ナンセンス変異を起因とする遺伝子発現抑制による脂肪酸組成改変技術
【課題】
植物細胞のα-リノレン酸含量をより簡易で効率的に低減させる方法を提供すること。
【解決手段】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、植物細胞内で発現させることにより植物細胞内のα-リノレン酸含量を低減させる方法とする。また、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が挿入されており、かつ該変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現している植物とする。
植物細胞のα-リノレン酸含量をより簡易で効率的に低減させる方法を提供すること。
【解決手段】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、植物細胞内で発現させることにより植物細胞内のα-リノレン酸含量を低減させる方法とする。また、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が挿入されており、かつ該変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現している植物とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナンセンス変異が導入された変異遺伝子、その変異遺伝子が挿入された植物、及び、その変異遺伝子の発現により植物の脂肪酸の組成を改変させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素は、脂質の脂肪酸側鎖であるリノール酸をα−リノレン酸に不飽和化する酵素である。植物脂質は食用油として重要でありその脂肪酸組成の改変は産業上大変重要である。またα−リノレン酸含量が変化した形質転換植物が作出され、その中でも特にα−リノレン酸含量が低下した植物では、高温環境下での耐性能力が向上していることが報告されている（例えば下記非特許文献１参照）。
【０００３】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を低減させる方法としては、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現プロモーターに接続して植物細胞に導入し、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現させることでコサプレッションと呼ばれる遺伝子発現抑制現象を誘導し、α−リノレン酸含量を低減させる方法がある(例えば下記非特許文献２参照)。
【０００４】
また、ヘアピンＲＮＡと呼ばれる２本鎖ＲＮＡを転写させることによる発現抑制（一般にＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉと呼ばれる）によっても、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を抑制することができる。ＲＮＡｉを用いる方法では、器官特異性を示さないプロモーター配列をヘアピンＲＮＡの転写に用いれば、植物体全体で目的とする遺伝子の発現を抑制できる。事実ＲＮＡｉを用いた方法による小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現抑制によって葉と根でα−リノレン酸含量の低減が可能であることが示されている(これについても例えば下記非特許文献２参照)。
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、２８７巻、４７６〜４７９頁
【非特許文献２】Ｔｏｍｉｔａら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００４年、５７３巻、１１７〜１２０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、コサプレッション法では得られた遺伝子導入植物の中からコサプレッション個体が得られる頻度が低く、特に小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の場合にはその頻度がわずか１〜２％程度である。さらにコサプレッション法による小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現低下は器官特異的であり、葉ではα−リノレン酸含量の低下が生じるが、根では生じない。つまり植物細胞器官によっては全くα−リノレン酸含量を低減させることができない。
【０００７】
また、ＲＮＡｉを用いる方法ではω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の塩基配列をスペーサー配列を挟んでセンス方向とアンチセンス方向に接続したものを高発現プロモーターの下流に接続したコンストラクト（これをＲＮＡｉコンストラクトと呼ぶ）を作製する必要がある。このコンストラクトから転写されたＲＮＡはヘアピンＲＮＡとなり、ＲＮＡｉを用いる方法によるω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を抑制することができる。しかしながらＲＮＡｉコンストラクトの作製には、サブクローニングのステップが多いため多くの日数と煩雑な操作が必要とされる。また、一般にこのような同一の配列をセンス方向−アンチセンス方向につないだものをｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ配列とよぶが、大腸菌を宿主とした場合にｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ配列を持つプラスミドは安定に保持されないため、クローニングなどの遺伝子操作が困難であるという問題もある。
【０００８】
そこで本発明は、上記課題を鑑み、植物細胞のα-リノレン酸含量をより簡易で効率的に低減させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内で高発現させることで、植物細胞のα−リノレン酸含量が低減することを見出し本発明を完成させるに至った。ここで、「ナンセンス変異」とは、本来アミノ酸をコードしている塩基配列が塩基配列の変更によりストップコドンとなることで翻訳が終結する変異をいう。
【００１０】
即ち、本発明に係る植物細胞内のα−リノレン酸含有量を低減させる方法は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、植物細胞内で発現させることにより行う。なおここで「発現させる」とは、植物細胞内において遺伝子が転写されることをいう。
【００１１】
また本発明に係る植物細胞内のα−リノレン酸含有量を低減させる方法において、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内であることが望ましく、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内、更に望ましくは６１塩基以内である。
【００１２】
また、本発明に係る植物は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が挿入されており、かつ変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現しているものである。
【００１３】
また、本発明に係る植物において、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内であることが望ましく、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内、更に望ましくは６１塩基以内である。
【００１４】
また、本発明に係る変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入したものである。
【００１５】
また、本発明に係る変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内であり、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内、更に望ましくは６１塩基以内である。
【発明の効果】
【００１６】
以上、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入することにより得られる変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内において高発現させ、植物細胞のα−リノレン酸含量を低減することが可能となる。これは遺伝子発現の抑制方法として広く使われるＲＮＡｉを用いる方法と比較して、変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現コンストラクトの作製は簡易であり、また変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を持つプラスミドはＲＮＡｉコンストラクトを持つプラスミドよりも大腸菌内において安定に保持されるために、クローニングなどの遺伝子操作が容易ともなる。特に、α−リノレン酸含量が低減した植物では高温環境下での耐性能力が向上すると期待されているため、より環境に適応する能力が向上した植物を得ることができ、更には植物油の脂肪酸組成の改変に本発明を適用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
【００１８】
本実施形態ではω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入して変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とし、植物細胞内で発現させることにより植物細胞内のα-リノレン酸含量を低減させることを特徴の一つとしている。
【００１９】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する方法としては、特に限られるわけではないが、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子へ点突然変異を導入し、その点突然変異が導入された部位のコドンをストップコドンとする方法が非常に好適である。また点突然変異を導入する方法についてもこれに限られるわけではないが、化学的に合成した変異を導入しようとする塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた一般的に用いられている点突然変異導入法を用いることが好適である。
【００２０】
ナンセンス変異を導入する部位については、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンの近傍が望ましく、例えば翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内が望ましく、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内である。なお後述の実施例では翻訳開始コドンから６１塩基のところに塩基置換により同部位にストップコドンを創生した場合にα−リノレン酸含量が極めて顕著に低減していることを見出している。なお本明細書において、「翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内」とは、例えば配列表の配列番号１に記載するタバコ小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の場合、配列番号１に記載の塩基配列の２５０番目の塩基よりも前であることを指す（なお、配列番号１に記載の塩基配列の最初の塩基３つａｔｇが翻訳開始コドンである）。後述の実施例ではタバコの小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子について言及しているが、小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子自体は高等植物であればほぼ同じ長さの塩基配列を有しており、同様の効果を期待することができる。
【００２１】
変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内で発現させる方法としては、これに限定されるわけではないが、遺伝導入用のバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ内部にカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター配列やその配列に由来するＥ１２Ω配列（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９６年、３７巻、４９〜５９頁）などの植物細胞内で高発現を行うプロモーター配列を挿入し、その下流に塩基配列の変更によりナンセンス変異を導入したω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をサブクローニングさせる。そして、作製したバイナリーベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に導入し、バイナリベクターを保持するアグロバクテリウムを植物細胞に感染させることで植物細胞に遺伝子導入を行う方法が好適である。なお、高発現プロモーターを保持するバイナリーベクターとしては様々なものが採用可能であるが、ｐＢＩ１２１（クロンテック社製）などが好適である。
【００２２】
またこの場合において、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ内部にはさらに形質転換植物を選抜するための薬剤耐性遺伝子を挿入しておくことが好適である。遺伝子導入が行われた植物細胞は薬剤を含む植物組織培養用培地上で培養が可能であるため、Ｔ−ＤＮＡが植物ゲノムＤＮＡに導入され薬剤耐性となった植物細胞を選抜することで、α−リノレン酸含量が低減した植物細胞を得ることができるようになる。なお具体的な効果の確認については以下記載の実施例により明らかになる。
【００２３】
（実施例１）
翻訳開始コドンから６１塩基３’側下流にある塩基を置換することにより同部位にストップコドンを導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入した植物細胞におけるα−リノレン酸含量への影響を検討した。
【００２４】
（１）ナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作製
プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にタバコ小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（以下、単にＮｔＦＡＤ３遺伝子）のｃＤＮＡ（約１．４ｋｂ）をクローニングし（得られたプラスミドを以後、ｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３という）、このｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３に対して点突然変異によりＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドン（ａｔｇ）から６１番目のｇをｔに置換することで、ストップコドン（ｔａａ）を創出した。なお以下の２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
【００２５】
プライマー１：ｃｔｔｔａａｃｇａｇａｔｇｇａｇｔｔｔｔａａｔｔｃｇａｃｃｃｇａｇｔｇｃｃｃｃ（配列番号２）
プライマー２：ｇｇｇｇｃａｃｔｃｇｇｇｔｃｇａａｔｔａａａａｃｔｃｃａｔｃｔｃｇｔｔａａａｇ（配列番号３）
【００２６】
プライマー１とプライマー２は相補的な配列となっている。プライマー１の第２０番目の塩基（ｔ）、及びプライマー２の第２０番目の塩基（ａ）は、ともに変異を導入しようとするＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから６１番目の塩基（ｇ）に対応する。
【００２７】
点突然変異はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の取扱説明書に従って行った。４０ｎｇのｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３、プライマー１および２をそれぞれ０．２μＭ、１×ｐｆｕ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（ストラタジーン社製）、ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３％ Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅからなる反応溶液２５μｌを調製し、９５℃保温３０秒間、５５℃保温１分間、６８℃保温９分間からなる保温過程を１サイクルとして２０サイクル繰り返した。
【００２８】
サイクル終了後、反応液に５ＵのＤｐｎＩ（プロメガ社製）を加え３７℃で６０分間保温することでｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの鋳型となったｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３を分解した。反応液５μｌを１００μｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５αコンピテントセル（宝酒造社製）に形質転換し、１０ｍｌの液体培地（アンピシリン添加ＬＢ培地）中で形質転換細胞を増殖させた。これよりプラスミドを調製した。点突然変異の導入の有無は、得られたプラスミドの塩基配列を決定することで確認した。点突然変異が導入されたプラスミドを以後ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−６１ＧＴとした。
【００２９】
（２）アグロバクテリウム用バイナリーベクターへの変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子のサブクローニング
アグロバクテリウム用バイナリーベクターであるｐＢＩ１２１（図１参照）のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター配列をＥｌ２Ω配列に置換したｐＥｌ２ΩＧＵＳを作製した。ＮｔＦＡＤ３遺伝子にナンセンス変異が導入されたプラスミド（以下「ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−６１ＧＴ」という）をＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行い、変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子をプラスミドから切り出し、ＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行ったｐＥｌ２ΩＧＵＳプラスミドにサブクローニングした（以下、得られた変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子を持つプラスミドを「ｐＴＳＴ６１」という。図1参照）。本来ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから１１３８〜１１４０番目にストップコドンがあるところが、ｐＴＳＴ６１ではＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから６１番目の塩基を含むコドンがストップに変化したナンセンス変異が生じている。
【００３０】
ｐＴＳＴ６１のＴ−ＤＮＡにより形質転換された植物細胞では、Ｅｌ２Ω配列によりナンセンス変異の挿入されたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡが植物細胞内で多く転写される。また一方でｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３からＮｔＦＡＤ３遺伝子をＸｂａＩとＳａｃＩによる制限酵素処理を行い、ｐＥｌ２ΩＧＵＳのＸｂａＩとＳａｃＩに挟まれた領域にサブクローニングすることによりｐＴＰＭ１（図１）を得た。ｐＴＳＴ６１、ｐＴＰＭ１およびｐＢＩ１２１のＴ−ＤＮＡの部分が植物細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれると、同細胞はカナマイシン耐性となる。
【００３１】
（３）毛状根の作出
変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子の導入による植物細胞のα−リノレン酸含量への影響の評価は、形質転換根を作出し、根のα−リノレン酸含量を測定することで行った。
ｐＴＳＴ６１、ｐＴＰＭ１およびｐＢＩ１２１をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００に形質転換した（以下「ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００」をいう）。ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００はＲｉプラスミドを保持している。ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００が植物に感染し、ＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡにより植物細胞が形質転換すると、Ｔ−ＤＮＡに含まれるｒｏｌ遺伝子と呼ばれる一群の遺伝子の作用によって毛状根と呼ばれる形質転換根を形成する。ｐＴＳＴ６１、ｐＴＰＭ１およびｐＢＩ１２１により形質転換したｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００をカナマイシン添加ＬＢ培地で培養したのち、無菌状態で育てたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．ＳＲ１）の葉に感染させ、植物組織培養用培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地、以後ＭＳ培地）に移し、２４℃で３日間共存培養した。つづいてｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００菌を除菌するために抗生物質であるクラフォランを含むカナマイシン添加MS培地に感染葉を移し、２４℃で２週間培養した。感染部位から伸長したきた毛状根を根端から１．５ｃｍ程度のところで切り出し、クラフォランを含むカナマイシン添加ＭＳ培地に移植することで毛状根を継代培養し、カナマイシン耐性毛状根を伸長させた。
【００３２】
（４）毛状根のα-リノレン酸含量の測定
得られた形質転換植物根である毛状根のα−リノレン酸含量を測定した。
根を１ｍｌのメタノール性塩酸溶液（和光純薬工業社製）に浸し、８０℃で６０分間保温した。その後、０．９％ＮａＣｌ溶液を１ｍｌ加え、さらにｎ−ヘキサン溶液を０．５ｍｌ加えたのち、激しく攪拌して、脂肪酸をｎ−ヘキサン層に抽出した。抽出液をガスクロマトグラフィーにより解析することで、脂肪酸組成を決定した。
【００３３】
図２にｐＢＩ１２１を導入した毛状根のα−リノレン酸含量の分布を示す。２５本の毛状根のα−リノレン酸含量を測定した結果、総脂肪酸に占めるα−リノレン酸の割合が１０％より低いα−リノレン酸含量を示す毛状根はなく、すべての毛状根が１０％以上３０％未満のα−リノレン酸含量を示した。
【００３４】
一方、図３にｐＴＰＭ１を導入した２９本の形質転換毛状根のα−リノレン酸含量の分布を示す。ｐＴＰＭ１を導入すると、正常なＮｔＦＡＤ３ ｍＲＮＡが大量に転写されるためにα−リノレン酸含量が増加する。最も含量が高いものでは総脂肪酸の５０％以上をα−リノレン酸が占めていた。逆に１０％未満のα−リノレン酸含量を示す形質転換毛状根は得られなかった。
【００３５】
図４にｐＴＳＴ６１を導入した２８本の毛状根のα−リノレン酸含量を示す。ｐＴＳＴ６１が導入された植物細胞ではナンセンス変異が生じたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡが大量に転写される。その結果、総脂肪酸に占めるα−リノレン酸の割合が１０％未満である毛状根が全体の２８％に当たる８本も得られた。ｐＢＩ１２１を導入した毛状根では１０％より低いα−リノレン酸含量を示す毛状根は得られないことから、ｐＴＳＴ６１を導入することでα−リノレン酸含量が低下した植物細胞を得ることができることが明らかになった。
【００３６】
（実施例２）
翻訳開始コドンから３’側下流の２３４番目、４３０の番目の塩基置換によりストップコドンを創出した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入した植物細胞におけるα−リノレン酸含量への影響の検討を行った。
【００３７】
（１）ナンセンス変異を導入したω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作製
プラスミドｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３に対して点突然変異によりＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから２３４番目のｃをｇに置換することで、ストップコドン（ｔａｇ）を導入した。以下の２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
【００３８】
プライマー３：ｇｇａｔａｇｔｔｇｇｔｔａｔｔｔｔａｇｃｃａｃｔｔｔａｃｔｇｇｇｃｔａｔｃ（配列番号４）
プライマー４：ｇａｔａｇｃｃｃａｇｔａａａｇｔｇｇｃｔａａａａｔａａｃｃａａｃｔａｔｃｃ（配列番号５）
【００３９】
なお、プライマー３の第１９番目の塩基（ｇ）、及びプライマー４の第１９番目の塩基（ｃ）は、ともに変異を導入しようとする塩基に対応する。これらのプライマーを用いて点突然変異を実施例１と同様な操作により導入した。点突然変異の導入の有無は、得られたプラスミドの塩基配列を決定することで確認した（点突然変異が導入されたプラスミドを「ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−２３４ＣＧ」という）。さらにｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３に対し点突然変異によりＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから４３０番目のｇをｔに置換することで、ストップコドン（ｔａｇ）を創出した。なおプライマーとしては以下の２つの合成オリゴヌクレオチドを用いた。
【００４０】
プライマー５：ｇａａｃｃａｔｇｇａａａｔｇｔｇｔａｇａｃｔｇａｔｇａｇｔｃｔｔｇ（配列番号６）
プライマー６：ｃａａｇａｃｔｃａｔｃａｇｔｃｔａｃａｃａｔｔｔｃｃａｔｇｇｔｔｃ（配列番号７）
【００４１】
プライマー５の第１７番目の塩基（ｔ）、及びプライマー６の第１７番目の塩基（ａ）は、ともに変異を導入しようとする塩基に対応する。これらのプライマーを用いて点突然変異を実施例１と同様な操作により導入した。点突然変異の導入の有無は、得られたプラスミドの塩基配列を決定することで確認し、点突然変異が導入されたプラスミドを以後、ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−４３０ＧＴとした。
【００４２】
（２）アグロバクテリウム用バイナリーベクターへの変異ＮｔＦＡＤ遺伝子のサブクローニング
ＮｔＦＡＤ３遺伝子にナンセンス変異が創出されたプラスミド、ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−２３４ＣＧとｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−４３０ＧＴをＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行い、変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子をプラスミドから切り出し、ＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行ったｐＥｌ２ΩＧＵＳプラスミドにサブクローニングした。（得られた変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子を持つプラスミドを、「ｐＴＳＴ４３０」という。図１参照）。
【００４３】
ｐＴＳＴ２３４では本来ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから１１３８〜１１４０番目にストップコドンがあるところが、２３４番目の塩基を含むコドンがストップコドンに変化したナンセンス変異が生じており、ｐＴＳＴ２３４のＴ−ＤＮＡで形質転換された植物細胞内でナンセンス変異の挿入されたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡがＥｌ２Ω配列により転写される。ｐＴＳＴ４３０では４３０番目の塩基を含むコドンがストップコドンに変化したナンセンス変異が生じており、ｐＴＳＴ４３０のＴ−ＤＮＡで形質転換された植物細胞内でナンセンス変異の挿入されたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡがＥｌ２Ω配列により転写される。ｐＴＳＴ２３４、ｐＴＳＴ４３０のＴ−ＤＮＡの部分が植物細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれると、形質転換植物細胞となり同細胞はカナマイシン耐性となる。
【００４４】
（３）毛状根の作出
変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子の導入による植物細胞のα−リノレン酸含量への影響の評価は、形質転換毛状根を作出し、毛状根のα−リノレン酸含量を測定することで行った。ｐＴＳＴ２３４、ｐＴＳＴ４３０によりｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００を形質転換した。形質転換細胞をカナマイシン添加ＬＢ培地で培養したのち、無菌状態で育てたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． ＳＲ１）の葉に感染させ、実施例１と同様な操作によりカナマイシン耐性毛状根を得た。
【００４５】
（４）毛状根のα−リノレン酸含量の測定
得られた形質転換植物根である毛状根のα−リノレン酸含量は実施例１と同様な操作方法により測定した。図５にｐＴＳＴ２３４を導入した形質転換毛状根のα−リノレン酸含量の分布を、図６にｐＴＳＴ４３０を導入した形質転換毛状根の結果を示す。
【００４６】
α−リノレン酸含量が１０％未満である毛状根の割合は、ｐＴＳＴ２３４において２６本中１本であり、他は１０％以上３０％未満のα−リノレン酸含量を示した。ｐＴＳＴ４３０ではα−リノレン酸含量が１０％未満である毛状根の割合は２７本中１本で、他は１０％以上２０％未満であった。これらの結果からナンセンス変異を有するＮｔＦＡＤ３遺伝子の転写によるα−リノレン酸含量の低減には、ナンセンス変異がＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンより３’側下流の４３０塩基以内にあることによりα−リノレン酸含有量の低減の効果が得られはじめることが確認できた。
【００４７】
（比較例）
比較例として、ＲＮＡｉを用いた方法によるＮｔＦＡＤ３遺伝子の発現抑制がα−リノレン酸含量に与える影響の検討を行った。
【００４８】
ＮｔＦＡＤ３遺伝子配列の一部をスペーサー配列を挟んでアンチセンス方向とセンス方向に接続したコンストラクト、ｐＴＦ１ＡＧＳ (Ｔｏｍｉｔａら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００４年、５７３巻、１１７〜１２０頁参照)をｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００に導入した。形質転換ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００をカナマイシン添加ＬＢ培地で培養したのち、無菌状態で育てたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．ＳＲ１）の葉に感染させ、実施例1と同様な操作によりカナマイシン耐性毛状根を得た。得られた形質転換植物根である毛状根のα−リノレン酸含量は実施例１と同様な操作方法により測定した。その結果、α−リノレン酸含量が１０％未満の低い値を示す毛状根が２３本中に１０本得られ、ＲＮＡｉ法によるα-リノレン酸含量の低減が可能であることが見出された。
【００４９】
以上、ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから３'側下流の４３０塩基以内にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内において高発現させることにより、植物細胞のα−リノレン酸含量を低減することが可能であることが見出された。特に、１００塩基以内、より望ましくは６１塩基以内に変異を導入すればより顕著な効果を得ることができる。本方法では、遺伝子発現の抑制方法として広く使われるＲＮＡｉを用いた方法と比較しても非常に簡易に行うことができ、更に、変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を持つプラスミドはＲＮＡｉコンストラクトを持つプラスミドよりも大腸菌内において安定に保持されるため、サブクローニングなどの遺伝子操作が容易である。また、コサプレッション法も植物の遺伝子発現抑制方法として用いられているが、小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のコサプレッションの場合、根では発現抑制が生じないことが報告されている(Ｔｏｍｉｔａら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００４年、５７３巻、１１７〜１２０頁参照)。本方法では毛状根と呼ばれる形質転換根でのα−リノレン酸含量の低減に効果があり、コサプレッションを誘導できない器官においても有効である。α−リノレン酸含量が低減した植物では高温環境下での耐性能力が向上していることが報告されているため、より環境に適応する能力が向上した植物の作出や植物油の脂肪酸組成の改変に本発明を適用することが可能であり、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】タバコ毛状根に導入したコンストラクト。Ｔ−ＤＮＡの内部を示す。ＲＢはライトボーダー、ＬＢはレフトボーダーを示す。図中のＸｂａＩおよびＳａｃＩはそれぞれ制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩの認識配列の部位を示す。ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンとストップコドンを示した。各コドンの隣にある括弧には翻訳開始コドンを１として点突然変異を導入した位置と本来のストップコドンの最初の塩基の位置を示した。
【図２】ｐＢＩ１２１を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図３】ｐＴＰＭ１を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図４】ｐＴＳＴ６１を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図５】ｐＴＳＴ２３４を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図６】ｐＴＳＴ４３０を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明はナンセンス変異が導入された変異遺伝子、その変異遺伝子が挿入された植物、及び、その変異遺伝子の発現により植物の脂肪酸の組成を改変させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素は、脂質の脂肪酸側鎖であるリノール酸をα−リノレン酸に不飽和化する酵素である。植物脂質は食用油として重要でありその脂肪酸組成の改変は産業上大変重要である。またα−リノレン酸含量が変化した形質転換植物が作出され、その中でも特にα−リノレン酸含量が低下した植物では、高温環境下での耐性能力が向上していることが報告されている（例えば下記非特許文献１参照）。
【０００３】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を低減させる方法としては、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現プロモーターに接続して植物細胞に導入し、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現させることでコサプレッションと呼ばれる遺伝子発現抑制現象を誘導し、α−リノレン酸含量を低減させる方法がある(例えば下記非特許文献２参照)。
【０００４】
また、ヘアピンＲＮＡと呼ばれる２本鎖ＲＮＡを転写させることによる発現抑制（一般にＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉと呼ばれる）によっても、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を抑制することができる。ＲＮＡｉを用いる方法では、器官特異性を示さないプロモーター配列をヘアピンＲＮＡの転写に用いれば、植物体全体で目的とする遺伝子の発現を抑制できる。事実ＲＮＡｉを用いた方法による小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現抑制によって葉と根でα−リノレン酸含量の低減が可能であることが示されている(これについても例えば下記非特許文献２参照)。
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、２８７巻、４７６〜４７９頁
【非特許文献２】Ｔｏｍｉｔａら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００４年、５７３巻、１１７〜１２０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、コサプレッション法では得られた遺伝子導入植物の中からコサプレッション個体が得られる頻度が低く、特に小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の場合にはその頻度がわずか１〜２％程度である。さらにコサプレッション法による小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現低下は器官特異的であり、葉ではα−リノレン酸含量の低下が生じるが、根では生じない。つまり植物細胞器官によっては全くα−リノレン酸含量を低減させることができない。
【０００７】
また、ＲＮＡｉを用いる方法ではω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の塩基配列をスペーサー配列を挟んでセンス方向とアンチセンス方向に接続したものを高発現プロモーターの下流に接続したコンストラクト（これをＲＮＡｉコンストラクトと呼ぶ）を作製する必要がある。このコンストラクトから転写されたＲＮＡはヘアピンＲＮＡとなり、ＲＮＡｉを用いる方法によるω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を抑制することができる。しかしながらＲＮＡｉコンストラクトの作製には、サブクローニングのステップが多いため多くの日数と煩雑な操作が必要とされる。また、一般にこのような同一の配列をセンス方向−アンチセンス方向につないだものをｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ配列とよぶが、大腸菌を宿主とした場合にｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ配列を持つプラスミドは安定に保持されないため、クローニングなどの遺伝子操作が困難であるという問題もある。
【０００８】
そこで本発明は、上記課題を鑑み、植物細胞のα-リノレン酸含量をより簡易で効率的に低減させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内で高発現させることで、植物細胞のα−リノレン酸含量が低減することを見出し本発明を完成させるに至った。ここで、「ナンセンス変異」とは、本来アミノ酸をコードしている塩基配列が塩基配列の変更によりストップコドンとなることで翻訳が終結する変異をいう。
【００１０】
即ち、本発明に係る植物細胞内のα−リノレン酸含有量を低減させる方法は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、植物細胞内で発現させることにより行う。なおここで「発現させる」とは、植物細胞内において遺伝子が転写されることをいう。
【００１１】
また本発明に係る植物細胞内のα−リノレン酸含有量を低減させる方法において、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内であることが望ましく、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内、更に望ましくは６１塩基以内である。
【００１２】
また、本発明に係る植物は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が挿入されており、かつ変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現しているものである。
【００１３】
また、本発明に係る植物において、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内であることが望ましく、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内、更に望ましくは６１塩基以内である。
【００１４】
また、本発明に係る変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入したものである。
【００１５】
また、本発明に係る変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内であり、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内、更に望ましくは６１塩基以内である。
【発明の効果】
【００１６】
以上、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入することにより得られる変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内において高発現させ、植物細胞のα−リノレン酸含量を低減することが可能となる。これは遺伝子発現の抑制方法として広く使われるＲＮＡｉを用いる方法と比較して、変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現コンストラクトの作製は簡易であり、また変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を持つプラスミドはＲＮＡｉコンストラクトを持つプラスミドよりも大腸菌内において安定に保持されるために、クローニングなどの遺伝子操作が容易ともなる。特に、α−リノレン酸含量が低減した植物では高温環境下での耐性能力が向上すると期待されているため、より環境に適応する能力が向上した植物を得ることができ、更には植物油の脂肪酸組成の改変に本発明を適用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
【００１８】
本実施形態ではω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入して変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とし、植物細胞内で発現させることにより植物細胞内のα-リノレン酸含量を低減させることを特徴の一つとしている。
【００１９】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する方法としては、特に限られるわけではないが、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子へ点突然変異を導入し、その点突然変異が導入された部位のコドンをストップコドンとする方法が非常に好適である。また点突然変異を導入する方法についてもこれに限られるわけではないが、化学的に合成した変異を導入しようとする塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた一般的に用いられている点突然変異導入法を用いることが好適である。
【００２０】
ナンセンス変異を導入する部位については、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンの近傍が望ましく、例えば翻訳開始コドンから３’側下流の４３０塩基以内が望ましく、より望ましくは２５０塩基以内、更に望ましくは１００塩基以内である。なお後述の実施例では翻訳開始コドンから６１塩基のところに塩基置換により同部位にストップコドンを創生した場合にα−リノレン酸含量が極めて顕著に低減していることを見出している。なお本明細書において、「翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内」とは、例えば配列表の配列番号１に記載するタバコ小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の場合、配列番号１に記載の塩基配列の２５０番目の塩基よりも前であることを指す（なお、配列番号１に記載の塩基配列の最初の塩基３つａｔｇが翻訳開始コドンである）。後述の実施例ではタバコの小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子について言及しているが、小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子自体は高等植物であればほぼ同じ長さの塩基配列を有しており、同様の効果を期待することができる。
【００２１】
変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内で発現させる方法としては、これに限定されるわけではないが、遺伝導入用のバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ内部にカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター配列やその配列に由来するＥ１２Ω配列（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９６年、３７巻、４９〜５９頁）などの植物細胞内で高発現を行うプロモーター配列を挿入し、その下流に塩基配列の変更によりナンセンス変異を導入したω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をサブクローニングさせる。そして、作製したバイナリーベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に導入し、バイナリベクターを保持するアグロバクテリウムを植物細胞に感染させることで植物細胞に遺伝子導入を行う方法が好適である。なお、高発現プロモーターを保持するバイナリーベクターとしては様々なものが採用可能であるが、ｐＢＩ１２１（クロンテック社製）などが好適である。
【００２２】
またこの場合において、バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ内部にはさらに形質転換植物を選抜するための薬剤耐性遺伝子を挿入しておくことが好適である。遺伝子導入が行われた植物細胞は薬剤を含む植物組織培養用培地上で培養が可能であるため、Ｔ−ＤＮＡが植物ゲノムＤＮＡに導入され薬剤耐性となった植物細胞を選抜することで、α−リノレン酸含量が低減した植物細胞を得ることができるようになる。なお具体的な効果の確認については以下記載の実施例により明らかになる。
【００２３】
（実施例１）
翻訳開始コドンから６１塩基３’側下流にある塩基を置換することにより同部位にストップコドンを導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入した植物細胞におけるα−リノレン酸含量への影響を検討した。
【００２４】
（１）ナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作製
プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にタバコ小胞体局在型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（以下、単にＮｔＦＡＤ３遺伝子）のｃＤＮＡ（約１．４ｋｂ）をクローニングし（得られたプラスミドを以後、ｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３という）、このｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３に対して点突然変異によりＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドン（ａｔｇ）から６１番目のｇをｔに置換することで、ストップコドン（ｔａａ）を創出した。なお以下の２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
【００２５】
プライマー１：ｃｔｔｔａａｃｇａｇａｔｇｇａｇｔｔｔｔａａｔｔｃｇａｃｃｃｇａｇｔｇｃｃｃｃ（配列番号２）
プライマー２：ｇｇｇｇｃａｃｔｃｇｇｇｔｃｇａａｔｔａａａａｃｔｃｃａｔｃｔｃｇｔｔａａａｇ（配列番号３）
【００２６】
プライマー１とプライマー２は相補的な配列となっている。プライマー１の第２０番目の塩基（ｔ）、及びプライマー２の第２０番目の塩基（ａ）は、ともに変異を導入しようとするＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから６１番目の塩基（ｇ）に対応する。
【００２７】
点突然変異はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の取扱説明書に従って行った。４０ｎｇのｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３、プライマー１および２をそれぞれ０．２μＭ、１×ｐｆｕ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（ストラタジーン社製）、ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３％ Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅからなる反応溶液２５μｌを調製し、９５℃保温３０秒間、５５℃保温１分間、６８℃保温９分間からなる保温過程を１サイクルとして２０サイクル繰り返した。
【００２８】
サイクル終了後、反応液に５ＵのＤｐｎＩ（プロメガ社製）を加え３７℃で６０分間保温することでｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの鋳型となったｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３を分解した。反応液５μｌを１００μｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５αコンピテントセル（宝酒造社製）に形質転換し、１０ｍｌの液体培地（アンピシリン添加ＬＢ培地）中で形質転換細胞を増殖させた。これよりプラスミドを調製した。点突然変異の導入の有無は、得られたプラスミドの塩基配列を決定することで確認した。点突然変異が導入されたプラスミドを以後ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−６１ＧＴとした。
【００２９】
（２）アグロバクテリウム用バイナリーベクターへの変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子のサブクローニング
アグロバクテリウム用バイナリーベクターであるｐＢＩ１２１（図１参照）のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター配列をＥｌ２Ω配列に置換したｐＥｌ２ΩＧＵＳを作製した。ＮｔＦＡＤ３遺伝子にナンセンス変異が導入されたプラスミド（以下「ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−６１ＧＴ」という）をＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行い、変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子をプラスミドから切り出し、ＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行ったｐＥｌ２ΩＧＵＳプラスミドにサブクローニングした（以下、得られた変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子を持つプラスミドを「ｐＴＳＴ６１」という。図1参照）。本来ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから１１３８〜１１４０番目にストップコドンがあるところが、ｐＴＳＴ６１ではＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから６１番目の塩基を含むコドンがストップに変化したナンセンス変異が生じている。
【００３０】
ｐＴＳＴ６１のＴ−ＤＮＡにより形質転換された植物細胞では、Ｅｌ２Ω配列によりナンセンス変異の挿入されたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡが植物細胞内で多く転写される。また一方でｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３からＮｔＦＡＤ３遺伝子をＸｂａＩとＳａｃＩによる制限酵素処理を行い、ｐＥｌ２ΩＧＵＳのＸｂａＩとＳａｃＩに挟まれた領域にサブクローニングすることによりｐＴＰＭ１（図１）を得た。ｐＴＳＴ６１、ｐＴＰＭ１およびｐＢＩ１２１のＴ−ＤＮＡの部分が植物細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれると、同細胞はカナマイシン耐性となる。
【００３１】
（３）毛状根の作出
変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子の導入による植物細胞のα−リノレン酸含量への影響の評価は、形質転換根を作出し、根のα−リノレン酸含量を測定することで行った。
ｐＴＳＴ６１、ｐＴＰＭ１およびｐＢＩ１２１をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００に形質転換した（以下「ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００」をいう）。ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００はＲｉプラスミドを保持している。ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００が植物に感染し、ＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡにより植物細胞が形質転換すると、Ｔ−ＤＮＡに含まれるｒｏｌ遺伝子と呼ばれる一群の遺伝子の作用によって毛状根と呼ばれる形質転換根を形成する。ｐＴＳＴ６１、ｐＴＰＭ１およびｐＢＩ１２１により形質転換したｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００をカナマイシン添加ＬＢ培地で培養したのち、無菌状態で育てたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．ＳＲ１）の葉に感染させ、植物組織培養用培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地、以後ＭＳ培地）に移し、２４℃で３日間共存培養した。つづいてｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００菌を除菌するために抗生物質であるクラフォランを含むカナマイシン添加MS培地に感染葉を移し、２４℃で２週間培養した。感染部位から伸長したきた毛状根を根端から１．５ｃｍ程度のところで切り出し、クラフォランを含むカナマイシン添加ＭＳ培地に移植することで毛状根を継代培養し、カナマイシン耐性毛状根を伸長させた。
【００３２】
（４）毛状根のα-リノレン酸含量の測定
得られた形質転換植物根である毛状根のα−リノレン酸含量を測定した。
根を１ｍｌのメタノール性塩酸溶液（和光純薬工業社製）に浸し、８０℃で６０分間保温した。その後、０．９％ＮａＣｌ溶液を１ｍｌ加え、さらにｎ−ヘキサン溶液を０．５ｍｌ加えたのち、激しく攪拌して、脂肪酸をｎ−ヘキサン層に抽出した。抽出液をガスクロマトグラフィーにより解析することで、脂肪酸組成を決定した。
【００３３】
図２にｐＢＩ１２１を導入した毛状根のα−リノレン酸含量の分布を示す。２５本の毛状根のα−リノレン酸含量を測定した結果、総脂肪酸に占めるα−リノレン酸の割合が１０％より低いα−リノレン酸含量を示す毛状根はなく、すべての毛状根が１０％以上３０％未満のα−リノレン酸含量を示した。
【００３４】
一方、図３にｐＴＰＭ１を導入した２９本の形質転換毛状根のα−リノレン酸含量の分布を示す。ｐＴＰＭ１を導入すると、正常なＮｔＦＡＤ３ ｍＲＮＡが大量に転写されるためにα−リノレン酸含量が増加する。最も含量が高いものでは総脂肪酸の５０％以上をα−リノレン酸が占めていた。逆に１０％未満のα−リノレン酸含量を示す形質転換毛状根は得られなかった。
【００３５】
図４にｐＴＳＴ６１を導入した２８本の毛状根のα−リノレン酸含量を示す。ｐＴＳＴ６１が導入された植物細胞ではナンセンス変異が生じたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡが大量に転写される。その結果、総脂肪酸に占めるα−リノレン酸の割合が１０％未満である毛状根が全体の２８％に当たる８本も得られた。ｐＢＩ１２１を導入した毛状根では１０％より低いα−リノレン酸含量を示す毛状根は得られないことから、ｐＴＳＴ６１を導入することでα−リノレン酸含量が低下した植物細胞を得ることができることが明らかになった。
【００３６】
（実施例２）
翻訳開始コドンから３’側下流の２３４番目、４３０の番目の塩基置換によりストップコドンを創出した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入した植物細胞におけるα−リノレン酸含量への影響の検討を行った。
【００３７】
（１）ナンセンス変異を導入したω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作製
プラスミドｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３に対して点突然変異によりＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから２３４番目のｃをｇに置換することで、ストップコドン（ｔａｇ）を導入した。以下の２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
【００３８】
プライマー３：ｇｇａｔａｇｔｔｇｇｔｔａｔｔｔｔａｇｃｃａｃｔｔｔａｃｔｇｇｇｃｔａｔｃ（配列番号４）
プライマー４：ｇａｔａｇｃｃｃａｇｔａａａｇｔｇｇｃｔａａａａｔａａｃｃａａｃｔａｔｃｃ（配列番号５）
【００３９】
なお、プライマー３の第１９番目の塩基（ｇ）、及びプライマー４の第１９番目の塩基（ｃ）は、ともに変異を導入しようとする塩基に対応する。これらのプライマーを用いて点突然変異を実施例１と同様な操作により導入した。点突然変異の導入の有無は、得られたプラスミドの塩基配列を決定することで確認した（点突然変異が導入されたプラスミドを「ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−２３４ＣＧ」という）。さらにｐＵＣ１１９−ＮｔＦＡＤ３に対し点突然変異によりＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから４３０番目のｇをｔに置換することで、ストップコドン（ｔａｇ）を創出した。なおプライマーとしては以下の２つの合成オリゴヌクレオチドを用いた。
【００４０】
プライマー５：ｇａａｃｃａｔｇｇａａａｔｇｔｇｔａｇａｃｔｇａｔｇａｇｔｃｔｔｇ（配列番号６）
プライマー６：ｃａａｇａｃｔｃａｔｃａｇｔｃｔａｃａｃａｔｔｔｃｃａｔｇｇｔｔｃ（配列番号７）
【００４１】
プライマー５の第１７番目の塩基（ｔ）、及びプライマー６の第１７番目の塩基（ａ）は、ともに変異を導入しようとする塩基に対応する。これらのプライマーを用いて点突然変異を実施例１と同様な操作により導入した。点突然変異の導入の有無は、得られたプラスミドの塩基配列を決定することで確認し、点突然変異が導入されたプラスミドを以後、ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−４３０ＧＴとした。
【００４２】
（２）アグロバクテリウム用バイナリーベクターへの変異ＮｔＦＡＤ遺伝子のサブクローニング
ＮｔＦＡＤ３遺伝子にナンセンス変異が創出されたプラスミド、ｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−２３４ＣＧとｐＵＣ−ＮｔＦＡＤ３−４３０ＧＴをＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行い、変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子をプラスミドから切り出し、ＸｂａＩとＳａｃＩで制限酵素処理を行ったｐＥｌ２ΩＧＵＳプラスミドにサブクローニングした。（得られた変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子を持つプラスミドを、「ｐＴＳＴ４３０」という。図１参照）。
【００４３】
ｐＴＳＴ２３４では本来ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから１１３８〜１１４０番目にストップコドンがあるところが、２３４番目の塩基を含むコドンがストップコドンに変化したナンセンス変異が生じており、ｐＴＳＴ２３４のＴ−ＤＮＡで形質転換された植物細胞内でナンセンス変異の挿入されたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡがＥｌ２Ω配列により転写される。ｐＴＳＴ４３０では４３０番目の塩基を含むコドンがストップコドンに変化したナンセンス変異が生じており、ｐＴＳＴ４３０のＴ−ＤＮＡで形質転換された植物細胞内でナンセンス変異の挿入されたＮｔＦＡＤ３ ＲＮＡがＥｌ２Ω配列により転写される。ｐＴＳＴ２３４、ｐＴＳＴ４３０のＴ−ＤＮＡの部分が植物細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれると、形質転換植物細胞となり同細胞はカナマイシン耐性となる。
【００４４】
（３）毛状根の作出
変異ＮｔＦＡＤ３遺伝子の導入による植物細胞のα−リノレン酸含量への影響の評価は、形質転換毛状根を作出し、毛状根のα−リノレン酸含量を測定することで行った。ｐＴＳＴ２３４、ｐＴＳＴ４３０によりｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００を形質転換した。形質転換細胞をカナマイシン添加ＬＢ培地で培養したのち、無菌状態で育てたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． ＳＲ１）の葉に感染させ、実施例１と同様な操作によりカナマイシン耐性毛状根を得た。
【００４５】
（４）毛状根のα−リノレン酸含量の測定
得られた形質転換植物根である毛状根のα−リノレン酸含量は実施例１と同様な操作方法により測定した。図５にｐＴＳＴ２３４を導入した形質転換毛状根のα−リノレン酸含量の分布を、図６にｐＴＳＴ４３０を導入した形質転換毛状根の結果を示す。
【００４６】
α−リノレン酸含量が１０％未満である毛状根の割合は、ｐＴＳＴ２３４において２６本中１本であり、他は１０％以上３０％未満のα−リノレン酸含量を示した。ｐＴＳＴ４３０ではα−リノレン酸含量が１０％未満である毛状根の割合は２７本中１本で、他は１０％以上２０％未満であった。これらの結果からナンセンス変異を有するＮｔＦＡＤ３遺伝子の転写によるα−リノレン酸含量の低減には、ナンセンス変異がＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンより３’側下流の４３０塩基以内にあることによりα−リノレン酸含有量の低減の効果が得られはじめることが確認できた。
【００４７】
（比較例）
比較例として、ＲＮＡｉを用いた方法によるＮｔＦＡＤ３遺伝子の発現抑制がα−リノレン酸含量に与える影響の検討を行った。
【００４８】
ＮｔＦＡＤ３遺伝子配列の一部をスペーサー配列を挟んでアンチセンス方向とセンス方向に接続したコンストラクト、ｐＴＦ１ＡＧＳ (Ｔｏｍｉｔａら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００４年、５７３巻、１１７〜１２０頁参照)をｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００に導入した。形質転換ｓｔｒａｉｎ Ｒ１０００をカナマイシン添加ＬＢ培地で培養したのち、無菌状態で育てたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．ＳＲ１）の葉に感染させ、実施例1と同様な操作によりカナマイシン耐性毛状根を得た。得られた形質転換植物根である毛状根のα−リノレン酸含量は実施例１と同様な操作方法により測定した。その結果、α−リノレン酸含量が１０％未満の低い値を示す毛状根が２３本中に１０本得られ、ＲＮＡｉ法によるα-リノレン酸含量の低減が可能であることが見出された。
【００４９】
以上、ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンから３'側下流の４３０塩基以内にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を植物細胞内において高発現させることにより、植物細胞のα−リノレン酸含量を低減することが可能であることが見出された。特に、１００塩基以内、より望ましくは６１塩基以内に変異を導入すればより顕著な効果を得ることができる。本方法では、遺伝子発現の抑制方法として広く使われるＲＮＡｉを用いた方法と比較しても非常に簡易に行うことができ、更に、変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を持つプラスミドはＲＮＡｉコンストラクトを持つプラスミドよりも大腸菌内において安定に保持されるため、サブクローニングなどの遺伝子操作が容易である。また、コサプレッション法も植物の遺伝子発現抑制方法として用いられているが、小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のコサプレッションの場合、根では発現抑制が生じないことが報告されている(Ｔｏｍｉｔａら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００４年、５７３巻、１１７〜１２０頁参照)。本方法では毛状根と呼ばれる形質転換根でのα−リノレン酸含量の低減に効果があり、コサプレッションを誘導できない器官においても有効である。α−リノレン酸含量が低減した植物では高温環境下での耐性能力が向上していることが報告されているため、より環境に適応する能力が向上した植物の作出や植物油の脂肪酸組成の改変に本発明を適用することが可能であり、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】タバコ毛状根に導入したコンストラクト。Ｔ−ＤＮＡの内部を示す。ＲＢはライトボーダー、ＬＢはレフトボーダーを示す。図中のＸｂａＩおよびＳａｃＩはそれぞれ制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩの認識配列の部位を示す。ＮｔＦＡＤ３遺伝子の翻訳開始コドンとストップコドンを示した。各コドンの隣にある括弧には翻訳開始コドンを１として点突然変異を導入した位置と本来のストップコドンの最初の塩基の位置を示した。
【図２】ｐＢＩ１２１を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図３】ｐＴＰＭ１を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図４】ｐＴＳＴ６１を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図５】ｐＴＳＴ２３４を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【図６】ｐＴＳＴ４３０を導入したタバコ毛状根のα−リノレン酸含量。１０％きざみのα−リノレン酸含量を示した毛状根の数を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、植物細胞内で発現させることにより植物細胞内のα-リノレン酸含量を低減させる方法。
【請求項２】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内であることを特徴とする請求項１記載の植物細胞内のα−リノレン酸含量を低減させる方法。
【請求項３】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の１００塩基以内であることを特徴とする請求項１記載の植物細胞内のα−リノレン酸含量を低減させる方法。
【請求項４】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が挿入されており、かつ該変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現している植物。
【請求項５】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内であることを特徴とする請求項４記載の植物。
【請求項６】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の１００塩基以内であることを特徴とする請求項４記載の植物。
【請求項７】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
【請求項８】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内であることを特徴とする請求項７記載の変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
【請求項９】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の１００塩基以内であることを特徴とする請求項７記載の変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
【請求項１】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、植物細胞内で発現させることにより植物細胞内のα-リノレン酸含量を低減させる方法。
【請求項２】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内であることを特徴とする請求項１記載の植物細胞内のα−リノレン酸含量を低減させる方法。
【請求項３】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の１００塩基以内であることを特徴とする請求項１記載の植物細胞内のα−リノレン酸含量を低減させる方法。
【請求項４】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が挿入されており、かつ該変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現している植物。
【請求項５】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内であることを特徴とする請求項４記載の植物。
【請求項６】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異が導入された部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の１００塩基以内であることを特徴とする請求項４記載の植物。
【請求項７】
ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入した変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
【請求項８】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の２５０塩基以内であることを特徴とする請求項７記載の変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
【請求項９】
前記ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子にナンセンス変異を導入する部位は、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の翻訳開始コドンから３’側下流の１００塩基以内であることを特徴とする請求項７記載の変異ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２２３２７０（Ｐ２００６−２２３２７０Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４４６８３（Ｐ２００５−４４６８３）
【出願日】平成１７年２月２１日（２００５．２．２１）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２１日（２００５．２．２１）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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