パン酵母菌株の作製方法
【目的】 冷蔵貯蔵では活性を示さず、しかし生存し、１３〜１４℃以上ではドウ膨脹能を回復するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅパン酵母菌株を得ることを目的とする。
【構成】 冷蔵庫、低温室又は冷蔵棚に貯蔵後喫食直前にオーブンでベーキングするベーカリ品の製造に使用できる冷蔵下で不活性であるが生存性を有するパン酵母菌株。
【構成】 冷蔵庫、低温室又は冷蔵棚に貯蔵後喫食直前にオーブンでベーキングするベーカリ品の製造に使用できる冷蔵下で不活性であるが生存性を有するパン酵母菌株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はｌｔｉ性を有するパン酵母菌株の作製方法および本方法により作製した酵母菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】特に伝統的遺伝学に基礎をおくパン酵母菌株を作製する各種既知方法があり、これらはベーカリに有用な特性を有する菌株を供しようと努めている。例えば、米国特許第４，５４７，３７４号明細書は冷蔵耐性があり、発酵およびベーキング前に冷蔵するためのパンドウの製造にパン酵母として使用できるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種菌株を選択的にハイブリド化することにより作製することを記載する。
【０００３】米国特許第４，３４１，８７１号明細書は圧搾形にしてもこれらの活性が過度に失われずに脱水できるパン酵母のハイブリドを記載する。米国特許第４，６４３，９０１号明細書は甘味性および無甘味性ドウの双方を発酵し、膨脹することができ、「プチット」突然変異株の原形質融合によりハイブリド化して得られるパン酵母の純粋菌株を記載する。発酵およびベーキング前冷蔵貯蔵するベーカリ品も既知である。しかし、例えばロールおよびクロワッサンのような製品は化学膨脹剤を含有する。
【０００４】本発明の課題はｌｔｉ性、すなわち冷蔵下で不活性であるが生存性（ｌｔｉは英語「ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ」の略語である）を有し、かつ例えば冷蔵庫、低温室又は冷蔵棚で貯蔵後喫食直前にオーブンでべーキングするベーカリ品の製造にパン酵母として使用できるパン酵母菌株の作製方法およびこのように作製した菌株を供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】このため、ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株を作製する本発明方法の第１態様は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株を突然変異誘発処理し、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの突然変異株を選択し、反対の接合型を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑し、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウの膨脹能を有するこうして得た二倍体菌株を選択することを特徴とする。
【０００６】本発明において、「潜在的生育能」とは工業的に実施しうる培養方法、特に緩徐栄養物供給バッチ方法（酵母サスペンジョンに通気しながら糖溶液をゆっくりかつ徐々に添加してバイオマスの産生中アルコールの形成を回避し、収量を最高にする）として既知のパン酵母の伝統的培養方法により高収量かつすぐれた生産性で培養できる能力をいう。
【０００７】同様に、「ドウ膨脹能」とは例えばドウが吸収しうるＣＯ2 、およびドウの保存料として作用しうるアルコールのような代謝産物を非常にゆっくり産生させることにより、冷蔵温度でドウを非常にゆっくり変形する能力と解される。非常にゆっくりした変形の結果は、例えばドウを冷蔵庫、低温室又は冷蔵棚に貯蔵後、直接オーブンに入れる場合、ドウは膨脹しうることである。
【０００８】ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株を作製する本発明方法の第２態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体は任意には突然変異誘発処理し、次いで胞子を形成させ、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの分離株を選択し、反対の接合型を有するこの菌株の別の分離株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑し、こうして得た潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する倍数体菌株を選択する。
【０００９】この方法により通例の冷蔵温度で、特に３〜９又は１０℃の温度で実質的に不活性であるが、これらの温度で生存し、次いで例えば１３〜１４℃のオーダのより高い温度でこれらの活性を回復する性質を有するパン酵母菌株を作製することができた。
【００１０】従って、このタイプのパン酵母菌株は冷蔵後喫食する直前にオーブンでベーキングするベーカリ品の製造に化学膨脹剤の代りに使用できる。これらは例えば、ロール、クロワッサンおよびピザの皮又は台所で混捏するドウのような呼び成形品の製造に特に使用できる。これらは冷蔵後、オーブンでベーキングすると、従来の市販パン酵母を使用して新たに膨脹させてオーブンでベーキングした同じものに匹敵できる官能性を有する。このタイプの菌株は冷蔵貯蔵する食品に温度誤用指示器として使用することもできる。
【００１１】従って、本発明方法は例えば、従来の実験室パン酵母を形成するもののようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株、又は従来の市販パン酵母を形成するもののようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株から出発できる。
【００１２】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株から出発する本発明方法の上記第１態様では、この菌株を突然変異誘発処理する。このため、この菌株の細胞は例えば２％グルコース、１％酵母エキスおよび２％ペプトンを含有するＹＰＤ培地に生育させることができ、細胞は例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又はＩＣＲ−１７０のような突然変異誘発剤により処理できる。
【００１３】ｌｔｉ性、特に９又は１０℃のオーダの温度で不活性であるが生存性を有するいくつかの突然変異株を選択することが好ましい。
【００１４】次に選択した突然変異株は反対の接合型を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と少なくとも１回戻し交雑して出発半数体菌株が最初に、又はその突然変異誘発処理後有しうる何らかの希望しない突然変異を回避し、および／又は可能な場合唯一回の突然変異によりｌｔｉ性を保有させる。数回の戻し交雑操作を行なう場合、ｌｔｉ性、特に約９又は１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも１つの分離株を２つの連続操作間で選択することができ、こうして選択した分離株はこれらの２つの連続操作の２番目にかける。
【００１５】次に反対の接合型およびｌｔｉ性、特に約９又は１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑する。
【００１６】最後に、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの二倍体菌株を選択する。この最後の段階で前の段階で使用したものより一層きびしく、かつ一層完全な選択基準を保持できる。特に、パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で二倍体菌株に生育試験を行なうことができる。
【００１７】次にｌｔｉ性はマルトース含有栄養培地、すなわち炭素源としてマルトースを含有する栄養培地で、例えば３〜７日間の毎日時間の関数としておよび例えば３〜１４℃間のすべての温度で温度の関数として二倍体菌株にＣＯ2 産生試験を行なうことにより証明できる。
【００１８】最後に、菌株のドウ膨脹能はピザドウに唯一の膨脹剤として菌株を添加することにより、例えばこのドウでピザの皮を形成し、これを数日又は数週冷蔵温度で貯蔵し、次いでオーブンでベーキングすることにより証明できる。この試験はマルトース含有培地で、例えば約２０〜３０℃の温度で菌株のＣＯ2 産生を証明することにより完了することもできる。
【００１９】従って、本発明方法の第１態様により冷蔵貯蔵後喫食直前にオーブンでベーキングするベーキング品の製造に使用できる顕著なｌｔｉ性を有する菌株を作製することができる。特に、緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜１０℃に冷蔵したマルトース含有培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき２０ｍｌ未満のＣＯ2 産生レベルおよび少なくとも１４℃の温度に保持したマルトース含有培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも４０ｍｌのＣＯ2 産生レベルを有するパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株を作製することができる。
【００２０】こうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株のうち、３菌株を例としてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ）、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ３１，１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ，ＡＢＥＲＤＥＥＮ ＡＢ９ ８ＤＧ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（英国）に１９９０年１１月６日ブタペスト条約により寄託し、番号ＮＣＩＭＢ４０３２８、４０３２９および４０３３０を与えられた。
【００２１】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株から出発する本発明方法の第２態様では、この菌株は任意には突然変異誘発処理する。例えばある種の市販パン酵母は本発明方法の間に検知しうる突然変異を初めに示すので菌株に突然変異処理を施すことは常に必要であるとは限らないことが実際上分った。
【００２２】倍数体菌株に突然変異誘発処理を施す場合、このため例えば２％グルコース、１％酵母エキスおよび２％プロトンを含有するＹＰＤ培地でこの菌株を生育させることができ、得た細胞は例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又はＩＣＲ−７０のような突然変異誘発剤により処理できる。
【００２３】従って、本発明方法の第２態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株は任意には突然変異誘発処理後胞子形成させる。この菌株を胞子形成させるために、この細胞は０．８％酵母エキス、０．３％ペプトン、１０％グルコースおよび２％寒天を含有するＰＳＡ培地のようないわゆる予備胞子形成培地で１又は２日生育させることができる。次にこれらは１％酢酸カリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％グルコースおよび２％寒天のような胞子形成培地に移し、３〜５日保持できる。次に胞子は例えば顕微操作で単離でき、倍数性低減菌株、換言すれば分離株は例えばＹＰＤ培地で発芽させることによりこれらから得ることができる。
【００２４】次にｌｔｉ性、特に約９〜１０℃の温度で不活性であるが、生存性を有するこの倍数体菌株の数個の分離株を選択することが好ましい。次に選択した分離株はｌｔｉ性を有しないが反対の接合型を有する倍数体菌株の他の分離株と少なくとも１回戻し交雑する。これは倍数体菌株が初めに又は任意の突然変異誘発処理後有しうる何らかの希望しない突然変異を回避し、および／又は可能ならば唯一の突然変異によりｌｔｉ性を保有するためである。数回の戻し交雑操作を行なう場合、ｌｔｉ性、特に約９〜１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも１つの分離株は連続２操作間で選択でき、この分離株は連続２操作の２番目の操作に供することができる。
【００２５】次に反対の接合型およびｌｔｉ性、特に約９〜１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑する。
【００２６】最後に、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株を選択する。このため、同じ選択基準を保持でき、この倍数体菌株は本発明方法の第１態様の最終工程と同じ試験を行なうことができる。
【００２７】従って、本発明方法の第２態様により冷蔵貯蔵後喫食直前にオーブンでベーキングするベーカリ品の製造に使用できる顕著なｌｔｉ性を有する菌株を作製することができる。特に、緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜９℃に冷蔵したマルトース含有培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき３０ｍｌ未満のＣＯ2 産生量および少なくとも１３℃の温度に保持したマルトース含有培地で６日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも６０ｍｌのＣＯ2 産生量を有するパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株を作製することができる。
【００２８】こうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株のうち、２株は例としてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ３１，１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ，ＡＢＥＲＤＥＥＮ ＡＢ９ ８ＤＧ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（英国）に１９９０年１１月６日ブダペスト条約により寄託し、番号ＮＣＩＭＢ ４０３３１およひ４０３３２を与えられた。
【００２９】本発明方法および得た菌株は次例により説明する。例中、％および部は特記しない限り重量による。例を記載する前に各種試験および各種使用培地の組成を記載し、図面の各種数字の簡単な記載および比較例を記載する。
【００３０】試験１．生育試験パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給方法をまねて、乳酸（Ｓ−ｌａｃ培地）エタノール（Ｓ−ＥｔＯＨ２％およびＳ−ＥｔＯＨ１％培地）およびグリセロール（ＹＰＧ培地）のような非発酵性炭素源を含有する各種培地を使用して生育試験を計画した。
【００３１】この試験の背後にある推測では、パン酵母は緩徐栄養物供給バッチ方法の過程で、蔗糖のような発酵性糖溶液の臨界的添加割合に応答して非発酵性炭素含有代謝産物を蓄積する。これらの代謝産物は代謝および酵母の呼吸に阻害および毒性効果を有する。高潜在的生育能を有する菌株はより高添加割合でこれらの毒性炭素含有代謝産物を蓄積でき、より低い潜在的生育能を有する菌株よりこれらの代謝産物の蓄積に対し感受性が低い。
【００３２】この生育試験の結果は菌株細胞の接種後培地プレートに３０℃の温度で３日間に形成するコロニーの寸法を図１に示す。各培地に相当する横のバンドはコロニーの平均観察寸法を０、０．５ｍｍ、０．５〜１．５ｍｍ、１．５〜２．５ｍｍ、２．５ｍｍの標線まで示す。
【００３３】２．ＣＯ2 産生テストこの試験は例えば発酵管の低端を導入できる各種温度のセルを有する温度勾配ブロックを含む特に設計した装置で行なう。これらの管は密閉され、目盛付上端および１端に連結した膨脹フラスコを有する。酵母が産生したＣＯ2 は各管の上部の目盛りを付した端部に蓄積し、培地は膨脹フラスコ中に通過しうる蓄積ガムにより置換される。
【００３４】この試験を行なうために、試験菌株をＹＰＤ培地に一夜培養したカルチャー２ｍｌを、名称「酵母窒素ベースＷ／Ｏアミノ酸」としてＤｉｆｃｏ Ｃｏｍｐａｎｙにより市販される商品のような、例えば０．５％酵母エキス、２％蔗糖、１％コハク酸ナトリウムおよびｐＨ４．５に調整する濃塩酸を含むアミノ酸を含まない０．６７％の窒素ベースを含有する５００ｍｌフラスコ中の２００ｍｌの第１培地中に接種する。全体を攪拌しながら３０℃で２４時間培養する。
【００３５】細胞は５分、６，０００ｇ／２０℃で遠心分離して分離し、次いで５００ｍｌフラスコ中のアミノ酸を含まない０．６７％の窒素ベース、０．３％の酵母エキスおよび０．３％蔗糖、１％のコハク酸ナトリウムおよびｐＨを４．５に調整する濃塩酸を含有する２００ｍｌの第２培地に懸濁させる。全体を３０℃で２４時間培養する。
【００３６】細胞は５分、６，０００ｇ／４℃で遠心分離して分離し、得た酵母細胞残渣は５０ｍｌ蒸留水により２回洗滌する。
【００３７】細胞は１０ｍｌの蒸留水に懸濁し、１５ｍｌの目盛り付きの予め秤量したポリプロピレン管に移す。これらは１０分３，０００ｇ／４℃で遠心分離する。管は水切りし、酵母残渣は秤量し、約２７％／ｍｌの乾物含量を有する０．５ｇの圧搾酵母に相当する０．６１ｇの酵母残渣量で、アミノ酸を含まない０．６７％窒素ベース、２％マルトース、１％コハク酸ナトリウムおよびｐＨを４．５に調整する濃塩酸を含有する第３培地に懸濁させる。０．５ｍｌ（≧１０℃の温度に対し）又は１ｍｌ（＜１０℃温度に対し）量をそれぞれ５０ｍｌの第３培地、換言すればマルトース含有培地を満たし、４℃に冷却した上記タイプの発酵管中に導入する。
【００３８】発酵管は上記濃度勾配ブロックに上記所望温度で培養する。ＣＯ2 の産生は管を超音波処理浴に数秒間浸漬して液体培地に保持されたＣＯ2 泡を遊離させた後選択した間隔で記録する。
【００３９】３．ドウ膨脹試験ドウを３０部の水、６０部の白色軟質小麦粉、１．４部の食塩および７．６部の落花生油を混合して調製する。試験菌株は１部の圧搾酵母量で小麦粉に添加する。次に２０ｃｍの直径および０．５ｃｍ厚さのピザの皮をドウから形成し、密封プラスチック包装中に８℃で２１時間貯蔵する。次にピザの皮は包装から取り出し、１８０℃で１５分オーブンでヘーキングする。
【００４０】ピザの皮が約２ｃｍの厚さを有し、かつ伝統的市販パン酵母を作用させて新たに膨脹させたドウから製造した類似のピザの皮のものに匹敵できる官能性、すなわち味およびテクスチャーを有する場合、試験に合格したと見做される。
【００４１】培地ＹＰＤグルコース ２％酵母エキス １％ペプトン ２％ＰＳＡグルコース １０％酵母エキス ０．８％ペプトン ０．３％寒天 ２％ＳＡグルコース ０．０５％酵母エキス ０．１％酢酸カリウム １％寒天 ２％Ｓ−ｌａｃアミノ酸を含まない窒素ベース ０．６７％乳酸 ０．５％寒天 ２％Ｓ−ＥｔＯＨ１％又は２％アミノ酸を含まない窒素ベース ０．６７％エタノール １％又は２％寒天 ２％ＹＰＧグリセロール ２％酵母エキス １％ペプトン ２％
【００４２】図面図１：直線はＳ−ｌａｃ、Ｓ ＥｔＯＨ１％および２％およびＹＰＧ培地にＮＣＩＭＢ ４０３２８、４０３２９、４０３３０、４０３３１、４０３３２および「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用）の菌株細胞を生育させて得たコロニーの大きさを示す。
【００４３】図２〜図７：マルトース培地に温度と時間の関数としてＮＣＩＭＢ ４０３２８（図２）、ＮＣＩＭＢ ４０３２９（図３）、ＮＣＩＭＢ ４０３３０（図４）、ＮＣＩＭＢ ４０３３１（図５）、ＮＣＩＭＢ ４０３３２（図６）および「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用、図７R>７）菌株のＣＯ2 産生レベルを三次元で示す。
【００４４】図８：３０℃のマルトース培地に時間の関数としてＮＣＩＭＢ４０３２８、４０３２９、４０３３０および４０３３２および「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用）菌株のＣＯ2 産生レベルを二次元で示す。
【００４５】比較例比較として、市販パン酵母菌株、すなわち「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ）の名称でＦｏｕｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙにより市販されるパン酵母を形成する菌株を潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する二倍体および倍数体を選択するために上記と同じ試験、すなわち上記１〜３の試験を行なう。図１に示す比較生育試験の結果は予期したようにＬＢＢ菌株がパン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法できわめて良好な生育力を有することを示した。比較ＣＯ2 産生試験結果は図７に示し、図からマルトース培地におけるＣＯ2 の産生は３〜５℃で６〜７日後、５〜９℃で５〜６日後および１０℃で３〜４日後圧搾酵母１ｇにつき４０ｍｌを超えることが分る。マルトース培地におけるＬＢＢ菌株のＣＯ2 産生は３０℃で約４時間後圧搾酵母１ｇにつき２０ｍｌを急速に超えることも図８から分る。ドウ膨脹能に対する比較試験結果はＬＢＢ菌株がオーブンでベーキング前に冷蔵貯蔵に適応しないことを示す。ＬＢＢ菌株を使用して得た密封プラスチック包装のピザの皮は８℃で１日後気球のようにふくらむ。対照的に、本発明方法により作製した菌株を使用し、一方で上記ドウ膨脹試験を行なったピザの皮とＬＢＢ菌株を使用し、冷蔵貯蔵せずに同じ試験を行ったピザの皮間の品質に識別できる差はほとんどないことが分る。
【００４６】例１出発菌株は伝統的実験室パン酵母を形成するもの、特に遺伝子型ＭＡＴａ ａｒｇ４−１７ ｈｉｓ４−３８ ｌｙｓ１−１ ｍｅｔ８−１ ｔｒｐ１−１ｍａｌを有する菌株（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ３１，１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ，ＡＢＥＲＤＥＥＮ ＡＢ９ ８ＤＧ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（英国）に１９９０年１１月６日にブダペスト条約のもとに寄託し、番号ＮＣＩＭＢ ４０３３３を得た）のようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株である。この菌株はＥＭＳにより突然変異誘発処理する。このため、この菌株細胞を５ｍｌのＹＰＤ培地に定常期まで生育させ、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で１回洗滌し、次いで１０8 細胞／ｍｌ量で同じ緩衝液に懸濁させる。３％容ＥＭＳを懸濁液に添加し、これは次に烈しく攪拌しながら３０℃で１時間反応させる。処理は１０倍容量の５％チオ硫酸ナトリウム溶液に懸濁液を稀釈して終了する。次に細胞は固体ＹＰＤ培地上に分配し、３０℃で２日培養する。次にこれらは固体ＹＰＤ培地上に再分配し、１０℃で３週培養してこれらのｌｔｉ性を試験する。その温度で不活性であるが生存性を有するいくつかの安定な突然変異株を次に選択する。接合型ＭＡＴａを有するこれらの突然変異株の１つは、次に例えば専門家には周知の遺伝子型ＭＡＴα ｃａｎｌｈｉｓ３−１１，１５ ｌｅｕ２−３，１１２を有する菌株ＧＲＦ１８（Ｇ．Ｒ，Ｆｉｎｋ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｉｎｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ０１ １４２，ＵＳＡ参照）のようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑する。１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴａ ｌｙｓ１ ｈｉｓ３／４ｔｒｐ１ ｍａｌを有するこの戻し交雑分離株を次に選択する。この分離株は出発菌株の突然変異株の戻し交雑に使用したものと同じ野生菌株と戻し交雑する。１０℃で明白なｌｔｉ性を示し、遺伝子型ＭＡＴα ｌｅｕ２ Ｈｉｓ３／４ｍａｌを有するこの戻し交雑の２分離株を次に選択する。これらの各２分離株は例えば専門家に周知の菌株１４０３−７Ａのような少なくとも１つのＭＡＬ遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑する（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇ ｂｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄＭｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂａｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ９４７２０，ＵＳＡ）。それぞれが１０℃で明白なｌｔｉ性を有するこれらの各分離株、１つは遺伝子型ＭＡＴａ ＭＡＬを有し、もう１つは遺伝子型ＭＡＴα ｌｅｕ２ ＭＡＬを有するものを選択する。これら２つの分離株は交雑し、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこの交雑により産生したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種二倍体菌株を選択する。こうして得た各種菌株のうち、上記菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８を例として寄託した。この菌株はパン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で比較的適度の潜在的生育能を有する。このことは上記生育試験で得た結果を説明する図１から分る。しかし、容易に上記の相当する試験に合格する。従って高いドウ発酵能を有することが分る。最後に、明白なｌｔｉ性を有する。このことは詳細に上記したＣＯ2 産生試験により測定して、マルトース培地で発酵温度および時間の関数としてそのＣＯ2 産生量で示す３次元図の図２R>２から分る。少なくとも約１週３〜１０℃で実質的に不活性であるが生存し、約１３〜１４℃で約６〜７日後有意な活性を回復しうることが分る。特に、そのＣＯ2 産生量は３〜８℃で７日後尚雰であり、１０℃で７日後圧搾酵母１ｇにつき約８ｍｌに上昇するに過ぎないことが分る。対照的に、マルトース培地におけるそのＣＯ2 産生量は１３〜１４℃で６日後４０ｍｌ／ｇ以上に増加する。マルトース培地におけるそのＣＯ2 産生量は３０℃で約２時間後２０ｍｌ／ｇ以上に急上昇する。さらに、菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８は次の特徴を示す：形態長円形細胞。ある細胞は大きさを増し、偽菌糸を形成する。
糖の発酵菌株は蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
【００４７】例２使用出発菌株および手順は双方共１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴα ｌｅｕ２ ｈｉｓ３／４ ｍａｌを有する２つの戻し交雑分離株の選択まで例１記載の通りである。これらの２つの分離株のうちの１つは例えば当業者に周知の遺伝子型ＭＡＴαＣＵＰ１ ＳＵＣ２ ｇａ１２ ｍａｌ ｍｅｌを有する菌株Ｘ２１８０−１ＡのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑させる（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇ参照）。１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴαｈｉｓ３／４ ｌｅｕ２ｍａｌを有するこの戻し交雑分離株を選択する。この分離株は上記と同じ菌株Ｘ２１８０−１Ａと戻し交雑して栄養要求性変異ｈｉｓ３／４およびｌｅｕ２を除去する。遺伝子型ＭＡＴα ｍａｌおよび１回の突然変異により１０℃で有意なｌｔｉ性、換言すればｌｔｉ性に関し完全な２：２分離を有するこの戻し交雑分離株を選択する。この分離株は例えば専門家に周知の菌株１４０３−７Ａのような少なくとも１つのＭＡＬ遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑する（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｇ参照）。一方では１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴα ＭＡＬを有するこの１つの戻し交雑分離株、他方では１０℃で明白および非常に明白なｌｔｉ性をそれぞれ示し、それぞれが表現型ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｍａｌを有するこの戻し交雑の２分離株を選択する。これら２つの最後の分離株は最初のものと交雑し、それぞれ潜在的生育能、ｌｔｉ性およひドウ膨脹能を有するこれら２つの交雑により産生したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種二倍体菌株を選択する。こうして得た各種菌株のうち、例として寄託した上記菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２９およびＮＣＩＭＢ ４０３３０はそれぞれこれら２つの交雑の１つにより産生した。これらの２菌株は図１から分るように、パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で比較的良好な潜在的生育能を有する。これらは容易に上記相当する試験に合格することから良好なドウ膨脹能をも有する。最後に、これらは著しいｌｔｉ性を有する。これらは少なくとも約１週間３〜１０℃のマルトース培地で実質的に不活性であるが生存し、約１１〜１４℃で約５〜７日後有意な活性を回復しうることは図３から分る。特に、これらのＣＯ2 産生量は３〜９℃で７日後尚雰付近であり、１０℃で７日後約１２ｍｌ／１ｇ圧搾酵母に上昇するに過ぎないことが分る。対照的に、これらのＣＯ2 産生レベルは１２〜１４℃で６日後４０ｍｌ／ｇ以上に増加する。マルトース培地におけるこれらのＣＯ2 産生量は３０℃で約１．５時間後２０ｍｌ／ｇ以上に急増することが図８から分る。さらに、これらの菌株は次の特徴を示す：ＮＣＩＭＢ ４０３２９形態：長円形細胞。細胞の大きさは比較的均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
ＮＣＩＭＢ ４０３３０形態：長円形細胞。細胞の大きさは比較的均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
【００４８】例３出発菌株は名称「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」としてＦｏｕｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙが市販するパン酵母を形成するようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの市販倍数体菌株であり、この細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株の細胞より３〜４倍多くＤＮＡを含有する。この菌株に胞子を形成させるために、その細胞を３０℃で２日ＰＳＡ予備胞子形成培地に生育させる。次にこれらはＳＡ胞子形成培地に移し、そこで３０℃で４日保持する。次に胞子を単離し、ＹＰＤ培地で発芽させ、菌株、すなわち倍数性の低減した分離株を得る。１０℃で非常に明白なｌｔｉ性、さらに接合型ＭＡＴαを有するこれらの分離株の１つを選択する。この分離株はｌｔｉ性を示さず、接合型ＭＡＴａを有しない倍数性の低減した別の分離株と戻し交雑する。１０℃で非常に明白なｌｔｉおよび１つの接合型を有するこの戻し交雑のいくつかの分離株を選択する。反対の接合型を有する分離株は数回交雑し、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこれらの交雑により産生したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種倍数体菌株を選択する。こうして得た各種菌株のうち、上記菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３１およひＮＣＩＭＢ ４０３３２は例として寄託した。特に、これら２つの菌株は図１から分るように、パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で非常に良好な潜在的生育能を有する。これらは容易に上記相当する試験に合格することから良好なドウ膨脹能をも有する。最後に、これらは明白なｌｔｉ性を有する。これらは少なくとも４〜５日間３〜９℃のマルトース培地で実質的に不活性であるが生存し、約１０〜１３℃で約５〜７日後有意な活性を回復しうることは図５および６から分る。特に、これらのＣＯ2 産生量は３〜９℃で５日後尚雰付近であり、３〜９℃で７日後圧搾酵母１ｇにつき約２０〜２５ｍｌに急上昇するに過ぎないことが分る。対照的に、これらのＣＯ2 産生量は１２〜１４℃で５日後６０ｍｌ／ｇ以上に増加する。マルトース培地における菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３２のＣＯ2 産生レベルは３０℃で約４時間後２０ｍｌ／ｇ以上に急増することも図８から分る。さらに、これらの菌株は次の特徴を有する：ＮＣＩＭＢ ４０３３１形態：円形細胞。細胞の大きさは均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
ＮＣＩＭＢ ４０３３２形態：円形細胞。細胞の大きさは均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は各種培地に各種菌株を培養して得たコロニーの大きさを示す。
【図２】図２は菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図３】図３は菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２９によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図４】図４は菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３０によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図５】図５はＮＣＩＭＢ ４０３３１によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図６】図６はＮＣＩＭＢ ４０３３２によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図７】図７は「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用）によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図８】図８は各種菌株による３０℃のマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を時間の関数として示す。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はｌｔｉ性を有するパン酵母菌株の作製方法および本方法により作製した酵母菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】特に伝統的遺伝学に基礎をおくパン酵母菌株を作製する各種既知方法があり、これらはベーカリに有用な特性を有する菌株を供しようと努めている。例えば、米国特許第４，５４７，３７４号明細書は冷蔵耐性があり、発酵およびベーキング前に冷蔵するためのパンドウの製造にパン酵母として使用できるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種菌株を選択的にハイブリド化することにより作製することを記載する。
【０００３】米国特許第４，３４１，８７１号明細書は圧搾形にしてもこれらの活性が過度に失われずに脱水できるパン酵母のハイブリドを記載する。米国特許第４，６４３，９０１号明細書は甘味性および無甘味性ドウの双方を発酵し、膨脹することができ、「プチット」突然変異株の原形質融合によりハイブリド化して得られるパン酵母の純粋菌株を記載する。発酵およびベーキング前冷蔵貯蔵するベーカリ品も既知である。しかし、例えばロールおよびクロワッサンのような製品は化学膨脹剤を含有する。
【０００４】本発明の課題はｌｔｉ性、すなわち冷蔵下で不活性であるが生存性（ｌｔｉは英語「ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ」の略語である）を有し、かつ例えば冷蔵庫、低温室又は冷蔵棚で貯蔵後喫食直前にオーブンでべーキングするベーカリ品の製造にパン酵母として使用できるパン酵母菌株の作製方法およびこのように作製した菌株を供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】このため、ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株を作製する本発明方法の第１態様は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株を突然変異誘発処理し、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの突然変異株を選択し、反対の接合型を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑し、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウの膨脹能を有するこうして得た二倍体菌株を選択することを特徴とする。
【０００６】本発明において、「潜在的生育能」とは工業的に実施しうる培養方法、特に緩徐栄養物供給バッチ方法（酵母サスペンジョンに通気しながら糖溶液をゆっくりかつ徐々に添加してバイオマスの産生中アルコールの形成を回避し、収量を最高にする）として既知のパン酵母の伝統的培養方法により高収量かつすぐれた生産性で培養できる能力をいう。
【０００７】同様に、「ドウ膨脹能」とは例えばドウが吸収しうるＣＯ2 、およびドウの保存料として作用しうるアルコールのような代謝産物を非常にゆっくり産生させることにより、冷蔵温度でドウを非常にゆっくり変形する能力と解される。非常にゆっくりした変形の結果は、例えばドウを冷蔵庫、低温室又は冷蔵棚に貯蔵後、直接オーブンに入れる場合、ドウは膨脹しうることである。
【０００８】ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株を作製する本発明方法の第２態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体は任意には突然変異誘発処理し、次いで胞子を形成させ、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの分離株を選択し、反対の接合型を有するこの菌株の別の分離株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑し、こうして得た潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する倍数体菌株を選択する。
【０００９】この方法により通例の冷蔵温度で、特に３〜９又は１０℃の温度で実質的に不活性であるが、これらの温度で生存し、次いで例えば１３〜１４℃のオーダのより高い温度でこれらの活性を回復する性質を有するパン酵母菌株を作製することができた。
【００１０】従って、このタイプのパン酵母菌株は冷蔵後喫食する直前にオーブンでベーキングするベーカリ品の製造に化学膨脹剤の代りに使用できる。これらは例えば、ロール、クロワッサンおよびピザの皮又は台所で混捏するドウのような呼び成形品の製造に特に使用できる。これらは冷蔵後、オーブンでベーキングすると、従来の市販パン酵母を使用して新たに膨脹させてオーブンでベーキングした同じものに匹敵できる官能性を有する。このタイプの菌株は冷蔵貯蔵する食品に温度誤用指示器として使用することもできる。
【００１１】従って、本発明方法は例えば、従来の実験室パン酵母を形成するもののようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株、又は従来の市販パン酵母を形成するもののようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株から出発できる。
【００１２】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株から出発する本発明方法の上記第１態様では、この菌株を突然変異誘発処理する。このため、この菌株の細胞は例えば２％グルコース、１％酵母エキスおよび２％ペプトンを含有するＹＰＤ培地に生育させることができ、細胞は例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又はＩＣＲ−１７０のような突然変異誘発剤により処理できる。
【００１３】ｌｔｉ性、特に９又は１０℃のオーダの温度で不活性であるが生存性を有するいくつかの突然変異株を選択することが好ましい。
【００１４】次に選択した突然変異株は反対の接合型を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と少なくとも１回戻し交雑して出発半数体菌株が最初に、又はその突然変異誘発処理後有しうる何らかの希望しない突然変異を回避し、および／又は可能な場合唯一回の突然変異によりｌｔｉ性を保有させる。数回の戻し交雑操作を行なう場合、ｌｔｉ性、特に約９又は１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも１つの分離株を２つの連続操作間で選択することができ、こうして選択した分離株はこれらの２つの連続操作の２番目にかける。
【００１５】次に反対の接合型およびｌｔｉ性、特に約９又は１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑する。
【００１６】最後に、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの二倍体菌株を選択する。この最後の段階で前の段階で使用したものより一層きびしく、かつ一層完全な選択基準を保持できる。特に、パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で二倍体菌株に生育試験を行なうことができる。
【００１７】次にｌｔｉ性はマルトース含有栄養培地、すなわち炭素源としてマルトースを含有する栄養培地で、例えば３〜７日間の毎日時間の関数としておよび例えば３〜１４℃間のすべての温度で温度の関数として二倍体菌株にＣＯ2 産生試験を行なうことにより証明できる。
【００１８】最後に、菌株のドウ膨脹能はピザドウに唯一の膨脹剤として菌株を添加することにより、例えばこのドウでピザの皮を形成し、これを数日又は数週冷蔵温度で貯蔵し、次いでオーブンでベーキングすることにより証明できる。この試験はマルトース含有培地で、例えば約２０〜３０℃の温度で菌株のＣＯ2 産生を証明することにより完了することもできる。
【００１９】従って、本発明方法の第１態様により冷蔵貯蔵後喫食直前にオーブンでベーキングするベーキング品の製造に使用できる顕著なｌｔｉ性を有する菌株を作製することができる。特に、緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜１０℃に冷蔵したマルトース含有培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき２０ｍｌ未満のＣＯ2 産生レベルおよび少なくとも１４℃の温度に保持したマルトース含有培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも４０ｍｌのＣＯ2 産生レベルを有するパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株を作製することができる。
【００２０】こうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株のうち、３菌株を例としてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ）、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ３１，１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ，ＡＢＥＲＤＥＥＮ ＡＢ９ ８ＤＧ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（英国）に１９９０年１１月６日ブタペスト条約により寄託し、番号ＮＣＩＭＢ４０３２８、４０３２９および４０３３０を与えられた。
【００２１】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株から出発する本発明方法の第２態様では、この菌株は任意には突然変異誘発処理する。例えばある種の市販パン酵母は本発明方法の間に検知しうる突然変異を初めに示すので菌株に突然変異処理を施すことは常に必要であるとは限らないことが実際上分った。
【００２２】倍数体菌株に突然変異誘発処理を施す場合、このため例えば２％グルコース、１％酵母エキスおよび２％プロトンを含有するＹＰＤ培地でこの菌株を生育させることができ、得た細胞は例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又はＩＣＲ−７０のような突然変異誘発剤により処理できる。
【００２３】従って、本発明方法の第２態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株は任意には突然変異誘発処理後胞子形成させる。この菌株を胞子形成させるために、この細胞は０．８％酵母エキス、０．３％ペプトン、１０％グルコースおよび２％寒天を含有するＰＳＡ培地のようないわゆる予備胞子形成培地で１又は２日生育させることができる。次にこれらは１％酢酸カリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％グルコースおよび２％寒天のような胞子形成培地に移し、３〜５日保持できる。次に胞子は例えば顕微操作で単離でき、倍数性低減菌株、換言すれば分離株は例えばＹＰＤ培地で発芽させることによりこれらから得ることができる。
【００２４】次にｌｔｉ性、特に約９〜１０℃の温度で不活性であるが、生存性を有するこの倍数体菌株の数個の分離株を選択することが好ましい。次に選択した分離株はｌｔｉ性を有しないが反対の接合型を有する倍数体菌株の他の分離株と少なくとも１回戻し交雑する。これは倍数体菌株が初めに又は任意の突然変異誘発処理後有しうる何らかの希望しない突然変異を回避し、および／又は可能ならば唯一の突然変異によりｌｔｉ性を保有するためである。数回の戻し交雑操作を行なう場合、ｌｔｉ性、特に約９〜１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも１つの分離株は連続２操作間で選択でき、この分離株は連続２操作の２番目の操作に供することができる。
【００２５】次に反対の接合型およびｌｔｉ性、特に約９〜１０℃の温度で不活性であるが生存性を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、少なくとも１回交雑する。
【００２６】最後に、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株を選択する。このため、同じ選択基準を保持でき、この倍数体菌株は本発明方法の第１態様の最終工程と同じ試験を行なうことができる。
【００２７】従って、本発明方法の第２態様により冷蔵貯蔵後喫食直前にオーブンでベーキングするベーカリ品の製造に使用できる顕著なｌｔｉ性を有する菌株を作製することができる。特に、緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜９℃に冷蔵したマルトース含有培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき３０ｍｌ未満のＣＯ2 産生量および少なくとも１３℃の温度に保持したマルトース含有培地で６日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも６０ｍｌのＣＯ2 産生量を有するパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株を作製することができる。
【００２８】こうして得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株のうち、２株は例としてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ３１，１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ，ＡＢＥＲＤＥＥＮ ＡＢ９ ８ＤＧ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（英国）に１９９０年１１月６日ブダペスト条約により寄託し、番号ＮＣＩＭＢ ４０３３１およひ４０３３２を与えられた。
【００２９】本発明方法および得た菌株は次例により説明する。例中、％および部は特記しない限り重量による。例を記載する前に各種試験および各種使用培地の組成を記載し、図面の各種数字の簡単な記載および比較例を記載する。
【００３０】試験１．生育試験パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給方法をまねて、乳酸（Ｓ−ｌａｃ培地）エタノール（Ｓ−ＥｔＯＨ２％およびＳ−ＥｔＯＨ１％培地）およびグリセロール（ＹＰＧ培地）のような非発酵性炭素源を含有する各種培地を使用して生育試験を計画した。
【００３１】この試験の背後にある推測では、パン酵母は緩徐栄養物供給バッチ方法の過程で、蔗糖のような発酵性糖溶液の臨界的添加割合に応答して非発酵性炭素含有代謝産物を蓄積する。これらの代謝産物は代謝および酵母の呼吸に阻害および毒性効果を有する。高潜在的生育能を有する菌株はより高添加割合でこれらの毒性炭素含有代謝産物を蓄積でき、より低い潜在的生育能を有する菌株よりこれらの代謝産物の蓄積に対し感受性が低い。
【００３２】この生育試験の結果は菌株細胞の接種後培地プレートに３０℃の温度で３日間に形成するコロニーの寸法を図１に示す。各培地に相当する横のバンドはコロニーの平均観察寸法を０、０．５ｍｍ、０．５〜１．５ｍｍ、１．５〜２．５ｍｍ、２．５ｍｍの標線まで示す。
【００３３】２．ＣＯ2 産生テストこの試験は例えば発酵管の低端を導入できる各種温度のセルを有する温度勾配ブロックを含む特に設計した装置で行なう。これらの管は密閉され、目盛付上端および１端に連結した膨脹フラスコを有する。酵母が産生したＣＯ2 は各管の上部の目盛りを付した端部に蓄積し、培地は膨脹フラスコ中に通過しうる蓄積ガムにより置換される。
【００３４】この試験を行なうために、試験菌株をＹＰＤ培地に一夜培養したカルチャー２ｍｌを、名称「酵母窒素ベースＷ／Ｏアミノ酸」としてＤｉｆｃｏ Ｃｏｍｐａｎｙにより市販される商品のような、例えば０．５％酵母エキス、２％蔗糖、１％コハク酸ナトリウムおよびｐＨ４．５に調整する濃塩酸を含むアミノ酸を含まない０．６７％の窒素ベースを含有する５００ｍｌフラスコ中の２００ｍｌの第１培地中に接種する。全体を攪拌しながら３０℃で２４時間培養する。
【００３５】細胞は５分、６，０００ｇ／２０℃で遠心分離して分離し、次いで５００ｍｌフラスコ中のアミノ酸を含まない０．６７％の窒素ベース、０．３％の酵母エキスおよび０．３％蔗糖、１％のコハク酸ナトリウムおよびｐＨを４．５に調整する濃塩酸を含有する２００ｍｌの第２培地に懸濁させる。全体を３０℃で２４時間培養する。
【００３６】細胞は５分、６，０００ｇ／４℃で遠心分離して分離し、得た酵母細胞残渣は５０ｍｌ蒸留水により２回洗滌する。
【００３７】細胞は１０ｍｌの蒸留水に懸濁し、１５ｍｌの目盛り付きの予め秤量したポリプロピレン管に移す。これらは１０分３，０００ｇ／４℃で遠心分離する。管は水切りし、酵母残渣は秤量し、約２７％／ｍｌの乾物含量を有する０．５ｇの圧搾酵母に相当する０．６１ｇの酵母残渣量で、アミノ酸を含まない０．６７％窒素ベース、２％マルトース、１％コハク酸ナトリウムおよびｐＨを４．５に調整する濃塩酸を含有する第３培地に懸濁させる。０．５ｍｌ（≧１０℃の温度に対し）又は１ｍｌ（＜１０℃温度に対し）量をそれぞれ５０ｍｌの第３培地、換言すればマルトース含有培地を満たし、４℃に冷却した上記タイプの発酵管中に導入する。
【００３８】発酵管は上記濃度勾配ブロックに上記所望温度で培養する。ＣＯ2 の産生は管を超音波処理浴に数秒間浸漬して液体培地に保持されたＣＯ2 泡を遊離させた後選択した間隔で記録する。
【００３９】３．ドウ膨脹試験ドウを３０部の水、６０部の白色軟質小麦粉、１．４部の食塩および７．６部の落花生油を混合して調製する。試験菌株は１部の圧搾酵母量で小麦粉に添加する。次に２０ｃｍの直径および０．５ｃｍ厚さのピザの皮をドウから形成し、密封プラスチック包装中に８℃で２１時間貯蔵する。次にピザの皮は包装から取り出し、１８０℃で１５分オーブンでヘーキングする。
【００４０】ピザの皮が約２ｃｍの厚さを有し、かつ伝統的市販パン酵母を作用させて新たに膨脹させたドウから製造した類似のピザの皮のものに匹敵できる官能性、すなわち味およびテクスチャーを有する場合、試験に合格したと見做される。
【００４１】培地ＹＰＤグルコース ２％酵母エキス １％ペプトン ２％ＰＳＡグルコース １０％酵母エキス ０．８％ペプトン ０．３％寒天 ２％ＳＡグルコース ０．０５％酵母エキス ０．１％酢酸カリウム １％寒天 ２％Ｓ−ｌａｃアミノ酸を含まない窒素ベース ０．６７％乳酸 ０．５％寒天 ２％Ｓ−ＥｔＯＨ１％又は２％アミノ酸を含まない窒素ベース ０．６７％エタノール １％又は２％寒天 ２％ＹＰＧグリセロール ２％酵母エキス １％ペプトン ２％
【００４２】図面図１：直線はＳ−ｌａｃ、Ｓ ＥｔＯＨ１％および２％およびＹＰＧ培地にＮＣＩＭＢ ４０３２８、４０３２９、４０３３０、４０３３１、４０３３２および「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用）の菌株細胞を生育させて得たコロニーの大きさを示す。
【００４３】図２〜図７：マルトース培地に温度と時間の関数としてＮＣＩＭＢ ４０３２８（図２）、ＮＣＩＭＢ ４０３２９（図３）、ＮＣＩＭＢ ４０３３０（図４）、ＮＣＩＭＢ ４０３３１（図５）、ＮＣＩＭＢ ４０３３２（図６）および「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用、図７R>７）菌株のＣＯ2 産生レベルを三次元で示す。
【００４４】図８：３０℃のマルトース培地に時間の関数としてＮＣＩＭＢ４０３２８、４０３２９、４０３３０および４０３３２および「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用）菌株のＣＯ2 産生レベルを二次元で示す。
【００４５】比較例比較として、市販パン酵母菌株、すなわち「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ）の名称でＦｏｕｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙにより市販されるパン酵母を形成する菌株を潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する二倍体および倍数体を選択するために上記と同じ試験、すなわち上記１〜３の試験を行なう。図１に示す比較生育試験の結果は予期したようにＬＢＢ菌株がパン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法できわめて良好な生育力を有することを示した。比較ＣＯ2 産生試験結果は図７に示し、図からマルトース培地におけるＣＯ2 の産生は３〜５℃で６〜７日後、５〜９℃で５〜６日後および１０℃で３〜４日後圧搾酵母１ｇにつき４０ｍｌを超えることが分る。マルトース培地におけるＬＢＢ菌株のＣＯ2 産生は３０℃で約４時間後圧搾酵母１ｇにつき２０ｍｌを急速に超えることも図８から分る。ドウ膨脹能に対する比較試験結果はＬＢＢ菌株がオーブンでベーキング前に冷蔵貯蔵に適応しないことを示す。ＬＢＢ菌株を使用して得た密封プラスチック包装のピザの皮は８℃で１日後気球のようにふくらむ。対照的に、本発明方法により作製した菌株を使用し、一方で上記ドウ膨脹試験を行なったピザの皮とＬＢＢ菌株を使用し、冷蔵貯蔵せずに同じ試験を行ったピザの皮間の品質に識別できる差はほとんどないことが分る。
【００４６】例１出発菌株は伝統的実験室パン酵母を形成するもの、特に遺伝子型ＭＡＴａ ａｒｇ４−１７ ｈｉｓ４−３８ ｌｙｓ１−１ ｍｅｔ８−１ ｔｒｐ１−１ｍａｌを有する菌株（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ３１，１３５ Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ，ＡＢＥＲＤＥＥＮ ＡＢ９ ８ＤＧ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（英国）に１９９０年１１月６日にブダペスト条約のもとに寄託し、番号ＮＣＩＭＢ ４０３３３を得た）のようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株である。この菌株はＥＭＳにより突然変異誘発処理する。このため、この菌株細胞を５ｍｌのＹＰＤ培地に定常期まで生育させ、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で１回洗滌し、次いで１０8 細胞／ｍｌ量で同じ緩衝液に懸濁させる。３％容ＥＭＳを懸濁液に添加し、これは次に烈しく攪拌しながら３０℃で１時間反応させる。処理は１０倍容量の５％チオ硫酸ナトリウム溶液に懸濁液を稀釈して終了する。次に細胞は固体ＹＰＤ培地上に分配し、３０℃で２日培養する。次にこれらは固体ＹＰＤ培地上に再分配し、１０℃で３週培養してこれらのｌｔｉ性を試験する。その温度で不活性であるが生存性を有するいくつかの安定な突然変異株を次に選択する。接合型ＭＡＴａを有するこれらの突然変異株の１つは、次に例えば専門家には周知の遺伝子型ＭＡＴα ｃａｎｌｈｉｓ３−１１，１５ ｌｅｕ２−３，１１２を有する菌株ＧＲＦ１８（Ｇ．Ｒ，Ｆｉｎｋ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｉｎｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ０１ １４２，ＵＳＡ参照）のようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑する。１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴａ ｌｙｓ１ ｈｉｓ３／４ｔｒｐ１ ｍａｌを有するこの戻し交雑分離株を次に選択する。この分離株は出発菌株の突然変異株の戻し交雑に使用したものと同じ野生菌株と戻し交雑する。１０℃で明白なｌｔｉ性を示し、遺伝子型ＭＡＴα ｌｅｕ２ Ｈｉｓ３／４ｍａｌを有するこの戻し交雑の２分離株を次に選択する。これらの各２分離株は例えば専門家に周知の菌株１４０３−７Ａのような少なくとも１つのＭＡＬ遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑する（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇ ｂｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄＭｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂａｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ９４７２０，ＵＳＡ）。それぞれが１０℃で明白なｌｔｉ性を有するこれらの各分離株、１つは遺伝子型ＭＡＴａ ＭＡＬを有し、もう１つは遺伝子型ＭＡＴα ｌｅｕ２ ＭＡＬを有するものを選択する。これら２つの分離株は交雑し、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこの交雑により産生したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種二倍体菌株を選択する。こうして得た各種菌株のうち、上記菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８を例として寄託した。この菌株はパン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で比較的適度の潜在的生育能を有する。このことは上記生育試験で得た結果を説明する図１から分る。しかし、容易に上記の相当する試験に合格する。従って高いドウ発酵能を有することが分る。最後に、明白なｌｔｉ性を有する。このことは詳細に上記したＣＯ2 産生試験により測定して、マルトース培地で発酵温度および時間の関数としてそのＣＯ2 産生量で示す３次元図の図２R>２から分る。少なくとも約１週３〜１０℃で実質的に不活性であるが生存し、約１３〜１４℃で約６〜７日後有意な活性を回復しうることが分る。特に、そのＣＯ2 産生量は３〜８℃で７日後尚雰であり、１０℃で７日後圧搾酵母１ｇにつき約８ｍｌに上昇するに過ぎないことが分る。対照的に、マルトース培地におけるそのＣＯ2 産生量は１３〜１４℃で６日後４０ｍｌ／ｇ以上に増加する。マルトース培地におけるそのＣＯ2 産生量は３０℃で約２時間後２０ｍｌ／ｇ以上に急上昇する。さらに、菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８は次の特徴を示す：形態長円形細胞。ある細胞は大きさを増し、偽菌糸を形成する。
糖の発酵菌株は蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
【００４７】例２使用出発菌株および手順は双方共１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴα ｌｅｕ２ ｈｉｓ３／４ ｍａｌを有する２つの戻し交雑分離株の選択まで例１記載の通りである。これらの２つの分離株のうちの１つは例えば当業者に周知の遺伝子型ＭＡＴαＣＵＰ１ ＳＵＣ２ ｇａ１２ ｍａｌ ｍｅｌを有する菌株Ｘ２１８０−１ＡのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑させる（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇ参照）。１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴαｈｉｓ３／４ ｌｅｕ２ｍａｌを有するこの戻し交雑分離株を選択する。この分離株は上記と同じ菌株Ｘ２１８０−１Ａと戻し交雑して栄養要求性変異ｈｉｓ３／４およびｌｅｕ２を除去する。遺伝子型ＭＡＴα ｍａｌおよび１回の突然変異により１０℃で有意なｌｔｉ性、換言すればｌｔｉ性に関し完全な２：２分離を有するこの戻し交雑分離株を選択する。この分離株は例えば専門家に周知の菌株１４０３−７Ａのような少なくとも１つのＭＡＬ遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と戻し交雑する（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｇ参照）。一方では１０℃で明白なｌｔｉ性および遺伝子型ＭＡＴα ＭＡＬを有するこの１つの戻し交雑分離株、他方では１０℃で明白および非常に明白なｌｔｉ性をそれぞれ示し、それぞれが表現型ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｍａｌを有するこの戻し交雑の２分離株を選択する。これら２つの最後の分離株は最初のものと交雑し、それぞれ潜在的生育能、ｌｔｉ性およひドウ膨脹能を有するこれら２つの交雑により産生したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種二倍体菌株を選択する。こうして得た各種菌株のうち、例として寄託した上記菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２９およびＮＣＩＭＢ ４０３３０はそれぞれこれら２つの交雑の１つにより産生した。これらの２菌株は図１から分るように、パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で比較的良好な潜在的生育能を有する。これらは容易に上記相当する試験に合格することから良好なドウ膨脹能をも有する。最後に、これらは著しいｌｔｉ性を有する。これらは少なくとも約１週間３〜１０℃のマルトース培地で実質的に不活性であるが生存し、約１１〜１４℃で約５〜７日後有意な活性を回復しうることは図３から分る。特に、これらのＣＯ2 産生量は３〜９℃で７日後尚雰付近であり、１０℃で７日後約１２ｍｌ／１ｇ圧搾酵母に上昇するに過ぎないことが分る。対照的に、これらのＣＯ2 産生レベルは１２〜１４℃で６日後４０ｍｌ／ｇ以上に増加する。マルトース培地におけるこれらのＣＯ2 産生量は３０℃で約１．５時間後２０ｍｌ／ｇ以上に急増することが図８から分る。さらに、これらの菌株は次の特徴を示す：ＮＣＩＭＢ ４０３２９形態：長円形細胞。細胞の大きさは比較的均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
ＮＣＩＭＢ ４０３３０形態：長円形細胞。細胞の大きさは比較的均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
【００４８】例３出発菌株は名称「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」としてＦｏｕｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙが市販するパン酵母を形成するようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの市販倍数体菌株であり、この細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株の細胞より３〜４倍多くＤＮＡを含有する。この菌株に胞子を形成させるために、その細胞を３０℃で２日ＰＳＡ予備胞子形成培地に生育させる。次にこれらはＳＡ胞子形成培地に移し、そこで３０℃で４日保持する。次に胞子を単離し、ＹＰＤ培地で発芽させ、菌株、すなわち倍数性の低減した分離株を得る。１０℃で非常に明白なｌｔｉ性、さらに接合型ＭＡＴαを有するこれらの分離株の１つを選択する。この分離株はｌｔｉ性を示さず、接合型ＭＡＴａを有しない倍数性の低減した別の分離株と戻し交雑する。１０℃で非常に明白なｌｔｉおよび１つの接合型を有するこの戻し交雑のいくつかの分離株を選択する。反対の接合型を有する分離株は数回交雑し、潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有するこれらの交雑により産生したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種倍数体菌株を選択する。こうして得た各種菌株のうち、上記菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３１およひＮＣＩＭＢ ４０３３２は例として寄託した。特に、これら２つの菌株は図１から分るように、パン酵母を培養する伝統的緩徐栄養物供給バッチ方法で非常に良好な潜在的生育能を有する。これらは容易に上記相当する試験に合格することから良好なドウ膨脹能をも有する。最後に、これらは明白なｌｔｉ性を有する。これらは少なくとも４〜５日間３〜９℃のマルトース培地で実質的に不活性であるが生存し、約１０〜１３℃で約５〜７日後有意な活性を回復しうることは図５および６から分る。特に、これらのＣＯ2 産生量は３〜９℃で５日後尚雰付近であり、３〜９℃で７日後圧搾酵母１ｇにつき約２０〜２５ｍｌに急上昇するに過ぎないことが分る。対照的に、これらのＣＯ2 産生量は１２〜１４℃で５日後６０ｍｌ／ｇ以上に増加する。マルトース培地における菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３２のＣＯ2 産生レベルは３０℃で約４時間後２０ｍｌ／ｇ以上に急増することも図８から分る。さらに、これらの菌株は次の特徴を有する：ＮＣＩＭＢ ４０３３１形態：円形細胞。細胞の大きさは均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
ＮＣＩＭＢ ４０３３２形態：円形細胞。細胞の大きさは均質。
糖の発酵：蔗糖、マルトースおよびグルコースを発酵できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は各種培地に各種菌株を培養して得たコロニーの大きさを示す。
【図２】図２は菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図３】図３は菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２９によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図４】図４は菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３０によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図５】図５はＮＣＩＭＢ ４０３３１によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図６】図６はＮＣＩＭＢ ４０３３２によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図７】図７は「ｌｅｖｕｒｅ ｂｏｕｌａｎｇｉｒｅ ｂｌｅｕｅ」（ＬＢＢ、比較用）によるマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を温度および時間の関数として示す。
【図８】図８は各種菌株による３０℃のマルトース培地におけるＣＯ2 産生量を時間の関数として示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株を突然変異誘発処理し、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの突然変異株を選択し、反対の接合型を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、次いで少なくとも１回交雑し、こうして得た潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する二倍体菌株を選択することを特徴とする、ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株の作製方法。
【請求項２】 選択する二倍体菌株のｌｔｉ性を証明するために、炭素源としてマルトースを含有する栄養培地で３〜１４℃の範囲の温度で数日間ＣＯ2 産生試験を行なう、請求項１記載の方法。
【請求項３】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株を任意には突然変異誘発処理し、次いで胞子を形成させ、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの分離株を選択し、反対の接合型を有するこの菌株の別の分離株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、次いで少なくとも１回交雑し、こうして得た潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する倍数体菌株を選択することを特徴とする、ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株の作製方法。
【請求項４】 選択する倍数体菌株のｌｔｉ性を証明するために、炭素源としてマルトースを含有する栄養培地で３〜１４℃の範囲の温度で数日間ＣＯ2 産生試験を行なう、請求項３記載の方法。
【請求項５】 緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜１０℃に冷蔵したマルトース培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき２０ｍｌ未満のＣＯ2 産生レベルおよび少なくとも１４℃の温度に保持したマルトース培地で６日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも４０ｍｌのＣＯ2 産生量を有する、請求項１又は２記載の方法により得たパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株。
【請求項６】 緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜９℃に冷蔵したマルトース培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき３０ｍｌ未満のＣＯ2 産生量および少なくとも１３℃の温度に保持したマルトース培地で６日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも６０ｍｌのＣＯ2 産生量を有する、請求項３又は４記載の方法により得たパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株。
【請求項７】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８、４０３２９およひ４０３３０から成る群から選択する、請求項５記載のパン酵母菌株。
【請求項８】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３１および４０３３２から成る群から選択する、請求項６記載のパン酵母菌株。
【請求項９】 冷蔵貯蔵後オーブンでベーキングするベーカリ品の製造に請求項５〜８のいずれか１項に記載のパン酵母菌株の使用。
【請求項１０】 冷蔵貯蔵する食品に温度誤用表示器として請求項５〜８のいずれか１項に記載のパン酵母菌株の使用。
【請求項１】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株を突然変異誘発処理し、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの突然変異株を選択し、反対の接合型を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生半数体菌株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、次いで少なくとも１回交雑し、こうして得た潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する二倍体菌株を選択することを特徴とする、ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株の作製方法。
【請求項２】 選択する二倍体菌株のｌｔｉ性を証明するために、炭素源としてマルトースを含有する栄養培地で３〜１４℃の範囲の温度で数日間ＣＯ2 産生試験を行なう、請求項１記載の方法。
【請求項３】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの倍数体菌株を任意には突然変異誘発処理し、次いで胞子を形成させ、ｌｔｉ性を有する少なくとも１つの分離株を選択し、反対の接合型を有するこの菌株の別の分離株と少なくとも１回戻し交雑し、ｌｔｉ性および反対の接合型を有する少なくとも２つの戻し交雑分離株を選択し、次いで少なくとも１回交雑し、こうして得た潜在的生育能、ｌｔｉ性およびドウ膨脹能を有する倍数体菌株を選択することを特徴とする、ｌｔｉ性を有するパン酵母菌株の作製方法。
【請求項４】 選択する倍数体菌株のｌｔｉ性を証明するために、炭素源としてマルトースを含有する栄養培地で３〜１４℃の範囲の温度で数日間ＣＯ2 産生試験を行なう、請求項３記載の方法。
【請求項５】 緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜１０℃に冷蔵したマルトース培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき２０ｍｌ未満のＣＯ2 産生レベルおよび少なくとも１４℃の温度に保持したマルトース培地で６日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも４０ｍｌのＣＯ2 産生量を有する、請求項１又は２記載の方法により得たパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株。
【請求項６】 緩徐栄養物供給バッチ方法で潜在的生育能、ドウ膨脹能、３〜９℃に冷蔵したマルトース培地で７日後圧搾酵母１ｇにつき３０ｍｌ未満のＣＯ2 産生量および少なくとも１３℃の温度に保持したマルトース培地で６日後圧搾酵母１ｇにつき少なくとも６０ｍｌのＣＯ2 産生量を有する、請求項３又は４記載の方法により得たパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株。
【請求項７】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＮＣＩＭＢ ４０３２８、４０３２９およひ４０３３０から成る群から選択する、請求項５記載のパン酵母菌株。
【請求項８】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＮＣＩＭＢ ４０３３１および４０３３２から成る群から選択する、請求項６記載のパン酵母菌株。
【請求項９】 冷蔵貯蔵後オーブンでベーキングするベーカリ品の製造に請求項５〜８のいずれか１項に記載のパン酵母菌株の使用。
【請求項１０】 冷蔵貯蔵する食品に温度誤用表示器として請求項５〜８のいずれか１項に記載のパン酵母菌株の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
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【公開番号】特開平５−７６３４８
【公開日】平成５年（１９９３）３月３０日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平３−２９３２９３
【出願日】平成３年（１９９１）１１月８日
【出願人】（５９０００２０１３）ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム (31)
【公開日】平成５年（１９９３）３月３０日
【国際特許分類】
【出願日】平成３年（１９９１）１１月８日
【出願人】（５９０００２０１３）ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム (31)
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