チトクロムＰ４５０アイソフォーム３Ａ４及び３Ａ５のアッセイ
チトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）３Ａ４／５の活性及びＣＹＰ３Ａ４／５活性を阻害する又はＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導する検体の可能性を評価するための、迅速かつ高感度の放射測定を記載する。インキュベーション、生成物分離及び放射活性カウントを含むアッセイの段階は全て、好ましくはマルチウェル方式で行われ、これは自動化できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１）発明の分野
本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性及び、例えばＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤又はＣＹＰ３Ａ４／５発現の誘導剤などの、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調節する可能性を評価するためのアッセイに関する。このアッセイは、基質としての６β位においてトリチウムにより標識されたテストステロン及び、ＣＹＰ３Ａ４／５による６β位における標識テストステロンのヒドロキシル化の際に生じるトリチウム化水から標識テストステロンを分離するための、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を用いる、ＣＹＰ３Ａ４／５、ＣＹＰ３Ａ４／５を含むミクロソーム又は肝細胞を含む反応において、テストステロンの６β−ヒドロキシル化を測定することにより、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性又は発現を調べる。このアッセイは、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性及び候補薬物のＣＹＰ３Ａ４／５阻害又は誘導の可能性を評価して、さらなる開発から可能性のあるＣＹＰ阻害剤又は誘導剤を除外するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の説明
医薬品の薬物動態及び毒物動態特性は、大部分、薬物代謝酵素によるそれらの生体内変化に依存する。哺乳動物における主要な薬物代謝系はチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）であり、これは、肝臓に主に存在するミクロソーム酵素のファミリーである。複数のＣＹＰアイソフォームが、薬物、ステロイド、プロスタノイド、エイコサノイド、脂肪酸及び環境毒素を含む、内在性及び外来性の化学物質の酸化を触媒する（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ．（１９９６））。特定のＣＹＰアイソザイムにより代謝される薬物がその同じ酵素の阻害剤と同時投与されると、その薬物動態が変化し得、悪影響が生じ得る（Ｂｅｒｔｚ及びＧｒａｎｎｅｍａｎ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３２：２１０−２５８（１９９７）；Ｌｉｎ及びＬｕ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３５：３６１−３９０（１９９８）；Ｔｈｕｍｍｅｌ及びＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：３８９−４３０（１９９８）；ｖｏｎ Ｍｏｌｔｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：１１３−１２２（１９９８））。したがって、代謝阻害のためにクリアランスの変化が起きることを予想し回避できることは重要である。薬物探索プロセス中に、さらなる開発から可能性のある阻害剤を除外するために、候補薬物のＣＹＰ阻害の可能性を評価することは、製薬工業における通常業務である（Ｌｉｎ及びＬｕ，前出（１９９８）；Ｃｒｅｓｐｉ及びＳｔｒｅｓｓｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４４：３２５−３３１（２０００）；Ｂａｃｈｍａｎｎ及びＧｈｏｓｈ，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．２：２９９−３１４（２００１）；Ｒｉｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．４：４５−５４（２００１））。
【０００３】
多くのＣＹＰがまた、５０倍から１００倍以下で、生体異物により強く誘導可能である。薬物療法において、ＣＹＰ阻害に関して２つの大きな懸案事項がある。第一に、薬物代謝が向上する結果として全身的な曝露が減少することにより、誘導によって治療効果が低下し得る。第二に反応性代謝物の形成が増加する結果として、誘導によって毒性と解毒との間に望ましくない不均衡が生じ得る（Ｌｉｎ及びＬｕ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３５：３６１−３９０（１９９８））。
【０００４】
ＣＹＰ３Ａ４はヒト肝臓において最も豊富なＣＹＰであり、ヒト治療において使用される薬物の約５０％の代謝に関与する（Ｇｕｅｎｅｇｅｒｉｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９：１−１７（１９９９））。ＣＹＰ３Ａ４活性の阻害により、臨床的に重要かつ生命を脅かす可能性のある薬物相互作用が生じ得る（Ｔｈｕｍｍｅｌ及びＷｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：３８９−４３０（１９９８））。したがって、ＣＹＰ３Ａ４阻害の可能性について候補薬物を評価することは重要なこととなってきた。ＣＹＰ３Ａ４誘導は、おそらく、確認された誘導に基づく薬物−ＣＹＰ相互作用の最も重要な原因である（Ｗｈｉｔｌｏｃｋら、ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第二版）。Ｏｒｔｉｚ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｌｌｏａｎｏ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）．ｐｐ．３６７−３９０）。候補薬物は、望ましくないＣＹＰ３Ａ４誘導に基づく相互作用を誘導する可能性を有し得るので、新しい候補薬物をそれらのＣＹＰ３Ａ４誘導の可能性に関して評価することは重要なこととなっている。
【０００５】
候補薬物がＣＹＰ３Ａ４活性を阻害する可能性を調べるために、いくつかのアッセイ法が現在使用されている。これらの方法のそれぞれが相異なる長所及び短所を示す。最も広く使用されている方法は、テストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイであり、これはヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）において行われ、ＣＹＰ３Ａファミリー（ＣＹＰ３Ａ４／５）の酵素に対して特異的である（Ｗａｘｍａｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｉｐｈｙｓ．２６３：４２４−４３６（１９８８）；Ｍａｅｎｐａａら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４：６１−６７（１９９３）；Ｗａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２５：５０２−５０７（１９９７）；Ｙａｍａｚａｋｉ及びＳｈｉｍａｄａ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｉｐｈｙｓ．３４６：１６１−１６９（１９９７））。Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのレビュワーにより行われた最近の調査によると、テストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイは、新しい薬物適用のサポートにおいて最も一般的に使用されているアッセイである（Ｙｕａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６６：９−１５（１９９９）；Ｙｕａｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：１３１１−１３１９（２００２））。このアッセイによりもたらされる実用面での困難な課題は、反応産物の基質からのＨＰＬＣ分離と、それに続いてＵＶ又は質量分析検出が必要なことである。これにより、このアッセイが比較的労力及び時間を要するものとなっており、これは、産業レベルでの薬物探索設定において通常必要とされる多数の化合物のスクリーニングを行うには理想的ではない。
【０００６】
高スループットスクリーニングに使用できるいくつかの代替的アッセイが過去数年にわたり導入されてきた。これらのアッセイは、蛍光性又は放射性標識基質の使用に基づくものであり、これによりＨＰＬＣ分離を使用する必要がなくなる。おそらく、これらの中で最もうまくいったものは、基質として７−ベンジルオキシ−４−トリフルオロメチルクマリンを使用する蛍光分析によるアッセイである（Ｃｒｅｓｐｉ及びＳｔｒｅｓｓｅｒ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４４：３２５−３３１（２０００））。基質がＣＹＰ３Ａ４に特異的ではないので、この蛍光分析によるアッセイはＨＬＭを用いて行うことはできず、組み換え酵素の使用が必要である。ＣＹＰ３Ａ４特異的基質を使用し、したがってＨＬＭを用いて行うことができる代替的な蛍光分析によるアッセイが記載されている（Ｃｈａｕｒｅｔら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：２１５−２２６（１９９９）；Ｓｔｒｅｓｓｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：８４５−８５２（２００２））。これらの蛍光分析によるアッセイは迅速であり、実施が容易であり、高スループットスクリーニング及び自動化を行うことができるが、これらには多くの制限がある。第一に、試験化合物は複数のアイソザイムによる代謝に供され得、それにより基質減少又は阻害代謝産物の形成の速度が異なることになるため、ＣＹＰアイソザイム全てを含有するＨＬＭの代わりに組み換えＣＹＰを使用することにより、阻害可能性の相違が生じ得る。ＣＹＰ３Ａ４特異的基質の使用によりこの懸案事項がなくなったとしても、第二の問題は、ＣＹＰ３Ａ阻害が基質依存性であるということである。（Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：７１６−７２７（１９９９）；Ｓｔｒｅｓｓｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：１４４０−１４４８（２０００）；Ｗａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：３６０−３６６（２０００））。ＣＹＰ３Ａ４は、複数の形式及び結合部位で基質及び阻害剤に結合すると考えられている、大型の複合酵素である（Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２９：１６４４−１６５１（２００１）；Ｓｈｏｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９４：１９９−２０９（２０００）；Ｅｋｉｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２４：１６１−１６６（２００３））。結果として、古典的ではないＣＹＰ３Ａ４プローブを用いて観察される阻害的相互作用は、他の基質を用いて観察されるものを代表例するものではないであろう（Ｃｏｈｅｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１：１００５−１０１５（２００３））。最後に、ある一定のクラスの化合物によって、蛍光干渉が頻繁に観察される。
【０００７】
基質のヒドロキシル化に伴うトリチウム放出を使用して、チトクロムＰ−４５０酵素の活性が測定されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ及びＳｉｉｔｅｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５３６４−５３７２（１９７４）；Ｒｅｅｄ及びＯｈｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１６２５−１６３１（１９７６）；Ｍｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６０４９−６０５４（１９８０）；Ｍｉｙａｉｒｉ及びＦｉｓｈｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３２０−３２５（１９８５）；Ｏｓａｗａ及びＣｏｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：３５５−３６１（１９８７））。Ｄｒａｐｅｒ及び共同研究者らは、この原理を利用したＣＹＰ３Ａアッセイ手段を述べており、このアッセイでは、ＣＹＰＡ介在性の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの代謝から生じるトリチウム化水がチャコール抽出により未反応基質から分離される（Ｄｒａｐｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２６：３０５−３１２（１９９８））。
【０００８】
インビボ動物モデルは、誘導データのインビトロ／インビボ外挿に影響する因子におけるいくつかの有用な情報を提供し得るが、誘導性反応において顕著な種の相違があるため、新しい候補薬物に対するヒトＣＹＰ３Ａ４誘導の評価に対して動物モデルを使用することはできない。新しい候補薬物に対するＣＹＰ３Ａ４誘導の可能性を評価するために、肝臓スライス、不死化細胞株及び初代肝細胞を含むいくつかのインビトロモデルが確立されている（Ｓｉｌｖａら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２６：４９０−４９６（１９９８）；Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２７：８８７−８９４（１９９９）；Ｍａｕｒｅｌ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｖ．２２：１０５−１３２（１９９６）；ＬｅＣｌｕｙｓｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．１３：３４３−３６８（２００１））。これらのモデルの中で、ＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために、大学及び企業の研究所により、ヒト肝細胞の初代培養が広く使用されてきた。一般に、初代肝細胞培養は、ＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するための最も期待できるインビトロモデルであると考えられている。ヒト肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために使用されている一般的な方法は、２４時間から７８時間、リファムピシンなどの典型的な誘導剤の存在下又は非存在下で、又は試験化合物の存在下で、細胞をインキュベートすることである。次に、インタクトな細胞又は細胞から調製したミクロソームの何れかを用いて、テストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイによりＣＹＰ３Ａ４活性を調べる。試験化合物の誘導活性は通常、リファムピシンの誘導活性と比較して表される。ＣＹＰ３Ａ４により生じる代謝産物６βヒドロキシテストステロンの定量には、ＵＶ又は質量分析検出と組み合わせたＨＰＬＣ分析が必要であり、したがって、高スループットスクリーニングには理想的に適切ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の観点から、高スループットスクリーニング形式に適合し得、テストステロンなどの古典的なＣＹＰ３Ａ４基質の使用に基づく、ＣＹＰ３Ａ４活性の調節因子を同定するためのＨＰＬＣを使用しないアッセイが特に望まれよう。したがって、基質としてテストステロンを使用することに基づき、少なくとも従来のアッセイと同じ程度に高感度で特異的であり、高スループットスクリーニング形式に容易に適合させることができる、ＣＹＰ調節因子を同定するためのアッセイが依然として要求されている。肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４活性を評価するためのアッセイもまた必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の要約
本発明は、チトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）３Ａ４／５の活性及び、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性を阻害する又はＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導する可能性を評価するための、迅速かつ高感度の放射分析アッセイを提供する。このアッセイは、検体存在下での、６β位においてトリチウム標識されたテストステロンのＣＹＰ３Ａ４／５介在性６β−ヒドロキシル化において生じる［３Ｈ］Ｈ２Ｏとしてのトリチウム放出の検出に基づくものであり、ここで、肝細胞における時間経過によるトリチウム放出の増加又はＣＹＰ３Ａ４／５を含有する反応での時間経過によるトリチウム放出の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性又は発現の調節因子であることを示す。この方法により、さらに、肝細胞標本におけるＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調べることができる。従来のテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイとは異なり、本発明のアッセイは、ＨＰＬＣ分離及び質量分析を必要としない。代わりに、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を用いた固相抽出プロセスにおいて、トリチウム化テストステロンから、トリチウム化水生成物を分離する。トリチウム化テストステロンが６β位でのみ標識されている場合、分画変換速度及びアッセイ感度の両方が向上する。インキュベーション、生成物の分離及び放射活性測定を含む本アッセイの全段階が好ましくはマルチウェル形式で行われ、これは自動化できる。
【００１１】
したがって、ある実施形態において、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する水性混合液を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５活性が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、水性混合液をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に水性混合液を適用して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、水性混合液中のトリチウム標識水の量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロムＰ４５０ ３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００１２】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００１３】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含有する。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００１４】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識されている。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてのみトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する水性混合液を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５活性が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、水性混合液をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーに水性混合物を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、水性混合液中のトリチウムの量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００１６】
上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。
【００１７】
上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。
【００１８】
上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００１９】
上記の実施形態のさらなる態様において、反応混合液中にテストステロン−３−エチレンアセタール及び過酢酸をインキュベートすること；反応混合液中に生じた５α，６α−エポキシド（５α，６α−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタンヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）から５β，６β−エポキシド（５β，６β−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）を分離すること；［３Ｈ］−アルミニウムリチウムを含有するテトラヒドロフラン中で５α，６α−エポキシドをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α,１７β−ジオールを生成させること；及び酢酸の水性混合液中に［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオールをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−テストステロンを生成させること、によりテストステロンが６β位においてのみ標識される。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する水性混合液を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５活性が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、水性混合液をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；形成されるポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが加湿性とあり及び有機溶質保持において有効となるようなＮ−ビニルピロリドンに対するジビニルベンゼンの割合で、ジビニルベンゼン及びＮ−ビニルピロリドンをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーに水性混合物を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウムの量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２１】
上記の実施形態のさらなる態様において、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンは１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含み、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００２２】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識されている。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。
【００２３】
上記のさらなる実施形態において、吸着剤又は加湿性ポリマーは固相抽出カートリッジ又はカラムの内側に充てんされる。上記の何れか１つの特に好ましい実施形態において、本方法は、インキュベーションを行う第一のマルチウェルプレート、インキュベーション後にトリチウム化水から標識テストステロンを分離するための、マルチウェルプレートと同じ配列であるマルチカラムプレート及びトリチウムを測定するためにマルチカラムからカラムの空隙容量及び洗浄液を回収するための第二のマルチウェルプレートを含むマルチウェルプレート形式で行われる。
【００２４】
本発明はさらに、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているラムプレート又はカラム（テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤をその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する水性混合液を添加することと；上記のウェルのそれぞれの中の水性混合液にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位でトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各水性混合液を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウム量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２５】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００２６】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００２７】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識されている。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているカラムプレート又はカラム（形成されるポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが加湿性であり及び有機溶質保持において有効となるようなＮ−ビニルピロリドンに対するジビニルベンゼンの割合で、ジビニルベンゼン及びＮ−ビニルピロリドンをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーをその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位でトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する水性混合液を添加することと；ウェルのそれぞれの中の水性混合液にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位でトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートし（トリチウム標識水が生成する。）、場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各水性混合液を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウム量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２９】
上記の実施形態のさらなる態様において、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンは、１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含み、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３０】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。
【００３１】
本発明は、さらに、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているカラムプレート又はカラム（ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーをその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてのみトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する水性混合液を添加することと；上記のウェルのそれぞれの中の水性混合液にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位でトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各水性混合液を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウム量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム量に対する検体存在下でのトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００３２】
上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。
【００３３】
上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。
【００３４】
上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３５】
上記の実施形態及び態様の何れか１つのさらなる態様において、カラムプレートのミニカラムのそれぞれは、そこにポリマーを保持するための多孔性の手段をさらに含む。好ましい実施形態において、マルチウェルプレート及びカラムプレートのウェルはそれぞれ、９６ウェル組織培養プレートの形式を有する。
【００３６】
本発明は、さらに、ＣＹＰ３Ａ４／５、ＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；様々な時間、混合物をインキュベートすることと；混合物を希釈し、次いで希釈混合物に６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及びＮＡＤＰＨを添加することと；ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、希釈混合物をインキュベートすることと；混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に混合物を添加して、混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体が不可逆的にＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を不可逆的に阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００３７】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーはポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３８】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００３９】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。
【００４０】
上記の実施形態及び態様の何れか１つの特定の実施形態において、ＣＹＰ３Ａ４／５はミクロソームにおいて提供される。ミクロソームは、哺乳動物及び昆虫細胞からなる群から選択される細胞から生成され得、この細胞は、ＣＹＰ３Ａ４／５を発現するベクター（例えば、ウイルス又はプラスミドベクター）を含むか、又はミクロソームは、腎臓、肝臓、脳、筋肉などの細胞由来であり得る。好ましくは、ミクロソームは、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）である。ＣＹＰ３Ａ４／５源としてＨＬＭを使用する上記の実施形態及び態様の何れか１つの特定の実施形態において、酸性化及び／又は遠心により水性混合液からＨＬＭを除去する。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位においてトリチウムにより標識されたテストステロンを含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；肝細胞の培養物から培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された培地中のトリチウム量を測定することと（これは、肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４／５の相対活性を決定する。）、を含む、肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４／５の活性を決定するための方法を提供する。
【００４２】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；６β位においてトリチウムにより標識されたテストステロンを含有する第二の培地で検体を含有する培地を置き換え、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、肝細胞をインキュベートすることと（これによりトリチウム標識水が生成する。）；肝細胞の培養物から第二の培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に第二の培地を添加して、第二の培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された第二の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム標識テストステロン存在下、検体非存在下でインキュベートした肝細胞の対照培養物に対するトリチウム量の増加は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導することを示す。）、を含む、ＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導する検体を同定するための方法を提供する。好ましくは、肝細胞は、検体を含有する培地中で約２４時間から７８時間インキュベートされる。
【００４３】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位においてトリチウム標識されたテストステロン及び検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと（これによりトリチウム標識水が生成する。）；肝細胞の培養物から培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、段階の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム標識テストステロン存在下、検体非存在下でインキュベートした肝細胞の対照培養物に対するトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ３Ａ４／５活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００４４】
上記の実施形態のさらなる態様において、肝細胞の培養物はマルチウェルプレートの１以上のウェル中に提供され、吸着剤は、カラムプレートを構成する、１以上の固相抽出カートリッジ又はカラムに充てんされて提供される。
【００４５】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーはポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００４６】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００４７】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。さらなる態様において、反応混合液中でテストステロン−３−エチレンアセタール及び過酢酸をインキュベートすること；反応混合液中で生じた５α，６α−エポキシド（５α，６α−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタンヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）から５β，６β−エポキシド（５β，６β−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）を分離すること；［３Ｈ］−リチウムアルミニウムを含有するテトラヒドロフラン中で５α，６α−エポキシドをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオールを生成させること；及び酢酸の水性混合液中で［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオールをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−テストステロンを生成させることにより、テストステロンが６β位においてのみ標識される。
【００４８】
上記のさらなる実施形態において、加湿性ポリマーは、固相抽出カートリッジ又はカラムの内側に充てんされる。上記の何れか１つの特に好ましい実施形態において、本方法は、インキュベーションを行うための第一のマルチウェルプレート、インキュベーション後にトリチウム化水から標識ジクロフェナックを分離するための、マルチウェルプレートと同じ配列であるマルチカラムプレート及び、その中のトリチウムを測定するためにマルチカラムからカラムの空隙容量及び洗浄液を回収するための第二のマルチウェルプレートを含むマルチウェルプレート形式で行われる。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン」とは、６β位においてのみ標識されたテストステロン及び１、２、６β及び７位において標識されたテストステロンを指す。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「検体」という用語は、分子、化合物、化学物質、組成物、薬物などを指す。
【００５１】
本発明の詳細な説明
本発明は、チトクロムＰ−４５０アイソフォーム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）活性を評価するための、及びＣＹＰ３Ａ４活性又は発現の調節因子を同定するための、迅速かつ高感度のテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイを提供する。とりわけ、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５を含有する混合物中のＣＹＰ３Ａ４／５の活性を評価するためのアッセイを提供する。本アッセイは、可逆的阻害アッセイ及び機能ベース又は時間依存的阻害アッセイの両方を含む。混合物の例として、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）などの様々な組織からのミクロソーム；組み換えＣＹＰ３Ａ４／５を発現する発現ベクターを含有する哺乳動物又は昆虫細胞からのミクロソーム；又は肝細胞、何らかの上記混合物中で検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害する可能性及び肝細胞において検体がＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導する可能性が含まれる。好ましくは、ＣＹＰ３Ａ４／５は、ヒトＣＹＰ３Ａ４／５である。本アッセイは、検体の存在下での、ＣＹＰ３Ａ４／５が介在する、６β位においてトリチウム標識されたテストステロンの６β−ヒドロキシル化において生じる［３Ｈ］−Ｈ２Ｏとしてのトリチウムの放出を検出することに基づき、本アッセイにおいて、時間経過による放出の増減は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の調節因子であることを示す。例えば、検体存在下でのＨＬＭ中のトリチウム放出の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤であることを示し、一方、検体での肝細胞処理後の肝細胞におけるトリチウム放出の増加は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の誘導剤であることを示す。吸着剤を用いて固相抽出プロセスにおいてトリチウム化テストステロンからトリチウム化水生成物を分離する。この吸着剤は、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する基材を含む。インキュベーション、生成物分離及び放射活性カウントを含むアッセイの全段階をマルチウェル形式で行い、これは自動化することができる。
【００５２】
ある態様において肝細胞を用いてＣＹＰ３Ａ４／５の活性を誘導又は阻害する検体を同定するための実施形態により、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードする遺伝子の発現を阻害又は誘導する検体、即ち、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードする遺伝子の転写に影響を与える検体が同定される。別の態様における実施形態によって、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードするｍＲＮＡの転写後プロセシングに影響を与えることによりＣＹＰ３Ａ４／５活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。さらなる態様における実施形態によって、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードするｍＲＮＡの翻訳に影響を与えることによりＣＹＰ３Ａ４／５活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。さらなる態様における実施形態によって、ＣＹＰ３Ａ４／５と直接又は間接的に相互作用することによりＣＹＰ３Ａ４／５活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。
【００５３】
ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を評価するための実施形態は、例えば新しい化学物質を用いて代謝安定性試験を行うためのこれらの肝細胞を使用する前など、市販のバッチの肝細胞の活性又は研究室内で単離された肝細胞の質を調整するために有用である。ＣＹＰ３Ａ４調節因子を同定するための実施形態は、さらなる開発から強力な阻害剤又は誘導剤である候補薬物を排除するために、候補薬物の潜在的なＣＹＰ３Ａ４／５阻害又は誘導を評価するのに有用である。何れかの実施形態において、本発明は、検体のＣＹＰ３Ａ４／５阻害又は誘導の可能性を評価するためにＨＰＬＣ分離及び質量分析に依存する先行技術のアッセイよりも重要である。
【００５４】
本アッセイは本明細書中でＨＬＭ又は肝細胞を用いて説明されるが、本アッセイは、精製組み換えＣＹＰ３Ａ４／５又は、例えば腎臓、腸、肺などの他の組織から分離されたミクロソーム又はミクロソームを含有するその他の細胞内分画を使用し得る。ＣＹＰ３Ａ４／５、好ましくはヒトＣＹＰ３Ａ４／５を発現する、プラスミド又はウイルスベクターを含有する哺乳動物細胞からミクロソームを調製することができる。ミクロソームは、ＣＹＰ３Ａ４／５及びＰ４５０レダクターゼを発現する組み換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞由来であり得る。組み換えＣＹＰ３Ａ４／５を発現する細胞の長所は、ＣＹＰ３Ａ４／５が、これらのミクロソームにおいて存在する唯一のチトクロムＰ４５０であり、通常は比活性がより高いことである。組み換えＣＹＰ３Ａ４を用いたアッセイに対する濃度範囲は約１から１００ｐｍｏｌ／ｍＬであり、好ましい濃度は、約５から５０ｐｍｏｌ／ｍＬの間である。時間依存的アッセイの場合、酵素は５から１０倍高いものであるべきである（第二のインキュベーションにおける最終希釈のため。）。
【００５５】
ＣＹＰ３Ａ４／５の活性の阻害について検体を試験するために、ＣＹＰ３Ａ４／５活性における阻害効果について試験すべき検体、基質プローブとしての６β位においてトリチウム標識されたテストステロン、適切な基質濃度を与えるための非標識テストステロン、プールしたＨＬＭ及び生理的ｐＨの緩衝液を含む水性混合液を含有する第一の容器を提供する。通常、トリチウム標識テストステロンの約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍの間を使用し、好ましくは、標識テストステロンは約１，０００，０００ｄｐｍである。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６ベータ位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から２００，０００ｄｐｍの間で使用することができる。非標識テストステロンの量は、約１から１００μＭの間、通常は約６０μＭである。プールされたＨＬＭは、一般に約０．０５から２ｍｇ／ｍＬ、通常約０．２５ｍｇ／ｍＬである。適切な緩衝液の例は、０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．６である。最終体積は、好ましくは約１００μＬから２００μＬの間である。好ましくは、検体に対して使用されるビヒクルの当量を含有する対照を提供する。
【００５６】
通常、１、２、６及び７位でトリチウム標識された市販のテストステロンを基質プローブとして用いてアッセイを行うことができる一方、好ましい基質プローブは、６β位においてのみトリチウム標識されたテストステロンである。６β位においてのみ標識されたトリチウム化テストステロンを本アッセイで使用する場合、分画変換速度及びアッセイの感度の両方が向上する。さらに、１、２、６及び７位において標識された市販のテストステロンを用いた反応は好ましくは約２００μＬの体積で行われるが、一方、６β位においてのみ標識されたテストステロンを用いた反応は、約１００μＬの体積で行うことができる。［６β−３Ｈ］−テストステロンの合成は、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８０：４７１７−４７２１（１９５８））、Ｔｏｆｔら（Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，９：４１３（１９７３））及びＬｉｓｔｏｎ及びＴｏｆｔ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３４：２２８８（１９６９））により、及び実施例１で述べられている。
【００５７】
３７℃にて数分間緩衝液中でミクロソームの好ましいインキュベーション段階を行った後、約５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、約３ｍＭ ＭｇＣｌ２及び約１ユニット／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有するＮＡＤＰＨ再生系あり又は無しで、約１ｍＭ ＮＡＤＰＨを水性混合液に添加して反応混合物を形成し、次いでこれをテストステロンの６βヒドロキシル化が可能となるのに十分な時間、３７℃でインキュベートする。通常、約１０分間という時間は、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を検出するのに一般に十分である。場合によっては、様々な時間の長さで複数のアッセイを行う。次に、約０．１Ｎの濃度のＨＣｌなどの酸を添加することにより、反応混合物を反応停止させる。好ましくは、トリチウム化テストステロンからトリチウム化水を分離するための抽出カートリッジ又はカラムに反応混合物を移す前に、水性混合液からＨＬＭを除去する。ろ過、遠心分離などにより、水層からＨＬＭを除去することができる。好ましい実施形態において、遠心分離によりＨＬＭを除去する。反応の酸性化によりＨＬＭにおけるタンパク質が沈殿するので、低速遠心分離を用いてＨＬＭのタンパク質を除去することができる。
【００５８】
テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに、ＨＬＭが除去された水性混合液又はＨＬＭを含有する反応混合物を移す。カラムからの、空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水がないか、又は陽性対照においてトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が減少していることは、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤であることを示す。
【００５９】
肝組織からの肝細胞の調製物のＣＹＰ３Ａ４／５活性を次のように調べる。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。培地中、又は肝細胞を培養するのに適切な水性混合液中で、５％ＣＯ２及び９５％空気又は酸素の加湿環境中で３７℃において肝細胞を維持する（例えば、Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐｏｌｌａｎｄ及びＷａｌｋｅｒ編）ｐｐ．１６１−１７６、Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９８９））を参照のこと。）。懸濁液中又は細胞培養プレートに接着した培養細胞においての何れかの細胞を用いてアッセイを行うことができる。懸濁液アッセイの場合、通常、約１ｘ１０５個の細胞／ｍＬから約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度、好ましくは約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度で肝細胞をインキュベートする。したがって、各培養ウェルは、約１ｘ１０６個の細胞、肝細胞培地（ＨＣＭ）１ｍＬ（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、前出）、非標識テストステロン及びトリチウム標識テストステロンを含有する。通常、約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍの間のトリチウム標識テストステロンを使用する。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６β位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から５００，０００ｄｐｍの間であり得る。非標識テストステロンの量は、約１から２００μＭの間、通常は約６０から２００μＭの間である。プレーティングされた細胞においてアッセイを行う場合、組織培養プレートに肝細胞をプレーティングし（好ましくは、培養プレートはコラーゲン被覆した２４又は９６ウェル組織培養プレートである。）、新鮮な肝細胞の培養に適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境において３７℃にて維持する。好ましくは、培地にＩＴＳを添加する。通常、約１５０，０００から２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞をプレーティングする。
【００６０】
インキュベーション後、例えば遠心分離によりインキュベーション液を細胞から除去し、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で数回洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。生成したトリチウム化水の量により、肝細胞の相対的ＣＹＰ３Ａ４／５活性が決定される。
【００６１】
検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性を阻害する能力を調べるためのアッセイは次の通りである。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。懸濁液中又は細胞培養プレートに接着した培養細胞においての何れかの細胞を用いてアッセイを行うことができる。懸濁液アッセイの場合、上記のように肝細胞を培養するのに適切な培地中で５％ＣＯ２の加湿環境中で３７℃にて肝細胞を維持する。通常、肝細胞は、１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度でインキュベートする。非懸濁液アッセイの場合、コラーゲン被覆したプレートに肝細胞をプレーティングし、肝細胞を培養するのに適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境中で３７℃にて維持する。したがって、各培養ウェルは、約１ｘ１０６個の細胞、ＨＣＭ １ｍＬ、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性における阻害効果について試験すべき検体、非標識テストステロン及びトリチウム標識テストステロンを含有する。通常、トリチウム標識テストステロン約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍを使用する。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６β位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から５００，０００ｄｐｍであり得る。非標識テストステロンの量は、約１から２００μＭ、通常は約６０から２００μＭの間である。好ましくは、検体に対するビヒクル又はケトコナゾールなどのＣＹＰ３Ａ４阻害剤を含む対照を提供する。
【００６２】
インキュベーション後、細胞からインキュベーション液を除去し、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で数回洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水がない、又はビヒクルのみを含有する対照におけるトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が減少していることは、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤であることを示す。
【００６３】
検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性を誘導する能力を調べるためのアッセイは次の通りである。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。組織培養プレートに肝細胞をプレーティングし（好ましくは、培養プレートはコラーゲン被覆した２４又は９６ウェル組織培養プレートである。）、新鮮な肝細胞の培養に適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境において３７℃にて維持する。好ましくは、培地にＩＴＳを添加する。通常、肝細胞を約１５０，０００から２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングする。２４時間から７８時間後、培地を除去し、新鮮な培地及び、誘導の可能性についての試験を行う検体を肝細胞に添加する。好ましくは、検体に対するビヒクル又はリファムピシンなどの公知の誘導剤の何れかを含有する対照を提供する。上記のようにＣＹＰ３Ａ４／５の誘導に十分な時間（通常は約２４時間から７８時間）、肝細胞をインキュベートした後、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性を調べる。
【００６４】
生理的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）の緩衝液を含有する平衡塩類溶液を含有するインキュベーション液中で肝細胞をインキュベートする。平衡塩類溶液の例は、Ｈａｎｋ’平衡塩類溶液であり、適切な緩衝液の例は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳである。次に、非標識テストステロン及びトリチウム標識テストステロンを含有する混合液を添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を評価するのに適切な時間（約１時間）上述のように肝細胞をインキュベートするが、一般に約１時間は十分な時間である。通常、トリチウム標識テストステロン約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍ／ｍＬを使用し、好ましくは、標識テストステロンは約１，０００，０００ｄｐｍ／ｍＬである。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６β位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から５００，０００ｄｐｍ／ｍＬの間で使用することができる。非標識テストステロンの量は約１から３００μＭの間であり、通常約６０μＭである。場合によっては、平行したインキュベーションを行うが、これは、検出された酵素活性が特異的にＣＹＰ３Ａ４／５により媒介されることを確認するために、ＣＹＰ３Ａ４阻害剤ケトコナゾールを含有する。
【００６５】
インキュベーション後、インキュベーション液を細胞から除去し、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する、抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水が存在すること、又はビヒクルのみを含有する対照におけるトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が増加していることは、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の誘導剤であることを示す。
【００６６】
下記で考察し、本発明の好ましい態様において実施例１で示すように、マルチウェル形式、好ましくは９６ウェル形式で本アッセイを行う。マルチウェル形式により複数の検体を同時に試験できるようになる。マルチウェル形式において、マルチウェルプレートのウェル（第一の容器）中で各反応を行う。反応終了時及びＨＬＭを除去する任意の段階後のトリチウム化テストステロンからのトリチウム化水の分離は、複数の小型カラム（それぞれが本明細書中で開示する吸着剤を含有する。）を含む精密ろ過／抽出カラムプレートの個々のカラムに各反応液を添加することにより行う。好ましくは、精密ろ過／抽出カラムプレートのカラムはマルチウェルプレートに対するものと同じように配置する。精密ろ過／抽出カラムプレートと同じ形式である第二のマルチウェルプレートで空隙容積及び洗浄液を回収し、シンチレーション液と混合し、マルチウェル形式中の試料をカウントするために適合させたシンチレーションカウンターにおいてカウントする。
【００６７】
吸着剤はテストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する、すなわち、吸着剤は標識テストステロンに吸着又は結合することができるが、ヒドロキシル化により生成した標識水には吸着又は結合しない。テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤としては、以下に限定されないが、ポリスチレン−ジビニルベンゼン又はポリ（ジビニル−ベンゼン−ビニルピロリドン）などの疎水性又は脂溶性ポリマーを含有する吸着剤、吸着剤が標識テストステロンに結合するがトリチウム化水に結合しないことを可能にするような比で脂溶性及び親水性モノマーを含有する加湿性ポリマー及びＣ２−Ｃ１８シランなどのシリコンベースの吸着剤が挙げられる。
【００６８】
加湿性ポリマーを含有する吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される。脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン及びＣ２−Ｃ１８−アルキル基などの脂溶性部分を含み得る。特に有用な脂溶性モノマーとしては、ジビニルベンゼン及びスチレンが挙げられる。親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基（例えば、ピロリドニル基又はピリジル基）などの親水性部分を含み得る。あるいは、親水性基はエーテル基であり得る。特に有用なモノマーとしては、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン及びエチレンオキシドが挙げられる。加湿性ポリマーのある実施形態において、ポリマーは、１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含む、好ましくは、約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーである。好ましい加湿性ポリマーの例は、ＷＯ９７３８７７４及び米国特許第６，７２６，８４２号（両方ともＢｏｕｖｉｅｒらに対するものである。）で開示されている。好ましい吸着剤はＯＡＳＩＳ ＨＬＢ吸着剤であり、これは、Ｎ−ビニルピロリドンとジビニルベンゼンモノマーとの調和の取れた割合を含み、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）から市販されている。
【００６９】
シリコンベースの基材又はマトリクスを含有する吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。吸着剤は、非極性化合物を抽出することが当技術分野で周知の１以上のシランを含み得る。このような吸着剤としては、以下に限定されないが、フェニルシラン、ブチルジメチルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン又はオクタデシルシランが挙げられる。シランは、単官能性又は三官能性であり得る。シリカ基材又はマトリクスとしては、以下に限定されないが、固体もしくは多孔性シリカ又はセラミック粒子又は微粒子又はシリカゲルが挙げられる。
【００７０】
本方法の好ましい実施形態において、吸着剤は、固相抽出カートリッジ又はカラムを形成するように開口容器中に充てんされた、粒子、ビーズなどとして提供される。本発明の特定の実施形態において、吸着剤は、多孔性膜に捕捉された、固相抽出カートリッジ又はカラムに充てんされる。他の実施形態において、固相抽出カートリッジ又はカラムはさらに、吸着剤に隣接した固相抽出カートリッジ又はカラムの片端もしくは両端で、又はその付近で、フィルター成分などの多孔性の保持手段又はガラス原料を含む。多孔性保持手段は、固相抽出カートリッジ又はカラム内に吸着剤を保持するためである。さらなる実施形態において、一対の多孔性保持手段の間に吸着剤を配置するが、第一の多孔性保持手段は固相抽出カートリッジ又はカラム内で吸着剤を保持し、第二の保持手段はまた、カラム中の吸着剤の保持を補助し、ＨＬＭなどの固体材料が吸着剤と混合されるのを防ぐ。フィルター又は硝子材料は、例えば、フリット硝子又は多孔性ポリマー、例えば高密度ポリエチレン、ＴＥＦＬＯＮ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＤＥ）又はポリカーボネートなどである。
【００７１】
図１は、本発明の方法の実施に適切な固相抽出カートリッジ又はカラム１０の例の横断面図を示す。カラム１０は、壁１４を有する伸長体１２（これは、軸方向の空洞部１６を規定する。）、水性混合液を受容するための、カラム１０の遠位端２０のインレット１８及び、水性混合液を排出するための、カラム１０の近位端２４のアウトレット２２から構成される。図１でさらに示されるように、近位端２４に多孔性保持手段２６が隣接し、これは面２８を有する。多孔性保持手段２６は、面２８がカラム１０の壁１４に垂直であるように、カラム１０において近位端２４に隣接して位置する。多孔性保持手段２６の面２８には吸着剤３０が配置される。場合によっては、示されるように、第二の多孔性保持手段３２が、遠位端２０に隣接して、もしくはその付近に位置し得、吸着剤３０はそれらの間に配置され得る。カラム１０は、水性混合液がインレット１８を介して容器に入り、カラム１０内で吸着剤３０に接触し、アウトレット２２を介してカラム１０から排出されることを可能にする。好ましくは、吸着剤３０は、好ましくは直径が約３０から６０μｍであるビーズなどの小粒子としてカラム１０中に充てんされる。
【００７２】
好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニングに特に適切な形式を与えるために、複数のカラム１０を配置する。例えば、固相抽出カートリッジ又はカラム（好ましくは、小型固相抽出カートリッジ又はカラム、つまり、ミニカラム）を与えるために、複数のウェルを含む、マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレートを適合させた。好ましいマルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレート形式では、マルチウェル組織培養プレートに対して使用される形式に対応する形式でミニカラムが配置される。例えば、精密ろ過／抽出カラムプレートのミニカラムは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル又は３８４ウェル形式で配置することができる。好ましい実施形態において、マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレートでは、９６ウェル形式でミニカラムが配置される。例として、図２は、水性混合液を受容するための開口部１４と水性混合液を排出するためのアウトレット１０６とを有する複数のミニカラム１０２を含むマルチカラム精密ろ過／抽出プレート１００を示し、ここで、ミニカラム１０２のそれぞれは、９６−ミニカラム形式で並べられた図２のカラム１０に対して示されるものと同様の内部配置を含む。遠心分離又は減圧により、このカラムを介して、９６ウェル形式で配置されたウェルを含有する回収プレートへの水性混合液の移動が達成され得る。マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレート及び、このプレートを使用するための方法ならびに装置は、多くの米国特許、例えば、米国特許第６，５０６，３４３号（Ｂｏｄｎｅｒらに対する。）、同第６，４９１，８７３号（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＷｏｅｌｋに対する。）及び同第６，３３８，８０２号（Ｂｏｄｎｅｒらに対する。）及び米国公開特許出願第２００３０１４３１２４号（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＧｒｅｎｚに対する。）で開示されている。
【００７３】
ＣＹＰの可逆的阻害に加えて、ある種の検体又はそれらのＣＹＰにより生成された代謝産物による不可逆的又は見かけ上不可逆的な不活性化が起こり得る。このタイプの阻害、作用機序に基づく又は時間依存的阻害（ＭＢＩ）と呼ばれるもの、は、阻害剤存在下で酵素活性が進行性に時間依存的低下を示すことを特徴とする。ＣＹＰの３種類の作用機序に基づく（時間依存的）不活性化が報告されている：（ｉ）阻害剤が酵素アポタンパク質に共有結合する；（ｉｉ）阻害剤が合成ヘムに共有結合する；（ｉｉｉ）阻害剤がきつく（見かけ上不可逆的に）ヘム又はアポタンパク質に結合する。ＣＹＰ３Ａ４／５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｅ１を含む殆どのヒト肝臓薬物代謝ＣＹＰは、作用機序に基づく阻害（ＭＢＩ）にさらされる（Ｚｈａｎｇ及びＷｏｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．６：２４１−２５７（２００５）；Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．４：４２３−４５９（２００３）；Ｚｈｏｕら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．５：４１５−４４２（２００４）；Ｚｈｏｕら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４：２７９−３０４（２００５））。
【００７４】
インビボでの影響が必ずしも明らかではない可逆的ＣＹＰ阻害に対して、ＭＢＩは殆ど常に、臨床的に関心のある薬物−薬物相互作用を導く。実際に、ＭＢＩは、臨床的な薬物−薬物相互作用に対する主要な原因の１つと現在では考えられていおり、過去において潜在的に見過ごされてきた。
【００７５】
ＭＢＩが活性酵素の時間依存的喪失を導くので、同じＣＹＰにより代謝される薬物の薬物動態における時間依存的ＣＹＰ阻害剤の臨床的影響は次の通りである。
・ＭＢＩは、連続投与において非定常のＰＫを引き起こす。
・薬物−薬物相互作用の程度は発現及び消失において時間依存的である。
・腸管腔で阻害剤が高濃度であると、基質において顕著な影響が生じ、腸代謝によりその経口でのバイオアベイラビリティーが制限される。
【００７６】
ＣＹＰ３Ａ４は、主要な肝臓及び腸ＣＹＰの１つであり、臨床で使用される薬物の５０％超の代謝に関与する。ＣＹＰ３Ａ４の時間依存的阻害剤としては、カルシウムチャネルブロッカーベラパミル、ニカルジピン、ジルチアゼム及びミベフラジル；抗プロゲスチン剤ミフェプリストン；マクロライド系抗生物質トロレアンドマイシン、エリスロマイシン及びクラリスロマイシン；及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤リトナビル及びネルフィナビルが挙げられる。
【００７７】
したがって、本発明はまた、上述の、可逆的又は見かけ上可逆的なアッセイに加えて、作用機序に基づくアッセイ又は時間依存的アッセイも提供する。化合物が時間依存的ＣＹＰ阻害剤として作用する可能性を評価するために、一連の様々な長さの時間（通常、０分から６０分間）、ＮＡＤＰＨ再生系存在下で、検体をＣＹＰ３Ａ４／５とともにプレインキュベートする。一般に、可逆的阻害アッセイにおいて使用される量よりも約５から１０倍多い量でＣＹＰ３Ａ４／５を提供する。温度不安定性による酵素活性の喪失を監視するために、阻害剤非存在下で対照インキュベーションを行う。プレインキュベーション終了時に、時間０のプレインキュベーション時間対照に対する、酵素的に活性なＣＹＰの量の変化を調べる。プレインキュベーションが約１０倍希釈され、基質が添加される第二のインキュベーションを行うことにより、これを遂行する。特定の時間間隔の間に形成される生成物の量を測定することにより、酵素活性を求める。時間依存的ＣＹＰ阻害アッセイに使用される通常の基質は、上記可逆的阻害アッセイに対して使用されるものと同じである。例えば、テストステロンとのＣＹＰ３Ａ４／５に対するＫｍは約５０μＭであり、テストステロンの好ましい濃度は、約２００から５００μＭの間である。実施例４は、ＨＬＭを用いた時間依存的アッセイの例を提供する。
【００７８】
第二のインキュベーションにおける試験検体により生じる何らかの可逆的ＣＹＰ阻害効果を最小限に抑えるために、プレインキュベーション混合液を数倍希釈（通常、５−２０倍）し、半最大活性に必要とされる濃度より数倍（通常、５−１０倍）高い濃度でＣＹＰ基質を添加し（試験化合物による競合的阻害を最小限に抑えるために。）、インキュベーション時間を短くする（通常１０分間）。検体が時間依存的阻害剤として作用する場合、ＣＹＰとのプレインキュベーションは、擬一次反応速度式による酵素活性の喪失を引き起こす。各阻害剤濃度に対して、残存酵素活性の％（阻害剤なしの対照に対して。）は、次の式に従い時間とともに変化する。
【００７９】
【数１】
（式中、ｋは、実測の擬一次不活性化速度定数であり、これは、次の関係に従いプレインキュベーション中の阻害剤濃度に関連する。
【００８０】
【数２】
（式中、Ｉは阻害剤濃度であり、ｋｉｎａｃｔは最大不活性化速度定数であり、Ｋ０．５は、５０％ｋｉｎａｃｔでの阻害剤濃度であり、ｎはＨｉｌｌ係数である。））ｋｉｎａｃｔ及びＫ０．５を求めるために、非線形回帰分析を用い、Ｉに対するｋの曲線を数式２にフィットさせる。
【００８１】
次の実施例は、本発明のさらなる理解を促すものである。
【実施例１】
【００８２】
この実施例は、本発明のアッセイの開発及びＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤を同定するためのその使用を説明する。
【００８３】
［６β−３Ｈ］−テストステロンの合成。［６β−３Ｈ］−テストステロンの合成は次の通りである。
【００８４】
【化１】
【００８５】
クロロホルム１４ｍＬ中のテストステロン−３−エチレンアセタール（１、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩより入手。）０．８５ｇの撹拌溶液に、氷−塩浴で冷却しながら、酢酸ナトリウム０．１ｇ及び過酢酸（３６％）１ｍＬを添加した。２時間後、最初に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５ｍＬ）、次いで水（２ｘ５ｍＬ）で溶液を洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（６０ｇ、シリカゲル、溶出液としてヘキサン：アセトン）を用いることにより、形成された５β，６β−エポキシド（５β，６β−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール；２）及び５α，６α−エポキシド（５α，６α−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール；３）（本反応で精製させた。）を互いに分離した。５α，６α−エポキシド（３）を含有する分画を回収し、蒸発乾固し、生成物３３０ｍｇを得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）＋３４９（１００％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）Ｌｉｓｔｏｎ及びＴｏｆｔ，前出を参照のこと。）。
【００８６】
【化２】
【００８７】
［３Ｈ］−水素化アルミニウムリチウム（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手した、ＬＡＴ、１００ｍＣｉ）とともに１時間、窒素雰囲気下で撹拌しながら、無水テトラヒドロフラン（２ｍＬ）中の５α，６α−エポキシ（３、３.４８ｍｇ）を還流下で加熱し、［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α,１７β−ジオール（４）を生成させた。１％水酸化ナトリウム水溶液を用いて反応混合物の反応を停止させ、エーテル（１０ｍＬ）で希釈し、水（２ｘ５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発乾固し、さらなる精製を行わずに残渣を次の反応に対して使用した（全放射能２０ｍＣｉ）。
【００８８】
【化３】
【００８９】
［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオール（４、２０ｍＣｉ）を酢酸（０．１５０ｍＬ）及び水（０．０５ｍＬ）の混合液とともに１００℃で１５分間加熱した。溶液を室温に冷却し、エーテル（２ｘ１０ｍＬ）で抽出した。有機層を重炭酸ナトリウム飽和溶液（５ｍＬ）、水（２ｘ５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗製生成物（５、１０ｍＣｉ）をメタノール（５ｍＬ）、水（２ｍＬ）中で溶解させ、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（０．１ｍＬ）で処理した。溶液を室温にて１６時間撹拌し、次いで酢酸（０．１ｍＬ）で処理した。ロータリーエバポレーターで溶液を半分の体積まで蒸発させた。逆相ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ フェニルヘキシルカラム、０．１％ＴＦＡ含有の水：アセトニトリル、５５：４５、ＵＶは２５４ｎｍ、流速４ｍＬ／分）、保持時間は１０．５分であった。）により粗製生成物を精製した。合わせた分画をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８に通し、エタノール（１０ｍＬ）でさらに洗浄し、［６β−３Ｈ］−テストステロン（６）２．２ｍＣｉを得た。比放射能は、ＬＣ／ＭＳにより計算したところ１．６Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。
【００９０】
トリチウムＮＭＲにより、トリチウム標識の位置がテストステロンの６β位にあることが確認された。ＬＣ／ＭＳ２８９（ＭＨ）＋、２９０（ＭＨ＋１）＋、２９１（ＭＨ＋２）＋。プロトンＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３，δ）０．７９（３Ｈ、ｓ １８−Ｈ３）、１．２（３Ｈ，ｓ，１８−Ｈ３）、５．７３（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ）。トリチウムＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３，δ）２．１（１ Ｔ，ｓ，６β−トリチウム）。
【００９１】
［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの精製。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを購入した。極性不純物を除去するために、市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの一定分量（約０．１ｍＣｉ）を真空下で乾燥させ、水で再構成し、３０ｍｇＷａｔｅｒｓ ＯＡＳＩＳ抽出カートリッジ（製造者の説明書に従い前もって調整した。）に載せた。ＯＡＳＩＳ抽出カートリッジは、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）から購入した。水５ｍＬで洗浄した後、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンをメタノール２ｍＬで溶出し、再び乾燥させ、エタノール中で再構成した（元の一定分量と同体積）。
【００９２】
［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた放射分析ＣＹＰ３Ａ４アッセイ。２００μＬの最終体積中に精製［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロントレーサー（０．２から０．５μＣｉ）、非標識テストステロン（６０μＭ、別段の指示がある場合を除く。）、プールしたヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）（０．２５ｍｇ／ｍＬ、別段の指示がある場合を除く。）及び０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．６を含有する９６ウェルコニカルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡより入手可能）中で反応を行った。プールしたＨＬＭは、Ｇｅｎｔｅｓｔ Ｃｏｒｐ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手した。ＤＭＳＯ中の保存溶液から、阻害剤を反応混合物に添加し、最終溶媒濃度を０．６％（ｖ／ｖ）とした。阻害剤なしの対照はビヒクル当量を含有した。３７℃にて１０分間のプレインキュベーション後、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ及び、５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、３ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１Ｕ／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有するＮＡＤＰＨ再生系を添加することにより、反応を開始させた。３７℃にて１０分間アッセイを行い、０．１Ｎの最終濃度になるようにＨＣｌを添加することにより反応停止させた。次に、マイクロプレートローターにおいてプレートを１０分間遠心分離し、前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳ９６ウェルＨＬＢプレートのウェルに上清を載せた。ＯＡＳＩＳ吸着剤１０又は３０ｍｇを含有するＯＡＳＩＳ ＨＬＢ９６ウェル抽出プレート及び真空マニホールドはＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．から購入した。真空にして、空隙容積を回収プレートで回収した。次に、水２００μＬを添加し、再び真空にして、同じプレートで洗浄液を回収した。この段階を繰り返した。プールした空隙容積及び水洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、β−シンチレーションカウンタ中でカウントした。あるいは、ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて２４ウェルシンチレーションプレート中で一定分量に対してカウントした。酵素活性の計算のために、ＮＡＤＰＨ再生系なしで行った対照インキュベーションで得られたカウントを差し引くことにより、生成物カウントを補正した。
【００９３】
［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた放射分析ＣＹＰ３Ａ４アッセイ。アッセイ手段は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンヒドロキシル化アッセイと同様であるが次の改変がある。
【００９４】
全放射能は１００，０００から２００，０００ｄｐｍであり、反応体積は１００μＬであり、溶媒濃度（阻害剤保存溶液由来）は０．３から０．７％ＤＭＳＯ及び０．５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）であった。１０ｍｇＯＡＳＩＳ９６ウェルＨＬＢプレートを用いて生成物分離を行った。空隙容積を回収し、７５μＬ水洗浄液と合わせた。Ｂｅｃｋｍａｎ βシンチレーションカウンタを用いて放射活性を調べるか、又は、ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンタを用いて９６ウェルシンチレーションプレート中で１２０μＬの一定分量に対してカウントを行うことにより、放射活性を調べた。
【００９５】
６β−ヒドロキシテストステロン及び２β−ヒドロキシテストステロンの定量。ＣＴＣＡｎａｌｙｔｉｃｓ ＰＡＬ自動サンプラー（ＨＴＳ ＰＡＬ；ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＨＰＬＣにより、アッセイ反応混合物の一定分量及び代謝産物の一定分量の標準曲線を分析した。ＸＴＥＲＲＡ ＭＳ Ｃ１８カラム（４．６ｍＭｘ５ｃｍ；５μｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）において、１ｍＬ／分の流速で、水中０．１％ギ酸（Ａ）及びアセトニトリル中０．１％ギ酸（Ｂ）（５から１００％Ｂの４分間の直線的勾配；１００％Ｂで２分間。）からなる移動相を用いてクロマトグラフィーを行った。最初の１分間、溶離液を捨て、次いで、陽イオンモードで操作されるＴｕｒｂｏ Ｉｏｎｓｐｒａｙイオン化ソースを備えたＳｃｉｅｘ ＡＰＩ−２０００トリプレット四極子質量分析装置に送った。スプレー電圧は５５００Ｖであり、ソース温度は４５℃であり、カーテンガス設定は１０であり、クラスタ分離電位は６０Ｖであり、フォーカシング電位は２５０Ｖであり、衝突エネルギーは２５Ｖであった。代謝産物を検出し、遷移ｍ／ｚ３０５．０から２６９．１により同定した。Ａｎａｌｙｓｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄソフトウェアバージョン１．４を用いて、標準曲線のそれに対するピーク領域比の加重線形最小二乗回帰分析により、代謝産物濃度を調べた。
【００９６】
トリチウム動的同位体効果の決定。次の式（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８７：６０７−６２５（１９８２））に従い、Ｖ／Ｋ比に対する、ＴＶ／Ｋ、動的同位体効果を調べた：
【００９７】
【数３】
（式中、ｆは生成物に対する基質の分画変換であり、ＳＡ０は標識基質の最初の比放射能であり、ＳＡＰは生成物の比放射能である。）。本実験において観察されるもののようなｆ（＜５％）の低値において、この式は、次の式に変形される（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８７：６０７−６２５（１９８２））：
【００９８】
【数４】
【００９９】
トレーサー競合実験からの非標識生成物の見かけの形成速度の計算。［６β−３Ｈ］−テストステロンの固定量及び非標識テストステロンの様々な濃度を用いてアッセイを行う場合、非標識生成物の形成速度ｖは、次式により与えられる：
【０１００】
【数５】
（式中、ｖ＊はトリチウム化水の形成速度である。）。式４から差し引くことにより、
【０１０１】
【数６】
を得て、動的同位体効果で割った非標識生成物の形成速度としてｖ’を定義し、つまり、
【０１０２】
【数７】
であり、次式：
【０１０３】
【数８】
を得る。既知のＴＶ／Ｋ比（これは、ＳＡｐ由来であったため、同語を繰り返すことになる。）を用いずに、ｖ’、非標識生成物の見かけの形成速度を計算できる。基質濃度、Ｓに対してプロットし、Ｈｉｌｌの式へフィットさせた場合（式９）、Ｖ’ｍａｘ、Ｓ５０、５０％での基質濃度及びｎ、Ｈｉｌｌ係数を導き出すことができる。
【０１０４】
【数９】
（式中、
【０１０５】
【数１０】
つまり、生成物形成の見かけの最大速度である。
【０１０６】
曲線のフィッティング。ＸＬＦＩＴ４．０（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を用いて、非線形回帰により、Ｈｉｌｌの式又は４パラメーターロジスティック阻害モデル（Ｒｏｄｂａｒｄ及びＦｒａｚｉｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７：３−２２（１９７５））への曲線のフィッティングを行った。
【０１０７】
結果
９６ウェル固相抽出プレートを用いた放射性標識テストステロン及び［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの分離。１０ｍｇ又は３０ｍｇＯＡＳＩＳ吸着剤を含有する９６ウェル抽出プレートに、精製［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン（１０４から１０７ｄｐｍ）を含有するアッセイ緩衝液の溶液及び停止溶液を載せた場合、９９．９％を超える放射活性がプレートに保持された。放射活性の０．０４５±０．００６％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝７）のみが合わせた空隙容積及び水性洗浄液において溶出された。［６β−３Ｈ］−テストステロンの場合、放射活性の０．１３±０．１％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）が水性分画において溶出された。メタノールで溶出することにより、標識テストステロンを回収できた。標識テストステロンとは異なり、［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ（１０２から１０５ｄｐｍ）は同じ条件下で保持されなかった。１０ｍｇ及び３０ｍｇプレートの両方で、１００μＬ又は４００μＬの水による洗浄後の合わせた空隙容積中で溶出された［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの回収は定量的であった（９４±６％、平均±ＳＤ、ｎ＝６）。放射性標識テストステロン及び水の回収は、６００μＭ以下の濃度の非標識テストステロンの存在によって影響を受けなかった。時間的理由のために、それぞれ、３０ｍｇ及び１０ｍｇＯＡＳＩＳプレートを用いて、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた実験を行った。
【０１０８】
ＨＬＭにおける［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成。ＮＡＤＰＨ再生系存在下で［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンをＨＬＭとともにインキュベートした場合、時間依存的な形式で［３Ｈ］−Ｈ２Ｏが形成された（図３Ａ）。トリチウム化水の形成は、ＮＡＤＰＨに依存した。０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで、ミクロソーム濃度とともに、生成物形成は直線的に増加した。基質として［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いて、同様の結果が得られた（図３Ｂ）。２種類の基質間の主な違いは、ノイズ比に対するシグナル及び分画変換速度であった。ノイズ比に対するシグナルは、ＮＡＤＰＨ非存在に対するＮＡＤＰＨ存在において得られる生成物カウント間の比として定義される。分画変換速度は、単位時間あたり及びミクロソームタンパク質１ｍｇあたりのトリチウム化水に変換された総放射性標識基質の％として表される。表１でまとめるように、ノイズ比に対するシグナルは、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合約７であり、［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合約２０であった。分画変換速度は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合約０．６％／分／ｍｇであり、［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合１０から１４倍高かった。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
ＣＹＰ阻害剤及び抗ＣＹＰ抗体の影響。どのＣＹＰアイソフォームが生成物形成に介在するかを調べるために、一連のアイソフォーム選択的化学阻害剤（Ｂｏｕｒｒｉｅら、１９９６；Ｅａｇｌｉｎｇら、１９９８）もしくはモノクローナル抗体（Ｍｅｉら、１９９９；Ｓｈｏｕら、２０００）の存在下又は非存在下で反応を行った。使用した化学阻害剤は、フラフィリン（ＣＹＰ １Ａ２阻害剤）、クマリン（ＣＹＰ２Ａ６阻害剤）、スルファフェナゾール（ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤）、キニジン（ＣＹＰ ２Ｄ６阻害剤）、ジエチルジチオカルバメート（ＣＹＰ２Ｅ１阻害剤）及びケトコナゾール（ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤）であった。使用したモノクローナル抗体は、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４／５の阻害剤であった。図４Ａ及び４Ｂで示されるように、これらの薬剤の中で、ケトコナゾール及び抗ＣＹＰ３Ａ４／５モノクローナル抗体を除き（これらは、９０％を超えて反応を阻害した。）、ＨＬＭ中からのトリチウム化水の形成に顕著な影響を与えたものはなかった。このことから、本アッセイが、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を検出するのに特異的であったことが示された。
【０１１１】
動的同位体効果。６β−又は２β−位の何れかでのヒドロキシル化の結果として、ＣＹＰ３Ａ４／５が介在する、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウムの喪失が起こり得る（Ｗａｘｍａｎら、前出；Ｙａｍａｚａｋｉ及びＳｈｉｍａｄａ、前出（１９９７））。本実験で使用したＨＬＭのバッチにおけるテストステロン２β−ヒドロキシラーゼの活性は、６β−ヒドロキシラーゼの活性の約１１％であった（データは示さない。）。両方の代謝産物の形成にはＣＹＰ３Ａ４／５が介在するが、これは、全基質濃度範囲にわたり、１０μＭケトコナゾールにより完全に形成が阻害されたからである（データは示さない。）。［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの６β及び２β−位における標識の相対的比率は不明であり、したがって、どの位置からトリチウム喪失が起こったかを知ることはできない。
【０１１２】
［６β−３Ｈ］−テストステロンのＣＹＰ３Ａ４介在性ヒドロキシル化の後、トリチウムが６位からのみ失われ得る。トリチウム置換が動的同位体効果を生み出すか否かを調べるために、同じ反応混合物中での６β−ヒドロキシテストステロン形成速度と［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成速度を比較した。テストステロンのヒドロキシル化において失われるプロトンが６β−ヒドロキシテストステロンとともに化学量論的に形成されることを考慮すると、形成された６β−ヒドロキシテストステロンの量で［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ生成物カウントを割ることにより、トリチウム化水生成物の比放射能を計算することができる（表２）。トリチウム化した分画変換速度及びその既知の最初の比放射能とともに、形成におけるこれを使用して、Ｖ／Ｋにおける動的同位体効果を計算するためにこの情報を使用できる。表２で示されるように、ＴＶ／Ｋは２．３であり、これは、基質／生成物の比放射能比に等しい。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
放射性標識テストステロンと非標識テストステロンとの間の競合。ＨＬＭにおけるトリチウム化水の形成に対する非標識テストステロンの影響を図５Ａで示す。曲線から、「低用量フック」、すなわち、生成物形成速度が非標識基質の濃度上昇とともに上昇し、３０から４０μＭのテストステロン濃度でピークに到達し、次に低下することが示される。［６β−３Ｈ］−テストステロンが同位体トレーサーとして使用されるため、トリチウム化水の形成速度（ｖ＊）は、非標識生成物、すなわち、テストステロンの６β−ヒドロキシル化由来の水（これは、６β−ヒドロキシテストステロンとともに化学量論的に形成される。）の形成速度の典型である。基質濃度（Ｓ）に対するｖ＊の依存性を用いて、非標識生成物の基質濃度への依存に関する情報を得ることができる（後者が直接測定されないとしても。）。発明者らは、ｖ＊、非標識生成物の見かけの形成速度を、動的同位体効果により割った非標識生成物の形成速度（ｖ）として定義する（上記の実験セクションを参照のこと。）。図５Ｂで示すように、Ｓに対するｖ’の曲線をＨｉｌｌの式にフィットさせることができ、Ｓ５０＝９８±１８μＭ、ｎ＝１．４±０．２及びＶ’ｍａｘ＝１．３±０．１ｎｍｏｌ／分／ｍｇ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）であった。Ｈｉｌｌの係数は１より大きかったが、このことから、正の協同作用が示唆される。実際、低基質濃度において、図５Ｂの差込図において示されるように、ｖ’とＳとの間でシグモイド型の関係が見られた。
【０１１５】
６β−ヒドロキシテストステロン形成のカイネティクスを図５Ｃで示す。この反応は、Ｓ５０が６５±１７μＭ、Ｖｍａｘが３．４±０．０４ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質であり、Ｈｉｌｌ係数が１．５±０．２である（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）。Ｖ’ｍａｘとＶｍａｘとの間の比が２．６であり、これは、Ｖ’ｍａｘの定義から予想されるように、Ｖ／Ｋにおける動的同位体効果に近いことに留意されたい（上記の実験セクションを参照のこと。）。トリチウム化水の形成及び６β−ヒドロキシテストステロンの形成はケトコナゾールにより完全に阻害され、このことから、両生成物がＣＹＰ３Ａ４介在代謝により形成されることが確認される。
【０１１６】
同様に、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの固定濃度と非標識テストステロンの上昇濃度との間の基質競合から、低用量フックが示され、この基質からのトリチウム化水形成がケトコナゾールにより完全に阻害された（図５Ｄ）。トレーサーの比放射能又は２β−及び６β−位からの生成物の割合の何れも分からないため、同位体希釈実験から対応する非標識生成物の形成速度を求めることはできない。
【０１１７】
ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤による阻害のカイネティクス。［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成速度に対するＣＹＰ３Ａ４／５の公知の阻害剤の影響を図６Ａから６Ｆで示す。ＩＣ５０値を表３でまとめる。［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いて、２種類の異なる濃度の非標識テストステロン（１０及び６０μＭ）存在下で阻害実験を行った。この２種類の異なる基質濃度において、ＩＣ５０値の顕著な差は観察されなかった（３．５倍未満）。この２種類の異なるトレーサーを用いて求めたＩＣ５０値は非常に近く、差は２倍未満であった。放射分析アッセイにより得られたＩＣ５０値が従来のアッセイのＩＣ５０値を反映していることを確認するために、同じ反応混合物において［３Ｈ−Ｈ２Ｏ］及び６β−ヒドロキシテストステロン形成に対する阻害剤効果を調べた。表３で示されるように、殆ど同じＩＣ５０値が得られた。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
これらの実験で試験したＣＹＰ阻害剤は、有機溶媒中で溶解させねばならなかった。ＣＹＰ３Ａ４活性に対する溶媒の阻害効果が報告されているので（Ｃｈａｕｒｅｔら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：２１５−２２６（１９９９）；Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２６：２０７−２１５（１９９８）；Ｂｕｓｂｙら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２７：２４６−２４９（１９９９））、発明者らは、［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ−Ｈ２Ｏ］放出及び選択した阻害剤のＩＣ５０値における、ＤＭＳＯの２種類の異なる濃度の効果を評価した。ＤＭＳＯは生成物形成を阻害し、０．３％及び０．７％（ｖ／ｖ）の溶媒濃度で残存するのは、それぞれ、対照活性の約７０％及び５０％であった。しかし、ＤＭＳＯは、エチニルエストラジオール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ブロモクリプチン、ニカルジピン、ニフェジピン、キニジン及びベラパミルのＩＣ５０値にには影響がなかった（データは示さない。）。したがって、溶媒対照を含めることに留意し、活性データをこれらの対照に対して表す限り、０．３％から０．７％の間のＤＭＳＯ濃度を用いて、阻害アッセイを行うことができる。
【０１２０】
多数の化合物に対する従来のテストステロン６βヒドロキシル化アッセイとの比較。［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いて、放射分析アッセイにおいて、３９種類の構造的に多様な新規化学物質（ＮＣＥ）に対するＩＣ５０値を調べ、従来のテストステロン６βヒドロキシル化アッセイを用いて得られている従来のデータと比較した。この比較の結果を表４で示す。
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
３種類の化合物のＩＣ５０値は、両アッセイとも１００μＭより大きかった。６種類の化合物のＩＣ５０値は、一方のアッセイにおいて１００μＭより大きく、他方のアッセイにおいて４５μＭより大きかった。１つの化合物のＩＣ５０値は、一方のアッセイにおいて０．４μＭより小さく、他方のアッセイにおいて０．２μＭであった。残りの２９種類の化合物のＩＣ５０値のこの２種類のアッセイ間での差は４．２倍未満であった。これらのうち２５種類（８６％）の差は３倍未満であった。両アッセイにおいて測定可能なＩＣ５０値を有する化合物に対して、従来のアッセイにおけるＩＣ５０値に対する放射分析アッセイにおけるＩＣ５０値のプロットを、１．０９の勾配及び０．５６２の相関係数ｒ２の直線により描くことができた（図７Ａ及び７Ｂ）。相関直線を殆ど逸脱した点は、弱い阻害剤（化合物２８）に相当し、これは、２種類のアッセイ間でＩＣ５０値の差が３倍未満であった。この化合物を分析から除外した場合、勾配は０．８９となり、相関係数は０．７５７に上昇した。
【０１２３】
考察
基質のヒドロキシル化を伴うトリチウムの放出を用いて、チトクロムＰ−４５０酵素の活性が測定されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ及びＳｉｉｔｅｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５３６４−５３７２（１９７４）；Ｒｅｅｄ及びＯｈｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１６２５−１６３１（１９７６）；Ｍｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６０４９−６０５４（１９８０）；Ｍｉｙａｉｒｉ及びＦｉｓｈｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３２０−３２５（１９８５）；Ｏｓａｗａ及びＣｏｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：３５５−３６１（１９８７））。Ｄｒａｐｅｒ及び共同研究者らは、この原理に基づくＣＹＰ３Ａアッセイ手段について述べ、このアッセイ手段において、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンのＣＹＰＡ介在性の代謝から生じたトリチウム化水を未反応基質からチャコール抽出により分離した（Ｄｒａｐｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２６：３０５−３１２（１９９８））。
【０１２４】
本発明は、自動化でき、インキュベーション及び抽出段階を通してマルチウェル形式でアッセイを行い、マルチウェルプレート中でシンチレーションカウントのために反応生成物を回収することを可能にする。本発明は、次の点で上記の先行技術のアッセイとは異なる。第一に、本アッセイ体積は、５００μＬから２００μＬへと減少しており、ミクロソーム濃度は、０．４ｍｇ／ｍＬから０．２５ｍｇ／ｍＬへと低下している。したがって、使用されるミクロソームの最終量は２００μｇではなく５０μｇである。第二に、本明細書中で示すような好ましい実施形態において、複数ウェル形式、例えば９６ウェル形式でインキュベートを行う。第三に、ＯＡＳＩＳ逆相レジンを含む９６ウェルプレートなど、親水性及び脂溶性ポリマーのバランスの取れた割合を含む支持体を含有するマルチウェル固相抽出プレートを用いて、トリチウム化テストステロン基質からトリチウム化水を分離する。最後に、好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロン基質は６β位においてのみトリチウムを含有する。
【０１２５】
実施例１で示されるように、１０から６０μＭのテストステロン濃度（約７倍）でのノイズ比のシグナルは、１２．５μＭの基質濃度においてＤｒａｐｅｒらにより得られたもの（プールされたＨＬＭにおいて６から７倍）と同様である。しかし、本アッセイの実施形態を用いた反応速度は、使用した放射性標識の３から６倍高い量に対して正規化した場合でも、顕著に高かった（Ｄｒａｐｅｒらにおいて８０ｎＣｉであるのに対して、２５０から５００ｎＣｉ）。このように、Ｄｒａｐｅｒらは、非標識テストステロンの１２．５μＭの濃度を用いて、トリチウム化水への［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの分画変換速度が、約０．０８％／分／ｍｇであることを報告した。一方、本アッセイにおける［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの分画変換速度は、同じ濃度の非標識テストステロンで約０．６％／分／ｍｇであった（上記参照。）。この違いの理由は分からないが、しかし、テストステロン６βヒドロキシル化活性が同等だったので、この違いは市販用に調製された［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンのバッチが違うと、含有される６β位におけるトリチウム標識の分画量が異なるためであると思われる。
【０１２６】
［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた実験から、組み換えＣＹＰの１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６及び２Ｅ１によるものよりも６倍高い速度で［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム標識水の放出が組み換えＣＹＰ３Ａ４により触媒されることが示されている（Ｄｒａｐｅｒら、前出）。ＨＬＭにおける非標識テストステロンのＮＡＤＰＨ−依存性代謝は主に６β−ヒドロキシル化により起こり（７５％超）、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化の放出速度は、１２名の異なるドナー肝臓からのＨＬＭにおけるテストステロン６β−ヒドロキシル化の放出速度に相関した。これらの知見に基づき、Ｄｒａｐｅｒらは、ＨＬＭにおける［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウムのＮＡＤＰＨ−依存性放出をＣＹＰ３Ａ４活性に対するプローブ反応として使用し得ることを提案した（Ｄｒａｐｅｒら、前出）。この主張の信頼性のある検証は、特異的なＣＹＰ３Ａ４阻害剤により反応が完全に阻害され得るが、その他のアイソフォームの阻害剤により阻害されないという証明から得られる。Ｄｒａｐｅｒらの実験で使用された唯一の阻害剤は競合的基質エリスロマイシンであり、これは、１３０μＭという弱いＩＣ５０を示した。他の著者らは、エリスロマイシン及びテストステロンのみが互いの代謝を弱く阻害することを報告している（Ｗａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２５：５０２−５０７（１９９７））。したがって、エリスロマイシンを用いた結果は、アッセイのＣＹＰ３Ａ４特異性を的確に表していない。アッセイがＣＹＰ３Ａ４に特異的であることを示すために、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性又は他のアイソフォームを特異的に中和するモノクローナル抗体（Ｍｅｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：７４９−７５９（１９９９）；Ｓｈｏｕら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２：１７−３６（２０００））（ＣＹＰ、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｃ１９及び２Ｄ６）、ならびにＣＹＰの３Ａ４／５、１Ａ２、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｄ６及び２Ｅ１の特異的化学阻害剤を使用した。本明細書中で示されるように、これらの全ての物質の中で、ケトコナゾール及び抗ＣＹＰ３Ａ４／５モノクローナル抗体のみがＨＬＭにおいて［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の放出を強く阻害し、それにより、ヒドロキシル化反応には殆ど排他的（９５％超）にＣＹＰ３Ａ４／５が介在することが示された。
【０１２７】
一連のＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤の阻害可能性のより詳細な分析の本明細書中で示される結果から、さらなる証拠が得られた。ケトコナゾール、ニフェジピン、ブロモクリプチン、ミコナゾール、ニカルジピン及び化合物Ａ（ＭＲＬで合成されたＣＹＰ３Ａ４阻害剤）は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の放出を阻害し、そのＩＣ５０値は、同じ反応混合物中でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定したテストステロン６βヒドロキシル化の阻害に対する値と顕著な差がなかった。総合すれば、これらの結果から、本明細書中で開示するアッセイにより、ミクロソームＣＹＰ３Ａ４／５活性が介在するテストステロンのヒドロキシル化が正確に測定され、これを使用して治験薬の阻害可能性を分析できることが示される。
【０１２８】
Ｄｒａｐｅｒ及び共同研究者らは、以前、トリチウム化したトレーサーの反応が何ら動的同位体効果なく進行し、（非標識）６β−ヒドロキシテストステロンの１当量の形成がトリチウム化水の１当量の形成に相当するという仮定に基づき、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び６β−ヒドロキシル化からの水の放出が同様のＫｍ及びＶｍａｘ値を示したことを報告した。しかし、下記で考察するように、トリチウム化トレーサーのヒドロキシル化が動的同位体効果なしで進行するという仮定は妥当ではなく、これにより、市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いたモル濃度反応速度を決定することができなかった。トリチウム化基質からの生成物形成の速度を計算するために、６β位に存在する放射性標識の比放射能を知る必要がある。市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの場合、この情報が得られない。製造元により与えられる情報によると、標識の約２０％が１α位にあり、１９％が２α、２０％が６α、２５％が７β、１０％が１β＋７β、６％未満が２β及び６βにあるが、６β位に存在する標識の正確な割合は分からない。
【０１２９】
市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いて動的反応パラメーターを決定することができないこと以外に、ＣＹＰ３Ａプローブとしての市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの使用には、いくつかのさらなる欠点がある。６β位における標識の量が非常に少ないので（６％未満）、正確な生成物カウントを得るために非常に大量の放射活性基質を使用する必要があった（０．５から１ｘ１０６ｄｐｍ／アッセイ）。これは、アッセイのコストに重大な影響を与え、これによって生成物カウント手段を小型化すること（例えば９６ウェルシンチレーションカウンターを用いること）が困難になる。さらに、６β位以外の位置からのトリチウム喪失が生成物形成に関与することを本当に除外することはできない。６β位において特異的に標識されたテストステロンが利用できることにより、これらの問題に関して大きな長所が得られる。この新規トレーサーを用いる場合、アッセイ体積をさらに１００μＬに縮小することができ、ミクロソーム量を２５μｇに縮小でき、基質プローブ１００，０００ｄｐｍ／アッセイという少ない量で妥当な生成物カウント（２０００から４０００ｄｐｍ）を得ることができた。ノイズ比に対するシグナルは約２０倍に顕著に向上した。［６β−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の形成は、ＮＡＤＰＨ依存的であり、一連のＣＹＰ３Ａ／５阻害剤により阻害され、そのＩＣ５０値は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いて得られた値と顕著な差がなかった。したがって、本発明の改良アッセイにより、古典的なテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイの真のハイスループット放射分析バージョンが得られ、この方法は、以下でさらに考察するように、治験薬の阻害可能性の迅速なスクリーニングに適切である。
【０１３０】
基質プローブとして比放射能が既知である［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いることにより、動的同位体効果、ＴＶ／Ｋ（上記参照）を決定することができるようになる。トリチウム化基質及び非標識基質の濃度間に大きな相違があると、それらの個別の反応速度を測定することができない。トリチウム化基質のトレース濃度を使用して、競合的非標識基質存在下で反応速度を測定する場合、Ｖ／Ｋ比に対する動的同位体効果を測定することができる（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８７：６０７−６２５（１９８２））。同じ反応混合物中でトリチウム化水及び６β−ヒドロキシテストステロンの形成を測定することにより、トリチウム化水生成物の比放射能を計算し、基質の最初の比放射能と比較することができ、これらの値を用いてＴＶ／Ｋを導き出すことができる。ＴＶ／Ｋにおける動的同位体効果は２．３倍であった。重水素で置換されたテストステロンの６β−ヒドロキシル化が動的同位体効果なしで進行することが以前報告された（Ｂｊｏｒｋｈｅｍ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：３５４−３６３（１９７２））。これは、おそらく、Ｃ−Ｄ及びＣ−Ｔ結合エネルギー間の差によるものと思われる。動的同位体効果は、トリチウム化プローブに対する反応速度を低下させるが、トリチウム化水形成の阻害に対するＩＣ５０値が６β−ヒドロキシテストステロン形成に対する値と顕著な相違がなく、基質プローブの６倍同位体希釈により変化がなかったという観察から示されるように、競合的ＣＹＰ３Ａ阻害剤の阻害可能性には影響を与えない。
【０１３１】
放射性標識基質の固定量及び非標識基質の上昇濃度の存在下で反応速度を測定する場合、生成物カウントは、非標識基質の濃度が、酵素の活性部位に対するトレーサーの結合と競合するのに十分に高くなるときは低下すると予想される。図５Ａから５Ｂで示されるように、低濃度の非標識テストステロンにおいて、トリチウム化水の形成は、実際に、非標識基質が増加するにつれて促進され、非標識基質の高濃度（４０μＭ超）でのみ低下し始める。「低用量フック」と呼ばれるこの影響は、正の方向に協同するリガンド置換相互作用にとって特徴的である（Ｄｅ Ｌｅａｎ及びＲｏｄｂａｒｄ、Ｒｅｃｅｐｔ：Ｃｏｍｐｒ．Ｔｒｅａｔｉｓｅ １：１４３−１９２（１９７９））。トリチウム化生成物の形成が増加する理由は、低基質濃度で、正の方向に協同する酵素の反応速度が、基質濃度が上昇するにつれて用量に比例した上昇よりも大きく上昇するからである。非標識生成物の見かけの形成速度をトレーサー競合データから計算し、基質濃度に対してプロットした場合、シグモイド型の関係が見られ、このことから、この反応が正の協同作用を示すことが確認される。１．３４のＨｉｌｌ係数及び１２０μＭのＳ５０で、データをＨｉｌｌの式にフィットさせることができた。同じ条件下での６β−ヒドロキシテストステロン形成の測定から、１．３５の見かけのＨｉｌｌ係数及び１０１μＭのＳ５０で、非標識テストステロンの反応速度論が実際に、正の協同作用を示すことが分かる。ＣＹＰ３Ａ４介在性のテストステロンの６β−ヒドロキシル化に対して、１．３のＨｉｌｌ係数が以前に報告されている（Ｕｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：３７０−３８１（１９９７））。トレーサー競合データから得られる速度パラメーターと非標識生成物の直接測定により決定されるものとがよく一致することから、ＨＬＭでの［６β−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の形成に、６β−ヒドロキシテストステロンの形成と同じ機序が介在するという概念が補強される。低用量フックはまた、基質として［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いても観察された。このトレーサーに対して、双曲線（非シグモイド）カイネティクスが報告されていることに留意されたい（Ｄｒａｐｅｒら、前出）。この明らかな相違に対する最も有望な説明は、本研究において０．４から２０μＭの間の基質濃度でのみ「低用量フック」が観察されたが、一方でＤｒａｐｅｒは１４μＭより大きい基質濃度で反応カイネティクスを研究したということである。
【０１３２】
ＣＹＰ３Ａ４／５阻害に対するスクリーニング法としてのこの新しいアッセイの使用を確認するために、多数の構造的に多様な治験化合物に対してＩＣ５０値を決定し、その結果を古典的なテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる生成物定量を行う。）から得られた結果と比較した。この分析の結果から、本発明のアッセイにより得られたＩＣ５０値が、従来のアッセイの値と非常に近いことが示される。ＩＣ５０値の差は４倍未満であり、化合物の８６％に対して３倍未満であり、これは、６βヒドロキシル化アッセイに対する古典的なデータがこの比較に対して使用されたことを考慮すると、非常に注目に値するものである。３９種類の試験化合物のうち、放射分析アッセイの結果に基づき、強い又は弱い阻害剤の何れかとして間違って分類されたものがないといことは、最も重要なことである。
【０１３３】
テストステロンに対して蛍光性ＣＹＰ３Ａ４／５プローブを用いて得られたＩＣ５０値の多数の化合物についての詳細な比較から、これらのアッセイ間の相関関係が比較的乏しいことが明らかとなった。この研究の著者らは、蛍光性プローブを用いたスクリーニングの後、従来の基質を用いた試験を行うべきであることを推奨した（Ｃｏｈｅｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１：１００５−１０１５（２００３））。したがって、スピード、ハイスループット及び従来の基質の使用の長所を組み合わせた本発明のアッセイは、この問題を回避し、薬物探索設定において化合物がＣＹＰ３Ａ４を阻害する可能性を迅速に調べるために価値あるものである。
【実施例２】
【０１３４】
この実施例は、インタクトな肝細胞において酵素活性及びＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤の影響を調べ、定量するための本発明の使用を説明する。
【０１３５】
新鮮な肝臓試料からヒト肝細胞を調製した（地元の病院から入手した手術による廃棄物）。確立されたプロトコールに従い、肝細胞を単離し、液体窒素中で凍結保存した（例えば、Ｈｅｎｇｓｔｌｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３２：８１−１１８（２０００）；Ｆｅｒｒｉｎｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０７：３４１−５２（１９９８）を参照。）。細胞を凍結融解し、１２ウェルの培養プレート中で、５％ＣＯ２、９５％酸素の加湿環境下、振盪水浴中で３７℃にて１時間インキュベートした。各培養ウェルは、百万個の細胞、肝細胞培養液（ＨＣＭ）１ｍＬ（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐｏｌｌａｒｄ及びＷａｌｋｅｒ編）ｐｐ．１６１−１７６、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ．（１９８９））、２００μＭ非標識テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロン３７０，０００ｄｐｍを含有した。ＣＹＰ３Ａ４／５の活性の阻害に関して検体をアッセイする場合、上記反応系に検体を添加する。この実施例において、阻害剤１０μＭケトコナゾールを平行したインキュベーションに添加した。１０μＭケトコナゾールなどの公知の阻害剤又は検体に対するビヒクルを含有する対照インキュベーションも行った。１時間後、前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートの個々のウェルにインキュベーションメディウムの一定分量を入れ、水２００μＬでこれを２回洗浄した。各ウェルに対して、フロースルーを水洗浄液と合わせ、シンチレーション液添加後にβ−カウンターにおいてカウントした。
【０１３６】
６β−ヒドロキシテストステロンの形成速度を測定するために、メタノール１ｍＬを用いてＯＡＳＩＳプレートから６β−ヒドロキシテストステロンを溶出し、Ｎ２下で乾燥させ、ギ酸０．１％を含有する５０％アセトニトリル／水（５０：５０）２００μＬ中で再構成した。６β−ヒドロキシテストステロンの定量のために、ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ系に一定分量を注入した。定量は、ピーク領域と、未知の試料のように正確に処理し抽出した標準曲線のそれとの比較に基づいて行った。実施例１で述べたように、テストステロンの比放射能で生成物カウントを割ることにより、［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの見かけの形成速度を計算した。結果を表５で示す。
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
本発明の放射分析アッセイを用いて決定された活性は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイにより求められた活性よりもわずかに（３０％）低かったが、これは、おそらく、実施例１で述べたような穏やかな動的トリチウム同位体効果によるものである。ケトコナゾール存在下で［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成形式が完全に阻害され、このことから、本アッセイがまた、インタクトなヒト肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤の影響を調べるために使用できることが分かった。
【実施例３】
【０１３９】
この実施例は、肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４／５誘導剤の影響を調べ、定量するための本発明の使用を説明する。
【０１４０】
２名の異なるドナーからの凍結保存ヒト肝細胞をＴｉｓｓｕｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｉｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）から入手した。細胞（およそ３２０，０００）を２４ウェルのコラーゲン被覆培養プレートにプレーティングし、ＩＴＳ＋（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加した肝細胞培養液（ＨＣＭ）（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、前出）中で５％ＣＯ２、９５％空気の加湿環境下で３７℃にて維持した。２４時間後、細胞の各ウェルに対する培養液を除去し、ＩＴＳとともに新鮮なＨＣＭを添加し、ビヒクル（対照）、リファムピシン（陽性の対照）又は、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性の誘導能について試験する検体の何れかで細胞を４８時間処理した。次に、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性を次のように求めた。
【０１４１】
各ウェルに対して、培養液を除去し、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、６０μＭ非標識テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンおよそ２００，０００ｄｐｍを含有するＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）０．５ｍＬ中で、３７℃にて１時間、細胞をインキュベートした。それぞれに対して、酵素活性に特異的にＣＹＰ３Ａ４／５が介在することを確認するために、１０μＭケトコナゾール存在下で平行インキュベーションも行った。次に、前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートの個別のウェルにインキュベーション液を入れ、水２００μＬでこれを２回洗浄した。各ウェルに対して、フロースルーを水洗浄液と合わせ、シンチレーション液添加後にβ−カウンターにおいてカウントした。メタノール１ｍＬを用いてＯＡＳＩＳプレートから６β−ヒドロキシテストステロンを溶出し、Ｎ２下で乾燥させ、ギ酸０．１％を含有する５０％アセトニトリル／水（５０：５０）２００μＬ中で再構成した。６β−ヒドロキシテストステロンの定量のために、ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ系に一定分量を注入した。定量は、ピーク領域と、未知の試料のように正確に処理し抽出した標準曲線のそれとの比較に基づいて行った。
【０１４２】
図８Ａ及び８Ｂで示されるように（それぞれドナー１及び２に対する結果）、培養したヒト肝細胞をリファムピシンで４８時間処理することにより、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性の用量依存的な増加が起こった。［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成を測定し、平行して、同じ細胞のインキュベーションにおける６β−ヒドロキシテストステロンの形成を測定することにより、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を求めた。対照（リファムピシンで処理しなかった細胞）に対する代謝産物形成の％として結果を表す。本発明の放射分析法により測定したリファムピシンの影響は、従来の（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイにより測定したものと顕著な差はなかった。１０μＭケトコナゾールの存在下でインキュベーションを行った場合、両代謝産物の形成はほぼ完全に阻害され（データは示さない。）、このことから、反応のＣＹＰ３Ａ４／５特異性が確認された。これらの結果は、インタクトな細胞、特に培養したヒト肝細胞において、ＣＹＰ３Ａ４誘導剤の影響を調べるために、本発明のアッセイを使用できることを示す。
【実施例４】
【０１４３】
この実施例は、時間依存的ＣＹＰ３Ａ４／５アッセイを示す。インキュベーションは全て、９６ウェルボックス＋ポリプロピレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＢＩ）中で行った。
【０１４４】
次のようにプレインキュベーション段階を行った。プレインキュベーション混合液は３０μＬ ＨＬＭ（タンパク質３．３ｍｇ／ｍＬ、好ましい最終濃度２ｍｇ／ｍＬ；０．１から５ｍｇ／ｍＬの範囲）、試験検体１μＬ（３５％ＤＭＳＯ、６５％メタノール中に溶解）、アッセイ緩衝液９μＬ（０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．６）を含有した。ＮＡＤＰＨ再生系１０μＬ（アッセイ緩衝液中、５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、１７ｍＭ ＭｇＣｌ２、５Ｕ／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を添加することによりプレインキュベーションを開始した。逆順で様々な時間でプレインキュベーションを開始した（最長のプレインキュベーションを最初に開始し、最短のプレインキュベーションを最後に開始した。）。振盪水浴中で３７℃にて０から３０分間、混合液をプレインキュベートした。
【０１４５】
残存活性の決定は次の通りであった。［６β−３Ｈ］テストステロン（約８００，０００ｄｐｍ）、２００μＭ非標識テストステロン及び１ｍＭ ＮＡＤＰＨを含有するアッセイ緩衝液４５０μＬでのプレインキュベーション混合液の１０倍希釈により第二のインキュベーションを開始した。振盪水浴中で３７℃にて１０分間インキュベーションを行った。１Ｎ ＨＣｌ ５０μＬを添加することにより、反応を停止させた。室温にて２８００ｒｐｍで１５分間、プレートを遠心分離した。前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートに上清３００μＬを入れた。フロースルーを回収し、１２０μＬの一定分量を９６ウェルシンチレーションカウンティングプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ４０シンチレーション液１８０μＬを添加し、プレートを密封し、振盪して、Ｐａｃｋａｒｄ ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンターでカウントした。
【０１４６】
図９Ａ及び９Ｂは、ＣＹＰ３Ａ４／５介在性のテストステロン６β−ヒドロキシル化を定量するための、トリチウム化水の放射分析検出を用いた典型的な実験の結果を示す。使用した時間依存的阻害剤はミフェプリストンであった。図１０Ａ及び１０Ｂは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によりテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性を求めた場合に、同様の結果が得られたことを示す。表６は、様々な時間依存的ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤に対して得られた速度パラメーターをまとめている。試験した全ての化合物に対して、放射分析アッセイにより得られた結果は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイにより得られた結果と同様であり、このことから、化合物が時間依存的ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤として作用する可能性を評価するために放射分析アッセイを使用できることが示される。
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
例としての実施形態を参照して本明細書中で本発明を説明してきたが、本発明がこれに限定されないことを理解されたい。当業者及び本明細書中での教示を入手した者は、この範囲内のさらなる修飾及び実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、抽出カートリッジ又はカラム１０の横断面を示す。
【図２】図２は、マルチカラム精密ろ過／抽出プレート１００の透視図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、インキュベーション時間及びヒト肝臓ミクロソーム濃度に対する、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成の依存性を示す。１０μＭ非標識テストステロン及び指定濃度のＨＬＭの存在下で実験を行った。生成物形成は、総放射活性の％で表した。各点は、デュプリケート測定の平均±ＳＥＭである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、インキュベーション時間及びヒト肝臓ミクロソーム濃度に対する、［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成の依存性を示す。６０μＭ非標識テストステロン及び指定濃度のＨＬＭの存在下で実験を行った。生成物形成は、総放射活性の％で表した。各点は、デュプリケート測定の平均±ＳＥＭである。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒト肝臓ミクロソームにおける、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるＣＹＰ阻害の効果を示す。６０μＭ非標識テストステロン存在下及び次の化合物の存在下又は非存在下で反応を行った：３０μＭフラフィリン、５０μＭクマリン、１０μＭスルファフェナゾール、１０μＭキニジン、１００μＭジエチルジチオカルバメート、１μＭケトコナゾール。酵素活性は、未処理対照の％として表し、デュプリケート測定の平均±標準誤差を表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト肝臓ミクロソームにおける、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における抗ＣＹＰモノクローナル抗体の影響を示す。６０μＭ非標識テストステロン存在下及び抗体０．４ｍｇ／ｍＬの存在下又は非存在下で反応を行った。酵素活性は、未処理対照の％として表し、デュプリケート測定の平均±標準誤差を表す。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒト肝臓ミクロソームにおける、［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における非標識テストステロンの影響を示す。メタノール中の保存溶液から、テストステロンを添加した（最終メタノール濃度はアッセイにおいて０．６％）。１０μＭケトコナゾールの非存在下（黒印）又は存在下（白印）において生成物形成を評価した。結果は３回の別個の実験の平均±ＳＥＭである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、総基質濃度におけるｖ’の依存性を示す。実施例１で述べられるように定義されるｖ’という用語は、図５Ａで示される生成物カウントから計算した。非線形回帰分析により、データをＨｉｌｌの式にフィットさせた。
【図５Ｃ】図５Ｃは、総基質濃度における６β−ヒドロキシテストステロンの形成速度の依存性を示す。データは３回の別個の実験からの平均±ＳＥＭである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における非標識テストステロンの影響を示す。１０μＭケトコナゾールの非存在下（黒印）又は存在下（白印）において生成物形成を評価した。結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝２である。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるケトコナゾールの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるニフェジピンの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における化合物Ａの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるミコナゾールの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるブロモクリプチンの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるニカルジピンの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図７Ａ】図７Ａは、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。放射分析［６β−３Ｈ］−テストステロンヒドロキシル化アッセイにおける２９Ｍｅｒｃｋ ＮＣＥに対するＩＣ５０値は、従来のテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイで得た値と相関があった。従来のアッセイからのデータは、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｈｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおいて記録されていた。
【図７Ｂ】図７Ｂは、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。図７Ａにおいて矢印で強調した化合物を除き、２８種類の化合物からのデータを用いて相関分析を行った。
【図８Ａ】図８Ａは、ドナー１からの培養ヒト肝細胞での、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性におけるＣＹＰ３Ａ４誘導剤リファムピシンの影響を調べるための、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ドナー２からの培養ヒト肝細胞での、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性におけるＣＹＰ３Ａ４誘導剤リファムピシンの影響を調べるための、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害を示す。放射分析テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調べ、ミフェプリストンの指定濃度での様々なプレインキュベーション後に残存した％ＣＹＰ３Ａ４／５活性を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、放射分析テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイにより決定した場合の、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害に対する阻害の速度パラメーターを導き出すための、阻害剤濃度曲線に対する不活性率のフィッティングを示す。放射分析テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５活性を調べた。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害を示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を用いて、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調べ、ミフェプリストンの指定濃度での、様々なプレインキュベーション後に残存する％ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害に対する阻害の速度パラメーターを導き出すための、阻害剤濃度曲線に対する不活性率のフィッティングを示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を用いて、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５活性を調べた。
【技術分野】
【０００１】
（１）発明の分野
本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性及び、例えばＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤又はＣＹＰ３Ａ４／５発現の誘導剤などの、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調節する可能性を評価するためのアッセイに関する。このアッセイは、基質としての６β位においてトリチウムにより標識されたテストステロン及び、ＣＹＰ３Ａ４／５による６β位における標識テストステロンのヒドロキシル化の際に生じるトリチウム化水から標識テストステロンを分離するための、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を用いる、ＣＹＰ３Ａ４／５、ＣＹＰ３Ａ４／５を含むミクロソーム又は肝細胞を含む反応において、テストステロンの６β−ヒドロキシル化を測定することにより、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性又は発現を調べる。このアッセイは、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性及び候補薬物のＣＹＰ３Ａ４／５阻害又は誘導の可能性を評価して、さらなる開発から可能性のあるＣＹＰ阻害剤又は誘導剤を除外するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の説明
医薬品の薬物動態及び毒物動態特性は、大部分、薬物代謝酵素によるそれらの生体内変化に依存する。哺乳動物における主要な薬物代謝系はチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）であり、これは、肝臓に主に存在するミクロソーム酵素のファミリーである。複数のＣＹＰアイソフォームが、薬物、ステロイド、プロスタノイド、エイコサノイド、脂肪酸及び環境毒素を含む、内在性及び外来性の化学物質の酸化を触媒する（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ．（１９９６））。特定のＣＹＰアイソザイムにより代謝される薬物がその同じ酵素の阻害剤と同時投与されると、その薬物動態が変化し得、悪影響が生じ得る（Ｂｅｒｔｚ及びＧｒａｎｎｅｍａｎ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３２：２１０−２５８（１９９７）；Ｌｉｎ及びＬｕ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３５：３６１−３９０（１９９８）；Ｔｈｕｍｍｅｌ及びＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：３８９−４３０（１９９８）；ｖｏｎ Ｍｏｌｔｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：１１３−１２２（１９９８））。したがって、代謝阻害のためにクリアランスの変化が起きることを予想し回避できることは重要である。薬物探索プロセス中に、さらなる開発から可能性のある阻害剤を除外するために、候補薬物のＣＹＰ阻害の可能性を評価することは、製薬工業における通常業務である（Ｌｉｎ及びＬｕ，前出（１９９８）；Ｃｒｅｓｐｉ及びＳｔｒｅｓｓｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４４：３２５−３３１（２０００）；Ｂａｃｈｍａｎｎ及びＧｈｏｓｈ，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．２：２９９−３１４（２００１）；Ｒｉｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．４：４５−５４（２００１））。
【０００３】
多くのＣＹＰがまた、５０倍から１００倍以下で、生体異物により強く誘導可能である。薬物療法において、ＣＹＰ阻害に関して２つの大きな懸案事項がある。第一に、薬物代謝が向上する結果として全身的な曝露が減少することにより、誘導によって治療効果が低下し得る。第二に反応性代謝物の形成が増加する結果として、誘導によって毒性と解毒との間に望ましくない不均衡が生じ得る（Ｌｉｎ及びＬｕ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３５：３６１−３９０（１９９８））。
【０００４】
ＣＹＰ３Ａ４はヒト肝臓において最も豊富なＣＹＰであり、ヒト治療において使用される薬物の約５０％の代謝に関与する（Ｇｕｅｎｅｇｅｒｉｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９：１−１７（１９９９））。ＣＹＰ３Ａ４活性の阻害により、臨床的に重要かつ生命を脅かす可能性のある薬物相互作用が生じ得る（Ｔｈｕｍｍｅｌ及びＷｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：３８９−４３０（１９９８））。したがって、ＣＹＰ３Ａ４阻害の可能性について候補薬物を評価することは重要なこととなってきた。ＣＹＰ３Ａ４誘導は、おそらく、確認された誘導に基づく薬物−ＣＹＰ相互作用の最も重要な原因である（Ｗｈｉｔｌｏｃｋら、ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第二版）。Ｏｒｔｉｚ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｌｌｏａｎｏ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）．ｐｐ．３６７−３９０）。候補薬物は、望ましくないＣＹＰ３Ａ４誘導に基づく相互作用を誘導する可能性を有し得るので、新しい候補薬物をそれらのＣＹＰ３Ａ４誘導の可能性に関して評価することは重要なこととなっている。
【０００５】
候補薬物がＣＹＰ３Ａ４活性を阻害する可能性を調べるために、いくつかのアッセイ法が現在使用されている。これらの方法のそれぞれが相異なる長所及び短所を示す。最も広く使用されている方法は、テストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイであり、これはヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）において行われ、ＣＹＰ３Ａファミリー（ＣＹＰ３Ａ４／５）の酵素に対して特異的である（Ｗａｘｍａｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｉｐｈｙｓ．２６３：４２４−４３６（１９８８）；Ｍａｅｎｐａａら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４：６１−６７（１９９３）；Ｗａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２５：５０２−５０７（１９９７）；Ｙａｍａｚａｋｉ及びＳｈｉｍａｄａ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｉｐｈｙｓ．３４６：１６１−１６９（１９９７））。Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのレビュワーにより行われた最近の調査によると、テストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイは、新しい薬物適用のサポートにおいて最も一般的に使用されているアッセイである（Ｙｕａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６６：９−１５（１９９９）；Ｙｕａｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：１３１１−１３１９（２００２））。このアッセイによりもたらされる実用面での困難な課題は、反応産物の基質からのＨＰＬＣ分離と、それに続いてＵＶ又は質量分析検出が必要なことである。これにより、このアッセイが比較的労力及び時間を要するものとなっており、これは、産業レベルでの薬物探索設定において通常必要とされる多数の化合物のスクリーニングを行うには理想的ではない。
【０００６】
高スループットスクリーニングに使用できるいくつかの代替的アッセイが過去数年にわたり導入されてきた。これらのアッセイは、蛍光性又は放射性標識基質の使用に基づくものであり、これによりＨＰＬＣ分離を使用する必要がなくなる。おそらく、これらの中で最もうまくいったものは、基質として７−ベンジルオキシ−４−トリフルオロメチルクマリンを使用する蛍光分析によるアッセイである（Ｃｒｅｓｐｉ及びＳｔｒｅｓｓｅｒ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４４：３２５−３３１（２０００））。基質がＣＹＰ３Ａ４に特異的ではないので、この蛍光分析によるアッセイはＨＬＭを用いて行うことはできず、組み換え酵素の使用が必要である。ＣＹＰ３Ａ４特異的基質を使用し、したがってＨＬＭを用いて行うことができる代替的な蛍光分析によるアッセイが記載されている（Ｃｈａｕｒｅｔら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：２１５−２２６（１９９９）；Ｓｔｒｅｓｓｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：８４５−８５２（２００２））。これらの蛍光分析によるアッセイは迅速であり、実施が容易であり、高スループットスクリーニング及び自動化を行うことができるが、これらには多くの制限がある。第一に、試験化合物は複数のアイソザイムによる代謝に供され得、それにより基質減少又は阻害代謝産物の形成の速度が異なることになるため、ＣＹＰアイソザイム全てを含有するＨＬＭの代わりに組み換えＣＹＰを使用することにより、阻害可能性の相違が生じ得る。ＣＹＰ３Ａ４特異的基質の使用によりこの懸案事項がなくなったとしても、第二の問題は、ＣＹＰ３Ａ阻害が基質依存性であるということである。（Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：７１６−７２７（１９９９）；Ｓｔｒｅｓｓｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：１４４０−１４４８（２０００）；Ｗａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：３６０−３６６（２０００））。ＣＹＰ３Ａ４は、複数の形式及び結合部位で基質及び阻害剤に結合すると考えられている、大型の複合酵素である（Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２９：１６４４−１６５１（２００１）；Ｓｈｏｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９４：１９９−２０９（２０００）；Ｅｋｉｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２４：１６１−１６６（２００３））。結果として、古典的ではないＣＹＰ３Ａ４プローブを用いて観察される阻害的相互作用は、他の基質を用いて観察されるものを代表例するものではないであろう（Ｃｏｈｅｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１：１００５−１０１５（２００３））。最後に、ある一定のクラスの化合物によって、蛍光干渉が頻繁に観察される。
【０００７】
基質のヒドロキシル化に伴うトリチウム放出を使用して、チトクロムＰ−４５０酵素の活性が測定されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ及びＳｉｉｔｅｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５３６４−５３７２（１９７４）；Ｒｅｅｄ及びＯｈｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１６２５−１６３１（１９７６）；Ｍｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６０４９−６０５４（１９８０）；Ｍｉｙａｉｒｉ及びＦｉｓｈｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３２０−３２５（１９８５）；Ｏｓａｗａ及びＣｏｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：３５５−３６１（１９８７））。Ｄｒａｐｅｒ及び共同研究者らは、この原理を利用したＣＹＰ３Ａアッセイ手段を述べており、このアッセイでは、ＣＹＰＡ介在性の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの代謝から生じるトリチウム化水がチャコール抽出により未反応基質から分離される（Ｄｒａｐｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２６：３０５−３１２（１９９８））。
【０００８】
インビボ動物モデルは、誘導データのインビトロ／インビボ外挿に影響する因子におけるいくつかの有用な情報を提供し得るが、誘導性反応において顕著な種の相違があるため、新しい候補薬物に対するヒトＣＹＰ３Ａ４誘導の評価に対して動物モデルを使用することはできない。新しい候補薬物に対するＣＹＰ３Ａ４誘導の可能性を評価するために、肝臓スライス、不死化細胞株及び初代肝細胞を含むいくつかのインビトロモデルが確立されている（Ｓｉｌｖａら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２６：４９０−４９６（１９９８）；Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．２７：８８７−８９４（１９９９）；Ｍａｕｒｅｌ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｖ．２２：１０５−１３２（１９９６）；ＬｅＣｌｕｙｓｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．１３：３４３−３６８（２００１））。これらのモデルの中で、ＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために、大学及び企業の研究所により、ヒト肝細胞の初代培養が広く使用されてきた。一般に、初代肝細胞培養は、ＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するための最も期待できるインビトロモデルであると考えられている。ヒト肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４誘導を評価するために使用されている一般的な方法は、２４時間から７８時間、リファムピシンなどの典型的な誘導剤の存在下又は非存在下で、又は試験化合物の存在下で、細胞をインキュベートすることである。次に、インタクトな細胞又は細胞から調製したミクロソームの何れかを用いて、テストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイによりＣＹＰ３Ａ４活性を調べる。試験化合物の誘導活性は通常、リファムピシンの誘導活性と比較して表される。ＣＹＰ３Ａ４により生じる代謝産物６βヒドロキシテストステロンの定量には、ＵＶ又は質量分析検出と組み合わせたＨＰＬＣ分析が必要であり、したがって、高スループットスクリーニングには理想的に適切ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の観点から、高スループットスクリーニング形式に適合し得、テストステロンなどの古典的なＣＹＰ３Ａ４基質の使用に基づく、ＣＹＰ３Ａ４活性の調節因子を同定するためのＨＰＬＣを使用しないアッセイが特に望まれよう。したがって、基質としてテストステロンを使用することに基づき、少なくとも従来のアッセイと同じ程度に高感度で特異的であり、高スループットスクリーニング形式に容易に適合させることができる、ＣＹＰ調節因子を同定するためのアッセイが依然として要求されている。肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４活性を評価するためのアッセイもまた必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の要約
本発明は、チトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）３Ａ４／５の活性及び、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性を阻害する又はＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導する可能性を評価するための、迅速かつ高感度の放射分析アッセイを提供する。このアッセイは、検体存在下での、６β位においてトリチウム標識されたテストステロンのＣＹＰ３Ａ４／５介在性６β−ヒドロキシル化において生じる［３Ｈ］Ｈ２Ｏとしてのトリチウム放出の検出に基づくものであり、ここで、肝細胞における時間経過によるトリチウム放出の増加又はＣＹＰ３Ａ４／５を含有する反応での時間経過によるトリチウム放出の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性又は発現の調節因子であることを示す。この方法により、さらに、肝細胞標本におけるＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調べることができる。従来のテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイとは異なり、本発明のアッセイは、ＨＰＬＣ分離及び質量分析を必要としない。代わりに、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を用いた固相抽出プロセスにおいて、トリチウム化テストステロンから、トリチウム化水生成物を分離する。トリチウム化テストステロンが６β位でのみ標識されている場合、分画変換速度及びアッセイ感度の両方が向上する。インキュベーション、生成物の分離及び放射活性測定を含む本アッセイの全段階が好ましくはマルチウェル形式で行われ、これは自動化できる。
【００１１】
したがって、ある実施形態において、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する水性混合液を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５活性が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、水性混合液をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に水性混合液を適用して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、水性混合液中のトリチウム標識水の量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロムＰ４５０ ３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００１２】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００１３】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含有する。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００１４】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識されている。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてのみトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する水性混合液を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５活性が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、水性混合液をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーに水性混合物を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、水性混合液中のトリチウムの量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００１６】
上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。
【００１７】
上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。
【００１８】
上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００１９】
上記の実施形態のさらなる態様において、反応混合液中にテストステロン−３−エチレンアセタール及び過酢酸をインキュベートすること；反応混合液中に生じた５α，６α−エポキシド（５α，６α−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタンヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）から５β，６β−エポキシド（５β，６β−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）を分離すること；［３Ｈ］−アルミニウムリチウムを含有するテトラヒドロフラン中で５α，６α−エポキシドをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α,１７β−ジオールを生成させること；及び酢酸の水性混合液中に［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオールをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−テストステロンを生成させること、によりテストステロンが６β位においてのみ標識される。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する水性混合液を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５活性が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、水性混合液をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；形成されるポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが加湿性とあり及び有機溶質保持において有効となるようなＮ−ビニルピロリドンに対するジビニルベンゼンの割合で、ジビニルベンゼン及びＮ−ビニルピロリドンをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーに水性混合物を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウムの量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２１】
上記の実施形態のさらなる態様において、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンは１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含み、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００２２】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識されている。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。
【００２３】
上記のさらなる実施形態において、吸着剤又は加湿性ポリマーは固相抽出カートリッジ又はカラムの内側に充てんされる。上記の何れか１つの特に好ましい実施形態において、本方法は、インキュベーションを行う第一のマルチウェルプレート、インキュベーション後にトリチウム化水から標識テストステロンを分離するための、マルチウェルプレートと同じ配列であるマルチカラムプレート及びトリチウムを測定するためにマルチカラムからカラムの空隙容量及び洗浄液を回収するための第二のマルチウェルプレートを含むマルチウェルプレート形式で行われる。
【００２４】
本発明はさらに、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているラムプレート又はカラム（テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤をその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する水性混合液を添加することと；上記のウェルのそれぞれの中の水性混合液にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位でトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各水性混合液を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウム量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２５】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００２６】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００２７】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識されている。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているカラムプレート又はカラム（形成されるポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが加湿性であり及び有機溶質保持において有効となるようなＮ−ビニルピロリドンに対するジビニルベンゼンの割合で、ジビニルベンゼン及びＮ−ビニルピロリドンをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーをその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位でトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する水性混合液を添加することと；ウェルのそれぞれの中の水性混合液にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位でトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートし（トリチウム標識水が生成する。）、場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各水性混合液を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウム量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２９】
上記の実施形態のさらなる態様において、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンは、１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含み、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３０】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。
【００３１】
本発明は、さらに、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているカラムプレート又はカラム（ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーをその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてのみトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する水性混合液を添加することと；上記のウェルのそれぞれの中の水性混合液にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位でトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の水性混合液からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各水性混合液を添加して、水性混合液からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された水性混合液中のトリチウム量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム量に対する検体存在下でのトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００３２】
上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。
【００３３】
上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。
【００３４】
上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３５】
上記の実施形態及び態様の何れか１つのさらなる態様において、カラムプレートのミニカラムのそれぞれは、そこにポリマーを保持するための多孔性の手段をさらに含む。好ましい実施形態において、マルチウェルプレート及びカラムプレートのウェルはそれぞれ、９６ウェル組織培養プレートの形式を有する。
【００３６】
本発明は、さらに、ＣＹＰ３Ａ４／５、ＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；様々な時間、混合物をインキュベートすることと；混合物を希釈し、次いで希釈混合物に６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及びＮＡＤＰＨを添加することと；ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、希釈混合物をインキュベートすることと；混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に混合物を添加して、混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体が不可逆的にＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を不可逆的に阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００３７】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーはポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３８】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００３９】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。
【００４０】
上記の実施形態及び態様の何れか１つの特定の実施形態において、ＣＹＰ３Ａ４／５はミクロソームにおいて提供される。ミクロソームは、哺乳動物及び昆虫細胞からなる群から選択される細胞から生成され得、この細胞は、ＣＹＰ３Ａ４／５を発現するベクター（例えば、ウイルス又はプラスミドベクター）を含むか、又はミクロソームは、腎臓、肝臓、脳、筋肉などの細胞由来であり得る。好ましくは、ミクロソームは、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）である。ＣＹＰ３Ａ４／５源としてＨＬＭを使用する上記の実施形態及び態様の何れか１つの特定の実施形態において、酸性化及び／又は遠心により水性混合液からＨＬＭを除去する。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位においてトリチウムにより標識されたテストステロンを含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；肝細胞の培養物から培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された培地中のトリチウム量を測定することと（これは、肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４／５の相対活性を決定する。）、を含む、肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４／５の活性を決定するための方法を提供する。
【００４２】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；６β位においてトリチウムにより標識されたテストステロンを含有する第二の培地で検体を含有する培地を置き換え、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、肝細胞をインキュベートすることと（これによりトリチウム標識水が生成する。）；肝細胞の培養物から第二の培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に第二の培地を添加して、第二の培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された第二の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム標識テストステロン存在下、検体非存在下でインキュベートした肝細胞の対照培養物に対するトリチウム量の増加は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導することを示す。）、を含む、ＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導する検体を同定するための方法を提供する。好ましくは、肝細胞は、検体を含有する培地中で約２４時間から７８時間インキュベートされる。
【００４３】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位においてトリチウム標識されたテストステロン及び検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと（これによりトリチウム標識水が生成する。）；肝細胞の培養物から培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及びトリチウム標識テストステロンが除去された、段階の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム標識テストステロン存在下、検体非存在下でインキュベートした肝細胞の対照培養物に対するトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ３Ａ４／５活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００４４】
上記の実施形態のさらなる態様において、肝細胞の培養物はマルチウェルプレートの１以上のウェル中に提供され、吸着剤は、カラムプレートを構成する、１以上の固相抽出カートリッジ又はカラムに充てんされて提供される。
【００４５】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーはポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００４６】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００４７】
上記の実施形態のさらなる態様において、トリチウム標識テストステロンは１、２、６β及び７位において標識される。上記の実施形態及び態様の特に好ましい態様において、トリチウム標識テストステロンは６β位においてのみ標識される。さらなる態様において、反応混合液中でテストステロン−３−エチレンアセタール及び過酢酸をインキュベートすること；反応混合液中で生じた５α，６α−エポキシド（５α，６α−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタンヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）から５β，６β−エポキシド（５β，６β−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール）を分離すること；［３Ｈ］−リチウムアルミニウムを含有するテトラヒドロフラン中で５α，６α−エポキシドをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオールを生成させること；及び酢酸の水性混合液中で［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオールをインキュベートして、［６β−３Ｈ］−テストステロンを生成させることにより、テストステロンが６β位においてのみ標識される。
【００４８】
上記のさらなる実施形態において、加湿性ポリマーは、固相抽出カートリッジ又はカラムの内側に充てんされる。上記の何れか１つの特に好ましい実施形態において、本方法は、インキュベーションを行うための第一のマルチウェルプレート、インキュベーション後にトリチウム化水から標識ジクロフェナックを分離するための、マルチウェルプレートと同じ配列であるマルチカラムプレート及び、その中のトリチウムを測定するためにマルチカラムからカラムの空隙容量及び洗浄液を回収するための第二のマルチウェルプレートを含むマルチウェルプレート形式で行われる。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン」とは、６β位においてのみ標識されたテストステロン及び１、２、６β及び７位において標識されたテストステロンを指す。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「検体」という用語は、分子、化合物、化学物質、組成物、薬物などを指す。
【００５１】
本発明の詳細な説明
本発明は、チトクロムＰ−４５０アイソフォーム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）活性を評価するための、及びＣＹＰ３Ａ４活性又は発現の調節因子を同定するための、迅速かつ高感度のテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイを提供する。とりわけ、本発明は、ＣＹＰ３Ａ４／５を含有する混合物中のＣＹＰ３Ａ４／５の活性を評価するためのアッセイを提供する。本アッセイは、可逆的阻害アッセイ及び機能ベース又は時間依存的阻害アッセイの両方を含む。混合物の例として、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）などの様々な組織からのミクロソーム；組み換えＣＹＰ３Ａ４／５を発現する発現ベクターを含有する哺乳動物又は昆虫細胞からのミクロソーム；又は肝細胞、何らかの上記混合物中で検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害する可能性及び肝細胞において検体がＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導する可能性が含まれる。好ましくは、ＣＹＰ３Ａ４／５は、ヒトＣＹＰ３Ａ４／５である。本アッセイは、検体の存在下での、ＣＹＰ３Ａ４／５が介在する、６β位においてトリチウム標識されたテストステロンの６β−ヒドロキシル化において生じる［３Ｈ］−Ｈ２Ｏとしてのトリチウムの放出を検出することに基づき、本アッセイにおいて、時間経過による放出の増減は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の調節因子であることを示す。例えば、検体存在下でのＨＬＭ中のトリチウム放出の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤であることを示し、一方、検体での肝細胞処理後の肝細胞におけるトリチウム放出の増加は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の誘導剤であることを示す。吸着剤を用いて固相抽出プロセスにおいてトリチウム化テストステロンからトリチウム化水生成物を分離する。この吸着剤は、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する基材を含む。インキュベーション、生成物分離及び放射活性カウントを含むアッセイの全段階をマルチウェル形式で行い、これは自動化することができる。
【００５２】
ある態様において肝細胞を用いてＣＹＰ３Ａ４／５の活性を誘導又は阻害する検体を同定するための実施形態により、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードする遺伝子の発現を阻害又は誘導する検体、即ち、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードする遺伝子の転写に影響を与える検体が同定される。別の態様における実施形態によって、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードするｍＲＮＡの転写後プロセシングに影響を与えることによりＣＹＰ３Ａ４／５活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。さらなる態様における実施形態によって、ＣＹＰ３Ａ４／５をコードするｍＲＮＡの翻訳に影響を与えることによりＣＹＰ３Ａ４／５活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。さらなる態様における実施形態によって、ＣＹＰ３Ａ４／５と直接又は間接的に相互作用することによりＣＹＰ３Ａ４／５活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。
【００５３】
ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を評価するための実施形態は、例えば新しい化学物質を用いて代謝安定性試験を行うためのこれらの肝細胞を使用する前など、市販のバッチの肝細胞の活性又は研究室内で単離された肝細胞の質を調整するために有用である。ＣＹＰ３Ａ４調節因子を同定するための実施形態は、さらなる開発から強力な阻害剤又は誘導剤である候補薬物を排除するために、候補薬物の潜在的なＣＹＰ３Ａ４／５阻害又は誘導を評価するのに有用である。何れかの実施形態において、本発明は、検体のＣＹＰ３Ａ４／５阻害又は誘導の可能性を評価するためにＨＰＬＣ分離及び質量分析に依存する先行技術のアッセイよりも重要である。
【００５４】
本アッセイは本明細書中でＨＬＭ又は肝細胞を用いて説明されるが、本アッセイは、精製組み換えＣＹＰ３Ａ４／５又は、例えば腎臓、腸、肺などの他の組織から分離されたミクロソーム又はミクロソームを含有するその他の細胞内分画を使用し得る。ＣＹＰ３Ａ４／５、好ましくはヒトＣＹＰ３Ａ４／５を発現する、プラスミド又はウイルスベクターを含有する哺乳動物細胞からミクロソームを調製することができる。ミクロソームは、ＣＹＰ３Ａ４／５及びＰ４５０レダクターゼを発現する組み換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞由来であり得る。組み換えＣＹＰ３Ａ４／５を発現する細胞の長所は、ＣＹＰ３Ａ４／５が、これらのミクロソームにおいて存在する唯一のチトクロムＰ４５０であり、通常は比活性がより高いことである。組み換えＣＹＰ３Ａ４を用いたアッセイに対する濃度範囲は約１から１００ｐｍｏｌ／ｍＬであり、好ましい濃度は、約５から５０ｐｍｏｌ／ｍＬの間である。時間依存的アッセイの場合、酵素は５から１０倍高いものであるべきである（第二のインキュベーションにおける最終希釈のため。）。
【００５５】
ＣＹＰ３Ａ４／５の活性の阻害について検体を試験するために、ＣＹＰ３Ａ４／５活性における阻害効果について試験すべき検体、基質プローブとしての６β位においてトリチウム標識されたテストステロン、適切な基質濃度を与えるための非標識テストステロン、プールしたＨＬＭ及び生理的ｐＨの緩衝液を含む水性混合液を含有する第一の容器を提供する。通常、トリチウム標識テストステロンの約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍの間を使用し、好ましくは、標識テストステロンは約１，０００，０００ｄｐｍである。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６ベータ位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から２００，０００ｄｐｍの間で使用することができる。非標識テストステロンの量は、約１から１００μＭの間、通常は約６０μＭである。プールされたＨＬＭは、一般に約０．０５から２ｍｇ／ｍＬ、通常約０．２５ｍｇ／ｍＬである。適切な緩衝液の例は、０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．６である。最終体積は、好ましくは約１００μＬから２００μＬの間である。好ましくは、検体に対して使用されるビヒクルの当量を含有する対照を提供する。
【００５６】
通常、１、２、６及び７位でトリチウム標識された市販のテストステロンを基質プローブとして用いてアッセイを行うことができる一方、好ましい基質プローブは、６β位においてのみトリチウム標識されたテストステロンである。６β位においてのみ標識されたトリチウム化テストステロンを本アッセイで使用する場合、分画変換速度及びアッセイの感度の両方が向上する。さらに、１、２、６及び７位において標識された市販のテストステロンを用いた反応は好ましくは約２００μＬの体積で行われるが、一方、６β位においてのみ標識されたテストステロンを用いた反応は、約１００μＬの体積で行うことができる。［６β−３Ｈ］−テストステロンの合成は、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８０：４７１７−４７２１（１９５８））、Ｔｏｆｔら（Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，９：４１３（１９７３））及びＬｉｓｔｏｎ及びＴｏｆｔ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３４：２２８８（１９６９））により、及び実施例１で述べられている。
【００５７】
３７℃にて数分間緩衝液中でミクロソームの好ましいインキュベーション段階を行った後、約５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、約３ｍＭ ＭｇＣｌ２及び約１ユニット／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有するＮＡＤＰＨ再生系あり又は無しで、約１ｍＭ ＮＡＤＰＨを水性混合液に添加して反応混合物を形成し、次いでこれをテストステロンの６βヒドロキシル化が可能となるのに十分な時間、３７℃でインキュベートする。通常、約１０分間という時間は、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を検出するのに一般に十分である。場合によっては、様々な時間の長さで複数のアッセイを行う。次に、約０．１Ｎの濃度のＨＣｌなどの酸を添加することにより、反応混合物を反応停止させる。好ましくは、トリチウム化テストステロンからトリチウム化水を分離するための抽出カートリッジ又はカラムに反応混合物を移す前に、水性混合液からＨＬＭを除去する。ろ過、遠心分離などにより、水層からＨＬＭを除去することができる。好ましい実施形態において、遠心分離によりＨＬＭを除去する。反応の酸性化によりＨＬＭにおけるタンパク質が沈殿するので、低速遠心分離を用いてＨＬＭのタンパク質を除去することができる。
【００５８】
テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに、ＨＬＭが除去された水性混合液又はＨＬＭを含有する反応混合物を移す。カラムからの、空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水がないか、又は陽性対照においてトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が減少していることは、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤であることを示す。
【００５９】
肝組織からの肝細胞の調製物のＣＹＰ３Ａ４／５活性を次のように調べる。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。培地中、又は肝細胞を培養するのに適切な水性混合液中で、５％ＣＯ２及び９５％空気又は酸素の加湿環境中で３７℃において肝細胞を維持する（例えば、Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐｏｌｌａｎｄ及びＷａｌｋｅｒ編）ｐｐ．１６１−１７６、Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９８９））を参照のこと。）。懸濁液中又は細胞培養プレートに接着した培養細胞においての何れかの細胞を用いてアッセイを行うことができる。懸濁液アッセイの場合、通常、約１ｘ１０５個の細胞／ｍＬから約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度、好ましくは約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度で肝細胞をインキュベートする。したがって、各培養ウェルは、約１ｘ１０６個の細胞、肝細胞培地（ＨＣＭ）１ｍＬ（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、前出）、非標識テストステロン及びトリチウム標識テストステロンを含有する。通常、約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍの間のトリチウム標識テストステロンを使用する。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６β位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から５００，０００ｄｐｍの間であり得る。非標識テストステロンの量は、約１から２００μＭの間、通常は約６０から２００μＭの間である。プレーティングされた細胞においてアッセイを行う場合、組織培養プレートに肝細胞をプレーティングし（好ましくは、培養プレートはコラーゲン被覆した２４又は９６ウェル組織培養プレートである。）、新鮮な肝細胞の培養に適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境において３７℃にて維持する。好ましくは、培地にＩＴＳを添加する。通常、約１５０，０００から２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞をプレーティングする。
【００６０】
インキュベーション後、例えば遠心分離によりインキュベーション液を細胞から除去し、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で数回洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。生成したトリチウム化水の量により、肝細胞の相対的ＣＹＰ３Ａ４／５活性が決定される。
【００６１】
検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性を阻害する能力を調べるためのアッセイは次の通りである。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。懸濁液中又は細胞培養プレートに接着した培養細胞においての何れかの細胞を用いてアッセイを行うことができる。懸濁液アッセイの場合、上記のように肝細胞を培養するのに適切な培地中で５％ＣＯ２の加湿環境中で３７℃にて肝細胞を維持する。通常、肝細胞は、１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度でインキュベートする。非懸濁液アッセイの場合、コラーゲン被覆したプレートに肝細胞をプレーティングし、肝細胞を培養するのに適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境中で３７℃にて維持する。したがって、各培養ウェルは、約１ｘ１０６個の細胞、ＨＣＭ １ｍＬ、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性における阻害効果について試験すべき検体、非標識テストステロン及びトリチウム標識テストステロンを含有する。通常、トリチウム標識テストステロン約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍを使用する。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６β位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から５００，０００ｄｐｍであり得る。非標識テストステロンの量は、約１から２００μＭ、通常は約６０から２００μＭの間である。好ましくは、検体に対するビヒクル又はケトコナゾールなどのＣＹＰ３Ａ４阻害剤を含む対照を提供する。
【００６２】
インキュベーション後、細胞からインキュベーション液を除去し、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で数回洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水がない、又はビヒクルのみを含有する対照におけるトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が減少していることは、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤であることを示す。
【００６３】
検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性を誘導する能力を調べるためのアッセイは次の通りである。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。組織培養プレートに肝細胞をプレーティングし（好ましくは、培養プレートはコラーゲン被覆した２４又は９６ウェル組織培養プレートである。）、新鮮な肝細胞の培養に適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境において３７℃にて維持する。好ましくは、培地にＩＴＳを添加する。通常、肝細胞を約１５０，０００から２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングする。２４時間から７８時間後、培地を除去し、新鮮な培地及び、誘導の可能性についての試験を行う検体を肝細胞に添加する。好ましくは、検体に対するビヒクル又はリファムピシンなどの公知の誘導剤の何れかを含有する対照を提供する。上記のようにＣＹＰ３Ａ４／５の誘導に十分な時間（通常は約２４時間から７８時間）、肝細胞をインキュベートした後、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性を調べる。
【００６４】
生理的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）の緩衝液を含有する平衡塩類溶液を含有するインキュベーション液中で肝細胞をインキュベートする。平衡塩類溶液の例は、Ｈａｎｋ’平衡塩類溶液であり、適切な緩衝液の例は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳである。次に、非標識テストステロン及びトリチウム標識テストステロンを含有する混合液を添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を評価するのに適切な時間（約１時間）上述のように肝細胞をインキュベートするが、一般に約１時間は十分な時間である。通常、トリチウム標識テストステロン約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍ／ｍＬを使用し、好ましくは、標識テストステロンは約１，０００，０００ｄｐｍ／ｍＬである。好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロンは６β位においてのみ標識され、これは、約１００，０００から５００，０００ｄｐｍ／ｍＬの間で使用することができる。非標識テストステロンの量は約１から３００μＭの間であり、通常約６０μＭである。場合によっては、平行したインキュベーションを行うが、これは、検出された酵素活性が特異的にＣＹＰ３Ａ４／５により媒介されることを確認するために、ＣＹＰ３Ａ４阻害剤ケトコナゾールを含有する。
【００６５】
インキュベーション後、インキュベーション液を細胞から除去し、テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する、抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ３Ａ４／５によりトリチウム化テストステロンから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水が存在すること、又はビヒクルのみを含有する対照におけるトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が増加していることは、検体がＣＹＰ３Ａ４／５活性の誘導剤であることを示す。
【００６６】
下記で考察し、本発明の好ましい態様において実施例１で示すように、マルチウェル形式、好ましくは９６ウェル形式で本アッセイを行う。マルチウェル形式により複数の検体を同時に試験できるようになる。マルチウェル形式において、マルチウェルプレートのウェル（第一の容器）中で各反応を行う。反応終了時及びＨＬＭを除去する任意の段階後のトリチウム化テストステロンからのトリチウム化水の分離は、複数の小型カラム（それぞれが本明細書中で開示する吸着剤を含有する。）を含む精密ろ過／抽出カラムプレートの個々のカラムに各反応液を添加することにより行う。好ましくは、精密ろ過／抽出カラムプレートのカラムはマルチウェルプレートに対するものと同じように配置する。精密ろ過／抽出カラムプレートと同じ形式である第二のマルチウェルプレートで空隙容積及び洗浄液を回収し、シンチレーション液と混合し、マルチウェル形式中の試料をカウントするために適合させたシンチレーションカウンターにおいてカウントする。
【００６７】
吸着剤はテストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する、すなわち、吸着剤は標識テストステロンに吸着又は結合することができるが、ヒドロキシル化により生成した標識水には吸着又は結合しない。テストステロンなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤としては、以下に限定されないが、ポリスチレン−ジビニルベンゼン又はポリ（ジビニル−ベンゼン−ビニルピロリドン）などの疎水性又は脂溶性ポリマーを含有する吸着剤、吸着剤が標識テストステロンに結合するがトリチウム化水に結合しないことを可能にするような比で脂溶性及び親水性モノマーを含有する加湿性ポリマー及びＣ２−Ｃ１８シランなどのシリコンベースの吸着剤が挙げられる。
【００６８】
加湿性ポリマーを含有する吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される。脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン及びＣ２−Ｃ１８−アルキル基などの脂溶性部分を含み得る。特に有用な脂溶性モノマーとしては、ジビニルベンゼン及びスチレンが挙げられる。親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基（例えば、ピロリドニル基又はピリジル基）などの親水性部分を含み得る。あるいは、親水性基はエーテル基であり得る。特に有用なモノマーとしては、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン及びエチレンオキシドが挙げられる。加湿性ポリマーのある実施形態において、ポリマーは、１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含む、好ましくは、約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーである。好ましい加湿性ポリマーの例は、ＷＯ９７３８７７４及び米国特許第６，７２６，８４２号（両方ともＢｏｕｖｉｅｒらに対するものである。）で開示されている。好ましい吸着剤はＯＡＳＩＳ ＨＬＢ吸着剤であり、これは、Ｎ−ビニルピロリドンとジビニルベンゼンモノマーとの調和の取れた割合を含み、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）から市販されている。
【００６９】
シリコンベースの基材又はマトリクスを含有する吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。吸着剤は、非極性化合物を抽出することが当技術分野で周知の１以上のシランを含み得る。このような吸着剤としては、以下に限定されないが、フェニルシラン、ブチルジメチルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン又はオクタデシルシランが挙げられる。シランは、単官能性又は三官能性であり得る。シリカ基材又はマトリクスとしては、以下に限定されないが、固体もしくは多孔性シリカ又はセラミック粒子又は微粒子又はシリカゲルが挙げられる。
【００７０】
本方法の好ましい実施形態において、吸着剤は、固相抽出カートリッジ又はカラムを形成するように開口容器中に充てんされた、粒子、ビーズなどとして提供される。本発明の特定の実施形態において、吸着剤は、多孔性膜に捕捉された、固相抽出カートリッジ又はカラムに充てんされる。他の実施形態において、固相抽出カートリッジ又はカラムはさらに、吸着剤に隣接した固相抽出カートリッジ又はカラムの片端もしくは両端で、又はその付近で、フィルター成分などの多孔性の保持手段又はガラス原料を含む。多孔性保持手段は、固相抽出カートリッジ又はカラム内に吸着剤を保持するためである。さらなる実施形態において、一対の多孔性保持手段の間に吸着剤を配置するが、第一の多孔性保持手段は固相抽出カートリッジ又はカラム内で吸着剤を保持し、第二の保持手段はまた、カラム中の吸着剤の保持を補助し、ＨＬＭなどの固体材料が吸着剤と混合されるのを防ぐ。フィルター又は硝子材料は、例えば、フリット硝子又は多孔性ポリマー、例えば高密度ポリエチレン、ＴＥＦＬＯＮ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＤＥ）又はポリカーボネートなどである。
【００７１】
図１は、本発明の方法の実施に適切な固相抽出カートリッジ又はカラム１０の例の横断面図を示す。カラム１０は、壁１４を有する伸長体１２（これは、軸方向の空洞部１６を規定する。）、水性混合液を受容するための、カラム１０の遠位端２０のインレット１８及び、水性混合液を排出するための、カラム１０の近位端２４のアウトレット２２から構成される。図１でさらに示されるように、近位端２４に多孔性保持手段２６が隣接し、これは面２８を有する。多孔性保持手段２６は、面２８がカラム１０の壁１４に垂直であるように、カラム１０において近位端２４に隣接して位置する。多孔性保持手段２６の面２８には吸着剤３０が配置される。場合によっては、示されるように、第二の多孔性保持手段３２が、遠位端２０に隣接して、もしくはその付近に位置し得、吸着剤３０はそれらの間に配置され得る。カラム１０は、水性混合液がインレット１８を介して容器に入り、カラム１０内で吸着剤３０に接触し、アウトレット２２を介してカラム１０から排出されることを可能にする。好ましくは、吸着剤３０は、好ましくは直径が約３０から６０μｍであるビーズなどの小粒子としてカラム１０中に充てんされる。
【００７２】
好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニングに特に適切な形式を与えるために、複数のカラム１０を配置する。例えば、固相抽出カートリッジ又はカラム（好ましくは、小型固相抽出カートリッジ又はカラム、つまり、ミニカラム）を与えるために、複数のウェルを含む、マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレートを適合させた。好ましいマルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレート形式では、マルチウェル組織培養プレートに対して使用される形式に対応する形式でミニカラムが配置される。例えば、精密ろ過／抽出カラムプレートのミニカラムは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル又は３８４ウェル形式で配置することができる。好ましい実施形態において、マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレートでは、９６ウェル形式でミニカラムが配置される。例として、図２は、水性混合液を受容するための開口部１４と水性混合液を排出するためのアウトレット１０６とを有する複数のミニカラム１０２を含むマルチカラム精密ろ過／抽出プレート１００を示し、ここで、ミニカラム１０２のそれぞれは、９６−ミニカラム形式で並べられた図２のカラム１０に対して示されるものと同様の内部配置を含む。遠心分離又は減圧により、このカラムを介して、９６ウェル形式で配置されたウェルを含有する回収プレートへの水性混合液の移動が達成され得る。マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレート及び、このプレートを使用するための方法ならびに装置は、多くの米国特許、例えば、米国特許第６，５０６，３４３号（Ｂｏｄｎｅｒらに対する。）、同第６，４９１，８７３号（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＷｏｅｌｋに対する。）及び同第６，３３８，８０２号（Ｂｏｄｎｅｒらに対する。）及び米国公開特許出願第２００３０１４３１２４号（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＧｒｅｎｚに対する。）で開示されている。
【００７３】
ＣＹＰの可逆的阻害に加えて、ある種の検体又はそれらのＣＹＰにより生成された代謝産物による不可逆的又は見かけ上不可逆的な不活性化が起こり得る。このタイプの阻害、作用機序に基づく又は時間依存的阻害（ＭＢＩ）と呼ばれるもの、は、阻害剤存在下で酵素活性が進行性に時間依存的低下を示すことを特徴とする。ＣＹＰの３種類の作用機序に基づく（時間依存的）不活性化が報告されている：（ｉ）阻害剤が酵素アポタンパク質に共有結合する；（ｉｉ）阻害剤が合成ヘムに共有結合する；（ｉｉｉ）阻害剤がきつく（見かけ上不可逆的に）ヘム又はアポタンパク質に結合する。ＣＹＰ３Ａ４／５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｅ１を含む殆どのヒト肝臓薬物代謝ＣＹＰは、作用機序に基づく阻害（ＭＢＩ）にさらされる（Ｚｈａｎｇ及びＷｏｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．６：２４１−２５７（２００５）；Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．４：４２３−４５９（２００３）；Ｚｈｏｕら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．５：４１５−４４２（２００４）；Ｚｈｏｕら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４：２７９−３０４（２００５））。
【００７４】
インビボでの影響が必ずしも明らかではない可逆的ＣＹＰ阻害に対して、ＭＢＩは殆ど常に、臨床的に関心のある薬物−薬物相互作用を導く。実際に、ＭＢＩは、臨床的な薬物−薬物相互作用に対する主要な原因の１つと現在では考えられていおり、過去において潜在的に見過ごされてきた。
【００７５】
ＭＢＩが活性酵素の時間依存的喪失を導くので、同じＣＹＰにより代謝される薬物の薬物動態における時間依存的ＣＹＰ阻害剤の臨床的影響は次の通りである。
・ＭＢＩは、連続投与において非定常のＰＫを引き起こす。
・薬物−薬物相互作用の程度は発現及び消失において時間依存的である。
・腸管腔で阻害剤が高濃度であると、基質において顕著な影響が生じ、腸代謝によりその経口でのバイオアベイラビリティーが制限される。
【００７６】
ＣＹＰ３Ａ４は、主要な肝臓及び腸ＣＹＰの１つであり、臨床で使用される薬物の５０％超の代謝に関与する。ＣＹＰ３Ａ４の時間依存的阻害剤としては、カルシウムチャネルブロッカーベラパミル、ニカルジピン、ジルチアゼム及びミベフラジル；抗プロゲスチン剤ミフェプリストン；マクロライド系抗生物質トロレアンドマイシン、エリスロマイシン及びクラリスロマイシン；及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤リトナビル及びネルフィナビルが挙げられる。
【００７７】
したがって、本発明はまた、上述の、可逆的又は見かけ上可逆的なアッセイに加えて、作用機序に基づくアッセイ又は時間依存的アッセイも提供する。化合物が時間依存的ＣＹＰ阻害剤として作用する可能性を評価するために、一連の様々な長さの時間（通常、０分から６０分間）、ＮＡＤＰＨ再生系存在下で、検体をＣＹＰ３Ａ４／５とともにプレインキュベートする。一般に、可逆的阻害アッセイにおいて使用される量よりも約５から１０倍多い量でＣＹＰ３Ａ４／５を提供する。温度不安定性による酵素活性の喪失を監視するために、阻害剤非存在下で対照インキュベーションを行う。プレインキュベーション終了時に、時間０のプレインキュベーション時間対照に対する、酵素的に活性なＣＹＰの量の変化を調べる。プレインキュベーションが約１０倍希釈され、基質が添加される第二のインキュベーションを行うことにより、これを遂行する。特定の時間間隔の間に形成される生成物の量を測定することにより、酵素活性を求める。時間依存的ＣＹＰ阻害アッセイに使用される通常の基質は、上記可逆的阻害アッセイに対して使用されるものと同じである。例えば、テストステロンとのＣＹＰ３Ａ４／５に対するＫｍは約５０μＭであり、テストステロンの好ましい濃度は、約２００から５００μＭの間である。実施例４は、ＨＬＭを用いた時間依存的アッセイの例を提供する。
【００７８】
第二のインキュベーションにおける試験検体により生じる何らかの可逆的ＣＹＰ阻害効果を最小限に抑えるために、プレインキュベーション混合液を数倍希釈（通常、５−２０倍）し、半最大活性に必要とされる濃度より数倍（通常、５−１０倍）高い濃度でＣＹＰ基質を添加し（試験化合物による競合的阻害を最小限に抑えるために。）、インキュベーション時間を短くする（通常１０分間）。検体が時間依存的阻害剤として作用する場合、ＣＹＰとのプレインキュベーションは、擬一次反応速度式による酵素活性の喪失を引き起こす。各阻害剤濃度に対して、残存酵素活性の％（阻害剤なしの対照に対して。）は、次の式に従い時間とともに変化する。
【００７９】
【数１】
（式中、ｋは、実測の擬一次不活性化速度定数であり、これは、次の関係に従いプレインキュベーション中の阻害剤濃度に関連する。
【００８０】
【数２】
（式中、Ｉは阻害剤濃度であり、ｋｉｎａｃｔは最大不活性化速度定数であり、Ｋ０．５は、５０％ｋｉｎａｃｔでの阻害剤濃度であり、ｎはＨｉｌｌ係数である。））ｋｉｎａｃｔ及びＫ０．５を求めるために、非線形回帰分析を用い、Ｉに対するｋの曲線を数式２にフィットさせる。
【００８１】
次の実施例は、本発明のさらなる理解を促すものである。
【実施例１】
【００８２】
この実施例は、本発明のアッセイの開発及びＣＹＰ３Ａ４／５活性の阻害剤を同定するためのその使用を説明する。
【００８３】
［６β−３Ｈ］−テストステロンの合成。［６β−３Ｈ］−テストステロンの合成は次の通りである。
【００８４】
【化１】
【００８５】
クロロホルム１４ｍＬ中のテストステロン−３−エチレンアセタール（１、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩより入手。）０．８５ｇの撹拌溶液に、氷−塩浴で冷却しながら、酢酸ナトリウム０．１ｇ及び過酢酸（３６％）１ｍＬを添加した。２時間後、最初に１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５ｍＬ）、次いで水（２ｘ５ｍＬ）で溶液を洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（６０ｇ、シリカゲル、溶出液としてヘキサン：アセトン）を用いることにより、形成された５β，６β−エポキシド（５β，６β−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール；２）及び５α，６α−エポキシド（５α，６α−エポキシ−１７β−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン，３−エチレンアセタール；３）（本反応で精製させた。）を互いに分離した。５α，６α−エポキシド（３）を含有する分画を回収し、蒸発乾固し、生成物３３０ｍｇを得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）＋３４９（１００％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）Ｌｉｓｔｏｎ及びＴｏｆｔ，前出を参照のこと。）。
【００８６】
【化２】
【００８７】
［３Ｈ］−水素化アルミニウムリチウム（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手した、ＬＡＴ、１００ｍＣｉ）とともに１時間、窒素雰囲気下で撹拌しながら、無水テトラヒドロフラン（２ｍＬ）中の５α，６α−エポキシ（３、３.４８ｍｇ）を還流下で加熱し、［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α,１７β−ジオール（４）を生成させた。１％水酸化ナトリウム水溶液を用いて反応混合物の反応を停止させ、エーテル（１０ｍＬ）で希釈し、水（２ｘ５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発乾固し、さらなる精製を行わずに残渣を次の反応に対して使用した（全放射能２０ｍＣｉ）。
【００８８】
【化３】
【００８９】
［６β−３Ｈ］−３，３−エチレンジオキシアンドロスタン−５α，１７β−ジオール（４、２０ｍＣｉ）を酢酸（０．１５０ｍＬ）及び水（０．０５ｍＬ）の混合液とともに１００℃で１５分間加熱した。溶液を室温に冷却し、エーテル（２ｘ１０ｍＬ）で抽出した。有機層を重炭酸ナトリウム飽和溶液（５ｍＬ）、水（２ｘ５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗製生成物（５、１０ｍＣｉ）をメタノール（５ｍＬ）、水（２ｍＬ）中で溶解させ、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（０．１ｍＬ）で処理した。溶液を室温にて１６時間撹拌し、次いで酢酸（０．１ｍＬ）で処理した。ロータリーエバポレーターで溶液を半分の体積まで蒸発させた。逆相ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ フェニルヘキシルカラム、０．１％ＴＦＡ含有の水：アセトニトリル、５５：４５、ＵＶは２５４ｎｍ、流速４ｍＬ／分）、保持時間は１０．５分であった。）により粗製生成物を精製した。合わせた分画をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８に通し、エタノール（１０ｍＬ）でさらに洗浄し、［６β−３Ｈ］−テストステロン（６）２．２ｍＣｉを得た。比放射能は、ＬＣ／ＭＳにより計算したところ１．６Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。
【００９０】
トリチウムＮＭＲにより、トリチウム標識の位置がテストステロンの６β位にあることが確認された。ＬＣ／ＭＳ２８９（ＭＨ）＋、２９０（ＭＨ＋１）＋、２９１（ＭＨ＋２）＋。プロトンＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３，δ）０．７９（３Ｈ、ｓ １８−Ｈ３）、１．２（３Ｈ，ｓ，１８−Ｈ３）、５．７３（１Ｈ，ｓ，４−Ｈ）。トリチウムＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３，δ）２．１（１ Ｔ，ｓ，６β−トリチウム）。
【００９１】
［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの精製。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを購入した。極性不純物を除去するために、市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの一定分量（約０．１ｍＣｉ）を真空下で乾燥させ、水で再構成し、３０ｍｇＷａｔｅｒｓ ＯＡＳＩＳ抽出カートリッジ（製造者の説明書に従い前もって調整した。）に載せた。ＯＡＳＩＳ抽出カートリッジは、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）から購入した。水５ｍＬで洗浄した後、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンをメタノール２ｍＬで溶出し、再び乾燥させ、エタノール中で再構成した（元の一定分量と同体積）。
【００９２】
［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた放射分析ＣＹＰ３Ａ４アッセイ。２００μＬの最終体積中に精製［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロントレーサー（０．２から０．５μＣｉ）、非標識テストステロン（６０μＭ、別段の指示がある場合を除く。）、プールしたヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）（０．２５ｍｇ／ｍＬ、別段の指示がある場合を除く。）及び０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．６を含有する９６ウェルコニカルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡより入手可能）中で反応を行った。プールしたＨＬＭは、Ｇｅｎｔｅｓｔ Ｃｏｒｐ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手した。ＤＭＳＯ中の保存溶液から、阻害剤を反応混合物に添加し、最終溶媒濃度を０．６％（ｖ／ｖ）とした。阻害剤なしの対照はビヒクル当量を含有した。３７℃にて１０分間のプレインキュベーション後、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ及び、５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、３ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１Ｕ／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有するＮＡＤＰＨ再生系を添加することにより、反応を開始させた。３７℃にて１０分間アッセイを行い、０．１Ｎの最終濃度になるようにＨＣｌを添加することにより反応停止させた。次に、マイクロプレートローターにおいてプレートを１０分間遠心分離し、前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳ９６ウェルＨＬＢプレートのウェルに上清を載せた。ＯＡＳＩＳ吸着剤１０又は３０ｍｇを含有するＯＡＳＩＳ ＨＬＢ９６ウェル抽出プレート及び真空マニホールドはＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．から購入した。真空にして、空隙容積を回収プレートで回収した。次に、水２００μＬを添加し、再び真空にして、同じプレートで洗浄液を回収した。この段階を繰り返した。プールした空隙容積及び水洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、β−シンチレーションカウンタ中でカウントした。あるいは、ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて２４ウェルシンチレーションプレート中で一定分量に対してカウントした。酵素活性の計算のために、ＮＡＤＰＨ再生系なしで行った対照インキュベーションで得られたカウントを差し引くことにより、生成物カウントを補正した。
【００９３】
［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた放射分析ＣＹＰ３Ａ４アッセイ。アッセイ手段は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンヒドロキシル化アッセイと同様であるが次の改変がある。
【００９４】
全放射能は１００，０００から２００，０００ｄｐｍであり、反応体積は１００μＬであり、溶媒濃度（阻害剤保存溶液由来）は０．３から０．７％ＤＭＳＯ及び０．５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）であった。１０ｍｇＯＡＳＩＳ９６ウェルＨＬＢプレートを用いて生成物分離を行った。空隙容積を回収し、７５μＬ水洗浄液と合わせた。Ｂｅｃｋｍａｎ βシンチレーションカウンタを用いて放射活性を調べるか、又は、ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンタを用いて９６ウェルシンチレーションプレート中で１２０μＬの一定分量に対してカウントを行うことにより、放射活性を調べた。
【００９５】
６β−ヒドロキシテストステロン及び２β−ヒドロキシテストステロンの定量。ＣＴＣＡｎａｌｙｔｉｃｓ ＰＡＬ自動サンプラー（ＨＴＳ ＰＡＬ；ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＨＰＬＣにより、アッセイ反応混合物の一定分量及び代謝産物の一定分量の標準曲線を分析した。ＸＴＥＲＲＡ ＭＳ Ｃ１８カラム（４．６ｍＭｘ５ｃｍ；５μｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）において、１ｍＬ／分の流速で、水中０．１％ギ酸（Ａ）及びアセトニトリル中０．１％ギ酸（Ｂ）（５から１００％Ｂの４分間の直線的勾配；１００％Ｂで２分間。）からなる移動相を用いてクロマトグラフィーを行った。最初の１分間、溶離液を捨て、次いで、陽イオンモードで操作されるＴｕｒｂｏ Ｉｏｎｓｐｒａｙイオン化ソースを備えたＳｃｉｅｘ ＡＰＩ−２０００トリプレット四極子質量分析装置に送った。スプレー電圧は５５００Ｖであり、ソース温度は４５℃であり、カーテンガス設定は１０であり、クラスタ分離電位は６０Ｖであり、フォーカシング電位は２５０Ｖであり、衝突エネルギーは２５Ｖであった。代謝産物を検出し、遷移ｍ／ｚ３０５．０から２６９．１により同定した。Ａｎａｌｙｓｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄソフトウェアバージョン１．４を用いて、標準曲線のそれに対するピーク領域比の加重線形最小二乗回帰分析により、代謝産物濃度を調べた。
【００９６】
トリチウム動的同位体効果の決定。次の式（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８７：６０７−６２５（１９８２））に従い、Ｖ／Ｋ比に対する、ＴＶ／Ｋ、動的同位体効果を調べた：
【００９７】
【数３】
（式中、ｆは生成物に対する基質の分画変換であり、ＳＡ０は標識基質の最初の比放射能であり、ＳＡＰは生成物の比放射能である。）。本実験において観察されるもののようなｆ（＜５％）の低値において、この式は、次の式に変形される（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８７：６０７−６２５（１９８２））：
【００９８】
【数４】
【００９９】
トレーサー競合実験からの非標識生成物の見かけの形成速度の計算。［６β−３Ｈ］−テストステロンの固定量及び非標識テストステロンの様々な濃度を用いてアッセイを行う場合、非標識生成物の形成速度ｖは、次式により与えられる：
【０１００】
【数５】
（式中、ｖ＊はトリチウム化水の形成速度である。）。式４から差し引くことにより、
【０１０１】
【数６】
を得て、動的同位体効果で割った非標識生成物の形成速度としてｖ’を定義し、つまり、
【０１０２】
【数７】
であり、次式：
【０１０３】
【数８】
を得る。既知のＴＶ／Ｋ比（これは、ＳＡｐ由来であったため、同語を繰り返すことになる。）を用いずに、ｖ’、非標識生成物の見かけの形成速度を計算できる。基質濃度、Ｓに対してプロットし、Ｈｉｌｌの式へフィットさせた場合（式９）、Ｖ’ｍａｘ、Ｓ５０、５０％での基質濃度及びｎ、Ｈｉｌｌ係数を導き出すことができる。
【０１０４】
【数９】
（式中、
【０１０５】
【数１０】
つまり、生成物形成の見かけの最大速度である。
【０１０６】
曲線のフィッティング。ＸＬＦＩＴ４．０（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を用いて、非線形回帰により、Ｈｉｌｌの式又は４パラメーターロジスティック阻害モデル（Ｒｏｄｂａｒｄ及びＦｒａｚｉｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７：３−２２（１９７５））への曲線のフィッティングを行った。
【０１０７】
結果
９６ウェル固相抽出プレートを用いた放射性標識テストステロン及び［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの分離。１０ｍｇ又は３０ｍｇＯＡＳＩＳ吸着剤を含有する９６ウェル抽出プレートに、精製［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン（１０４から１０７ｄｐｍ）を含有するアッセイ緩衝液の溶液及び停止溶液を載せた場合、９９．９％を超える放射活性がプレートに保持された。放射活性の０．０４５±０．００６％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝７）のみが合わせた空隙容積及び水性洗浄液において溶出された。［６β−３Ｈ］−テストステロンの場合、放射活性の０．１３±０．１％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）が水性分画において溶出された。メタノールで溶出することにより、標識テストステロンを回収できた。標識テストステロンとは異なり、［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ（１０２から１０５ｄｐｍ）は同じ条件下で保持されなかった。１０ｍｇ及び３０ｍｇプレートの両方で、１００μＬ又は４００μＬの水による洗浄後の合わせた空隙容積中で溶出された［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの回収は定量的であった（９４±６％、平均±ＳＤ、ｎ＝６）。放射性標識テストステロン及び水の回収は、６００μＭ以下の濃度の非標識テストステロンの存在によって影響を受けなかった。時間的理由のために、それぞれ、３０ｍｇ及び１０ｍｇＯＡＳＩＳプレートを用いて、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた実験を行った。
【０１０８】
ＨＬＭにおける［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成。ＮＡＤＰＨ再生系存在下で［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンをＨＬＭとともにインキュベートした場合、時間依存的な形式で［３Ｈ］−Ｈ２Ｏが形成された（図３Ａ）。トリチウム化水の形成は、ＮＡＤＰＨに依存した。０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで、ミクロソーム濃度とともに、生成物形成は直線的に増加した。基質として［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いて、同様の結果が得られた（図３Ｂ）。２種類の基質間の主な違いは、ノイズ比に対するシグナル及び分画変換速度であった。ノイズ比に対するシグナルは、ＮＡＤＰＨ非存在に対するＮＡＤＰＨ存在において得られる生成物カウント間の比として定義される。分画変換速度は、単位時間あたり及びミクロソームタンパク質１ｍｇあたりのトリチウム化水に変換された総放射性標識基質の％として表される。表１でまとめるように、ノイズ比に対するシグナルは、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合約７であり、［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合約２０であった。分画変換速度は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合約０．６％／分／ｍｇであり、［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いた場合１０から１４倍高かった。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
ＣＹＰ阻害剤及び抗ＣＹＰ抗体の影響。どのＣＹＰアイソフォームが生成物形成に介在するかを調べるために、一連のアイソフォーム選択的化学阻害剤（Ｂｏｕｒｒｉｅら、１９９６；Ｅａｇｌｉｎｇら、１９９８）もしくはモノクローナル抗体（Ｍｅｉら、１９９９；Ｓｈｏｕら、２０００）の存在下又は非存在下で反応を行った。使用した化学阻害剤は、フラフィリン（ＣＹＰ １Ａ２阻害剤）、クマリン（ＣＹＰ２Ａ６阻害剤）、スルファフェナゾール（ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤）、キニジン（ＣＹＰ ２Ｄ６阻害剤）、ジエチルジチオカルバメート（ＣＹＰ２Ｅ１阻害剤）及びケトコナゾール（ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤）であった。使用したモノクローナル抗体は、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４／５の阻害剤であった。図４Ａ及び４Ｂで示されるように、これらの薬剤の中で、ケトコナゾール及び抗ＣＹＰ３Ａ４／５モノクローナル抗体を除き（これらは、９０％を超えて反応を阻害した。）、ＨＬＭ中からのトリチウム化水の形成に顕著な影響を与えたものはなかった。このことから、本アッセイが、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を検出するのに特異的であったことが示された。
【０１１１】
動的同位体効果。６β−又は２β−位の何れかでのヒドロキシル化の結果として、ＣＹＰ３Ａ４／５が介在する、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウムの喪失が起こり得る（Ｗａｘｍａｎら、前出；Ｙａｍａｚａｋｉ及びＳｈｉｍａｄａ、前出（１９９７））。本実験で使用したＨＬＭのバッチにおけるテストステロン２β−ヒドロキシラーゼの活性は、６β−ヒドロキシラーゼの活性の約１１％であった（データは示さない。）。両方の代謝産物の形成にはＣＹＰ３Ａ４／５が介在するが、これは、全基質濃度範囲にわたり、１０μＭケトコナゾールにより完全に形成が阻害されたからである（データは示さない。）。［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの６β及び２β−位における標識の相対的比率は不明であり、したがって、どの位置からトリチウム喪失が起こったかを知ることはできない。
【０１１２】
［６β−３Ｈ］−テストステロンのＣＹＰ３Ａ４介在性ヒドロキシル化の後、トリチウムが６位からのみ失われ得る。トリチウム置換が動的同位体効果を生み出すか否かを調べるために、同じ反応混合物中での６β−ヒドロキシテストステロン形成速度と［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成速度を比較した。テストステロンのヒドロキシル化において失われるプロトンが６β−ヒドロキシテストステロンとともに化学量論的に形成されることを考慮すると、形成された６β−ヒドロキシテストステロンの量で［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ生成物カウントを割ることにより、トリチウム化水生成物の比放射能を計算することができる（表２）。トリチウム化した分画変換速度及びその既知の最初の比放射能とともに、形成におけるこれを使用して、Ｖ／Ｋにおける動的同位体効果を計算するためにこの情報を使用できる。表２で示されるように、ＴＶ／Ｋは２．３であり、これは、基質／生成物の比放射能比に等しい。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
放射性標識テストステロンと非標識テストステロンとの間の競合。ＨＬＭにおけるトリチウム化水の形成に対する非標識テストステロンの影響を図５Ａで示す。曲線から、「低用量フック」、すなわち、生成物形成速度が非標識基質の濃度上昇とともに上昇し、３０から４０μＭのテストステロン濃度でピークに到達し、次に低下することが示される。［６β−３Ｈ］−テストステロンが同位体トレーサーとして使用されるため、トリチウム化水の形成速度（ｖ＊）は、非標識生成物、すなわち、テストステロンの６β−ヒドロキシル化由来の水（これは、６β−ヒドロキシテストステロンとともに化学量論的に形成される。）の形成速度の典型である。基質濃度（Ｓ）に対するｖ＊の依存性を用いて、非標識生成物の基質濃度への依存に関する情報を得ることができる（後者が直接測定されないとしても。）。発明者らは、ｖ＊、非標識生成物の見かけの形成速度を、動的同位体効果により割った非標識生成物の形成速度（ｖ）として定義する（上記の実験セクションを参照のこと。）。図５Ｂで示すように、Ｓに対するｖ’の曲線をＨｉｌｌの式にフィットさせることができ、Ｓ５０＝９８±１８μＭ、ｎ＝１．４±０．２及びＶ’ｍａｘ＝１．３±０．１ｎｍｏｌ／分／ｍｇ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）であった。Ｈｉｌｌの係数は１より大きかったが、このことから、正の協同作用が示唆される。実際、低基質濃度において、図５Ｂの差込図において示されるように、ｖ’とＳとの間でシグモイド型の関係が見られた。
【０１１５】
６β−ヒドロキシテストステロン形成のカイネティクスを図５Ｃで示す。この反応は、Ｓ５０が６５±１７μＭ、Ｖｍａｘが３．４±０．０４ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質であり、Ｈｉｌｌ係数が１．５±０．２である（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）。Ｖ’ｍａｘとＶｍａｘとの間の比が２．６であり、これは、Ｖ’ｍａｘの定義から予想されるように、Ｖ／Ｋにおける動的同位体効果に近いことに留意されたい（上記の実験セクションを参照のこと。）。トリチウム化水の形成及び６β−ヒドロキシテストステロンの形成はケトコナゾールにより完全に阻害され、このことから、両生成物がＣＹＰ３Ａ４介在代謝により形成されることが確認される。
【０１１６】
同様に、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの固定濃度と非標識テストステロンの上昇濃度との間の基質競合から、低用量フックが示され、この基質からのトリチウム化水形成がケトコナゾールにより完全に阻害された（図５Ｄ）。トレーサーの比放射能又は２β−及び６β−位からの生成物の割合の何れも分からないため、同位体希釈実験から対応する非標識生成物の形成速度を求めることはできない。
【０１１７】
ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤による阻害のカイネティクス。［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成速度に対するＣＹＰ３Ａ４／５の公知の阻害剤の影響を図６Ａから６Ｆで示す。ＩＣ５０値を表３でまとめる。［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いて、２種類の異なる濃度の非標識テストステロン（１０及び６０μＭ）存在下で阻害実験を行った。この２種類の異なる基質濃度において、ＩＣ５０値の顕著な差は観察されなかった（３．５倍未満）。この２種類の異なるトレーサーを用いて求めたＩＣ５０値は非常に近く、差は２倍未満であった。放射分析アッセイにより得られたＩＣ５０値が従来のアッセイのＩＣ５０値を反映していることを確認するために、同じ反応混合物において［３Ｈ−Ｈ２Ｏ］及び６β−ヒドロキシテストステロン形成に対する阻害剤効果を調べた。表３で示されるように、殆ど同じＩＣ５０値が得られた。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
これらの実験で試験したＣＹＰ阻害剤は、有機溶媒中で溶解させねばならなかった。ＣＹＰ３Ａ４活性に対する溶媒の阻害効果が報告されているので（Ｃｈａｕｒｅｔら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：２１５−２２６（１９９９）；Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２６：２０７−２１５（１９９８）；Ｂｕｓｂｙら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２７：２４６−２４９（１９９９））、発明者らは、［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ−Ｈ２Ｏ］放出及び選択した阻害剤のＩＣ５０値における、ＤＭＳＯの２種類の異なる濃度の効果を評価した。ＤＭＳＯは生成物形成を阻害し、０．３％及び０．７％（ｖ／ｖ）の溶媒濃度で残存するのは、それぞれ、対照活性の約７０％及び５０％であった。しかし、ＤＭＳＯは、エチニルエストラジオール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ブロモクリプチン、ニカルジピン、ニフェジピン、キニジン及びベラパミルのＩＣ５０値にには影響がなかった（データは示さない。）。したがって、溶媒対照を含めることに留意し、活性データをこれらの対照に対して表す限り、０．３％から０．７％の間のＤＭＳＯ濃度を用いて、阻害アッセイを行うことができる。
【０１２０】
多数の化合物に対する従来のテストステロン６βヒドロキシル化アッセイとの比較。［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いて、放射分析アッセイにおいて、３９種類の構造的に多様な新規化学物質（ＮＣＥ）に対するＩＣ５０値を調べ、従来のテストステロン６βヒドロキシル化アッセイを用いて得られている従来のデータと比較した。この比較の結果を表４で示す。
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
３種類の化合物のＩＣ５０値は、両アッセイとも１００μＭより大きかった。６種類の化合物のＩＣ５０値は、一方のアッセイにおいて１００μＭより大きく、他方のアッセイにおいて４５μＭより大きかった。１つの化合物のＩＣ５０値は、一方のアッセイにおいて０．４μＭより小さく、他方のアッセイにおいて０．２μＭであった。残りの２９種類の化合物のＩＣ５０値のこの２種類のアッセイ間での差は４．２倍未満であった。これらのうち２５種類（８６％）の差は３倍未満であった。両アッセイにおいて測定可能なＩＣ５０値を有する化合物に対して、従来のアッセイにおけるＩＣ５０値に対する放射分析アッセイにおけるＩＣ５０値のプロットを、１．０９の勾配及び０．５６２の相関係数ｒ２の直線により描くことができた（図７Ａ及び７Ｂ）。相関直線を殆ど逸脱した点は、弱い阻害剤（化合物２８）に相当し、これは、２種類のアッセイ間でＩＣ５０値の差が３倍未満であった。この化合物を分析から除外した場合、勾配は０．８９となり、相関係数は０．７５７に上昇した。
【０１２３】
考察
基質のヒドロキシル化を伴うトリチウムの放出を用いて、チトクロムＰ−４５０酵素の活性が測定されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ及びＳｉｉｔｅｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：５３６４−５３７２（１９７４）；Ｒｅｅｄ及びＯｈｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１６２５−１６３１（１９７６）；Ｍｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６０４９−６０５４（１９８０）；Ｍｉｙａｉｒｉ及びＦｉｓｈｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３２０−３２５（１９８５）；Ｏｓａｗａ及びＣｏｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：３５５−３６１（１９８７））。Ｄｒａｐｅｒ及び共同研究者らは、この原理に基づくＣＹＰ３Ａアッセイ手段について述べ、このアッセイ手段において、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンのＣＹＰＡ介在性の代謝から生じたトリチウム化水を未反応基質からチャコール抽出により分離した（Ｄｒａｐｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２６：３０５−３１２（１９９８））。
【０１２４】
本発明は、自動化でき、インキュベーション及び抽出段階を通してマルチウェル形式でアッセイを行い、マルチウェルプレート中でシンチレーションカウントのために反応生成物を回収することを可能にする。本発明は、次の点で上記の先行技術のアッセイとは異なる。第一に、本アッセイ体積は、５００μＬから２００μＬへと減少しており、ミクロソーム濃度は、０．４ｍｇ／ｍＬから０．２５ｍｇ／ｍＬへと低下している。したがって、使用されるミクロソームの最終量は２００μｇではなく５０μｇである。第二に、本明細書中で示すような好ましい実施形態において、複数ウェル形式、例えば９６ウェル形式でインキュベートを行う。第三に、ＯＡＳＩＳ逆相レジンを含む９６ウェルプレートなど、親水性及び脂溶性ポリマーのバランスの取れた割合を含む支持体を含有するマルチウェル固相抽出プレートを用いて、トリチウム化テストステロン基質からトリチウム化水を分離する。最後に、好ましい実施形態において、トリチウム化テストステロン基質は６β位においてのみトリチウムを含有する。
【０１２５】
実施例１で示されるように、１０から６０μＭのテストステロン濃度（約７倍）でのノイズ比のシグナルは、１２．５μＭの基質濃度においてＤｒａｐｅｒらにより得られたもの（プールされたＨＬＭにおいて６から７倍）と同様である。しかし、本アッセイの実施形態を用いた反応速度は、使用した放射性標識の３から６倍高い量に対して正規化した場合でも、顕著に高かった（Ｄｒａｐｅｒらにおいて８０ｎＣｉであるのに対して、２５０から５００ｎＣｉ）。このように、Ｄｒａｐｅｒらは、非標識テストステロンの１２．５μＭの濃度を用いて、トリチウム化水への［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの分画変換速度が、約０．０８％／分／ｍｇであることを報告した。一方、本アッセイにおける［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの分画変換速度は、同じ濃度の非標識テストステロンで約０．６％／分／ｍｇであった（上記参照。）。この違いの理由は分からないが、しかし、テストステロン６βヒドロキシル化活性が同等だったので、この違いは市販用に調製された［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンのバッチが違うと、含有される６β位におけるトリチウム標識の分画量が異なるためであると思われる。
【０１２６】
［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いた実験から、組み換えＣＹＰの１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６及び２Ｅ１によるものよりも６倍高い速度で［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム標識水の放出が組み換えＣＹＰ３Ａ４により触媒されることが示されている（Ｄｒａｐｅｒら、前出）。ＨＬＭにおける非標識テストステロンのＮＡＤＰＨ−依存性代謝は主に６β−ヒドロキシル化により起こり（７５％超）、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化の放出速度は、１２名の異なるドナー肝臓からのＨＬＭにおけるテストステロン６β−ヒドロキシル化の放出速度に相関した。これらの知見に基づき、Ｄｒａｐｅｒらは、ＨＬＭにおける［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウムのＮＡＤＰＨ−依存性放出をＣＹＰ３Ａ４活性に対するプローブ反応として使用し得ることを提案した（Ｄｒａｐｅｒら、前出）。この主張の信頼性のある検証は、特異的なＣＹＰ３Ａ４阻害剤により反応が完全に阻害され得るが、その他のアイソフォームの阻害剤により阻害されないという証明から得られる。Ｄｒａｐｅｒらの実験で使用された唯一の阻害剤は競合的基質エリスロマイシンであり、これは、１３０μＭという弱いＩＣ５０を示した。他の著者らは、エリスロマイシン及びテストステロンのみが互いの代謝を弱く阻害することを報告している（Ｗａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２５：５０２−５０７（１９９７））。したがって、エリスロマイシンを用いた結果は、アッセイのＣＹＰ３Ａ４特異性を的確に表していない。アッセイがＣＹＰ３Ａ４に特異的であることを示すために、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性又は他のアイソフォームを特異的に中和するモノクローナル抗体（Ｍｅｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：７４９−７５９（１９９９）；Ｓｈｏｕら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２：１７−３６（２０００））（ＣＹＰ、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｃ１９及び２Ｄ６）、ならびにＣＹＰの３Ａ４／５、１Ａ２、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｄ６及び２Ｅ１の特異的化学阻害剤を使用した。本明細書中で示されるように、これらの全ての物質の中で、ケトコナゾール及び抗ＣＹＰ３Ａ４／５モノクローナル抗体のみがＨＬＭにおいて［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の放出を強く阻害し、それにより、ヒドロキシル化反応には殆ど排他的（９５％超）にＣＹＰ３Ａ４／５が介在することが示された。
【０１２７】
一連のＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤の阻害可能性のより詳細な分析の本明細書中で示される結果から、さらなる証拠が得られた。ケトコナゾール、ニフェジピン、ブロモクリプチン、ミコナゾール、ニカルジピン及び化合物Ａ（ＭＲＬで合成されたＣＹＰ３Ａ４阻害剤）は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の放出を阻害し、そのＩＣ５０値は、同じ反応混合物中でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定したテストステロン６βヒドロキシル化の阻害に対する値と顕著な差がなかった。総合すれば、これらの結果から、本明細書中で開示するアッセイにより、ミクロソームＣＹＰ３Ａ４／５活性が介在するテストステロンのヒドロキシル化が正確に測定され、これを使用して治験薬の阻害可能性を分析できることが示される。
【０１２８】
Ｄｒａｐｅｒ及び共同研究者らは、以前、トリチウム化したトレーサーの反応が何ら動的同位体効果なく進行し、（非標識）６β−ヒドロキシテストステロンの１当量の形成がトリチウム化水の１当量の形成に相当するという仮定に基づき、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロン及び６β−ヒドロキシル化からの水の放出が同様のＫｍ及びＶｍａｘ値を示したことを報告した。しかし、下記で考察するように、トリチウム化トレーサーのヒドロキシル化が動的同位体効果なしで進行するという仮定は妥当ではなく、これにより、市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いたモル濃度反応速度を決定することができなかった。トリチウム化基質からの生成物形成の速度を計算するために、６β位に存在する放射性標識の比放射能を知る必要がある。市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの場合、この情報が得られない。製造元により与えられる情報によると、標識の約２０％が１α位にあり、１９％が２α、２０％が６α、２５％が７β、１０％が１β＋７β、６％未満が２β及び６βにあるが、６β位に存在する標識の正確な割合は分からない。
【０１２９】
市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いて動的反応パラメーターを決定することができないこと以外に、ＣＹＰ３Ａプローブとしての市販の［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンの使用には、いくつかのさらなる欠点がある。６β位における標識の量が非常に少ないので（６％未満）、正確な生成物カウントを得るために非常に大量の放射活性基質を使用する必要があった（０．５から１ｘ１０６ｄｐｍ／アッセイ）。これは、アッセイのコストに重大な影響を与え、これによって生成物カウント手段を小型化すること（例えば９６ウェルシンチレーションカウンターを用いること）が困難になる。さらに、６β位以外の位置からのトリチウム喪失が生成物形成に関与することを本当に除外することはできない。６β位において特異的に標識されたテストステロンが利用できることにより、これらの問題に関して大きな長所が得られる。この新規トレーサーを用いる場合、アッセイ体積をさらに１００μＬに縮小することができ、ミクロソーム量を２５μｇに縮小でき、基質プローブ１００，０００ｄｐｍ／アッセイという少ない量で妥当な生成物カウント（２０００から４０００ｄｐｍ）を得ることができた。ノイズ比に対するシグナルは約２０倍に顕著に向上した。［６β−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の形成は、ＮＡＤＰＨ依存的であり、一連のＣＹＰ３Ａ／５阻害剤により阻害され、そのＩＣ５０値は、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いて得られた値と顕著な差がなかった。したがって、本発明の改良アッセイにより、古典的なテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイの真のハイスループット放射分析バージョンが得られ、この方法は、以下でさらに考察するように、治験薬の阻害可能性の迅速なスクリーニングに適切である。
【０１３０】
基質プローブとして比放射能が既知である［６β−３Ｈ］−テストステロンを用いることにより、動的同位体効果、ＴＶ／Ｋ（上記参照）を決定することができるようになる。トリチウム化基質及び非標識基質の濃度間に大きな相違があると、それらの個別の反応速度を測定することができない。トリチウム化基質のトレース濃度を使用して、競合的非標識基質存在下で反応速度を測定する場合、Ｖ／Ｋ比に対する動的同位体効果を測定することができる（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８７：６０７−６２５（１９８２））。同じ反応混合物中でトリチウム化水及び６β−ヒドロキシテストステロンの形成を測定することにより、トリチウム化水生成物の比放射能を計算し、基質の最初の比放射能と比較することができ、これらの値を用いてＴＶ／Ｋを導き出すことができる。ＴＶ／Ｋにおける動的同位体効果は２．３倍であった。重水素で置換されたテストステロンの６β−ヒドロキシル化が動的同位体効果なしで進行することが以前報告された（Ｂｊｏｒｋｈｅｍ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：３５４−３６３（１９７２））。これは、おそらく、Ｃ−Ｄ及びＣ−Ｔ結合エネルギー間の差によるものと思われる。動的同位体効果は、トリチウム化プローブに対する反応速度を低下させるが、トリチウム化水形成の阻害に対するＩＣ５０値が６β−ヒドロキシテストステロン形成に対する値と顕著な相違がなく、基質プローブの６倍同位体希釈により変化がなかったという観察から示されるように、競合的ＣＹＰ３Ａ阻害剤の阻害可能性には影響を与えない。
【０１３１】
放射性標識基質の固定量及び非標識基質の上昇濃度の存在下で反応速度を測定する場合、生成物カウントは、非標識基質の濃度が、酵素の活性部位に対するトレーサーの結合と競合するのに十分に高くなるときは低下すると予想される。図５Ａから５Ｂで示されるように、低濃度の非標識テストステロンにおいて、トリチウム化水の形成は、実際に、非標識基質が増加するにつれて促進され、非標識基質の高濃度（４０μＭ超）でのみ低下し始める。「低用量フック」と呼ばれるこの影響は、正の方向に協同するリガンド置換相互作用にとって特徴的である（Ｄｅ Ｌｅａｎ及びＲｏｄｂａｒｄ、Ｒｅｃｅｐｔ：Ｃｏｍｐｒ．Ｔｒｅａｔｉｓｅ １：１４３−１９２（１９７９））。トリチウム化生成物の形成が増加する理由は、低基質濃度で、正の方向に協同する酵素の反応速度が、基質濃度が上昇するにつれて用量に比例した上昇よりも大きく上昇するからである。非標識生成物の見かけの形成速度をトレーサー競合データから計算し、基質濃度に対してプロットした場合、シグモイド型の関係が見られ、このことから、この反応が正の協同作用を示すことが確認される。１．３４のＨｉｌｌ係数及び１２０μＭのＳ５０で、データをＨｉｌｌの式にフィットさせることができた。同じ条件下での６β−ヒドロキシテストステロン形成の測定から、１．３５の見かけのＨｉｌｌ係数及び１０１μＭのＳ５０で、非標識テストステロンの反応速度論が実際に、正の協同作用を示すことが分かる。ＣＹＰ３Ａ４介在性のテストステロンの６β−ヒドロキシル化に対して、１．３のＨｉｌｌ係数が以前に報告されている（Ｕｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：３７０−３８１（１９９７））。トレーサー競合データから得られる速度パラメーターと非標識生成物の直接測定により決定されるものとがよく一致することから、ＨＬＭでの［６β−３Ｈ］−テストステロンからのトリチウム化水の形成に、６β−ヒドロキシテストステロンの形成と同じ機序が介在するという概念が補強される。低用量フックはまた、基質として［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンを用いても観察された。このトレーサーに対して、双曲線（非シグモイド）カイネティクスが報告されていることに留意されたい（Ｄｒａｐｅｒら、前出）。この明らかな相違に対する最も有望な説明は、本研究において０．４から２０μＭの間の基質濃度でのみ「低用量フック」が観察されたが、一方でＤｒａｐｅｒは１４μＭより大きい基質濃度で反応カイネティクスを研究したということである。
【０１３２】
ＣＹＰ３Ａ４／５阻害に対するスクリーニング法としてのこの新しいアッセイの使用を確認するために、多数の構造的に多様な治験化合物に対してＩＣ５０値を決定し、その結果を古典的なテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる生成物定量を行う。）から得られた結果と比較した。この分析の結果から、本発明のアッセイにより得られたＩＣ５０値が、従来のアッセイの値と非常に近いことが示される。ＩＣ５０値の差は４倍未満であり、化合物の８６％に対して３倍未満であり、これは、６βヒドロキシル化アッセイに対する古典的なデータがこの比較に対して使用されたことを考慮すると、非常に注目に値するものである。３９種類の試験化合物のうち、放射分析アッセイの結果に基づき、強い又は弱い阻害剤の何れかとして間違って分類されたものがないといことは、最も重要なことである。
【０１３３】
テストステロンに対して蛍光性ＣＹＰ３Ａ４／５プローブを用いて得られたＩＣ５０値の多数の化合物についての詳細な比較から、これらのアッセイ間の相関関係が比較的乏しいことが明らかとなった。この研究の著者らは、蛍光性プローブを用いたスクリーニングの後、従来の基質を用いた試験を行うべきであることを推奨した（Ｃｏｈｅｎら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１：１００５−１０１５（２００３））。したがって、スピード、ハイスループット及び従来の基質の使用の長所を組み合わせた本発明のアッセイは、この問題を回避し、薬物探索設定において化合物がＣＹＰ３Ａ４を阻害する可能性を迅速に調べるために価値あるものである。
【実施例２】
【０１３４】
この実施例は、インタクトな肝細胞において酵素活性及びＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤の影響を調べ、定量するための本発明の使用を説明する。
【０１３５】
新鮮な肝臓試料からヒト肝細胞を調製した（地元の病院から入手した手術による廃棄物）。確立されたプロトコールに従い、肝細胞を単離し、液体窒素中で凍結保存した（例えば、Ｈｅｎｇｓｔｌｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３２：８１−１１８（２０００）；Ｆｅｒｒｉｎｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０７：３４１−５２（１９９８）を参照。）。細胞を凍結融解し、１２ウェルの培養プレート中で、５％ＣＯ２、９５％酸素の加湿環境下、振盪水浴中で３７℃にて１時間インキュベートした。各培養ウェルは、百万個の細胞、肝細胞培養液（ＨＣＭ）１ｍＬ（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐｏｌｌａｒｄ及びＷａｌｋｅｒ編）ｐｐ．１６１−１７６、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ．（１９８９））、２００μＭ非標識テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロン３７０，０００ｄｐｍを含有した。ＣＹＰ３Ａ４／５の活性の阻害に関して検体をアッセイする場合、上記反応系に検体を添加する。この実施例において、阻害剤１０μＭケトコナゾールを平行したインキュベーションに添加した。１０μＭケトコナゾールなどの公知の阻害剤又は検体に対するビヒクルを含有する対照インキュベーションも行った。１時間後、前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートの個々のウェルにインキュベーションメディウムの一定分量を入れ、水２００μＬでこれを２回洗浄した。各ウェルに対して、フロースルーを水洗浄液と合わせ、シンチレーション液添加後にβ−カウンターにおいてカウントした。
【０１３６】
６β−ヒドロキシテストステロンの形成速度を測定するために、メタノール１ｍＬを用いてＯＡＳＩＳプレートから６β−ヒドロキシテストステロンを溶出し、Ｎ２下で乾燥させ、ギ酸０．１％を含有する５０％アセトニトリル／水（５０：５０）２００μＬ中で再構成した。６β−ヒドロキシテストステロンの定量のために、ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ系に一定分量を注入した。定量は、ピーク領域と、未知の試料のように正確に処理し抽出した標準曲線のそれとの比較に基づいて行った。実施例１で述べたように、テストステロンの比放射能で生成物カウントを割ることにより、［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの見かけの形成速度を計算した。結果を表５で示す。
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
本発明の放射分析アッセイを用いて決定された活性は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイにより求められた活性よりもわずかに（３０％）低かったが、これは、おそらく、実施例１で述べたような穏やかな動的トリチウム同位体効果によるものである。ケトコナゾール存在下で［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成形式が完全に阻害され、このことから、本アッセイがまた、インタクトなヒト肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤の影響を調べるために使用できることが分かった。
【実施例３】
【０１３９】
この実施例は、肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４／５誘導剤の影響を調べ、定量するための本発明の使用を説明する。
【０１４０】
２名の異なるドナーからの凍結保存ヒト肝細胞をＴｉｓｓｕｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｉｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）から入手した。細胞（およそ３２０，０００）を２４ウェルのコラーゲン被覆培養プレートにプレーティングし、ＩＴＳ＋（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加した肝細胞培養液（ＨＣＭ）（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、前出）中で５％ＣＯ２、９５％空気の加湿環境下で３７℃にて維持した。２４時間後、細胞の各ウェルに対する培養液を除去し、ＩＴＳとともに新鮮なＨＣＭを添加し、ビヒクル（対照）、リファムピシン（陽性の対照）又は、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性の誘導能について試験する検体の何れかで細胞を４８時間処理した。次に、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性を次のように求めた。
【０１４１】
各ウェルに対して、培養液を除去し、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、６０μＭ非標識テストステロン及び［６β−３Ｈ］−テストステロンおよそ２００，０００ｄｐｍを含有するＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）０．５ｍＬ中で、３７℃にて１時間、細胞をインキュベートした。それぞれに対して、酵素活性に特異的にＣＹＰ３Ａ４／５が介在することを確認するために、１０μＭケトコナゾール存在下で平行インキュベーションも行った。次に、前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートの個別のウェルにインキュベーション液を入れ、水２００μＬでこれを２回洗浄した。各ウェルに対して、フロースルーを水洗浄液と合わせ、シンチレーション液添加後にβ−カウンターにおいてカウントした。メタノール１ｍＬを用いてＯＡＳＩＳプレートから６β−ヒドロキシテストステロンを溶出し、Ｎ２下で乾燥させ、ギ酸０．１％を含有する５０％アセトニトリル／水（５０：５０）２００μＬ中で再構成した。６β−ヒドロキシテストステロンの定量のために、ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ系に一定分量を注入した。定量は、ピーク領域と、未知の試料のように正確に処理し抽出した標準曲線のそれとの比較に基づいて行った。
【０１４２】
図８Ａ及び８Ｂで示されるように（それぞれドナー１及び２に対する結果）、培養したヒト肝細胞をリファムピシンで４８時間処理することにより、ＣＹＰ３Ａ４／５酵素活性の用量依存的な増加が起こった。［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成を測定し、平行して、同じ細胞のインキュベーションにおける６β−ヒドロキシテストステロンの形成を測定することにより、ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を求めた。対照（リファムピシンで処理しなかった細胞）に対する代謝産物形成の％として結果を表す。本発明の放射分析法により測定したリファムピシンの影響は、従来の（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイにより測定したものと顕著な差はなかった。１０μＭケトコナゾールの存在下でインキュベーションを行った場合、両代謝産物の形成はほぼ完全に阻害され（データは示さない。）、このことから、反応のＣＹＰ３Ａ４／５特異性が確認された。これらの結果は、インタクトな細胞、特に培養したヒト肝細胞において、ＣＹＰ３Ａ４誘導剤の影響を調べるために、本発明のアッセイを使用できることを示す。
【実施例４】
【０１４３】
この実施例は、時間依存的ＣＹＰ３Ａ４／５アッセイを示す。インキュベーションは全て、９６ウェルボックス＋ポリプロピレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＢＩ）中で行った。
【０１４４】
次のようにプレインキュベーション段階を行った。プレインキュベーション混合液は３０μＬ ＨＬＭ（タンパク質３．３ｍｇ／ｍＬ、好ましい最終濃度２ｍｇ／ｍＬ；０．１から５ｍｇ／ｍＬの範囲）、試験検体１μＬ（３５％ＤＭＳＯ、６５％メタノール中に溶解）、アッセイ緩衝液９μＬ（０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．６）を含有した。ＮＡＤＰＨ再生系１０μＬ（アッセイ緩衝液中、５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、１７ｍＭ ＭｇＣｌ２、５Ｕ／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を添加することによりプレインキュベーションを開始した。逆順で様々な時間でプレインキュベーションを開始した（最長のプレインキュベーションを最初に開始し、最短のプレインキュベーションを最後に開始した。）。振盪水浴中で３７℃にて０から３０分間、混合液をプレインキュベートした。
【０１４５】
残存活性の決定は次の通りであった。［６β−３Ｈ］テストステロン（約８００，０００ｄｐｍ）、２００μＭ非標識テストステロン及び１ｍＭ ＮＡＤＰＨを含有するアッセイ緩衝液４５０μＬでのプレインキュベーション混合液の１０倍希釈により第二のインキュベーションを開始した。振盪水浴中で３７℃にて１０分間インキュベーションを行った。１Ｎ ＨＣｌ ５０μＬを添加することにより、反応を停止させた。室温にて２８００ｒｐｍで１５分間、プレートを遠心分離した。前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートに上清３００μＬを入れた。フロースルーを回収し、１２０μＬの一定分量を９６ウェルシンチレーションカウンティングプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ４０シンチレーション液１８０μＬを添加し、プレートを密封し、振盪して、Ｐａｃｋａｒｄ ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンターでカウントした。
【０１４６】
図９Ａ及び９Ｂは、ＣＹＰ３Ａ４／５介在性のテストステロン６β−ヒドロキシル化を定量するための、トリチウム化水の放射分析検出を用いた典型的な実験の結果を示す。使用した時間依存的阻害剤はミフェプリストンであった。図１０Ａ及び１０Ｂは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によりテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性を求めた場合に、同様の結果が得られたことを示す。表６は、様々な時間依存的ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤に対して得られた速度パラメーターをまとめている。試験した全ての化合物に対して、放射分析アッセイにより得られた結果は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイにより得られた結果と同様であり、このことから、化合物が時間依存的ＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤として作用する可能性を評価するために放射分析アッセイを使用できることが示される。
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
例としての実施形態を参照して本明細書中で本発明を説明してきたが、本発明がこれに限定されないことを理解されたい。当業者及び本明細書中での教示を入手した者は、この範囲内のさらなる修飾及び実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、抽出カートリッジ又はカラム１０の横断面を示す。
【図２】図２は、マルチカラム精密ろ過／抽出プレート１００の透視図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、インキュベーション時間及びヒト肝臓ミクロソーム濃度に対する、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成の依存性を示す。１０μＭ非標識テストステロン及び指定濃度のＨＬＭの存在下で実験を行った。生成物形成は、総放射活性の％で表した。各点は、デュプリケート測定の平均±ＳＥＭである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、インキュベーション時間及びヒト肝臓ミクロソーム濃度に対する、［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成の依存性を示す。６０μＭ非標識テストステロン及び指定濃度のＨＬＭの存在下で実験を行った。生成物形成は、総放射活性の％で表した。各点は、デュプリケート測定の平均±ＳＥＭである。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒト肝臓ミクロソームにおける、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるＣＹＰ阻害の効果を示す。６０μＭ非標識テストステロン存在下及び次の化合物の存在下又は非存在下で反応を行った：３０μＭフラフィリン、５０μＭクマリン、１０μＭスルファフェナゾール、１０μＭキニジン、１００μＭジエチルジチオカルバメート、１μＭケトコナゾール。酵素活性は、未処理対照の％として表し、デュプリケート測定の平均±標準誤差を表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト肝臓ミクロソームにおける、［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における抗ＣＹＰモノクローナル抗体の影響を示す。６０μＭ非標識テストステロン存在下及び抗体０．４ｍｇ／ｍＬの存在下又は非存在下で反応を行った。酵素活性は、未処理対照の％として表し、デュプリケート測定の平均±標準誤差を表す。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒト肝臓ミクロソームにおける、［６β−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における非標識テストステロンの影響を示す。メタノール中の保存溶液から、テストステロンを添加した（最終メタノール濃度はアッセイにおいて０．６％）。１０μＭケトコナゾールの非存在下（黒印）又は存在下（白印）において生成物形成を評価した。結果は３回の別個の実験の平均±ＳＥＭである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、総基質濃度におけるｖ’の依存性を示す。実施例１で述べられるように定義されるｖ’という用語は、図５Ａで示される生成物カウントから計算した。非線形回帰分析により、データをＨｉｌｌの式にフィットさせた。
【図５Ｃ】図５Ｃは、総基質濃度における６β−ヒドロキシテストステロンの形成速度の依存性を示す。データは３回の別個の実験からの平均±ＳＥＭである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における非標識テストステロンの影響を示す。１０μＭケトコナゾールの非存在下（黒印）又は存在下（白印）において生成物形成を評価した。結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝２である。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるケトコナゾールの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるニフェジピンの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成における化合物Ａの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるミコナゾールの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるブロモクリプチンの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ヒト肝臓ミクロソームでの［１，２，６，７−３Ｈ］−テストステロンからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるニカルジピンの影響を示す。非線形回帰分析により、４個のパラメータロジスティック方程式にデータをフィットさせた。ＩＣ５０値を表３にまとめる。データはデュプリケート実験からの平均±ＳＥＭである。
【図７Ａ】図７Ａは、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。放射分析［６β−３Ｈ］−テストステロンヒドロキシル化アッセイにおける２９Ｍｅｒｃｋ ＮＣＥに対するＩＣ５０値は、従来のテストステロン６β−ヒドロキシル化アッセイで得た値と相関があった。従来のアッセイからのデータは、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｈｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおいて記録されていた。
【図７Ｂ】図７Ｂは、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。図７Ａにおいて矢印で強調した化合物を除き、２８種類の化合物からのデータを用いて相関分析を行った。
【図８Ａ】図８Ａは、ドナー１からの培養ヒト肝細胞での、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性におけるＣＹＰ３Ａ４誘導剤リファムピシンの影響を調べるための、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ドナー２からの培養ヒト肝細胞での、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性におけるＣＹＰ３Ａ４誘導剤リファムピシンの影響を調べるための、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の比較を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害を示す。放射分析テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調べ、ミフェプリストンの指定濃度での様々なプレインキュベーション後に残存した％ＣＹＰ３Ａ４／５活性を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、放射分析テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイにより決定した場合の、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害に対する阻害の速度パラメーターを導き出すための、阻害剤濃度曲線に対する不活性率のフィッティングを示す。放射分析テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５活性を調べた。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害を示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を用いて、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５の活性を調べ、ミフェプリストンの指定濃度での、様々なプレインキュベーション後に残存する％ＣＹＰ３Ａ４／５の活性を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ミフェプリストンによるＣＹＰ３Ａ４／５活性の時間依存的阻害に対する阻害の速度パラメーターを導き出すための、阻害剤濃度曲線に対する不活性率のフィッティングを示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を用いて、テストステロン６β−ヒドロキシラーゼアッセイによりＣＹＰ３Ａ４／５活性を調べた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ及び検体を含有する混合物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位においてトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、混合物をインキュベートすることと；
（ｃ）混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に混合物を添加して、混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項２】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３】
吸着剤がポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
トリチウム標識テストステロンが、１、２、６β及び７位において標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トリチウム標識テストステロンが６β位においてのみ標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
水性混合液がＮＡＤＰＨ再生系をさらに含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｅ）の混合物中のトリチウムが、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたテストステロン及びＮＡＤＰＨを含有し検体を含有していない対照混合物からの混合物中のトリチウムの量と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＹＰ３Ａ４／５がミクロソーム中において提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ミクロソームがヒト肝臓ミクロソームである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ミクロソームが、哺乳動物及び昆虫細胞からなる群から選択される細胞（これらの細胞は、ＣＹＰ３Ａ４／５を発現するベクターを含む。）から産生される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有するカラムプレート又はカラム（非極性化合物に選択的に結合する吸着剤をその中に有する。）が並んだカラムプレートを提供することと；
（ｂ）マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する混合物を添加することと；
（ｃ）段階（ｂ）のウェルのそれぞれの中の混合物にＮＡＤＰＨを接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと；
（ｄ）マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の段階（ｃ）での混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；
（ｅ）カラムプレートの個々のミニカラムに段階（ｄ）での各混合物を添加して、混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｆ）トリチウム標識テストステロンが除去された段階（ｅ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項１２】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位におけるトリチウム標識されたテストステロンを含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）肝細胞の培養物から培地を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の培地中のトリチウム量を測定することと（これは、肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４／５の活性を決定する。）
を含む、肝細胞においてチトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を決定するための方法。
【請求項１４】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位のおけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位におけるトリチウム標識されたテストステロン及び検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）肝細胞の培養物から培地を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の培地中のトリチウム量を測定することと（培地中のトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項１６】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）６β位においてトリチウム標識されたテストステロンを含有する第二の培地で検体を含有する培地を置き換え、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、肝細胞をインキュベートすることと；
（ｄ）肝細胞の培養物から第二の培地を除去することと；
（ｅ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に第二の培地を添加して、第二の培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｆ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｅ）の第二の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の増加は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）発現を誘導する検体を同定するための方法。
【請求項１８】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）ＣＹＰ３Ａ４／５、ＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；
（ｂ）様々な時間、前記混合物をインキュベートすることと；
（ｃ）前記混合物を希釈し、次いで希釈混合物に６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及びＮＡＤＰＨを添加することと；
（ｄ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、前記希釈混合物をインキュベートすることと；
（ｅ）前記混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；
（ｆ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に前記混合物を適用して、前記混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｇ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体が不可逆的にＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を不可逆的に阻害する検体を同定するための方法。
【請求項１】
（ａ）ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたトリチウム標識テストステロン、ＮＡＤＰＨ及び検体を含有する混合物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位においてトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、混合物をインキュベートすることと；
（ｃ）混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に混合物を添加して、混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項２】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３】
吸着剤がポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
トリチウム標識テストステロンが、１、２、６β及び７位において標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トリチウム標識テストステロンが６β位においてのみ標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
水性混合液がＮＡＤＰＨ再生系をさらに含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｅ）の混合物中のトリチウムが、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウム標識されたテストステロン及びＮＡＤＰＨを含有し検体を含有していない対照混合物からの混合物中のトリチウムの量と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＹＰ３Ａ４／５がミクロソーム中において提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ミクロソームがヒト肝臓ミクロソームである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ミクロソームが、哺乳動物及び昆虫細胞からなる群から選択される細胞（これらの細胞は、ＣＹＰ３Ａ４／５を発現するベクターを含む。）から産生される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有するカラムプレート又はカラム（非極性化合物に選択的に結合する吸着剤をその中に有する。）が並んだカラムプレートを提供することと；
（ｂ）マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ３Ａ４／５、６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及び検体を含有する混合物を添加することと；
（ｃ）段階（ｂ）のウェルのそれぞれの中の混合物にＮＡＤＰＨを接触させ、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと；
（ｄ）マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の段階（ｃ）での混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を分離することと；
（ｅ）カラムプレートの個々のミニカラムに段階（ｄ）での各混合物を添加して、混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｆ）トリチウム標識テストステロンが除去された段階（ｅ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項１２】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位におけるトリチウム標識されたテストステロンを含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）肝細胞の培養物から培地を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の培地中のトリチウム量を測定することと（これは、肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４／５の活性を決定する。）
を含む、肝細胞においてチトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を決定するための方法。
【請求項１４】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位のおけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、６β位におけるトリチウム標識されたテストステロン及び検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）肝細胞の培養物から培地を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の培地中のトリチウム量を測定することと（培地中のトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項１６】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）６β位においてトリチウム標識されたテストステロンを含有する第二の培地で検体を含有する培地を置き換え、ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、肝細胞をインキュベートすることと；
（ｄ）肝細胞の培養物から第二の培地を除去することと；
（ｅ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に第二の培地を添加して、第二の培地からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｆ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｅ）の第二の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の増加は、検体がＣＹＰ３Ａ４／５発現を誘導することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）発現を誘導する検体を同定するための方法。
【請求項１８】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー並びにシリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）ＣＹＰ３Ａ４／５、ＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；
（ｂ）様々な時間、前記混合物をインキュベートすることと；
（ｃ）前記混合物を希釈し、次いで希釈混合物に６β位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識テストステロン及びＮＡＤＰＨを添加することと；
（ｄ）ＣＹＰ３Ａ４／５が６β位におけるトリチウム標識テストステロンをヒドロキシル化するのに十分な時間、前記希釈混合物をインキュベートすることと；
（ｅ）前記混合物からＣＹＰ３Ａ４／５を除去することと；
（ｆ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に前記混合物を適用して、前記混合物からトリチウム標識テストステロンを除去することと；及び
（ｇ）トリチウム標識テストステロンが除去された、段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体が不可逆的にＣＹＰ３Ａ４／５の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム３Ａ４又は３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ４／５）の活性を不可逆的に阻害する検体を同定するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５１５４１０（Ｐ２００８−５１５４１０Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５０７８（Ｐ２００７−５３５０７８）
【出願日】平成１７年１０月３日（２００５．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０６９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３７６１７
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月３日（２００５．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０６９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３７６１７
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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