で観察した（励起：４６０〜５００ｎｍ、発光：５０５〜５６０ｎｍ、ダイクロイック・ミラー：５０５ＬＰ）。ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで画像を獲得した。図３は、ｐ５３／ｐ５３、Ｅ６／Ｅ６ＡＰおよびＥ６／ｐ５３の相互作用についてのＧＦＰ ＰＣＡに対するＹＦＰ ＰＣＡの蛍光顕微鏡観察結果を示す。再構成されたＧＦＰまたはＹＦＰシグナルを明瞭に見ることができ、複合体の細胞内位置がそれらの公知の位置に一致することを決定できた。しかし、ＹＦＰ ＰＣＡのシグナルは３つのタンパク質−タンパク質複合体すべてについてＧＦＰ ＰＣＡシグナルよりも視覚的に明るく、全長タンパク質のシグナル強度を増強することが以前に示されたＹＦＰ突然変異が再集合した断片の強度の増強にも有効であったことが実証された。さらに、ＹＦＰ ＰＣＡの最大励起および最大発光は無傷蛍光タンパク質ＹＦＰ １０ｃとほぼ同等であり（表２）、これは相補的断片が折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）でき、無傷タンパク質から発生するのと同じ性質を実質的に有する発色団を発生できることを示唆している。
【００７８】
［実施例２］
蛍光タンパク質における代替切断部位
代替切断部位から発生する蛍光タンパク質断片（本発明の主題である）がＰＣＡで使用できることを実証するために、基本となる蛍光タンパク質ＰＣＡを黄色（ＹＦＰ）蛍光タンパク質について創製した（図４参照）。全長タンパク質（Ｐｄｋ２、１４−３−３σ、ならびにＮＦκＢヘテロ二量体の構成要素であるｐ５０およびｐ６５）をコードするｃＤＮＡを、相補性ＹＦＰ断片であるＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］のＮまたはＣ末端の一方に融合させた。これらの断片は、図１ａおよび図１ｂにＧｌｎ１５７、Ｌｙｓ１５８またはＡｓｐ１７３と示す位置での全長タンパク質の切断に対応する。ここで、表示されたアミノ酸残基はＹＦＰ［１］と称されるＮ末端レポーター断片のＣ末端を表す。１４−３−３／１４−３−３二量体の形成を、各ＰＣＡ断片対がタンパク質−タンパク質複合体の検出を可能にする能力を評価するために使用した。Ｐｄｋ２−ＹＦＰ［１］／Ｐｄｋ２−ＹＦＰ［２］をＰＣＡ陰性対照として使用した。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に各構築体対１００ｎｇを一過性トランスフェクトし、その４８時間後にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダーを用いて総蛍光を評価した。各棒線は３回の測定の平均蛍光を表し、誤差の棒線は９５％信頼限界を表す。モックトランスフェクトされた細胞（ＤＮＡおよび単一ＤＮＡ構築体を含まない）を黄色で示す。様々な断片の方向および組合せを試験した。それは、複合体形成の最適な検出が方向に依存するおそれがあるからである。この実施例において、Ｌｙｓ１５８およびＡｓｐ１７３の切断部位はすべての可能性のある断片の組合せからの１４−３−３／１４−３−３複合体の検出を可能にした。Ｇｌｎ１５６切断部位はＮＣおよびＣＣ方向の両方で１４−３−３／１４−３−３複合体の検出を可能にした。断片／遺伝子方向は以下のとおりであった：
ＮＮ＝１４−３−３−ＹＦＰ［１］／１４−３−３−ＹＦＰ［２］、
ＮＣ＝１４−３−３−ＹＦＰ［１］／ＹＦＰ［２］−１４−３−３、
ＣＮ＝ＹＦＰ［１］−１４−３−３／１４−３−３−ＹＦＰ［２］、
ＣＣ＝ＹＦＰ［１］−１４−３−３／ＹＦＰ［２］−１４−３−３）。
これらの結果は、本発明に組み込まれているタンパク質工学原理の有用性を実証し、様々な断片がＰＣＡに有用であることを示した。本発明の主題である組成物にはＰＣＡに有用な広範囲の突然変異を組み込まれた様々な断片対がある。
【００７９】
［実施例３］
生物学応用のためにＹＦＰ ＰＣＡよりも明るいシグナルを有するスーパー強化ＹＦＰ ＰＣＡ（ＳＥＹＦＰ−ＰＣＡ）および強烈蛍光ＰＣＡ（ＩＦＰ ＰＣＡ）を発生する突然変異断片
ＰＣＡのスペクトル的性質が突然変異断片を操作することによって影響されうることをさらに実証するために、本発明者らはまずＰＣＲで操作してＹＦＰ［１］にＳＥＹＦＰのＦ６４ＬおよびＭ１５３Ｔ突然変異を導入し、新規な断片ＳＥＹＦＰ［１］を創製した。実施例１に記載したようにサブクローニングを行った。プロテインキナーゼＭＥＫおよびＥＲＫと相互作用させるために融合構築体を上に記載するように調製した。配列決定により確認された各レポーター断片における特異的突然変異を付記し、表２および３のようにｗｔＧＦＰに対して示した。
【００８０】
蛍光強度の定量測定のために、トランスフェクションの２４時間前に９６穴ポリリジンコート平板の各穴にＨＥＫ２９３Ｅ細胞１５０００個を蒔いた。ＦｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬を用い、製造業者の勧める条件で各穴あたり総量１００ｎｇのＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。各融合構築体の量は各構築体５０ｎｇから各構築体わずか０．１ｎｇまで変動し、残りのＤＮＡを空の「担体」ベクターで供給した（例えば融合構築体ＤＮＡの総量２ｎｇに対して担体ＤＮＡ９８ｎｇまで）。すべてのトランスフェクションを３回実施した。トランスフェクションの２４時間または４８時間後に細胞を１：３００に希釈したＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）で１０分間染色してからダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で数回洗浄し、次に少量のハンクス緩衝塩類溶液少量を重層した。９０分間３７℃で温置した後に、各穴についての平均蛍光強度のデータをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で励起波長４８５ｎｍ、発光５２７ｎｍおよびカットオフ５１５ｎｍを用いて獲得した。各試料ＰＣＡについて、平均蛍光強度を３回の測定から計算した。蛍光の相対増加倍率を試験ＰＣＡの平均蛍光強度を陰性対照の平均蛍光強度に対して基準化することによって決定した。
【００８１】
図５に示すようにＭＥＫ／ＥＲＫタンパク質−タンパク質複合体を２つの蛍光ＰＣＡのどちらでも検出できた。しかし、ＹＦＰ［１］の代わりにＳＥＹＦＰ［１］（Ｆ６４ＬおよびＭ１５３Ｔ）を使用すると、シグナル強度は２から４倍増強した。この特定の突然変異ＹＦＰ ＰＣＡ（ヒストグラムの左側）で、わずか合計２ｎｇの「試験」ＤＮＡでバックグラウンドを超えるシグナルを容易に検出できた。さらに、ＹＦＰ ＰＣＡ（ヒストグラムの右側）用のＤＮＡ１０ｎｇはほとんど検出できるシグナルを与えなかったが、同量のＳＥＹＦＰ ＰＣＡ用のＤＮＡはバックグラウンドのほぼ４倍のシグナルを与えた（ヒストグラムの左側）。この実施例は、無傷タンパク質の強度を増強することが知られている突然変異が再集合した断片に類似した性質を与えることを実証している。
【００８２】
図６は、図５と同じＰＣＡの蛍光顕微鏡像を示し、ＳＥＹＦＰ［１］の追加の突然変異（ａ欄）が蛍光顕微鏡によって検出されるシグナル強度を増強し、タンパク質−タンパク質複合体の細胞内位置の識別を改善できることを実証している。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に（担体ＤＮＡ９０ｎｇを加えた）各融合構築体５ｎｇをトランスフェクトした。露出時間２０ｍｓおよびＦＩＴＣフィルターセットを用いたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ−１自動画像獲得システムを用いて４８時間後に画像を獲得した。ＹＦＰ ＰＣＡ（ｂ欄）でもタンパク質−タンパク質複合体を容易に視覚化できたが、強度は低かった。
【００８３】
これらの構築体の断片１は無傷蛍光タンパク質において発色団を形成するアミノ酸の３つすべてを含むことから、本発明者らは単一突然変異断片ＹＦＰ［１］およびＹＦＰ［２］も試験し個別の断片が蛍光シグナルを発生できないことを確認した。図６のｃ欄およびｄ欄については、表示された突然変異を有する単一融合構築体からのＤＮＡ５０ｎｇをトランスフェクトした。左側の欄は蛍光像を、右側の欄は細胞のＤＡＰＩ染色を示し、撮像された視野に細胞が存在することを実証している。タンパク質Ｐｄｋ２との融合体として発現された断片単独のどちらも蛍光シグナルを与えなかった。６０００を超えるアッセイのその後の分析において、本発明者らが採用した実験条件では蛍光ＰＣＡシグナルの発生は相互作用する分子に依存することが分かった。本発明者らが蛍光分子をタンパク質にタグ付けしているのではないことを実証していることから、これは本発明の重要な特徴である。それどころか、本発明者らはそれ自体が蛍光を発しないポリペプチド断片でタンパク質をタグ付けしている。蛍光シグナルはレポーター断片が融合している分子の相互作用に反応した場合にのみ発生する。目的分子の相互作用によってレポーター断片は極めて近接し、断片が一緒にフォールドし蛍光シグナルを発生することのできる活性構造になることが可能になる。
【００８４】
図７ａおよび７ｂに、生物学応用にいっそう高い感度が可能になるさらに別の新規な突然変異の蛍光タンパク質ＰＣＡの創製を示す。表３においてＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ（Ｖｅｎｕｓ）と称するＹＦＰ変異体に基づいて突然変異を選択した。これらの突然変異は無傷タンパク質において蛍光シグナルの成熟を促進することが示されている（Ｔ．Ｎａｇａｉら、２００２、「Ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｆｕｌｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｆａｓｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８７〜９０頁）。ＰＣＲ突然変異誘発がＳＥＹＦＰ［１］に追加の突然変異Ｆ４６Ｌを、かつＹＦＰ［２］にＶ１６３ＡおよびＳ１７５Ｇを組み入れるために採用され、本発明者らがＩＦＰ［１］およびＩＦＰ［２］と称した新規な断片が生じた。
【００８５】
ＭＡＰキナーゼ・シグナル伝達タンパク質であるＭＥＫおよびＥＲＫの間でのタンパク質−タンパク質複合体の形成を、ＩＦＰ［１］のＮ末端にＭＥＫ１を融合させＩＦＰ［２］のＣ末端にＥＲＫを融合させることによる新規なＩＦＰ ＰＣＡで評価した。図７ａおよび７ｂに示すように、１穴あたり総ＤＮＡ１００ｎｇをトランスフェクトし、ＰＣＡに提供されるＤＮＡの量を１００ｎｇから１００ｐｇまで変動し、残りのＤＮＡを空の「担体」ベクターによって供するタイトレーション系列を実施した。４８時間後に蛍光画像をＨＹＱ−ＦＩＴＣフィルター・キューブを用いたＳＰニコン蛍光顕微鏡で獲得した（励起：４６０〜５００ｎｍ、発光：５０５〜５６０ｎｍ、ダイクロイック・ミラー：５０５ＬＰ）。ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで、表示された露出時間（ｍｓ）で画像を獲得した。ＭＥＫ／ＥＲＫ ＰＣＡの各希釈についての総蛍光も蛍光プレートリーダーで定量した。各希釈について３回の測定を行い、平均蛍光値を陰性対照ＰＣＡの平均蛍光に対して基準化し、図７ｂに示すように陰性対照からの増加倍率を決定した。ＹＦＰ断片への追加の突然変異の導入は、蛍光シグナルを大きく増強し、その蛍光シグナルは０．１ｎｇ（１００ｐｇ）のＤＮＡでも視覚化でき（図７ａ）、定量できた（図７ｂ）。ＩＦＰ ＰＣＡについてのＤＮＡレベルは陰性対照に比べて有意なシグナルを生成した（１．５倍の増加）。対照的に、同じ蛍光強度をＹＦＰ ＰＣＡで生成するには１０ｎｇのＤＮＡが必要であった。
【００８６】
タンパク質−タンパク質相互作用の細胞内位置を同定できることから、ハイコンテント・スクリーニング（ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能になる。例えばシグナル伝達経路内のタンパク質の輸送を観察できる。例えば、本発明者らはｐ６５／ｐ５０のＮＦκＢ転写複合体のサイトカイン誘導性移行を研究するために、上に記載したＩＦＰ ＰＣＡを用いたこのアプローチを使用した（図８）。このタンパク質−タンパク質複合体は腫瘍壊死因子に反応して生細胞の細胞質から核に移行する。一過性トランスフェクトした細胞においてｐ６５およびｐ５０を相補性突然変異断片ＩＦＰ［１］およびＩＦＰ［２］でそれぞれタグづけした場合、トランスフェクションの４８時間後に未刺激細胞の細胞質に主として蛍光シグナルを観察できる。ＴＮＦ反応性ＨＥＫ細胞をＴＮＦ−アルファで処理後３０分以内に蛍光タンパク質−タンパク質複合体は核に専ら移動する。
【００８７】
上の実施例は、ＰＣＡに特定の望みの性質を与えるために操作して突然変異を蛍光タンパク質断片に導入できることを実証している。従って、本発明者らは緑色蛍光タンパク質の以前に記載された突然変異を組み入れて、蛍光タンパク質の新規な断片を多数生み出した（表２および表３参照）。これらの突然変異は操作され、図１に示し上の明細に記載した部位で蛍光タンパク質が切断することによって発生した断片に導入された。追加的に、本発明者らはサンゴ蛍光タンパク質（表４）、ＤｓＲｅｄから得られた単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）（表５および表６）およびアネモニア・スルカータから得られたキンドリング蛍光タンパク質（ＫＦＰ１）（表７および表８）の相同切断部位で新規な断片を生み出した。新規な断片の配列を本発明の請求項の前の付表に示し、配列リストの配列番号２０〜１０６７として表す。これらの配列は請求された本発明の主題である。一般的な用語では本発明者らはこれらを「突然変異断片」と呼ぶ。本発明のために、「突然変異断片」は野生型ｃＤＮＡまたはタンパク質に対して１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸変化を有する蛍光タンパク質の断片である。
【００８８】
［実施例４］
スペクトル偏移ＰＣＡ
緑色蛍光シグナルおよび黄色蛍光シグナルを発生するＰＣＡの多数の例が上に記載され実証された。本明細書に記載された本発明は突然変異断片のアミノ酸配列に応じて多様なスペクトル的性質を発生するＰＣＡを可能にする。この原理をさらに実証するために、シアン蛍光タンパク質の断片に基づくＰＣＡを創製してタンパク質−タンパク質相互作用によって発生した青色蛍光を実証した（図９）。ＣＦＰの断片に対応する２つのオリゴヌクレオチドをＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ボセル、ワシントン州）で合成した。結果として生じた断片をＰＣＲで増幅して、ｐｃＤＮＡ３に基づく発現ベクターにクローニングするために制限部位および１０ａａのフレキシブル・リンカーを付着させ（ＥＣＦＰのａａ１〜１５８とコードする）ＣＦＰ［１］または（ＥＣＦＰのａａ１５９〜２３９をコードする）ＣＦＰ［２］を含むベクターをもたらす。ここでＣＦＰは表３にＥＣＦＰとして示したアミノ酸配列を有する。タンパク質Ｐｄｋ２および１４−３−３ａをそれぞれＣＦＰ［１］およびＣＦＰ［２］のＮ末端に融合させ、一方でＮＦκＢヘテロ二量体のｐ５０サブユニットおよびｐ６５サブユニットをＣＦＰ断片のＣ末端に融合させた。構築体対１４−３−３σ／１４−３−３σ、ｐ６５／ｐ５０およびＰｄｋ２／Ｐｄｋ２陰性対照をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクトし、４８時間後に蛍光顕微鏡観察を行った。蛍光画像を、Ｃｈｒｏｍａ ＣＦＰフィルター（励起：４２６〜４４６ｎｍ、発光：４６０〜５００ｎｍ、ダイクロイックミラー：４５５ＬＰ）を用いたＳＰニコン蛍光顕微鏡で獲得した。画像を図８に示すようにＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで露出時間１〜５秒で獲得した。結果は、無傷蛍光タンパク質においてスペクトル偏移を引き起こす突然変異を操作してＰＣＡ用の断片に導入して、生物学応用への有用性を有する青色蛍光シグナルを発生するＰＣＡを生じることができることを示す。
【００８９】
［実施例５］
多色ＰＣＡ
１組の蛍光タンパク質ＰＣＡを入手できることは、多様な生物学、バイオテクノロジー、創薬および診断応用のための多色ＰＣＡの構築を可能にする。そのような多色ＰＣＡ本発明の別の態様である。
【００９０】
例えば、２、３、４またはそれを超える二分子イベントを同時に検出するために「一般的」Ｆ２ポリペプチド断片を多数の異なるＦ１突然変異断片と組み合わせることができよう。Ｆ２によって相補された場合にＦ１が発色団の形成に必要なすべてのアミノ酸残基を含むというやり方で蛍光タンパク質を切断することによってこれを達成できる。次にＦ１の２つ以上の突然変異断片を創製する。例えば緑色、黄色、シアン、青色または赤色シグナルのいずれかを再構成できる突然変異Ｆ１断片を生み出すことができる。Ｆ２が分子Ａに融合しており、突然変異Ｆ１断片はそれぞれ分子Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに別々に融合しているならば、ＡとＢ、ＡとＣ、ＡとＤ、ＡとＥおよびＡとＦの相互作用を、断片の相補によって発生する蛍光シグナルを５つの異なる波長で試験することによってすべて同時に試験できる。
【００９１】
本発明者らは、モデル系としてＮＦκＢのｐ６５サブユニットがｐ５０サブユニットと、およびタンパク質ＩｋＢαとも複合体を形成できることを用いて生細胞における多色ＰＣＡの原理を実証した。休止細胞においてＩｋＢαはＮＦｋＢに結合し細胞質にその複合体を保有する。このように、ｐ６５はｐ５０およびＩκＢαとも細胞質タンパク質−タンパク質複合体を形成する。本発明者らはＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３つのＰＣＡ構築体ＣＦＰ［１］−ｐ５０、ＣＦＰ［２］−ｐ６５およびＩκＢα−ＹＦＰ［１］を同時トランスフェクトした。Ｃｈｒｏｍａ ＣＦＰフィルター（励起：４２６〜４４６ｎｍ、発光：４６０〜５００ｎｍ、ダイクロイックミラー：４５５ＬＰ）およびＦＩＴＣフィルター（励起：４６０〜５００ｎｍ、発光：５０５〜５６０ｎｍ、ダイクロイックミラー：５０５ＬＰ）を用いたＳＰニコン蛍光顕微鏡で蛍光画像を獲得した。ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ ＣＣＤカメラで１６ビットモノクロ画像を獲得した。各ＰＣＡについてのＣＦＰおよびＦＩＴＣ画像を次に疑似着色し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてオーバーレイした。ｐ５０とｐ６５との間にタンパク質−タンパク質複合体が形成するならば、ＣＦＰ［１］断片はＣＦＰ［２］断片と相補して青色蛍光を生成するはずである。あるいは、ＩｋＢαとｐ６５との間にタンパク質−タンパク質複合体が形成するならば、ＹＦＰ［１］断片はＣＦＰ［２］断片と相補して黄色蛍光を生成するはずである。図１０に示すように、ｐ６５／ｐ５０（青色）複合体およびＩｋＢα／ｐ６５（黄色）複合体の両方を予想の通り細胞質から検出できた。明るい黄色（ほぼ白色）の細胞質染色パターンを示す細胞はｐ６５／ｐ５０複合体およびＩｋＢα／ｐ６５複合体の両方を発現している。多色ＰＣＡを構築できることによって、同一細胞内で多数の別個のタンパク質−タンパク質複合体を検出および定量することが可能になる。
【００９２】
蛍光タンパク質ＰＣＡの追加の応用
本発明の多数の実際的な応用には、生細胞、細胞溶解物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ形式におけるハイコンテント・アッセイおよびハイスループット・アッセイがある。本発明の応用にはアゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤による生細胞での経路活性化および経路「スイッチング」の検出がある。ある細胞内区画から別の区画へのタンパク質の移行または輸送を追跡できる。もしもタンパク質Ａが当初細胞膜にあるタンパク質Ｂに結合し黄色蛍光シグナルを発し、次に細胞核に移動してタンパク質Ｃに結合しシアン蛍光シグナルを発するならば、黄色対シアンの比を移行イベントの活性化の検出器として使用できる。さらに、診断およびナノテクノロジーにおいて蛍光タンパク質ＰＣＡの多数の応用がある。例えば、各突然変異Ｆ１断片を、異なる抗体との融合体として固相表面アレイに結合させることができ、これを試料中の特異的抗原の存在を検出するために使用できよう。多色ＰＣＡの応用には、生物戦物質の迅速多色診断がある。そのような多色ＰＣＡは本発明の主題である新規な突然変異断片によって可能となる。
【００９３】
組織培養平板、マイクロタイター平板、またはスライド形式を含めた多様な形式で細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ研究できる。ＰＣＡ構築体を保有する細胞をｉｎ ｖｉｖｏでも研究できる。例えば特定のＰＣＡを安定発現する適当な培養細胞を生動物中の腹水として増殖させるか、またはヌード・マウスに導入して腫瘍を形成させることができる。あるいは、ＰＣＡ構築体を保有するトランスジェニック・マウスを作製することができる。動物内のタンパク質−タンパク質複合体を次に例えばＸｅｎｏｇｅｎ（アラミダ、カリフォルニア州）またはＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって供給されるような動物全身画像化システムによって研究できる。本明細書に提示したすべてのＰＣＡ、ならびに様々な強烈黄色蛍光および赤色蛍光ＰＣＡはｉｎ ｖｉｖｏのＰＣＡに特に有用であろう。ｉｎ ｖｉｖｏのＰＣＡ応用には、動物による薬物の消費または注射に対してｉｎ ｖｉｖｏで反応するＰＣＡを生み出す能力がある。前臨床薬物開発への応用には、血液または尿を採取せずに生動物においてＡＤＭＥ研究（薬物の吸収、分布、代謝または排泄）を実施する能力がある。例えば、薬物が生動物の細胞内で特異的タンパク質−タンパク質複合体の増加または減少を引き起こすならば、薬物投与後の様々な時間に蛍光シグナルを獲得でき、それによって動物全身における薬物の薬物動態および薬物動力学的性質の推定が可能になる。
【００９４】
最後に、蛍光タンパク質の広範囲の相補性突然変異断片が入手できることから、ＰＣＡに特に有用な突然変異断片の組合せを経験的に試験することが可能になる。組合せに関するＰＣＡのこの特徴によって、薬物スクリーニング、ターゲット・バリデーション、ＡＤＭＥ、および診断応用に使用するための多様な色、強度、組合せおよび物理的性質を有する多数の新規なアッセイを生み出すことが可能になる。
【００９５】
以下の特許および刊行物のすべての内容は、そこに引用されている参照を含めて、すべての目的に対してその全体が参照により組み込まれ、それはそれぞれ個別の特許、特許出願または公報がそのように個別に表示されているのと同程度である。
【００９６】
米国特許第６２７０９６４号 Ｍｉｃｈｎｉｃｋら
米国特許第６２９４３３０号 Ｍｉｃｈｎｉｃｋら
米国特許第６４２８９５１号 Ｍｉｃｈｎｉｃｋら
米国特許第５８０４３８７号 Ｃｏｒｍａｃｋら
米国特許第５６２５０４８号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６０５４３２１号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６０２７８８１号 Ｐａｖｌａｋｉｓら
米国特許第６４６９１５４号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６０６６４７６号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６１７２１８８号 Ｔｈａｓｔｒｕｐら
米国特許第６９６８７３８号 Ａｎｄｅｒｓｏｎら
米国特許第６０９０９１９号 Ｃｏｒｍａｃｋら
米国特許第６１２４１２８号 Ｔｓｉｅｎら
米国特許第６５１８０２１号 Ｔｈａｓｔｒｕｐら
【００９７】
Pelletier, J.N.、Remy, I.およびMichnick, S.W. 1998（タンパク質断片の相補性アッセイ：タンパク質−タンパク質相互作用のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための一般戦略）J. Biomolecular Techniques 10: 32〜19頁
Remy, I.、Pelletier, J.N.、Galarneau, A.およびMichnick, S.W.、2002（タンパク質断片相補戦略を用いたタンパク質相互作用およびライブラリー・スクリーニング）Protein-protein Interactions: A Molecular Cloning Manual、E.A. Golemis編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第25章、449〜475頁
Michnick, S.W.、Remy, I.、C.-Valois, F.X.、Vallee-Belisle, A.、Galarneau, A.およびPelletier, J.N.、2000（タンパク質断片相補戦略によるタンパク質−タンパク質相互作用の検出、第Ａ部および第Ｂ部）（John N. Abelson、Scott D. EmrおよびJeremy Thorner編）Methods in Enzymology、328: 208〜230頁
J. N. PelletierおよびS. W. Michnick.、1997（タンパク質断片相補に基づくｉｎ ｖｉｖｏタンパク質−タンパク質相互作用の検出戦略）Protein Engineering、10（増刊）: 89
I. Ghosh、A.D. HamiltonおよびL. Regan、2000、（逆平行ロイシン・ジッパー特異的タンパク質再集合：緑色蛍光タンパク質への応用）J. Am. Chem. Soc 122: 5658〜5659頁、2000
C.-D. Huら、2002（二分子蛍光相補を用いた生細胞におけるbZIPおよびRelファミリー・タンパク質間の相互作用の視覚化）Molecular Cell 9: 789〜798頁
Tsien, R.Y.、1998（緑色蛍光タンパク質）Annual Reviews of Biochemistry 67: 509〜544頁
Zhang J.、Campbell R.E.、Ting A.Y.およびTsien, R.T. (2000)（細胞生物学のための新しい蛍光プローブの創製）Nature Reviews 3: 906〜918頁
【００９８】
新規な断片の配列を以下の付表に示し、配列リストの配列番号２０〜１０６７として表し、これらの配列は請求された本発明の主題である。
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】
【０２２１】
【０２２２】
【０２２３】
【０２２４】
【０２２５】
【０２２６】
【０２２７】
【０２２８】
【０２２９】
【０２３０】
【０２３１】
【０２３２】
【０２３３】
【０２３４】
【０２３５】
【０２３６】
【０２３７】
【０２３８】
【０２３９】
【０２４０】
【０２４１】
【０２４２】
【０２４３】
【０２４４】
【０２４５】
【０２４６】
【０２４７】
【０２４８】
【０２４９】
【０２５０】
【０２５１】
【０２５２】
【０２５３】
【０２５４】
【０２５５】
【０２５６】
【０２５７】
【０２５８】
【０２５９】
【０２６０】
【０２６１】
【０２６２】
【０２６３】
【０２６４】
【０２６５】
【０２６６】
【０２６７】
【０２６８】
【０２６９】
【０２７０】
【０２７１】
【０２７２】
【０２７３】
【０２７４】
【０２７５】
【０２７６】
【０２７７】
【０２７８】
【０２７９】
【０２８０】
【０２８１】
【０２８２】
【０２８３】
【０２８４】
【０２８５】
【０２８６】
【０２８７】
【０２８８】
【０２８９】
【０２９０】
【０２９１】
【０２９２】
【０２９３】
【０２９４】
【０２９５】
【０２９６】
【０２９７】
【０２９８】
【０２９９】
【０３００】
【０３０１】
【０３０２】
【０３０３】
【０３０４】
【０３０５】
【０３０６】
【０３０７】
【０３０８】
【０３０９】
【０３１０】
【０３１１】
【０３１２】
【０３１３】
【０３１４】
【０３１５】
【０３１６】
【０３１７】
【０３１８】
【０３１９】
【０３２０】
【０３２１】
【０３２２】
【０３２３】
【０３２４】
【０３２５】
【０３２６】
【０３２７】
【０３２８】
【０３２９】
【０３３０】
【０３３１】
【０３３２】
【０３３３】
【０３３４】
【０３３５】
【０３３６】
【０３３７】
【０３３８】
【０３３９】
【０３４０】
【０３４１】
【０３４２】
【０３４３】
【０３４４】
【０３４５】
【０３４６】
【０３４７】
【０３４８】
【０３４９】
【０３５０】
【０３５１】
【０３５２】
【０３５３】
【０３５４】
【０３５５】
【０３５６】
【０３５７】
【０３５８】
【０３５９】
【０３６０】
【０３６１】
【０３６２】
【０３６３】
【０３６４】
【０３６５】
【０３６６】
【０３６７】
【０３６８】
【０３６９】
【０３７０】
【０３７１】
【０３７２】
【０３７３】
【０３７４】
【０３７５】
【０３７６】
【０３７７】
【０３７８】
【０３７９】
【０３８０】
【０３８１】
【０３８２】
【０３８３】
【０３８４】
【０３８５】
【０３８６】
【０３８７】
【０３８８】
【０３８９】
【０３９０】
【０３９１】
【０３９２】
【０３９３】
【０３９４】
【０３９５】
【０３９６】
【０３９７】
【０３９８】
【０３９９】
【０４００】
【０４０１】
【０４０２】
【０４０３】
【０４０４】
【０４０５】
【０４０６】
【０４０７】
【０４０８】
【０４０９】
【０４１０】
【０４１１】
【０４１２】
【０４１３】
【０４１４】
【０４１５】
【０４１６】
【０４１７】
【０４１８】
【０４１９】
【０４２０】
【０４２１】
【０４２２】
【０４２３】
【０４２４】
【０４２５】
【０４２６】
【０４２７】
【０４２８】
【０４２９】
【０４３０】
【０４３１】
【０４３２】
【０４３３】
【０４３４】
【０４３５】
【０４３６】
【０４３７】
【０４３８】
【０４３９】
【０４４０】
【０４４１】
【０４４２】
【０４４３】
【０４４４】
【０４４５】
【０４４６】
【０４４７】
【０４４８】
【０４４９】
【０４５０】
【０４５１】
【０４５２】
【０４５３】
【０４５４】
【０４５５】
【０４５６】
【０４５７】
【０４５８】
【０４５９】
【０４６０】
【０４６１】
【０４６２】
【０４６３】
【０４６４】
【０４６５】
【０４６６】
【０４６７】
【０４６８】
【０４６９】
【０４７０】
【０４７１】
【０４７２】
【０４７３】
【０４７４】
【０４７５】
【０４７６】
【０４７７】
【０４７８】
【０４７９】
【０４８０】
【０４８１】
【０４８２】
【０４８３】
【０４８４】
【０４８５】
【０４８６】
【０４８７】
【０４８８】
【０４８９】
【０４９０】
【０４９１】
【０４９２】
【０４９３】
【０４９４】
【０４９５】
【０４９６】
【０４９７】
【０４９８】
【０４９９】
【０５００】
【０５０１】
【０５０２】
【０５０３】
【０５０４】
【０５０５】
本発明の一部を形成する突然変異していない断片
［ａａはアミノ酸である］
ＧＦＰ Ｆ１：ｗｔ ＧＦＰ（配列番号２）のａａ残基１−３９
ＧＦＰ Ｆ２：ｗｔ ＧＦＰ（配列番号２）のａａ残基４０−２３８
ＹＦＰ Ｆ１Ａ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−４０
ＹＦＰ Ｆ２Ａ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基４１−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｂ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１０３
ＹＦＰ Ｆ２Ｂ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１０４−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｃ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１１７
ＹＦＰ Ｆ２Ｃ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１１８−２３９
ＹＦＰ Ｆ１ＤＸ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１５８
ＹＦＰ Ｆ２ＤＸ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１５９−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｄ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１５９
ＹＦＰ Ｆ２Ｄ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１６０−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｅ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１７４
ＹＦＰ Ｆ２Ｅ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１７５−２３９
ＹＦＰ Ｆ１Ｆ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１−１９１
ＹＦＰ Ｆ２Ｆ：ｗｔ ＥＹＦＰ（配列番号４）のａａ残基１９２−２３９
ＥＧＦＰＦＡ：ｗｔ ＥＧＦＰ（配列番号３）のａａ残基４１−２３９
ＲＦＰ Ｆ１Ａ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−３９
ＲＦＰ Ｆ２Ａ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基４０−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｂ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１０１
ＲＦＰ Ｆ２Ｂ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１０２−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｃ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１１５
ＲＦＰ Ｆ２Ｃ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１１６−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｄ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１５３
ＲＦＰ Ｆ２Ｄ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１５４−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｅ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１６９
ＲＦＰ Ｆ２Ｅ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１７０−２２５
ＲＦＰ Ｆ１Ｆ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１−１８４
ＲＦＰ Ｆ２Ｆ：ｗｔ ｍＲＦＰ（配列番号１５，１６）のａａ残基１８５−２２５
ＫＦＰ Ｆ１Ａ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−３６
ＫＦＰ Ｆ２Ａ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基３７−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｂ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−９８
ＫＦＰ Ｆ２Ｂ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基９９−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｃ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１５３
ＫＦＰ Ｆ２Ｃ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１５４−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｄ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１１２
ＫＦＰ Ｆ２Ｄ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１１３−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｅ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１６９
ＫＦＰ Ｆ２Ｅ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１７０−２３２
ＫＦＰ Ｆ１Ｆ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１−１８６
ＫＦＰ Ｆ２Ｆ：ｗｔ ＫＦＰ１（配列番号１７，１８）のａａ残基１８７−２３２
【０５０６】
本明細書に開示された本発明の多数の形態が目下の好ましい実施形態を構成するが、他の多くの実施形態が可能であり、好ましい実施形態および他の可能性のある実施形態のさらなる詳細は限定として解釈すべきではない。本明細書に使用された用語は限定よりも記述に過ぎず、請求された本発明の精神または範囲から逸脱せずに様々な変更、多くの等価物を行えることが了承されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の相補的断片を含む組成物であって、
前記断片が会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）場合に光学的に検出できるシグナルを発生することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記断片が会合した場合に蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記断片が会合した場合に発光シグナルを発生することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記断片が会合した場合に燐光シグナルを発生することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記断片が蛍光タンパク質に由来することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記断片が突然変異の蛍光タンパク質に由来することを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記相補的断片が野生型タンパク質の対応する断片と少なくとも１アミノ酸異なることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記相補的断片が配列番号２０から配列番号１０６７で構成される群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記配列番号２０から配列番号１０６７が別個の分子にさらに融合していることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
突然変異タンパク質の相補的断片を含む組成物であって、
前記断片が会合した場合に光学的に検出できるシグナルを発生し、
各断片が別個の分子に融合していることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
前記断片が会合した場合に蛍光シグナル、発光シグナルまたは燐光シグナルを発生することを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記相補的断片が野生型タンパク質の対応する断片と少なくとも１アミノ酸異なることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
光学的に検出できるタンパク質からの分離した断片の再集合を含む、分子相互作用の検出のためのタンパク質断片の相補性アッセイであって、
前記断片の再集合が各断片に融合している分子ドメインの相互作用によって作動され、
前記断片の再集合が他の分子プロセスから独立しており、
前記再集合が前記光学的に検出できるタンパク質の活性の再構成によって検出される、ことを特徴とするタンパク質断片の相補性アッセイ。
【請求項１４】
前記断片が会合した場合に蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項１３に記載の相補性アッセイ。
【請求項１５】
前記断片が突然変異の蛍光タンパク質に由来することを特徴とする請求項１３に記載の相補性アッセイ。
【請求項１６】
（ａ）光学的に検出できる適切なタンパク質を選択する工程と、
（ｂ）前記光学的に検出できるタンパク質がタンパク質機能を可逆的に喪失するように効果的に断片化する工程と、
（ｃ）前記光学的に検出できるタンパク質の断片を別々に他の分子に融合または付着させる工程と、
（ｄ）前記タンパク質の断片に融合または付着している分子の相互作用を通じて前記断片を再会合させる工程と、
（ｅ）結果として生じる光学シグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とする生体分子相互作用を検出するための方法。
【請求項１７】
前記光学的に検出できるレポーター・タンパク質が突然変異の蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
タンパク質の相補的断片を含む組成物であって、
前記断片が会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）場合に光学的に検出できるシグナルを発生することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記断片が会合した場合に蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記断片が会合した場合に発光シグナルを発生することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記断片が会合した場合に燐光シグナルを発生することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記断片が蛍光タンパク質に由来することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記断片が突然変異の蛍光タンパク質に由来することを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記相補的断片が野生型タンパク質の対応する断片と少なくとも１アミノ酸異なることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記相補的断片が配列番号２０から配列番号１０６７で構成される群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記配列番号２０から配列番号１０６７が別個の分子にさらに融合していることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
突然変異タンパク質の相補的断片を含む組成物であって、
前記断片が会合した場合に光学的に検出できるシグナルを発生し、
各断片が別個の分子に融合していることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
前記断片が会合した場合に蛍光シグナル、発光シグナルまたは燐光シグナルを発生することを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記相補的断片が野生型タンパク質の対応する断片と少なくとも１アミノ酸異なることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
光学的に検出できるタンパク質からの分離した断片の再集合を含む、分子相互作用の検出のためのタンパク質断片の相補性アッセイであって、
前記断片の再集合が各断片に融合している分子ドメインの相互作用によって作動され、
前記断片の再集合が他の分子プロセスから独立しており、
前記再集合が前記光学的に検出できるタンパク質の活性の再構成によって検出される、ことを特徴とするタンパク質断片の相補性アッセイ。
【請求項１４】
前記断片が会合した場合に蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項１３に記載の相補性アッセイ。
【請求項１５】
前記断片が突然変異の蛍光タンパク質に由来することを特徴とする請求項１３に記載の相補性アッセイ。
【請求項１６】
（ａ）光学的に検出できる適切なタンパク質を選択する工程と、
（ｂ）前記光学的に検出できるタンパク質がタンパク質機能を可逆的に喪失するように効果的に断片化する工程と、
（ｃ）前記光学的に検出できるタンパク質の断片を別々に他の分子に融合または付着させる工程と、
（ｄ）前記タンパク質の断片に融合または付着している分子の相互作用を通じて前記断片を再会合させる工程と、
（ｅ）結果として生じる光学シグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とする生体分子相互作用を検出するための方法。
【請求項１７】
前記光学的に検出できるレポーター・タンパク質が突然変異の蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１８２７９６（Ｐ２０１１−１８２７９６Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−９２４４２（Ｐ２０１１−９２４４２）
【出願日】平成２３年４月１８日（２０１１．４．１８）
【分割の表示】特願２００６−５０９８５７（Ｐ２００６−５０９８５７）の分割
【原出願日】平成１６年４月９日（２００４．４．９）
【出願人】（５０５２９８３６４）オデッセイ セラ， インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＯＤＹＳＳＥＹ ＴＨＥＲＡ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】４５５０ Ｎｏｒｒｉｓ Ｃａｎｙｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓｕｉｔｅ １４０， Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ， ＣＡ ９４５８３ Ｕ． Ｓ． Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９２４４２（Ｐ２０１１−９２４４２）
【出願日】平成２３年４月１８日（２０１１．４．１８）
【分割の表示】特願２００６−５０９８５７（Ｐ２００６−５０９８５７）の分割
【原出願日】平成１６年４月９日（２００４．４．９）
【出願人】（５０５２９８３６４）オデッセイ セラ， インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＯＤＹＳＳＥＹ ＴＨＥＲＡ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】４５５０ Ｎｏｒｒｉｓ Ｃａｎｙｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓｕｉｔｅ １４０， Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ， ＣＡ ９４５８３ Ｕ． Ｓ． Ａ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]