パターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板及びマイクロアレイ、該マイクロアレイ基板及びマイクロアレイを製造する方法
【課題】 パターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板及びマイクロアレイ、該マイクロアレイ基板及びマイクロアレイを製造する方法を提供する。
【解決手段】 基板と薄膜層物質は相異なる屈折率を有し、パターン化された薄膜層は、照射された励起光が基板から反射される第１反射光と薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が基板から反射される第１反射光と薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを含む基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板である。
【解決手段】 基板と薄膜層物質は相異なる屈折率を有し、パターン化された薄膜層は、照射された励起光が基板から反射される第１反射光と薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が基板から反射される第１反射光と薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを含む基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイ基板、マイクロアレイ、該マイクロアレイ基板またはマイクロアレイを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、マイクロアレイの光学的分析方法に使われる基板は、一般の基板の表面に何の処理もされていないか、または得られる信号の敏感度（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ、以下Ｓ／Ｎ比率とする）を高めるために、格子を使用していた。例えば、特許文献１には、円形格子構造を使用することにより、励起光と放射光とを分離することによって信号の敏感度を高める方法を提供している。
【特許文献１】米国特許第６，４８３，０９６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、かかる従来技術は、格子を形成させるところに多くの費用がかかり、測定される放射光は、ガイドされた放射光であり、その強度が相対的に低いという問題点があった。従って、信号の敏感度を高める要求は相変らず残っていた。 本発明の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを製造するのに使われるマイクロアレイ基板を提供することである。
【０００４】
本発明の他の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを提供することである。
【０００５】
本発明のさらに他の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを製造するのに使われるマイクロアレイ基板を製造する方法を提供することである。
【０００６】
本発明のさらに他の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そのために、本発明者らは、鋭意研究している中で、予測もしなかったことに、特定厚さの酸化膜は、光学的信号の強度を増幅させ、また他の特定厚さの酸化膜は、光学的信号の強度を減殺させる現象を発見し、マイクロアレイのスポット領域は補強干渉が起こる薄膜層パターンを有し、バックグラウンド領域は相殺干渉が起こる薄膜層パターンを有するようにすることにより、マイクロアレイから発生する光学的信号の感度を高められるということを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
前記の課題を解決するために、本発明の一様態は、基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板であり、前記基板と前記薄膜層を構成する物質とは、相異なる屈折率を有し、前記パターン化された薄膜層は、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを含むマイクロアレイ基板を提供することを特徴とする。
【０００９】
前記の他の課題を解決するために、本発明の一様態は、前記マイクロアレイ基板を含むマイクロアレイを提供することを特徴とする。
【００１０】
前記のさらに他の課題を解決するために、本発明の一様態は、基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する工程と、前記薄膜層をパターニングして照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程とを含む前記マイクロアレイ基板を製造する方法を提供することを特徴とする。
【００１１】
前記のさらに他の課題を解決するために、本発明の一様態は、基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングし、薄膜層を形成する工程と、前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程と、前記スポット領域に生体分子を固定化する工程とを含む前記マイクロアレイを製造する方法を提供することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるマイクロアレイ基板によれば、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイを製造できる。
【００１３】
本発明のマイクロアレイによれば、光学的検出過程においてバックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高い。
【００１４】
本発明のマイクロアレイ基板によれば、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイを製造するのに使われるマイクロアレイ基板を製造できる。
【００１５】
本発明のマイクロアレイを製造する方法によれば、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板であり、前記基板と前記薄膜層物質とは相異なる屈折率を有し、前記パターン化された薄膜層は、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを含むマイクロアレイ基板を提供する。
【００１７】
本発明において、基板は、重合体、金属、セラミック、酸化物などを含んだ膜として使われうる任意の物質である。前記基板は、その表面にアレイが形成されるか、またはその表面によってアレイが支持される物質である。基板は、無機、有機、複合体または重合体でありうる。一般的に使われる基板には、ガラス、シリコンウェーハ、石英ガラス、金、銀、銅、白金、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択されるものが含まれるが、それらの例に限定されるものではない。基板表面は、変形され、前記変形された表面とアレイ要素との間の吸着、化学反応または物理的な相互作用が起こり、それによってアレイ生成を支持したり、促進したり、触媒化することも可能である。
【００１８】
また、本発明において、前記薄膜層は、特定の波長の光を透過させることができる物質ならば、特別に限定されるものではない。薄膜層物質の例には、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、ガラス、セラミック、マイカ、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＩＴＯなどの多様な金属酸化膜、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択されるものが含まれるが、それらの例に限定されるものではない。
【００１９】
本発明において、前記薄膜層は、パターン化され、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを有する。本発明で使われた「スポット領域」とは、一般の生体分子マイクロアレイで使われる意味であり、生体分子が固定化される特定の領域をいう。また、「バックグラウンド領域」とは、生体分子が固定化されていないか、または固定化されていても、標的分子と結合した後、検出過程で検出されない領域をいう。本発明は、前記スポット領域の厚さは、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さをいうものであり、かかる補強干渉によってスポット領域から発生する光信号は増幅される。従って、本発明において、「補強干渉を起こす厚さ」とは、特定の数値をいうものではなく、第１反射光と第２反射光とが補強されてその強度を強める厚さは、いかなるものでも含まれるものであり、一定の範囲の厚さを意味する。同様に、本発明において、「相殺干渉を起こす厚さ」とは、特定の数値をいうものではなく、第１反射光と第２反射光とが相殺されてその強度を弱める厚さは、いかなるものでも含まれるものであり、一定の範囲の厚さを意味する。薄膜層表面は、変形され、前記変形された表面とアレイ要素との間の吸着、化学反応または物理的相互作用が起こることが可能であり、それによってアレイ生成を支持したり、促進したり、触媒化することも可能である。
【００２０】
本発明において、前記基板の屈折率は、前記薄膜層物質の屈折率より大きくて、補強干渉が起こる条件は、第１反射光と第２反射光の経路差２ｎｓｉｎθｄが、下記数式１に従う場合である。
【００２１】
【数１】
【００２２】
式中、ｄは前記スポット領域の厚さ、ｎは屈折率、θは入射光の入射角、λは波長である。前記数式によれば、第１反射光と第２反射光の経路差が半波長の奇数倍であるときに補強干渉が起こる。波長λが５３２ｎｍであり、屈折率ｎ＝１．４６２であり、入射角が９０゜である場合、前記スポット領域の厚さｄ＝９１ｎｍ，２７３ｎｍであるときに補強干渉が起こる。
【００２３】
また、相殺干渉が起こる条件は、第１反射光と第２反射光の経路差２ｎｓｉｎθｄが、下記数式２に従う場合である。
【００２４】
【数２】
【００２５】
波長λが５３２ｎｍであり、屈折率ｎ＝１．４６２であり、入射角が９０゜である場合、前記バックグラウンド領域の厚さｄ＝０ｎｍ、１８２ｎｍであるときに相殺干渉が起こる。
【００２６】
本発明の特定の具現例で、前記基板は、シリコンまたはガラスであり、前記パターン化された薄膜層は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）（屈折率＝１．４６２）である。また、前記スポット領域の厚さは、望ましくは５００Åないし１，５００Åであり、前記バックグラウンド領域の厚さは、望ましくは０Åないし１０Åまたは１，９００Åないし２，１００Åである。前記二酸化ケイ素膜をシリコンまたはガラス膜上に形成させる方法は、当業界に公知である。例えば、二酸化ケイ素膜は乾式酸化または湿式酸化によって、石英ガラス（ＳｉＯ２）をシリコン基板上に沈積させることによって形成可能である。その場合、望ましい励起光の波長は、５３２ｎｍであり、標的物質またはプローブ物質はフルオレシン、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されうる。
【００２７】
図１は、本発明のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイを図式的に表したものである。図１に表したように、本発明のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイ１０は、パターニングされてスポット領域３０及びバックグラウンド領域２０を有する。図２は、図１のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイの平面図である。図１及び２では、パターニングされて突出される部分をスポット領域、底部分をバックグラウンド領域と表示したが、薄膜層と基板物質の屈折率によってパターニングされて突出される部分がバックグラウンド領域、かつ底部分がスポット領域になることもある。
【００２８】
本発明はまた、前記のようなマイクロアレイ基板に生体分子またはその他の化学物質が固定化されているマイクアレイ基板を含むマイクロアレイを提供する。マイクロアレイ基板上に生体分子を固定化する過程は、当業界に公知である。固定化方法には、例えばフォトリソグラフィを利用する方法とスポッティングとを利用する方法が含まれる。フォトリソグラフィを利用する方法によれば、除去可能な基で保護された単量体が塗布された基板表面上の一定の領域をエネルギー源に露出させて保護基を除去し、除去可能な基で保護された単量体をカップリングさせる工程を反復することにより、ポリヌクレオチドのアレイを製造できる。この場合、ポリヌクレオチドマイクロアレイ上に固定化されるポリヌクレオチドは、単量体を一つずつ延長させる方式で合成される。また、スポッティング法による場合、マイクロアレイは、すでに合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化させることによって製造される。かかるポリヌクレオチドマイクロアレイの製造方法は、例えば米国特許第５，７４４，３０５号明細書、同第５，１４３，８５４号明細書及び同第５，４２４，１８６号明細書に開示されている。ポリヌクレオチドマイクロアレイ及びその製造方法についての前記文献は、援用によって本明細書にその全体として含まれうる。
【００２９】
本発明のマイクロアレイの特定の例において、前記生体分子は、蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択されうる。
【００３０】
本発明はまた、（ａ）基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する工程と、（ｂ）前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程とを含む、前記の本発明のマイクロアレイ基板を製造する方法を提供する。
【００３１】
本発明のマイクロアレイ基板の製造方法の（ａ）工程で、基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する。薄膜層をコーティングする方法は、当業界に公知である。例えば、スピンコーティング、気相または液相蒸着法などが使われうる。薄膜層に使われうる物質及び厚さは、前記の通りである。
【００３２】
本発明のマイクロアレイ基板の製造方法の（ｂ）工程で、得られる薄膜層をパターニングして照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する。薄膜層をパターニングする方法は、当業界に公知である任意の方法が使われうる。例えば、フォトリソグラフィ方法が使われうる。すなわち、フォトレジスト物質を前記薄膜層上にコーティングし、パターンが描かれたマスクを介して露光した後、シェーピング及びエッチングすることにより、スポット領域とバックグラウンド領域とにパターンが形成された薄膜層を得ることができる。このとき、エッチングによってエッチングされる深さは、スポット領域については、第１反射光と第２反射光とが補強干渉が起こすほどの深さほど、バックグラウンド領域については、第１反射光と第２反射光とが相殺干渉が起こすほどの深さだけエッチングする。かかる補強干渉または相殺干渉が起こる条件は、照射される特定の励起光の波長、及び基板の屈折率と薄膜層の屈折率との大小によって変わる。かかる補強干渉または相殺干渉が起こる厚さ条件は、前記数式１及び２のように計算可能である。
【００３３】
本発明はまた、（ａ）基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する工程と、（ｂ）前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程と、（ｃ）前記スポット領域に生体分子を固定化する工程を含む、前記本発明のマイクロアレイを製造する方法を提供する。
【００３４】
本発明の方法の特定の例において、前記生体分子は、蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択されうる。
【００３５】
本発明のマイクロアレイを製造する方法において、薄膜層コーティング、パターニングする工程及び生体分子を固定化する工程についての説明は前記の通りである。
【００３６】
以下本発明を、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：基板上の薄膜層の厚さが光学信号に及ぼす影響
本実施例で、シリコン基板上に５００Åないし２，０００Å厚さのＳｉＯ２層を形成し、フォトリソグラフィを利用してＳｉＯ２層をパターニングしてカップリング剤を結合させた後、プローブポリヌクレオチドを固定化したマイクロアレイを製造した。次に、酸化膜厚さが検出される信号に及ぼす影響を確認するために、製造されたそれぞれのマイクロアレイに対して標識された標的核酸を混成化反応させた後で励起光を加え、それから発生する放射光を測定した。
【００３８】
１．基板上に酸化膜の形成
基板は、シリコン材質を使用した。ファーニスＳＶＦ−２００機器（セルトロン社）を利用し、熱酸化方式で基板に多様な厚さの酸化膜を形成した。酸化膜の厚さは、５００Å〜２，０００Åとした。
【００３９】
酸化膜の厚さは、ＮＡＮＯＳＰＥＣ Ｍｏｄｅｌ ＡＦＴ ２００（ＮＡＮＯＭＥＴＴＩＣＳ社）を利用して測定した。ナノスペック（ＮＡＮＯＰＳＰＥＣ）装備は、シリコンウェーハに光が入ったときに、一部の光は、ウェーハ酸化膜で反射され、一部は、通過してシリコンで反射される原理を利用したものである。このとき、酸化膜で反射された光と、シリコンで反射された光との位相差を利用して酸化膜の厚さを測定する。ナノスペック装備のサンプルステージ上に、シリコンウェーハを置いて測定すれば厚さが測定される。ウェーハで、５、６ポイントを測定して平均値を確認した後でコーティングに利用した。あらゆる実験は、ほとんどのホコリ粒子が十分に除去されたクリーンルーム−クラス１０００でなされた。
【００４０】
２．基板上の酸化膜パターンの形成
シリコンウェーハ上のＳｉＯ２酸化膜をフォトリソグラフィを利用してパターニングした。まず、ヘキサメチルジシラン（ＨＭＤＳ）を利用してシリコンウェーハ表面を前処理した。前処理の目的は、その後にコーティングする感光剤（フォトレジスト）との接着力を向上させ、パターンの解像度を高めるためである。ＨＭＤＳコーティングは、スピンコータモデルＣＥＥ ７０（ＣＥＥ社）を利用し、スピンコーティング法を利用した。スピンコーティングは、初期コーティング５００ｒｐｍ／５ｓｅｃ、主コーティング４，０００ｒｐｍ／４０ｓｅｃの工程で行われた。次に、一般的な半導体工程に利用されるポジレジスト、ＡＺ １５１２またはＡＺ ＧＸＲ ６０１をスピンコータモデルＣＥＥ ７０（ＣＥＥ社）を利用し、前記ＨＭＤＳ上にスピンコーティングした。スピンコーティングは、初期コーティング５００ｒｐｍ／５ｓｅｃ、主コーティング４，０００ｒｐｍ／４０ｓｅｃの工程で行われた。スピンコーティングが終われば、直ちに１１０℃のホットプレートに２分間ソフトベーキングを実施し、感光剤とシリコンウェーハ表面との接着力を強めた。
【００４１】
次に、前記コーティングされた感光剤上に光に対して透明な領域と不透明な領域とで、スポット領域とバックグラウンド領域とが描かれたフォトマスク（ＰＫＬ社に注文製作）を整列させた後、ＥＶ ６２０装備（Ｖｉｓｉｏｎ社）を利用して露光した。露光量は、１３ｍＪの光量で４．５秒間進めた。露光が完了した後、ＭＩＦ ３００Ｋを現像液として使用して現像し、感光剤パターンを形成した。
【００４２】
次に、前記感光剤パターンにフッ酸溶液またはＢＯＥ（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｏｘｉｄｅ Ｅｔｃｈｅｒ、６：１または５：１）をエッチング溶液として使用し、１〜３分間エッチングした。その結果、シリコン酸化膜（ＳｉＯ２）に対し、１，０００Å〜２，０００Åほどの厚さを選択的に除去した。最後に、アセトン／イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）または過酸化水素及び硫酸（１：３）からなるピラニア溶液を感光剤除去液として使用して感光剤を除去した。
【００４３】
３．蛍光染料物質のコーティング、酸化膜厚による相殺干渉及び補強干渉現象の確認
まず、表面処理前に基板を用意周到に洗浄した。洗浄は、過酸化水素及び硫酸（１：３）からなるピラニア溶液を使用して有機汚染物を除去した。最後に多量の水で洗った後、乾燥した。前記基板の洗浄過程は、半導体工程で利用するウェットステーションを利用し、ピラニア溶液について硫酸槽を利用し水で洗い落とす過程は、ＱＤＲ（Ｑｕａｄ Ｄａｔａ Ｒａｔｅ）という工程を利用した。それぞれの基板は、テフロン（ポリ四フッ化エチレン）材質のシリコンウェーハキャリアに固定されて工程を経た。洗浄が終わった基板は、スピンドライを介して乾燥した。
【００４４】
洗浄の直後、エタノール中の２０％（体積／体積）γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）溶液をスピンコータモデルＣＥＥ ７０（ＣＥＥ社）を利用し、前記シリコン酸化膜パターンを有する基板上にスピンコーティングした。スピンコーティングは、初期コーティング５００ｒｐｍ／１０ｓｅｃ、主コーティング２，０００ｒｐｍ／１０ｓｅｃの工程で行った。スピンコーティングが終われば、基板をテフロンウェーハキャリアに固定し、１３分間培養した後、１２０℃で４０分間硬化させた。硬化された基板は、水に１０分間浸漬させた後で１５分間超音波洗浄した後、再び水に１０分間浸漬させた後でスピン乾燥した。乾燥が完了した基板は、実験のために正方形か長方形に切って利用した。あらゆる実験は、ほとんどのホコリ粒子が十分に除去されたクリーンルーム−クラス１０００でなされた。
【００４５】
前記シラン化基板上にフルオレシン（０．０５ｇ／１０ｍｌ）を浸漬コーティングした。まず、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液にフルオレシンを溶かし、浸漬溶液（フルオレシン０．０５ｇ／１０ｍｌ）を製造した。浸漬溶液と基板とを反応容器に入れ、４０℃で１２０分間反応させた。反応の完了後、浸漬溶液から基板を取り出し、ＤＭＦで１０分間３回洗浄し、またメタノールで１０分間３回洗浄した。次に、基板を乾燥した後、基板に反応したフルオレシンの量をＧｅｎｅ Ｐｉｘ ４０００Ｂスキャナ（Ａｘｏｎ社）を利用して定量した。
【００４６】
その結果を図３、図４、図５及び図６に表した。図３は、酸化膜の厚さが５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図３の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚を５００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚を０〜１０Å（自然酸化膜の厚さ）（バックグラウンド領域）にパターンを形成した後、ＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後、５３２ｎｍの光を照射し、５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。蛍光強度は、スキャナの光増幅器（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）を３００〜７００で調節して感度を高めて行って測定した。各図面上の数値は、光増幅器感度を表す。図３で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちノイズに対する信号（（Ｓ／Ｎ）比率）を表１に表した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に上昇するにつれ、１．４ないし１４９であり、良好な値を示した。一般的なマイクロアレイの場合、ＰＭＴ感度が５００のときＳ／Ｎ比率が１０以上であれば正常な信号とみなすことを勘案すれば、前記結果は優秀な結果であるといえる。
【００４９】
図４は、酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図４の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚を１，０００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚を０〜１０Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後、５３２ｎｍの光を照射して５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。図４で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちＳ／Ｎ比率を表２に表した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に向上するにつれ、４ないし５８９であり、良好な値を示した。
【００５２】
図５は、酸化膜の厚さが１，５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図５の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚さを１，５００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚さを０〜１０Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後で５３２ｎｍの光を照射し、５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。図５で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちＳ／Ｎ比率を表３に表した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表３に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に向上するにつれ、１．７ないし２１６であり、良好な値を示した。
【００５５】
図６は、酸化膜の厚さが２，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図６の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚さを１，０００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚さを２，０００Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後で５３２ｎｍの光を照射し、５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。図６で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちＳ／Ｎ比率を表４に表した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に向上するにつれ、２．８ないし６０であった。
【００５８】
以上のような結果から、Ｓ／Ｎ比率の改善は、表２で最も明確であり、それは、１，０００Åの酸化膜を補強干渉に利用し、０〜１０Åの酸化膜を相殺干渉に利用することが最も効率的であることを表す。
【００５９】
実施例２：ポリヌクレオチドマイクロアレイの製造及び酸化膜の厚さが蛍光強度に及ぼす影響
本実施例では、実施例１で製作された厚さが１，０００Åであるパターン化された酸化膜のスポット領域にプローブポリヌクレオチドを固定化し、標識された標的核酸を混成化した後で蛍光強度を測定し、酸化膜の厚さがマイクロアレイの蛍光強度に及ぼす影響を調べた。
【００６０】
まず、実施例１に表したように、スポット領域の厚さが１，０００Åであり、バックグラウンド領域の厚さが０ないし１０Åであるパターン化された酸化膜を得て、ここにプローブポリヌクレオチドを固定化した。プローブポリヌクレオチドの固定化は、前記基板にポリヌクレオチドをスポッティング工程によって固定化してなされた。プローブポリヌクレオチドを１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝９．０）溶液に添加して撹拌し、３７℃で１時間放置した後、これをスポッティング溶液に使用した。前記スポッティング溶液を、基板上にスポッティングした後、温度が７０℃、相対湿度が４０％のウェットチャンバで1時間放置した。次に、バックグラウンドノイズの制御に必要な工程、すなわち標的核酸をガラス表面に付着させないように、スポッティングされていない位置の基板表面のアミン基が負電荷を帯びるように反応を行って乾燥器に保管した。前記製作された基板、すなわちＤＮＡチップにＣｙ−３で標識された標的ポリヌクレオチドを混成化反応させた後、５３２ｎｍで蛍光を測定した。
【００６１】
その結果を図７に表した。図７は、酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図７の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚を１，０００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚を０〜１０Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにプローブポリヌクレオチド（序列番号１）をスポッティングして固定化した後、Ｃｙ−３で標識された標的ポリヌクレオチド（序列番号２）を混成化反応させた後、５３２ｎｍで蛍光を測定したものである。図７に表したように、厚さが１，０００Åのパターン化された酸化膜を有するマイクロアレイもやはり１，０００Åのパターン化された酸化膜を有する基板と同様に、Ｓ／Ｎ比率が良好である蛍光強度信号を得ることができた。
【００６２】
以上、本発明を典型的な実施例を挙げて詳細に説明したが、特許請求の範囲に示す本発明の技術的思想から逸脱することなしに、形式や詳細において、当業者によって様々な変形が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板及びマイクロアレイ、前記マイクロアレイ基板及びマイクロアレイを製造する方法は、マイクロアレイの光学的分析に効果的に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイを、図式的に表した図面である。
【図２】図１のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイの平面図である。
【図３】酸化膜の厚さが５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図４】酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図５】酸化膜の厚さが１，５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図６】酸化膜の厚さが２，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図７】酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンがマイクロアレイの蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【符号の説明】
【００６５】
１０ マイクロアレイ基板、
２０ バックグラウンド領域、
３０ スポット領域。
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイ基板、マイクロアレイ、該マイクロアレイ基板またはマイクロアレイを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、マイクロアレイの光学的分析方法に使われる基板は、一般の基板の表面に何の処理もされていないか、または得られる信号の敏感度（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ、以下Ｓ／Ｎ比率とする）を高めるために、格子を使用していた。例えば、特許文献１には、円形格子構造を使用することにより、励起光と放射光とを分離することによって信号の敏感度を高める方法を提供している。
【特許文献１】米国特許第６，４８３，０９６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、かかる従来技術は、格子を形成させるところに多くの費用がかかり、測定される放射光は、ガイドされた放射光であり、その強度が相対的に低いという問題点があった。従って、信号の敏感度を高める要求は相変らず残っていた。 本発明の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを製造するのに使われるマイクロアレイ基板を提供することである。
【０００４】
本発明の他の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを提供することである。
【０００５】
本発明のさらに他の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを製造するのに使われるマイクロアレイ基板を製造する方法を提供することである。
【０００６】
本発明のさらに他の目的は、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率を向上させることができるマイクロアレイを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そのために、本発明者らは、鋭意研究している中で、予測もしなかったことに、特定厚さの酸化膜は、光学的信号の強度を増幅させ、また他の特定厚さの酸化膜は、光学的信号の強度を減殺させる現象を発見し、マイクロアレイのスポット領域は補強干渉が起こる薄膜層パターンを有し、バックグラウンド領域は相殺干渉が起こる薄膜層パターンを有するようにすることにより、マイクロアレイから発生する光学的信号の感度を高められるということを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
前記の課題を解決するために、本発明の一様態は、基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板であり、前記基板と前記薄膜層を構成する物質とは、相異なる屈折率を有し、前記パターン化された薄膜層は、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを含むマイクロアレイ基板を提供することを特徴とする。
【０００９】
前記の他の課題を解決するために、本発明の一様態は、前記マイクロアレイ基板を含むマイクロアレイを提供することを特徴とする。
【００１０】
前記のさらに他の課題を解決するために、本発明の一様態は、基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する工程と、前記薄膜層をパターニングして照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程とを含む前記マイクロアレイ基板を製造する方法を提供することを特徴とする。
【００１１】
前記のさらに他の課題を解決するために、本発明の一様態は、基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングし、薄膜層を形成する工程と、前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程と、前記スポット領域に生体分子を固定化する工程とを含む前記マイクロアレイを製造する方法を提供することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるマイクロアレイ基板によれば、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイを製造できる。
【００１３】
本発明のマイクロアレイによれば、光学的検出過程においてバックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高い。
【００１４】
本発明のマイクロアレイ基板によれば、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイを製造するのに使われるマイクロアレイ基板を製造できる。
【００１５】
本発明のマイクロアレイを製造する方法によれば、光学的検出過程において、バックグラウンド信号に対するスポット領域信号の比率が高いマイクロアレイを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板であり、前記基板と前記薄膜層物質とは相異なる屈折率を有し、前記パターン化された薄膜層は、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを含むマイクロアレイ基板を提供する。
【００１７】
本発明において、基板は、重合体、金属、セラミック、酸化物などを含んだ膜として使われうる任意の物質である。前記基板は、その表面にアレイが形成されるか、またはその表面によってアレイが支持される物質である。基板は、無機、有機、複合体または重合体でありうる。一般的に使われる基板には、ガラス、シリコンウェーハ、石英ガラス、金、銀、銅、白金、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択されるものが含まれるが、それらの例に限定されるものではない。基板表面は、変形され、前記変形された表面とアレイ要素との間の吸着、化学反応または物理的な相互作用が起こり、それによってアレイ生成を支持したり、促進したり、触媒化することも可能である。
【００１８】
また、本発明において、前記薄膜層は、特定の波長の光を透過させることができる物質ならば、特別に限定されるものではない。薄膜層物質の例には、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、ガラス、セラミック、マイカ、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＩＴＯなどの多様な金属酸化膜、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択されるものが含まれるが、それらの例に限定されるものではない。
【００１９】
本発明において、前記薄膜層は、パターン化され、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを有する。本発明で使われた「スポット領域」とは、一般の生体分子マイクロアレイで使われる意味であり、生体分子が固定化される特定の領域をいう。また、「バックグラウンド領域」とは、生体分子が固定化されていないか、または固定化されていても、標的分子と結合した後、検出過程で検出されない領域をいう。本発明は、前記スポット領域の厚さは、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さをいうものであり、かかる補強干渉によってスポット領域から発生する光信号は増幅される。従って、本発明において、「補強干渉を起こす厚さ」とは、特定の数値をいうものではなく、第１反射光と第２反射光とが補強されてその強度を強める厚さは、いかなるものでも含まれるものであり、一定の範囲の厚さを意味する。同様に、本発明において、「相殺干渉を起こす厚さ」とは、特定の数値をいうものではなく、第１反射光と第２反射光とが相殺されてその強度を弱める厚さは、いかなるものでも含まれるものであり、一定の範囲の厚さを意味する。薄膜層表面は、変形され、前記変形された表面とアレイ要素との間の吸着、化学反応または物理的相互作用が起こることが可能であり、それによってアレイ生成を支持したり、促進したり、触媒化することも可能である。
【００２０】
本発明において、前記基板の屈折率は、前記薄膜層物質の屈折率より大きくて、補強干渉が起こる条件は、第１反射光と第２反射光の経路差２ｎｓｉｎθｄが、下記数式１に従う場合である。
【００２１】
【数１】
【００２２】
式中、ｄは前記スポット領域の厚さ、ｎは屈折率、θは入射光の入射角、λは波長である。前記数式によれば、第１反射光と第２反射光の経路差が半波長の奇数倍であるときに補強干渉が起こる。波長λが５３２ｎｍであり、屈折率ｎ＝１．４６２であり、入射角が９０゜である場合、前記スポット領域の厚さｄ＝９１ｎｍ，２７３ｎｍであるときに補強干渉が起こる。
【００２３】
また、相殺干渉が起こる条件は、第１反射光と第２反射光の経路差２ｎｓｉｎθｄが、下記数式２に従う場合である。
【００２４】
【数２】
【００２５】
波長λが５３２ｎｍであり、屈折率ｎ＝１．４６２であり、入射角が９０゜である場合、前記バックグラウンド領域の厚さｄ＝０ｎｍ、１８２ｎｍであるときに相殺干渉が起こる。
【００２６】
本発明の特定の具現例で、前記基板は、シリコンまたはガラスであり、前記パターン化された薄膜層は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）（屈折率＝１．４６２）である。また、前記スポット領域の厚さは、望ましくは５００Åないし１，５００Åであり、前記バックグラウンド領域の厚さは、望ましくは０Åないし１０Åまたは１，９００Åないし２，１００Åである。前記二酸化ケイ素膜をシリコンまたはガラス膜上に形成させる方法は、当業界に公知である。例えば、二酸化ケイ素膜は乾式酸化または湿式酸化によって、石英ガラス（ＳｉＯ２）をシリコン基板上に沈積させることによって形成可能である。その場合、望ましい励起光の波長は、５３２ｎｍであり、標的物質またはプローブ物質はフルオレシン、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されうる。
【００２７】
図１は、本発明のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイを図式的に表したものである。図１に表したように、本発明のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイ１０は、パターニングされてスポット領域３０及びバックグラウンド領域２０を有する。図２は、図１のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイの平面図である。図１及び２では、パターニングされて突出される部分をスポット領域、底部分をバックグラウンド領域と表示したが、薄膜層と基板物質の屈折率によってパターニングされて突出される部分がバックグラウンド領域、かつ底部分がスポット領域になることもある。
【００２８】
本発明はまた、前記のようなマイクロアレイ基板に生体分子またはその他の化学物質が固定化されているマイクアレイ基板を含むマイクロアレイを提供する。マイクロアレイ基板上に生体分子を固定化する過程は、当業界に公知である。固定化方法には、例えばフォトリソグラフィを利用する方法とスポッティングとを利用する方法が含まれる。フォトリソグラフィを利用する方法によれば、除去可能な基で保護された単量体が塗布された基板表面上の一定の領域をエネルギー源に露出させて保護基を除去し、除去可能な基で保護された単量体をカップリングさせる工程を反復することにより、ポリヌクレオチドのアレイを製造できる。この場合、ポリヌクレオチドマイクロアレイ上に固定化されるポリヌクレオチドは、単量体を一つずつ延長させる方式で合成される。また、スポッティング法による場合、マイクロアレイは、すでに合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化させることによって製造される。かかるポリヌクレオチドマイクロアレイの製造方法は、例えば米国特許第５，７４４，３０５号明細書、同第５，１４３，８５４号明細書及び同第５，４２４，１８６号明細書に開示されている。ポリヌクレオチドマイクロアレイ及びその製造方法についての前記文献は、援用によって本明細書にその全体として含まれうる。
【００２９】
本発明のマイクロアレイの特定の例において、前記生体分子は、蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択されうる。
【００３０】
本発明はまた、（ａ）基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する工程と、（ｂ）前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程とを含む、前記の本発明のマイクロアレイ基板を製造する方法を提供する。
【００３１】
本発明のマイクロアレイ基板の製造方法の（ａ）工程で、基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する。薄膜層をコーティングする方法は、当業界に公知である。例えば、スピンコーティング、気相または液相蒸着法などが使われうる。薄膜層に使われうる物質及び厚さは、前記の通りである。
【００３２】
本発明のマイクロアレイ基板の製造方法の（ｂ）工程で、得られる薄膜層をパターニングして照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する。薄膜層をパターニングする方法は、当業界に公知である任意の方法が使われうる。例えば、フォトリソグラフィ方法が使われうる。すなわち、フォトレジスト物質を前記薄膜層上にコーティングし、パターンが描かれたマスクを介して露光した後、シェーピング及びエッチングすることにより、スポット領域とバックグラウンド領域とにパターンが形成された薄膜層を得ることができる。このとき、エッチングによってエッチングされる深さは、スポット領域については、第１反射光と第２反射光とが補強干渉が起こすほどの深さほど、バックグラウンド領域については、第１反射光と第２反射光とが相殺干渉が起こすほどの深さだけエッチングする。かかる補強干渉または相殺干渉が起こる条件は、照射される特定の励起光の波長、及び基板の屈折率と薄膜層の屈折率との大小によって変わる。かかる補強干渉または相殺干渉が起こる厚さ条件は、前記数式１及び２のように計算可能である。
【００３３】
本発明はまた、（ａ）基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングして薄膜層を形成する工程と、（ｂ）前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程と、（ｃ）前記スポット領域に生体分子を固定化する工程を含む、前記本発明のマイクロアレイを製造する方法を提供する。
【００３４】
本発明の方法の特定の例において、前記生体分子は、蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択されうる。
【００３５】
本発明のマイクロアレイを製造する方法において、薄膜層コーティング、パターニングする工程及び生体分子を固定化する工程についての説明は前記の通りである。
【００３６】
以下本発明を、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：基板上の薄膜層の厚さが光学信号に及ぼす影響
本実施例で、シリコン基板上に５００Åないし２，０００Å厚さのＳｉＯ２層を形成し、フォトリソグラフィを利用してＳｉＯ２層をパターニングしてカップリング剤を結合させた後、プローブポリヌクレオチドを固定化したマイクロアレイを製造した。次に、酸化膜厚さが検出される信号に及ぼす影響を確認するために、製造されたそれぞれのマイクロアレイに対して標識された標的核酸を混成化反応させた後で励起光を加え、それから発生する放射光を測定した。
【００３８】
１．基板上に酸化膜の形成
基板は、シリコン材質を使用した。ファーニスＳＶＦ−２００機器（セルトロン社）を利用し、熱酸化方式で基板に多様な厚さの酸化膜を形成した。酸化膜の厚さは、５００Å〜２，０００Åとした。
【００３９】
酸化膜の厚さは、ＮＡＮＯＳＰＥＣ Ｍｏｄｅｌ ＡＦＴ ２００（ＮＡＮＯＭＥＴＴＩＣＳ社）を利用して測定した。ナノスペック（ＮＡＮＯＰＳＰＥＣ）装備は、シリコンウェーハに光が入ったときに、一部の光は、ウェーハ酸化膜で反射され、一部は、通過してシリコンで反射される原理を利用したものである。このとき、酸化膜で反射された光と、シリコンで反射された光との位相差を利用して酸化膜の厚さを測定する。ナノスペック装備のサンプルステージ上に、シリコンウェーハを置いて測定すれば厚さが測定される。ウェーハで、５、６ポイントを測定して平均値を確認した後でコーティングに利用した。あらゆる実験は、ほとんどのホコリ粒子が十分に除去されたクリーンルーム−クラス１０００でなされた。
【００４０】
２．基板上の酸化膜パターンの形成
シリコンウェーハ上のＳｉＯ２酸化膜をフォトリソグラフィを利用してパターニングした。まず、ヘキサメチルジシラン（ＨＭＤＳ）を利用してシリコンウェーハ表面を前処理した。前処理の目的は、その後にコーティングする感光剤（フォトレジスト）との接着力を向上させ、パターンの解像度を高めるためである。ＨＭＤＳコーティングは、スピンコータモデルＣＥＥ ７０（ＣＥＥ社）を利用し、スピンコーティング法を利用した。スピンコーティングは、初期コーティング５００ｒｐｍ／５ｓｅｃ、主コーティング４，０００ｒｐｍ／４０ｓｅｃの工程で行われた。次に、一般的な半導体工程に利用されるポジレジスト、ＡＺ １５１２またはＡＺ ＧＸＲ ６０１をスピンコータモデルＣＥＥ ７０（ＣＥＥ社）を利用し、前記ＨＭＤＳ上にスピンコーティングした。スピンコーティングは、初期コーティング５００ｒｐｍ／５ｓｅｃ、主コーティング４，０００ｒｐｍ／４０ｓｅｃの工程で行われた。スピンコーティングが終われば、直ちに１１０℃のホットプレートに２分間ソフトベーキングを実施し、感光剤とシリコンウェーハ表面との接着力を強めた。
【００４１】
次に、前記コーティングされた感光剤上に光に対して透明な領域と不透明な領域とで、スポット領域とバックグラウンド領域とが描かれたフォトマスク（ＰＫＬ社に注文製作）を整列させた後、ＥＶ ６２０装備（Ｖｉｓｉｏｎ社）を利用して露光した。露光量は、１３ｍＪの光量で４．５秒間進めた。露光が完了した後、ＭＩＦ ３００Ｋを現像液として使用して現像し、感光剤パターンを形成した。
【００４２】
次に、前記感光剤パターンにフッ酸溶液またはＢＯＥ（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｏｘｉｄｅ Ｅｔｃｈｅｒ、６：１または５：１）をエッチング溶液として使用し、１〜３分間エッチングした。その結果、シリコン酸化膜（ＳｉＯ２）に対し、１，０００Å〜２，０００Åほどの厚さを選択的に除去した。最後に、アセトン／イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）または過酸化水素及び硫酸（１：３）からなるピラニア溶液を感光剤除去液として使用して感光剤を除去した。
【００４３】
３．蛍光染料物質のコーティング、酸化膜厚による相殺干渉及び補強干渉現象の確認
まず、表面処理前に基板を用意周到に洗浄した。洗浄は、過酸化水素及び硫酸（１：３）からなるピラニア溶液を使用して有機汚染物を除去した。最後に多量の水で洗った後、乾燥した。前記基板の洗浄過程は、半導体工程で利用するウェットステーションを利用し、ピラニア溶液について硫酸槽を利用し水で洗い落とす過程は、ＱＤＲ（Ｑｕａｄ Ｄａｔａ Ｒａｔｅ）という工程を利用した。それぞれの基板は、テフロン（ポリ四フッ化エチレン）材質のシリコンウェーハキャリアに固定されて工程を経た。洗浄が終わった基板は、スピンドライを介して乾燥した。
【００４４】
洗浄の直後、エタノール中の２０％（体積／体積）γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）溶液をスピンコータモデルＣＥＥ ７０（ＣＥＥ社）を利用し、前記シリコン酸化膜パターンを有する基板上にスピンコーティングした。スピンコーティングは、初期コーティング５００ｒｐｍ／１０ｓｅｃ、主コーティング２，０００ｒｐｍ／１０ｓｅｃの工程で行った。スピンコーティングが終われば、基板をテフロンウェーハキャリアに固定し、１３分間培養した後、１２０℃で４０分間硬化させた。硬化された基板は、水に１０分間浸漬させた後で１５分間超音波洗浄した後、再び水に１０分間浸漬させた後でスピン乾燥した。乾燥が完了した基板は、実験のために正方形か長方形に切って利用した。あらゆる実験は、ほとんどのホコリ粒子が十分に除去されたクリーンルーム−クラス１０００でなされた。
【００４５】
前記シラン化基板上にフルオレシン（０．０５ｇ／１０ｍｌ）を浸漬コーティングした。まず、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液にフルオレシンを溶かし、浸漬溶液（フルオレシン０．０５ｇ／１０ｍｌ）を製造した。浸漬溶液と基板とを反応容器に入れ、４０℃で１２０分間反応させた。反応の完了後、浸漬溶液から基板を取り出し、ＤＭＦで１０分間３回洗浄し、またメタノールで１０分間３回洗浄した。次に、基板を乾燥した後、基板に反応したフルオレシンの量をＧｅｎｅ Ｐｉｘ ４０００Ｂスキャナ（Ａｘｏｎ社）を利用して定量した。
【００４６】
その結果を図３、図４、図５及び図６に表した。図３は、酸化膜の厚さが５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図３の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚を５００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚を０〜１０Å（自然酸化膜の厚さ）（バックグラウンド領域）にパターンを形成した後、ＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後、５３２ｎｍの光を照射し、５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。蛍光強度は、スキャナの光増幅器（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）を３００〜７００で調節して感度を高めて行って測定した。各図面上の数値は、光増幅器感度を表す。図３で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちノイズに対する信号（（Ｓ／Ｎ）比率）を表１に表した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に上昇するにつれ、１．４ないし１４９であり、良好な値を示した。一般的なマイクロアレイの場合、ＰＭＴ感度が５００のときＳ／Ｎ比率が１０以上であれば正常な信号とみなすことを勘案すれば、前記結果は優秀な結果であるといえる。
【００４９】
図４は、酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図４の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚を１，０００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚を０〜１０Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後、５３２ｎｍの光を照射して５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。図４で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちＳ／Ｎ比率を表２に表した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に向上するにつれ、４ないし５８９であり、良好な値を示した。
【００５２】
図５は、酸化膜の厚さが１，５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図５の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚さを１，５００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚さを０〜１０Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後で５３２ｎｍの光を照射し、５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。図５で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちＳ／Ｎ比率を表３に表した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表３に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に向上するにつれ、１．７ないし２１６であり、良好な値を示した。
【００５５】
図６は、酸化膜の厚さが２，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図６の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚さを１，０００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚さを２，０００Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにフルオレシンでコーティングした後で５３２ｎｍの光を照射し、５７０ｎｍで蛍光強度を測定して得た。図６で観察されたスポット領域とバックグラウンド領域の蛍光強度及びそれから計算されたバックグラウンド領域の蛍光強度に対するスポット領域の蛍光強度の比率、すなわちＳ／Ｎ比率を表４に表した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４に表したように、Ｓ／Ｎ比率は、光増幅器感度が３００ないし７００に向上するにつれ、２．８ないし６０であった。
【００５８】
以上のような結果から、Ｓ／Ｎ比率の改善は、表２で最も明確であり、それは、１，０００Åの酸化膜を補強干渉に利用し、０〜１０Åの酸化膜を相殺干渉に利用することが最も効率的であることを表す。
【００５９】
実施例２：ポリヌクレオチドマイクロアレイの製造及び酸化膜の厚さが蛍光強度に及ぼす影響
本実施例では、実施例１で製作された厚さが１，０００Åであるパターン化された酸化膜のスポット領域にプローブポリヌクレオチドを固定化し、標識された標的核酸を混成化した後で蛍光強度を測定し、酸化膜の厚さがマイクロアレイの蛍光強度に及ぼす影響を調べた。
【００６０】
まず、実施例１に表したように、スポット領域の厚さが１，０００Åであり、バックグラウンド領域の厚さが０ないし１０Åであるパターン化された酸化膜を得て、ここにプローブポリヌクレオチドを固定化した。プローブポリヌクレオチドの固定化は、前記基板にポリヌクレオチドをスポッティング工程によって固定化してなされた。プローブポリヌクレオチドを１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝９．０）溶液に添加して撹拌し、３７℃で１時間放置した後、これをスポッティング溶液に使用した。前記スポッティング溶液を、基板上にスポッティングした後、温度が７０℃、相対湿度が４０％のウェットチャンバで1時間放置した。次に、バックグラウンドノイズの制御に必要な工程、すなわち標的核酸をガラス表面に付着させないように、スポッティングされていない位置の基板表面のアミン基が負電荷を帯びるように反応を行って乾燥器に保管した。前記製作された基板、すなわちＤＮＡチップにＣｙ−３で標識された標的ポリヌクレオチドを混成化反応させた後、５３２ｎｍで蛍光を測定した。
【００６１】
その結果を図７に表した。図７は、酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。図７の結果は、補強干渉が要求される酸化膜厚を１，０００Å（スポット領域）、相殺干渉が要求される酸化膜厚を０〜１０Å（バックグラウンド領域）に酸化膜パターンを形成した後でＧＡＰＳをコーティングし、さらにプローブポリヌクレオチド（序列番号１）をスポッティングして固定化した後、Ｃｙ−３で標識された標的ポリヌクレオチド（序列番号２）を混成化反応させた後、５３２ｎｍで蛍光を測定したものである。図７に表したように、厚さが１，０００Åのパターン化された酸化膜を有するマイクロアレイもやはり１，０００Åのパターン化された酸化膜を有する基板と同様に、Ｓ／Ｎ比率が良好である蛍光強度信号を得ることができた。
【００６２】
以上、本発明を典型的な実施例を挙げて詳細に説明したが、特許請求の範囲に示す本発明の技術的思想から逸脱することなしに、形式や詳細において、当業者によって様々な変形が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板及びマイクロアレイ、前記マイクロアレイ基板及びマイクロアレイを製造する方法は、マイクロアレイの光学的分析に効果的に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイを、図式的に表した図面である。
【図２】図１のマイクロアレイ基板またはマイクロアレイの平面図である。
【図３】酸化膜の厚さが５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図４】酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図５】酸化膜の厚さが１，５００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図６】酸化膜の厚さが２，０００Åであるとき、酸化膜パターンが蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【図７】酸化膜の厚さが１，０００Åであるとき、酸化膜パターンがマイクロアレイの蛍光強度に及ぼす影響を表す図面である。
【符号の説明】
【００６５】
１０ マイクロアレイ基板、
２０ バックグラウンド領域、
３０ スポット領域。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板であって、
前記基板と前記薄膜層を構成する物質とは相異なる屈折率を有し、前記パターン化された薄膜層は、
照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、
照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを備えるマイクロアレイ基板。
【請求項２】
前記基板は、ガラス、シリコンウェーハ、石英ガラス、金、銀、銅、白金、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択される請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項３】
前記薄膜層は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、ガラス、フッ化リチウム（ＬｉＦ）、シリコンウェーハ、石英ガラス、セラミック、マイカ、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＩＴＯ、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択される請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項４】
前記基板の屈折率が前記薄膜層物質の屈折率より大きい場合、前記スポット領域の厚さは、ｄ＝（２ｍ＋１）λ／４ｎｓｉｎθを満足し、前記バックグラウンド領域の厚さは、ｄ＝２ｍλ／４ｎｓｉｎθを満足し、前記式でｍは０以上の整数であり、ｄは厚さ、ｎは屈折率、θは入射光の入射角、λは波長を表す請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項５】
前記基板は、シリコンまたはガラスであり、前記パターン化された薄膜層は、二酸化ケイ素である請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項６】
前記スポット領域の厚さは，５００Åないし１，５００Åである請求項５に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項７】
前記バックグラウンド領域の厚さは、０Åないし１０Åまたは１，９００Åないし２，０００Åである請求項５に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のうちいずれか１項に記載のマイクロアレイ基板を含むマイクロアレイ。
【請求項９】
蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択される生体分子をスポット領域に固定化させる請求項８に記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングし、薄膜層を形成する工程と、
前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程とを含む、請求項１ないし請求項７のうちいずれか１項に記載のマイクロアレイ基板の製造方法。
【請求項１１】
基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングし、薄膜層を形成する工程と、
前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程と、
前記スポット領域に生体分子を固定化する工程とを含む、請求項８に記載のマイクロアレイの製造方法。
【請求項１２】
前記生体分子は、蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択される請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１】
基板上にパターン化された薄膜層を有するマイクロアレイ基板であって、
前記基板と前記薄膜層を構成する物質とは相異なる屈折率を有し、前記パターン化された薄膜層は、
照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、
照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを備えるマイクロアレイ基板。
【請求項２】
前記基板は、ガラス、シリコンウェーハ、石英ガラス、金、銀、銅、白金、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択される請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項３】
前記薄膜層は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、ガラス、フッ化リチウム（ＬｉＦ）、シリコンウェーハ、石英ガラス、セラミック、マイカ、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＩＴＯ、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）及びポリカーボネートから構成される群から選択される請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項４】
前記基板の屈折率が前記薄膜層物質の屈折率より大きい場合、前記スポット領域の厚さは、ｄ＝（２ｍ＋１）λ／４ｎｓｉｎθを満足し、前記バックグラウンド領域の厚さは、ｄ＝２ｍλ／４ｎｓｉｎθを満足し、前記式でｍは０以上の整数であり、ｄは厚さ、ｎは屈折率、θは入射光の入射角、λは波長を表す請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項５】
前記基板は、シリコンまたはガラスであり、前記パターン化された薄膜層は、二酸化ケイ素である請求項１に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項６】
前記スポット領域の厚さは，５００Åないし１，５００Åである請求項５に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項７】
前記バックグラウンド領域の厚さは、０Åないし１０Åまたは１，９００Åないし２，０００Åである請求項５に記載のマイクロアレイ基板。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のうちいずれか１項に記載のマイクロアレイ基板を含むマイクロアレイ。
【請求項９】
蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択される生体分子をスポット領域に固定化させる請求項８に記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングし、薄膜層を形成する工程と、
前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程とを含む、請求項１ないし請求項７のうちいずれか１項に記載のマイクロアレイ基板の製造方法。
【請求項１１】
基板上に前記基板と異なる屈折率を有する薄膜層物質をコーティングし、薄膜層を形成する工程と、
前記薄膜層をパターニングし、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが補強干渉を起こす厚さを有するスポット領域と、照射された励起光が前記基板から反射される第１反射光と前記薄膜層から反射される第２反射光とが相殺干渉を起こす厚さを有するバックグラウンド領域とを形成する工程と、
前記スポット領域に生体分子を固定化する工程とを含む、請求項８に記載のマイクロアレイの製造方法。
【請求項１２】
前記生体分子は、蛋白質、核酸、及び多糖類から構成される群から選択される請求項１１に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−３３５４（Ｐ２００６−３３５４Ａ）
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１７３０２６（Ｐ２００５−１７３０２６）
【出願日】平成１７年６月１３日（２００５．６．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】４１６，Ｍａｅｔａｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−ｇｕ，Ｓｕｗｏｎ−ｓｉ Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１３日（２００５．６．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】４１６，Ｍａｅｔａｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−ｇｕ，Ｓｕｗｏｎ−ｓｉ Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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