トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に外因性タンパク質を産生するためのプロセスおよびそれからタンパク質を精製するためのプロセス
本発明は、目的のタンパク質を産生する方法に関し、その方法は、その乳汁中に上記タンパク質を産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程、その非ヒトトランスジェニック哺乳動物から上記乳汁を得る工程、およびその乳汁から上記目的のタンパク質を精製する工程を包含する。トランスジェニックウシ動物が生み出され、その動物は、乳腺においてヒト成長ホルモンを産生し得る。この方法は、ｈＧＨ遺伝子をコードする遺伝的構築物およびβカゼインプロモーターを発現ベクターに首尾よくクローニングすることを含む。また、ウシ胎仔の体細胞（一般的には、線維芽細胞）へのトランスフェクション手順および除核されたウシ卵母細胞への核移植を含み、それゆえ、トランスジェニック胚を生み出す。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ヒトの健康管理に関与するタンパク質因子およびホルモンは、一般的に、この数十年間、抽出によってか、または組換え技術によって製薬産業により生成された。所望の遺伝子を含む遺伝的構築物の発現は、細菌、酵母または哺乳類細胞株で首尾よく発現された。しかし、複雑なタンパク質（例えば、適切なグリコシル化パターンを必要とするタンパク質）を得るために哺乳類細胞培養物を使用することは、高コストの手順を伴う。
【０００２】
組換えＤＮＡ技術は、商業的に重要な生物学的物質の産生のために、この十年間にわたってますます使用されている。この目的のために、種々の医学的に重要なヒトタンパク質をコードするＤＮＡ配列がクローニングされている。これらとしては、インスリン、プラスミノゲン活性化因子、α−抗トリプシンならびに凝固因子ＶＩＩＩおよび凝固因子ＩＸが挙げられる。現在、新興の組換えＤＮＡ技術を用いても、これらのタンパク質は、通常は血液および組織から精製される、感染因子（例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎を引き起こす因子）を伝達する危険性を有し得る高価で時間のかかるプロセスである。
【０００３】
所望の医学的に重要なタンパク質を産生するための、細菌におけるＤＮＡ配列の発現は魅力的な提案であるように見えるが、実際には、細菌は多くの場合、宿主として不十分であると判明する。なぜなら、細菌細胞において、外来のタンパク質は不安定であり、正確にプロセスされないからである。
【０００４】
この問題を認識して、哺乳類組織培養物におけるクローン化遺伝子の発現が試みられ、いくつかの事例では、実現性のあるストラテジーが証明された。しかし、動物細胞のバッチ発酵は高価であり、技術的な要求の厳しいプロセスである。
【０００５】
従って、正確に改変された真核生物のポリペプチドのような生物学的物質の産生のための、高収量で低コストのプロセスに対する必要性が存在する。ヒトに対して感染性である因子が存在しないことが、そのようなプロセスの利点である。
【０００６】
所望の遺伝子に対して、乳汁中に大量のヒトタンパク質を得る目的で、ウシのようなトランスジェニック動物を得る可能性は、産業にとって非常に関心のあることである。いくつかのグループが文献で、ヒト血清アルブミン、α抗トリプシンを産生することにおける成功、およびトランスジェニックウシもしくはヤギにおける他のいくつかの例を報告している。
【０００７】
以前に多くの実験がマウスまたはラットで行われ、βカゼインプロモーターまたはラクトアルブミンプロモーター（これらは、授乳中の雌性における乳腺転写因子に対してのみ応答する）が使用されるので、トランスジーン発現は常に乳腺に限定されることが好まれた。
【０００８】
乳汁において排他的な異種タンパク質の発現は、宿主動物の健康への望ましくない影響を避けること、および容易な精製方法を提供することが意図されている。
【０００９】
現在、人々は、細胞のトランスフェクションまたは選択の収量を改善するようないくつかのシステムを提示すること、ならびにクローン動物の生存状態および免疫状態を改善するような相同の胎児体細胞の供給源を選択することに専念している。
【００１０】
他方では、農業的な目的および生物医学的な目的で、主にえり抜きの家畜の繁殖およびトランスジェニック動物の遺伝子操作を可能にするために、体細胞核移植に非常に大きな関心が存在する。簡単に述べると、核移植（ＮＴ）は、受容卵母細胞の除核、その後の受容細胞質体に接して付着する卵黄周囲腔へのドナー細胞の移植、およびそれらの融合を含む。発生は、化学的活性化または物理的活性化によって人工的に誘導される。体細胞核移植によるクローン子孫の産生は、ヒツジで（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、ヤギで（非特許文献４）、そしてウシで（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）首尾よく達成されている。
【００１１】
ＮＴ（除核、融合、活性化およびドナー−レシピエント細胞周期同調性の方法を含む）の結果に影響を与えるいくつかの要因が存在する。受容卵母細胞の除核の高効率は、クロマチンを可視化するためにＤＮＡ特異的生体色素を用いて達成されている（非特許文献８、非特許文献９）。ドナー細胞と受容卵母細胞の融合は、パルスフィールドにおける細胞配置の精度、ドナー細胞と受容卵母細胞の接触、およびドナー細胞のサイズに依存する（非特許文献１０）。ＮＴで再構築された胚の活性化は洗練されており、胚盤胞への発生率は、インビトロで授精された卵母細胞と同等である（非特許文献１１）。
【００１２】
ＮＴ胚の成功した発生は、受容細胞質体として成熟卵母細胞を用いて（非特許文献１２）、接合体を用いて（非特許文献１３）、および卵割段階の胚を用いて（非特許文献１４）達成されている。しかし、これは、ドナー核の供給源に依存する。受容細胞質体とドナー細胞との間の細胞周期の適合性は、ＮＴ胚の発生に影響を与える重要な要因の１つである。適切な同調化が、再構築された胚の倍数性を保つために必要である。
【００１３】
有糸分裂細胞周期は、以下の連続的な期を有する：前複製間期（Ｇ１）、ＤＮＡ合成期（Ｓ）、前分裂間期（Ｇ２）および分裂期（Ｍ）。一回の細胞周期の間、すべてのゲノムＤＮＡが分裂前に一度複製する。除核された成熟卵母細胞（第２中期）に移植された間期ドナー核は、数度の形態学的な変化を経験する。融合後、しかしドナー核エンベロープ崩壊（ＮＥＢＤ）前に、染色体は凝集する（ＰＣＣ）。これらの変化は、成熟／有糸分裂／減数分裂促進因子（ＭＰＦ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性によって誘導される（非特許文献１５）。ＭＰＦおよびＭＡＰＫ活性は、すべての減数分裂細胞および有糸分裂細胞において見出され、そしてＭＰＦおよびＭＡＰＫ活性は、中期で最も高く、哺乳類卵母細胞ではこれらの高レベルはまた、第２中期の停止を誘導する。受精またはカルシウムイオノフォアでの活性化によるＭＰＦおよびＭＡＰＫの減少は、減数分裂の完了、第二極体放出、精核脱凝集および前核形成のシグナルである。
【００１４】
ドナークロマチンにおけるＮＥＢＤおよびＰＣＣの直接的な効果は、移植時におけるドナー核の細胞周期に依存する。二倍体のＧ０／Ｇ１核は凝集して単一の染色分体を形成するが、四倍体のＧ２核は凝集して二重の染色分体を形成する。しかし、移植時におけるＳ期の核は、特徴的な「バラバラになった（ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ）」外見を示す；ＰＣＣが広範なＤＮＡ損傷を生じる。従って、活性化時またはその前にＧ１核またはＧ０核を第２中期の卵母細胞に移植することによって、正確な倍数性がもたらされ得る。第２の方法は、Ｓ期に予め活性化された卵母細胞に核を移植することであり、この場合、Ｇ１期、Ｇ０期またはＳ期のドナー細胞を使用することが可能である。ＭＰＦおよびＭＡＰＫは低いので、クロマチンは脱凝集し、ＰＣＣおよびＮＥＢＤを伴わずにＤＮＡ複製が起こる。
【００１５】
第３の同調化スキームは、マウスで報告されており、生存子孫の発生が、Ｇ２ドナー細胞または中期ドナー細胞と除核された第２中期卵母細胞とを使用する胚再構築によってもたらされた（非特許文献１６、非特許文献１７）。ＮＴで再構築された胚からの極体の排出が単一の二倍体胚および二倍体極体を生じることが報告された（非特許文献１７）。しかし、ウシ、ヒツジまたはブタにおいて除核されたＭＩＩ卵母細胞へのＮＴ後の極体形成に関する報告は存在せず、これは、無傷の紡錘体の形成および極体の排出を制御する仕組みにおける種間の相違を示唆する。
【００１６】
ドナー細胞およびレシピエントの細胞周期段階は、ドナー細胞核をリプログラム（ｒｅｐｒｏｇｒａｍ）するためにもまた重要であることが示唆されている。ドナー核移植と接合体転写との間の時間の増加は、核のリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）を改善し得る。この理由により、数人の著者は、卵母細胞を融合の数時間後に活性化させた（非特許文献５、非特許文献１８、非特許文献１９）。他の報告は、連続的な核移植を適用した（非特許文献８）。
【００１７】
ドナー核のリプログラミング時間を増加させるための未開の手順は、第２中期前の核移植による手順である。卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の後、すべての核事象が卵母細胞の細胞質ゾルのＭＰＦおよびＭＡＰＫの実質的な増加によって調節され、これは核エンベロープの再構築および受精もしくは活性化までＳ期に入ることを妨げる。従って、成熟卵母細胞は、中期ドナー細胞またはＧ２ドナー細胞についての一般的なレシピエントであり得る。活性化が細胞分裂前にＳ期を誘導する場合には、Ｇ１またはＧ０でさえもドナー細胞として使用され得る。
【００１８】
Ｇ２またはＭにおける割球がドナー細胞として使用される場合、核のリプログラミングが可能である（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献２０）。１つの説明は、染色体凝集の結果として、いくつかの要素がクロマチンから置き換わるということである。実際に、核移植について、ＮＥＢＤおよびＰＣＣは核のリプログラミングの形態学的なサインであると考えられている。従って、受精時に精子クロマチンが極度に凝集し、その容積が体細胞の核の容積よりも非常に小さくなり、卵母細胞が精子核タンパク質を除去する能力を有する。卵母細胞染色体もまた、精子−卵母細胞の融合中に凝集する。凝集したクロマチンコンフォメーションがいくらかの生物学的な関連性を有し得る可能性がある。従って、中期核移植によるこの局面を模倣することによって、中期に除核されたレシピエントがＮＴの結果を改善し得る。しかし、少数の研究者は、家畜においてドナー細胞として割球を用いてこのアプローチを使用した（非特許文献２０）。
【非特許文献１】Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０、１９９６年、ｐ．６４−６６
【非特許文献２】Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ５７、１９９７年、ｐ．３８５−３９３
【非特許文献３】Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５、１９９７年、ｐ．８１０−８１３
【非特許文献４】Ｂａｇｕｉｓｉ，Ａ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７、１９９９年、ｐ．４５６−４６１
【非特許文献５】Ｃｉｂｅｌｌｉ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０、１９９８年、ｐ．１２５６−１２５８
【非特許文献６】Ｋａｔｏ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、１９９８年、ｐ．２０９５−２０９８
【非特許文献７】Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ １０、１９９８年、ｐ．３６９−３７８
【非特許文献８】Ｓｔｉｃｅ，Ｓ．Ｌ．およびＫｅｅｆｅｒ，Ｃ．Ｌ．、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４８、１９９３年、ｐ．７１５−７１９
【非特許文献９】Ｗｅｓｔｈｕｓｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ ９５、１９９２年、ｐ．４７５−４８０
【非特許文献１０】Ｃｏｌｌａｓ，Ｐ．ら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０８、１９９３年、ｐ．１−９
【非特許文献１１】Ｌｉｕ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ ４９、１９９８年、ｐ．２９８−３０７
【非特許文献１２】Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２０、１９８６年、ｐ．６３−６５
【非特許文献１３】ＭｃＧｒａｔｈ，Ｊ．およびＳｏｌｔｅｒ，Ｄ．、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｎ Ｙ ４、１９８５年、ｐ．３７−５５
【非特許文献１４】Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｙ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ ９６、１９９２年、ｐ．２７５−２８１
【非特許文献１５】Ｃｏｌｌａｓ，Ｐ．およびＲｏｂｌ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４５、１９９１年、ｐ．４５５−４６５
【非特許文献１６】Ｃｈｅｏｎｇ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４８、１９９３年、ｐ．９５８−９６３
【非特許文献１７】Ｋｗｏｎ，Ｏ．Ｙ．およびＫｏｎｏ，Ｔ．、ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３、１９９６年、ｐ．１３０１０−１３０１３
【非特許文献１８】Ｗａｋａｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４、１９９８年、ｐ．３６９−３７４
【非特許文献１９】Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ６０、１９９９年、ｐ．９９６−１００５
【非特許文献２０】Ｌｉｕ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ ４７、１９９７年、ｐ．２５５−２６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の１つの目的は、既存の体細胞核移植を特徴付けし、成体ドナー細胞から遺伝的に同一の幼獣を産生するための信頼性のある経済的な技術に洗練することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、この非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、その乳汁における予想外に高レベルの組換え成長ホルモンの産生によって特徴付けられる。組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００２１】
本発明はさらに、哺乳動物の乳腺細胞において目的のタンパク質の発現を提供するプラスミドに関し、その哺乳動物において発現は、βカゼインプロモーターによって調節される。目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。
【００２２】
本発明はまた、その乳汁中に組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する様々な方法に関する。組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００２３】
本発明はまた、目的のタンパク質を産生する方法に関し、その方法は、その乳汁中に上記タンパク質を産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程、その非ヒトトランスジェニック哺乳動物から上記乳汁を得る工程、およびその乳汁から上記目的のタンパク質を精製する工程を包含する。目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００２４】
本発明はまた、トランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを産生し、精製する方法に関する。組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。トランスジェニック動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、この非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、その乳汁における予想外に高レベルの組換え成長ホルモンの産生によって特徴付けられる。この哺乳動物は、ウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。トランスジェニック哺乳動物の他の種は、ブタ種、ヒツジ種、ヤギ種、または齧歯動物種であり得るが、これらに限定されない。
【００２６】
組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。ソマトトロピンとしても公知であるこの分子は、１９１個のアミノ酸からなるタンパク質であり、約２２ｋＤの分子量を有する。ヒト成長ホルモンは線形成長に必須であり、その適用は十分に確立されている。
【００２７】
本発明はまた、トランスジェニック哺乳動物に関し、このトランスジェニック哺乳動物は、その乳汁中に産生される組換え成長ホルモンがそのホルモンを含む乳汁をより多く産生するために、その動物の乳腺を自己刺激するという事実によって特徴付けられる。
【００２８】
本発明はまた、βカゼインプロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質をコードする遺伝子と、βラクタマーゼ遺伝子とを含むプラスミドに関する。この目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。このプラスミドはｐＲβｈＧＨであり得る。
【００２９】
さらなる実施形態において、プラスミドは、ジェネティシン耐性細胞の選択のために、ネオマイシン耐性遺伝子をさらに含む。そのようなプラスミドの例は、ｐＲＮｅｏである。
【００３０】
さらなる実施形態において、プラスミドは、ＧＦＰのような緑色蛍光タンパク質（これは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある）をコードする遺伝子を含む。そのようなプラスミドの例は、ｐＲＮｅｏＧｒｅｅｎである。
【００３１】
本発明はさらに、上に記載されたプラスミドのようなプラスミドに関し、そのプラスミドは、制限消化によって直鎖状にされる。特に、制限酵素ＡｐａＬＩの使用が採用され、βラクタマーゼ遺伝子が切除される。
【００３２】
上で言及したプラスミドの、ブダペスト条約に基づく寄託手順が進行中である。寄託機関の名称および所在地は、以下である：ＤＳＭＺ−ドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクトゥレン ゲーエムベーハー、マッシャーオーダー ヴェーク １ｂ，３８１２４ ブラウンシュヴァイク，ドイツ。対応する受託番号は、後日提供される。
【００３３】
本発明はさらに、改変されたより短いβカゼインプロモーター領域がｈＧＨコード領域の上流に挿入されたＮｅｏ耐性遺伝子を含むプラスミド（例えば、ｐＶＥβｃａｓｈＧＨ）のもとに構築されたプラスミドに関する。直鎖状フラグメントは、βラクタマーゼ遺伝子を切除することによってプラスミドｐＶＥβｃａｓｈＧＨから得られ得る。
【００３４】
本発明はさらに、リポソーム利用のためにカチオン性脂質の組み合わせを用いる、遺伝的構築物のトランスフェクションのための方法に関する。
【００３５】
適切な培地におけるネオマイシン耐性細胞の選択方法もまた、緑色蛍光トランスジェニック細胞を選択する方法と同様に記載される。これらの細胞は、細胞損傷を避けるように注意深く採取される。
【００３６】
本発明はまた、Ｇ０または細胞周期の異なる時期に停止された細胞の、除核されたウシ卵母細胞への核移植方法に関する。
【００３７】
本発明は、ホルモン刺激したウシの子宮へのトランスジェニック胚移植方法に関する。
【００３８】
本発明に従って、動物の健康パラメーターを決定する方法が開示される。分析はそのようなパラメーターを決定するために、動物の血清および乳汁の両方で行われる。
【００３９】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、成長ホルモンをコードする遺伝子を得る工程、その遺伝子をプラスミドにクローニングし、それによって乳腺細胞においてその遺伝子の発現を誘導するプロモーターにその遺伝子が作動可能に連結され、発現プラスミドを得る工程、その発現プラスミドが体細胞のゲノムに組み込まれるように体細胞をその発現プラスミドでトランスフェクトする工程、トランスジェニック体細胞を得る工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合し、単細胞胚を得る工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４０】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、その乳汁において組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雌性哺乳動物から体細胞（必要に応じて、線維芽細胞）を抽出する工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合し、単細胞胚を得る工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４１】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、その乳汁において組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を雄性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物由来の精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４２】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、その乳汁において組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を上記組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４３】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、雌性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を得る工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４４】
上記組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。
上記非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００４５】
本発明はさらに、タンパク質を産生する方法に関し、その方法は、その乳汁中に予想外に高収量で目的のタンパク質を産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程、その非ヒトトランスジェニック哺乳動物からその乳汁を得る工程、およびその乳汁からその目的のタンパク質を精製する工程を包含する。
【００４６】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、上記目的のタンパク質をコードする遺伝子を得る工程、その遺伝子をプラスミドにクローニングし、それによって乳腺細胞においてその遺伝子の発現を誘導するプロモーターにその遺伝子が作動可能に連結され、発現プラスミドを得る工程、体細胞のゲノムにそのプラスミドが組み込まれるように体細胞（必要に応じて、線維芽細胞）をそのプラスミドでトランスフェクトし、トランスジェニック体細胞を得る工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびその哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４７】
本発明はさらにまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、その乳汁において上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性哺乳動物から体細胞（必要に応じて、線維芽細胞）を抽出する工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合し、単細胞胚を得る工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４８】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、その乳汁において上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を雄性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物から得られる精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４９】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、その乳汁において上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００５０】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、雌性の非ヒトかつ非トランスジェニック哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じてモニタリングする工程を包含する。
【００５１】
その乳汁において目的のタンパク質の予想外に高レベルの産生によって特徴付けられるトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これらに限定されない。トランスジェニック哺乳動物の他の種は、ブタ種、ヒツジ種、ヤギ種または齧歯動物種であり得るが、これらに限定されない。目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。
【００５２】
本発明はさらに、その乳汁中に組換えヒト成長ホルモンを産生するウシ種の非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、そのゲノムは統合されたプラスミドを含み、上記プラスミドはヒト成長ホルモン遺伝子と、その哺乳動物の乳腺細胞において上記遺伝子の発現を誘導するβカゼインプロモーターとを含む。
【００５３】
本発明はさらに、予想外の高レベルでｈＧＨを産生するが、そのような高レベルのｈＧＨ産生で期待される身体的発育を示さないトランスジェニック哺乳動物に関する。トランスジェニックウシはヒト成長ホルモンの存在によって影響を受けるので、その動物が非トランスジェニックの成長速度を超えて成長すること、ならびに真性糖尿病、高血圧、心血管疾患および身体器官（肝臓、脾臓、腎臓および心臓が挙げられる）の肥大の増大した危険性などの状態に苦しむと見込まれる。そのような高レベルのｈＧＨは、その動物を理論的には生育不能にするはずである。しかし、これは事実ではない。その血液中に憂慮すべきほど高レベルの外来ホルモンを含むが、全く健康で組換えタンパク質の顕著な生産性を生じる哺乳動物（例えば、ウシ）は、予想外かつ革新的な貢献をする。
【００５４】
本発明の組換えヒト成長ホルモンは、予想外に高レベルで産生される。産生されるヒト成長ホルモンのレベルは、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇを超える。ｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇを超え得る。産生されるｈＧＨのレベルはまた、乳汁１Ｌあたり約３．０ｇを超え得る。別の実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約４．０ｇを超え得る。さらに別の実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約５．０ｇを超え得る。さらなる実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約６．０ｇを超え得る。なおさらなる実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇ〜乳汁１Ｌあたり約７．０ｇである。さらなる実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ〜乳汁１Ｌあたり約６．０ｇである。さらに別の実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ〜乳汁１Ｌあたり約５．０ｇである。
【００５５】
さらに、本発明は、トランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法、ならびに上記ホルモンのアッセイに関する。精製方法は、クロマトグラフィー工程および濃縮工程を含み得る。様々な型のクロマトグラフィーが使用され得、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーはアニオン交換クロマトグラフィーであり得る。アフィニティークロマトグラフィーはイムノアフィニティークロマトグラフィーであり得る。さらに、複数のクロマトグラフィー工程が行われ得る。
【００５６】
本発明はさらに、組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法に関し、その方法は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁を清澄し、清澄された乳汁を得る工程、およびその清澄された乳汁をクロマトグラフィーに供し、精製された組換え成長ホルモンを得る工程を包含する。
【００５７】
本発明はさらに、組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法に関し、その方法は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁を清澄し、清澄された乳汁を得る工程、その清澄された乳汁を流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ−ｂｅｄ）によるアニオン交換クロマトグラフィーに供し、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程、そのアニオン交換クロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供し、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程、その逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程、そのアニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程、その分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮し、濃縮された物質を得る工程、およびその濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程を包含する。
【００５８】
本発明はまた、組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法に関し、その方法は、トランスジェニック哺乳動物から得られた乳汁を清澄し、清澄された乳汁を得る工程、その清澄された乳汁をイムノアフィニティークロマトグラフィーに供し、イムノアフィニティークロマトグラフされた物質を得る工程、そのイムノアフィニティークロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供し、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程、その逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程、そのアニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程、その分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮に供し、濃縮された物質を得る工程、およびその濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程を包含する。
【００５９】
上で記載される精製方法の組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。トランスジェニック哺乳動物はウシ種の哺乳動物であり得るが、これに限定されない。
【００６０】
以下の実施例は本発明の方法および組成物の例示であるが、限定するものではない。当業者に明らかである、通常は化学物質の酵素的生成およびタンパク質精製手順において直面する種々の条件およびパラメーターの他の適切な改変および適合は、本発明の精神および範囲のうちにある。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
（発現プラスミドの構築）
本発明者らは、ヒト成長ホルモン遺伝子のコード配列に融合された、ウシβカゼイン遺伝子プロモーターの大部分（５’非コードβカゼイン遺伝子領域の短いフラグメントを含む）を有する構築物を生成した。様々な構築物で使用したβカゼイン領域を、３．８ｋｂｐから約１．３ｋｂｐまで減少させた。ｈＧＨ遺伝子は、内因性のポリＡシグナルが含まれるか否かに依存して約２ｋｂｐ〜２．２ｋｂｐを含む。
【００６２】
発現カセットを、ｐＵＣ型またはｐＢＳ型の通常のクローニングベクターのポリリンカー中に提供した。
【００６３】
このプロモーターは、その制御下で、βカゼインおよびこの場合は異種ｈＧＨのように、遺伝子の組織特異的かつ発生的に調節された発現を保証する。
【００６４】
最も代表的なプラスミドはｐＲβｈＧＨであり、これは、ヒト成長ホルモン遺伝子のコード配列に融合された、全長ウシβカゼインプロモーターを有する。
【００６５】
開示される他の構築物は、主に、示されるように、トランスフェクト細胞選択またはウシ細胞ゲノムへのＤＮＡ統合効率を改善するために、もとのものに由来する。
【００６６】
第１の期間に、ジェネティシン耐性遺伝子を含むプラスミドとの同時トランスフェクションを、選択を補助するために行ったが、次に、ｈＧＨ発現カセットを含む同一のベクターにおけるネオマイシン耐性のためにＮＰＴ遺伝子を有する他の構築物を使用した。そのようなプラスミドの例はｐＲＮｅｏである。
【００６７】
緑色蛍光タンパク質の構成的発現のための別のプラスミドを得、これは、ＣＭＶプロモーター、植物起源（アルファルファ）のエンハンサー、およびクラゲＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む。そのようなプラスミドの例はｐＲＮｅｏＧｒｅｅｎである。
【００６８】
さらに、別のプラスミドを生成した。これは、改変されたより短いβカゼインプロモーター領域をｈＧＨコード領域の上流に挿入した、Ｎｅｏ耐性遺伝子を含むプラスミドを基に構築した。このプラスミドはｐＶＥβｃａｓｈＧＨである。
【００６９】
他の構築物を生成し、それらの構築物では、βラクタマーゼ領域をＡｐａＬＩ制限によって切除し、アガロースゲル電気泳動、およびゲル抽出の後に全発現カセットを含む直鎖状フラグメントを精製した。
【００７０】
構築物を制限酵素およびＤＮＡ配列決定によって分析し、ｈＧＨ発現を行うそれらの能力を蛍光抗体認識によって乳腺細胞株で事前に試験した。
【００７１】
プラスミドｐＶＥβｃａｓｈＧＨの調製は、遺伝的構築物に関する部分の実施例として詳細に記載される。
【００７２】
（ｐＶＥβｃａｓｈＧＨの調製）
この構築物の目的は、宿主生物におけるそのポリＡシグナルに並んですぐ下流に融合されたｈＧＨ遺伝子の特異的に調節された転写を誘導するβカゼインプロモーター領域の最小限の伸長を提供することである。
【００７３】
元のベクターとしてのｐＶＥＸの使用は、このプラスミドにすでに存在するｔｋプロモーターによって調節されるネオマイシン耐性遺伝子の使用を可能にする。５５４ｂｐからなる初期ＳＶ４０プロモーターを、ＳｔｕＩおよびＮｄｅＩでの制限によって切除し、最後の部位をＫｌｅｎｏｗで補充し、得られるベクターを自己連結させた。
【００７４】
プライマーとして以下のオリゴ：
ＰＢ１ ５’ＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡＧ（配列番号１）および
ＰＢ２ ５’ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧ（配列番号２）
を使用することにより、３．８ｋｂｐの元の遺伝子プロモーター領域からの１．３ｋｂｐのフラグメントのＰＣＲ増幅後、βカゼインの短いプロモーターを得た。このフラグメントは、１２３０ｂｐの標準プロモーターと、４９ｂｐのβカゼイン遺伝子の第１の非コードエキソンとを含む。
【００７５】
ｈＧＨ遺伝子フラグメントを、プライマーとして以下のオリゴ：
ＰＢ４ ５’ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＣ（配列番号３）および
ＧＨＴＥ ５’ＡＴＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＣＴ（配列番号４）
を使用して、元のウシゲノムｈＧＨクローンでのＰＣＲ技術によって得た。βカゼインプロモーターフラグメントを、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、ｐＶＥＸのＢａｍＨＩ充填部位（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ ｓｉｔｅ）に挿入した。組換えクローンを選択した後、本発明者らは、ｐＶＥＸで下流に位置する固有のＨｉｎｄＩＩＩ部位をｈＧＨコード領域に挿入するために使用するのに適切な特定の方向を選択する。
【００７６】
この目的のために、ｈＧＨフラグメントもまた平滑末端化し、プラスミドＨｉｎｄＩＩＩ部位を同様に満たした。βカゼインプロモーターと、このプロモーターの制御下でのみｈＧＨを発現するように適切に融合されたｈＧＨとを含むクローンを選択した。
【００７７】
このプラスミドのサイズは約８．５ｋｂｐである。
【００７８】
（体細胞のトランスフェクション）
次いで、プラスミドｐＲβｈＧＨ（ジェネティシン耐性遺伝子を含む別のプラスミドを伴う）、ｐＲＮｅｏ、ｐＲＮｅｏＧｒｅｅｎまたはｐＶＥβｃａｓｈＧＨを、リン酸カルシウム法またはリポソーム法を用いて体細胞の初期培養物をトランスフェクションするために使用した。概して、ウシ胎仔線維芽細胞を使用してトランスフェクトした。
【００７９】
トランスフェクトされた細胞を、培養物にジェネティシンを添加して選択した。２週間〜８週間の期間の後、ジェネティシンに耐性であった細胞は、ドナー細胞としてトランスジェニッククローンを得るのに適切であった。トランスフェクトされ、選択された細胞が発現カセットを含むことをＰＣＲによって分析して、トランスジェニック胚を産生するための適切な核移植を保証した。
【００８０】
（実施例２）
（卵母細胞の除核および除核された成熟卵母細胞における中期核移植）
（ウシ卵母細胞の収集およびインビトロ成熟）
ウシ卵母細胞を食肉処理場の卵巣から吸引し、ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ中、３９℃で２４時間成熟させた。その成熟培地を使用前にＣＯ２で少なくとも２時間平衡化した。成熟卵母細胞を、１ｍｇ／ｍｌのウシ精巣ヒアルロニダーゼを含む温ＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で２分間ボルテックスすることによって裸にした。
【００８１】
（卵丘細胞による核移植）
（除核）
卵母細胞を、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ液圧マイクロマニピュレータ（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）およびＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡を用いて機会的に除核した。除核を、２０μｍの斜めにとがったピペットを用いて行った。卵母細胞を予め、５μｇ／ｍｌのビスベンズイミジン（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ，ＵＳＡ）色素で２０分間染色した。中期を、紫外線下での染色された染色体の可視化によって除核した。ピペットに吸引した後、中期染色体を評価した。トランスジェニック体細胞を卵黄周囲腔に移植し、除核された卵母細胞としっかりと向かい合わせた。
【００８２】
（融合）
トランスジェニック体細胞および除核された卵母細胞を、融合される膜が電極と平行になるように、手動で融合チャンバーに並べた。これを、ガラス製の胚取扱い用ピペットを用いて行った。
【００８３】
（電気的手段による融合）
融合を、１回の１８０ボルト／ｃｍの電気パルス（ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ２００、ＢＴＸ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ，ＵＳＡ）を１５μ秒間用いて行い、ＢＴＸ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ−Ｇｒａｐｈｉｃ Ｐｕｌｓｅ Ａｎａｌｙｚｅｒでモニタリングした。２つの０．５ｍｍステンレススチールワイヤ電極からなる、胚をパルスするためのチャンバーを、ガラス顕微鏡スライドに０．５ｍｍ離して取り付けた。推定接合体を、融合、溶解およびフラグメント化についてモニタリングした。
【００８４】
（発生能力の評価）
接合体を受精４８時間後に卵割について評価し、７日〜９日後に桑実胚または胚盤胞への発生について評価した。
【００８５】
（実施例３）
（細胞培養および胚培養）
様々なドナー細胞、培養系および卵母細胞レシピエント処理を、手順を単純化することおよびウシクローニングプログラムにおける胚の生存率を増加させることを目的とした実験で試験した。成体の線維芽細胞をドナー細胞として使用する場合、再構築された胚について３つの培養系を使用した：ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ、Ｍｅｎｅｚｏ ＋ ５％ＦＣＳ（いずれも同時培養物としてＶＥＲＯ細胞を含む）、および同時培養物は含まないがＯ２濃度が低いＳＯＦ。ドナー細胞が遺伝的に改変された胎仔線維芽細胞および非遺伝的に改変された胎仔線維芽細胞である場合、ＳＯＦ培地もまた、再構築された胚を培養するために使用した。最後に、遺伝的に改変された胎仔線維芽細胞をドナー細胞として使用する場合、受容性の卵母細胞を予めロスコビチン（Ｒ）で試験して、減数分裂を中断させ、レシピエントの有用性を最適化した。卵母細胞を食肉処理場の卵巣から吸引し、ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ中、３９℃で２４時間成熟させた。Ｒ処理群について、卵母細胞を、成熟前にＴＣＭ １９９ ＋ ５％ＦＣＳ中の２５μＭのＲで、３９℃で２４時間インキュベートした。成熟卵母細胞を、１ｍｇ／ｍｌのウシ精巣ヒアルロニダーゼを含むＴＬ ＨＥＰＥＳ中で３分間ボルテックスすることによって裸にした。中期を評価し、卵母細胞をＵＶ光下でのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（５μｇ／ｍｌ）による可視化（６秒未満）によって除核した。Ａｕｇｕｓ雄ウシに由来する成体の線維芽細胞および４５日齢のＪｅｒｓｅｙ胎仔雌性に由来する胎仔線維芽細胞をドナー細胞として使用した。ネオマイシン耐性遺伝子を含む構築物を用いるトランスフェクションをリポソームを用いて行った。ジェネティシンで１０日間〜１５日間選択した後、Ｇ０／Ｇ１期のドナー細胞を、電気パルスによって除核された卵母細胞に融合した。３時間後、５μＭイオノマイシンを含むＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で４分間、そして２ｍＭ ６−ＤＭＡＰで３時間インキュベーションすることにより、活性化を誘導した。次いで、その卵母細胞をＴＬ−ＨＥＰＥＳで洗浄し、ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ ＋ １０ｇ／ｌアルブミンまたはＭｅｎｅｚｏ ＋ ２％ＦＣＳ（いずれもＶＥＲＯ細胞を含む）のいずれかで、あるいはＳＯＦ培地および５％ＣＯ２ ＋ ５％Ｏ２ ＋ ９０％Ｎ２雰囲気において同時培養した。概して、２つの線維芽細胞を、１頭のレシピエントウシあたり非外科的に移植し、３０〜３５日目に妊娠を超音波検査によって決定した。卵割（４８時間）、線維芽細胞への発生（７日目〜９日目）を記録し、カイ二乗により分析した。卵割率および線維芽細胞への発生は、胚をＳＯＦで培養した場合により高かった。しかし、様々な培養条件またはドナー細胞の供給源に起因する妊娠率では、差異は観察されなかった。２４時間の減数分裂成熟の中断は、レシピエント卵母細胞の発生能力を損なわなかった。従って、ロスコビチンによる処理は、ＮＴ手順に対する卵母細胞のアベイラビリティを増大させるために使用され得る。以下の表１を参照のこと。
【００８６】
【表１】
異なる上付き文字を含む縦の欄内のパーセンテージは異なる（ｐ＜０．０５）
移植されたウシは、妊娠を正常に自然分娩まで経過させることが可能である。最終的に、外科的アプローチ（Ｃａｅｓａｒｅａ）が分娩に使用され得る。新生仔に最初の４８時間の間、Ｉｇリッチの初乳を与え、次いで、人工の食物を、のちに天然の食物（そのすべては動物起源の化合物を含まない）を使用した。
【００８７】
（実施例４）
（トランスジェニック子ウシおよび産生された組換えタンパク質に対して行った試験）
本実施例において、本発明者らは、実施例１〜３に記載される手順の結果として得られた特定のトランスジェニック子ウシ、およびそのウシによって産生された組換えタンパク質に対して行った試験の完全な記載を示す。それにもかかわらず、同一のアッセイのセットが、トランスジェニック子ウシを得るための他の方法（例えば、以下の実施例５および６に記載される方法）の結果として出生する動物に対して行われることが明らかであるはずである。
【００８８】
子ウシの白血球から精製されたＤＮＡに対して行ったＰＣＲ反応によって、ネガティブコントロールとして非トランスジェニックジャージー子ウシ由来のＤＮＡを用いて、ウシβカゼインプロモーターおよびｈＧＨコード遺伝子がトランスジェニック子ウシ細胞ゲノム中に含まれることが証明された。これらは一緒に、その動物のホモログβカゼイン遺伝子とは異なる固有のＤＮＡフラグメントとして見出され得る。
【００８９】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ自動シーケンサーを用いることによって、挿入された遺伝子配列がｈＧＨコード遺伝子に１００％対応することが確認された。その遺伝子は、イントロン、分泌シグナルおよびターミネーターを含む。本発明者らの子ウシにおいて同一のｈＧＨ遺伝子発現を制御するウシβカゼインプロモーターも配列決定した。これらすべてのエレメントは、クローンが生成された細胞を形質転換するために使用された遺伝的構築物に由来する、予期された理論配列を正確に一致する。
【００９０】
一旦、実験の遺伝的段階の正確性が分かると、本発明者らは、産生された組換えタンパク質が予期されたものであり、天然のｈＧＨとその物理的特徴および化学的特徴のすべてが一致することを証明することに移行した。
【００９１】
この目的のために、動物がその乳汁産生期にある場合、βカゼインプロモーターが乳腺においてのみ組換えタンパク質の発現を可能にするので、本発明者らは子ウシから乳汁を得なければならなかった。
【００９２】
次いで、トランスジェニック子ウシを、そのウシが１０ヶ月齢を満了するまでに乳汁を産生させるためにホルモン処置によって誘導した。そのころまでには、子ウシの体重は２４０ｋｇであった（約５３０ｌｂｓ）。
【００９３】
上記処置の第１期は、４８時間毎に（すなわち、処置を１日目に開始すると仮定して、１日目、３日目、５日目、７日目および９日目に）、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で、５回の連続適用からなる、皮下経路による、エストロゲン（安息香酸エストラジオール、Ｈｉｓｔｅｒｅｎ（登録商標）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｒｏｓｅｎｂｕｓｃｈ）およびプロゲスタゲン（酢酸メドロキシプロゲステロン、Ｐｒｏｎａｌ（登録商標）、Ａｔｏｎ）の、併用投与を包含した。
【００９４】
第２期は、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ、Ｓｉｄｕｓ）およびオキシトシン（Ｏｒａｓｔｈｉｎ（登録商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）の、皮下経路による投与からなり；１８日目〜２０日目からなる期間にわたり注入されるデキサメタゾンに関して２０ｍｇの総量（各々の日に上記全質量の３分の１）、および２１日目〜２３日目にオキシトシンの５０ＩＵの３回適用を包含した。
【００９５】
上記の情報は、表２に要約される：
【００９６】
【表２】
＊各々の日に全質量（２０ｍｇ）の約３分の１を投与した
予期されるように、処置が終了した翌日にウシは初乳の産生を開始し、次いで、徐々に産生される流体の質が乳汁に変化した。収集した流体を適切に保存し、徹底的に分析した。
【００９７】
いくつかの試験（その結果は、図１〜４に示される）を、初乳および乳汁に対して行った（簡単にするために、区別がなされるべき場合を除いて、初乳および乳汁の両方を以下「乳汁」と称する）。第一に、収集した乳汁の容量を測定した。初期乳汁生産性（最初の５回の授乳日）は、約１，６５０ｍＬ／日であった。最初の生産月の間、１日あたり２回の手動搾乳を行い、片方は午前に、もう片方は午後に行った（最終容量に対する各乳房の寄与が示され得る）；一方で、２ヶ月目以降、乳汁の産生が増加し始めるにつれて、１日あたり３回の搾乳を行った（午前、正午、および午後）。１日の容量は、最初の搾乳の３ヵ月後に１０，０００ｍＬ近くに到達するまで、ほぼ連続的な様式で増加した。このトピックに関する詳細な情報（図１Ａ）は、１日の乳汁容量 対 日付の曲線で可視化され得る（図１Ｂ）。
【００９８】
乳汁容量の測定と平行して、微生物学的アッセイをその乳汁に対して行い、その結果（図２Ａ）を、１ｍｌあたりのＣＦＵ（コロニー形成単位） 対 日付 に対応するプロットで示し、そして（図２Ｂ〜２Ｃ）に示す。
【００９９】
（ｈＧＨの）生物学的活性もまた、ＮＢ２細胞培養においてインビトロでの生物学的アッセイによって評価した（図３Ａ〜３Ｂ）。若い雌牛の乳汁において産生された組換えｈＧＨの生物学的活性が、ヒト天然ｈＧＨに対する正常値において、その方法のエラーランク内にあることが証明された。さらに、得られた乳汁をＷｅｓｔｅｒｎブロットによって研究し、そのＷｅｓｔｅｒｎブロットで無傷なｈＧＨに対応する主要なバンドを検出した。これらの生産システムにおいて予期されるように、切断された改変体および凝集体に対応するさらなる微量なバンドもまた見出した。
【０１００】
生物学的活性および１日の容量に関する情報に関して、等式１を用いてｈＧＨの１日の産生量を計算することが可能であった；ここで、ｍｈＧＨは、ミリグラム単位での１日に産生されたｈＧＨの質量であり；ＢＡは、国際単位での生物学的活性であり；ＳＡは、ｈＧＨの比活性度（３ＩＵ／ｍｇ）であり；そしてＶは、収集した乳汁の１日の容量である。このデータは、図４Ａに示される。ｈＧＨの１日の質量のプロットは、図４Ｂに示される。ｈＧＨの１日の質量と乳汁の１日の容量との間の可視的な相関を確立するために、乳汁の１日の容量もまた図４Ｂにプロットした。
【０１０１】
【数１】
この情報から観察され得るように、乳汁中のｈＧＨの１日の質量および乳汁の１日の容量は、ウシの発達につれて増加する傾向にあり（乳汁中のｈＧＨの１日の質量がより高い割合であるが）、このことは、組換えホルモンの生産性（乳汁１リットルあたりのｈＧＨのグラム数）における上昇傾向となる。この生産性が、生産物が初乳である場合、１リットルあたり約２ｇのｈＧＨ（最初の搾乳）から、第２の授乳月以降から乳汁１リットルあたり平均５ｇのｈＧＨの量になったことが認められ得る。従って、予想外に高収量のヒト成長ホルモンを、流体の質が初乳から乳汁へと変化するにつれてほぼ連続的な様式で、生産性が増大するにつれて得た。
【０１０２】
現在、１日あたり産生されるｈＧＨの質量は実際顕著であるが、そのウシがまだ完全に成長していない場合、１日あたり産生される組換えタンパク質の質量における上昇傾向が将来、最大に達するまで継続すべきであることが注意されるべきである。
【０１０３】
乳汁に対して行った試験に平行して、異なるセットのアッセイをウシの血清に対して行い、その結果を５Ａ〜５Ｃに示す。第一に、ウシの血清におけるｈＧＨの濃度の測定を行った。その結果（図５Ａ）を、乳汁中のｈＧＨの１日の質量と一緒にグラフにプロットし、両方の大きさの比較を可能にする（図５Ｂ）。
【０１０４】
（ヒトにおける）血清中のＧＨに対する参照範囲は、０．０６ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌである。ウシについて仮定上の類似の範囲を想定すると、始めを除いて、トランスジェニックウシの血清中のｈＧＨ 対 日付の全体の曲線は、上記範囲の上部限界を十分に上回ることが認められ得る。この事実にもかかわらず、ｈＧＨおよび対応するウシホルモン（ｂＧＨ）が、そのアミノ酸配列および三次元構造に関して非常に類似しており、ｈＧＨはたとえ完全に機能性でもウシでは全く活性でないことを考慮に入れなければならない。
【０１０５】
従って、その血清中の高レベルのｈＧＨに起因するウシの健康に対する潜在的な危険性を評価するために、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１、ソマトメジンＣとしてもまた公知である）の血清濃度の測定を平行して行った（図５Ａ）。成長ホルモンは、主に、肝臓で作製されるＩＧＦ−１を介してその機能を果たす。ＩＧＦ−１はインビボ細胞分割および成長ホルモンの代謝効果の多くを媒介するので、ＩＧＦ−１評価は疑われる成長ホルモン障害の間接的な評価のために価値のある診断ツールである。従って、ＩＧＦ−１は、生物が利用可能な成長ホルモンの信頼できる指標を表す。この分析の結果を、ｈＧＨに対応する結果と一緒に、図５Ｃに示し、両方の大きさの同時可視化を可能にする。
【０１０６】
さらに、ＩＧＦ−１およびｈＧＨを、コントロール群を得て、トランスジェニックウシに対応するデータとの比較を確立するために、非トランスジェニックウシの一群の血清で測定した。非トランスジェニック群およびトランスジェニックウシについての両方のタンパク質の測定の平均を、以下の表３に示す。
【０１０７】
【表３】
非トランスジェニック群におけるｈＧＨの平均血清濃度が仮定的な参照範囲内にあるが、トランスジェニックウシについての平均は上記範囲の上限を十分に上回ることは注目すべきことである。さらに、トランスジェニック動物の血清中のＩＧＦ−１の平均レベルが非トランスジェニックウシに対応するレベルよりもはっきりと高く、これが根本的な相違をなすことは疑う余地がない。
【０１０８】
従って、トランスジェニックウシの血清中の高濃度のｈＧＨ（これはヒトにおいては、 重篤な結果を伴う障害（例えば、真性糖尿病、高血圧、心血管疾患および身体器官（肝臓、脾臓、腎臓および心臓が挙げられる）の肥大の増大した危険性）を引き起こすことが公知である）はその動物を理論的には生育不能にするが、このことは、その健康および福利に対する障壁を明らかに示すものではない。その血液中に憂慮すべきほど高レベルの外来ホルモンを有するが、完全に健康であり組換えタンパク質の顕著な生産性を示すウシは、予想外かつ革新的な寄与をなす。
【０１０９】
本発明の別の革新的な局面は、ウシの血流に入る組換えｈＧＨが乳腺を刺激してより多くの乳汁を産生することである。この効果は間接的に、すなわち、ＩＧＦ−１の作用を介して達成される。この分子は、乳腺を流れる血流を増加させ、乳脂肪、タンパク質、およびラクトースの合成に重要な前駆体を提供する。従って、ＩＧＦ−１は、乳房において栄養素を血液を通して細胞へ導くように作用し、その栄養素は乳汁の産生を補助する。従って、トランスジェニックウシの乳汁で産生された組換えｈＧＨが、その乳汁における対応するｈＧＨのより多くの分泌を伴って、その乳腺の刺激を通じてその動物によって産生される乳汁の容量の持続的増加を促進するので、自己刺激する動物が獲得される。
【０１１０】
（実施例５）
（サブクローニングによってトランスジェニック子ウシを得ること）
トランスジェニック子ウシの耳由来の５つの組織サンプルを、１．５ｍｍ直径の針（その針の先端はこの目的のために予め斜めにしていた）を使用して取得した。そのサンプルを、抗生物質および抗真菌剤を含むＰＢＳベースの培地中、冷凍下で研究室に送った。
【０１１１】
その後、その組織サンプルを、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＭＥＭ培地中、３９℃および５％ＣＯ２雰囲気で７２時間インキュベートした。最終的に、組織サンプルを取り出し、プレートの周辺における線維芽細胞をコンフルエンスまで増殖させた。一旦これを達成すると、その線維芽細胞を、Ｇ０期における同調化を達成するために培養培地を変えることなく少なくとも５日間インキュベートし、このＧ０期における同調化を顕微鏡による可視化によって評価した。
【０１１２】
トリプシン処理後、個々の線維芽細胞を、実施例２に従って除核されたウシ卵母細胞と融合し、それによって得られた胚を、ＳＯＦ培地および５％ＣＯ２ ＋ ５％Ｏ２ ＋ ９０％Ｎ２雰囲気で、胚盤胞の段階まで培養した。その後、１頭のレシピエントウシあたりおおむね２つの線維芽細胞を非外科的に移植し、妊娠を超音波検査によって３０日〜３５日目に決定した。
【０１１３】
移植されたウシを、自然分娩まで正常に妊娠を経過させる。最終的には、外科的アプローチ（Ｃａｅｓａｒｅａ）を分娩のために使用し得る。新生仔に、最初の４８時間の間Ｉｇリッチの初乳を与え、次いで、人工食物を、のちに天然の食物（そのすべては動物起源の化合物を含まない）を与える。
【０１１４】
図６Ａおよび６Ｂは、トランスジェニックウシのサブクローニングによって得られたトランスジェニック動物のうちの２頭に対して平行して行ったｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度の測定を示し、これらの分析の結果を、それぞれ図６Ｃおよび６Ｄに示し、各動物について両方の大きさの同時可視化を可能にする。現在、子ウシは若いので、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１の両方についての値は依然としてそれぞれの参照範囲内にあるが、これら２頭のクローンが得られたトランスジェニックウシと同一の様式で成長すると期待される。
【０１１５】
（実施例６）
（過排卵させたトランスジェニックウシの人工授精によってトランスジェニック子ウシを得ること）
トランスジェニックウシを得るための代替的なアプローチが本実施例に開示される。この方法は、ホルモン処置によってトランスジェニック雌ウシを過排卵させる工程；その雌ウシを人工授精させる工程；そのようにして産生された胚を再収集する工程；代理雌ウシへのその胚の移植工程；およびその動物の出生までの妊娠の発生工程を包含する。この手順の説明は以下に示される。
【０１１６】
（過排卵）
１日目（すなわち、手順を開始した日）の午前に、１５０μｇのプロスタグランジン（Ｄ（＋）−クロルプロステロール、Ａｒｓａｐｒｏｓｔ（登録商標）、Ａｒｓａ）を、筋肉内経路によってトランスジェニック雌ウシに投与した。その動物を、約１５％のタンパク質（１日目の前に、その動物に、同一のタンパク質含量を有する２ｋｇの飼料を与えていた）を含む１日４ｋｇの食餌に供した。８日目の午前に、プロゲステロンのＣＩＤＲ（体内薬物放出制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ））デバイスを膣内に置いた。さらに、５０ｍｇのプロゲステロンおよびエストラジオールを筋肉内経路によって投与した。動物に与えた飼料の量を、同一のタンパク質含量で６ｋｇ／日に増やした。次いで、ＦＳＨおよびＬＨ（ＰＬＵＳＥＴ（登録商標）、Ｃａｌｉｅｒ）の２回の筋肉内注射を１２日目、１３日目および１４日目に（１回は午前に、もう１回は午後に）行った。次の日（１５日目）、ＰＬＵＳＥＴ（登録商標）の２回の注射（１回は午前に、もう１回は午後に）および各々１５０μｇのプロスタグランジンの２回の注射（同一の投与レジメン）を筋肉内経路により行って処置を続けた。１６日目の午前に、ＣＩＤＲを取り外した。過排卵段階の全体にわたって投与したＰＬＵＳＥＴ（登録商標）の総量は３５０ＩＵであった。
【０１１７】
（授精）
この段階は、ドナーのジャージー雄ウシ由来の精液（これは、予め入手し、精子の生存度を維持するために凍結させていた）の３回の連続投与（１回目および２回目は、それぞれ１７日目の午前および午後、そして最後は１８日目の午前）を包含する。
【０１１８】
（胚の収集およびその胚の代理雌ウシへの移植）
２６日目の午前に、雌ウシの子宮の両方の角を１ｌのＤＡＭＰＢＳ（Ｎｕｔｒｉｃｅｌｌ（登録商標））でフラッシングすることによって、胚の収集を行った。その直後に、１頭のレシピエント雌ウシあたり２つの胚を非外科的に移植し、超音波検査によって妊娠を３０日〜３５日目に決定した。
【０１１９】
移植された雌ウシを、自然分娩まで正常に妊娠を経過させる。最終的には、外科的アプローチ（Ｃａｅｓａｒｅａ）が、分娩のために使用され得る。新生仔に、最初の４８時間の間にＩｇリッチの初乳を与え、次いで、人工の食物、天然の食物（そのすべては動物起源の化合物を含まない）を与える。
【０１２０】
生物学的な子孫の発生は、メンデルの法則に従うので、上で記載した手順の結果として生まれる動物の半数はトランスジェニックであるはずであり、そしてそのうち半数が雄性であり、他方の半数が雌性であるはずである。従って、トランスジェニックの雄性（創始動物（ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ））を得る確率が高く、その精液は、トランスジェニック群を拡大するために、過排卵されたトランスジェニック／非トランスジェニック雌ウシの授精のために使用されるジャージートランスジェニック精液のマスターバンク（Ｍａｓｔｅｒ Ｂａｎｋ）を確立するのに有用であり得る。
【０１２１】
（実施例７）
（乳汁からの組換えｈＧＨの精製）
一旦おおよその分子量、ウエスタンブロットの結果および子ウシの乳汁で産生された組換えｈＧＨの生物学的活性が妥当であることを確認すると、徹底的な精製プロセスを行った。なぜなら、生物薬学的生成物を製造する場合、上記生成物中に起こり得る混入物の存在を回避するために、目的のタンパク質を精製して均一にすべきであることが不可欠であるからである。このプロセスは、以下の工程を包含する：遠心分離によって乳汁の皮膜を得、得られた上清を希釈して、最終的にカゼインのミセル中に保持される組換えｈＧＨのより良好な可溶性を達成する（清澄）工程；およびこの溶液を流動層によるアニオン交換クロマトグラフィーカラムを通過させる工程（この工程に対する代替はイムノアフィニティーカラムの使用である、以下の実施例８を参照のこと）；得られる溶液を逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）工程に供する（ｓｕｂｄｕｅ）工程；その後、組換えｈＧＨが多い画分をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程。
【０１２２】
精製した物質を脱塩し、濃縮し、そして分子排除クロマトグラフィーに供する。これを、純粋な組換えｈＧＨを得るために分子量で分ける。
【０１２３】
乳汁由来のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製のための手順は、順に以下の工程を包含する：（ａ）清澄、（ｂ）流動層によるアニオン交換クロマトグラフィー、（ｃ）逆相クロマトグラフィー、（ｄ）アニオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）分子排除クロマトグラフィー（脱塩）、（ｆ）濃縮および（ｇ）分子排除クロマトグラフィー。
【０１２４】
（清澄）
新鮮な乳汁を、０．５％溶液を得るために、十分量のＴｗｅｅｎ ８０と混合した。Ｔｗｅｅｎ ８０の添加後、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを添加して７．３±０．１のｐＨを得た。その後、生成物を３０分間ホモジナイズし、次いで、脂肪層を分離させるために１４０００ｇで遠心分離した。その後、得られた溶液を、１５００μＳ／ｃｍ以下の伝導率まで０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０で希釈した。ｐＨを、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで７．３±０．１に調整し、次いで、生成物を０．８μｍ孔径の膜で濾過し、都合よく保管した。
【０１２５】
（流動層によるアニオン交換クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、以下のパラメーターに従って、アニオン交換マトリックスを用いてクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：３０ｃｍ（コンパクト層）
３）マトリックス：
ａ．Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ Ｑ ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
ｂ．容量：６００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．５Ｎ ＮａＯＨ
Ｂ．２０％エタノール
Ｃ．緩衝液Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．３
Ｄ．緩衝液Ｂ：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．３
Ｅ．緩衝液Ｃ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３
Ｆ．緩衝液Ｄ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．清澄した乳汁
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：２５±５ｌ
２）伝導率：≦１５００μＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．３±０．１ 。
【０１２６】
カラムを平衡化するために、その１．５カラム容量（「ｖｃ」）（９００ｍＬ）の純水を、１１５±５ｃｍ／時間の流量で通過させた（下向きの流れ）。その後、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、２３０±３０ｃｍ／時間の流量で連続的に通過させた（上向きの流れ）：３．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；３．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の緩衝液Ｂ；そして最後に、３．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の緩衝液Ａ。
【０１２７】
一旦カラムを平衡化したら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、１２±３℃、２３０±３０ｃｍ／時間の流量で行った。その後、溶出を１１５±１５ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行った。第一に、十分量の緩衝液Ａをカラムに通過させ（上向きの流れ）、第二に、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた（下向きの流れ）：１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の緩衝液Ａ；２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の緩衝液Ｄ。
【０１２８】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で連続的にカラムを通過させた：１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の純水；１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の緩衝液Ｂ；１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の純水；そして最後に、１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の２０％エタノール。
【０１２９】
選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）、そして目的のタンパク質について（ＲＩＡにより）アッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１３０】
（逆相クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、以下のパラメーターに従ってクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：４ｃｍ
２）層の高さ：４８ｃｍ
３）マトリックス
ａ．ＢａｋｅｒＢｏｎｄ Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ Ｂｕｔｙｌ（Ｃ４）１５μｍ ｐｒｅｐ ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇ（Ｂａｋｅｒ）
ｂ．容量：６００ｍｌ
２．溶液および緩衝液
Ａ．可動相１（ＭＰ１）：３０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．２）：純水：アセトニトリル（３５：５５：１０）
Ｂ．可動相２（ＭＰ２）：３０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．２）：純水：アセトニトリル（２０：１０：７０）
Ｃ．５０％メタノール
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から得られる、選択した画分のプール
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：３０±１５ｌ
２）ｐＨ：７．３±０．３ 。
【０１３１】
カラムを平衡化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、４７８ｃｍ／時間以下の流量で連続的に通過させた：０．３ｖｃ（１８０ｍｌ）の５０％メタノール；その後、５０％メタノール−ＭＰ２の勾配を、上記溶液の１００：０の割合から始めて、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで適用した；一旦勾配が終了したら、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）のＭＰ２をそのカラムに通過させた；その後、ＭＰ２−ＭＰ１の勾配を、上記溶液の１００：０の割合から始めて、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで適用した；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）のＭＰ１をそのカラムに通過させた。
【０１３２】
一旦カラムを平衡化させたら、クロマトグラフされる物質を０．４５μｍ孔径の膜で濾過し、直後に充填した。この充填を、２０±５℃、２３８ｃｍ／時間以下の流量で行った。その後、溶出を、４７８±７８ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行い、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた：１．０ｖｃ（６００ｍｌ）のＭＰ１；ＭＰ１−ＭＰ２の勾配、上記溶液の６５：３５から始めて、１８．０ｖｃ（９，０００ｍｌ）の総容量において上記溶液の４５：５５の割合が達成されるまで；４５：５５の割合で１．０ｖｃ（６００ｍｌ）のＭＰ１−ＭＰ２；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）のＭＰ２。
【０１３３】
一旦この工程が終了したら、そのカラムを洗浄するために、ＭＰ２−５０％メタノールの勾配を、上記溶液の１００：０の割合から始めて、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで適用した；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の５０％メタノールをそのカラムに通過させた。
【０１３４】
このクロマトグラフィーから得られる画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２０％均質であること、および酸化型ｈＧＨについてアッセイし、その結果に依存して、選択を行った。その後、選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質について（ＢｒａｄＦｏｒｄ法によって）アッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１３５】
（アニオン交換クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、アニオン交換マトリックスを用いて、以下のとおりにクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：２５ｃｍ
３）マトリックス
ａ．Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ．容量：５００ｍｌ
２．溶液および緩衝液
Ａ．２０％エタノール
Ｂ．溶液Ｋ：０．５Ｎ ＮａＯＨ、３Ｍ ＮａＣｌ
Ｃ．溶液Ｌ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５０
Ｄ．溶液Ｍ：０．１Ｎ ＨＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ
Ｅ．可動相３（ＭＰ３）：溶液Ｌ：アセトニトリル（７０：３０）
Ｆ．可動相４（ＭＰ４）：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５０）：アセトニトリル（７０：３０）
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から得られる、選択した画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：４．５±１ｌ
２）ｐＨ：７．２±０．２ 。
【０１３６】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、１８３±２０ｃｍ／時間以下の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｋ；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｌ；そして最後に、１．０ｖｃ（５００ｍｌ）のＭＰ３。
【０１３７】
一旦カラムを平衡化したら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、２０±５℃、１８３ｃｍ／時間以下の流量で行った。その後、溶出を、１８３±２０ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行い、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた：１．０ｖｃ（５００ｍｌ）のＭＰ３、ＭＰ３−ＭＰ４の勾配、上記溶液の１５：８５の割合から始めて、５．０ｖｃ（２５００ｍｌ）の総容量において上記溶液の２５：７５の割合が達成されるまで；そして最後に、２．０ｖｃ（１０００ｍｌ）のＭＰ４をカラムに通過させた。
【０１３８】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量でカラムに連続的に通過させた：ＭＰ４−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；純水−溶液Ｋの勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｋ；溶液Ｋ−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；純水−溶液Ｍの勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｍ；溶液Ｍ−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の純水；純水−溶液Ｌの勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の溶液Ｌ；溶液Ｌ−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；そして最後に、１．５ｖｃ（７５０ｍｌ）の純水。
【０１３９】
選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）アッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１４０】
（分子排除クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を分子排除マトリックスを用いて、以下のとおりにクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：２５ｃｍ
３）マトリックス
ａ．Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＧＨ２５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
ｂ．容量：５００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．５Ｎ ＮａＯＨ
Ｂ．２０％エタノール
Ｃ．緩衝液Ｃ：１５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２
Ｄ．緩衝液Ｇ：３２０ｍＭ グリシン、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．９
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から得られる、選択した画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：０．５±０．２ｌ
２）ｐＨ：７．５±０．５ 。
【０１４１】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、１８０ｃｍ／時間以下の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、２．０ｖｃ（１０００ｍｌ）の緩衝液Ｇ。
【０１４２】
一旦カラムを平衡化したら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、２０±５℃、１８３±２０ｃｍ／時間の流量で行った。その後、溶出を同じ流速および同じ温度で行い、１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の緩衝液Ｇを実行に必要な回数だけカラムに通過させた。
【０１４３】
一旦この工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量でカラムに通過させた：０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の緩衝液Ｃ；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；そして最後に、１．５ｖｃ（７５０ｍｌ）の２０％エタノール。
【０１４４】
選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質についてアッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１４５】
（濃縮）
上記実施例から得られる画分を、以下に記載する条件に従って濃縮した：
１．機器：
Ａ．蠕動ポンプ：Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ − カタログ番号３０２Ｓ
Ｂ．チュービング：Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ − カタログ番号９０２．００８０．０１６
Ｃ．濃縮機：Ｐｒｅｐ Ｓｃａｌｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ − カタログ番号ＣＤＵ Ｆ００６ＬＣ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．２８％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
Ｂ．０．０６％トリトン
Ｃ．０．１２５Ｎ ＮａＯＨ
Ｄ．緩衝液Ｇ：３２０ｍＭグリシン、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．９
３．処理される物質
Ａ．上記実施例から得られる、選択した画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：１．０±０．５ｌ
２）伝導率：１２００±１００μＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：６．９±０．１ 。
【０１４６】
まず、機器を洗浄、衛生化および平衡化し、以下の順序の溶液および緩衝液をその機器に流した：２ｌの０．１２５Ｎ ＮａＯＨ；１０ｌの純水；そして最後に、２ｌの緩衝液Ｇ。次いで、その機器を、通常の方法論に従って、選択した画分における濃縮に使用できるようにした。濃縮手順を、１５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により評価）が達成されるまで行った。
【０１４７】
選択した画分を０．２２μｍ孔径の膜で濾過し、全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）アッセイし、４℃で保管した。
【０１４８】
選択した画分の伝導率およびｐＨは、それぞれ、１，１００μＳ／ｃｍ〜１，３００μＳ／ｃｍおよび６．９±０．１であった。
【０１４９】
（分子排除クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、分子排除マトリックスを用いて、以下のとおりにクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：９２ｃｍ
３）マトリックス
ａ，Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ．容量：１，８００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．５Ｎ ＮａＯＨ
Ｂ．２０％エタノール
Ｃ．緩衝液Ｈ：３２０ｍＭグリシン、２．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．３０
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から選択され、濃縮された画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：４０±２０ｍｌ
２）伝導率：１，２００±１００μＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．３±０．１ 。
【０１５０】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、４６ｃｍ／時間未満の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；そして最後に、２．０ｖｃ（３，６００ｍｌ）の緩衝液Ｈ。
【０１５１】
一旦カラムを平衡化させたら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、２０±５℃、４６±１５ｃｍ／時間の流量で行った。その後、溶出を、同じ流速および同じ温度で行い、１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の緩衝液Ｈを、実行に必要な回数だけ通過させた。
【０１５２】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の純水；そして１．５ｖｃ（２，７００ｍｌ）の２０％エタノール。
【０１５３】
純粋なｈＧＨを含む画分を、０．２２μｍ孔径の膜で、滅菌した脱発熱性のプラスチックボトルに無菌的に濾過し、全タンパク質についてアッセイし、−２０℃で保管した。
【０１５４】
（実施例８）
（乳汁からのｈＧＨの精製についての代替的手順）
先に記載した精製方法の代わりに、乳汁中に含まれる組換えｈＧＨを精製するために、代替的スキームが使用され得る。実施例７に記載した手順と本実施例で示される代替的手順との間の主な相違は、前者の第２工程が流動層によるアニオン交換クロマトグラフィーを包含する一方で、後者の対応する工程がイムノアフィニティークロマトグラフィーを伴うことである。両方の手順の清澄工程もまた、わずかに異なる。両方の精製スキームの残りは同一なので、代替的手順の最初の２つの工程のみを以下に記載する。
【０１５５】
（清澄）
新鮮な乳汁を、０．５％溶液を得るために十分量のＴｗｅｅｎ ８０と混合した。Ｔｗｅｅｎ ８０の添加後、１Ｍ Ｔｒｉｓを添加して、７．３±０．３のｐＨを得た。その後、生成物を３０分間ホモジナイズし、次いで、脂肪層を分離させるために１４０００ｇで遠心分離した。その後、得られる溶液を緩衝液Ｓ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ７．３）で２０倍に希釈し、次いで、０．４５μｍ孔径の膜で濾過し、都合よく保管した。
【０１５６】
（イムノアフィニティークロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、以下のパラメーターに従って、イムノアフィニティー相互作用マトリックス（抗ＧＨモノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｓｉｄｕｓ製）に共有結合したＡｆｆｉｇｅｌ １０ Ｅｓｔｅｒ Ａｇａｒｏｓｅ、ＢｉｏＲａｄ製）を用いてクロマトグラフした：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：３０ｃｍ
２）層の高さ：１５ｃｍ
３）マトリックス：
ａ．抗ＧＨモノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｓｉｄｕｓ）に共有結合したＡｆｆｉｇｅｌ １０ Ｅｓｔｅｒ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢｉｏＲａｄ）
ｂ．容量：１０ｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．緩衝液Ａ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２
Ｂ．緩衝液Ｂ：１００ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．０
Ｃ．緩衝液Ｃ：１５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２
Ｄ．緩衝液Ｄ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭグアニジン．ＨＣｌ、ｐＨ７．２
Ｅ．緩衝液Ｅ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、０．２％アジ化ナトリウム、０．１ｇ／ｌゲンタミシン
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．清澄された乳汁
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：３０〜５０ｌ
２）伝導率：４５±１５ｍＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．３±０．３ 。
【０１５７】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、カラムが最近７日間で使用されていない場合には、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、５１ｃｍ／時間の流量で連続的に通過させた：１．０カラム容量（「ｖｃ」）（１０ｌ）の緩衝液Ａ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｄ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ；１．０ｖｃ（１０ｌ）の緩衝液Ｂ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、１．０ｖｃ（１０ｌ）の緩衝液Ａ。
【０１５８】
一方で、カラムが最近７日間で使用されている場合には、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で５１ｃｍ／時間未満の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（１０ｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ。
【０１５９】
一旦カラムを平衡化させたら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、５±３℃、５１ｃｍ／時間未満の流量で行った。その後、溶出を、４２±９ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行い、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた：２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ；そして１．５ｖｃ（１５ｌ）の緩衝液Ｂ。
【０１６０】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で連続的に通過させた：２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｄ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ；そして最後に、２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｅ。
【０１６１】
選択したｈＧＨを含む画分を全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）および目的のタンパク質について（ＲＩＡにより）アッセイし、４℃で保管した。
【０１６２】
（実施例９）
（純粋な組換えｈＧＨの品質管理）
純粋な組換えｈＧＨの２つのバッチを、一連のアッセイに供して、その生成物が天然のｈＧＨと区別できないことを確認した。そのような手順としては、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、インビトロ（細胞ｎｂ２）およびインビボ（下垂体切除ラット）での生物学的活性、ペプチドマッピング、完全なアミノ酸配列の決定、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ならびに逆相ＨＰＬＣ分析およびサイズ排除ＨＰＬＣ分析が挙げられるが、これらに限定されない。これらすべてのアッセイで得られた結果は、組換えｈＧＨおよび天然のｈＧＨの両方について全く同じであり、これは、純粋な組換えｈＧＨが天然のｈＧＨと正確に一致し、それゆえ生物薬学的生成物を製造するのに適切であることを証明する。
【０１６３】
ここで本発明を完全に記載して、本発明にもそのいかなる実施形態の範囲にも影響を与えることなく、条件、処方および他のパラメーターの広範かつ等価な範囲内で同じことが行われ得ることが、当業者によって理解される。本明細書中に引用されるすべての特許および刊行物は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、トランスジェニックウシから収集された１日の乳汁容量を示し、このトランスジェニックウシは、除核された卵母細胞と、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする遺伝子および乳腺細胞にその発現を誘導するプロモーターを含むプラスミドで予めトランスフェクトされた線維芽細胞との融合によって得られた。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、同じトランスジェニックウシから収集された乳汁中に見出された細菌数を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、同じトランスジェニックウシの乳汁中に含まれるｈＧＨの生物学的活性を示す。
【図４】図４Ａは、同じトランスジェニックウシの乳汁中に産生されたｈＧＨの１日の質量を示す。この大きさおよびそのトランスジェニックウシから収集された１日の乳汁容量が一緒に図４Ｂにプロットされる。
【図５】図５Ａは、同じトランスジェニックウシの血清中のｈＧＨおよびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の濃度、および同じトランスジェニックウシ乳汁中に産生されたｈＧＨの１日の質量を示す。そのトランスジェニックウシの血清中のｈＧＨの濃度およびそのトランスジェニックウシの乳汁中に産生されたｈＧＨの１日の質量が、一緒に図５Ｂにプロットされる。図５Ｃには、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１のトランスジェニックウシの血清濃度に関する時間プロフィールが一緒にプロットされる。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ウシ（その乳汁におけるｈＧＨの産生のためのトランスジェニックである）のサブクローニングによって得られた２頭のトランスジェニック子ウシにおけるｈＧＨおよびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の血清濃度を示す。図６Ｃおよび図６Ｄには、これらのトランスジェニック子ウシの各々について、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度に関する時間プロフィールが一緒にプロットされる。
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ヒトの健康管理に関与するタンパク質因子およびホルモンは、一般的に、この数十年間、抽出によってか、または組換え技術によって製薬産業により生成された。所望の遺伝子を含む遺伝的構築物の発現は、細菌、酵母または哺乳類細胞株で首尾よく発現された。しかし、複雑なタンパク質（例えば、適切なグリコシル化パターンを必要とするタンパク質）を得るために哺乳類細胞培養物を使用することは、高コストの手順を伴う。
【０００２】
組換えＤＮＡ技術は、商業的に重要な生物学的物質の産生のために、この十年間にわたってますます使用されている。この目的のために、種々の医学的に重要なヒトタンパク質をコードするＤＮＡ配列がクローニングされている。これらとしては、インスリン、プラスミノゲン活性化因子、α−抗トリプシンならびに凝固因子ＶＩＩＩおよび凝固因子ＩＸが挙げられる。現在、新興の組換えＤＮＡ技術を用いても、これらのタンパク質は、通常は血液および組織から精製される、感染因子（例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎を引き起こす因子）を伝達する危険性を有し得る高価で時間のかかるプロセスである。
【０００３】
所望の医学的に重要なタンパク質を産生するための、細菌におけるＤＮＡ配列の発現は魅力的な提案であるように見えるが、実際には、細菌は多くの場合、宿主として不十分であると判明する。なぜなら、細菌細胞において、外来のタンパク質は不安定であり、正確にプロセスされないからである。
【０００４】
この問題を認識して、哺乳類組織培養物におけるクローン化遺伝子の発現が試みられ、いくつかの事例では、実現性のあるストラテジーが証明された。しかし、動物細胞のバッチ発酵は高価であり、技術的な要求の厳しいプロセスである。
【０００５】
従って、正確に改変された真核生物のポリペプチドのような生物学的物質の産生のための、高収量で低コストのプロセスに対する必要性が存在する。ヒトに対して感染性である因子が存在しないことが、そのようなプロセスの利点である。
【０００６】
所望の遺伝子に対して、乳汁中に大量のヒトタンパク質を得る目的で、ウシのようなトランスジェニック動物を得る可能性は、産業にとって非常に関心のあることである。いくつかのグループが文献で、ヒト血清アルブミン、α抗トリプシンを産生することにおける成功、およびトランスジェニックウシもしくはヤギにおける他のいくつかの例を報告している。
【０００７】
以前に多くの実験がマウスまたはラットで行われ、βカゼインプロモーターまたはラクトアルブミンプロモーター（これらは、授乳中の雌性における乳腺転写因子に対してのみ応答する）が使用されるので、トランスジーン発現は常に乳腺に限定されることが好まれた。
【０００８】
乳汁において排他的な異種タンパク質の発現は、宿主動物の健康への望ましくない影響を避けること、および容易な精製方法を提供することが意図されている。
【０００９】
現在、人々は、細胞のトランスフェクションまたは選択の収量を改善するようないくつかのシステムを提示すること、ならびにクローン動物の生存状態および免疫状態を改善するような相同の胎児体細胞の供給源を選択することに専念している。
【００１０】
他方では、農業的な目的および生物医学的な目的で、主にえり抜きの家畜の繁殖およびトランスジェニック動物の遺伝子操作を可能にするために、体細胞核移植に非常に大きな関心が存在する。簡単に述べると、核移植（ＮＴ）は、受容卵母細胞の除核、その後の受容細胞質体に接して付着する卵黄周囲腔へのドナー細胞の移植、およびそれらの融合を含む。発生は、化学的活性化または物理的活性化によって人工的に誘導される。体細胞核移植によるクローン子孫の産生は、ヒツジで（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、ヤギで（非特許文献４）、そしてウシで（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）首尾よく達成されている。
【００１１】
ＮＴ（除核、融合、活性化およびドナー−レシピエント細胞周期同調性の方法を含む）の結果に影響を与えるいくつかの要因が存在する。受容卵母細胞の除核の高効率は、クロマチンを可視化するためにＤＮＡ特異的生体色素を用いて達成されている（非特許文献８、非特許文献９）。ドナー細胞と受容卵母細胞の融合は、パルスフィールドにおける細胞配置の精度、ドナー細胞と受容卵母細胞の接触、およびドナー細胞のサイズに依存する（非特許文献１０）。ＮＴで再構築された胚の活性化は洗練されており、胚盤胞への発生率は、インビトロで授精された卵母細胞と同等である（非特許文献１１）。
【００１２】
ＮＴ胚の成功した発生は、受容細胞質体として成熟卵母細胞を用いて（非特許文献１２）、接合体を用いて（非特許文献１３）、および卵割段階の胚を用いて（非特許文献１４）達成されている。しかし、これは、ドナー核の供給源に依存する。受容細胞質体とドナー細胞との間の細胞周期の適合性は、ＮＴ胚の発生に影響を与える重要な要因の１つである。適切な同調化が、再構築された胚の倍数性を保つために必要である。
【００１３】
有糸分裂細胞周期は、以下の連続的な期を有する：前複製間期（Ｇ１）、ＤＮＡ合成期（Ｓ）、前分裂間期（Ｇ２）および分裂期（Ｍ）。一回の細胞周期の間、すべてのゲノムＤＮＡが分裂前に一度複製する。除核された成熟卵母細胞（第２中期）に移植された間期ドナー核は、数度の形態学的な変化を経験する。融合後、しかしドナー核エンベロープ崩壊（ＮＥＢＤ）前に、染色体は凝集する（ＰＣＣ）。これらの変化は、成熟／有糸分裂／減数分裂促進因子（ＭＰＦ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性によって誘導される（非特許文献１５）。ＭＰＦおよびＭＡＰＫ活性は、すべての減数分裂細胞および有糸分裂細胞において見出され、そしてＭＰＦおよびＭＡＰＫ活性は、中期で最も高く、哺乳類卵母細胞ではこれらの高レベルはまた、第２中期の停止を誘導する。受精またはカルシウムイオノフォアでの活性化によるＭＰＦおよびＭＡＰＫの減少は、減数分裂の完了、第二極体放出、精核脱凝集および前核形成のシグナルである。
【００１４】
ドナークロマチンにおけるＮＥＢＤおよびＰＣＣの直接的な効果は、移植時におけるドナー核の細胞周期に依存する。二倍体のＧ０／Ｇ１核は凝集して単一の染色分体を形成するが、四倍体のＧ２核は凝集して二重の染色分体を形成する。しかし、移植時におけるＳ期の核は、特徴的な「バラバラになった（ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ）」外見を示す；ＰＣＣが広範なＤＮＡ損傷を生じる。従って、活性化時またはその前にＧ１核またはＧ０核を第２中期の卵母細胞に移植することによって、正確な倍数性がもたらされ得る。第２の方法は、Ｓ期に予め活性化された卵母細胞に核を移植することであり、この場合、Ｇ１期、Ｇ０期またはＳ期のドナー細胞を使用することが可能である。ＭＰＦおよびＭＡＰＫは低いので、クロマチンは脱凝集し、ＰＣＣおよびＮＥＢＤを伴わずにＤＮＡ複製が起こる。
【００１５】
第３の同調化スキームは、マウスで報告されており、生存子孫の発生が、Ｇ２ドナー細胞または中期ドナー細胞と除核された第２中期卵母細胞とを使用する胚再構築によってもたらされた（非特許文献１６、非特許文献１７）。ＮＴで再構築された胚からの極体の排出が単一の二倍体胚および二倍体極体を生じることが報告された（非特許文献１７）。しかし、ウシ、ヒツジまたはブタにおいて除核されたＭＩＩ卵母細胞へのＮＴ後の極体形成に関する報告は存在せず、これは、無傷の紡錘体の形成および極体の排出を制御する仕組みにおける種間の相違を示唆する。
【００１６】
ドナー細胞およびレシピエントの細胞周期段階は、ドナー細胞核をリプログラム（ｒｅｐｒｏｇｒａｍ）するためにもまた重要であることが示唆されている。ドナー核移植と接合体転写との間の時間の増加は、核のリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）を改善し得る。この理由により、数人の著者は、卵母細胞を融合の数時間後に活性化させた（非特許文献５、非特許文献１８、非特許文献１９）。他の報告は、連続的な核移植を適用した（非特許文献８）。
【００１７】
ドナー核のリプログラミング時間を増加させるための未開の手順は、第２中期前の核移植による手順である。卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の後、すべての核事象が卵母細胞の細胞質ゾルのＭＰＦおよびＭＡＰＫの実質的な増加によって調節され、これは核エンベロープの再構築および受精もしくは活性化までＳ期に入ることを妨げる。従って、成熟卵母細胞は、中期ドナー細胞またはＧ２ドナー細胞についての一般的なレシピエントであり得る。活性化が細胞分裂前にＳ期を誘導する場合には、Ｇ１またはＧ０でさえもドナー細胞として使用され得る。
【００１８】
Ｇ２またはＭにおける割球がドナー細胞として使用される場合、核のリプログラミングが可能である（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献２０）。１つの説明は、染色体凝集の結果として、いくつかの要素がクロマチンから置き換わるということである。実際に、核移植について、ＮＥＢＤおよびＰＣＣは核のリプログラミングの形態学的なサインであると考えられている。従って、受精時に精子クロマチンが極度に凝集し、その容積が体細胞の核の容積よりも非常に小さくなり、卵母細胞が精子核タンパク質を除去する能力を有する。卵母細胞染色体もまた、精子−卵母細胞の融合中に凝集する。凝集したクロマチンコンフォメーションがいくらかの生物学的な関連性を有し得る可能性がある。従って、中期核移植によるこの局面を模倣することによって、中期に除核されたレシピエントがＮＴの結果を改善し得る。しかし、少数の研究者は、家畜においてドナー細胞として割球を用いてこのアプローチを使用した（非特許文献２０）。
【非特許文献１】Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０、１９９６年、ｐ．６４−６６
【非特許文献２】Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ５７、１９９７年、ｐ．３８５−３９３
【非特許文献３】Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５、１９９７年、ｐ．８１０−８１３
【非特許文献４】Ｂａｇｕｉｓｉ，Ａ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７、１９９９年、ｐ．４５６−４６１
【非特許文献５】Ｃｉｂｅｌｌｉ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０、１９９８年、ｐ．１２５６−１２５８
【非特許文献６】Ｋａｔｏ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、１９９８年、ｐ．２０９５−２０９８
【非特許文献７】Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ １０、１９９８年、ｐ．３６９−３７８
【非特許文献８】Ｓｔｉｃｅ，Ｓ．Ｌ．およびＫｅｅｆｅｒ，Ｃ．Ｌ．、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４８、１９９３年、ｐ．７１５−７１９
【非特許文献９】Ｗｅｓｔｈｕｓｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ ９５、１９９２年、ｐ．４７５−４８０
【非特許文献１０】Ｃｏｌｌａｓ，Ｐ．ら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０８、１９９３年、ｐ．１−９
【非特許文献１１】Ｌｉｕ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ ４９、１９９８年、ｐ．２９８−３０７
【非特許文献１２】Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２０、１９８６年、ｐ．６３−６５
【非特許文献１３】ＭｃＧｒａｔｈ，Ｊ．およびＳｏｌｔｅｒ，Ｄ．、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｎ Ｙ ４、１９８５年、ｐ．３７−５５
【非特許文献１４】Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｙ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ ９６、１９９２年、ｐ．２７５−２８１
【非特許文献１５】Ｃｏｌｌａｓ，Ｐ．およびＲｏｂｌ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４５、１９９１年、ｐ．４５５−４６５
【非特許文献１６】Ｃｈｅｏｎｇ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４８、１９９３年、ｐ．９５８−９６３
【非特許文献１７】Ｋｗｏｎ，Ｏ．Ｙ．およびＫｏｎｏ，Ｔ．、ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３、１９９６年、ｐ．１３０１０−１３０１３
【非特許文献１８】Ｗａｋａｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４、１９９８年、ｐ．３６９−３７４
【非特許文献１９】Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ６０、１９９９年、ｐ．９９６−１００５
【非特許文献２０】Ｌｉｕ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ ４７、１９９７年、ｐ．２５５−２６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の１つの目的は、既存の体細胞核移植を特徴付けし、成体ドナー細胞から遺伝的に同一の幼獣を産生するための信頼性のある経済的な技術に洗練することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、この非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、その乳汁における予想外に高レベルの組換え成長ホルモンの産生によって特徴付けられる。組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００２１】
本発明はさらに、哺乳動物の乳腺細胞において目的のタンパク質の発現を提供するプラスミドに関し、その哺乳動物において発現は、βカゼインプロモーターによって調節される。目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。
【００２２】
本発明はまた、その乳汁中に組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する様々な方法に関する。組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００２３】
本発明はまた、目的のタンパク質を産生する方法に関し、その方法は、その乳汁中に上記タンパク質を産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程、その非ヒトトランスジェニック哺乳動物から上記乳汁を得る工程、およびその乳汁から上記目的のタンパク質を精製する工程を包含する。目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００２４】
本発明はまた、トランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを産生し、精製する方法に関する。組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。トランスジェニック動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、この非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、その乳汁における予想外に高レベルの組換え成長ホルモンの産生によって特徴付けられる。この哺乳動物は、ウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。トランスジェニック哺乳動物の他の種は、ブタ種、ヒツジ種、ヤギ種、または齧歯動物種であり得るが、これらに限定されない。
【００２６】
組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。ソマトトロピンとしても公知であるこの分子は、１９１個のアミノ酸からなるタンパク質であり、約２２ｋＤの分子量を有する。ヒト成長ホルモンは線形成長に必須であり、その適用は十分に確立されている。
【００２７】
本発明はまた、トランスジェニック哺乳動物に関し、このトランスジェニック哺乳動物は、その乳汁中に産生される組換え成長ホルモンがそのホルモンを含む乳汁をより多く産生するために、その動物の乳腺を自己刺激するという事実によって特徴付けられる。
【００２８】
本発明はまた、βカゼインプロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質をコードする遺伝子と、βラクタマーゼ遺伝子とを含むプラスミドに関する。この目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。このプラスミドはｐＲβｈＧＨであり得る。
【００２９】
さらなる実施形態において、プラスミドは、ジェネティシン耐性細胞の選択のために、ネオマイシン耐性遺伝子をさらに含む。そのようなプラスミドの例は、ｐＲＮｅｏである。
【００３０】
さらなる実施形態において、プラスミドは、ＧＦＰのような緑色蛍光タンパク質（これは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある）をコードする遺伝子を含む。そのようなプラスミドの例は、ｐＲＮｅｏＧｒｅｅｎである。
【００３１】
本発明はさらに、上に記載されたプラスミドのようなプラスミドに関し、そのプラスミドは、制限消化によって直鎖状にされる。特に、制限酵素ＡｐａＬＩの使用が採用され、βラクタマーゼ遺伝子が切除される。
【００３２】
上で言及したプラスミドの、ブダペスト条約に基づく寄託手順が進行中である。寄託機関の名称および所在地は、以下である：ＤＳＭＺ−ドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクトゥレン ゲーエムベーハー、マッシャーオーダー ヴェーク １ｂ，３８１２４ ブラウンシュヴァイク，ドイツ。対応する受託番号は、後日提供される。
【００３３】
本発明はさらに、改変されたより短いβカゼインプロモーター領域がｈＧＨコード領域の上流に挿入されたＮｅｏ耐性遺伝子を含むプラスミド（例えば、ｐＶＥβｃａｓｈＧＨ）のもとに構築されたプラスミドに関する。直鎖状フラグメントは、βラクタマーゼ遺伝子を切除することによってプラスミドｐＶＥβｃａｓｈＧＨから得られ得る。
【００３４】
本発明はさらに、リポソーム利用のためにカチオン性脂質の組み合わせを用いる、遺伝的構築物のトランスフェクションのための方法に関する。
【００３５】
適切な培地におけるネオマイシン耐性細胞の選択方法もまた、緑色蛍光トランスジェニック細胞を選択する方法と同様に記載される。これらの細胞は、細胞損傷を避けるように注意深く採取される。
【００３６】
本発明はまた、Ｇ０または細胞周期の異なる時期に停止された細胞の、除核されたウシ卵母細胞への核移植方法に関する。
【００３７】
本発明は、ホルモン刺激したウシの子宮へのトランスジェニック胚移植方法に関する。
【００３８】
本発明に従って、動物の健康パラメーターを決定する方法が開示される。分析はそのようなパラメーターを決定するために、動物の血清および乳汁の両方で行われる。
【００３９】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、成長ホルモンをコードする遺伝子を得る工程、その遺伝子をプラスミドにクローニングし、それによって乳腺細胞においてその遺伝子の発現を誘導するプロモーターにその遺伝子が作動可能に連結され、発現プラスミドを得る工程、その発現プラスミドが体細胞のゲノムに組み込まれるように体細胞をその発現プラスミドでトランスフェクトする工程、トランスジェニック体細胞を得る工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合し、単細胞胚を得る工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４０】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、その乳汁において組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雌性哺乳動物から体細胞（必要に応じて、線維芽細胞）を抽出する工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合し、単細胞胚を得る工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４１】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、その乳汁において組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を雄性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物由来の精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４２】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、その乳汁において組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を上記組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４３】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する方法に関し、その方法は、雌性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を組換え成長ホルモンを産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を得る工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４４】
上記組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。
上記非ヒトトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これに限定されない。
【００４５】
本発明はさらに、タンパク質を産生する方法に関し、その方法は、その乳汁中に予想外に高収量で目的のタンパク質を産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程、その非ヒトトランスジェニック哺乳動物からその乳汁を得る工程、およびその乳汁からその目的のタンパク質を精製する工程を包含する。
【００４６】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、上記目的のタンパク質をコードする遺伝子を得る工程、その遺伝子をプラスミドにクローニングし、それによって乳腺細胞においてその遺伝子の発現を誘導するプロモーターにその遺伝子が作動可能に連結され、発現プラスミドを得る工程、体細胞のゲノムにそのプラスミドが組み込まれるように体細胞（必要に応じて、線維芽細胞）をそのプラスミドでトランスフェクトし、トランスジェニック体細胞を得る工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびその哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４７】
本発明はさらにまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、その乳汁において上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性哺乳動物から体細胞（必要に応じて、線維芽細胞）を抽出する工程、成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程、１つのトランスジェニック体細胞とその除核された卵母細胞とを融合し、単細胞胚を得る工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４８】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、その乳汁において上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を雄性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物から得られる精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００４９】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、その乳汁において上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程を包含する。
【００５０】
本発明はまた、一定のプロセスによって作製された非ヒトトランスジェニック哺乳動物において目的のタンパク質を産生するための方法に関し、その方法は、雌性の非ヒトかつ非トランスジェニック哺乳動物を過排卵させる工程、その哺乳動物を上記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雄性の非ヒト哺乳動物から得られた精液と人工授精させて胚を産生させる工程、その胚を収集する工程、その胚を受容性の哺乳動物の子宮移植する工程、およびそのトランスジェニック哺乳動物の出生を通じてモニタリングする工程を包含する。
【００５１】
その乳汁において目的のタンパク質の予想外に高レベルの産生によって特徴付けられるトランスジェニック哺乳動物はウシ種の動物であり得るが、これらに限定されない。トランスジェニック哺乳動物の他の種は、ブタ種、ヒツジ種、ヤギ種または齧歯動物種であり得るが、これらに限定されない。目的のタンパク質はヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。
【００５２】
本発明はさらに、その乳汁中に組換えヒト成長ホルモンを産生するウシ種の非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、そのゲノムは統合されたプラスミドを含み、上記プラスミドはヒト成長ホルモン遺伝子と、その哺乳動物の乳腺細胞において上記遺伝子の発現を誘導するβカゼインプロモーターとを含む。
【００５３】
本発明はさらに、予想外の高レベルでｈＧＨを産生するが、そのような高レベルのｈＧＨ産生で期待される身体的発育を示さないトランスジェニック哺乳動物に関する。トランスジェニックウシはヒト成長ホルモンの存在によって影響を受けるので、その動物が非トランスジェニックの成長速度を超えて成長すること、ならびに真性糖尿病、高血圧、心血管疾患および身体器官（肝臓、脾臓、腎臓および心臓が挙げられる）の肥大の増大した危険性などの状態に苦しむと見込まれる。そのような高レベルのｈＧＨは、その動物を理論的には生育不能にするはずである。しかし、これは事実ではない。その血液中に憂慮すべきほど高レベルの外来ホルモンを含むが、全く健康で組換えタンパク質の顕著な生産性を生じる哺乳動物（例えば、ウシ）は、予想外かつ革新的な貢献をする。
【００５４】
本発明の組換えヒト成長ホルモンは、予想外に高レベルで産生される。産生されるヒト成長ホルモンのレベルは、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇを超える。ｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇを超え得る。産生されるｈＧＨのレベルはまた、乳汁１Ｌあたり約３．０ｇを超え得る。別の実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約４．０ｇを超え得る。さらに別の実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約５．０ｇを超え得る。さらなる実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約６．０ｇを超え得る。なおさらなる実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇ〜乳汁１Ｌあたり約７．０ｇである。さらなる実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ〜乳汁１Ｌあたり約６．０ｇである。さらに別の実施形態において、産生されるｈＧＨのレベルは、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ〜乳汁１Ｌあたり約５．０ｇである。
【００５５】
さらに、本発明は、トランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法、ならびに上記ホルモンのアッセイに関する。精製方法は、クロマトグラフィー工程および濃縮工程を含み得る。様々な型のクロマトグラフィーが使用され得、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーはアニオン交換クロマトグラフィーであり得る。アフィニティークロマトグラフィーはイムノアフィニティークロマトグラフィーであり得る。さらに、複数のクロマトグラフィー工程が行われ得る。
【００５６】
本発明はさらに、組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法に関し、その方法は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁を清澄し、清澄された乳汁を得る工程、およびその清澄された乳汁をクロマトグラフィーに供し、精製された組換え成長ホルモンを得る工程を包含する。
【００５７】
本発明はさらに、組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法に関し、その方法は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁を清澄し、清澄された乳汁を得る工程、その清澄された乳汁を流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ−ｂｅｄ）によるアニオン交換クロマトグラフィーに供し、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程、そのアニオン交換クロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供し、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程、その逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程、そのアニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程、その分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮し、濃縮された物質を得る工程、およびその濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程を包含する。
【００５８】
本発明はまた、組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法に関し、その方法は、トランスジェニック哺乳動物から得られた乳汁を清澄し、清澄された乳汁を得る工程、その清澄された乳汁をイムノアフィニティークロマトグラフィーに供し、イムノアフィニティークロマトグラフされた物質を得る工程、そのイムノアフィニティークロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供し、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程、その逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程、そのアニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程、その分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮に供し、濃縮された物質を得る工程、およびその濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供し、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程を包含する。
【００５９】
上で記載される精製方法の組換え成長ホルモンはヒト成長ホルモンであり得るが、これに限定されない。トランスジェニック哺乳動物はウシ種の哺乳動物であり得るが、これに限定されない。
【００６０】
以下の実施例は本発明の方法および組成物の例示であるが、限定するものではない。当業者に明らかである、通常は化学物質の酵素的生成およびタンパク質精製手順において直面する種々の条件およびパラメーターの他の適切な改変および適合は、本発明の精神および範囲のうちにある。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
（発現プラスミドの構築）
本発明者らは、ヒト成長ホルモン遺伝子のコード配列に融合された、ウシβカゼイン遺伝子プロモーターの大部分（５’非コードβカゼイン遺伝子領域の短いフラグメントを含む）を有する構築物を生成した。様々な構築物で使用したβカゼイン領域を、３．８ｋｂｐから約１．３ｋｂｐまで減少させた。ｈＧＨ遺伝子は、内因性のポリＡシグナルが含まれるか否かに依存して約２ｋｂｐ〜２．２ｋｂｐを含む。
【００６２】
発現カセットを、ｐＵＣ型またはｐＢＳ型の通常のクローニングベクターのポリリンカー中に提供した。
【００６３】
このプロモーターは、その制御下で、βカゼインおよびこの場合は異種ｈＧＨのように、遺伝子の組織特異的かつ発生的に調節された発現を保証する。
【００６４】
最も代表的なプラスミドはｐＲβｈＧＨであり、これは、ヒト成長ホルモン遺伝子のコード配列に融合された、全長ウシβカゼインプロモーターを有する。
【００６５】
開示される他の構築物は、主に、示されるように、トランスフェクト細胞選択またはウシ細胞ゲノムへのＤＮＡ統合効率を改善するために、もとのものに由来する。
【００６６】
第１の期間に、ジェネティシン耐性遺伝子を含むプラスミドとの同時トランスフェクションを、選択を補助するために行ったが、次に、ｈＧＨ発現カセットを含む同一のベクターにおけるネオマイシン耐性のためにＮＰＴ遺伝子を有する他の構築物を使用した。そのようなプラスミドの例はｐＲＮｅｏである。
【００６７】
緑色蛍光タンパク質の構成的発現のための別のプラスミドを得、これは、ＣＭＶプロモーター、植物起源（アルファルファ）のエンハンサー、およびクラゲＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む。そのようなプラスミドの例はｐＲＮｅｏＧｒｅｅｎである。
【００６８】
さらに、別のプラスミドを生成した。これは、改変されたより短いβカゼインプロモーター領域をｈＧＨコード領域の上流に挿入した、Ｎｅｏ耐性遺伝子を含むプラスミドを基に構築した。このプラスミドはｐＶＥβｃａｓｈＧＨである。
【００６９】
他の構築物を生成し、それらの構築物では、βラクタマーゼ領域をＡｐａＬＩ制限によって切除し、アガロースゲル電気泳動、およびゲル抽出の後に全発現カセットを含む直鎖状フラグメントを精製した。
【００７０】
構築物を制限酵素およびＤＮＡ配列決定によって分析し、ｈＧＨ発現を行うそれらの能力を蛍光抗体認識によって乳腺細胞株で事前に試験した。
【００７１】
プラスミドｐＶＥβｃａｓｈＧＨの調製は、遺伝的構築物に関する部分の実施例として詳細に記載される。
【００７２】
（ｐＶＥβｃａｓｈＧＨの調製）
この構築物の目的は、宿主生物におけるそのポリＡシグナルに並んですぐ下流に融合されたｈＧＨ遺伝子の特異的に調節された転写を誘導するβカゼインプロモーター領域の最小限の伸長を提供することである。
【００７３】
元のベクターとしてのｐＶＥＸの使用は、このプラスミドにすでに存在するｔｋプロモーターによって調節されるネオマイシン耐性遺伝子の使用を可能にする。５５４ｂｐからなる初期ＳＶ４０プロモーターを、ＳｔｕＩおよびＮｄｅＩでの制限によって切除し、最後の部位をＫｌｅｎｏｗで補充し、得られるベクターを自己連結させた。
【００７４】
プライマーとして以下のオリゴ：
ＰＢ１ ５’ＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡＧ（配列番号１）および
ＰＢ２ ５’ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧ（配列番号２）
を使用することにより、３．８ｋｂｐの元の遺伝子プロモーター領域からの１．３ｋｂｐのフラグメントのＰＣＲ増幅後、βカゼインの短いプロモーターを得た。このフラグメントは、１２３０ｂｐの標準プロモーターと、４９ｂｐのβカゼイン遺伝子の第１の非コードエキソンとを含む。
【００７５】
ｈＧＨ遺伝子フラグメントを、プライマーとして以下のオリゴ：
ＰＢ４ ５’ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＣ（配列番号３）および
ＧＨＴＥ ５’ＡＴＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＣＴ（配列番号４）
を使用して、元のウシゲノムｈＧＨクローンでのＰＣＲ技術によって得た。βカゼインプロモーターフラグメントを、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、ｐＶＥＸのＢａｍＨＩ充填部位（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ ｓｉｔｅ）に挿入した。組換えクローンを選択した後、本発明者らは、ｐＶＥＸで下流に位置する固有のＨｉｎｄＩＩＩ部位をｈＧＨコード領域に挿入するために使用するのに適切な特定の方向を選択する。
【００７６】
この目的のために、ｈＧＨフラグメントもまた平滑末端化し、プラスミドＨｉｎｄＩＩＩ部位を同様に満たした。βカゼインプロモーターと、このプロモーターの制御下でのみｈＧＨを発現するように適切に融合されたｈＧＨとを含むクローンを選択した。
【００７７】
このプラスミドのサイズは約８．５ｋｂｐである。
【００７８】
（体細胞のトランスフェクション）
次いで、プラスミドｐＲβｈＧＨ（ジェネティシン耐性遺伝子を含む別のプラスミドを伴う）、ｐＲＮｅｏ、ｐＲＮｅｏＧｒｅｅｎまたはｐＶＥβｃａｓｈＧＨを、リン酸カルシウム法またはリポソーム法を用いて体細胞の初期培養物をトランスフェクションするために使用した。概して、ウシ胎仔線維芽細胞を使用してトランスフェクトした。
【００７９】
トランスフェクトされた細胞を、培養物にジェネティシンを添加して選択した。２週間〜８週間の期間の後、ジェネティシンに耐性であった細胞は、ドナー細胞としてトランスジェニッククローンを得るのに適切であった。トランスフェクトされ、選択された細胞が発現カセットを含むことをＰＣＲによって分析して、トランスジェニック胚を産生するための適切な核移植を保証した。
【００８０】
（実施例２）
（卵母細胞の除核および除核された成熟卵母細胞における中期核移植）
（ウシ卵母細胞の収集およびインビトロ成熟）
ウシ卵母細胞を食肉処理場の卵巣から吸引し、ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ中、３９℃で２４時間成熟させた。その成熟培地を使用前にＣＯ２で少なくとも２時間平衡化した。成熟卵母細胞を、１ｍｇ／ｍｌのウシ精巣ヒアルロニダーゼを含む温ＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で２分間ボルテックスすることによって裸にした。
【００８１】
（卵丘細胞による核移植）
（除核）
卵母細胞を、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ液圧マイクロマニピュレータ（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）およびＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡を用いて機会的に除核した。除核を、２０μｍの斜めにとがったピペットを用いて行った。卵母細胞を予め、５μｇ／ｍｌのビスベンズイミジン（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ，ＵＳＡ）色素で２０分間染色した。中期を、紫外線下での染色された染色体の可視化によって除核した。ピペットに吸引した後、中期染色体を評価した。トランスジェニック体細胞を卵黄周囲腔に移植し、除核された卵母細胞としっかりと向かい合わせた。
【００８２】
（融合）
トランスジェニック体細胞および除核された卵母細胞を、融合される膜が電極と平行になるように、手動で融合チャンバーに並べた。これを、ガラス製の胚取扱い用ピペットを用いて行った。
【００８３】
（電気的手段による融合）
融合を、１回の１８０ボルト／ｃｍの電気パルス（ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ２００、ＢＴＸ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ，ＵＳＡ）を１５μ秒間用いて行い、ＢＴＸ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ−Ｇｒａｐｈｉｃ Ｐｕｌｓｅ Ａｎａｌｙｚｅｒでモニタリングした。２つの０．５ｍｍステンレススチールワイヤ電極からなる、胚をパルスするためのチャンバーを、ガラス顕微鏡スライドに０．５ｍｍ離して取り付けた。推定接合体を、融合、溶解およびフラグメント化についてモニタリングした。
【００８４】
（発生能力の評価）
接合体を受精４８時間後に卵割について評価し、７日〜９日後に桑実胚または胚盤胞への発生について評価した。
【００８５】
（実施例３）
（細胞培養および胚培養）
様々なドナー細胞、培養系および卵母細胞レシピエント処理を、手順を単純化することおよびウシクローニングプログラムにおける胚の生存率を増加させることを目的とした実験で試験した。成体の線維芽細胞をドナー細胞として使用する場合、再構築された胚について３つの培養系を使用した：ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ、Ｍｅｎｅｚｏ ＋ ５％ＦＣＳ（いずれも同時培養物としてＶＥＲＯ細胞を含む）、および同時培養物は含まないがＯ２濃度が低いＳＯＦ。ドナー細胞が遺伝的に改変された胎仔線維芽細胞および非遺伝的に改変された胎仔線維芽細胞である場合、ＳＯＦ培地もまた、再構築された胚を培養するために使用した。最後に、遺伝的に改変された胎仔線維芽細胞をドナー細胞として使用する場合、受容性の卵母細胞を予めロスコビチン（Ｒ）で試験して、減数分裂を中断させ、レシピエントの有用性を最適化した。卵母細胞を食肉処理場の卵巣から吸引し、ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ中、３９℃で２４時間成熟させた。Ｒ処理群について、卵母細胞を、成熟前にＴＣＭ １９９ ＋ ５％ＦＣＳ中の２５μＭのＲで、３９℃で２４時間インキュベートした。成熟卵母細胞を、１ｍｇ／ｍｌのウシ精巣ヒアルロニダーゼを含むＴＬ ＨＥＰＥＳ中で３分間ボルテックスすることによって裸にした。中期を評価し、卵母細胞をＵＶ光下でのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（５μｇ／ｍｌ）による可視化（６秒未満）によって除核した。Ａｕｇｕｓ雄ウシに由来する成体の線維芽細胞および４５日齢のＪｅｒｓｅｙ胎仔雌性に由来する胎仔線維芽細胞をドナー細胞として使用した。ネオマイシン耐性遺伝子を含む構築物を用いるトランスフェクションをリポソームを用いて行った。ジェネティシンで１０日間〜１５日間選択した後、Ｇ０／Ｇ１期のドナー細胞を、電気パルスによって除核された卵母細胞に融合した。３時間後、５μＭイオノマイシンを含むＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で４分間、そして２ｍＭ ６−ＤＭＡＰで３時間インキュベーションすることにより、活性化を誘導した。次いで、その卵母細胞をＴＬ−ＨＥＰＥＳで洗浄し、ＴＣＭ−１９９ ＋ ５％ＦＣＳ ＋ １０ｇ／ｌアルブミンまたはＭｅｎｅｚｏ ＋ ２％ＦＣＳ（いずれもＶＥＲＯ細胞を含む）のいずれかで、あるいはＳＯＦ培地および５％ＣＯ２ ＋ ５％Ｏ２ ＋ ９０％Ｎ２雰囲気において同時培養した。概して、２つの線維芽細胞を、１頭のレシピエントウシあたり非外科的に移植し、３０〜３５日目に妊娠を超音波検査によって決定した。卵割（４８時間）、線維芽細胞への発生（７日目〜９日目）を記録し、カイ二乗により分析した。卵割率および線維芽細胞への発生は、胚をＳＯＦで培養した場合により高かった。しかし、様々な培養条件またはドナー細胞の供給源に起因する妊娠率では、差異は観察されなかった。２４時間の減数分裂成熟の中断は、レシピエント卵母細胞の発生能力を損なわなかった。従って、ロスコビチンによる処理は、ＮＴ手順に対する卵母細胞のアベイラビリティを増大させるために使用され得る。以下の表１を参照のこと。
【００８６】
【表１】
異なる上付き文字を含む縦の欄内のパーセンテージは異なる（ｐ＜０．０５）
移植されたウシは、妊娠を正常に自然分娩まで経過させることが可能である。最終的に、外科的アプローチ（Ｃａｅｓａｒｅａ）が分娩に使用され得る。新生仔に最初の４８時間の間、Ｉｇリッチの初乳を与え、次いで、人工の食物を、のちに天然の食物（そのすべては動物起源の化合物を含まない）を使用した。
【００８７】
（実施例４）
（トランスジェニック子ウシおよび産生された組換えタンパク質に対して行った試験）
本実施例において、本発明者らは、実施例１〜３に記載される手順の結果として得られた特定のトランスジェニック子ウシ、およびそのウシによって産生された組換えタンパク質に対して行った試験の完全な記載を示す。それにもかかわらず、同一のアッセイのセットが、トランスジェニック子ウシを得るための他の方法（例えば、以下の実施例５および６に記載される方法）の結果として出生する動物に対して行われることが明らかであるはずである。
【００８８】
子ウシの白血球から精製されたＤＮＡに対して行ったＰＣＲ反応によって、ネガティブコントロールとして非トランスジェニックジャージー子ウシ由来のＤＮＡを用いて、ウシβカゼインプロモーターおよびｈＧＨコード遺伝子がトランスジェニック子ウシ細胞ゲノム中に含まれることが証明された。これらは一緒に、その動物のホモログβカゼイン遺伝子とは異なる固有のＤＮＡフラグメントとして見出され得る。
【００８９】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ自動シーケンサーを用いることによって、挿入された遺伝子配列がｈＧＨコード遺伝子に１００％対応することが確認された。その遺伝子は、イントロン、分泌シグナルおよびターミネーターを含む。本発明者らの子ウシにおいて同一のｈＧＨ遺伝子発現を制御するウシβカゼインプロモーターも配列決定した。これらすべてのエレメントは、クローンが生成された細胞を形質転換するために使用された遺伝的構築物に由来する、予期された理論配列を正確に一致する。
【００９０】
一旦、実験の遺伝的段階の正確性が分かると、本発明者らは、産生された組換えタンパク質が予期されたものであり、天然のｈＧＨとその物理的特徴および化学的特徴のすべてが一致することを証明することに移行した。
【００９１】
この目的のために、動物がその乳汁産生期にある場合、βカゼインプロモーターが乳腺においてのみ組換えタンパク質の発現を可能にするので、本発明者らは子ウシから乳汁を得なければならなかった。
【００９２】
次いで、トランスジェニック子ウシを、そのウシが１０ヶ月齢を満了するまでに乳汁を産生させるためにホルモン処置によって誘導した。そのころまでには、子ウシの体重は２４０ｋｇであった（約５３０ｌｂｓ）。
【００９３】
上記処置の第１期は、４８時間毎に（すなわち、処置を１日目に開始すると仮定して、１日目、３日目、５日目、７日目および９日目に）、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で、５回の連続適用からなる、皮下経路による、エストロゲン（安息香酸エストラジオール、Ｈｉｓｔｅｒｅｎ（登録商標）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｒｏｓｅｎｂｕｓｃｈ）およびプロゲスタゲン（酢酸メドロキシプロゲステロン、Ｐｒｏｎａｌ（登録商標）、Ａｔｏｎ）の、併用投与を包含した。
【００９４】
第２期は、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ、Ｓｉｄｕｓ）およびオキシトシン（Ｏｒａｓｔｈｉｎ（登録商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）の、皮下経路による投与からなり；１８日目〜２０日目からなる期間にわたり注入されるデキサメタゾンに関して２０ｍｇの総量（各々の日に上記全質量の３分の１）、および２１日目〜２３日目にオキシトシンの５０ＩＵの３回適用を包含した。
【００９５】
上記の情報は、表２に要約される：
【００９６】
【表２】
＊各々の日に全質量（２０ｍｇ）の約３分の１を投与した
予期されるように、処置が終了した翌日にウシは初乳の産生を開始し、次いで、徐々に産生される流体の質が乳汁に変化した。収集した流体を適切に保存し、徹底的に分析した。
【００９７】
いくつかの試験（その結果は、図１〜４に示される）を、初乳および乳汁に対して行った（簡単にするために、区別がなされるべき場合を除いて、初乳および乳汁の両方を以下「乳汁」と称する）。第一に、収集した乳汁の容量を測定した。初期乳汁生産性（最初の５回の授乳日）は、約１，６５０ｍＬ／日であった。最初の生産月の間、１日あたり２回の手動搾乳を行い、片方は午前に、もう片方は午後に行った（最終容量に対する各乳房の寄与が示され得る）；一方で、２ヶ月目以降、乳汁の産生が増加し始めるにつれて、１日あたり３回の搾乳を行った（午前、正午、および午後）。１日の容量は、最初の搾乳の３ヵ月後に１０，０００ｍＬ近くに到達するまで、ほぼ連続的な様式で増加した。このトピックに関する詳細な情報（図１Ａ）は、１日の乳汁容量 対 日付の曲線で可視化され得る（図１Ｂ）。
【００９８】
乳汁容量の測定と平行して、微生物学的アッセイをその乳汁に対して行い、その結果（図２Ａ）を、１ｍｌあたりのＣＦＵ（コロニー形成単位） 対 日付 に対応するプロットで示し、そして（図２Ｂ〜２Ｃ）に示す。
【００９９】
（ｈＧＨの）生物学的活性もまた、ＮＢ２細胞培養においてインビトロでの生物学的アッセイによって評価した（図３Ａ〜３Ｂ）。若い雌牛の乳汁において産生された組換えｈＧＨの生物学的活性が、ヒト天然ｈＧＨに対する正常値において、その方法のエラーランク内にあることが証明された。さらに、得られた乳汁をＷｅｓｔｅｒｎブロットによって研究し、そのＷｅｓｔｅｒｎブロットで無傷なｈＧＨに対応する主要なバンドを検出した。これらの生産システムにおいて予期されるように、切断された改変体および凝集体に対応するさらなる微量なバンドもまた見出した。
【０１００】
生物学的活性および１日の容量に関する情報に関して、等式１を用いてｈＧＨの１日の産生量を計算することが可能であった；ここで、ｍｈＧＨは、ミリグラム単位での１日に産生されたｈＧＨの質量であり；ＢＡは、国際単位での生物学的活性であり；ＳＡは、ｈＧＨの比活性度（３ＩＵ／ｍｇ）であり；そしてＶは、収集した乳汁の１日の容量である。このデータは、図４Ａに示される。ｈＧＨの１日の質量のプロットは、図４Ｂに示される。ｈＧＨの１日の質量と乳汁の１日の容量との間の可視的な相関を確立するために、乳汁の１日の容量もまた図４Ｂにプロットした。
【０１０１】
【数１】
この情報から観察され得るように、乳汁中のｈＧＨの１日の質量および乳汁の１日の容量は、ウシの発達につれて増加する傾向にあり（乳汁中のｈＧＨの１日の質量がより高い割合であるが）、このことは、組換えホルモンの生産性（乳汁１リットルあたりのｈＧＨのグラム数）における上昇傾向となる。この生産性が、生産物が初乳である場合、１リットルあたり約２ｇのｈＧＨ（最初の搾乳）から、第２の授乳月以降から乳汁１リットルあたり平均５ｇのｈＧＨの量になったことが認められ得る。従って、予想外に高収量のヒト成長ホルモンを、流体の質が初乳から乳汁へと変化するにつれてほぼ連続的な様式で、生産性が増大するにつれて得た。
【０１０２】
現在、１日あたり産生されるｈＧＨの質量は実際顕著であるが、そのウシがまだ完全に成長していない場合、１日あたり産生される組換えタンパク質の質量における上昇傾向が将来、最大に達するまで継続すべきであることが注意されるべきである。
【０１０３】
乳汁に対して行った試験に平行して、異なるセットのアッセイをウシの血清に対して行い、その結果を５Ａ〜５Ｃに示す。第一に、ウシの血清におけるｈＧＨの濃度の測定を行った。その結果（図５Ａ）を、乳汁中のｈＧＨの１日の質量と一緒にグラフにプロットし、両方の大きさの比較を可能にする（図５Ｂ）。
【０１０４】
（ヒトにおける）血清中のＧＨに対する参照範囲は、０．０６ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌである。ウシについて仮定上の類似の範囲を想定すると、始めを除いて、トランスジェニックウシの血清中のｈＧＨ 対 日付の全体の曲線は、上記範囲の上部限界を十分に上回ることが認められ得る。この事実にもかかわらず、ｈＧＨおよび対応するウシホルモン（ｂＧＨ）が、そのアミノ酸配列および三次元構造に関して非常に類似しており、ｈＧＨはたとえ完全に機能性でもウシでは全く活性でないことを考慮に入れなければならない。
【０１０５】
従って、その血清中の高レベルのｈＧＨに起因するウシの健康に対する潜在的な危険性を評価するために、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１、ソマトメジンＣとしてもまた公知である）の血清濃度の測定を平行して行った（図５Ａ）。成長ホルモンは、主に、肝臓で作製されるＩＧＦ−１を介してその機能を果たす。ＩＧＦ−１はインビボ細胞分割および成長ホルモンの代謝効果の多くを媒介するので、ＩＧＦ−１評価は疑われる成長ホルモン障害の間接的な評価のために価値のある診断ツールである。従って、ＩＧＦ−１は、生物が利用可能な成長ホルモンの信頼できる指標を表す。この分析の結果を、ｈＧＨに対応する結果と一緒に、図５Ｃに示し、両方の大きさの同時可視化を可能にする。
【０１０６】
さらに、ＩＧＦ−１およびｈＧＨを、コントロール群を得て、トランスジェニックウシに対応するデータとの比較を確立するために、非トランスジェニックウシの一群の血清で測定した。非トランスジェニック群およびトランスジェニックウシについての両方のタンパク質の測定の平均を、以下の表３に示す。
【０１０７】
【表３】
非トランスジェニック群におけるｈＧＨの平均血清濃度が仮定的な参照範囲内にあるが、トランスジェニックウシについての平均は上記範囲の上限を十分に上回ることは注目すべきことである。さらに、トランスジェニック動物の血清中のＩＧＦ−１の平均レベルが非トランスジェニックウシに対応するレベルよりもはっきりと高く、これが根本的な相違をなすことは疑う余地がない。
【０１０８】
従って、トランスジェニックウシの血清中の高濃度のｈＧＨ（これはヒトにおいては、 重篤な結果を伴う障害（例えば、真性糖尿病、高血圧、心血管疾患および身体器官（肝臓、脾臓、腎臓および心臓が挙げられる）の肥大の増大した危険性）を引き起こすことが公知である）はその動物を理論的には生育不能にするが、このことは、その健康および福利に対する障壁を明らかに示すものではない。その血液中に憂慮すべきほど高レベルの外来ホルモンを有するが、完全に健康であり組換えタンパク質の顕著な生産性を示すウシは、予想外かつ革新的な寄与をなす。
【０１０９】
本発明の別の革新的な局面は、ウシの血流に入る組換えｈＧＨが乳腺を刺激してより多くの乳汁を産生することである。この効果は間接的に、すなわち、ＩＧＦ−１の作用を介して達成される。この分子は、乳腺を流れる血流を増加させ、乳脂肪、タンパク質、およびラクトースの合成に重要な前駆体を提供する。従って、ＩＧＦ−１は、乳房において栄養素を血液を通して細胞へ導くように作用し、その栄養素は乳汁の産生を補助する。従って、トランスジェニックウシの乳汁で産生された組換えｈＧＨが、その乳汁における対応するｈＧＨのより多くの分泌を伴って、その乳腺の刺激を通じてその動物によって産生される乳汁の容量の持続的増加を促進するので、自己刺激する動物が獲得される。
【０１１０】
（実施例５）
（サブクローニングによってトランスジェニック子ウシを得ること）
トランスジェニック子ウシの耳由来の５つの組織サンプルを、１．５ｍｍ直径の針（その針の先端はこの目的のために予め斜めにしていた）を使用して取得した。そのサンプルを、抗生物質および抗真菌剤を含むＰＢＳベースの培地中、冷凍下で研究室に送った。
【０１１１】
その後、その組織サンプルを、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＭＥＭ培地中、３９℃および５％ＣＯ２雰囲気で７２時間インキュベートした。最終的に、組織サンプルを取り出し、プレートの周辺における線維芽細胞をコンフルエンスまで増殖させた。一旦これを達成すると、その線維芽細胞を、Ｇ０期における同調化を達成するために培養培地を変えることなく少なくとも５日間インキュベートし、このＧ０期における同調化を顕微鏡による可視化によって評価した。
【０１１２】
トリプシン処理後、個々の線維芽細胞を、実施例２に従って除核されたウシ卵母細胞と融合し、それによって得られた胚を、ＳＯＦ培地および５％ＣＯ２ ＋ ５％Ｏ２ ＋ ９０％Ｎ２雰囲気で、胚盤胞の段階まで培養した。その後、１頭のレシピエントウシあたりおおむね２つの線維芽細胞を非外科的に移植し、妊娠を超音波検査によって３０日〜３５日目に決定した。
【０１１３】
移植されたウシを、自然分娩まで正常に妊娠を経過させる。最終的には、外科的アプローチ（Ｃａｅｓａｒｅａ）を分娩のために使用し得る。新生仔に、最初の４８時間の間Ｉｇリッチの初乳を与え、次いで、人工食物を、のちに天然の食物（そのすべては動物起源の化合物を含まない）を与える。
【０１１４】
図６Ａおよび６Ｂは、トランスジェニックウシのサブクローニングによって得られたトランスジェニック動物のうちの２頭に対して平行して行ったｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度の測定を示し、これらの分析の結果を、それぞれ図６Ｃおよび６Ｄに示し、各動物について両方の大きさの同時可視化を可能にする。現在、子ウシは若いので、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１の両方についての値は依然としてそれぞれの参照範囲内にあるが、これら２頭のクローンが得られたトランスジェニックウシと同一の様式で成長すると期待される。
【０１１５】
（実施例６）
（過排卵させたトランスジェニックウシの人工授精によってトランスジェニック子ウシを得ること）
トランスジェニックウシを得るための代替的なアプローチが本実施例に開示される。この方法は、ホルモン処置によってトランスジェニック雌ウシを過排卵させる工程；その雌ウシを人工授精させる工程；そのようにして産生された胚を再収集する工程；代理雌ウシへのその胚の移植工程；およびその動物の出生までの妊娠の発生工程を包含する。この手順の説明は以下に示される。
【０１１６】
（過排卵）
１日目（すなわち、手順を開始した日）の午前に、１５０μｇのプロスタグランジン（Ｄ（＋）−クロルプロステロール、Ａｒｓａｐｒｏｓｔ（登録商標）、Ａｒｓａ）を、筋肉内経路によってトランスジェニック雌ウシに投与した。その動物を、約１５％のタンパク質（１日目の前に、その動物に、同一のタンパク質含量を有する２ｋｇの飼料を与えていた）を含む１日４ｋｇの食餌に供した。８日目の午前に、プロゲステロンのＣＩＤＲ（体内薬物放出制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ））デバイスを膣内に置いた。さらに、５０ｍｇのプロゲステロンおよびエストラジオールを筋肉内経路によって投与した。動物に与えた飼料の量を、同一のタンパク質含量で６ｋｇ／日に増やした。次いで、ＦＳＨおよびＬＨ（ＰＬＵＳＥＴ（登録商標）、Ｃａｌｉｅｒ）の２回の筋肉内注射を１２日目、１３日目および１４日目に（１回は午前に、もう１回は午後に）行った。次の日（１５日目）、ＰＬＵＳＥＴ（登録商標）の２回の注射（１回は午前に、もう１回は午後に）および各々１５０μｇのプロスタグランジンの２回の注射（同一の投与レジメン）を筋肉内経路により行って処置を続けた。１６日目の午前に、ＣＩＤＲを取り外した。過排卵段階の全体にわたって投与したＰＬＵＳＥＴ（登録商標）の総量は３５０ＩＵであった。
【０１１７】
（授精）
この段階は、ドナーのジャージー雄ウシ由来の精液（これは、予め入手し、精子の生存度を維持するために凍結させていた）の３回の連続投与（１回目および２回目は、それぞれ１７日目の午前および午後、そして最後は１８日目の午前）を包含する。
【０１１８】
（胚の収集およびその胚の代理雌ウシへの移植）
２６日目の午前に、雌ウシの子宮の両方の角を１ｌのＤＡＭＰＢＳ（Ｎｕｔｒｉｃｅｌｌ（登録商標））でフラッシングすることによって、胚の収集を行った。その直後に、１頭のレシピエント雌ウシあたり２つの胚を非外科的に移植し、超音波検査によって妊娠を３０日〜３５日目に決定した。
【０１１９】
移植された雌ウシを、自然分娩まで正常に妊娠を経過させる。最終的には、外科的アプローチ（Ｃａｅｓａｒｅａ）が、分娩のために使用され得る。新生仔に、最初の４８時間の間にＩｇリッチの初乳を与え、次いで、人工の食物、天然の食物（そのすべては動物起源の化合物を含まない）を与える。
【０１２０】
生物学的な子孫の発生は、メンデルの法則に従うので、上で記載した手順の結果として生まれる動物の半数はトランスジェニックであるはずであり、そしてそのうち半数が雄性であり、他方の半数が雌性であるはずである。従って、トランスジェニックの雄性（創始動物（ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ））を得る確率が高く、その精液は、トランスジェニック群を拡大するために、過排卵されたトランスジェニック／非トランスジェニック雌ウシの授精のために使用されるジャージートランスジェニック精液のマスターバンク（Ｍａｓｔｅｒ Ｂａｎｋ）を確立するのに有用であり得る。
【０１２１】
（実施例７）
（乳汁からの組換えｈＧＨの精製）
一旦おおよその分子量、ウエスタンブロットの結果および子ウシの乳汁で産生された組換えｈＧＨの生物学的活性が妥当であることを確認すると、徹底的な精製プロセスを行った。なぜなら、生物薬学的生成物を製造する場合、上記生成物中に起こり得る混入物の存在を回避するために、目的のタンパク質を精製して均一にすべきであることが不可欠であるからである。このプロセスは、以下の工程を包含する：遠心分離によって乳汁の皮膜を得、得られた上清を希釈して、最終的にカゼインのミセル中に保持される組換えｈＧＨのより良好な可溶性を達成する（清澄）工程；およびこの溶液を流動層によるアニオン交換クロマトグラフィーカラムを通過させる工程（この工程に対する代替はイムノアフィニティーカラムの使用である、以下の実施例８を参照のこと）；得られる溶液を逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）工程に供する（ｓｕｂｄｕｅ）工程；その後、組換えｈＧＨが多い画分をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程。
【０１２２】
精製した物質を脱塩し、濃縮し、そして分子排除クロマトグラフィーに供する。これを、純粋な組換えｈＧＨを得るために分子量で分ける。
【０１２３】
乳汁由来のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製のための手順は、順に以下の工程を包含する：（ａ）清澄、（ｂ）流動層によるアニオン交換クロマトグラフィー、（ｃ）逆相クロマトグラフィー、（ｄ）アニオン交換クロマトグラフィー、（ｅ）分子排除クロマトグラフィー（脱塩）、（ｆ）濃縮および（ｇ）分子排除クロマトグラフィー。
【０１２４】
（清澄）
新鮮な乳汁を、０．５％溶液を得るために、十分量のＴｗｅｅｎ ８０と混合した。Ｔｗｅｅｎ ８０の添加後、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを添加して７．３±０．１のｐＨを得た。その後、生成物を３０分間ホモジナイズし、次いで、脂肪層を分離させるために１４０００ｇで遠心分離した。その後、得られた溶液を、１５００μＳ／ｃｍ以下の伝導率まで０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０で希釈した。ｐＨを、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで７．３±０．１に調整し、次いで、生成物を０．８μｍ孔径の膜で濾過し、都合よく保管した。
【０１２５】
（流動層によるアニオン交換クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、以下のパラメーターに従って、アニオン交換マトリックスを用いてクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：３０ｃｍ（コンパクト層）
３）マトリックス：
ａ．Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ Ｑ ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
ｂ．容量：６００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．５Ｎ ＮａＯＨ
Ｂ．２０％エタノール
Ｃ．緩衝液Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．３
Ｄ．緩衝液Ｂ：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．３
Ｅ．緩衝液Ｃ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３
Ｆ．緩衝液Ｄ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．清澄した乳汁
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：２５±５ｌ
２）伝導率：≦１５００μＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．３±０．１ 。
【０１２６】
カラムを平衡化するために、その１．５カラム容量（「ｖｃ」）（９００ｍＬ）の純水を、１１５±５ｃｍ／時間の流量で通過させた（下向きの流れ）。その後、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、２３０±３０ｃｍ／時間の流量で連続的に通過させた（上向きの流れ）：３．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；３．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の緩衝液Ｂ；そして最後に、３．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の緩衝液Ａ。
【０１２７】
一旦カラムを平衡化したら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、１２±３℃、２３０±３０ｃｍ／時間の流量で行った。その後、溶出を１１５±１５ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行った。第一に、十分量の緩衝液Ａをカラムに通過させ（上向きの流れ）、第二に、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた（下向きの流れ）：１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の緩衝液Ａ；２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の緩衝液Ｄ。
【０１２８】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で連続的にカラムを通過させた：１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の純水；１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の緩衝液Ｂ；１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の純水；そして最後に、１．５ｖｃ（９００ｍｌ）の２０％エタノール。
【０１２９】
選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）、そして目的のタンパク質について（ＲＩＡにより）アッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１３０】
（逆相クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、以下のパラメーターに従ってクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：４ｃｍ
２）層の高さ：４８ｃｍ
３）マトリックス
ａ．ＢａｋｅｒＢｏｎｄ Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ Ｂｕｔｙｌ（Ｃ４）１５μｍ ｐｒｅｐ ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇ（Ｂａｋｅｒ）
ｂ．容量：６００ｍｌ
２．溶液および緩衝液
Ａ．可動相１（ＭＰ１）：３０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．２）：純水：アセトニトリル（３５：５５：１０）
Ｂ．可動相２（ＭＰ２）：３０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．２）：純水：アセトニトリル（２０：１０：７０）
Ｃ．５０％メタノール
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から得られる、選択した画分のプール
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：３０±１５ｌ
２）ｐＨ：７．３±０．３ 。
【０１３１】
カラムを平衡化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、４７８ｃｍ／時間以下の流量で連続的に通過させた：０．３ｖｃ（１８０ｍｌ）の５０％メタノール；その後、５０％メタノール−ＭＰ２の勾配を、上記溶液の１００：０の割合から始めて、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで適用した；一旦勾配が終了したら、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）のＭＰ２をそのカラムに通過させた；その後、ＭＰ２−ＭＰ１の勾配を、上記溶液の１００：０の割合から始めて、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで適用した；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）のＭＰ１をそのカラムに通過させた。
【０１３２】
一旦カラムを平衡化させたら、クロマトグラフされる物質を０．４５μｍ孔径の膜で濾過し、直後に充填した。この充填を、２０±５℃、２３８ｃｍ／時間以下の流量で行った。その後、溶出を、４７８±７８ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行い、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた：１．０ｖｃ（６００ｍｌ）のＭＰ１；ＭＰ１−ＭＰ２の勾配、上記溶液の６５：３５から始めて、１８．０ｖｃ（９，０００ｍｌ）の総容量において上記溶液の４５：５５の割合が達成されるまで；４５：５５の割合で１．０ｖｃ（６００ｍｌ）のＭＰ１−ＭＰ２；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）のＭＰ２。
【０１３３】
一旦この工程が終了したら、そのカラムを洗浄するために、ＭＰ２−５０％メタノールの勾配を、上記溶液の１００：０の割合から始めて、１．０ｖｃ（６００ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで適用した；そして最後に、２．０ｖｃ（１，２００ｍｌ）の５０％メタノールをそのカラムに通過させた。
【０１３４】
このクロマトグラフィーから得られる画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２０％均質であること、および酸化型ｈＧＨについてアッセイし、その結果に依存して、選択を行った。その後、選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質について（ＢｒａｄＦｏｒｄ法によって）アッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１３５】
（アニオン交換クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、アニオン交換マトリックスを用いて、以下のとおりにクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：２５ｃｍ
３）マトリックス
ａ．Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ．容量：５００ｍｌ
２．溶液および緩衝液
Ａ．２０％エタノール
Ｂ．溶液Ｋ：０．５Ｎ ＮａＯＨ、３Ｍ ＮａＣｌ
Ｃ．溶液Ｌ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５０
Ｄ．溶液Ｍ：０．１Ｎ ＨＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ
Ｅ．可動相３（ＭＰ３）：溶液Ｌ：アセトニトリル（７０：３０）
Ｆ．可動相４（ＭＰ４）：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５０）：アセトニトリル（７０：３０）
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から得られる、選択した画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：４．５±１ｌ
２）ｐＨ：７．２±０．２ 。
【０１３６】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、１８３±２０ｃｍ／時間以下の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｋ；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｌ；そして最後に、１．０ｖｃ（５００ｍｌ）のＭＰ３。
【０１３７】
一旦カラムを平衡化したら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、２０±５℃、１８３ｃｍ／時間以下の流量で行った。その後、溶出を、１８３±２０ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行い、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた：１．０ｖｃ（５００ｍｌ）のＭＰ３、ＭＰ３−ＭＰ４の勾配、上記溶液の１５：８５の割合から始めて、５．０ｖｃ（２５００ｍｌ）の総容量において上記溶液の２５：７５の割合が達成されるまで；そして最後に、２．０ｖｃ（１０００ｍｌ）のＭＰ４をカラムに通過させた。
【０１３８】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量でカラムに連続的に通過させた：ＭＰ４−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；純水−溶液Ｋの勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｋ；溶液Ｋ−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；純水−溶液Ｍの勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の溶液Ｍ；溶液Ｍ−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の純水；純水−溶液Ｌの勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の溶液Ｌ；溶液Ｌ−純水の勾配、上記溶液の１００：０の割合から始めて、０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の総容量において上記溶液の０：１００の割合が達成されるまで；そして最後に、１．５ｖｃ（７５０ｍｌ）の純水。
【０１３９】
選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）アッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１４０】
（分子排除クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を分子排除マトリックスを用いて、以下のとおりにクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：２５ｃｍ
３）マトリックス
ａ．Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＧＨ２５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
ｂ．容量：５００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．５Ｎ ＮａＯＨ
Ｂ．２０％エタノール
Ｃ．緩衝液Ｃ：１５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２
Ｄ．緩衝液Ｇ：３２０ｍＭ グリシン、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．９
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から得られる、選択した画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：０．５±０．２ｌ
２）ｐＨ：７．５±０．５ 。
【０１４１】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、１８０ｃｍ／時間以下の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、２．０ｖｃ（１０００ｍｌ）の緩衝液Ｇ。
【０１４２】
一旦カラムを平衡化したら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、２０±５℃、１８３±２０ｃｍ／時間の流量で行った。その後、溶出を同じ流速および同じ温度で行い、１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の緩衝液Ｇを実行に必要な回数だけカラムに通過させた。
【０１４３】
一旦この工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量でカラムに通過させた：０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（５００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の緩衝液Ｃ；０．５ｖｃ（２５０ｍｌ）の純水；そして最後に、１．５ｖｃ（７５０ｍｌ）の２０％エタノール。
【０１４４】
選択したｈＧＨを含む画分を、全タンパク質についてアッセイし、２〜８℃で保管した。
【０１４５】
（濃縮）
上記実施例から得られる画分を、以下に記載する条件に従って濃縮した：
１．機器：
Ａ．蠕動ポンプ：Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ − カタログ番号３０２Ｓ
Ｂ．チュービング：Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ − カタログ番号９０２．００８０．０１６
Ｃ．濃縮機：Ｐｒｅｐ Ｓｃａｌｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ − カタログ番号ＣＤＵ Ｆ００６ＬＣ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．２８％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
Ｂ．０．０６％トリトン
Ｃ．０．１２５Ｎ ＮａＯＨ
Ｄ．緩衝液Ｇ：３２０ｍＭグリシン、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．９
３．処理される物質
Ａ．上記実施例から得られる、選択した画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：１．０±０．５ｌ
２）伝導率：１２００±１００μＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：６．９±０．１ 。
【０１４６】
まず、機器を洗浄、衛生化および平衡化し、以下の順序の溶液および緩衝液をその機器に流した：２ｌの０．１２５Ｎ ＮａＯＨ；１０ｌの純水；そして最後に、２ｌの緩衝液Ｇ。次いで、その機器を、通常の方法論に従って、選択した画分における濃縮に使用できるようにした。濃縮手順を、１５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により評価）が達成されるまで行った。
【０１４７】
選択した画分を０．２２μｍ孔径の膜で濾過し、全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）アッセイし、４℃で保管した。
【０１４８】
選択した画分の伝導率およびｐＨは、それぞれ、１，１００μＳ／ｃｍ〜１，３００μＳ／ｃｍおよび６．９±０．１であった。
【０１４９】
（分子排除クロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、分子排除マトリックスを用いて、以下のとおりにクロマトグラフする：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：５ｃｍ
２）層の高さ：９２ｃｍ
３）マトリックス
ａ，Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｂ．容量：１，８００ｍｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．０．５Ｎ ＮａＯＨ
Ｂ．２０％エタノール
Ｃ．緩衝液Ｈ：３２０ｍＭグリシン、２．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．３０
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．上記工程から選択され、濃縮された画分
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：４０±２０ｍｌ
２）伝導率：１，２００±１００μＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．３±０．１ 。
【０１５０】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、４６ｃｍ／時間未満の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の純水；１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の０．５Ｎ ＮａＯＨ；そして最後に、２．０ｖｃ（３，６００ｍｌ）の緩衝液Ｈ。
【０１５１】
一旦カラムを平衡化させたら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、２０±５℃、４６±１５ｃｍ／時間の流量で行った。その後、溶出を、同じ流速および同じ温度で行い、１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の緩衝液Ｈを、実行に必要な回数だけ通過させた。
【０１５２】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（１，８００ｍｌ）の純水；そして１．５ｖｃ（２，７００ｍｌ）の２０％エタノール。
【０１５３】
純粋なｈＧＨを含む画分を、０．２２μｍ孔径の膜で、滅菌した脱発熱性のプラスチックボトルに無菌的に濾過し、全タンパク質についてアッセイし、−２０℃で保管した。
【０１５４】
（実施例８）
（乳汁からのｈＧＨの精製についての代替的手順）
先に記載した精製方法の代わりに、乳汁中に含まれる組換えｈＧＨを精製するために、代替的スキームが使用され得る。実施例７に記載した手順と本実施例で示される代替的手順との間の主な相違は、前者の第２工程が流動層によるアニオン交換クロマトグラフィーを包含する一方で、後者の対応する工程がイムノアフィニティークロマトグラフィーを伴うことである。両方の手順の清澄工程もまた、わずかに異なる。両方の精製スキームの残りは同一なので、代替的手順の最初の２つの工程のみを以下に記載する。
【０１５５】
（清澄）
新鮮な乳汁を、０．５％溶液を得るために十分量のＴｗｅｅｎ ８０と混合した。Ｔｗｅｅｎ ８０の添加後、１Ｍ Ｔｒｉｓを添加して、７．３±０．３のｐＨを得た。その後、生成物を３０分間ホモジナイズし、次いで、脂肪層を分離させるために１４０００ｇで遠心分離した。その後、得られる溶液を緩衝液Ｓ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ７．３）で２０倍に希釈し、次いで、０．４５μｍ孔径の膜で濾過し、都合よく保管した。
【０１５６】
（イムノアフィニティークロマトグラフィー）
上記工程から得られる物質を、以下のパラメーターに従って、イムノアフィニティー相互作用マトリックス（抗ＧＨモノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｓｉｄｕｓ製）に共有結合したＡｆｆｉｇｅｌ １０ Ｅｓｔｅｒ Ａｇａｒｏｓｅ、ＢｉｏＲａｄ製）を用いてクロマトグラフした：
１．機器：
Ａ．カラム：
１）直径：３０ｃｍ
２）層の高さ：１５ｃｍ
３）マトリックス：
ａ．抗ＧＨモノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｓｉｄｕｓ）に共有結合したＡｆｆｉｇｅｌ １０ Ｅｓｔｅｒ Ａｇａｒｏｓｅ（ＢｉｏＲａｄ）
ｂ．容量：１０ｌ
２．溶液および緩衝液：
Ａ．緩衝液Ａ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２
Ｂ．緩衝液Ｂ：１００ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．０
Ｃ．緩衝液Ｃ：１５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２
Ｄ．緩衝液Ｄ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭグアニジン．ＨＣｌ、ｐＨ７．２
Ｅ．緩衝液Ｅ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、０．２％アジ化ナトリウム、０．１ｇ／ｌゲンタミシン
３．クロマトグラフされる物質
Ａ．清澄された乳汁
Ｂ．サンプル条件：
１）容量：３０〜５０ｌ
２）伝導率：４５±１５ｍＳ／ｃｍ
３）ｐＨ：７．３±０．３ 。
【０１５７】
カラムを平衡化かつ衛生化するために、カラムが最近７日間で使用されていない場合には、以下の溶液または緩衝液を以下に詳述する量で、５１ｃｍ／時間の流量で連続的に通過させた：１．０カラム容量（「ｖｃ」）（１０ｌ）の緩衝液Ａ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｄ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ；１．０ｖｃ（１０ｌ）の緩衝液Ｂ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、１．０ｖｃ（１０ｌ）の緩衝液Ａ。
【０１５８】
一方で、カラムが最近７日間で使用されている場合には、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で５１ｃｍ／時間未満の流量で連続的に通過させた：１．０ｖｃ（１０ｌ）の緩衝液Ｃ；そして最後に、２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ。
【０１５９】
一旦カラムを平衡化させたら、クロマトグラフされる物質を充填した。この充填を、５±３℃、５１ｃｍ／時間未満の流量で行った。その後、溶出を、４２±９ｃｍ／時間の流量で、同じ温度で行い、以下に詳述する溶液および緩衝液を以下の順で通過させた：２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ；そして１．５ｖｃ（１５ｌ）の緩衝液Ｂ。
【０１６０】
一旦その工程が終了したら、カラムを洗浄するために、以下の溶液または緩衝液を、以下に詳述する量で連続的に通過させた：２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｄ；２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ａ；そして最後に、２．０ｖｃ（２０ｌ）の緩衝液Ｅ。
【０１６１】
選択したｈＧＨを含む画分を全タンパク質について（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により）および目的のタンパク質について（ＲＩＡにより）アッセイし、４℃で保管した。
【０１６２】
（実施例９）
（純粋な組換えｈＧＨの品質管理）
純粋な組換えｈＧＨの２つのバッチを、一連のアッセイに供して、その生成物が天然のｈＧＨと区別できないことを確認した。そのような手順としては、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、インビトロ（細胞ｎｂ２）およびインビボ（下垂体切除ラット）での生物学的活性、ペプチドマッピング、完全なアミノ酸配列の決定、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ならびに逆相ＨＰＬＣ分析およびサイズ排除ＨＰＬＣ分析が挙げられるが、これらに限定されない。これらすべてのアッセイで得られた結果は、組換えｈＧＨおよび天然のｈＧＨの両方について全く同じであり、これは、純粋な組換えｈＧＨが天然のｈＧＨと正確に一致し、それゆえ生物薬学的生成物を製造するのに適切であることを証明する。
【０１６３】
ここで本発明を完全に記載して、本発明にもそのいかなる実施形態の範囲にも影響を与えることなく、条件、処方および他のパラメーターの広範かつ等価な範囲内で同じことが行われ得ることが、当業者によって理解される。本明細書中に引用されるすべての特許および刊行物は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、トランスジェニックウシから収集された１日の乳汁容量を示し、このトランスジェニックウシは、除核された卵母細胞と、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする遺伝子および乳腺細胞にその発現を誘導するプロモーターを含むプラスミドで予めトランスフェクトされた線維芽細胞との融合によって得られた。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、同じトランスジェニックウシから収集された乳汁中に見出された細菌数を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、同じトランスジェニックウシの乳汁中に含まれるｈＧＨの生物学的活性を示す。
【図４】図４Ａは、同じトランスジェニックウシの乳汁中に産生されたｈＧＨの１日の質量を示す。この大きさおよびそのトランスジェニックウシから収集された１日の乳汁容量が一緒に図４Ｂにプロットされる。
【図５】図５Ａは、同じトランスジェニックウシの血清中のｈＧＨおよびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の濃度、および同じトランスジェニックウシ乳汁中に産生されたｈＧＨの１日の質量を示す。そのトランスジェニックウシの血清中のｈＧＨの濃度およびそのトランスジェニックウシの乳汁中に産生されたｈＧＨの１日の質量が、一緒に図５Ｂにプロットされる。図５Ｃには、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１のトランスジェニックウシの血清濃度に関する時間プロフィールが一緒にプロットされる。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ウシ（その乳汁におけるｈＧＨの産生のためのトランスジェニックである）のサブクローニングによって得られた２頭のトランスジェニック子ウシにおけるｈＧＨおよびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の血清濃度を示す。図６Ｃおよび図６Ｄには、これらのトランスジェニック子ウシの各々について、ｈＧＨおよびＩＧＦ−１の血清濃度に関する時間プロフィールが一緒にプロットされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を産生する方法であって、以下：
ａ）その乳汁中に目的のタンパク質を産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程；
ｂ）該非ヒトトランスジェニック哺乳動物から該乳汁を得る工程；および
ｃ）該乳汁から該目的のタンパク質を精製する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）目的のタンパク質をコードする遺伝子を得る工程；
ｂ）該遺伝子をプラスミドにクローニングし、それによって、該遺伝子が、乳腺細胞において該遺伝子の発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結され、発現プラスミドを得る工程；
ｃ）該発現プラスミドが体細胞のゲノムに組み込まれるように、該体細胞を該発現プラスミドでトランスフェクトし、トランスジェニック体細胞を得る工程；
ｄ）成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程；
ｅ）該トランスジェニック体細胞の１つを該除核された卵母細胞と融合し、単細胞胚を得る工程；
ｆ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｇ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターがβカゼインプロモーターであり、前記目的のタンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現プラスミドがｐＲβｈＧＨである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現プラスミドがネオマイシン耐性遺伝子をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発現プラスミドがｐＲＮｅｏである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、その乳汁中に組換えヒト成長ホルモンを産生するウシであり、そのゲノムは統合されたプラスミドを含み、該プラスミドは、該ヒト成長ホルモンの遺伝子と、該哺乳動物の乳腺細胞において該遺伝子の発現を誘導するβカゼインプロモーターとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミドがｐＲβｈＧＨである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ブラスミドがネオマイシン耐性遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プラスミドがｐＲＮｅｏである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニック体細胞が、その乳汁中に前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性からの単離によって得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスジェニック体細胞が線維芽細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程であって、該雌性は、その乳汁中に前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｂ）該哺乳動物を、雄性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物から得られる精液と人工授精させて、胚を産生させる工程；
ｃ）該胚を収集する工程；
ｄ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｅ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程であって、該雌性は、その乳汁中に前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｂ）該哺乳動物を、雄性の非ヒト哺乳動物から得られる精液と人工授精させて胚を産生させる工程であって、該雄性の非ヒト哺乳動物は、該目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｃ）該胚を収集する工程；
ｄ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｅ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）雌性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物を過排卵させる工程；
ｂ）該哺乳動物を、雄性の非ヒト哺乳動物から得られる精液と人工授精させて胚を産生させる工程であって、該雄性の非ヒト哺乳動物は、前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｃ）該胚を収集する工程；
ｄ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｅ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、ウシ種、ブタ種、ヒツジ種、ヤギ種または齧歯動物種の哺乳動物である、請求項２、１２、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物がウシ種の哺乳動物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記目的のタンパク質が哺乳類成長ホルモンである、請求項２、１２、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳類成長ホルモンが、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒツジ成長ホルモン、ヤギ成長ホルモンまたは齧歯動物成長ホルモンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳類成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約３．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約４．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約５．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約６．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物による前記哺乳類成長ホルモンの産生が、該哺乳類成長ホルモンを含む乳汁をより多く産生するように該哺乳動物を刺激する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記目的のタンパク質をコードする遺伝子（乳腺細胞において該遺伝子の発現を誘導するプロモーターに連結される）が、前記哺乳動物の体細胞および生殖細胞に見出される、請求項２、１２、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法であって、以下：
ａ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の該乳汁を清澄して、清澄された乳汁を得る工程；および
ｂ）該清澄された乳汁をクロマトグラフィーに供して、精製された組換え成長ホルモンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
複数のクロマトグラフィー工程が行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記アフィニティークロマトグラフィーがイムノクロマトグラフィーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
濃縮工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法であって、以下：
ａ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の該乳汁を清澄して、清澄された乳汁を得る工程；
ｂ）該清澄された乳汁を流動層によるアニオン交換クロマトグラフィーに供して、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｃ）該アニオン交換クロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供して、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｄ）該逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供して、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｅ）該アニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｆ）該分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮し、濃縮された物質を得る工程；および
ｇ）該濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法であって、以下：
ａ）トランスジェニック哺乳動物から得られた乳汁を清澄して、清澄された乳汁を得る工程；
ｂ）該清澄された乳汁をイムノアフィニティークロマトグラフィーに供して、イムノアフィニティークロマトグラフされた物質を得る工程；
ｃ）該イムノアフィニティークロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供して、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｄ）該逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供して、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｅ）該アニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｆ）該分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮に供して、濃縮された物質を得る工程；および
ｇ）該濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記成長ホルモンが哺乳類成長ホルモンである、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類成長ホルモンが、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒツジ成長ホルモン、ヤギ成長ホルモンまたは齧歯動物成長ホルモンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳類成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約３．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約４．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約５．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約６．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、ウシ種の哺乳動物である、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、ブタ、ヒツジ、ヤギまたは齧歯動物である、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
タンパク質を産生する方法であって、以下：
ａ）その乳汁中に目的のタンパク質を産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程；
ｂ）該非ヒトトランスジェニック哺乳動物から該乳汁を得る工程；および
ｃ）該乳汁から該目的のタンパク質を精製する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）目的のタンパク質をコードする遺伝子を得る工程；
ｂ）該遺伝子をプラスミドにクローニングし、それによって、該遺伝子が、乳腺細胞において該遺伝子の発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結され、発現プラスミドを得る工程；
ｃ）該発現プラスミドが体細胞のゲノムに組み込まれるように、該体細胞を該発現プラスミドでトランスフェクトし、トランスジェニック体細胞を得る工程；
ｄ）成熟卵母細胞を除核し、除核された卵母細胞を得る工程；
ｅ）該トランスジェニック体細胞の１つを該除核された卵母細胞と融合し、単細胞胚を得る工程；
ｆ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｇ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターがβカゼインプロモーターであり、前記目的のタンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現プラスミドがｐＲβｈＧＨである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現プラスミドがネオマイシン耐性遺伝子をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発現プラスミドがｐＲＮｅｏである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、その乳汁中に組換えヒト成長ホルモンを産生するウシであり、そのゲノムは統合されたプラスミドを含み、該プラスミドは、該ヒト成長ホルモンの遺伝子と、該哺乳動物の乳腺細胞において該遺伝子の発現を誘導するβカゼインプロモーターとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミドがｐＲβｈＧＨである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ブラスミドがネオマイシン耐性遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プラスミドがｐＲＮｅｏである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニック体細胞が、その乳汁中に前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである雌性からの単離によって得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスジェニック体細胞が線維芽細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程であって、該雌性は、その乳汁中に前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｂ）該哺乳動物を、雄性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物から得られる精液と人工授精させて、胚を産生させる工程；
ｃ）該胚を収集する工程；
ｄ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｅ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）雌性の非ヒト哺乳動物を過排卵させる工程であって、該雌性は、その乳汁中に前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｂ）該哺乳動物を、雄性の非ヒト哺乳動物から得られる精液と人工授精させて胚を産生させる工程であって、該雄性の非ヒト哺乳動物は、該目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｃ）該胚を収集する工程；
ｄ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｅ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、以下：
ａ）雌性の非ヒトかつ非トランスジェニックの哺乳動物を過排卵させる工程；
ｂ）該哺乳動物を、雄性の非ヒト哺乳動物から得られる精液と人工授精させて胚を産生させる工程であって、該雄性の非ヒト哺乳動物は、前記目的のタンパク質を産生するためのトランスジェニックである、工程；
ｃ）該胚を収集する工程；
ｄ）該胚を受容性の哺乳動物の子宮に移植する工程；および
ｅ）該トランスジェニック哺乳動物の出生を通じて妊娠をモニタリングする工程
を包含するプロセスによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、ウシ種、ブタ種、ヒツジ種、ヤギ種または齧歯動物種の哺乳動物である、請求項２、１２、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物がウシ種の哺乳動物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記目的のタンパク質が哺乳類成長ホルモンである、請求項２、１２、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳類成長ホルモンが、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒツジ成長ホルモン、ヤギ成長ホルモンまたは齧歯動物成長ホルモンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳類成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約３．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約４．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約５．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約６．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物による前記哺乳類成長ホルモンの産生が、該哺乳類成長ホルモンを含む乳汁をより多く産生するように該哺乳動物を刺激する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記目的のタンパク質をコードする遺伝子（乳腺細胞において該遺伝子の発現を誘導するプロモーターに連結される）が、前記哺乳動物の体細胞および生殖細胞に見出される、請求項２、１２、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法であって、以下：
ａ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の該乳汁を清澄して、清澄された乳汁を得る工程；および
ｂ）該清澄された乳汁をクロマトグラフィーに供して、精製された組換え成長ホルモンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
複数のクロマトグラフィー工程が行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記アフィニティークロマトグラフィーがイムノクロマトグラフィーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
濃縮工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法であって、以下：
ａ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の該乳汁を清澄して、清澄された乳汁を得る工程；
ｂ）該清澄された乳汁を流動層によるアニオン交換クロマトグラフィーに供して、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｃ）該アニオン交換クロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供して、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｄ）該逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供して、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｅ）該アニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｆ）該分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮し、濃縮された物質を得る工程；および
ｇ）該濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
組換え成長ホルモンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁から組換え成長ホルモンを精製する方法であって、以下：
ａ）トランスジェニック哺乳動物から得られた乳汁を清澄して、清澄された乳汁を得る工程；
ｂ）該清澄された乳汁をイムノアフィニティークロマトグラフィーに供して、イムノアフィニティークロマトグラフされた物質を得る工程；
ｃ）該イムノアフィニティークロマトグラフされた物質を逆相クロマトグラフィーに供して、逆相クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｄ）該逆相クロマトグラフされた物質をアニオン交換クロマトグラフィーに供して、アニオン交換クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｅ）該アニオン交換クロマトグラフされた物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、分子排除クロマトグラフされた物質を得る工程；
ｆ）該分子排除クロマトグラフされた物質を濃縮に供して、濃縮された物質を得る工程；および
ｇ）該濃縮された物質を分子排除クロマトグラフィーに供して、純粋な組換え成長ホルモンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記成長ホルモンが哺乳類成長ホルモンである、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類成長ホルモンが、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒツジ成長ホルモン、ヤギ成長ホルモンまたは齧歯動物成長ホルモンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳類成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約１．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約２．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約３．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約４．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約５．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物が、乳汁１Ｌあたり約６．０ｇ ｈＧＨよりも高いレベルでヒト成長ホルモンを産生する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、ウシ種の哺乳動物である、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、ブタ、ヒツジ、ヤギまたは齧歯動物である、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５０７５１０（Ｐ２００７−５０７５１０Ａ）
【公表日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３４０２２（Ｐ２００６−５３４０２２）
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１８１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３２７４
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【出願人】（５０１１７７３２２）スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１８１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３２７４
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【出願人】（５０１１７７３２２）スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]