【課題】特定の型の炭素質材料を含み、所望のタンパク質生成物の収率に悪影響することなく、特定の望ましくない不純物の効果的で選択的な除去をもたらす新規で改良されたタンパク質精製プロセスを提供すること。
【解決手段】方法は、目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、フロースルー様式において、（ｉ）炭素質材料；（ｉｉ）炭素質材料とＣＥＸ媒体との組合せ；（ｉｉｉ）炭素質材料とＡＥＸ媒体との組合せ；（ｉｖ）炭素質材料と混合様式媒体との組合せ；（ｖ）炭素質材料とＨＩＣ媒体との組合せ、ならびに（ｖｉ）炭素質材料とＣＥＸ、ＡＥＸおよび混合様式媒体との組合せと接触させた後、試料を、アフィニティ媒体、ＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体または混合様式媒体を含有する１または複数のクロマトグラフィーカラムと接触させ、それによって１または複数のクロマトグラフィーカラムの負担を減少させることを含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年８月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／５７５，３４９号および２０１２年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６６６，２４０号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、改良されたクロマトグラフィー方法およびタンパク質精製中に１または複数の不純物のレベルを低下させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
クロマトグラフィーは、生物材料、例えば、モノクローナル抗体の精製における主要な精製技術である。
【０００４】
一般的に用いられるクロマトグラフィー方法としては、１または複数のアフィニティクロマトグラフィー媒体、イオン交換クロマトグラフィー媒体、疎水性相互作用、親水性相互作用、サイズ排除クロマトグラフィーおよび混合様式（すなわち、様々なクロマトグラフィー相互作用の組合せ）のクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、モノクローナル抗体の精製について、典型的な精製プロセスは、最初にプロテインＡアフィニティ捕捉ステップ、次いで、１または複数のイオン交換仕上げステップを含み、その目的は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの１または複数の不純物のレベルを低下させることである。さらに、結合および溶出疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；フロースルー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＦＴＨＩＣ）；フロースルー陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）；陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、または疎水性相互作用樹脂を用いる弱分配クロマトグラフィー；混合様式のクロマトグラフィー技術、例えば、結合および溶出弱陽イオンおよび陰イオン交換、結合および溶出疎水性およびイオン交換相互作用ならびにフロースルー疎水性およびイオン交換混合様式相互作用（ＦＴＭＭ）（両方ともＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）などの樹脂を用いることができる。）などの他のクロマトグラフィー技術を用いることができる。さらに、他の様々な技術および様々な技術の組合せと一緒に、疎水性電荷誘導（ＨＣＩ）クロマトグラフィーを、仕上げのために用いることができる。
【０００５】
クロマトグラフィーは小規模のタンパク質精製に対して多くの利点を提供するが、大規模な場合クロマトグラフィーカラムの充填が労働集約的であり時間集約的であるだけでなく、費用も高い。さらに、クロマトグラフィーカラムの汚損は共通の問題であり、その結果、使用者はカラムを廃棄する必要があり、これは、特にクロマトグラフィー樹脂の費用が高いため望ましくない。
【０００６】
最近当業界においては、タンパク質精製プロセスにおけるステップ数を減少させようとする傾向が顕著である。また、バイオリアクターを用いてより高い発現力価を得るための技術の使用が当業界において上昇傾向である。これらの２つの傾向の組合せにより、カラム上にはより多くの生成物がロードされるようになり、それによって、かなり高価なクロマトグラフィー媒体への負担増加ならびに生成物純度の低下をもたらしており、それらは両方とも望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも部分的に予想外にも、特定の材料（例えば、活性化炭素などの炭素質材料）を、フロースルー様式でクロマトグラフィーカラムに基づくタンパク質精製プロセスに組み込むことができ、クロマトグラフィーカラムの負担が減少され、結果として、クロマトグラフィーカラムの寿命の増加をもたらすことができることを見出したことに基づく。
【０００８】
さらに、本発明は、炭素質材料（例えば、活性化炭素）を、捕捉クロマトグラフィーステップの上流または下流で用いて、１または複数の不純物のレベルを低下させることができることを見出したことに基づく。特許請求される方法によるいくつかの実施形態において、試料は、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップの前に炭素質材料と接触される。他の実施形態において、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップは、試料を炭素質材料と接触させる前に用いられる。さらに他の実施形態において、試料はプロテインＡアフィニティ捕捉ステップの後に炭素質材料と接触される。また、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーステップは、試料を炭素質材料と接触させた後に用いてもよい。特定の実施形態において、プロテインＡアフィニティ捕捉ステップの後に、陰イオン交換（ＡＥＸ）フロースルークロマトグラフィーステップをＣＥＸクロマトグラフィー結合／溶出ステップと共にまたはそれを行わずに行ってもよい。さらに他の実施形態において、炭素質材料は、非アフィニティ捕捉ステップ（例えば、捕捉ステップとしてＣＥＸ結合および溶出クロマトグラフィーを用いる）の後に用いてもよく、その後、ＡＥＸクロマトグラフィーステップを行う。
【０００９】
さらに、本発明は、従来のプロセスよりも少ないステップを含むクロマトグラフィーに基づくタンパク質精製プロセスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による一態様において、１または複数のクロマトグラフィーカラムの負担を減少させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、そのような方法は、目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、フロースルー様式において、（ｉ）炭素質材料；（ｉｉ）炭素質材料とＣＥＸ媒体との組合せ；（ｉｉｉ）炭素質材料とＡＥＸ媒体との組合せ；（ｉｖ）炭素質材料と混合様式媒体との組合せ；（ｖ）炭素質材料とＨＩＣ媒体との組合せ、ならびに（ｖｉ）炭素質材料とＣＥＸ、ＡＥＸおよび混合様式媒体との組合せと接触させた後、試料を、アフィニティ媒体、ＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体または混合様式媒体を含有する１または複数のクロマトグラフィーカラムと接触させ、それによって１または複数のクロマトグラフィーカラムの負担を減少させることを含む。
【００１１】
特許請求される方法による別の態様において、（ｉ）目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、アフィニティ媒体、ＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体または混合様式媒体を含有する１または複数のクロマトグラフィーカラムと、目的のタンパク質がカラムに結合するような条件下で接触させるステップ；（ｉｉ）試料の第１の溶出液を得るステップ；（ｉｉｉ）第１の溶出液を、フロースルー様式において、（ａ）炭素質材料；および（ｂ）炭素質材料と、１または複数のＣＥＸ媒体、ＡＥＸ媒体、混合様式媒体およびＨＩＣ媒体との組合せのうちの１つと接触させるステップ；ならびに（ｉｖ）試料の第２の溶出液を得るステップを含み；第２の溶出液が第１の溶出液中の１または複数の不純物のレベルと比較して、より低いまたは低下したレベルの１または複数の不純物を含む、目的のタンパク質および１または複数の不純物を含有する試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させる方法が提供される。
【００１２】
さらに別の態様において、（ｉ）目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、アフィニティ媒体を含有するクロマトグラフィーカラムと接触させるステップ；（ｉｉ）試料の第１の溶出液を得るステップ；（ｉｉｉ）第１の溶出液を、フロースルー様式において、炭素質材料と接触させるステップ；（ｉｖ）試料の第２の溶出液を得るステップ；（ｖ）第２の溶出液を、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；ならびに（ｖｉ）試料の第３の溶出液を得るステップを含み、第３の溶出液が、第１の溶出液を炭素質材料と接触させない場合の１または複数の不純物のレベルと比較して、より低いまたは低下したレベルの１または複数の不純物を含む、目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させる方法が提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、そのような方法は、アフィニティ捕捉ステップの後および試料を、いくつかの実施形態において、膜吸着剤である陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させる前に、ＣＥＸ結合および溶出クロマトグラフィーステップを含む。いくつかの実施形態において、特許請求される本発明による方法は、さらなるクロマトグラフィーステップ、例えば、アフィニティ捕捉ステップの後に用いられる結合および溶出ＣＥＸクロマトグラフィーステップの必要性を取り除く。市販の陰イオン交換クロマトグラフィー媒体の例は、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（ＰＡＬＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ（ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ ＳＴＥＤＩＭ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などの膜吸着剤、ならびにＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）などのビーズ媒体である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、特許請求される本発明による方法は、非カラムに基づくクロマトグラフィーステップを用いる。
【００１５】
さらに別の態様において、（ｉ）目的のタンパク質を含むタンパク質相を得るステップ；（ｉｉ）好適なバッファーを用いて目的のタンパク質を含むタンパク質相を再構成させることによって、再構成されたタンパク質溶液を得る工程；（ｉｉｉ）再構成されたタンパク質溶液を、炭素質材料とフロースルー様式において接触させるステップ；（ｉｖ）目的のタンパク質を含む第１の溶出液を得るステップ；（ｖ）第１の溶出液を、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；および（ｖｉ）目的のタンパク質を含む第２の溶出液を得るステップを含み、第２の溶出液が、（ｉｉｉ）に由来する再構成されたタンパク質溶液を炭素質材料と接触させない場合の１または複数の不純物のレベルと比較して、より低いまたは低下したレベルの１または複数の不純物を含む、目的のタンパク質を含む試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させる方法が提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、そのような方法は、任意の結合および溶出クロマトグラフィーステップ、例えば、結合および溶出アフィニティまたはＣＥＸクロマトグラフィーステップの必要性を取り除く。
【００１７】
本発明によるいくつかの方法において、タンパク質相は、沈降、軟凝集、結晶化、カラムクロマトグラフィー、可溶性小分子の使用、ポリマーリガンドの使用、または懸濁クロマトグラフィー媒体の使用からなる群より選択される１または複数の方法を用いて得られる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、炭素質材料と、１または複数のＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体および混合媒体との組合せは、炭素質材料と１または複数のそのような媒体とを混合することを必要とする。他の実施形態において、炭素質材料と、１または複数のＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体および混合媒体との組合せは、組合せ中の異なる材料を相前後して用いることを必要とする。
【００１９】
本発明の方法による様々な実施形態において、アフィニティ媒体はプロテインＡまたはプロテインＧから選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質は抗体またはＦｃ領域を含有するタンパク質である。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施形態においては、抗体はポリクローナル抗体である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、試料は細胞培養供給液を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、試料は清澄化された細胞培養供給液である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、清澄化された細胞培養供給液は深層濾過および／または遠心分離により得られる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、清澄化された細胞培養液は、塩、酸、ポリマー、または刺激原応答性ポリマーを用いる沈降により得られる。
【００２５】
様々な実施形態において、特許請求される本発明による方法において用いられる炭素質材料は、活性化炭素である。いくつかの実施形態において、活性化炭素は、活性炭を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、炭素質材料と、１または複数のＣＥＸ媒体、ＡＥＸ媒体、混合様式媒体およびＨＩＣ媒体との組合せは、活性化炭素と、１または複数のＣＥＸ樹脂、ＡＥＸ樹脂、混合様式樹脂およびＨＩＣ樹脂との混合物を含む。いくつかの実施形態において、そのような混合物は、クロマトグラフィーカラム中に充填される。他の実施形態において、混合物はディスク中に充填される。さらに他の実施形態において、混合物はポッド、カートリッジまたはカプセル中に充填される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、活性化炭素はクロマトグラフィーカラム中に充填される。他の実施形態において、活性化炭素はＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄなどの密閉使い捨てデバイス中に充填される。さらに他の実施形態において、活性化炭素はカートリッジまたはカプセル中に充填される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、活性化炭素は、多孔性材料中に含浸される、例えば、活性化炭素は多孔性繊維性媒体中に組み込まれる。多孔性材料は、カラム、ディスク、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ、カートリッジまたはカプセル内に含有させることができる。いくつかの実施形態において、活性化炭素はセルロース媒体中に充填される。
【００２９】
特定の実施形態において、ＡＥＸ媒体は、１または複数のポリマー第一級アミンまたはそれらのコポリマーを含む表面コーティングを有する膜である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料は、試料をアフィニティ捕捉ステップにかける前に活性化炭素と接触される。他の実施形態において、試料はアフィニティ捕捉ステップの後に活性化炭素と接触される。
【００３１】
特許請求される本発明による様々な方法において、活性化炭素を用いるプロセスを用いる目的のタンパク質の収率の損失は、タンパク質総量の２０％未満である。換言すれば、特許請求される本発明によるプロセスは、１００％がタンパク質総量である場合、８０％以上の収率の目的のタンパク質をもたらす。さらなる実施形態において、活性化炭素を用いるプロセスを用いる目的のタンパク質の収率の損失は、１０％未満である。換言すれば、特許請求される本発明によるプロセスは、１００％がタンパク質総量である場合、９０％以上の収率の目的のタンパク質をもたらす。
【００３２】
特定の実施形態において、活性化炭素は、試料（例えば、フロースルー精製ステップの前に実施された結合および溶出クロマトグラフィー捕捉プロセスステップから回収されたプロテインＡ溶出液などの溶出液）から標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質または抗体）を精製するための方法におけるフロースルー精製プロセスステップまたは単位操作の一部として用いられる。そのようなフロースルー精製プロセスステップまたは単位操作において、結合および溶出クロマトグラフィーステップ（例えば、プロテインＡアフィニティカラム）からの溶出液は、図１９に記載のように、活性化炭素、次いで、ＡＥＸ媒体、次いで、ＣＥＸ媒体、次いでウイルスフィルターの順に流動する。いくつかの実施形態において、溶液交換（例えば、ｐＨ変化）はＡＥＸステップとＣＥＸステップの間に実施され、ここで溶液はインラインスタティックミキサーおよび／またはサージタンクを用いる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のような、活性化炭素を用いるフロースルー精製プロセスステップまたは単位操作は、標的分子を精製するための連続プロセスの一部であり、フロースルー精製ステップは、フロースルー精製プロセスステップの上流のプロセスステップ（例えば、結合および溶出クロマトグラフィー捕捉ステップ）および下流のプロセスステップ（例えば、製剤化ステップ）と流体連通しており、それによって液体試料がプロセスを連続的に流動することができる。
【００３３】
特定の実施形態において、フロースループロセスステップまたは単位操作全体は、単一のスキッド（すなわち、制御／モニタリング装置）を用いる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】評価された様々な市販の吸着媒体の各々、すなわち、活性化炭素（ＡＣ）；アガロース陽イオン交換樹脂、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔｆｌｏｗ（ＳＰＦＦ）；ポリマー性陽イオン交換樹脂、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓ；アガロース陰イオン交換樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＱＦＦ）；およびアガロースＨＩＣ樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔｆｌｏｗ（ｐｈ ＦＦ）に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＩｇＧ収率を測定する実験の結果を示す棒グラフである。図１に示されるように、ＩｇＧ収率の最大で約５％の損失を示すＨＩＣ樹脂に関して以外は、スクリーニングされた全ての他の媒体が検出可能な収率の損失を示さなかった。
【図２】評価された様々な市販の吸着媒体の各々、すなわち、活性化炭素、Ｎｕｃｈａｒ（登録商標）ＲＧＣ、（ＡＣ）、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓ、ＱＦＦおよびｐｈ ＦＦならびに未処理の清澄化された供給液に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＵＶ ２８０ｎｍ活性種の量を測定する実験の結果を示す棒グラフである。図２に示されるように、活性化炭素は、他の吸着媒体と比較して、着色された種の量を有意に減少させた。
【図３】上記に列挙された市販の吸着媒体の各々、ならびに未処理の清澄化された供給液に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。ＨＣＰ濃度はＣｙｇｎｕｓ ＣＨＯ−ＣＭ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットを用いてｎｇ／ｍＬで測定された。図３に示されるように、活性化炭素を含む、スクリーニングされた全ての媒体が、ある程度までＨＣＰを除去した。しかしながら、陽イオン樹脂ＳＰＦＦおよびＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓが、最も効率的にＨＣＰを除去した。
【図４】上記に列挙された市販の吸着媒体の各々、ならびに未処理の清澄化された供給液に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて測定された。図４に示されるように、前記媒体の各々は、ある程度までＤＮＡを除去する。しかしながら、陰イオン交換媒体が最も効率的に、次いで活性化炭素がＤＮＡを除去する。
【図５】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎の上記に列挙された評価された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＩｇＧの濃度を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ散布図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、ＩｇＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）をｙ軸に示す。ＡＣ、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳおよびＱＦＦを含む、評価された全ての媒体が、未処理の清澄化された供給液の最大で１００ＣＶの負荷に対してＩｇＧの有意な損失を示さなかった。
【図６】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎の評価された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＵＶ活性種ピーク面積（ＵＶ活性種の量に対応する）を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ分散図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、プロテインＡ分析カラムのフロースルー中のＵＶ活性種ピーク面積をｙ軸上に示す。評価された全ての材料のうち、ＡＣは１００ＣＶにわたって７０％を超えるＵＶ活性種を除去した；ＱＦＦは１００ＣＶにわたって約１０％のＵＶ活性種を除去した；ならびに２つの陽イオン交換樹脂、ＳＰＦＦおよびＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓは最少量のＵＶ活性種を除去した。
【図７】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎の評価および上記に列挙された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ分散図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、ＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。ＳＰＦＦおよびＰｒｏＲｅｓ Ｓは１００ＣＶにわたって多くのＨＣＰを除去した。ＱＦＦはいくらかのＨＣＰを除去したが、迅速に漏出した。高濃度のＤＮＡを有したこの特定の供給液について、活性化炭素は最少量のＨＣＰを除去した。
【図８】未処理の清澄化された供給液を含む、１００ＣＶまでロードされた供給液の１０ＣＶ毎の評価および上記に列挙された媒体の各々に関する、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を測定する実験の結果を示すｘ−ｙ分散図である。カラム容量（ＣＶ）をｘ軸上に示し、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。ＡＣ、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳおよびＱＦＦを含む、評価された媒体の各々は、１００ＣＶにわたってＤＮＡを除去したが、しかしながら、異なる程度であった。
【図９】不純物除去に用いることができる操作の様々な様式例の概略図である。左側の流れ図は、未処理の清澄化された供給液が、ＡＣを含有するカラム、次いで、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳまたはＱＦＦ媒体を含有するカラム上にロードされる代表的な実験を示す。中央の流れ図は、未処理の清澄化された供給液が、ＡＣを含有するカラム、次いで、ＳＰＦＦまたはＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓおよび次いでＱＦＦを含有するカラム上にロードされる代表的な実験を示す。右側の流れ図は、未処理の清澄化された供給液が、ＡＣとＳＰＦＦとの１：１（ｖ／ｖ）混合物；またはＡＣとＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓとの１：１（ｖ／ｖ）混合物；またはＡＣとＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳとＱＦＦとの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物を含有するカラム上にロードされる代表的な実験を示す。
【図１０】未処理の清澄化された供給液を含む、図９に示された材料の組合せの各々に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＵＶ活性種ピーク面積（ＵＶ活性種の量に対応する）を示す棒グラフである。活性化炭素および活性化炭素を含む混合物は、ＵＶ活性種を有意に減少させた。活性化炭素および陰イオン交換樹脂が両方ともプロセスにおいて用いられた場合、連続的にまたは混合物として用いた場合、より多くのＵＶ活性種が除去されたが、これは異なる材料の相乗効果を示している。
【図１１】未処理の清澄化された供給液を含む、図９に示された材料の組合せの各々に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を示す棒グラフである。全ての材料がＨＣＰをある程度まで除去したが、活性化炭素が、ＳＰＦＦもしくはＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓなどの陽イオン樹脂と一緒にまたはＱＦＦなどの陰イオン樹脂と一緒にプロセスにおいて用いられた場合、樹脂と共に連続的にまたは樹脂との混合物として用いられた場合、ＨＣＰを最も効率的に除去したが、これは異なる材料の相乗効果を示唆している。
【図１２】未処理の清澄化された供給液を含む、図９に示された材料の組合せの各々に関する、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液のフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を示す棒グラフである。全ての材料がＤＮＡをある程度まで除去したが、活性化炭素がＱＦＦと共に連続的に用いられたまたはＱＦＦとの混合物として用いられた場合、それは評価された他の材料および組合せと比較して、ＤＮＡ除去において最も有効であった。
【図１３】評価された材料の各々、すなわち、ＡＣ；ＳＰＦＦ；ＱＦＦ；ｐｈ ＦＦ、ならびに２つの材料の組合せ、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物およびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物に関する、プロテインＡカラム溶出プールのフロースルー溶出液中のＩｇＧ収率を測定する実験の結果を示す棒グラフである。評価された異なる材料のフロースルー溶出液のための供給液は、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液からＰｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａ ＰｌｕｓプロテインＡ樹脂を用いて作製されたプロテインＡカラム溶出プールであった。スクリーニングされた全ての材料は８０％を超える収率を示した。
【図１４】評価された材料の各々、すなわち、ＡＣ；ＳＰＦＦ；ＱＦＦ；ｐｈ ＦＦ、ならびに２つの材料の組合せ、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物およびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物に関する、プロテインＡカラム溶出プールのフロースルー溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。評価された異なる材料のフロースルー溶出液のための供給液は、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液からＰｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａ ＰｌｕｓプロテインＡ樹脂を用いて作製されたプロテインＡカラム溶出プールであった。全ての材料または材料混合物がプロテインＡ溶出プールから特定量のＨＣＰを除去したが、単独で用いた場合、活性化炭素および陽イオン交換樹脂がより有効であった。混合物として用いた場合、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦおよびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦは、単一成分のみよりも多くのＨＣＰを除去した。ＱＦＦおよびＰｈＦＦは、単独で用いた場合、最少量のＨＣＰを除去した。
【図１５】評価された材料の各々、すなわち、ＡＣ；ＳＰＦＦ；ＱＦＦ；ｐｈ ＦＦ、ならびに２つの材料の組合せ、ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１混合物およびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦの１：１：１混合物に関する、プロテインＡカラム溶出プールのフロースルー溶出液中のＤＮＡ濃度を測定する実験の結果を示す棒グラフである。評価された異なる材料のフロースルー溶出液のための供給液は、ポリクローナルＩｇＧを添加したヌルＣＨＯ−Ｓ供給液からＰｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａ ＰｌｕｓプロテインＡ樹脂を用いて作製されたプロテインＡカラム溶出プールであった。全ての材料または材料混合物がプロテインＡ溶出プールから特定量のＤＮＡを除去したが、樹脂混合物ＡＣ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦおよびＰｈＦＦ／ＳＰＦＦ／ＱＦＦは任意の単一成分を超えるわずかな利点を示す。
【図１６】モノクローナル抗体溶液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を測定する実験の結果を示すグラフであり、ここで、溶液はプロテインＡクロマトグラフィーを用いて清澄化された細胞培養液（プロテインＡ溶出液と呼ぶ）から捕捉され、その後、３回の個別のフロースルー精製トレインにかけられた。１番目のトレインは、５つの層から構成された０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）陰イオン交換膜デバイスを用いた；２番目のトレインは、ＨＤ １ｍＬのＮｕｃｈａｒ活性化炭素が充填されたカラムを用いた；および３番目のトレインは、１ｍＬの活性化炭素カラム、次いで、０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）陰イオン交換膜を用いた。溶出液の１０個の１０ｍＬ画分がそれぞれの精製トレインから収集され、選択された画分が宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析された。グラフのＸ軸は、活性化炭素カラムからの溶出液のカラム容量（ＣＶ）中の１０ｍＬ画分に関する収集の終点を示す。グラフのＹ軸は、活性化炭素溶出液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を示す。このグラフは、活性化炭素のみ、および陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素によるアフィニティ捕捉された溶出液のフロースルー処理が、モノクローナル抗体溶液からの不純物の除去にとって予想外に有効であったことを示している。
【図１７】モノクローナル抗体溶液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を測定する実験の結果を示すグラフであり、ここで、溶液は陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを用いて清澄化された細胞培養液（ＣＥＸ溶出液と呼ぶ）から捕捉され、その後、ＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素の１ｍＬ充填されたカラムを用いる精製にかけられた。溶出液の７個の１０ｍＬ画分が収集され、これらが宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析された。グラフのＸ軸は、活性化炭素カラムからの溶出液の溶出した容量（ｍＬ）中の１０ｍＬ画分に関する収集の終点を示す。グラフのＹ軸は、個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を示す。このグラフは、活性化炭素を用いて、様々な異なるタンパク質溶液から不純物を除去することができることを示している。
【図１８】モノクローナル抗体溶液の個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体、ＭＡｂ ＩＩ）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を測定する実験の結果を示すグラフであり、ここで、溶液はプロテインＡカラムを備えた３つのカラムの連続多クロマトグラフィークロマトグラフィー（ＣＭＣ）系を用いて清澄化された細胞培養液から捕捉された後、カラム中に充填されたＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーデバイス（例えば、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））を用いて精製される。このグラフのＸ軸は、陰イオン交換デバイスの単位容量あたりにロードされる抗体の重量（ｋｇ／Ｌ）で測定された、画分収集の終点を示す。このグラフのＹ軸は、個々の画分についての生成物（すなわち、モノクローナル抗体）の濃度（ｐｐｍ）と比較したＨＣＰの濃度を示す。このグラフは、活性化炭素およびＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）の両方が、単独で用いた場合にＨＣＰの有意な部分を除去したが、組合せて用いた場合、それらは出発溶液の純度を１，３７０ｐｐｍのＨＣＰから１０ｐｐｍ以下まで増加させることを示している。
【図１９】本明細書に記載されたような、接続されたフロースルー精製プロセスステップの概略図である。活性化炭素含有デバイスは、陰イオン交換デバイスに直接接続される。陰イオン交換デバイスからの流出液はスタティックミキサーを通過し、そこで水性酸がｐＨを低下させるために添加され、次いで、陽イオン交換フロースルーデバイスおよびウイルスフィルターを通過する。
【図２０】陰イオン交換クロマトグラフィーデバイス（すなわち、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））後のＨＣＰ漏出を測定する実験の結果を示すグラフである。Ｙ軸はＨＣＰ濃度（ｐｐｍ）を示し、Ｘ軸はＡＥＸ負荷（ｋｇ／Ｌ）を示す。
【図２１】フロースルー精製プロセスステップにおけるウイルス濾過デバイスの負荷の関数としてＭＡｂ凝集物の除去を測定する実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸はウイルス濾過負荷（ｋｇ／ｍ^２）を示し、Ｙ軸はウイルス濾過後の試料中のＭＡｂ凝集物のパーセンテージを示す。
【図２２】深層濾過、活性化炭素およびウイルス濾過後の圧力プロファイルを測定する実験の結果を示すグラフである。Ｙ軸は圧力（ｐｓｉ）を示し、Ｘ軸は時間（ｈ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、目的のタンパク質および１または複数の不純物を含有する試料から目的のタンパク質を精製するための新規および改良されたプロセスを提供する。
【００３６】
活性化炭素は、以前は水精製プロセスにおいて用いられていた。さらに、活性化炭素は、血清アルブミン（album）から、脂肪酸およびビリルビンなどの小分子不純物を除去するために用いられてきた（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２：１７３−１８１（１９６７）；Ｎａｋａｎｏら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２９：６４−７１（１９８３）；Ｎｉｋｏｌａｅｖら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔ．Ｏｒｇ．，１４：１７９−１８５（１９９１）を参照されたい）。活性化炭素はまた、植物ウイルスの精製中に色素ならびに宿主タンパク質、プロテアーゼ、およびリボヌクレアーゼを除去するためにも用いられてきた（例えば、Ｐｒｉｃｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ，３３：４５−５４（１９４６）；Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５：８−１５（１９６１）；ＭｃＬｅａｎａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１：５８５−５９１（１９６７）を参照されたい）。
【００３７】
従って、一般的には、活性化炭素は溶液中の分子（例えば、水試料中の不純物）に非特異的に結合すると報告されてきた。
【００３８】
本発明は、少なくとも部分的には、活性化炭素がタンパク質性不純物およびＤＮＡの集団を選択的に除去し、それによって、それを細胞中での組換え発現により生成されたタンパク質の精製において有用にすることができるという予想外で驚くべき知見に基づくものである。
【００３９】
本明細書の実施例に示されるように、活性化炭素を、標的タンパク質の収率に有意に影響することなく、タンパク質精製プロセス中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡ不純物の選択的除去に用いることができる。さらに、本明細書に記載の実施例に示されるように、活性化炭素が、単独でまたは１もしくは複数の種々の型のクロマトグラフィー媒体との混合物中で、フロースルー様式におけるタンパク質精製プロセスにおいて用いられる場合、それはタンパク質含有試料中の１または複数の不純物のレベルの有意な低下をもたらし、ならびに下流のクロマトグラフィーカラムの負担を減少させる。さらに、特定の例において、活性化炭素は精製プロセスにおいて用いることができるステップ数を減少させ、それによって、全体の運転費用を減少させ、時間を節約することができる。さらに、本明細書に記載の実施例に示されるように、活性化炭素を捕捉ステップの前または後で用いることによって、目的のタンパク質を含有する試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させることができる。
【００４０】
本明細書に記載のいくつかの実施形態において、活性化炭素は、標的分子を精製するためのプロセス全体のフロースルー精製ステップにおいて用いられ、ここでプロセス全体ならびにフロースルー精製ステップは連続様式で実施される。
【００４１】
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して記載される。
【００４２】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる用語「炭素質材料」とは、炭素から構成されたまたは炭素を含有する任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、特許請求される本発明による方法において用いられる炭素質材料は、活性または活性化炭素である。いくつかの実施形態において、活性化炭素は活性炭を含む。いくつかの実施形態において、活性化炭素はセルロース媒体中に組み込まれる。
【００４３】
本明細書で互換的に用いられる用語「活性炭素（ａｃｔｉｖｅ ｃａｒｂｏｎ）」または「活性化炭素（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）」とは、その孔構造を増強するためのプロセスにかけられた炭素質材料を指す。活性化炭素は非常に高い表面積を有する多孔性固体である。それらは、石炭、木材、やし殻、堅果殻および泥炭などの様々な起源から誘導することができる。活性化炭素を、制御された雰囲気下での加熱を含む物理的活性化または強酸、塩基もしくは酸化剤を用いる化学的活性化を用いてこれらの材料から製造することができる。活性化プロセスは、不純物除去のための高い能力を活性化炭素に与える高い表面積を有する多孔性構造をもたらす。活性化プロセスを改変して、表面の酸度を制御することができる。
【００４４】
典型的な活性化プロセスは、樹脂廃棄物、石炭、石炭コークス、石油コークス、褐炭、ポリマー材料ならびにパルプおよび紙、パルプ生産に由来する残渣、木材（木材チップ、おがくずおよび木粉など）、堅果殻（アーモンド殻およびココナッツ殻など）、堅果仁および果実核（オリーブおよびサクランボ核など）などのリグノセルロース材料などの炭素源を、熱プロセス（例えば、酸化ガスを用いる）または化学的プロセス（例えば、リン酸もしくは塩化亜鉛などの金属塩を用いる）にかけることを含む。リン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）を用いる木材ベースの炭素の化学的活性化の例は、炭素の脱色およびガス吸着能力の改善をもたらした米国特許第Ｒｅ．３１，０９３号に開示されている。また、米国特許第５，１６２，２８６号は、堅果殻、果実核および堅果仁などの、特に高密度であり、比較的高い（３０％）リグニン含量を含む木材ベースの材料のリン酸活性化を教示している。リグノセルロース材料のリン酸活性化は、高い活性および高い密度の炭素を調製するステップとして、米国特許第５，２０４，３１０号にも考察されている。この段落に列挙されたそれぞれの特許の教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
多くの他の吸着材料とは対照的に、活性化炭素は比較的弱いｖａｎ ｄｅｒ ＷａａｌｓまたはＬｏｎｄｏｎ分散力を用いて分子と相互作用すると考えられている。典型的な市販の活性化炭素製品は、当業界において周知の方法である窒素吸着に基づくＢｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（「ＢＥＴ」）法により測定されるように、少なくとも３００ｍ^２／ｇの表面積を示す。
【００４６】
活性炭素または活性化炭素は以前は液体および気体を精製するためのプロセスにおいて用いられていたが、１または複数のタンパク質性不純物から組換え発現されたタンパク質を精製するためのプロセスにおいては以前は用いられていなかった。
【００４７】
用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」または「抗体」（本明細書では互換的に用いられる）とは、鎖が、例えば、鎖間ジスルフィド結合により安定化されており、抗原に特異的に結合する能力を有する、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる基本的な４個のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指す。用語「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」（本明細書では互換的に用いられる）とは、鎖が、例えば、鎖間ペプチドリンカーにより安定化されており、抗原に特異的に結合する能力を有する、重鎖および軽鎖からなる２個のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指す。用語「ドメイン」とは、例えば、β−プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループ（たとえば、３から４個のペプチドループを含む）を含む重鎖または軽鎖ポリペプチドの球形領域を指す。ドメインはさらに、本明細書では、「定常」ドメインの場合は様々なクラスのメンバーのドメイン内の配列変化の相対的欠如または「可変」ドメインの場合は様々なクラスのメンバーのドメイン内の有意な変化に基づいて、「定常」または「可変」と呼ばれる。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、抗体またはポリペプチド「領域」と当業界では互換的に呼ばれることも多い。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。
【００４８】
免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、モノマーまたはポリマー形態で存在してもよく、例えば、ＩｇＭ抗体はペンタマー形態で存在するおよび／またはＩｇＡ抗体はモノマー、ダイマーもしくはマルチマー形態で存在する。免疫グロブリンまたは抗体はまた、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）およびリガンド特異的結合ドメインを保持するまたはそれを含むように改変されている限り、抗体フラグメントを含んでもよい。抗体の用語「フラグメント」または「機能的フラグメント」とは、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の部分または一部を指す。フラグメントを、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理により得ることができる。フラグメントを組換え手段により得ることもできる。組換え生産する場合、フラグメントを単独でまたは融合タンパク質と呼ばれるより大きいタンパク質の部分として発現させることができる。フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントが挙げられる。融合タンパク質の例としては、Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。
【００４９】
特定の実施形態において、特許請求される本発明による方法は、Ｆｃ領域を含むフラグメントである抗体のフラグメントを精製するために用いられる。
【００５０】
用語「Ｆｃ領域」および「Ｆｃ領域を含有するタンパク質」は、タンパク質が、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖定常領域またはドメイン（前記で定義されたようなＣＨおよびＣＬ領域）を含むことを意味する。「Ｆｃ領域」を含有するタンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有してもよい。ＣＨ_２／ＣＨ_３領域などの「Ｆｃ領域」は、プロテインＡまたはその機能的変異体などのアフィニティリガンドに選択的に結合することができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域を含有するタンパク質は、プロテインＡまたはその機能的誘導体、変異体もしくは断片に特異的に結合する。他の実施形態において、Ｆｃ領域を含有するタンパク質は、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはその機能的誘導体、変異体もしくは断片に特異的に結合する。
【００５１】
上記で考察されたように、いくつかの実施形態において、標的タンパク質はＦｃ領域を含有するタンパク質、例えば、免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域を含有するタンパク質は、別のポリペプチドまたはその断片に融合された免疫グロブリンのＦｃ領域を含む組換えタンパク質である。
【００５２】
一般的には、免疫グロブリンまたは抗体は、目的の「抗原」を指向する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与はその哺乳動物において治療的利益をもたらすことができる。
【００５３】
本明細書で互換的に用いられる用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団中の個々の抗体は、少量で存在してもよい可能な天然の突然変異について以外は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位を指向する。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により初めて記載されたハイブリドーマ方法により作製するまたは組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作製することができる。「モノクローナル抗体」を、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５４】
モノクローナル抗体はさらに、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導されたまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるまたは相同であるが、それらが所望の生物活性を示す限り、鎖の残りが、別の種から誘導されたまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにそのような抗体のフラグメント中に対応する配列と同一であるまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含んでもよい（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００５５】
本明細書で用いられる場合の用語「超可変領域」とは、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））および／または「超可変ループ」に由来する残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最少の配列を含むキメラ抗体である。多くの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）に由来する超可変領域残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改善するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含み、その中の超可変ループの全部または実質的に全部は非ヒト免疫グロブリンのものと一致し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００５７】
本明細書で互換的に用いられる用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」とは、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマーまたは他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的には、ＲＮＡもしくはＤＮＡ中に見出すことができる）または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含んでもよい。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドを、相補鎖を合成し、好適な条件下で鎖とアニーリングさせることによりまたは好適なプライマーと共にＤＮＡポリメラーゼを用いてデノボで相補鎖を合成することにより、化学的合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。核酸分子は多くの異なる形態をとってもよく、例えば、遺伝子または遺伝子断片、１または複数のエクソン、１または複数のイントロン、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーであってよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、ウラシル、フルオロリボースおよびチオエートなどの他の糖および連結基ならびにヌクレオチド分枝などの改変ヌクレオチドを含んでもよい。本明細書で用いられる場合、「ＤＮＡ」または「ヌクレオチド配列」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧを含むだけでなく、任意のそれらの類似体またはこれらの塩基の改変形態、例えば、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電連結およびチオエート、糖類似体の使用、ならびに改変されたおよび／または選択的骨格構造、例えば、ポリアミドをも含む。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「溶液」、「組成物」または「試料」とは、目的のタンパク質または標的タンパク質（例えば、抗体などのＦｃ領域を含有するタンパク質）および１または複数の不純物の混合物を指す。いくつかの実施形態において、試料は特許請求される本発明による方法にかけられる前に清澄化ステップにかけられる。いくつかの実施形態において、試料は細胞培養供給液、例えば、哺乳動物細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞）からの供給液を含む。しかしながら、試料は目的のタンパク質を生成するのに用いられる非哺乳動物発現系をも包含する。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「非哺乳動物発現系」とは、宿主細胞または生物が非哺乳動物起源のものである、治療的タンパク質を作製するのに用いられる全ての宿主細胞または生物を指す。非哺乳動物発現系の非限定例は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「ＵＶ活性種」とは、ＵＶ分光光度計によりモニターされるように、培養液をプロテインＡ分析カラムにかけた後の清澄化された細胞培養液のフロースルー画分の組成物を指す。いくつかの実施形態において、ＵＶ分光光度計は、２８０ｎｍの画分をモニターする。この画分は一般的に、染料（ｐＨ指示剤など）、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、および画分から除去する必要がある他の細胞培養培地成分などの不純物からなり、目的のタンパク質（例えば、抗体）をも含む。フロースルー不純物ピークは手動でまたはプリセットアルゴリズムによって統合され、総不純物レベルを定量するのに用いられる。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」とは、一般的に約１０個より多いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を指す。本明細書で互換的に用いられる用語「目的のタンパク質」および「標的タンパク質」とは、限定されるものではないが、１または複数の不純物から、本発明の方法により精製されるべき抗体などのＦｃ領域を含有するタンパク質などのタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００６２】
ポリペプチドの例としては、例えば、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンα鎖；インスリンβ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼもしくはヒト尿もしくは組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化の際に調節され、通常はＴ細胞で発現分泌される）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラクシンα鎖；リラクシンβ鎖；プロリラクシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例えば、ＣＴＬＡ−４）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンもしくは成長因子の受容体；プロテインＡもしくはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５もしくはＮＴ−６）などの神経栄養因子またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；αＦＧＦおよびβＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４もしくはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４およびＣＤ４０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−βおよび−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；ならびに上記に列挙されたポリペプチドのいずれかの断片および／もしくは変異体が挙げられる。さらに、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、上記に列挙されたポリペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体、そのフラグメントまたは変異体である。
【００６３】
本明細書で互換的に用いられる用語「汚染物質」、「不純物」および「デブリ」とは、本発明のプロセスを用いて１または複数の外来または好ましくない分子から分離される標的タンパク質を含有する試料中に存在してもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、１または複数の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、エンドトキシン、脂質および１または複数の添加物などの生体大分子を含む任意の外来または好ましくない分子を指す。さらに、そのような汚染物質は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーステップを用いる場合の浸出したプロテインＡなどの、精製プロセスの前に生じ得るステップにおいて用いられるまたは生成される任意の試薬を含んでもよい。
【００６４】
用語「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」および「ＣＨＯＰ」は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞培養液から誘導された宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）の混合物を指すように互換的に用いられる。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは一般的には、ＣＨＯ細胞中で発現された抗体またはイムノアドヘシンなどの目的のタンパク質を含む細胞培養培地または溶解物（例えば、収穫された細胞培養液（「ＨＣＣＦ」））中に不純物として存在する。目的のタンパク質を含む混合物中に存在するＣＨＯＰの量は、目的のタンパク質の純度の尺度を提供する。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは、限定されるものではないが、ＣＨＯ宿主細胞などの宿主細胞により発現された目的のタンパク質を含む。典型的には、タンパク質混合物中のＣＨＯＰの量は、混合物中の目的のタンパク質の量に対して、百万分の一で発現される。宿主細胞が別の細胞型、例えば、ＣＨＯ以外の哺乳動物細胞、Ｅ．コリ、酵母、昆虫細胞または植物細胞である場合、ＨＣＰは標的タンパク質以外の、宿主細胞溶解物中に見出されるタンパク質を指すことが理解される。
【００６５】
用語「百万分の一」または「ｐｐｍ」は、本発明の方法により精製された標的タンパク質の純度の尺度を指すように本明細書で互換的に用いられる。単位ｐｐｍは、目的のタンパク質のナノグラム／ミリグラムでのまたはミリグラム／ミリリットルでのＨＣＰもしくはＣＨＯＰの量を指す（すなわち、ＣＨＯＰ ｐｐｍ＝（ＣＨＯＰ ｎｇ／ｍｌ）／（目的のタンパク質ｍｇ／ｍｌ）（式中、タンパク質は溶液中にある。））。
【００６６】
本明細書で互換的に用いられる用語「精製すること」、「分離すること」または「単離すること」とは、目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む組成物または試料から目的のポリペプチドもしくはタンパク質または標的タンパク質の純度を増加させることを指す。典型的には、目的のタンパク質の純度は、組成物から少なくとも１つの不純物を除去する（完全にまたは部分的に）ことにより増加する。「精製ステップ」は、目的のタンパク質を含む組成物中に１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満もしくは３ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物または試料を指すように本明細書で用いられる「均質な」組成物または試料をもたらす、精製プロセス全体の一部であってもよい。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「タンパク質相」とは、標的タンパク質の濃度が試料中の標的タンパク質の初期濃度と比較して実質的に増加した試料の一部を指す。この濃縮プロセスは、固体多孔性もしくは非多孔性支持体上でのタンパク質吸着；液体−空気もしくは液体−気体境界面でのタンパク質吸着；２つの非混和性もしくは部分的に混和性の液体間の境界面でのタンパク質吸着；純粋な成分としてまたは１もしくは複数の他の分子もしくはポリマーとの複合体形成の結果としてのタンパク質沈降；またはタンパク質結晶化の使用を含んでもよい。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「液相」とは、標的タンパク質の濃度が試料中のタンパク質の初期濃度と比較して実質的に低下した試料の一部を指す。液相は上記で定義されたタンパク質相と同時に作製することができる。
【００６９】
本明細書で互換的に用いられる用語「フロースループロセス」、「フロースルー様式」および「フロースルークロマトグラフィー」とは、試料中の少なくとも１つの生成物が、クロマトグラフィー樹脂または媒体を通って流動することを意図されるが、少なくとも１つの潜在的な成分がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する生成物分離技術を指す。
【００７０】
流動することが意図される試料とは、一般的には、「移動相」と呼ばれる。「フロースルー様式」は、一般的には、アイソクラチック操作（すなわち、移動相の組成が変化しないクロマトグラフィープロセス）である。フロースルーに用いられる媒体は通常、標的タンパク質分子を含有する同じバッファー溶液を用いて予め平衡化される。精製後、媒体をさらなる量の同じバッファーでフラッシュして、生成物の回収を増加させることができる。いくつかの実施形態において、「フロースルー様式」の移動相は、目的の生成物を含有する細胞培養供給液である。いくつかの例において、供給液のｐＨまたは伝導率を調整して、フロースループロセスを用いる不純物除去を最大化する。
【００７１】
特許請求される方法に記載のおよび本明細書に記載の実施例に記載されるいくつかの実施形態において、前記方法はフロースルー様式で実施される陰イオン交換ステップを用いる。
【００７２】
本明細書で互換的に用いられる用語「結合および溶出様式」ならびに「結合および溶出プロセス」とは、試料中に含まれる少なくとも１つの生成物がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合し、その後溶出される生成物分離技術を指す。
【００７３】
用語「クロマトグラフィー」とは、目的の分析物（例えば、免疫グロブリンなどのＦｃ領域を含有するタンパク質）が、混合物の個々の分子が移動相の影響下で、または結合および溶出プロセスにおいて固定された媒体を通って移動する速度の差異の結果として他の分子から分離される、混合物中に存在する他の分子から目的の分析物を分離する任意の種類の技術を指す。
【００７４】
用語「クロマトグラフィー樹脂」または「クロマトグラフィー媒体」は本明細書で互換的に用いられ、混合物中に存在する他の分子から目的の分析物（例えば、免疫グロブリンなどのＦｃ領域を含有するタンパク質）を分離する任意の種類の多孔性または非多孔性固相を指す。通常、目的の分析物は、混合物の個々の分子が移動相の影響下で、または結合および溶出プロセスにおいて固定された固相を通って移動する速度の差異の結果として、他の分子から分離される。非限定例としては、陽イオン、陰イオン、ＨＩＣまたは混合様式の表面改変を有する樹脂；陽イオン、陰イオン、ＨＩＣまたは混合様式の表面改変を有する膜；陽イオン、陰イオン、ＨＩＣまたは混合様式の表面改変を有する織ったまたは織られていない繊維；および陽イオン、陰イオン、ＨＩＣまたは混合様式の表面改変を有するモノリスが挙げられる。
【００７５】
本明細書で用いられる用語「アフィニティ分離」または「アフィニティ精製」とは、標的分析物（例えば、免疫グロブリンなどのＦｃ領域を含有するタンパク質）を含む試料を、標的分析物に結合することが知られたアフィニティ媒体（例えば、プロテインＡまたはその変異体などの分析物に結合することが知られたアフィニティリガンドをその上に担持する固相支持体）と接触させることを含む任意の精製またはアッセイ技術を指す。
【００７６】
本明細書で互換的に用いられる用語「アフィニティクロマトグラフィー」および「タンパク質アフィニティクロマトグラフィー」とは、標的タンパク質（例えば、目的のＦｃ領域を含有するタンパク質または抗体）が、標的タンパク質に特異的なリガンドに特異的に結合されるタンパク質分離技術を指す。いくつかの実施形態において、そのようなリガンドは、プロテインＡもしくはプロテインＧまたはその機能的変異体であり、これはクロマトグラフィー固相材料に共有結合し、溶液がクロマトグラフィー固相材料と接触する時に溶液中の標的タンパク質に接近できる。標的タンパク質は一般的には、クロマトグラフィーステップ中にリガンドに対するその特異的結合親和性を保持するが、混合物中の他の溶質および／またはタンパク質はリガンドに感知できるほどにまたは特異的に結合しない。固定されたリガンドへの標的タンパク質の結合は、標的タンパク質が固相材料上の固定されたリガンドに特異的に結合したままにしながら、汚染しているタンパク質またはタンパク質不純物がクロマトグラフィー媒体を通過するのを可能にする。次いで、特異的に結合した標的タンパク質は好適な条件下（例えば、低いｐＨ、高いｐＨ、高い塩、競合リガンドなど）で固定されたリガンドから活性形態で除去され、より早くカラムを通過できるようになった汚染しているタンパク質またはタンパク質不純物を含まない溶出バッファーと共にクロマトグラフィーカラムを通過する。任意の成分を、その対応する特異的結合タンパク質、例えば、抗体を精製するためのリガンドとして用いることができる。しかしながら、本発明による様々な方法において、プロテインＡが、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質または抗体のためのリガンドとして用いられる。標的タンパク質（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）のリガンド（例えば、プロテインＡ）からの溶出のための条件は、当業者によって容易に決定することができる。いくつかの実施形態において、プロテインＧまたはその機能的変異体をリガンドとして用いることができる。いくつかの実施形態において、プロテインＡなどのリガンドは、Ｆｃ領域を含有するタンパク質への結合、洗浄またはリガンド／標的タンパク質コンジュゲートの再平衡化、次いで、約４以下のｐＨを有するバッファーを用いる溶出のために５−９のｐＨ範囲で用いられる。
【００７７】
アフィニティクロマトグラフィーは目的のタンパク質を結合させるのに特異的であるが、プロテインＡおよびプロテインＧなどのリガンドの使用を用いるアフィニティクロマトグラフィーは非常に高価である傾向があり、非特異的材料（例えば、１または複数の不純物）によるクロマトグラフィーカラムの急速な汚損が当業界で大きな問題をもたらしている。本発明による方法は、試料から１または複数のそのような非特異的材料を除去することによりクロマトグラフィーカラムの負担を減少させる材料（例えば、活性化炭素）の使用によってこの問題に対する解決法を提供し、それによって、全体の費用を減少させるならびにカラムの寿命を増加させる。さらに、特許請求される本発明による方法のいくつかはアフィニティクロマトグラフィーステップ後により少ないクロマトグラフィーステップの使用をもたらし、それによってプロセス全体の効率を増加させる。
【００７８】
組換え生産されたタンパク質の複数ステップの精製において、通常は、プロセスの早期段階で細胞培養液中に存在する多種多様な可溶性不純物から標的タンパク質を単離することが有益である。この単離は、標的タンパク質のクロマトグラフィー捕捉または非クロマトグラフィー単離により達成することができる。
【００７９】
本明細書で用いられるクロマトグラフィー「捕捉」ステップは、細菌発酵または細胞培養発現により産生された収穫された原料のすぐ下流に配置されたクロマトグラフィー媒体に標的タンパク質を結合させることからなる。典型的には、収穫された原料は清澄化されるが、捕捉は清澄化されていない原料からも同様に達成することができる。このステップの主な機能は、不純物を流動させながら、可能な最も少ない量の樹脂を用いて溶液から標的タンパク質を結合させることである。次いで、標的タンパク質はさらなる下流のプロセッシングのために有意により少ない容量のバッファー中に溶出される。力学的結合能力、質量回収、および標的の生物活性の保持の最良の組合せを有するクロマトグラフィー媒体が選択される。Ｆｃ結合領域を含有する抗体については、プロテインＡまたはプロテインＧに基づくものなどの、アフィニティクロマトグラフィー媒体の使用が一般的である。
【００８０】
捕捉に用いられるクロマトグラフィー媒体は、多孔性樹脂、膜、モノリス、織ったまたは織られていない多孔性材料を含む群より選択される。
【００８１】
標的タンパク質の非クロマトグラフィー単離は、１または複数の下記ステップにより達成され得る：固体多孔性もしくは非多孔性支持体上でのタンパク質吸着；液体−空気もしくは液体−気体境界面でのタンパク質吸着；２つの非混和性もしくは部分的に混和性の液体間の境界面でのタンパク質吸着；純粋な成分としてまたは１もしくは複数の他の分子もしくはポリマーとの複合体形成の結果としてのタンパク質沈降；またはタンパク質結晶化の使用。
【００８２】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」とは、混合物中の目的の溶質または分析物（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）が、例えば、共有結合により固相イオン交換材料に連結された荷電化合物と相互作用し、目的の溶質または分析物が、ほぼ混合物中の溶質不純物または汚染物質である荷電化合物と非特異的に相互作用するクロマトグラフィープロセスを指す。混合物中の汚染している溶質は、目的の溶質よりも速くもしくは遅くイオン交換材料のカラムから溶出するまたは目的の溶質と比較して樹脂に結合するかもしくは樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的には、陽イオン交換、陰イオン交換、および混合様式のイオン交換クロマトグラフィーを含む。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）に結合した後、溶出する（陽イオン交換結合および溶出クロマトグラフィーもしくは「ＣＩＥＸ」）または標的分子がカラムを「流動」しながら主に不純物に結合する（陽イオン交換フロースルークロマトグラフィーＦＴ−ＣＩＥＸ）ことができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）に結合した後、溶出するまたは標的分子がカラムを「流動」しながら主に不純物に結合することができる。いくつかの実施形態においておよび本明細書に記載の実施例に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーステップは、フロースルー様式で実施される。特定の実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーステップは、コーティングが多孔性基質および１または複数のポリマー性第一級アミンまたはそのコポリマーを含む、基質上の多孔性コーティングを含む多孔性吸着媒体の使用を用いる。
【００８３】
本明細書で用いられる用語「混合様式クロマトグラフィー」または「多様式クロマトグラフィー」とは、それぞれ目的の分子と相互作用することができる少なくとも２つの異なる型の官能基を担持するクロマトグラフィー固定相を用いるプロセスを指す。混合様式クロマトグラフィー媒体の例は、ＡＥＸ混合様式樹脂であるＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。混合様式クロマトグラフィーは、一般的に標的タンパク質および／または不純物と１より多い様式で相互作用するリガンドを用いる。このリガンドは、典型的には、結合させようとする物質と相互作用する少なくとも２つの異なるが協働する部位を含む。例えば、これらの部位の１つは、目的の物質との電荷−電荷型相互作用を有してもよいが、他の部位は目的の物質との電子受容体−供与体型相互作用ならびに／または疎水性および／もしくは親水性相互作用を有してもよい。電子供与体−受容体相互作用型としては、水素結合、π−π、陽イオン−π、電荷移動、双極子−双極子および誘導双極子相互作用が挙げられる。一般的には、相互作用の合計の差異に基づいて、標的タンパク質および１または複数の不純物を様々な条件下で分離することができる。
【００８４】
本明細書で用いられる用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー」または「ＨＩＣ」とは、分子の疎水性、すなわち、水性溶液から疎水性表面に吸着する分子の能力に基づいて分子を分離するためのプロセスを指す。ＨＩＣは通常、典型的にはＲＰ（逆相）樹脂と比較して低い疎水性または疎水性リガンドの密度を有する特に命名されたＨＩＣ樹脂により逆相クロマトグラフィーと異なる。
【００８５】
ＨＩＣクロマトグラフィーは、典型的には、溶質分子の表面上の疎水性基の差異に依存する。これらの疎水性基は、不溶性マトリックスの表面上の疎水性基に結合する傾向を有する。ＨＩＣは逆相液体クロマトグラフィーよりも極性が高く、変性が少ない環境を用いるため、しばしばイオン交換またはゲル濾過クロマトグラフィーとの組合せにおいてタンパク質精製にとってますます一般的になっている。
【００８６】
用語「イオン交換樹脂」、「イオン交換媒体」および「イオン交換材料」とは、負に荷電した固相（すなわち、陽イオン交換樹脂）または正に荷電した固相（すなわち、陰イオン交換樹脂）を指す。電荷は、例えば、共有連結または非共有コーティングもしくは吸着により、固相に１または複数の荷電リガンドを結合させることにより提供され得る。または、もしくはさらに、電荷は固相の固有の特性であってもよい。
【００８７】
本明細書で用いられる用語「ＣＥＸ」、「陽イオン交換媒体」、「陽イオン交換樹脂」および「陽イオン交換材料」とは、負に荷電し、かくして、固相上を通過したまたは固相を通過した水性溶液中の陽イオンとの交換のための遊離陽イオンを有する固相を指す。固相に結合して陽イオン交換樹脂を形成する負に荷電したリガンドは、例えば、カルボキシレートまたはスルホナートであってよい。市販の陽イオン交換樹脂としては、カルボキシ−メチル−セルロース、アガロース上に固定されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａからのＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（商標）またはＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＨＩＧＨ ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ（商標））およびアガロース上に固定されたスルホニル（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａからのＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（商標））が挙げられる。
【００８８】
本明細書で用いられる用語「混合様式媒体」、「混合様式樹脂」および「混合様式イオン交換樹脂」とは、陽イオン、陰イオンおよび疎水性部分で共有改変された固相を指す。市販の混合様式イオン交換樹脂は、弱い陽イオン交換基、低濃度の陰イオン交換基およびシリカゲル固相支持体マトリックスに結合した疎水性リガンドを含有するＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸ（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）である。
【００８９】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＣ媒体」または「ＨＩＣ樹脂」または「ＨＩＣ材料」とは、ＨＩＣ分離に用いられるクロマトグラフィー材料を指す。ＨＩＣ媒体は通常、短い脂肪族基または芳香族基などの疎水性リガンドで改変された多孔性クロマトグラフィー樹脂から誘導される。ＨＩＣ媒体の例としては、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦが挙げられ、両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されている。市販のＨＩＣ樹脂のさらなる例としては、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＰｈｅｎｙｌおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）Ｐｒｏｐｙｌ（ＭＥＲＣＫ ＫＧＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）が挙げられる。
【００９０】
本明細書で用いられる用語「ＡＥＸ」、「陰イオン交換媒体」、「陰イオン交換樹脂」および「陰イオン交換材料」とは、例えば、固相に結合した、第一級、第二級、第三級または第四級アミノ基などの１または複数の正に荷電したリガンドを有する、正に荷電した固相を指す。市販の陰イオン交換樹脂としては、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）およびＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）が挙げられる。
【００９１】
用語「プロテインＡ」および「ＰｒｏＡ」は本明細書では互換的に用いられ、天然起源から回収されたプロテインＡ、合成的に製造されたプロテインＡ（例えば、ペプチド合成または組換え技術による）およびＦｃ領域などのＣＨ_２／ＣＨ_３領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するその変異体を包含する。プロテインＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ａｎｄ Ｌｏｎｚａから商業的に購入することができる。プロテインＡは、一般的には固相支持体材料上に固定される。用語「ＰｒｏＡ」はまた、プロテインＡに共有結合したクロマトグラフィー固相支持体マトリックスを含有するアフィニティクロマトグラフィー樹脂またはカラムをも指す。
【００９２】
本発明による方法において用いられるプロテインＡの機能的誘導体、断片または変異体は、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に関して、少なくともＫ＝１０^−８Ｍ、好ましくはＫ＝１０^−９Ｍの結合定数を特徴としてもよい。結合定数に関してそのような値に準拠する相互作用は、本文脈では「高親和性結合」と呼ばれる。好ましくは、プロテインＡのそのような機能的誘導体または変異体は、天然ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣまたはＩｇＧ結合機能を保持したその遺伝子操作された突然変異体から選択される、野生型プロテインＡの機能的ＩｇＧ結合ドメインの少なくとも一部を含む。
【００９３】
本発明による「汚染プロテインＡ」は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムから結合した抗体を溶出させる際に得られる上記で定義されたようなプロテインＡまたはその機能的誘導体の任意の型の機能的なＩｇＧ結合子孫である。そのような汚染プロテインＡ種は、例えば、特に、工業生産において酵素作用により生じる可能性が非常に高いペプチド結合の加水分解の結果生じるものであってよい。プロテインＡクロマトグラフィーは、粗く精製された新鮮な生成物溶液が依然としてかなりのプロテアーゼ活性を担持する場合、下流のプロセッシングにおける初期ステップとして適用される。細胞培養培地中の死んでいる細胞または初期の遠心分離もしくは濾過ステップにおいて破壊された細胞は、設定された遊離プロテアーゼを有する可能性が高い；調節のために、下流のプロセッシングの前またはその過程で細胞培養培地にプロテアーゼ阻害剤を補給することは、生化学研究実務とは対照的に、通常は達成されない。例はフェニル−メチル−スルホニル−クロリド（ＰＭＳＦ）またはｅ−カプロン酸である。そのような化学剤は生物医薬品の製造における添加剤として望ましくない。さらに、プロテインＡの組換え機能的誘導体または断片は、タンパク質折畳みの三次構造に応じて、野生型プロテインＡよりもプロテアーゼ耐性が低い可能性がある。一度結合ドメインの総数が減少したら、個々のＩｇＧ結合ドメインを連結するアミノ酸断片は曝露され得る。ドメイン間の接触はドメインの折畳みの安定性に寄与することもできる。また、プロテインＡまたはその前記機能的誘導体による抗体の結合は、抗体の結合の際に誘導されたコンフォメーション変化のため、プロテアーゼ作用に対する感受性に影響するまたはそれを促進することもある。
【００９４】
クロマトグラフィー樹脂への分子の「結合」は、分子がリガンド−タンパク質相互作用によってクロマトグラフィー樹脂中または上に可逆的に固定されるような好適な条件下（ｐＨ／伝導率）でクロマトグラフィー樹脂に分子を曝露することを意味する。非限定例としては、分子と、荷電した基またはイオン交換材料の荷電した基とのイオン相互作用およびプロテインＡと免疫グロブリンとの二特異的相互作用が挙げられる。
【００９５】
用語「洗浄バッファー」または「平衡化バッファー」は本明細書では互換的に用いられ、目的のポリペプチド分子を溶出させる前にクロマログラフィー樹脂を洗浄するまたは再平衡化させるのに用いられるバッファーを指す。いくつかの場合、洗浄バッファーおよび負荷バッファーは同じであってもよい。クロマトグラフィー媒体の「洗浄」は、好適なバッファーを媒体中に通過させるまたは媒体上を通過させることを包含することを意味する。
【００９６】
「溶出バッファー」は、固相から標的タンパク質を溶出させるために用いられる。溶出バッファーの伝導率および／またはｐＨは通常、標的タンパク質がクロマトグラフィー樹脂から溶出されるようなものである。
【００９７】
クロマトグラフィー樹脂から分子（例えば、目的のポリペプチドまたは不純物）を「溶出させる」こととは、バッファーがクロマトグラフィー樹脂への結合について目的の分子と競合するように溶液条件を変更することにより、そこから分子を除去することを意味する。非限定例は、イオン交換材料の周囲のバッファーのイオン強度を、該バッファーがイオン交換材料上の荷電部位について分子と競合するように変更することにより、イオン交換樹脂から分子を溶出させることである。
【００９８】
本明細書で用いられる用語「溶出液」とは、溶出により得られた目的の分子を含有する溶液ならびにフロースルー精製の結果として得られた目的の標的タンパク質を含有するフロースルー画分を指す。いくつかの実施形態において、用語「溶出液」とは、結合および溶出クロマトグラフィーステップ（例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーステップ）からの溶出プールを指す。いくつかの実施形態において、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーステップからの溶出液は、ウイルス不活化ステップを介入させてまたは介入させずに活性化炭素を用いるフロースルー精製プロセス中に流入する。
【００９９】
用語「固相」または「多孔性基質」または「ベースマトリックス」とは、１または複数の荷電リガンドが付着することができる非水性材料を指す。固相は、精製カラム、多孔性もしくは非多孔性である個別の粒子の不連続相、膜、織ったもしくは織られていない繊維、モノリスまたはフィルターなどであってよい。固相を形成させるための材料の例としては、多糖類（アガロースおよびセルロースなど）；ならびにシリカ（例えば、制御された孔のガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、ポリビニルエーテル、ナイロン、高分子量ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリエーテルスルホン、セラミック、および上記のいずれかの誘導体などの他の機械的に安定なマトリックスが挙げられる。
【０１００】
「バッファー」は、その酸−塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する溶液である。例えば、バッファーの望ましいｐＨに応じて用いることができる様々なバッファーが、Ｂｕｆｆｅｒｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．（編）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）に記載されている。特許請求される本発明の方法のいくつかのステップにおいて、バッファーは２．０から４．０または２．８から３．８の範囲のｐＨを有する。特許請求される本発明の他のステップにおいて、バッファーは５．０から９．０の範囲のｐＨを有する。特許請求される本発明の他のステップにおいて、バッファーは４．０から６．５の範囲のｐＨを有する。特許請求される本発明のさらに他のステップにおいて、バッファーは４．０より低いｐＨを有する。この範囲でｐＨを制御するバッファーの非限定例としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸およびアンモニウムバッファーならびにこれらの組合せが挙げられる。
【０１０１】
用語「伝導率」とは、２つの電極間に電流を伝導する水性溶液の能力を指す。溶液中で、電流はイオン輸送により流れる。従って、水性溶液中に存在するイオンの量が増加するにつれて、溶液はより高い伝導率を有する。伝導率の測定単位は、ミリシーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍまたはｍＳ）であり、市販の伝導率計（例えば、Ｏｒｉｏｎにより販売されている）を用いて測定することができる。溶液の伝導率は、その中のイオンの濃度を変化させることにより変更することができる。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩（例えば、ＮａＣｌもしくはＫＣｌ）の濃度を変更して、所望の伝導率を達成することができる。好ましくは、様々なバッファーの塩濃度を改変して、以下に記載の実施例のように所望の伝導率を達成する。
【０１０２】
ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」とは、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と釣り合うｐＨを指す。ｐＩは、ポリペプチドの付着した炭水化物のアミノ酸残基もしくはシアル酸残基の正味の電荷から算出するまたは等電点電気泳動法により決定することができる。
【０１０３】
本明細書で用いられる「濾液」とは、媒体を通過する試料の一部を指す。
【０１０４】
本明細書で用いられる「保持物」とは、媒体により実質的に保持される試料の一部を指す。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「清澄化」とは、懸濁した粒子を除去することにより、タンパク質含有溶液の濁度（ＮＴＵで測定される）を低下させるためのプロセスを指す。清澄化は、バッチ式および連続的遠心分離、深層濾過、通常の濾過および接線流濾過ならびに小分子およびポリマー種との軟凝集などの沈降またはそれらの方法の任意の組合せなどの様々な手段により達成することができる。
【０１０６】
語句「クロマトグラフィーカラムの負担を減少させること」とは、タンパク質試料が後にロードされるクロマトグラフィーカラムの汚損の減少をもたらす、タンパク質含有試料の処理またはプロセッシングを指す。典型的なクロマトグラフィー実験において、固定相上に残された非溶出物質または不純物が存在し、それによってクロマトグラフィーカラムの汚損がもたらされ得る。この問題は、存在する不純物のレベルがより高いことに起因して、カラムの汚損の程度がより高くなる規模拡大の間にさらに大きくなる。カラムの汚損はまた、通常は非常に高価であるカラムの寿命の有意な減少をもたらす。本発明による方法は、クロマトグラフィーカラムの負担を有意に減少させる改良された方法を提供し、それによって、カラムの寿命を増加させならびにより高いタンパク質収率をもたらす。本発明による方法は、試料をクロマトグラフィーカラム上にロードする前に有意な量の不純物の除去をもたらし、それによって、カラムの負担を減少させる。典型的な不純物としては、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、脂肪酸（細胞デブリ由来）、染料分子、消泡剤などが挙げられる。
【０１０７】
本明細書で互換的に用いられる用語「プロセスステップ」または「単位操作」とは、精製プロセスにおいて特定の結果を達成するための１もしくは複数の方法またはデバイスの使用を指す。本明細書に記載のプロセスおよび系において用いることができるプロセスステップまたは単位操作の例としては、限定されるものではないが、清澄化、結合および溶出クロマトグラフィー捕捉、ウイルス不活化、フロースルー精製および製剤化が挙げられる。プロセスステップまたは単位操作のそれぞれはそのプロセスステップまたは単位操作の意図される結果を達成するために１より多いステップまたは方法またはデバイスを用いてもよいことが理解される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフロースルー精製ステップは、そのプロセスステップまたは単位操作を達成するために、少なくとも１のそのようなステップが活性化炭素を含む、１より多いステップまたは方法またはデバイスを用いてもよい。いくつかの実施形態において、プロセスステップまたは単位操作を実施するのに用いられる１または複数のデバイスは、単回使用または使い捨てであり、プロセス中に任意の他のデバイスを置換する必要なくまたはさらにはプロセスの実行を停止させる必要なく、除去および／または置換することができる。
【０１０８】
本明細書で用いられる用語「プールタンク」とは、プロセスステップ間で一般的に用いられ、プロセスステップからの出力の全容量の収集を可能にするサイズ／容量を有する任意のコンテナ、ベッセル、リザーバー、タンクまたはバッグを指す。プールタンクは、プロセスステップからの出力の全容量の溶液条件を保持または保存または操作するために用いることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプロセスは１または複数のプールタンクを使用する必要がない。
【０１０９】
本明細書で用いられる用語「サージタンク」とは、プロセスステップ間またはプロセスステップ内（例えば、単一のプロセスステップが１より多いステップを含む場合）で用いられる任意のコンテナまたはベッセルまたはバッグを指す；そこで、あるステップからの出力がサージタンクを通って次のステップに流動する。従って、サージタンクは、それがステップからの出力の全容量を保持または収集することを意図されないが、その代わりにあるステップからの出力の次のステップへの連続流動を可能にするという点で、プールタンクとは異なる。いくつかの実施形態において、２つのプロセスステップ間または本明細書に記載のプロセスもしくは系におけるプロセスステップ内で用いられるサージタンクの容量は、プロセスステップからの出力の全容量の２５％以下である。別の実施形態において、サージタンクの容量は、プロセスステップからの出力の全容量の１０％以下である。いくつかの他の実施形態において、サージタンクの容量は、精製しようとする標的分子に由来する出発物質を構成する、バイオリアクター中の細胞培養液の全容量の３５％未満または３０％未満または２５％未満または２０％未満または１５％未満または１０％未満である。いくつかの実施形態において、サージタンクは、活性化炭素、次いで、ＡＥＸクロマトグラフィー、次いで、ＣＥＸクロマトグラフィー、次いで、ウイルス濾過を用いるフロースルー精製プロセスの間に用いられ、そこでサージタンクはＡＥＸクロマトグラフィーステップの後に溶液交換を実施するために用いられる。
【０１１０】
本明細書で用いられる用語「連続プロセス」とは、１つのプロセスステップからの出力が、介入なくプロセス中の次のプロセスステップに直接流動するような２つ以上のプロセスステップ（または単位操作）を含み、２つ以上のプロセスステップをその期間の少なくとも一部について同時に実施することができる、標的分子を精製するためのプロセスを指す。換言すれば、連続プロセスは、精製プロセスにおける次のプロセスステップを実施する前にプロセスステップを完了させる必要がない。用語「連続プロセス」はまた、プロセスステップ内の複数のステップにも適用され、その場合、複数のステップを含むプロセスステップの実施中に、試料がプロセスステップを実施するのに必要である様々なステップを連続的に流動する。従って、いくつかの実施形態において、活性化炭素を用いるフロースルー精製ステップは、フロースルー精製ステップの前の結合および溶出クロマトグラフィーステップ（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー捕捉ステップ）からの溶出液が、活性化炭素（セルロース媒体中に充填される）ステップ、次いで、ＡＥＸクロマトグラフィーステップ、次いで、ＣＥＸクロマトグラフィーステップ、次いで、ウイルス濾過ステップに流動する、連続様式で実施される。
【０１１１】
用語「スタティックミキサー」とは、２つの流体材料、典型的には、液体を混合するためのデバイスを指す。このデバイスは、一般的には、円筒状（管状）の筺体中に含まれるミキサーエレメント（非移動性エレメントとも呼ばれる）からなる。流れがスタティックミキサーを移動する時に、非移動性エレメントが材料を連続的に混合する。完全な混合は、流体の特性、管の内径、ミキサーエレメントの数およびそれらの設計などの多くの変数に依存する。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、１または複数のスタティックミキサーが、例えば、ＡＥＸクロマトグラフィーステップとＣＥＸクロマトグラフィーステップとの間に、本明細書に記載のプロセスにおいて用いられる。
【０１１２】
本発明を、限定と解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに例示する。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容ならびに図面は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
ＩＩ．特許請求される方法における使用のための炭素質材料の例
本発明による方法において、活性化炭素などの特定の炭素質材料が、タンパク質の精製において用いられる。活性化炭素は、非常に高い表面積を有する多孔性固体と説明することができる。いくつかの実施形態において、活性化炭素は、活性炭を含む。活性化炭素は、限定されるものではないが、石炭、木材、堅果殻および泥炭などの様々な起源から誘導することができる。活性化炭素を、制御された雰囲気下での加熱を含む物理的活性化または強酸、塩基もしくは酸化剤を用いる化学的活性化によりこれらの材料から製造することができる。活性化プロセスは、不純物除去のための高い能力を活性化炭素に与える高い表面積を有する多孔性構造をもたらす。活性化プロセスを改変して、表面の酸度を制御することができる。
【０１１４】
活性化炭素は、様々な商業的起源から入手可能であり、いくつかの等級および形式で販売されている。活性化炭素のいくつかの商業的供給者としては、ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ；Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，ＴＸ，ＵＳＡ；Ｃａｌｇｏｎ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡなどの会社が挙げられる。
【０１１５】
活性化炭素の２つの主な形式は、粉末状および顆粒状である。粉末状活性化炭素は小さく、通常は直径１ｍｍ未満の粒子を含み、最も一般的には液体の精製に用いられる。顆粒状活性化炭素は、より大きい粒径、その結果としてより小さい表面積を有し、従って拡散速度がより速い気体精製における使用が好ましい。
【０１１６】
消費者用途（水、食品、飲料および医薬精製など）における活性化炭素の使用に伴う安全性に関する重要な考慮は、抽出可能な化合物の減少および制御である。飲料水および食品接触適用を意図される活性化炭素は通常、水に対する全ての間接的な添加物を包含する安全基準ＡＮＳＩ／ＮＳＦ Ｓｔａｎｄａｒｄ ６１に従って作製される。また、ＡＳＴＭ標準試験法Ｄ６３８５は、灰化による活性化炭素中の酸により抽出可能な内容物の決定を記載し、これを用いて活性化炭素からの抽出可能物質のレベルを研究および最小化することができる。
【０１１７】
様々な活性化炭素型が様々な用途のために利用可能である。例えば、ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐ．は、その許容量、表面酸度、標的分子への孔接近性および意図される用途が異なる少なくとも１２の型の粉末状活性化炭素を供給する。一般的には、不純物除去のための活性化炭素の許容量を最大化することが望ましい。
【０１１８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態において、活性化炭素はセルロース媒体中に組み込まれる。
【０１１９】
ＩＩＩ．従来のフロースルー精製プロセス
多くの従来のフロースルー精製プロセスが、目的の標的タンパク質と除去しようとする不純物との異なる表面相互作用に明確に依存する。例えば、モノクローナル抗体の従来のＡＥＸフロースルー精製は、多くの抗体の等電点が他のタンパク質および核酸よりも高く、通常は７より上であるという事実に依存する。かくして、ＡＥＸフロースルー精製プロセスは、固定相および抗体が同じ電荷を有し、かくして、抗体が表面に有意に結合することなく媒体を通過して流動することを確実にするために、精製される抗体のｐＩよりも低いｐＨで実行される。他方、多くのタンパク質性不純物、核酸および内毒素は抗体よりも低いｐＩを有し、通常は７より下であり、従って、それらはＡＥＸ媒体の表面に結合する。
【０１２０】
多くのイオン交換クロマトグラフィープロセスと同様、ＡＥＸフロースルー精製は、一般的には、溶液の伝導率に対して感受性であり、一般的には、より高い塩濃度ではあまり有効ではない。モノクローナル抗体の典型的な精製プロセスにおいて、「仕上げステップ」とも呼ばれることがあるＡＥＸフロースルー精製は、１または複数の結合および溶出クロマトグラフィーステップに続く。
【０１２１】
２つの最も一般的に用いられる定型プロセスは、以下に示される：
１）プロテインＡ捕捉→ＣＥＸ結合および溶出精製および濃縮→希釈→ＡＥＸフロースルー
２）プロテインＡ捕捉→ＡＥＸフロースルー→ＣＥＸ結合および溶出精製および濃縮。
【０１２２】
これらの一般的に用いられる定型プロセスに加えて、ＣＥＸ捕捉ならびに混合様式および無機結合および溶出樹脂（セラミックヒドロキシアパタイト、ＣＨＴなど）の使用を含む他の精製スキームが用いられることもある。一般的には、フロースルー精製の目標は、微量レベルの不純物を除去することであるが、精製の大部分は結合および溶出ステップを用いて行われる。しかしながら、最初の結合および溶出ステップの使用からフロースルー精製プロセスへのシフトは、時間、試薬ならびに運転費用を節約する非常に費用効果的な解決法であり得る。従って、本明細書に記載のプロセスは、それらがより費用効果的であり、全体の製造費用および運転費用を減少させるという点で従来のプロセスに対する実行可能な解決法を提供する。
【０１２３】
本明細書に記載のいくつかの実施形態において、フロースルー精製を連続様式で実施することができる改良されたフロースルー精製プロセスが提供される。
【０１２４】
ＩＶ．精製プロセスにおける炭素質材料の使用
上記で考察されたように、本発明は、活性化炭素を用いる新規で改良された精製プロセスを提供する。活性化炭素は、精製ステップに直接添加してもよく、その後、沈殿化もしくは濾過によりまたは活性化炭素を含有するデバイスに溶液もしくは気体を通過させることにより除去することができる。活性化炭素は好適なデバイス中に独立に充填されてもよくまたはその機械的特性、流動特性もしくは分離特性を増強する他の材料と混合されてもよい。例えば、活性化炭素は、セルロースを含有する湿式繊維媒体中に組み込まれた後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ ＣＲまたはＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能なＳｅｉｔｚ（登録商標）ＡＫＳ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａなどの使い捨てデバイスの内部に密閉され得る。別の形式の活性化炭素は、熱可塑性粉末と一緒に圧縮することにより活性化炭素が多孔性モノリス中に組み込まれた活性化炭素ブロックである。また、顆粒状形態の活性化炭素は、クロマトグラフィー媒体と同様にカラム中に充填され得るまたは好適なデバイス中に充填され得る。活性化炭素媒体が脱色、小分子不純物の除去などのために用いられることが一般的に許容される。例えば、標的化された不純物の分子量に基づいて選択することができる、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能ないくつかの等級の活性化炭素媒体が存在する。３つの分子量範囲：２００−４００、４００−１，０００および４００−１，５００Ｄａが利用可能であり、後者が最も大きい。しかしながら、市販の活性化炭素媒体はいずれも、分子量が２０００から２００，０００Ｄａの範囲の生体試料からの非常により大きい不純物の選択的除去については記載されていない。
【０１２５】
本発明は、少なくとも部分的には、活性化炭素が、同時に標的タンパク質へのごくわずかな結合を示しながら、望ましくない不純物（例えば、ＨＣＰおよびＤＮＡ）に選択的に結合することができるという驚くべき発見に基づくものである。
【０１２６】
本発明はまた、あらゆる吸着材料と同様、活性化炭素の吸着能力が無制限であるという事実も認識する。例えば、ＣＨＯ−Ｓ供給液の場合、活性化炭素は、ＨＣＰとＤＮＡの両方の種が実施例１に示される代表的な供給液中で観察される濃度で存在する場合、それらを効率的に除去することを示した。しかしながら、異常に高レベルでのＤＮＡの添加は、実施例２に示されるように活性化炭素のＨＣＰ除去効率を抑制することがわかった。
【０１２７】
活性化炭素はまた、標的タンパク質捕捉ステップの前および後の両方に、標的タンパク質の溶液中に存在し得る細胞培養培地の潜在的な成分を除去するのに高度に有益であり得る。細胞培養培地の典型的な成分としては、界面活性剤（たとえば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）、インスリン、抗生物質、メトトレキサートおよび消泡剤が挙げられる。これらの成分のいくつかが精製された標的タンパク質中に持ち越される危険のため、これらの成分を除去することができるステップをタンパク質精製トレイン中に組み込むのが有利である。本明細書の実施例によりさらに証明されるように、活性化炭素を精製プロセスにおいて用いて、そのような成分を除去することができる。
【０１２８】
以下は、下記の表Ｉにおいて下線により示される、１または複数の中間ステップとして活性化炭素を組み込むタンパク質精製プロセスの例である。これらのプロセスの多くの変形を用いることができることが理解される。
【０１２９】
【表１】

【０１３０】
一般的に、上記の表において、アフィニティ媒体を用いる結合および溶出ならびに／またはＣＥＸ媒体を用いる結合および溶出のステップは、３つの様式のいずれかで運転され得る：（１）媒体を標的タンパク質と共にロードし、ロードを停止し、媒体を洗浄し溶出させ、プールを収集するバッチ様式；（２）負荷を連続的に実施するが、溶出は間欠的である半連続様式（例えば、連続多カラムクロマトグラフィーの場合）；および（３）負荷と溶出の両方を連続的に実施する完全連続様式。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、上記の表に記載の１または複数のプロセス、ウイルス不活化ステップを、本明細書に記載のように、結合および溶出ステップの後および溶出液をフロースルー精製ステップにかける前に実施することができる。
【０１３２】
本明細書および上記の表に記載のプロセスは、追加のステップならびに溶液条件をインラインでまたはサージタンクにより変化させるステップをさらに用いてもよいことが理解される。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、プロセスは以下のステップを含む：清澄化；プロテインＡアフィニティ媒体を用いる結合および溶出；インラインのウイルス不活化；以下のようなフロースルー精製：活性化炭素、次いで、フロースルーＡＥＸ媒体、次いで、インラインスタティックミキサーおよび／またはサージタンクを用いる溶液交換、次いで、フロースルーＣＥＸ媒体、次いで、ウイルス濾過；ならびに製剤化。
【０１３３】
Ｖ．１または複数の不純物のレベルを低下させるためのアッセイ
本発明は、目的のタンパク質を含有する試料中に存在する１または複数の不純物のレベルを低下させるプロセスを提供する。生物学的起源から誘導されるタンパク質試料中に含まれる典型的な不純物としては、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および核酸（ＤＮＡ）が挙げられる。宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である場合、ＨＣＰはＣＨＯ ＨＣＰまたはＣＨＯＰと一般的に呼ばれる。ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡなどのＨＣＰに対する抗体を用いる免疫学的方法が、そのような不純物の検出に従来用いられている。マイクロタイタープレート酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）も、高感度の分析を提供するために日常的に用いられる。そのようなアッセイは使用が簡単であり、客観的であり、精製プロセス中に１または複数の不純物のレベルを測定するための強力な道具である。
【０１３４】
ＨＣＰを測定するためのいくつかのＥＬＩＳＡキットが、例えば、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡなどの業者から市販されている。そのようなキットのいくつかは、それらが、用いられた精製プロセスとは無関係に生成物を汚染し得る本質的に全てのＨＣＰと反応することを意図されるという意味で「包括的」である。いくつかの実施形態において、市販のキットを、試料中の１または複数の不純物のレベルを検出するのに用いることができる。
【０１３５】
本発明を、限定と解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに例示する。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容ならびに図面は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３６】
［実施例１］
フロースルー様式における不純物除去のための様々な材料の評価
本実験において、清澄化されたＣＨＯ供給液から不純物を除去する能力について、異なる材料が評価された。表ＩＩに示される材料が、フロースルー様式における不純物除去のために試験された。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４）が平衡化バッファーおよび洗浄バッファーとして用いられた。
【０１３７】
【表２】

【０１３８】
重力フロースルー（ＦＴ）試験法を用いて、樹脂不純物除去を試験した。表ＩＩに列挙されたそれぞれの材料の１ｍｌをとり、５ｍｌの使い捨てクロマトグラフィーカラム（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＡ，ＣＡ）中に充填した。カラムを５カラム容量（ＣＶ）の平衡化バッファー（ＰＢＳ）で平衡化させ、２０ＣＶの供給液をロードし、５ＣＶの洗浄バッファー（ＰＢＳ）で再度洗浄した。フロースルー溶出液画分を収集した。ポリクローナルＩｇＧ（約２．６ｍｇ／ｍｌ、ＳｅｒａＣａｒｅ）を添加した未処理の清澄化されたヌルＣＨＯ−Ｓ供給液を用いた。
【０１３９】
フロースルー溶出液および対応する供給液を、ＩｇＧ収率、ＵＶ活性種（２８０ｎｍ）除去、ＨＣＰ除去およびＤＮＡ除去について試験した。ＩｇＧ収率を、業者の説明書に従ってＰｏｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ２．１ｍｍ Ｘ ３０ｍｍ分析カラム（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で定量した。２８０ｎｍでのＵＶ活性種を、プロテインＡクロマトグラム上のフロースルーピークとして示された非保持種のピーク面積を用いて定量した。宿主細胞タンパク質を、ＣＨＯ−ＣＭ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット（ＣＹＧＮＵＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）を用いて検出した。ＤＮＡを、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて検出した。全てのアッセイを、製造業者のプロトコールに従って行った。その結果を図１−４に示す。
【０１４０】
図１に示されるように、約５％のＩｇＧ収率損失を示すＨＩＣ樹脂以外のスクリーニングした全ての他の媒体、すなわち、活性化炭素、ＳＰＦＦ、ＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳおよびＱＦＦは、検出可能な収率損失を示さなかった。
【０１４１】
さらに、図２、３および４に示されるように、活性化炭素は２８０ｎｍでのＵＶ活性種のレベルの有意な低下をもたらした。これは、ｐＨ指示剤、ＨＣＰのいくらかの集団、ＤＮＡおよびいくらかの残留細胞培養成分を含む。ポリクローナルＩｇＧを用いた場合、この画分は、プロテインＡが結合しないＩｇＧ ３の集団も含む。活性化炭素などの、全ての材料はある程度までＨＣＰを除去するようであったが、陽イオン交換官能基を有する２つの材料、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗおよびＰｒｏＲｅｓ（商標）−ＳはほとんどのＨＣＰを除去した。ＤＮＡ除去に関してと同様、陰イオン交換樹脂、Ｑ ＦａｓｔＦｌｏｗによる有意なＤＮＡ除去がわかったことは驚くべきことではなかったが、活性化炭素が同様の能力でＤＮＡを除去することがわかったことは予想外であった。他の全ての材料はＤＮＡをより少ない程度で除去した。
【０１４２】
本実施例から得られたデータは、活性化炭素、ならびに陽イオン交換、陰イオン交換および疎水性相互作用官能基を有する材料が、ＣＨＯ供給液からのフロースルー様式における収率を有意に損失することなく様々な程度で不純物（ＨＣＰ、ＤＮＡおよびＵＶ活性種）を除去することができることを示している。
【０１４３】
［実施例２］
フロースルー不純物除去能力
代表的な実験において、単位容量あたりの異なる材料により除去される不純物の量を評価した。ＤＮＡとＨＣＰとの吸着競合の効果を理解するために、ＣＨＯ−Ｓ供給液中のＤＮＡのレベルを、市販のニシン精子ＤＮＡの添加により増加させた。不純物除去のために評価された材料を、以下の表ＩＩＩに列挙する。
【０１４４】
【表３】

【０１４５】
表ＩＩＩに列挙された材料の各々（１ｍｌ）を、Ｏｍｎｉｆｉｔカラム（内径０．６６ｃｍ）に充填した。カラムを５ＣＶのＰＢＳを用いて平衡化させ、ポリクローナルＩｇＧおよびニシン精子ＤＮＡを添加した１００ＣＶのヌル未処理清澄化ＣＨＯ−Ｓ供給液をロードし、ＢｉｏＣａｄ（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）上、２０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。負荷ステップ中のフロースルー溶出液画分を、１０カラム容量毎に収集した。フロースルー溶出液画分および対応する供給液を、実施例１に記載のものと同じ方法を用いて、ＩｇＧ収率、ＵＶ活性種、ＨＣＰおよびＤＮＡ除去についてアッセイした。
【０１４６】
図５に示されるように、スクリーニングした全ての材料は、供給液の１００カラム容量の負荷にわたってＩｇＧ収率の有意な損失を示さなかった。図６に示されるように、活性化炭素は、１００ＣＶを通じて多くのＵＶ活性種を除去した。陰イオン交換材料も、１００ＣＶを通じてある程度までＵＶ活性種を除去した。さらに、図７に示されるように、陰イオン交換樹脂、Ｑ ＦａｓｔＦｌｏｗによるＨＣＰ除去能力は、それが初期画分から漏出するため、限られていた。しかしながら、陽イオン交換材料、Ｑ ＦａｓｔＦｌｏｗおよびＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓは、１００カラム容量を通じて有意な量のＨＣＰを除去した。この特定の実験において高いＤＮＡ濃度（すなわち、さらなる１９５μｇ／ｍＬ）を用いた場合、活性化炭素はＤＮＡを添加していない供給液と比較して少ないＨＣＰを除去した。例えば、ＤＮＡを添加していない元のヌルＣＨＯ−Ｓ供給液を用いる同様の実験において、活性化炭素は、１００ＣＶを通じて２０％に近いＨＣＰを除去した（データは示さない）。これは、活性化炭素への吸着に関するＤＮＡとＨＣＰとのある程度の競合を示していた。さらに、図８に示されるように、全ての材料はある程度までＤＮＡを除去した。
【０１４７】
本実施例から得られたデータは、活性化炭素ならびに陽イオン交換、陰イオン交換および疎水性相互作用官能基を有する材料が、ＣＨＯ細胞供給液からのフロースルー様式における収率を有意に損失させることなく、１００カラム容量にわたって様々な程度で不純物（ＨＣＰ、ＤＮＡおよびＵＶ活性種）を除去することができることを示している。
【０１４８】
［実施例３］
不純物除去に対する様々な材料の組合せの効果
別の実験において、図９に記載のワークフローに示される材料の様々な組合せが、不純物除去について評価された。材料（１ｍｌ）を安定化させ、５ｍｌの使い捨てクロマトグラフィーカラム中に充填した。カラムを５ＣＶのＰＢＳで平衡化させ、２０ＣＶの供給液をロードし、５ＣＶのＰＢＳで洗浄した。
【０１４９】
フロースルー溶出液画分を、選択された媒体の次の使い捨てカラム上にさらにロードした（図９の左側に記載の２つのワークフローに示されている）。ワークフロー中の最後のフロースルー溶出液を分析した。供給液が媒体の混合物を通過した右側に記載のワークフローの場合、溶出液を直接分析した。供給液は、ＳｅｒａＣａｒｅから入手したポリクローナルＩｇＧ（約２．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した非発現ＣＨＯ−Ｓ供給液を用いて調製された。フロースルー溶出液画分および対応する供給液を、実施例１に上記されたのと同じ方法を用いて、ＩｇＧ収率、ＵＶ活性種、ＨＣＰおよびＤＮＡ除去についてアッセイした。結果を図１０−１２に示す。
【０１５０】
図１０に示されるように、活性化炭素および活性化炭素を含有する混合物は、ＵＶ活性種のレベルを有意に低下させた。さらに、全ての材料がある程度までＨＣＰ除去を示したが、陽イオン樹脂と組合せた活性化炭素混合物が図１１に示されるようにＨＣＰの最も効果的な除去を示した。また、図１２に示されるように、全ての材料がある程度までＤＮＡを除去したが、活性化炭素と陰イオン交換樹脂との組合せがＤＮＡの最も効率的な除去を示した。
【０１５１】
本実施例から得られたデータは、活性化炭素と、陽イオン交換、陰イオン交換および疎水性相互作用官能基を有する材料との組合せが、ＣＨＯ供給液からフロースルー様式において任意の単一成分よりも効率的に不純物（ＨＣＰ、ＤＮＡおよびＵＶ活性種）を除去することができることを示している。
【０１５２】
［実施例４］
プロテインＡ溶出プールの不純物除去
別の実験において、標準的な重力フロースルー試験法を用いて、プロテインＡプール後の不純物除去を調査した。実施例１においてスクリーニングされた材料、すなわち、活性化炭素、陽イオン交換樹脂（ＳＰ ＦＦおよびＰｒｏＲｅｓ（商標）−Ｓ）、陰イオン交換樹脂、Ｑ ＦＦおよびＨＩＣ樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ ＦａｓｔＦｌｏｗならびにこれらの材料の様々な組合せを評価した。活性化炭素または樹脂材料（１ｍｌ）を安定化させ、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎから入手した使い捨てクロマトグラフィーカラム中に充填した。それぞれのカラムを５ＣＶのＰＢＳで平衡化させ、２０ＣＶの供給液をロードし、５ＣＶのＰＢＳで洗浄した。負荷ステップ中のフロースルー溶出液画分を収集した。用いた供給液は、ｐＨを７．０に調整した後のプロテインＡ（ＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ）溶出プール（約３．２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ）であった。プロテインＡカラムのための供給液は、ポリクローナルＩｇＧと混合した非発現ＣＨＯ−Ｓであった。
【０１５３】
フロースルー溶出液画分およびプロテインＡ溶出プールを、ＩｇＧ収率、ＵＶ活性種除去、ＨＣＰ除去およびＤＮＡ除去について評価した。全てのアッセイは、ＨＣＰの場合にＣＨＯ−３Ｇ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット（ＣＹＧＮＵＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）を用いた点以外は、実施例１に記載のように実施された。
【０１５４】
図１３に示されるように、スクリーニングした全ての材料は、約８５％以上の収率を生成した。活性化炭素、陽イオン交換樹脂、ＳＰ ＦａｓｔＦｌｏｗが、単一の材料としてほとんどのＨＣＰを除去した。様々な材料の混合物が、図１４に示されるように、最も高いＨＣＰ除去を提供した。図１５は、全ての材料が、部分的に供給液中の低いレベルのため、有意な量のＤＮＡを除去するという事実を示す。全体として、材料の混合物は、一般的に、単一の材料と比較して不純物除去においてより効果的であった。
【０１５５】
本実施例から得られたデータは、活性化炭素ならびに陽イオン交換、陰イオン交換および疎水性相互作用官能基を有する材料、ならびにこれらの材料の混合物が、ＣＨＯ供給液から生成されたプロテインＡ溶出プールからフロースルー様式において様々な程度で不純物（ＨＣＰ、ＤＮＡおよびＵＶ活性種）を除去することができることを示している。
【０１５６】
［実施例５］
ＭＡｂの精製に関する活性化炭素の性能を評価するための代表的なアフィニティに基づく（プロテインＡ）捕捉されたＭＡｂ供給液の調製
ＭＡｂＩと呼ばれる部分精製されたモノクローナル抗体を、タンパク質を精製するための活性化炭素の性能を評価するための代表的なアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体供給液として使用するためにＣＨＯ細胞系培養液を用いて産生させた。まず、細胞培養液を、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ^＋（登録商標）ＰＯＤフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）として入手可能な、深層濾過媒体を用いてバイオリアクターから直接清澄化した。細胞培養液を、一連の２つのフィルター、Ｄ０ＨＣおよびＸ０ＨＣを通して１０ ＮＴＵ未満の最終濁度まで濾過した後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣカプセルフィルターを用いて滅菌濾過した。
【０１５７】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡから入手したアクリル系のＱｕｉｃｋ−Ｓｃａｌｅ（登録商標）内径１４ｃｍのカラムに、約３．２Ｌのベッド容量までＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ媒体を充填した。ＰＢＳを用いる流動充填と、振動との組合せを用いて、カラムを充填した。全てのクロマログラフィーステップは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｋ−Ｐｒｉｍｅ ４０−Ｉシステム上で実施され、検出は２８０ｎｍの波長でのＵＶ吸収を用いて実施された。カラムをＭＡｂ Ｉ精製のために少なくとも５サイクルにわたって使用し、４℃でＰＢＳ中で保存した。カラムを使用する前に、カラムを、少なくとも２カラム容量（ＣＶ）の０．１５Ｍリン酸ｐＨ １．５−１．７を用いてフラッシュした後、ｐＨが安定化されるまでＰＢＳを用いて平衡化させた（少なくとも３ＣＶ）。典型的には、清澄化させた次の日、滅菌濾過された清澄化された細胞培養液を、少なくとも５分の滞留時間で（すなわち、５００−６００ｍＬ／ｍｉｎの流速で）プロテインＡカラム上にロードした。１リットルの媒体あたり３０ｇのＭＡｂ Ｉと定義されたカラムの最大許容量を超えないことを確保するようにカラムにロードした。
【０１５８】
カラムの負荷の後、カラムを、微量のＵＶが基線に到達するまで、典型的には、３ＣＶ以内で、同じ滞留時間でＰＢＳを用いてフラッシュした。次いで、カラムを、ｐＨ ６の０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて、少なくとも３ＣＶだが５ＣＶを超えない量で洗浄した。次いで、生成物を２０ｍＭの酢酸ｐＨ ３．０への段階的変化を用いて溶出させ、溶出ピークの捕捉を手動で実施して、溶出ピークの希釈率を減少させた。溶出液を静置して室温（２０−２５℃）で少なくとも３０分間から最大で１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、溶出プールのｐＨを、ｐＨ １０以上の２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いてｐＨ ５±０．２に滴定した。溶出プールの出発ｐＨは、典型的には、ｐＨ ４．０近辺であり、Ｔｒｉｓ塩基溶液の５％容量未満の添加が必要であった。溶出プールの滴定の間、可視的沈殿物が観察された。沈殿物の除去を、溶出プールの滅菌濾過の前にＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ^＋（登録商標）Ｘ０ＨＣ ｌａｂ ｓｃａｌｅ ＰＯＤを用いて沈殿物の除去を行ったが、溶出プール全体の沈殿物を清澄化するには少なくとも２個の０．０２７ｍ^２のＰＯＤが必要であった。深層濾過の後、溶出液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを用いて滅菌濾過し、用いるまで４℃で保存した。
【０１５９】
［実施例６］
ＭＡｂの精製に関する活性化炭素の性能を評価するための代表的な非アフィニティに基づく（陽イオン交換）捕捉されたＭＡｂ供給液の調製
ＭＡｂ Ｉと呼ばれる、部分精製されたモノクローナル抗体を、タンパク質を精製するための活性化炭素の性能を評価するための代表的な非アフィニティ（陽イオン交換）捕捉モノクローナル抗体供給液として使用するためにＣＨＯ細胞系培養液を用いて産生させた。ＭＡｂ Ｉ清澄化された細胞培養液を、実施例５で考察されたように作製した。細胞培養液を一連の２つのフィルター、Ｄ０ＨＣおよびＸ０ＨＣを通して１０ ＮＴＵ未満の最終濁度まで濾過した後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＳＨＣカプセルフィルターを用いて滅菌濾過した。
【０１６０】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡから入手した内径２２ｃｍのガラス製Ｖａｎｔａｇｅ（登録商標）実験室カラムに、陽イオン交換（ＣＥＸ）媒体Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ_３⁻（Ｍ）を充填した。カラムを、ＰＢＳを用いて、約１０００ｃｍ／ｈの空塔速度でＡｋｔａ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で充填した。充填およびその後の全てのカラム泳動中に、カラムにわたる圧力低下を３ｂａｒより下に維持した。カラムのベッド圧縮率は約１５％であり、充填されたベッド容量は７５ｍＬであった。カラムの充填効率を、泳動バッファーとしてＰＢＳを用いて、１００ｃｍ／ｈの空塔速度で、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌ、３％（ｖ／ｖ）アセトンｐＨ６．９の５００μＬのパルス注入を用いて測定した。システムの死容積を計上した後標準的な方法を用いるアセトンピークを用いて理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を算出し、１．３のピーク非対称を有する０．０５３ｃｍと算出され、これはカラムが十分に充填されたことを示唆している。ＮａＣｌのピークは、より大きいレベルのピークテイリングを示したが、これは塩イオンと媒体との相互作用と関連する可能性があり、カラム効率の代表ではない。
【０１６１】
カラムの初回使用の前に、タンパク質ロードを用いずに完全なブランク泳動を実施して、ベース媒体との任意の溶液関連相互作用を減少させおよび／または排除した。負荷の前に、カラムを少なくとも５ＣＶにわたって２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ５を用いて平衡化させた。氷酢酸を用いてｐＨ ５まで低下させたｐＨを有するＭＡｂ Ｉを含有する清澄化された細胞培養液をカラムにロードした。細胞培養液のｐＨを低下させた時、沈殿物がしばしば観察され、これを、遠心分離と、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ^＋（登録商標）Ｘ０ＨＣ ｌａｂ ｓｃａｌｅ ＰＯＤを用いる深層濾過との組合せを用いて除去した。
【０１６２】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを用いて、負荷の前に負荷溶液を滅菌濾過した。滅菌濾過されたロードを、カラムにわたる圧力低下を最小化しながら、カラム許容量（約４５ｇのＭＡｂ Ｉ／Ｌ媒体）を最大化するために、１０ｍｉｎの滞留時間を用いてカラム上にロードした。負荷の後、カラムを５ＣＶにわたって平衡化バッファーを用いてフラッシュした。次いで、カラムを、５ＣＶにわたって２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ５．０バッファーを用いて洗浄した。カラムからの溶出を、少なくとも５ＣＶにわたって、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ６．０への段階的変化を用いて実施した。溶出液を分画し、ピーク画分をプールし、さらなる使用のために４℃で保存した。次いで、カラムを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ６．０を用いて洗浄して、強く結合したタンパク質を除去したが、これらの多くは宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であると決定された。次いで、カラムを、３０分の滞留時間に相当するより遅い流速で５ＣＶにわたって０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて洗浄した。次いで、カラムを、５ＣＶの平衡化バッファーで洗浄し、さらなる使用のために室温（２０−２５℃）で保存した。
【０１６３】
［実施例７］
アフィニティ捕捉されたＭＡｂ溶出液のフロースルー処理による様々な吸着剤の評価
活性化炭素がタンパク質溶液からの不純物の除去にとって、予想外に非常に効果的であることを証明するために、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液の精製のための陰イオン交換（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））、陽イオン交換（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ、ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ）および疎水性相互作用（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ、ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ）化合物などのタンパク質の精製に一般的に用いられているいくつかの異なる市販の吸着媒体と活性化炭素をフロースルー適用において比較した。
【０１６４】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液をＴｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０１６５】
Ｎｕｃｈａｒ ＨＤおよびＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素は、本明細書で互換的に用いられ、ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡから得られた粉末状活性化炭素の等級を指す。Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、１ｍＬの充填カラム容量を得た。０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜デバイスを、様々なサイズのデバイス中、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能な、ポリアリルアミンで改変された０．６５μｍ定格ポリエチレン膜を用いて製造した。この膜を２５ｍｍのディスクに切断した；５枚のディスクを積み重ね、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＯｐｔｉＳｃａｌｅ ２５使い捨てカプセルフィルターデバイスと同じ型の外側被覆ポリプロピレンデバイス中に密封した。このデバイスは、気泡形成を防止するための換気口を含み、３．５ｃｍ^２の有効濾過面積および０．２ｍＬの容量を有する。
【０１６６】
１ｍＬの予め充填されたクロマログラフィーカラムＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ、ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）およびＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡから購入し、使用前にバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。６つのフロースルー精製トレインを組立てた：ａ）活性化炭素、ｂ）ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ、ｃ）ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ、ｄ）ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ、ｅ）ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦおよびｆ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ。続いて、９６ｍＬのＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で各組立物に通過させた。精製トレインを通過させた後、溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＩｇＧ濃度および残留プロテインＡについて分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。プロテインＡ分析を、Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｏ，ＭＥ，ＵＳＡ、Ｋｉｔ Ｃ０Ｚ５１−１８８からの市販のＥＬＩＳＡキットを用いて実施した。結果を表ＩＶにまとめる。
【０１６７】
結果は、活性化炭素が、０．８７の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で最も多い量の不純物を除去したことを示している。活性化炭素に関するＨＣＰ値のＬＲＶは、０．１９から０．３５の範囲のＨＣＰのＬＲＶを有する試験した市販の媒体（陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用）と比較して有意により高かった。アフィニティ捕捉ステップからの残留プロテインＡも、活性化炭素により検出限界以下に効率的に除去された。有意な量の残留プロテインＡを除去することが観察された唯一の市販の媒体は、陰イオン交換媒体（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））であったが、これも残留プロテインＡの濃度を検出限界以下に低下させた。活性化炭素により除去された不純物の量がより高いにも拘わらず、それは依然としてモノクローナル抗体生成物（ＭＡｂ Ｉ）の優れた回収率（９６％）を有し、これは試験した市販の媒体について観察された生成物回収率（８２−１００％）と類似していた。
【０１６８】
【表４】

【０１６９】
［実施例８］
活性化炭素および／または陰イオン交換媒体を用いるＭＡＢのアフィニティ捕捉溶出液の静的ソーク（ｓｔａｔｉｃ ｓｏａｋ）処理
活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素を、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去について試験して、不純物の除去のための予想外に非常に効果的な方法を証明した。
【０１７０】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液をＴｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０１７１】
Ｎｕｃｈａｒ ＲＧＣおよびＲＧＣ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素は、本明細書で互換的に用いられ、ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡから得られた粉末状活性化炭素の等級を指す。代表的な実験において、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）膜の直径７ｍｍの環状部分（５μＬ）および／または１０ｍｇのＲＧＣ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７と共に１．５ｍＬの遠心チューブに添加して、吸着剤媒体を平衡化させた。チューブを遠心分離し、上清の平衡化バッファーを除去した。続いて、１ｍＬ容量のＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、平衡化された吸着剤を含有する１．５ｍＬの遠心チューブに添加した。吸着剤媒体および溶出液を、緩やかな撹拌下、室温で１８時間相互作用させた。次いで、チューブを遠心分離にかけ、上清溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。
【０１７２】
ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。１つのそのような実験の結果を表Ｖにまとめる。
【０１７３】
結果は、活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素が、モノクローナル抗体溶液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。活性化炭素および陰イオン交換媒体（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ）の組合せは、１．４３の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で最も多い量の不純物を除去した。個々の活性化炭素および陰イオン交換媒体は、それぞれ、１．２１および０．３６のＨＣＰのＬＲＶを有していた。活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素は両方とも、それぞれ９５％および９５％のモノクローナル抗体生成物の優れた回収率を有していた。
【０１７４】
【表５】

【０１７５】
［実施例９］
活性化炭素および／または陰イオン交換媒体を用いるＭＡｂのアフィニティ捕捉溶出液の静的ソーク処理
活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素を、ＭＡｂ Ｉとは異なるモノクローナル抗体（ＭＡｂ ＩＩと呼ぶ）を含有するアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去について試験して、活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素が、様々な異なるモノクローナル抗体の精製に適用することができる予想外に非常に効果的な方法を提供することを証明した。
【０１７６】
第２の部分精製されたＭＡｂ ＩＩアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ ＩＩの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０１７７】
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）膜の直径７ｍｍの環状部分（５μＬ）および／または１０ｍｇのＲＧＣ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７と共に１．５ｍＬの遠心チューブに添加して、吸着剤媒体を平衡化させた。チューブを遠心分離し、上清の平衡化バッファーを除去した。続いて、１ｍＬ容量のｐＨ調整されたＭＡｂ ＩＩプロテインＡ溶出液を、平衡化された吸着剤を含有する１．５ｍＬの遠心チューブに添加した。吸着剤媒体および溶出液を、緩やかな撹拌下、室温で１８時間相互作用させた。次いで、チューブを遠心分離にかけ、上清溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＶＩにまとめる。
【０１７８】
結果は、活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素が、第２の型のモノクローナル抗体を含有する溶液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。活性化炭素と陰イオン交換媒体（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））との組合せは、１．７８の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で最も多い量の不純物を除去した。個々の活性化炭素および陰イオン交換媒体は、それぞれ、１．０８および０．６４のＨＣＰのＬＲＶを有していた。活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素は両方とも、それぞれ８７％および８５％のモノクローナル抗体生成物の良好な回収率を有していた。
【０１７９】
【表６】

【０１８０】
［実施例１０］
活性化炭素および／または陰イオン交換媒体を用いるＭＡｂ Ｉの非アフィニティ捕捉溶出液の静的ソーク処理
活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素を、非アフィニティ（陽イオン交換）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去について試験して、活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素が、不純物の除去のための予想外に非常に効果的な方法を提供することを証明した。アフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液と比較して、非アフィニティ（陽イオン交換）捕捉溶出液は、有意により高いレベルの異なる型の不純物を含有する。非アフィニティ捕捉溶出液の精製のための活性化炭素の適用は、この方法が一般的であり、様々なタンパク質溶出液の精製に適用することができることを示している。
【０１８１】
別の実験において、部分精製されたＭＡｂ Ｉ ＣＥＸ溶出液を実施例６に記載のように調製した。溶出液を、バッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）で４倍希釈した後、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ Ｉ ＣＥＸ溶出液と呼ばれる。
【０１８２】
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜の２つの直径１０ｍｍの環状部分（１９．６μＬ）および／または２０ｍｇのＲＧＣ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７と共に１．５ｍＬの遠心チューブに添加して、吸着剤媒体を平衡化させた。チューブを遠心分離し、上清の平衡化バッファーを除去した。続いて、１ｍＬ容量のＭＡｂ Ｉ ＣＥＸ溶出液を、平衡化された吸着剤を含有する１．５ｍＬの遠心チューブに添加した。吸着剤媒体および溶出液を、緩やかな撹拌下、室温で１８時間相互作用させた。次いで、チューブを遠心分離にかけ、上清溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＶＩＩにまとめる。
【０１８３】
結果は、活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素が、非アフィニティ（陽イオン交換）クロマトグラフィーを用いて細胞培養液から捕捉されたモノクローナル抗体溶液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。非アフィニティ（陽イオン交換）に基づく捕捉媒体は、より特異的なアフィニティ（プロテインＡ）に基づく捕捉媒体よりも、モノクローナル抗体と共により多くの不純物に結合する。従って、非アフィニティ捕捉溶出液は、有意により高いレベルの異なる型の不純物を含有する。活性化炭素と陰イオン交換膜（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））との組合せは、１．４５の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で最も多い量の不純物を除去した。個々の活性化炭素および陰イオン交換媒体は、それぞれ、１．２０および０．５５のＨＣＰのＬＲＶを有していた。活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素は両方とも、それぞれ９５％および７４％のモノクローナル抗体生成物の良好な回収率を有していた。
【０１８４】
【表７】

【０１８５】
［実施例１１］
様々なｐＨ値での活性化炭素を用いるＭＡｂ Ｉのアフィニティ捕捉溶出液の静的ソーク処理
活性化炭素を、様々な溶液ｐＨのアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去について試験して、活性化炭素が様々な溶液条件にわたって効果的であることを証明した。
【０１８６】
別の実験において、部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０１８７】
ＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液（２０ｍＬ）のｐＨを、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）または酢酸（３Ｍ）の添加により５、６、７または８に調整した。続いて、得られたｐＨ調整されたＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）０．２２μｍ膜を用いて滅菌濾過して、任意の混濁物を除去した。次いで、ＲＧＣ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素（１０ｍｇ）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７と共に１．５ｍＬの遠心チューブに添加して、活性化炭素を平衡化させた。チューブを遠心分離し、上清の平衡化バッファーを除去した。続いて、１ｍＬのｐＨ調整されたＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液をチューブに添加した。吸着剤媒体および溶出液を、緩やかな撹拌下、室温で１８時間相互作用させた。次いで、チューブを遠心分離にかけ、０．５ｍＬの上清を除去し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＶＩＩＩにまとめる。
【０１８８】
結果は、活性化炭素が、幅広いｐＨ範囲にわたってモノクローナル抗体溶液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は、ＨＣＰの１．２７から１．３０の範囲のＬＲＶであり、ｐＨ ６、ｐＨ ７およびｐＨ ８について非常に類似していた。活性化炭素はｐＨ ５でも依然として選択的不純物除去を提供したが、ＨＣＰのＬＲＶは０．７０に低下した。活性化炭素は、試験した全てのｐＨ条件について、９０％から９５％の範囲のモノクローナル抗体生成物の優れた回収率を有していた。
【０１８９】
【表８】

【０１９０】
［実施例１２］
活性化炭素および／または陰イオン交換媒体を用いるＭＡｂ Ｉのアフィニティ捕捉溶出液のフロースルー処理
活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素を、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去についてフロースルー適用において試験して、活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素が、タンパク質の大規模精製に一般的に用いられるフロースルー条件下での不純物の除去のための予想外に非常に効果的な方法を提供することを証明した。
【０１９１】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０１９２】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、１ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムをバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。実施例７に上記されたように組立てられた０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイスも、バッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。続いて、３つの精製トレインを組立てた。１番目はＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイスからなり、２番目は活性化炭素カラムからなり、３番目は活性化炭素カラム、次いで、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイスからなる。１００ｍＬのＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で各組立物に通過させた。１０個の１０ｍＬの溶出液画分を収集した。１０個全ての画分ならびに選択された個々の画分のプールされた試料を、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＩＸにまとめる。
【０１９３】
図１６に示され、表ＩＸにまとめられた通り、結果は、活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素を用いるアフィニティ捕捉溶出液のフロースルー処理が、モノクローナル抗体溶液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。活性化炭素と陰イオン交換膜（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ）との組合せは、１．９５の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で最も多い量の不純物を除去した。個々の活性化炭素および陰イオン交換媒体は、それぞれ０．９６および０．２３のＨＣＰのＬＲＶを有していた。活性化炭素のみおよび陰イオン交換媒体と組合せた活性化炭素は両方とも、それぞれ９６％および９８％の範囲のモノクローナル抗体生成物の優れた回収率を有していた。
【０１９４】
【表９】

【０１９５】
［実施例１３］
様々な陰イオン交換媒体のみを用いるまたは活性化炭素を用いる処理後のＭＡｂ Ｉのアフィニティ捕捉溶出液のフロースルー処理
活性化炭素を、単独でおよび様々な市販の陰イオン交換媒体と組合せて、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去に関して試験して、活性化炭素を様々な陰イオン交換媒体と組合せることができることを証明した。試験した市販の陰イオン交換媒体は、第一級アミン（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ）および第四級アミン（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ）を含んでいた。膜（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ）および樹脂（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ）上に支持された市販の陰イオン交換化合物を試験した。
【０１９６】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０１９７】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、１ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムをバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。３層の０．２６ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜デバイスを、市販のＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜ディスク（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）（０．２６ｍＬ、３シート）およびデバイス筐体ならびに実施例７に上記されたように組立てられた０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイスを作成するのに用いられたプロセスを用いて製造した。Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜を用いた０．１８ｍＬのＡｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）Ｕｎｉｔｓを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡから購入した。これらのデバイスを、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ予備充填カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）および０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイスと共に、バッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。
【０１９８】
９つのフロースルー精製トレインを組立てた：ａ）活性化炭素、ｂ）ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ、ｃ）活性化炭素、次いで、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ、ｄ）Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、ｅ）活性化炭素、次いで、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、ｆ）Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、ｇ）活性化炭素、次いで、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、ｈ）ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ、ｉ）活性化炭素、次いで、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ。続いて、９６ｍＬのＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で各組立物に通過させた。精製トレインを通過させた後、溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表Ｘにまとめる。
【０１９９】
結果は、活性化炭素と様々な陰イオン交換媒体との組合せを用いるアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液のフロースルー処理が、不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は、活性化炭素のみについて０．９１であった。様々な市販の陰イオン交換媒体のみが、０．１７から０．２３の範囲の非常に類似したＨＣＰのＬＲＶを有していた。活性化炭素、次いで、様々な市販の陰イオン交換媒体の組合せは、１．７０から１．９０の範囲の非常により高いＨＣＰのＬＲＶを有していた。活性化炭素、次いで、様々な陰イオン交換媒体の組合せは、９６％から９７％の範囲のモノクローナル抗体生成物の優れた回収率を有していた。このデータは、活性化炭素が、第一級アミン（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））および第四級アミン（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ）などの様々な市販の陰イオン交換媒体と共に抗体の精製に関して予想外に効果的であることを示している。活性化炭素の組合せは、膜（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ）および樹脂（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ）上に支持された市販の陰イオン交換化合物と共に高度に効果的であった。
【０２００】
【表１０】

【０２０１】
［実施例１４］
活性化炭素、次いで、陰イオン交換媒体を用いるまたは陰イオン交換媒体、次いで、活性化炭素を用いるＭＡｂ Ｉのアフィニティ捕捉溶出液のフロースルー処理
アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物のフロースルー除去に関して活性化炭素および陰イオン交換媒体の順序を試験して、２つの吸着剤の順序がその有効性に予想外に影響することを証明した。この実験は、陰イオン交換媒体の前の活性化炭素の配置が、タンパク質溶液から不純物を除去する吸着剤の組合せの能力を最大化するのに重要であることを例示するものである。
【０２０２】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０２０３】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、１ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムをバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。実施例７に上記されたように組立てられた０．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜デバイスも、バッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。２つのフロースルートレインを組立てた。１番目は活性化炭素カラム、次いで、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜デバイスを有していたが、２番目はＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜デバイス、次いで、活性化炭素カラムの逆の順序を有していた。９６ｍＬのＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で各組立物に通過させた。精製トレインを通過させた後、溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＸＩにまとめる。
【０２０４】
結果は、活性化炭素および陰イオン交換媒体（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ）の順序が、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液のフロースルー精製の有効性にとって重要であるという予想外の結果を示している。活性化炭素を陰イオン交換媒体の前に置いた場合、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）は１．８７であった。陰イオン交換媒体を活性化炭素の前に置いた場合、ＨＣＰのＬＲＶは１．３８に減少した。活性化炭素および陰イオン交換媒体の順序は、抗体の回収率に対する影響を有さなかったが、それは吸着剤の両方の順序について９７％であった。それらの結果は、陰イオン交換媒体の前に活性化炭素を置くことは、タンパク質溶液から不純物を除去する２つの吸着剤の組合せの有効性を最大化するのに重要であるという重要な理解を示している。
【０２０５】
【表１１】

【０２０６】
［実施例１５］
活性化炭素を用いるＭＡｂ Ｉの非アフィニティ捕捉溶出液のフロースルー処理
活性化炭素を、非アフィニティ（陽イオン交換）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去に関してフロースルー適用において試験して、活性化炭素が、不純物の除去のための予想外に非常に効果的な方法を提供することを証明した。アフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液と比較して、非アフィニティ（陽イオン交換）捕捉溶出液は、有意により高いレベルの異なる型の不純物を含有する。非アフィニティ捕捉溶出液の精製のための活性化炭素の適用は、この方法が一般的であり、様々なタンパク質溶液の精製に適用することができることを示している。
【０２０７】
部分精製されたＭＡｂ Ｉ ＣＥＸ溶出液を、実施例６に記載のように調製した。溶出液を、バッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて４倍希釈した。ＭＡｂ Ｉの希釈された溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ６からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は本明細書ではＭＡｂ Ｉ ＣＥＸ溶出液と呼ばれる。
【０２０８】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、１ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムをバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。
【０２０９】
次いで、７０ｍＬのＭＡｂ Ｉ ＣＥＸ溶出液を、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で活性化炭素のカラムに通過させた。７個の１０ｍＬの溶出液画分を収集した。全部で７個の画分ならびに選択された個々の画分のプールされた試料を、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＸＩにまとめる。
【０２１０】
図１６に示され、以下の表ＸＩＩにまとめられる通り、結果は、活性化炭素を用いるフロースルー精製は、非アフィニティ（陽イオン交換）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。非アフィニティ（陽イオン交換）に基づく捕捉媒体は、より特異的なアフィニティ（プロテインＡ）に基づく捕捉媒体よりもモノクローナル抗体と共により多くの不純物に結合する。従って、非アフィニティ捕捉溶出液は、有意により高いレベルの異なる型の不純物を含有する。活性化炭素は、０．７６の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）を提供し、モノクローナル抗体生成物の８９％の回収率を有していた。これらの結果は、活性化炭素を用いて様々なタンパク質溶液から不純物を除去することができることを示唆している。
【０２１１】
【表１２】

【０２１２】
［実施例１６］
活性化炭素充填カラムおよび活性化炭素−セルロースデバイスを用いるＭＡｂ Ｉのアフィニティ捕捉溶出液のフロースルー精製
カラム中に充填されたまたはセルロースシート中に混合された活性化炭素を、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去についてフロースルー適用において試験して、活性化炭素が様々な形式における不純物の除去のための予想外に非常に効果的な方法を提供することを証明した。
【０２１３】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０２１４】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１５ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された６００ｍｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、２．４ｍＬの充填カラム容量を得た。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡからＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｐｏｄ ＣＲデバイスで市販されている、活性化炭素を含浸させたセルロースシート媒体を、入力および出力のためのＬｕｅｒコネクターを装備した、外側被覆されたポリプロピレンシリンジデバイス、内部濾過面積２５ｍｍ、４．６ｍＬベッド容量に入れた。
【０２１５】
カラムおよび活性化炭素−セルロースデバイスを、バッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。２つのフロースルートレインを組立てた。１番目は活性化炭素カラムを有していたが、２番目は活性化炭素−セルロースデバイスを有していた。続いて、３１５ｍＬのＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、０．７５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、各組立物に通過させた。精製トレインを通過させた後、溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＸＩＩＩにまとめる。
【０２１６】
結果は、活性化炭素を用いるフロースルー精製が、カラム中に充填されたまたはセルロースシート中に混合した場合、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。カラム中に充填されたまたはセルロースシート中に混合した活性化炭素は両方とも、それぞれ０．９５および０．９７の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の非常に類似した対数減少値（ＬＲＶ）を与えた。それらはまた、カラムについては９１％およびセルロースシートについては８７％のモノクローナル抗体生成物の非常に類似した回収率を有していた。これらの結果は、活性化炭素を、セルロースシート中に混合した場合、タンパク質溶液からの不純物の除去のために効果的に用いることができることを示唆している。
【０２１７】
【表１３】

【０２１８】
［実施例１７］
２つの他の型の活性化炭素を用いるＭＡｂ Ｉのアフィニティ捕捉溶出液のフロースルー精製
２つの他の型の市販の活性化炭素を、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去についてフロースルー適用において試験して、様々な活性化炭素をタンパク質溶液からの不純物の除去のために用いることができるという予想外の結果を証明した。
【０２１９】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０２２０】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径５ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された１２５ｍｇのＣｈｅｍｖｉｒｏｎ Ｐｕｌｓｏｒｂ ＰＧＣ活性化炭素（Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ｃａｒｂｏｎ，Ｆｅｌｕｙ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）またはＮｏｒｉｔ Ａ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰ活性化炭素（Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）をロードして、０．２４ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムをバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。２つのフロースルートレインを組立てた。１番目はＣｈｅｍｖｉｒｏｎ Ｐｕｌｓｏｒｂ ＰＧＣ活性化炭素カラムを有したが、２番目はＮｏｒｉｔ Ａ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰ活性化炭素カラムを有していた。９６ｍＬのＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で各組立物に通過させた。精製トレインを通過させた後、溶液を、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＸＩＶにまとめる。
【０２２１】
結果は、２つの他の型の活性化炭素を用いるフロースルー精製が、アフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ｐｕｌｓｏｒｂ ＰＳＧおよびＮｏｒｉｔ Ａ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰは両方とも、それぞれ０．４０および０．４８の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で不純物を除去した。それらはまた、Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ Ｐｕｌｓｏｒｂ ＰＳＧについては１００％およびＮｏｒｉｔ Ａ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰについては１００％のモノクローナル抗体生成物の優れた回収率を有していた。これらの結果は、いくつかの異なる型の活性化炭素を、タンパク質溶液からの不純物の除去に用いることができることを示唆している。
【０２２２】
【表１４】

【０２２３】
［実施例１８］
様々なバッファー塩の存在下でのＭＡｂ Ｉのアフィニティ捕捉溶出液のフロースルー精製
活性化炭素を、様々な塩を添加したアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去についてフロースルー適用において試験して、活性化炭素が多くの様々な塩の存在下での不純物の除去のための予想外に非常に効果的な方法を提供することを証明した。この調査は、この方法が一般的であり、様々なバッファー塩中でのタンパク質の精製に適用することができることを例示するものである。
【０２２４】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。ＭＡｂ Ｉの溶出液を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０２２５】
ＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液５０ｍＬに、３００ｍＭの様々な塩（ここで、塩は硫酸アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩無水物（ＥＤＴＡ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム無水物、リン酸ナトリウム七水和物、およびＴｒｉｚｍａ（登録商標）Ｐｒｅ−ｓｅｔ結晶、ｐＨ ７．０（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）である）を含有する１０ｍＬの水性溶液を添加した。
【０２２６】
１０ｍＬの水で希釈した溶液を対照として用いた。塩と混合したプロテインＡ溶出液のｐＨを、２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基または３Ｍ酢酸を用いて７に調整し戻した。この溶液は、本明細書では塩と混合したＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０２２７】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径５ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された１２５ｍｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、０．５ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムをバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。次いで、４０ｍＬの塩と混合したＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、０．１２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で活性化炭素のカラムに通過させた。カラムを通過させた後、溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＸＶにまとめる。
【０２２８】
結果は、活性化炭素を用いるアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体のフロースルー精製が、様々な塩添加物の存在下での不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。活性化炭素は、全ての添加した塩の存在下で、０．６３から１．００の範囲の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で不純物を除去した。それらはまた、９２％から９６％の範囲のモノクローナル抗体生成物の優れた回収率を有していた。これらの結果は、活性化炭素を、様々な塩のバッファー中におけるタンパク質溶液からの不純物の除去に用いることができることを示唆している。
【０２２９】
【表１５】

【０２３０】
［実施例１９］
ｐＨ ５およびｐＨ ７でのプロテインＡ溶出液のフロースルー精製
活性化炭素を、２つの異なるｐＨ条件でのアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液からの不純物の除去についてフロースルー適用において試験して、活性化炭素が異なる溶液ｐＨ条件での不純物のフロースルー除去のための予想外に非常に効果的な方法を提供することを証明した。この調査は、この方法が一般的であり、異なるｐＨ条件下でのタンパク質の精製に適用することができることを例示するものである。
【０２３１】
部分精製されたＭＡｂ Ｉアフィニティ（プロテインＡ）捕捉溶出液を、実施例５に従って調製した。この溶液は、本明細書ではｐＨ ５のＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０２３２】
実施例５に従って調製されたＭＡｂ Ｉの溶出液の一部を、Ｔｒｉｓ塩基（２Ｍ）を用いて約ｐＨ ５からｐＨ ７に調整し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを通して濾過した。この溶液は、本明細書ではｐＨ ７のＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液と呼ばれる。
【０２３３】
Ｇｌａｓｓ Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１５ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された１．２５ｇのＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素をロードして、５ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムをバッファー溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、２５ｍＭ、ｐＨ ７）を用いて平衡化させた。次いで、５００ｍＬのｐＨ ５のＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液またはｐＨ ７のＭＡｂ ＩプロテインＡ溶出液を、１．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で活性化カラムに通過させた。精製トレインを通過させた後、溶液を宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ５５０）を、キットの製造業者のプロトコールに従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果を表ＸＶＩにまとめる。
【０２３４】
結果は、活性化炭素を用いるアフィニティ（プロテインＡ）捕捉モノクローナル抗体溶出液のフロースルー精製が、ｐＨ ５およびｐＨ ７の両方において不純物の除去に関して予想外に効果的であったことを示している。活性化炭素は、ｐＨ ５では０．８５およびｐＨ ７では１．１５の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少値（ＬＲＶ）で不純物を除去した。活性化炭素はまた、ｐＨ ５では９７％およびｐＨ ７では１０１％のモノクローナル抗体の優れた回収率を有していた。これらの結果は、活性化炭素を、様々なｐＨ条件でのタンパク質溶液の不純物の除去に用いることができることを示唆している。
【０２３５】
【表１６】

【０２３６】
［実施例２０］
連続クロマトグラフィーを用いて調製されたプロテインＡ溶出液のフロースルー精製
この代表的な実験は、活性化炭素および陰イオン交換クロマトグラフィーデバイスを用いて、連続多カラムクロマトグラフィー（ＣＭＣ）を用いて得られたプロテインＡ溶出液を精製することができることを証明する。
【０２３７】
本実施例において、モノクローナル抗体（ＭＡｂ ＩＩ）は、参照により本明細書に組み込まれる同時係属出願欧州特許出願第ＥＰ１２００２８２８．７号に記載のようなＰｒｏｓｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いる３つのカラムの連続多カラムクロマトグラフィー（ＣＭＣ）法を用いて精製される。実施例１２に記載のように、プロテインＡ溶出液をプールし、活性化炭素デバイス、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーデバイス（すなわち、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））に通して処理する。
【０２３８】
図１８に示されるように、活性化炭素および陰イオン交換クロマトグラフィーデバイスの組合せを用いた場合、１０ｐｐｍ以下のＨＣＰ濃度の減少により測定されるように、モノクローナル抗体の精製の成功が得られる。
【０２３９】
［実施例２１］
いくつかのフロースルー不純物除去ステップの接続
この代表的な実験において、生成物の純度および収率目標を満たしながら、単一の単位操作またはプロセスステップとして運転するフロースルー様式でのいくつかの不純物除去ステップを接続する実現可能性が証明される。
【０２４０】
本実施例において、個々のデバイス、すなわち、活性化炭素デバイス、陰イオン交換クロマトグラフィーデバイス（すなわち、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））、陽イオン交換クロマトグラフィーデバイスおよびウイルス濾過デバイス（すなわち、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ）を接続して、フロースルー様式で運転する。さらに、インラインスタティックミキサーおよび／またはサージタンクを、陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーデバイスとの間に配置して、ｐＨ変化を達成する。最後に、精製される試料が濁っている場合、任意選択の深層フィルターを活性化炭素デバイスの上流に配置する。
【０２４１】
図１９は、以下に記載のデバイスを含む、フロースルー精製プロセスステップを実施するための実験組立物の略図を示す。
【０２４２】
さらに、必要なポンプ、バルブ、センサーなどもそのような組立物中に含有させてもよい。
【０２４３】
全てのデバイスを異なる位置で個別に湿らせた後、組立てる。デバイスは製造業者のプロトコールに従って湿らせ、予備処理する。簡単に述べると、深層フィルター（Ａ１ＨＣ等級）を、１００Ｌ／ｍ^２の水、次いで、５倍量の平衡化バッファー１（ＥＢ１；１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ １１でｐＨ ７．５に調整されたプロテインＡ溶出バッファー）を用いてフラッシュする。２．５ｍＬの活性化炭素を、実施例１２に記載の２．５ｃｍのＯｍｎｉｆｉｔカラムに充填して、０．５５ｋｇ／Ｌの抗体負荷を作製する。このカラムを１０ＣＶの水でフラッシュした後、ｐＨがｐＨ ７．５に安定化されるまでＥＢ１を用いて平衡化させる。２つのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイス（０．２および０．１２ｍＬ）を直列に接続して、４．３ｋｇ／Ｌの負荷を得る。デバイスを、少なくとも１０ｍｉｎにわたって１２．５ＣＶ／ｍｉｎの水、次いで５ＤＶ（デバイス容量）のＥＢ１で湿らせる。１２個のエレメントを有する使い捨てらせん形スタティックミキサー（Ｋｏｆｌｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｙ，ＩＬ）を用いて、インラインｐＨ調整を実施する。凝集物除去のための２つの１．２ｍＬ陽イオン交換フロースルーデバイスを平行に接続して、凝集物を除去する。ＣＥＸデバイス上のＭＡｂ負荷は、約５７０ｍｇ／ｍＬである。これらのデバイスを１０ＤＶの水、次いで、５ＤＶの平衡化バッファー２（ＥＢ２；１Ｍ酢酸を用いてｐＨ ５．０に調整されたＥＢ１）を用いて湿らせる。デバイスを５ＤＶ（デバイス容量）のＥＢ２＋１Ｍ ＮａＣｌでさらに処理した後、５ＤＶのＥＢ２を用いて平衡化させる。３．１ｃｍ^２のＶｉｒｅＳｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏデバイスを、３０ｐｓｉで少なくとも１０ｍｉｎにわたって加圧した水を用いて湿らせる。次いで、流速が連続で３分間一定のままになるまで、流速を毎分モニターする。全てのデバイスを湿らせ、平衡化させた後、それらを図１９に示されるように接続する。全ての圧力読み取り値およびｐＨ読み取り値が安定化されるまで、ＥＢ１をシステム全体に通過させる。平衡化の後、供給液をフロースルートレインに通過させる。泳動の間、サージタンクの前およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏの後で試料を収集して、ＩｇＧ濃度および不純物レベル（ＨＣＰ、ＤＮＡ、浸出したＰｒＡおよび凝集物）をモニターする。供給液を処理した後、システムを３死容量のＥＢ１でフラッシュして、デバイスおよび配管中のタンパク質を回収する。
【０２４４】
接続されたフロースループロセスのための供給液は、バッチ式プロテインＡプロセスにおいて製造されたＭＡｂ ＩＩのプロテインＡ溶出液である。このＭＡｂ中の凝集物の天然レベルは１％を超えず、従って、凝集物のレベルを増加させるための特殊な手順を開発した。溶液のｐＨを、緩やかに撹拌しながら、水性ＮａＯＨで１１に上昇させ、１時間保持する。次いで、このｐＨを、緩やかに撹拌しながら、水性ＨＣｌを用いてｐＨ ５にゆっくりと低下させる。ｐＨサイクルをさらに４回繰り返す。凝集物の最終レベルは約５％であり、その多くは、ＳＥＣにより測定されるようにＭＡｂダイマーおよびトリマーからなる。次いで、供給液をＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ ７．５中に、約３ｍＳ／ｃｍの伝導率で透析する。
【０２４５】
この泳動のために処理されるＭＡｂ供給液の量は、０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速の１０２ｍＬの１３．５ｍｇ／ｍＬのＭＡｂである。
【０２４６】
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）後の時間の関数としてのＨＣＰ漏出は、１０ｐｐｍの上限より下である（図２０）。凝集物は、ＣＥＸデバイスにより５％から１．１％に減少する（図２１）。接続されたプロセスのＭＡｂ ＩＩの収率は９２％である。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏデバイス上の処理量は３．７ｋｇ／ｍ^２より大きい。
【０２４７】
従って、前記実施例は、いくつかのデバイスを接続してフロースルー様式で上手く運転することによって、所望の生成物純度および収率目標を達成することができることを示している。
【０２４８】
［実施例２２］
フロースルー精製プロセスステップと連続結合および溶出クロマトグラフィー捕捉ステップとの接続
この代表的な実験において、本明細書に記載のフロースルー精製プロセスを、フロースルー精製の前にある連続結合および溶出クロマトグラフィー捕捉プロセスに直接連結した。
【０２４９】
本実施例において、ＣＨＯに基づくモノクローナル抗体（ＭＡｂＩＩ）を、フェドバッチ式バイオリアクター中で製造する。合計７Ｌの細胞培養液を、刺激原応答ポリマーの溶液と接触させて、０．２％ｖ／ｖの最終刺激原応答ポリマー濃度を作製する。細胞培養液を約１０分間混合させる。１７５ｍＬの２Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４溶液を添加し、さらに１０分間混合させる。次いで、ｐＨを、２Ｍトリス塩基を用いて７．０に上昇させ、１５分間混合させる。次いで、溶液を４，５００ ｘ ｇで１０分間、２Ｌアリコート中で遠心分離し、上清をデカンテーションし、保持する。固体を除去する。細胞培養上清をプールした後、連続撹拌しながらバッチ様式で１：１０の比で５Ｍ ＮａＣｌと混合する。溶液の最終伝導率をこの時点で測定すれば、５５±５ｍＳ／ｃｍである。得られたより高いＮａＣｌ濃度の溶液を、０．２２μｍのＥｘｐｒｅｓｓフィルターを通して滅菌濾過する。滅菌濾過された溶液は、プロテインＡクロマトグラフィーのための負荷材料である。
【０２５０】
プロテインＡ捕捉ステップは、改変Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００上の方法を用いて泳動する２つのプロテインＡカラムからなる。プロテインＡカラムは、１０．２５および１０．８５ｃｍのベッド高さまで内径１．６ｃｍのＶａｎｔａｇｅ−Ｌ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）クロマトグラフィーカラム中に充填された１０ｍＬのＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＰｌｕｓプロテインＡ媒体を有する。カラムを５カラム容量（ＣＶ）にわたって１Ｘ ＴＢＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌを用いて平衡化させる（全てのカラム容量は最も小さいカラムに基づく）。泳動を通して、負荷の流速を、約１分の負荷滞留時間を有するように設定する。最初の負荷の間に、両方のカラムを直列に置き、一次カラムの流出液を、特定のロード容量に達するまで二次カラム上に直接ロードする。特定の負荷容量をカラム上に通過させた後、供給液を停止させ、２ＣＶの平衡化バッファーを一次カラムから二次カラムに通過させる。次いで、一次カラムを、洗浄、溶出、クリーニングおよび再平衡化を受けるように配置する一方、二次カラムを一次カラムと同様にロードする。第１カラムの再平衡化の後、そのカラムを第２の位置に移動させて、現在の一次カラムと直列に存在させる。この一連の事象を、元の一次に位置するカラムを設定された容量までロードした後、一次の位置を取る各カラムを用いて繰り返す。各カラムを、合計７回ロードする。溶出の開始時間を制御するためのＵＶトリガーを用いて、各カラムからの溶出液を画分収集器を用いて収集し、約３．５ＣＶの一定容量まで収集する。
【０２５１】
フロースルー精製トレインは、６つの主要なデバイスからなる：任意選択の深層フィルター（ｐＨ ７．５にｐＨを調整した後の沈殿物除去のため）；活性化炭素；ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）；インラインｐＨ調整のためのスタティックミキサーおよび／またはサージタンク；凝集物除去のための陽イオン交換フロースルーデバイス（ＣＥＸデバイス）；ならびにウイルス濾過デバイス（すなわち、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ）。
【０２５２】
図１９は、これらのデバイスを接続する順序を例示する。
【０２５３】
全てのデバイスを異なる位置で個々に湿らせた後、図１９に示されるように組立てる。デバイスを、製造業者のプロトコールに従ってまたは以前に記載のように湿らせ、予備処理する。簡単に述べると、深層フィルター（Ａ１ＨＣ）を、１００Ｌ／ｍ^２の水、次いで、５倍量の平衡化バッファー１（ＥＢ１；１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ １１でｐＨ ７．５に調整されたＰｒＡ溶出バッファー）を用いてフラッシュする。１０ｍＬの活性化炭素を、実施例１２に記載のように２．５ｃｍのＯｍｎｉｆｉｔカラムに充填する。カラムを１０ＣＶの水でフラッシュした後、ｐＨがｐＨ ７．５に安定化されるまでＥＢ１を用いて平衡化させる。１．２ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜（７層）を、直径４７ｍｍのＳｗｉｎｅｘデバイス中に積み重ねる。このデバイスを、少なくとも１０ｍｉｎにわたって１２．５ＣＶ／ｍｉｎの水、次いで、５デバイス容量（ＤＶ）のＥＢ１で湿らせる。１２個のエレメントを有する使い捨てらせん形スタティックミキサー（Ｋｏｆｌｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｙ，ＩＬ）を用いて、インラインｐＨ調整を実施する。３層の陽イオン交換クロマトグラフィーデバイス（０．１２ｍＬの膜容量）を、１０ＤＶの水、次いで、５ＤＶの平衡化バッファー２（ＥＢ２：１Ｍ酢酸を用いてｐＨ ５．０に調整されたＥＢ１）を用いて湿らせる。デバイスを５ＤＶのＥＢ２＋１Ｍ ＮａＣｌを用いてさらに処理した後、５ＤＶのＥＢ２を用いて平衡化させる。３．１ｃｍ^２のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏウイルス濾過デバイスを、３０ｐｓｉで少なくとも１０分間加圧された水を用いて湿らせる。次いで、流速が連続３分間一定のままになるまで、流速を毎分モニターする。全てのデバイスを湿らせ、平衡化させた後、それらを図１９に示されるように接続する。全ての圧力読み取り値およびｐＨ読み取り値が安定化されるまで、ＥＢ１をシステム全体に通過させる。平衡化後、供給液（ｐＨ ７．５に調整されたＰｒＡ溶出液）を、フロースルー精製トレインに通過させる。泳動の間に、サージタンクの前およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏの後に試料を収集して、ＩｇＧ濃度および不純物レベル（ＨＣＰ、ＤＮＡ、浸出したＰｒＡおよび凝集物）をモニターする。供給液を処理した後、システムを３死容量のＥＢ１を用いてフラッシュして、デバイスおよび配管中のタンパク質を回収する。
【０２５４】
図２２は、深層フィルター、活性化炭素およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅＰｒｏの前の圧力読み取り値を示す。深層フィルター上の圧力は、泳動の多くの部分について未変化のままであるが、終わりに向かって上昇し、これはプロテインＡ泳動の終わりに向かうプロテインＡ溶出液供給画分のいくらかの沈殿物を示唆している。活性化炭素カラムは、活性化炭素の深層フィルター上流のため、任意の沈殿物からかなり保護されたままである。ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＰｒｏの圧力は時間と共にゆっくり上昇するが、運転最大限界（５０ｐｓｉ）よりもはるかに低い。
【０２５５】
ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＰｒｏプール中の最終的なＨＣＰは１ｐｐｍ未満である（表ＸＶＩ）。溶出液画分中の平均浸出プロテインＡは、３２ｐｐｍである。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏプール中の浸出プロテインＡは、４ｐｐｍである。凝集物は１％から０．４％まで減少する。以下の表ＸＶＩＩは、連続結合および溶出クロマトグラフィープロセスステップと接続した場合のフロースルー精製の性能を調査するための実験の結果を示す。
【０２５６】
【表１７】

【０２５７】
［実施例２３］
活性化炭素を用いる細胞培養液成分不純物の除去
この代表的な実験において、プロテインＡアフィニティ捕捉ステップを通じて存続し得る細胞培養液に由来する潜在的な不純物が活性化炭素により除去されることが証明される。
【０２５８】
細胞培養培地の一般的な成分、インスリン、哺乳動物細胞の成長刺激因子は、典型的には１−２０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中に存在する。組換えヒトインスリン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．からのＩｎｃｅｌｌｉｇｅｎｔ ＡＦ）を１ｍｇ／ｍＬで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．０バッファー中に溶解し、モノクローナル抗体ＭＡｂ ＩＩを７ｇ／Ｌの濃度まで添加した。ガラス製のＯｍｎｉｆｉｔカラムに、ＨＤ Ｎｕｃｈａｒ活性化炭素を充填する。溶液を、０．２５ＣＶ／ｍｉｎの一定速度で、１ｋｇ／Ｌの合計ＭＡｂ ＩＩ負荷でカラムに通過させる。フロースループールを、インスリンおよび抗体濃度について分析する。分析のために、ＨＣ１８カラム（Ｃａｄｅｎｚａ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いる；溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ；１５分にわたる５％−３０％のＢの最適化勾配を用いて、ＵＶ Ａ２１４吸光度によりインスリンを検出した。まず、抗体の存在下でインスリンの標準溶液を用いて補正曲線を作製する。活性化炭素カラムからの流出液中ではインスリンは検出されないが、これは活性化炭素が２４０ｍｇ／ｇの過剰量で、ＭＡｂの存在下でのインスリンに対する許容量を有することを示唆している。
【０２５９】
［実施例２４］
活性化炭素セルロース媒体を用いるＭＡｂ ＩＩのアフィニティ捕捉溶出液の濁った溶液からの不純物のフロースルー除去
この代表的な実験において、活性化炭素が、微生物供給液から誘導されるＨＣＰの除去について予想外に非常に効果的であることが証明された。Ｅ．コリ溶解物の溶液を、１．５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂモノクローナル抗体と混合した。混合した供給液を、フロースルー条件下でカラム中に充填された活性化炭素を用いて処理した。
【０２６０】
Ｅ．コリの培養物に由来する細胞を遠心分離により回収した。上清をデカンテーションにより除去し、残りの細胞ペレットを激しい振とうおよび撹拌により溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ７）中に懸濁した。次いで、１００ｍＭのＰＭＳＦのエタノール中の保存溶液の０．４ｍＬ分を添加した。懸濁液を画分（それぞれ約１００ｍＬ）に分割し、３ｓｅｃオンにし、４ｓｅｃオフにして５ｍｉｎにわたって超音波処理にかけた。超音波処理の後、材料をプールし、−８０℃で４８時間保存した。次いで、溶液を解凍し、４，５００ ｘ ｇで２時間遠心分離して、溶解した細胞を除去した。上清を、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＨＶ ０．４５μｍ Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（１０００ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＨＶＵ１１ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）を用いて濾過した。次いで、それをＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１０００ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ１１ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）に通して濾過した。次いで、濾過した溶解物を７．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ溶液と混合して、１．５ｍＬのｍＡｂと混合された溶液を得た。溶液のｐＨは７．７であると測定された。
【０２６１】
ガラス製のＯｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性化炭素（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）をロードして、１ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムを２５ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ ７を用いて平衡化させた。次いで、４２ｍＬのｍＡｂと混合したＥ．コリ溶解物を、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で活性化炭素カラムに通過させ、活性化炭素中での４分間の滞留時間を得た。対照およびプール試料を、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度に関する分析に提出した。
【０２６２】
ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥ．コリＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ４１０）をキットの製造業者の説明書に従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。結果は、活性化炭素が、微生物供給液から誘導されるＨＣＰの選択的除去について予想外に効果的であったことを示している。溶解物中のＨＣＰの濃度は、２０６，０００ｎｇ／ｍＬ（１３３，００ｐｐｍ）から１１９，０００ｎｇ／ｍＬ（７７，８００ｐｐｍ）に減少したが、ｍＡｂの回収率は９９％であり、１．５５ｇ／Ｌの濃度で出発し、１．５３ｇ／Ｌで回収された。本実施例は、活性化炭素を用いて、非哺乳動物細胞からＨＣＰを除去することができることを示している。
【０２６３】
［実施例２５］
活性化炭素−セルロース媒体および陰イオン交換媒体を用いるＭＡｂ ＩＩのアフィニティ捕捉溶出液の濁った溶液からの不純物の除去
この実験において、活性化炭素のみおよびイオン交換媒体と組合せた活性化炭素が、捕捉ステップ後の微生物供給液から誘導されるＨＣＰの除去に関して予想外に非常に効果的であることが示された。
【０２６４】
Ｅ．コリ溶解物の溶液に、１．５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂモノクローナル抗体を添加した後、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて捕捉した。捕捉された供給液を、フロースルー条件下でカラム中に充填された活性化炭素、および次いで、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）ＡＥＸ膜で処理した。
【０２６５】
Ｅ．コリの培養液に由来する細胞を遠心分離により回収した。上清をデカンテーションにより除去し、残りの細胞ペレットを激しい振とうおよび撹拌により溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７）に懸濁した。次いで、１００ｍＭ ＰＭＳＦのエタノール中の保存溶液の０．４ｍＬ分を添加した。懸濁液を画分（それぞれ約１００ｍＬ）に分割し、５ｍｉｎにわたって３ｓｅｃのオンおよび４ｓｅｃのオフを用いる超音波処理にかけた。超音波処理後、材料をプールし、−８０℃で４８時間保存した。次いで、溶液を解凍し、４，５００ ｘ ｇで２時間遠心分離して、溶解した細胞を除去した。上清をＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＨＶ ０．４５μｍ Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（１０００ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＨＶＵ１１ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）を用いて濾過した。次いで、それをＳｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（１０００ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ１１ＲＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）に通して濾過した。次いで、濾過された溶解物を、７．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ溶液と混合して、１．５ｍＬのｍＡｂと混合した溶液を得た。溶液のｐＨは７．７であると測定された。次いで、混合した溶解物中のｍＡｂを、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて捕捉した。次いで、３０ｍＬの捕捉されたｍＡｂを、低いｐＨで溶出させた。溶出ｐＨを、１Ｍ Ｔｒｉｓの滴下添加により３−４から７に上昇させた後、ＳｔｅｒｉｃｕｐＧＰ ０．２２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ膜（２５０ｍＬ、カタログ番号：ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）に通して濾過した。１ｍＬのｐＨ調整された溶液を、分析のために取りのけておいた。
【０２６６】
ガラス製のＯｍｎｉｆｉｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｌｕｍｎ（直径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、水中でスラリー化された２５０ｍｇのＮｕｃｈａｒ ＨＤ活性化炭素（ＭｅａｄＷｅｓｔＶａｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）をロードして、１ｍＬの充填カラム容量を得た。カラムを２５ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ ７を用いて平衡化させた。次いで、２９ｍＬのｍＡｂプロテインＡクロマトグラフィー溶出液を、０．２ｍＬ／ｍｉｎで活性化炭素に通過させた。滞留時間は４分であった。１ｍＬの活性化炭素処理された溶出液を、分析のために取りのけておいた。
【０２６７】
次いで、０．０８ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）デバイス（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，０１８２１，ＵＳＡ）を、説明書に従って水で湿らせた後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７を用いてフラッシュした。次いで、２７ｍＬの活性化炭素処理された溶出液を、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速でＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイスに通過させた。滞留時間は０．１６分であった。１ｍＬの活性化炭素およびＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ処理された溶出液を、分析のために取りのけておいた。
【０２６８】
それぞれの試料を、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＩｇＧ濃度について分析した。ＨＣＰ分析を、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，ＵＳＡからの市販のＥ．コリＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｆ４１０）をキットの製造業者の説明書に従って用いて実施した。ＩｇＧ濃度を、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡプロテインＡ分析カラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。
【０２６９】
結果は、活性化炭素のみおよびＡＥＸ膜と組合せた活性化炭素が、微生物供給液の捕捉された溶出液からのＨＣＰの選択的除去に関して予想外に効果的であったことを示している。溶出液中のＨＣＰの濃度は、活性化炭素によって８６ｎｇ／ｍＬ（７ｐｐｍ）から８ｎｇ／ｍＬ（０．７ｐｐｍ）に減少したが、ｍＡｂの回収率は９７％であり、１１．５ｇ／Ｌの濃度で開始して１１．２ｇ／Ｌで回収された。活性化炭素処理された溶出液中のＨＣＰの濃度は、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ ＡＥＸ膜によって３ｎｇ／ｍＬ（０．３ｐｐｍ）にさらに減少し、ｍＡｂの全体の回収率は９６％であり、１１．１ｇ／Ｌの最終濃度を得た。本実施例は、活性化炭素のみおよびＡＥＸ媒体と組合せた活性化炭素を用いて、捕捉ステップ後に非哺乳動物細胞から誘導されるＨＣＰを除去することができることを示している。
【０２７０】
本明細書は、参照により本明細書に組み込まれる本明細書内に引用された参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明における実施形態の例示を提供するものであり、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者であれば、多くの他の実施形態が本発明により包含されることを容易に認識する。全ての刊行物および発明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と相反するまたはそれと矛盾する範囲について、本明細書は任意のそのような材料に優先する。本明細書の任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対して先行技術であるとの許諾ではない。
【０２７１】
特に指摘がない限り、特許請求の範囲を含む本明細書において用いられる成分、細胞培養液、処理条件などの量を表す全ての数は、用語「約」により全ての事例において修飾されると理解されるべきである。従って、特に逆の記載がない限り、数的パラメーターは近似値であり、本発明により得られることが求められる所望の特性に応じて変化してもよい。特に指摘がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、あらゆる一連の要素について言及していると理解されるべきである。当業者であれば、日常的なものを超えない実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するまたは確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【０２７２】
当業者には明らかであるように、本発明の多くの改変および変更を、その精神および範囲を逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は、ほんの一例として提供されるものであり、いかなる意味でも限定を意味するものではない。本明細書および実施例は例示のみと考えられ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により示されることが意図される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡ溶出液から標的分子を精製するためのフロースループロセスであって、
下記ステップ：
（ｉ）プロテインＡクロマトグラフィーカラムから回収された溶出液を活性化炭素と接触させるステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からのフロースルー試料を陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からのフロースルー試料を陽イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；および
（ｉｖ）標的分子を含むステップ（ｉｉｉ）からのフロースルー試料を取得するステップ
を含み、溶出液がステップ（ｉ）−（ｉｉｉ）を連続的に流動し、ならびにステップ（ｉｉｉ）後のフロースルー試料中の１または複数の不純物のレベルが、ステップ（ｉ）における溶出液中のレベルよりも低い、フロースループロセス。
【請求項２】
ステップ（ｉｉｉ）からのフロースルー試料をウイルス濾過にかけることをさらに含む、請求項１のフロースループロセス。
【請求項３】
ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に、ｐＨを変化させるためのインラインスタティックミキサーおよび／またはサージタンクの使用をさらに含む、請求項１のフロースループロセス。
【請求項４】
単一のスキッドを用いる、請求項１のフロースループロセス。
【請求項５】
プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出液が、活性化炭素と接触させる前にウイルス不活化にかけられる、請求項１のフロースループロセス。
【請求項６】
ステップ（ｉ）−（ｉｉｉ）が任意の順序で実施され得る、請求項１のプロセス。
【請求項７】
プロテインＡ溶出液を、活性化炭素、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体およびウイルス濾過媒体から選択される２つ以上のマトリックスと接触させることを含み、溶出液の流動が連続的である、プロテインＡ溶出液から標的分子を精製するためのフロースルー精製プロセス。
【請求項８】
タンパク質精製の間に１または複数のクロマトグラフィーカラム上の負担を減少させる方法であって、
目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、フロースルー様式において、
（ｉ）炭素質材料；
（ｉｉ）炭素質材料とＣＥＸ媒体との組合せ；
（ｉｉｉ）炭素質材料とＡＥＸ媒体との組合せ；
（ｉｖ）炭素質材料と混合様式媒体との組合せ；および
（ｖ）炭素質材料とＨＩＣ媒体との組合せ
のうちの１つと接触させた後、試料を、アフィニティ媒体、ＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体または混合様式媒体を含む１または複数のクロマトグラフィーカラムと接触させることによって、１または複数のクロマトグラフィーカラム上の負担を減少させることを含む、方法。
【請求項９】
タンパク質精製の間に多孔性媒体を用いる１または複数のクロマトグラフィーステップ上の負担を減少させる方法であって、
目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、フロースルー様式において、
（ｉ）炭素質材料；
（ｉｉ）炭素質材料とＣＥＸ媒体との組合せ；
（ｉｉｉ）炭素質材料とＡＥＸ媒体との組合せ；
（ｉｖ）炭素質材料と混合様式媒体との組合せ；ならびに
（ｖ）炭素質材料とＨＩＣ媒体との組合せ
のうちの１つと接触させた後、試料を、多孔性媒体を用いる１または複数のクロマトグラフィーステップと接触させることによって、１または複数のクロマトグラフィーステップ上の負担を減少させることを含む、方法。
【請求項１０】
多孔性媒体が、アフィニティ媒体、ＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体または混合様式媒体のうちの１または複数を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
アフィニティ媒体がプロテインＡまたはプロテインＧから選択される、請求項８の方法。
【請求項１２】
目的のタンパク質が抗体またはその機能的フラグメントである、請求項８の方法。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
試料が細胞培養供給液を含む、請求項８の方法。
【請求項１６】
試料を（ｉ）から（ｖ）のうちの１つと接触させる前に、試料が清澄化ステップにかけられる、請求項８の方法。
【請求項１７】
清澄化ステップが、深層濾過、スクリーン濾過、軟凝集および／または遠心分離のうちの１または複数を含む、請求項９の方法。
【請求項１８】
炭素質材料が活性化炭素を含む、請求項８の方法。
【請求項１９】
活性化炭素が活性炭を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
炭素質材料とＡＥＸ媒体との組合せが活性化炭素とＡＥＸ樹脂との混合物であり、炭素質材料とＣＥＸ媒体との組合せが活性化炭素とＣＥＸ樹脂との混合物であり、炭素質材料と混合様式媒体との組合せが活性化炭素と混合様式樹脂との混合物であり、および炭素質材料とＨＩＣ媒体との組合せが活性化炭素とＨＩＣ樹脂との混合物である、請求項８の方法。
【請求項２１】
混合物がカラム中に充填される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
混合物が密閉された使い捨てデバイス中に充填される、請求項２０の方法。
【請求項２３】
ＣＥＸ媒体がＣＥＸ樹脂を含む、請求項８の方法。
【請求項２４】
ＡＥＸ媒体がＡＥＸ樹脂を含む、請求項８の方法。
【請求項２５】
ＨＩＣ媒体がＨＩＣ樹脂を含む、請求項８の方法。
【請求項２６】
混合様式媒体が第１群および第２群を含み、第１群および第２群の両方が異なる機構によって目的の分子と相互作用する、請求項８の方法。
【請求項２７】
活性化炭素が、カラム、密閉された使い捨てデバイス、カートリッジまたはカプセル中に充填される、請求項１８の方法。
【請求項２８】
活性化炭素が多孔性材料中に含浸される、請求項１８の方法。
【請求項２９】
多孔性材料が、カラム、密閉された使い捨てデバイス、カートリッジまたはカプセル内に含有される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
ＡＥＸ媒体が、１または複数のポリマー性第一級アミンまたはそのコポリマーを含む表面コーティングを有する多孔性吸着媒体である、請求項８の方法。
【請求項３１】
ＡＥＸ媒体が、１または複数のポリマー性第一級アミンまたはそのコポリマーを含む表面コーティングを有する多孔性吸着媒体である、請求項９の方法。
【請求項３２】
ＡＥＸ媒体が、１または複数の第一級、第二級、第三級および第四級アミンを含む表面コーティングを有する多孔性吸着媒体である、請求項８の方法。
【請求項３３】
ＡＥＸ媒体が、１または複数の第一級、第二級、第三級および第四級アミンを含む表面コーティングを有する多孔性吸着媒体である、請求項９の方法。
【請求項３４】
試料中の目的のタンパク質と関連する１または複数の不純物のレベルを低下させる方法であって、
下記ステップ：
（ｉ）目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、アフィニティ媒体、ＡＥＸ媒体、ＣＥＸ媒体、ＨＩＣ媒体または混合様式媒体を含む１または複数のクロマトグラフィーカラムと、目的のタンパク質が１または複数のクロマトグラフィーカラム中の媒体に結合するような条件下で接触させるステップ；
（ｉｉ）試料の第１の溶出液を取得するステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの第１の溶出液を、フロースルー様式において、（ａ）炭素質材料；および（ｂ）炭素式材料と、１または複数のアフィニティ媒体、ＣＥＸ媒体、ＡＥＸ媒体、混合様式媒体およびＨＩＣ媒体との組合せのうちの１つと接触させるステップ；ならびに
（ｉｖ）試料の第２の溶出液を取得するステップ
を含み、第２の溶出液が、第１の溶出液中の１または複数の不純物のレベルと比較して、より低いレベルの１または複数の不純物を含む、方法。
【請求項３５】
アフィニティ媒体がプロテインＡまたはプロテインＧから選択される、請求項３４の方法。
【請求項３６】
第２の溶出液が、目的のタンパク質の収率の１０％未満の損失を含む、請求項３４の方法。
【請求項３７】
目的のタンパク質および１または複数の不純物を含有する試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させる方法であって、
下記ステップ：
（ｉ）目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を、アフィニティ媒体を含むクロマトグラフィーカラムと接触させるステップ；
（ｉｉ）試料の第１の溶出液を取得するステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの第１の溶出液を、フロースルー様式において、炭素質材料と接触させるステップ；
（ｉｖ）試料の第２の溶出液を取得するステップ；
（ｖ）第２の溶出液を、陰イオン交換多孔性媒体膜吸着剤と接触させるステップ；ならびに
（ｖｉ）試料の第３の溶出液を取得するステップ
を含み、第３の溶出液が、炭素質材料が方法において用いられない場合の１または複数の不純物のレベルと比較して、より低いレベルの１または複数の不純物を含む、方法。
【請求項３８】
目的のタンパク質を含有する試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させる方法であって、
下記ステップ：
（ｉ）目的のタンパク質および１または複数の不純物を含む試料を用意するステップ；
（ｉｉ）試料を、好適な媒体と接触させて、目的のタンパク質を捕捉するステップ；
（ｉｉｉ）試料の第１の溶出液を取得するステップ；
（ｉｖ）第１の溶出液を、炭素質材料と接触させるステップ；
（ｖ）試料の第２の溶出液を取得するステップ；
（ｖｉ）第２の溶出液を、陰イオン交換媒体と接触させるステップ；ならびに
（ｖｉｉ）試料の第３の溶出液を取得するステップ
を含み、第３の溶出液が、ステップ（ｉｖ）を実施しない場合の１または複数の不純物のレベルと比較して、より低いレベルの１または複数の不純物を含む、方法。
【請求項３９】
目的のタンパク質が抗体である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３８の方法。
【請求項４１】
陰イオン交換媒体が樹脂または膜である、請求項３８の方法。
【請求項４２】
炭素質材料が活性化炭素である、請求項３８の方法。
【請求項４３】
目的のタンパク質を含む試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させる方法であって、
下記ステップ：
（ｉ）沈降、軟凝集、結晶化、可溶性小分子もしくはポリマーリガンドへの結合、または懸濁されたクロマトグラフィー媒体への結合により試料から目的のタンパク質を単離することによって、目的のタンパク質を含むタンパク質相を取得するステップ；
（ｉｉ）タンパク質相の好適なバッファー中への溶解によりタンパク質を再構成させるステップ；
（ｉｉｉ）再構成されたタンパク質を、フロースルー様式において炭素質材料と接触させるステップ；
（ｉｖ）試料の第１の溶出液を取得するステップ；
（ｖ）第１の溶出液を、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；および
（ｖｉ）試料の第２の溶出液を取得するステップ
を含み、第２の溶出液が、ステップ（ｉｉｉ）を実施しない場合の１または複数の不純物のレベルと比較して、より低いレベルの１または複数の不純物を含む、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【公開番号】特開２０１３−４４７４８（Ｐ２０１３−４４７４８Ａ）
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１７９１９７（Ｐ２０１２−１７９１９７）
【出願日】平成２４年８月１３日（２０１２．８．１３）
【出願人】（５０４１１５０１３）イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン (33)