ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶
【課題】 ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶及びその三次元構造を提供する。
【解決手段】 ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶であって、該ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが特定アミノ酸配列を有する結晶。本発明の結晶のＸ線結晶解析により、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに関する詳細な三次元構造が得られるので、本発明の結晶はヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に有用である。
【解決手段】 ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶であって、該ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが特定アミノ酸配列を有する結晶。本発明の結晶のＸ線結晶解析により、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに関する詳細な三次元構造が得られるので、本発明の結晶はヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶に関し、より詳細にはヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンドの四成分からなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、生体内において、神経伝達物質であるカテコールアミン類およびカテコール構造を有する種々の化合物の代謝に重要な役割を果たしている。例えば、ＣＯＭＴは、パーキンソン病の治療薬として用いられているＬ−ドパの代謝に関与している。Ｌ−ドパは、ドパミンの前駆物質であって、脳内でドパミンに代謝されて効果を示す薬剤であるが、血中半減期が非常に短い欠点を有する。そのため、Ｌ−ドパは、通常、Ｌ−ドパの代謝酵素阻害剤である、ＣＯＭＴ阻害剤とともに使用されている。ＣＯＭＴは、マグネシウムイオンの共存下に、その補酵素であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからカテコール基質へのメチル基の転送を触媒する酵素であり、この酵素を阻害することによりＬ−ドパから３−Ｏ−メチル−Ｌ−ドパへの代謝が阻害されることが知られている。
【０００３】
近年、哺乳動物のＣＯＭＴに関して精力的な研究がなされている。ＣＯＭＴは、補酵素であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを収容する部位、ＣＯＭＴの基質となるリガンドを収容する部位、およびマグネシウムイオンを収容する部位を含むことが知られている。
ラットＣＯＭＴに関しては、ラットＣＯＭＴ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンド（例えば、ジニトロカテコールなどのＣＯＭＴ阻害剤）の四成分複合体の共結晶が報告され（例えば、非特許文献１、２および３参照）、それぞれプロテインデータベースに、pdb1vid.ent、pdb1h1d.ent、pdb1jr4.entとして登録されている。一方、ヒトＣＯＭＴに関しては、Carola Tilgmanらが、大腸菌におけるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの発現および精製に関する研究を報告しているが、ここで精製されたヒトＣＯＭＴには、大腸菌由来の除去できない不純物が混在し、さらには蛋白質発現時に分子量の異なるヒトＣＯＭＴ類似の蛋白質を共に発現するため均一なヒトＣＯＭＴは得られず、ヒトＣＯＭＴの結晶化には成功していない（例えば、非特許文献４参照）。
【０００４】
今日まで、ヒトＣＯＭＴの結晶については報告されておらず、従ってヒトＣＯＭＴの詳細な三次元構造については知られていない。
【非特許文献１】Vidgren J.ら, 「Nature」, 1994年, 368巻, p.354
【非特許文献２】Bonifacio M.ら, 「Mol. Pharmacol.」, 2002年, 62巻, p.795
【非特許文献３】Lerner C.ら, 「Angew. Chem. Intern. Edition」, 2001年, 40巻, p.4040
【非特許文献４】Tilgmann C.ら， 「J. Chromatography」， 1996年, 684巻, p.147-161
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に有用である、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンドの四成分からなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、結晶化が可能であるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼについて鋭意研究を重ねたところ、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼと、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンドとの四成分複合体が予想外にも極めて良好な結晶として得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶であって、該ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む結晶に関する。
【０００８】
本発明の結晶は、空間群Ｐ３２２１を有し、その格子定数は、ａが５０．５８ű０．３Å、ｂが５０．５８ű０．３Å、ｃが１６７．２４ű０．４Å、αが９０．０°、βが９０．０°、γが１２０．０°に等しい値を有し、さらに好ましくは、ａが５０．５８Å、ｂが５０．５８Å、ｃが１６７．２４Å、αが９０．０°、βが９０．０°、γが１２０．０°に等しい値を有する。
【０００９】
また、本発明の結晶は、Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケットを有し、このポケットは、好ましくは、Ｓ−アデノシルメチオニンから５Åの範囲に含まれる、Met４２、Asn４３、Val４４、Leu６７、Gly６８、Ala６９、Tyr７０、Cys７１、Gly７２、Tyr７３、Ser７４、Ile９１、Glu９２、Ile９３、Asn９４、Cys９７、Gly１１９、Ala１２０、Ser１２１、Gln１２２、Phe１４１、Asp１４３、His１４４およびTrp１４５を含むアミノ酸残基により形成される。
【００１０】
さらに、本発明の結晶は、リガンドを収容するポケットを有し、このポケットは、好ましくは、Trp４０、Met４２、Asp１４３、Trp１４５、Lys１４６、Asp１７１、Asn１７２、Pro１７６、Leu２００およびGlu２０１を含むアミノ酸残基により形成される。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の結晶は、リガンドを収容するポケット内に、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤を含み、そのヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤は、好ましくは、３，５−ジニトロカテコールである。
【００１２】
本発明において、以下の用語は以下の意味を有する。
【００１３】
「リガンド」とは、生体高分子に結合する、低分子量の化合物を意味する。このようなリガンドの具体例として、例えば、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの基質、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ基質のアナログ、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤などが挙げられ、好適にはヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤である。
【００１４】
「ポケット」とは、生体高分子に結合する化合物（例えば、補因子、リガンドなど）の結合領域を意味し、結合部位、結合領域、結合ポケット、収容ポケットとも称される。このようなポケットの具体例として、Ｓ−アデノシルメチオニン収容ポケットおよびリガンド収容ポケットが挙げられる。
【００１５】
配列番号１に記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼは以下のようにして調製することができる。
組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを増幅するためのプライマー類の設計および調製は、当該分野の当業者には周知である、一般的な方法に従って行うことができる。例えば、完全長の蛋白質からＣ末端部位および／またはＮ末端部位の長さが変更された蛋白質をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーは、鋳型ｃＤＮＡにアニーリングさせる位置を変更し、更に５’側および／または３’側に適切な制限酵素認識部位を含むプライマーとして設計することができる。このようなプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を実施することにより、任意の長さの組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを増幅することが可能である。本発明においては、プラスミドに組み込みやすくするため、制限酵素認識部位が付加されたプライマー類として、５’側にBamH I、３’側にEcoR Iの認識部位を含む、下記のような５’-プライマーおよび３’-プライマーを使用する。
５’−プライマー： ５’−ｔｃｔｇｇａｔｃｃａｔｇｇｇｔｇａｃａｃｃａａｇｇａｇ−３’（配列番号３）
３’−プライマー： ５’−ｇａｇｇａａｔｔｃｔｃａｇｃｃｃｔｔｇｔａｇａｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃ−３’（配列番号４）
これらのプライマーは、鋳型としてヒト肝臓ｃＤＮＡを用い、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、KOD plusなど）を使用して標準的なＰＣＲ反応を行うことができる。増幅されたＰＣＲ産物は、好適には、制限酵素 BamH IおよびEcoR Iを用いて消化され、所望のベクター（例えば、pGEX-2Tなど）に連結される。続いて、この連結混合物を用いてプラスミド増幅用宿主細胞（例えば、大腸菌JM109など）を形質転換する。この宿主細胞を適切な培地中で培養することにより大量の組換えプラスミドが得られる。増幅された組換えプラスミドは、精製後、組換えペプチドを発現するための宿主細胞（例えば、大腸菌BL21 codon plus (DE3) RPなど）の形質転換に用いられる。続いて、形質転換後の大腸菌を適切な濃度のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの存在下、LB−アンピシリン培地にて、好適には室温で６〜１５時間程度の培養を行い大腸菌の培養懸濁液を得る。この培養懸濁液を遠心分離後、得られた大腸菌ペレットを溶菌させ、例えば、pGEX-2Tをベクターとして用いた場合にはグルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）を吸着可能なレジンを混合することで発現させたタンパクを固相上に吸着させることができる。次いでトロンビンを適切な濃度で加え、低温条件下（例えば約４℃）で約１２時間〜１５時間インキュベーションすることにより組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを遊離させることができる。得られた組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの精製は例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００１６】
本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなる四成分複合体の結晶化は次のようにして行うことができる。
まず上記のようにして調製した組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを含む溶液を、適切な濃度、好ましくは約１．０〜約１０．０mg/mＬ、さらに好ましくは約５．０〜約７．０mg/mＬとなるように濃縮する。この濃縮溶液に、Ｓ−アデノシルメチオニン（補因子）およびリガンドの溶液と、必要に応じてマグネシウムイオン源とを、好ましくは蛋白質：補因子：マグネシウムイオン：リガンドのモル比が約１：２：２：２となるように添加し、蛋白質：補因子：マグネシウムイオン：リガンド複合体の溶液を調製する。
次に、緩衝剤、イオン強度源、アルコール類などを含む沈殿溶液を調製する。沈殿溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、Tris、Hepes、カコジル酸、クエン酸、酢酸、イミダゾールなどが挙げられ、好ましくは約0.1〜約0.2Ｍの濃度範囲でｐＨが約４．０〜約９．０の範囲内である緩衝剤が用いられる。イオン強度源としては、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸２水素カリウム、酢酸亜鉛、蟻酸マグネシウム、蟻酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウムなどが用いられる。アルコール類としては、例えば、一価もしくは多価アルコール、ポリエチレングリコールなどが用いられる。
続いて、上記のように調製した四成分複合体溶液の液滴と、沈殿溶液の液滴とを混合し、得られた混合液滴を、沈殿溶液を入れたウェル上で、ハンギングドロップ、シッテイングドロップ等の方法により保持させ、四成分複合体の結晶がＸ線回折に適した大きさに成長するまで、長期にわたって４℃から２５℃の範囲の一定温度の条件下で放置する。
次いで、得られた四成分複合体結晶を約１０〜１５％（V/V）となるように抗凍結剤を加えた沈殿溶液に約３０秒から約１分浸し、０．５ｍｍから０．７ｍｍ径のナイロン製のループにて掬い取り、液体窒素中に直漬けし急速凍結させる。この際用いる抗凍結剤としてはグリセロール、ポリエチレングリコール、トレハロースなどが挙げられる。次いで凍結させた四成分複合体結晶はクライオバイアルに封じ込め、Ｘ線を照射するまで液体窒素を充填したデュワービンにて保存する。
【００１７】
このようにして得られた本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなる四成分複合体の結晶構造を解析することによって、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの詳細な三次元構造が得られる。このような三次元構造の座標データ、特にリガンドを収容するポケットの座標データは、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に極めて有用であり、当該リガンド収容ポケットと任意の化合物とのドッキングスタディーを行うことにより、当該化合物が候補化合物として適切であるか否かをスクリーニングすることができる。このようなドッキングスタディーは当該分野の当業者には周知であり、種々のコンピュータソフトウェア、例えば、ＡＤＡＭ（株式会社医薬分子設計研究所）、ＡＤＡＭ＆ＥＶＥ（株式会社医薬分子設計研究所）、ＤＯＣＫ（カリフォルニア大学サンフランシスコ）、ＦｌｅｘＸ（トライポス社）などを使用して行うことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドの四成分複合体結晶を解析することにより、これまで知られていなかったヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに関する詳細な三次元構造が得られる。さらにはヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが酵素活性を発現する部位である、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン収容ポケットおよびリガンド収容ポケットに関する詳細な三次元構造が得られるので、本発明の結晶は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の内容を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
以下の実施例において、配列番号１は、組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの配列である；配列番号２は、配列番号１の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するように配列番号３および４のプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ配列を示す；配列番号３は、配列番号２のＤＮＡを増幅するために使用された５’プライマーの配列である；配列番号４は、配列番号２のＤＮＡを増幅するために使用された３’プライマーの配列である；配列番号５は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをゲル電気泳動にて簡便に確認するための５’プライマーの配列であり、さらに配列番号５は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをダイターミネーター法にて確認するためにも使用できる；配列番号６は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをゲル電気泳動にて簡便に確認するための３’プライマーの配列である；配列番号７は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをダイターミネーター法にて確認するためのヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡ配列内部の５’プライマーの配列である。
【実施例】
【００２０】
実施例１
（結晶化可能な組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの調製）
１）結晶化可能な組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの設計
本発明の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；３，５−ジニトロカテコール；およびマグネシウムイオンの四成分複合体の結晶に用いる組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼとして、配列番号１記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを設計した。この配列番号１記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼは、完全長のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼのＮ末端にGly-Ser-残基が付加され、Ｃ末端から７個のアミノ酸が欠失したものである。
完全長のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードする、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information)上に登録されている受入番号ＢＣ０１１９３５のＤＮＡ配列に基づき、配列番号１記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を増幅するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。５’プライマーの配列を配列番号３に、３’プライマーの配列を配列番号４に示した。これらのプライマーは、所望のベクター中に該当ＰＣＲ産物を挿入しやすくするために制限酵素部位（５’側はBamHＩ, ３’側はEcoRＩ）を含んでいる。
これらのプライマーによって得られるインサートＤＮＡを配列番号２に示した。このインサートＤＮＡを、下記に示すように、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターに組込み、蛋白をＧＳＴ融合蛋白として発現させ、その後、トロンビンで処理して、配列番号１に示す組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを調製した。この組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を、文献記載の方法（例えば、G. Zurcher および M. Da Prada.ら, 「Journal of Neurochemistry」, 1982年，38巻, p.191-195 ）に従って調べたところ、完全長のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性とほぼ同等の活性を有することが確認された。
【００２１】
２）組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するためのインサートＤＮＡのクローニングおよび発現
配列番号３記載の５’プライマーおよび配列番号４記載の３’プライマーの各々を、TE緩衝液で希釈して15 pmol/μL 溶液とした。Ｈ２Ｏ（ＰＣＲ用, 34.8μＬ）, 25 mM ＭｇＳＯ４ (2.0μＬ), 2 mM dNTPs (5.0μＬ), １０倍濃縮のＤＮＡポリメラーゼ KOD plus 緩衝液 (5.0μＬ，東洋紡)を混合し、ＰＣＲ反応用混合物を調製した。次いでヒト肝臓ｃＤＮＡ(Invitrogen)(5.0μＬ)が、このＰＣＲ反応用混合物に加えられた。各々のプライマー対(1μＬ, 15 pmol)を上記混合物に加え、最後に1.0μＬのKOD plusが加えられた。その後、ＰＣＲ反応が行われた。ＰＣＲ反応は９４℃２分間、９４℃１５秒間、５９℃３０秒間、６８℃１分間でこのサイクルを４０サイクル行った。次いで６８℃５分間、４℃１０分間で終了した。ＰＣＲ産物の一部1.0μＬを分取し、10 x ローデイング緩衝液(1.2μＬ)とＨ２Ｏ(5.8μＬ)を加えた後に電気泳動により分析した。ＰＣＲ産物は増幅されていた。
ＰＣＲ産物をQIAquick PCR 精製キット（Qiagen）にて精製した。所望のインサートＤＮＡは同キットのEB緩衝液（30μＬ）により溶出された。次いで溶出されたＤＮＡ（1.0μＬ）はTE緩衝液（99μＬ）により希釈され濃度が決定された。当該組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するためのインサートＤＮＡは0.112 μｇ/μＬ, 260nm/280nm = 1.99であった。
【００２２】
３）組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼインサートＤＮＡおよびpGEX-2T ベクターの二重消化
組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼインサートＤＮＡ(1.5μｇ)に、10 x EcoR I 緩衝液 (New England Biolab社) (3.0μＬ), Ｈ２Ｏ(11.1μＬ), BamH I (1.5μＬ, 15 U, 10 u/μＬ)とEcoR I (1.0μＬ, 15 U, 15 U/μＬ)を加え混合した。混合溶液は３７℃で１．５時間加熱された。更にその溶液に１０Xローデイング緩衝液を加えた。混合溶液を電気泳動にて分離し、当該消化断片を有するDNAを含むゲルの部分を切り出し、Qiagen Mini Elute ゲル 抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。当該消化断片ＤＮＡの濃度は33.1 ng/μＬであった。
pGEX-2T ベクターＤＮＡ(1.5μｇ,Amersham)に、10 x EcoR I 緩衝液 (New England Biolab社) (3.0μＬ), Ｈ２Ｏ(21.5μＬ), BamH I (1.5μＬ, 15 U, 10 u/μＬ)とEcoR I (1.0μＬ, 15 U, 15 U/μＬ)を加え混合した。混合溶液は３７℃で１．５時間加熱された。更にその溶液に１０Xローデイング緩衝液を加えた。混合溶液を電気泳動にて分離し、当該消化断片を有するDNAを含むゲルの部分を切り出し、Qiagen Mini Elute ゲル 抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。当該消化断片ＤＮＡの濃度は25.0 ng/μＬであった。
【００２３】
４）ライゲーションと大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
二重消化したpGEX-2T ベクター（2.0μＬ, 50 ng, 25 ng/μＬ）およびインサートＤＮＡ(1.0μＬ, 33.1 ng, 33.1 ng/μＬ)を、2 x ライゲーション緩衝液(5.0μＬ, PGEM)およびＨ２Ｏ(1.7μＬ)に加えて混合した。次いで、リガーゼ(1.0μＬ, 3 U/μＬ, PGEM）を混合溶液に加え、その混合物を２５℃で１時間インキュベーションした。次に、大腸菌JM109(100μＬ)を０℃にて溶解し、リガーゼで反応させた上記混合溶液(5μＬ)をJM109懸濁液に加え、穏やかに混合し、強く振動させないようにしながら（０℃，２０分間，４２℃４０秒間，０℃３０分間）の熱ショックを加えた。次いで、450μＬのSOC溶液を熱ショック後の溶液に加え３７℃で１時間振盪した。振盪後、混合溶液の50μＬと200μＬを、LB-アンピシリン培地のプレート上(直径９ｃｍ, アンピシリン濃度: 100μｇ/mL）にそれぞれ蒔き、３７℃で１６時間の静置培養をおこなった。その結果、プレート上にはコロニーが出現していた。培養後のプレートは使用時まで４℃にて保存した。
【００２４】
５）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼのＰＣＲ法によるコロニーセレクション
以下に示す配列番号５記載の５’プライマーと、配列番号６記載の３’プライマーとを、それぞれTE緩衝液で希釈し、15pmol/μＬ溶液とした。
５’プライマー：５’−ｇａａｇｃｔａｔｃｃｃａｃａａａｔｔｇａｔａａｇ−３’（配列番号５）
３’プライマー：５’−ｃｔｇａｃｇｇｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｔｃｃ−３’（配列番号６）
次いで、５’プライマーの希釈溶液(20 μＬ, 15 pmol/μＬ)、３’プライマーの希釈溶液(20 μＬ, 15 pmol/μＬ)、 Ｈ２Ｏ(460 μＬ)、２倍濃縮AmpliTaq Gold Master Mix (500 μＬ, アプライドバイオシステムズ)を混合し２２本のＰＣＲチューブ(45 μＬ x 22 tubes)に分割した。４）で得られたLB-アンピシリン培地のプレート上より得られたコロニーから２２個を選択し、各々を上記の２２個のＰＣＲ混合溶液に別々に加えＰＣＲ反応を行った。尚、ＰＣＲ反応の条件は以下に示すとおりである。１）９５℃，５分間、２）９５℃，１５秒間、３）６１℃，１５秒間、４）７２℃，１分間、５）１）から４）を４０回繰り返し、６）７２℃，７分間、７）４℃，１０分間。次いでＰＣＲ生成物の1.0μＬを分取し１０Xローデイング緩衝液2.0μＬを加え電気泳動にて分析した。ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが導入されているコロニーを10ｍＬ LB-アンピシリン培地（アンピシリン濃度100μｇ/ｍＬ）に加え３７℃で１５時間の培養を行った。
【００２５】
６）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼプラスミドの大腸菌ＪＭ１０９からの抽出と精製
５）で得られたＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの形質転換が確認されたJM109の培養液は一部(100μＬ)をグリセロールストックとし、残りの培養液は12,000rpmで10分間遠心を行い、大腸菌ペレットを得た。得られた大腸菌ペレットはQiagen plasmid mini kit（Qiagen）のインストラクションマニュアルにより精製し、ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡを得た。それらの濃度はOD260nmによって決定され、311ng/μＬ、ＤＮＡと蛋白質濃度の比はOD260/280=1.87となった。各々のプラスミド溶液はTE緩衝液で希釈し１ng/μＬの溶液とした。得られたプラスミドＤＮＡの配列は、配列番号５および以下に記載の配列番号７に示すプライマーを用い、ダイターミネーター法にて分析することによって配列番号２のＤＮＡ配列のうち、５番目〜６５５番目の塩基を含む配列であることが確認された。
５’−プライマー；５’−ｃａｔｃｇａｇａｔｃａａｃｃｃｃｇａｃｔｇ−３’（配列番号７）
【００２６】
７）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼプラスミドＤＮＡの大腸菌 BL21 CODON PLUS (DE3) RP への形質転換
精製したＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼプラスミドDNA1.0μＬ(1.0ng/μＬ)を０℃で融解した大腸菌BL21 CODON PLUS (DE3) RP 細胞懸濁液50μＬに加え、０℃で３０分間静置した。この混合物に強く振盪すること無しに４２℃で４０秒間の熱ショックを与え、０℃で１０分間冷却した。次いで、450μＬのSOC培地を細胞懸濁溶液に加え、３７℃で１時間振盪した。得られた混合物をLB-アンピシリン培地のプレート(直径. 9cm, アンピシリン濃度100μｇ/mL)に蒔き、３７℃で１５時間静置培養した。
【００２７】
８）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの発現
形質転換後の大腸菌BL21 CODON PLUS (DE3) RP のプレートからＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するためのプラスミドを保有している大腸菌のコロニーを拾い上げ、10ｍＬのLB-アンピシリン培地（アンピシリン濃度100μｇ/ml）に投入した。上記混合物はOD600nm値が0.24になるまで３７℃にて４時間振盪培養を行った。培養液の一部50μＬはグリセロールストックとした。また1.0ｍＬをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド添加前サンプルとして分取した。分取後の残りの混合溶液に0.1Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを9.0μＬ加え２０℃で６時間振盪した。次いで、混合物を12,000rpmで15分間遠心し、大腸菌ペレットを回収し使用時まで−80℃で凍結保存した。
【００２８】
９）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼのトロンビン処理
８）から得られたセルペレットは１セルペレット当たり1.8ｍＬのBugBuster溶液(Novagen)により15分間室温にて穏やかに撹拌しながら処理した。得られたライゼートを12,000rpmで15分間遠心し、上澄み液を回収した。次いで、予めD−PBS（DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE）にて平衡化し、D−PBSで50％に再懸濁させた。400μＬのグルタチオン４B Sepharoseの（レジンベッドボリューム200μＬ）を上記上澄み溶液に加え、得られた混合物を4℃にて30分間振盪した。振盪後の混合物をフィルターによりレジンと濾液に分別した。得られたレジンを500μＬのD−PBSで5回洗浄し、300μＬのトロンビン処理用緩衝液（150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 10 % glycerol, 2.5 mM CaCl2, 0.5 % β-オクチル−D−グルコピラノシド）で３回洗浄した。次いで、レジンにトロンビン処理用緩衝液を加え500μＬとし、トロンビン（アマシャムバイオサイエンス）５ユニットを加えた。レジン混合液は４℃で１５時間穏やかに撹拌し、その一部をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、トロンビン処理により組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに該当するバンドが検出された。一部のレジン混合液をろ過して得られた蛋白質の濃度は258μｇ/ｍＬであった。更にエレクトロスプレー四重極型質量分析器にて当該組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分子量を測定したところ観測値＝23994.97となり、配列番号１記載のペプチドから算出される理論値=23997.67と良い一致をみた。
【００２９】
１０）組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの固相抽出による精製と透析処理
トロンビン処理後のレジン懸濁液を空きカラムにロードしその濾液を回収した。次いでこの操作で得られた濾液をGSTrap FF（アマシャムバイオサイエンス）にぺリスタポンプでロードし、その濾液を回収した。この濾液を2.0リットルの緩衝液（10mM NaCl, 10% Glycerol, 20mM Tris pH7.0, 0.5%β−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド, 4.0mM ジチオスレイトール）を用いて一晩透析した。
【００３０】
１１）Super Q-5PWカラムクロマトグラフィー
透析後のサンプル溶液を約10〜12ｍＬ（蛋白質の量として約10mg相当）を0.5ｍＬ/minの流速で予め緩衝液A（10mM NaCl, 10% Glycerol, 20mM Tris pH7.0, 0.5%β−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド, 4.0mM ジチオスレイトール ）にて平衡化されたSuper Q-5PWカラムにロードした。このカラムから目的蛋白質を0.5ｍＬ/minで緩衝液B (10% glycerol, 50mM Tris pH7.0, 4.0mM ジチオスレイトール, 0.2% β−オクチル−D−グルコピラノシド, 700mM NaCl )によりリニアグラジエントで溶出させた（（0％の緩衝液Bで7分間（Super Q-5PWカラム体積の約４倍量相当）、0-20％の緩衝液Bで70分間（Super Q-5PWカラム体積の約４0倍量相当）、20-100%の緩衝液Bで2分間（Super Q-5PWカラム体積の約１倍量相当））。その結果、開始から約50分の溶出により得られるピークをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し、組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分子量を与える事を確認した。
【００３１】
１２）Superdex HR75 prep gradeカラムクロマトグラフィー
１１）で得られたフラクションを合一し、YM-10膜（ミリポア社）により約４ｍＬにまで濃縮した。緩衝液（10% glycerol, 50mM MES pH6.5, 1.0mM ジチオスレイトール,2.5mM MgCl２）で予め２時間平衡化したSupedex HR75 prep gradeカラム（アマシャムバイオサイエンス）に1.0ｍＬのサンプル溶液をロードし、流速1.0ml/minにて溶出を行った。70分後に溶出される分画を組変えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼとして採取した。また、この溶出された分画は組変えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分子量を与えることをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。得られた組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分画をDevelosil C4カラム（野村化学株式会社）により分析し、95％以上の純度であることを確認した。
【００３２】
実施例２
（組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；３，５−ジニトロカテコール；およびマグネシウムイオンの四成分複合体の結晶化）
実施例１で調整した組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを含むフラクション10mLをYM-10膜（ミリポア社）により約1.5mLにまで濃縮し、その濃縮液を更にセントリコン-10膜（ミリポア社）にて最終濃度として5.0〜4.8mg/mLとなるように濃縮した。目的濃度にまで濃縮したヒトカテコールＯ-メチルトランスフェラーゼ溶液60μLに60mMのS−アデノシルメチオニン溶液を3.0μL加えて０℃で３０分インキュベーションした。次いで20mM の3,5-ジニトロカテコール溶液を6.0μl加え、同様に０℃で３０分インキュベーションした。結晶化のスクリーニングはハンプトンリサーチ社のCrystal Screen I, IIを使用し、ハンギングドロップ法にてセットアップし、２０℃によりインキュベーションを行った。その結果、0.1M Hepes pH7.5, 2% (v/v)PEG400, 2.0M （ＮＨ４）２ＳＯ４で規定される条件から約４日で黄色の楔状結晶が得られた。
得られた結晶を図１に示す。これらの結晶は、格子定数a=50.584, b=50.584, c=167.240Åで、空間群Ｐ３２２１に属する。それらは１非対称単位に当たり1分子を含み（Ｍｗ= 23.99kDa） 51.85%の溶媒含量であった。（Ｖｍ= 2.57 ; Matthews B.W., 「J. Mol. Biol.」, 1968年, 33巻, p.491-497）
【００３３】
得られた四成分複合体結晶を10〜15％グリセロールを含む結晶化バッファーに約３０〜６０秒浸し、０．５〜０．７mm径クライオループ（ハンプトンリサーチ社）にて掬い取り、液体窒素中に直漬けすることにより急速凍結させた。
【００３４】
実施例３
（組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；３，５−ジニトロカテコール；およびマグネシウムイオンからなる四成分複合体結晶の三次元構造の解析）
１）結晶のデータ収集
実施例２で得られた四成分複合体の結晶の回折データの収集を、ＳＰｒｉｎｇ−８大型放射光施設のビームラインＢＬ３２Ｂ２にて行った。予め凍結してある結晶を−１７３±１．０℃の冷却液体窒素気流中に浸すようにマウントし、波長１．０ÅにてジュピターCCD（株式会社リガク）を使用して測定した。ＣＣＤ検出器と結晶との間の距離は150mmである。データセットは−６０°〜６０°までの範囲を振動角度１．０°〜１．２°にて計１００〜１２０枚のイメージを取得した。Ｘ線の露出時間は４０秒から６０秒/イメージであった。
【００３５】
２）回折データの処理
Mosflm Ver 6.2.1により得られたイメージファイルのデータセットの反射強度の積分を行った。得られたmtzファイルをプログラムsortmtz, プログラムscala, プログラムtruncate（Collaborative Computational Project:(1994) Acta Crystallogr. D50, 760-763 ; CCP4 suite Ver 4.2.2）にて順次処理することで分子置換法用のファイルに変換した。各データセットの統計を下記に示す。
全反射数=29525
独立反射の数=9033
データの完全性(全体/最外殻)=98.9/98.4 (%)
Rマージ(全体/最外郭)=0.085/0.205
リダンダンシー(全体)=3.3
【００３６】
３）空間群の決定
分子置換はプロテインデータバンク（PDB）中のpdb1vid.entからS−アデノシルメチオニン、マグネシウムイオン、３，５−ジニトロカテコール、及び水分子を除いた蛋白質座標をサーチモデルとして使用し、ヒトとラットで種差に起因するアミノ酸の違いについてはアラニンに置換した。AMoRe（Navaza, J. (1994) AmoRe : 分子置換の為の自動パッケージ,Acta Cryst.D50,157-163 CCP4 Ver.4.2）パッケージにて回転と併進の位置を決定した結果、空間群はＰ３２２１と決定できた。結果の詳細を下記に示す。
分解能の範囲：20.0〜3.0 (Å)
剛体Ｒ因子：0.429
【００３７】
４）四成分複合体構造の精密化
構造の精密化はCNX2002 （アクセルリス株式会社）にて行った。テストセットとしては全反射の10％を使用した。主鎖及び側鎖のトレース、及びアミノ酸の置換はQUANTA2000（アクセルリス株式会社）を使用し、CNX2002で作成したオミットマップを参考にしながらモデルの修正を実施した。バルク水マスクはバビネットモデルを使用した。水分子はFo-Fc差フーリエマップを解釈しながらQUANTA2000のSolvation モジュールを使用し、マグネシウムイオン、S−アデノシルメチオニン等のリガンドはプログラム2-D sketcher, プログラムMolecular Editorを使用してモデリングを行い、Fo-Fc差フーリエマップの電子密度に合致するようにマニュアルフィッテイングによるモデリングを行った。個別温度因子精密化を実施した最終の精密化統計値は R=0.254となった。精密化された構造の質を評価する統計諸量を下記に示す。
最終精密化パラメータ
分解能の範囲：10.0-2.5Å
反射：9025
Ｒ因子：0.254
Ｒフリー因子：0.283
残基数：212
原子数：1660
RMS偏差（結合長）：0.010
RMS偏差（結合角）：1.445
平均温度因子（タンパク質）：12.94
平均温度因子（水分子）：21.15
【００３８】
得られた四成分複合体結晶の原子座標を、生体高分子の座標を扱う際の標準的形式であるプロテインデータバンク（ＰＤＢ）のフォーマットに準じて、下記の表１に示した。
【００３９】
【表１】
上記の表において、１〜１３列目はそれぞれ以下：１列目の「ATOM」は原子座標の一つ一つを意味し、「HETATM」は蛋白質以外の化学種を意味する；２列目の数字は原子の通し番号を表す；３列目は各アミノ酸残基、Ｓ−アデノシルメチオニンまたは３，５−ジニトロカテコールにおける位置を表す；４列目は、その原子が属するアミノ酸残基の種類を表し、MGはマグネシウムイオン、SAMはＳ−アデノシルメチオニン、DNCは３，５−ジニトロカテコールを表す；５列目は蛋白質鎖の識別記号を表す；６列目は、そのアミノ酸残基のＮ末端からの番号を表す；７、８および９列目は、それぞれＸ座標、Ｙ座標およびＺ座標（Å単位）を表す；１０列目は占有率を表す；１１列目は等方性温度因子を表す；１２列目はチェインアイデイーを表す；１３列目は原子を表す。
【００４０】
５）リガンド収容ポケットの特性化
図２には、本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体結晶のうち、リガンドを収容するポケット近傍の構造を示した。
ヒトカテコールＯ-メチルトランスフェラーゼのリガンド収容ポケットには、リガンドとマグネシウムイオンとが収容され、活性中心に存在するマグネシウムイオンは、Asp１４３、Asn１７２、Glu２０１の３つのアミノ酸残基の側鎖と配位相互作用を形成し、さらに３，５−ジニトロカテコールの２つの水酸基とも配位相互作用を形成していることが確認された。さらに、Glu２０１の側鎖は３，５−ジニトロカテコールの片方のヒドロキシル酸素原子と水素結合を形成し、複合体を安定化していると考えられる。Trp４０の側鎖であるインドール環は３，５−ジニトロカテコールのベンゼン環とEdge-to-FaceのＣＨ−π相互作用を起こしていることが確認された。また、Pro１７６のγ位の炭素原子は３，５−ジニトロカテコールのベンゼン環とファンデルワールス相互作用を形成していた。さらにLys１４６の側鎖のＮｚ原子は３，５−ジニトロカテコールのＳ−アデノシルメチオニン側のヒドロキシル酸素原子方向に向き、複合体を静電気的に安定化していると考えられる。
リガンド収容ポケットの近傍では、Arg２０３の側鎖はGlu３６と水素結合を形成し、３，５−ジニトロカテコール側に配向していないことが明らかになった。本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶と、公知のラットカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体結晶の三次元構造とを比較したところ、ラットカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼでは、Arg２０３に相当するアミノ酸残基が疎水性を有するメチオニンであって、このメチオニン残基の側鎖はリガンドの位置する方向に突き出ているのに対して、ヒトカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼでは、図２に示すようにArg２０３の側鎖がリガンドと反対方向に向いてGlu３６と水素結合を形成しており、ヒトカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、ラットラットカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼに比べて広いリガンド収容ポケットを有することが明らかとなった。係る知見は、本発明の四成分複合体の結晶を解析することによって初めて明らかとされたものである。
【００４１】
６）Ｓ−アデノシルメチオニン収容ポケットの特性化
図３には、本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体結晶のうち、Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケット近傍の構造を示した。
Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケットを以下のように特性化した。すなわち、ＱＵＡＮＴＡ（アクセルリス社製）を用い、Ｓ−アデノシルメチオニンから５Åの範囲内に位置するアミノ酸残基を切り出したところ、以下のアミノ酸残基：Met４２、Asn４３、Val４４、Leu６７、Gly６８、Ala６９、Tyr７０、Cys７１、Gly７２、Tyr７３、Ser７４、Ile９１、Glu９２、Ile９３、Asn９４、Cys９７、Gly１１９、Ala１２０、Ser１２１、Gln１２２、Phe１４１、Asp１４３、His１４４およびTrp１４５が同定された。
Trp１４５は、Ｓ−アデノシルメチオニンのアデニン環とedge-to-faceの相互作用を起こし安定化していた。同様に、His１４４はＳ−アデノシルメチオニンのアデニン環とedge-to-faceの相互作用を形成していた。またIle９３の側鎖はＳ−アデノシルメチオニンのアデニン環の環上に位置し、ファンデルワールス相互作用を成していた。Glu９２はＳ−アデノシルメチオニンのリボース環上の２つの水酸基と水素結合を形成していた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドの四成分複合体結晶により、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに関する詳細な三次元構造が得られるので、当該結晶は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体の結晶の写真を示す。
【図２】図２は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体のうち、リガンドを収容するポケット近傍の三次元構造を示す。黒いボールアンドステイックモデルはＳ−アデノシルメチオニンを示す。マグネシウムイオンを灰色の球として示す。灰色のボールアンドステイックモデルは３，５−ジニトロカテコールを示す。
【図３】図３は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体のうち、Ｓ−アデノイルメチオニンを収容するポケット近傍の三次元構造を示す。黒いボールアンドステイックモデルはＳ−アデノシルメチオニンを示す。マグネシウムイオンを灰色の球として示す。灰色のボールアンドステイックモデルは３，５−ジニトロカテコールを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶に関し、より詳細にはヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンドの四成分からなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、生体内において、神経伝達物質であるカテコールアミン類およびカテコール構造を有する種々の化合物の代謝に重要な役割を果たしている。例えば、ＣＯＭＴは、パーキンソン病の治療薬として用いられているＬ−ドパの代謝に関与している。Ｌ−ドパは、ドパミンの前駆物質であって、脳内でドパミンに代謝されて効果を示す薬剤であるが、血中半減期が非常に短い欠点を有する。そのため、Ｌ−ドパは、通常、Ｌ−ドパの代謝酵素阻害剤である、ＣＯＭＴ阻害剤とともに使用されている。ＣＯＭＴは、マグネシウムイオンの共存下に、その補酵素であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからカテコール基質へのメチル基の転送を触媒する酵素であり、この酵素を阻害することによりＬ−ドパから３−Ｏ−メチル−Ｌ−ドパへの代謝が阻害されることが知られている。
【０００３】
近年、哺乳動物のＣＯＭＴに関して精力的な研究がなされている。ＣＯＭＴは、補酵素であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを収容する部位、ＣＯＭＴの基質となるリガンドを収容する部位、およびマグネシウムイオンを収容する部位を含むことが知られている。
ラットＣＯＭＴに関しては、ラットＣＯＭＴ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンド（例えば、ジニトロカテコールなどのＣＯＭＴ阻害剤）の四成分複合体の共結晶が報告され（例えば、非特許文献１、２および３参照）、それぞれプロテインデータベースに、pdb1vid.ent、pdb1h1d.ent、pdb1jr4.entとして登録されている。一方、ヒトＣＯＭＴに関しては、Carola Tilgmanらが、大腸菌におけるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの発現および精製に関する研究を報告しているが、ここで精製されたヒトＣＯＭＴには、大腸菌由来の除去できない不純物が混在し、さらには蛋白質発現時に分子量の異なるヒトＣＯＭＴ類似の蛋白質を共に発現するため均一なヒトＣＯＭＴは得られず、ヒトＣＯＭＴの結晶化には成功していない（例えば、非特許文献４参照）。
【０００４】
今日まで、ヒトＣＯＭＴの結晶については報告されておらず、従ってヒトＣＯＭＴの詳細な三次元構造については知られていない。
【非特許文献１】Vidgren J.ら, 「Nature」, 1994年, 368巻, p.354
【非特許文献２】Bonifacio M.ら, 「Mol. Pharmacol.」, 2002年, 62巻, p.795
【非特許文献３】Lerner C.ら, 「Angew. Chem. Intern. Edition」, 2001年, 40巻, p.4040
【非特許文献４】Tilgmann C.ら， 「J. Chromatography」， 1996年, 684巻, p.147-161
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に有用である、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンドの四成分からなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、結晶化が可能であるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼについて鋭意研究を重ねたところ、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼと、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、マグネシウムイオンおよびリガンドとの四成分複合体が予想外にも極めて良好な結晶として得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶であって、該ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む結晶に関する。
【０００８】
本発明の結晶は、空間群Ｐ３２２１を有し、その格子定数は、ａが５０．５８ű０．３Å、ｂが５０．５８ű０．３Å、ｃが１６７．２４ű０．４Å、αが９０．０°、βが９０．０°、γが１２０．０°に等しい値を有し、さらに好ましくは、ａが５０．５８Å、ｂが５０．５８Å、ｃが１６７．２４Å、αが９０．０°、βが９０．０°、γが１２０．０°に等しい値を有する。
【０００９】
また、本発明の結晶は、Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケットを有し、このポケットは、好ましくは、Ｓ−アデノシルメチオニンから５Åの範囲に含まれる、Met４２、Asn４３、Val４４、Leu６７、Gly６８、Ala６９、Tyr７０、Cys７１、Gly７２、Tyr７３、Ser７４、Ile９１、Glu９２、Ile９３、Asn９４、Cys９７、Gly１１９、Ala１２０、Ser１２１、Gln１２２、Phe１４１、Asp１４３、His１４４およびTrp１４５を含むアミノ酸残基により形成される。
【００１０】
さらに、本発明の結晶は、リガンドを収容するポケットを有し、このポケットは、好ましくは、Trp４０、Met４２、Asp１４３、Trp１４５、Lys１４６、Asp１７１、Asn１７２、Pro１７６、Leu２００およびGlu２０１を含むアミノ酸残基により形成される。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の結晶は、リガンドを収容するポケット内に、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤を含み、そのヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤は、好ましくは、３，５−ジニトロカテコールである。
【００１２】
本発明において、以下の用語は以下の意味を有する。
【００１３】
「リガンド」とは、生体高分子に結合する、低分子量の化合物を意味する。このようなリガンドの具体例として、例えば、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの基質、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ基質のアナログ、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤などが挙げられ、好適にはヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤である。
【００１４】
「ポケット」とは、生体高分子に結合する化合物（例えば、補因子、リガンドなど）の結合領域を意味し、結合部位、結合領域、結合ポケット、収容ポケットとも称される。このようなポケットの具体例として、Ｓ−アデノシルメチオニン収容ポケットおよびリガンド収容ポケットが挙げられる。
【００１５】
配列番号１に記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼは以下のようにして調製することができる。
組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを増幅するためのプライマー類の設計および調製は、当該分野の当業者には周知である、一般的な方法に従って行うことができる。例えば、完全長の蛋白質からＣ末端部位および／またはＮ末端部位の長さが変更された蛋白質をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーは、鋳型ｃＤＮＡにアニーリングさせる位置を変更し、更に５’側および／または３’側に適切な制限酵素認識部位を含むプライマーとして設計することができる。このようなプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を実施することにより、任意の長さの組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを増幅することが可能である。本発明においては、プラスミドに組み込みやすくするため、制限酵素認識部位が付加されたプライマー類として、５’側にBamH I、３’側にEcoR Iの認識部位を含む、下記のような５’-プライマーおよび３’-プライマーを使用する。
５’−プライマー： ５’−ｔｃｔｇｇａｔｃｃａｔｇｇｇｔｇａｃａｃｃａａｇｇａｇ−３’（配列番号３）
３’−プライマー： ５’−ｇａｇｇａａｔｔｃｔｃａｇｃｃｃｔｔｇｔａｇａｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃ−３’（配列番号４）
これらのプライマーは、鋳型としてヒト肝臓ｃＤＮＡを用い、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、KOD plusなど）を使用して標準的なＰＣＲ反応を行うことができる。増幅されたＰＣＲ産物は、好適には、制限酵素 BamH IおよびEcoR Iを用いて消化され、所望のベクター（例えば、pGEX-2Tなど）に連結される。続いて、この連結混合物を用いてプラスミド増幅用宿主細胞（例えば、大腸菌JM109など）を形質転換する。この宿主細胞を適切な培地中で培養することにより大量の組換えプラスミドが得られる。増幅された組換えプラスミドは、精製後、組換えペプチドを発現するための宿主細胞（例えば、大腸菌BL21 codon plus (DE3) RPなど）の形質転換に用いられる。続いて、形質転換後の大腸菌を適切な濃度のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの存在下、LB−アンピシリン培地にて、好適には室温で６〜１５時間程度の培養を行い大腸菌の培養懸濁液を得る。この培養懸濁液を遠心分離後、得られた大腸菌ペレットを溶菌させ、例えば、pGEX-2Tをベクターとして用いた場合にはグルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）を吸着可能なレジンを混合することで発現させたタンパクを固相上に吸着させることができる。次いでトロンビンを適切な濃度で加え、低温条件下（例えば約４℃）で約１２時間〜１５時間インキュベーションすることにより組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを遊離させることができる。得られた組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの精製は例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００１６】
本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなる四成分複合体の結晶化は次のようにして行うことができる。
まず上記のようにして調製した組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを含む溶液を、適切な濃度、好ましくは約１．０〜約１０．０mg/mＬ、さらに好ましくは約５．０〜約７．０mg/mＬとなるように濃縮する。この濃縮溶液に、Ｓ−アデノシルメチオニン（補因子）およびリガンドの溶液と、必要に応じてマグネシウムイオン源とを、好ましくは蛋白質：補因子：マグネシウムイオン：リガンドのモル比が約１：２：２：２となるように添加し、蛋白質：補因子：マグネシウムイオン：リガンド複合体の溶液を調製する。
次に、緩衝剤、イオン強度源、アルコール類などを含む沈殿溶液を調製する。沈殿溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、Tris、Hepes、カコジル酸、クエン酸、酢酸、イミダゾールなどが挙げられ、好ましくは約0.1〜約0.2Ｍの濃度範囲でｐＨが約４．０〜約９．０の範囲内である緩衝剤が用いられる。イオン強度源としては、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸２水素カリウム、酢酸亜鉛、蟻酸マグネシウム、蟻酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウムなどが用いられる。アルコール類としては、例えば、一価もしくは多価アルコール、ポリエチレングリコールなどが用いられる。
続いて、上記のように調製した四成分複合体溶液の液滴と、沈殿溶液の液滴とを混合し、得られた混合液滴を、沈殿溶液を入れたウェル上で、ハンギングドロップ、シッテイングドロップ等の方法により保持させ、四成分複合体の結晶がＸ線回折に適した大きさに成長するまで、長期にわたって４℃から２５℃の範囲の一定温度の条件下で放置する。
次いで、得られた四成分複合体結晶を約１０〜１５％（V/V）となるように抗凍結剤を加えた沈殿溶液に約３０秒から約１分浸し、０．５ｍｍから０．７ｍｍ径のナイロン製のループにて掬い取り、液体窒素中に直漬けし急速凍結させる。この際用いる抗凍結剤としてはグリセロール、ポリエチレングリコール、トレハロースなどが挙げられる。次いで凍結させた四成分複合体結晶はクライオバイアルに封じ込め、Ｘ線を照射するまで液体窒素を充填したデュワービンにて保存する。
【００１７】
このようにして得られた本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなる四成分複合体の結晶構造を解析することによって、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの詳細な三次元構造が得られる。このような三次元構造の座標データ、特にリガンドを収容するポケットの座標データは、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に極めて有用であり、当該リガンド収容ポケットと任意の化合物とのドッキングスタディーを行うことにより、当該化合物が候補化合物として適切であるか否かをスクリーニングすることができる。このようなドッキングスタディーは当該分野の当業者には周知であり、種々のコンピュータソフトウェア、例えば、ＡＤＡＭ（株式会社医薬分子設計研究所）、ＡＤＡＭ＆ＥＶＥ（株式会社医薬分子設計研究所）、ＤＯＣＫ（カリフォルニア大学サンフランシスコ）、ＦｌｅｘＸ（トライポス社）などを使用して行うことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドの四成分複合体結晶を解析することにより、これまで知られていなかったヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに関する詳細な三次元構造が得られる。さらにはヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが酵素活性を発現する部位である、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン収容ポケットおよびリガンド収容ポケットに関する詳細な三次元構造が得られるので、本発明の結晶は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の内容を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
以下の実施例において、配列番号１は、組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの配列である；配列番号２は、配列番号１の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するように配列番号３および４のプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ配列を示す；配列番号３は、配列番号２のＤＮＡを増幅するために使用された５’プライマーの配列である；配列番号４は、配列番号２のＤＮＡを増幅するために使用された３’プライマーの配列である；配列番号５は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをゲル電気泳動にて簡便に確認するための５’プライマーの配列であり、さらに配列番号５は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをダイターミネーター法にて確認するためにも使用できる；配列番号６は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをゲル電気泳動にて簡便に確認するための３’プライマーの配列である；配列番号７は、配列番号２に示すＤＮＡがプラスミドに組み替えられたかどうかをダイターミネーター法にて確認するためのヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡ配列内部の５’プライマーの配列である。
【実施例】
【００２０】
実施例１
（結晶化可能な組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの調製）
１）結晶化可能な組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの設計
本発明の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；３，５−ジニトロカテコール；およびマグネシウムイオンの四成分複合体の結晶に用いる組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼとして、配列番号１記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを設計した。この配列番号１記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼは、完全長のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼのＮ末端にGly-Ser-残基が付加され、Ｃ末端から７個のアミノ酸が欠失したものである。
完全長のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードする、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information)上に登録されている受入番号ＢＣ０１１９３５のＤＮＡ配列に基づき、配列番号１記載の組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を増幅するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。５’プライマーの配列を配列番号３に、３’プライマーの配列を配列番号４に示した。これらのプライマーは、所望のベクター中に該当ＰＣＲ産物を挿入しやすくするために制限酵素部位（５’側はBamHＩ, ３’側はEcoRＩ）を含んでいる。
これらのプライマーによって得られるインサートＤＮＡを配列番号２に示した。このインサートＤＮＡを、下記に示すように、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターに組込み、蛋白をＧＳＴ融合蛋白として発現させ、その後、トロンビンで処理して、配列番号１に示す組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを調製した。この組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を、文献記載の方法（例えば、G. Zurcher および M. Da Prada.ら, 「Journal of Neurochemistry」, 1982年，38巻, p.191-195 ）に従って調べたところ、完全長のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性とほぼ同等の活性を有することが確認された。
【００２１】
２）組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するためのインサートＤＮＡのクローニングおよび発現
配列番号３記載の５’プライマーおよび配列番号４記載の３’プライマーの各々を、TE緩衝液で希釈して15 pmol/μL 溶液とした。Ｈ２Ｏ（ＰＣＲ用, 34.8μＬ）, 25 mM ＭｇＳＯ４ (2.0μＬ), 2 mM dNTPs (5.0μＬ), １０倍濃縮のＤＮＡポリメラーゼ KOD plus 緩衝液 (5.0μＬ，東洋紡)を混合し、ＰＣＲ反応用混合物を調製した。次いでヒト肝臓ｃＤＮＡ(Invitrogen)(5.0μＬ)が、このＰＣＲ反応用混合物に加えられた。各々のプライマー対(1μＬ, 15 pmol)を上記混合物に加え、最後に1.0μＬのKOD plusが加えられた。その後、ＰＣＲ反応が行われた。ＰＣＲ反応は９４℃２分間、９４℃１５秒間、５９℃３０秒間、６８℃１分間でこのサイクルを４０サイクル行った。次いで６８℃５分間、４℃１０分間で終了した。ＰＣＲ産物の一部1.0μＬを分取し、10 x ローデイング緩衝液(1.2μＬ)とＨ２Ｏ(5.8μＬ)を加えた後に電気泳動により分析した。ＰＣＲ産物は増幅されていた。
ＰＣＲ産物をQIAquick PCR 精製キット（Qiagen）にて精製した。所望のインサートＤＮＡは同キットのEB緩衝液（30μＬ）により溶出された。次いで溶出されたＤＮＡ（1.0μＬ）はTE緩衝液（99μＬ）により希釈され濃度が決定された。当該組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するためのインサートＤＮＡは0.112 μｇ/μＬ, 260nm/280nm = 1.99であった。
【００２２】
３）組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼインサートＤＮＡおよびpGEX-2T ベクターの二重消化
組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼインサートＤＮＡ(1.5μｇ)に、10 x EcoR I 緩衝液 (New England Biolab社) (3.0μＬ), Ｈ２Ｏ(11.1μＬ), BamH I (1.5μＬ, 15 U, 10 u/μＬ)とEcoR I (1.0μＬ, 15 U, 15 U/μＬ)を加え混合した。混合溶液は３７℃で１．５時間加熱された。更にその溶液に１０Xローデイング緩衝液を加えた。混合溶液を電気泳動にて分離し、当該消化断片を有するDNAを含むゲルの部分を切り出し、Qiagen Mini Elute ゲル 抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。当該消化断片ＤＮＡの濃度は33.1 ng/μＬであった。
pGEX-2T ベクターＤＮＡ(1.5μｇ,Amersham)に、10 x EcoR I 緩衝液 (New England Biolab社) (3.0μＬ), Ｈ２Ｏ(21.5μＬ), BamH I (1.5μＬ, 15 U, 10 u/μＬ)とEcoR I (1.0μＬ, 15 U, 15 U/μＬ)を加え混合した。混合溶液は３７℃で１．５時間加熱された。更にその溶液に１０Xローデイング緩衝液を加えた。混合溶液を電気泳動にて分離し、当該消化断片を有するDNAを含むゲルの部分を切り出し、Qiagen Mini Elute ゲル 抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。当該消化断片ＤＮＡの濃度は25.0 ng/μＬであった。
【００２３】
４）ライゲーションと大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
二重消化したpGEX-2T ベクター（2.0μＬ, 50 ng, 25 ng/μＬ）およびインサートＤＮＡ(1.0μＬ, 33.1 ng, 33.1 ng/μＬ)を、2 x ライゲーション緩衝液(5.0μＬ, PGEM)およびＨ２Ｏ(1.7μＬ)に加えて混合した。次いで、リガーゼ(1.0μＬ, 3 U/μＬ, PGEM）を混合溶液に加え、その混合物を２５℃で１時間インキュベーションした。次に、大腸菌JM109(100μＬ)を０℃にて溶解し、リガーゼで反応させた上記混合溶液(5μＬ)をJM109懸濁液に加え、穏やかに混合し、強く振動させないようにしながら（０℃，２０分間，４２℃４０秒間，０℃３０分間）の熱ショックを加えた。次いで、450μＬのSOC溶液を熱ショック後の溶液に加え３７℃で１時間振盪した。振盪後、混合溶液の50μＬと200μＬを、LB-アンピシリン培地のプレート上(直径９ｃｍ, アンピシリン濃度: 100μｇ/mL）にそれぞれ蒔き、３７℃で１６時間の静置培養をおこなった。その結果、プレート上にはコロニーが出現していた。培養後のプレートは使用時まで４℃にて保存した。
【００２４】
５）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼのＰＣＲ法によるコロニーセレクション
以下に示す配列番号５記載の５’プライマーと、配列番号６記載の３’プライマーとを、それぞれTE緩衝液で希釈し、15pmol/μＬ溶液とした。
５’プライマー：５’−ｇａａｇｃｔａｔｃｃｃａｃａａａｔｔｇａｔａａｇ−３’（配列番号５）
３’プライマー：５’−ｃｔｇａｃｇｇｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｔｃｃ−３’（配列番号６）
次いで、５’プライマーの希釈溶液(20 μＬ, 15 pmol/μＬ)、３’プライマーの希釈溶液(20 μＬ, 15 pmol/μＬ)、 Ｈ２Ｏ(460 μＬ)、２倍濃縮AmpliTaq Gold Master Mix (500 μＬ, アプライドバイオシステムズ)を混合し２２本のＰＣＲチューブ(45 μＬ x 22 tubes)に分割した。４）で得られたLB-アンピシリン培地のプレート上より得られたコロニーから２２個を選択し、各々を上記の２２個のＰＣＲ混合溶液に別々に加えＰＣＲ反応を行った。尚、ＰＣＲ反応の条件は以下に示すとおりである。１）９５℃，５分間、２）９５℃，１５秒間、３）６１℃，１５秒間、４）７２℃，１分間、５）１）から４）を４０回繰り返し、６）７２℃，７分間、７）４℃，１０分間。次いでＰＣＲ生成物の1.0μＬを分取し１０Xローデイング緩衝液2.0μＬを加え電気泳動にて分析した。ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが導入されているコロニーを10ｍＬ LB-アンピシリン培地（アンピシリン濃度100μｇ/ｍＬ）に加え３７℃で１５時間の培養を行った。
【００２５】
６）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼプラスミドの大腸菌ＪＭ１０９からの抽出と精製
５）で得られたＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの形質転換が確認されたJM109の培養液は一部(100μＬ)をグリセロールストックとし、残りの培養液は12,000rpmで10分間遠心を行い、大腸菌ペレットを得た。得られた大腸菌ペレットはQiagen plasmid mini kit（Qiagen）のインストラクションマニュアルにより精製し、ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡを得た。それらの濃度はOD260nmによって決定され、311ng/μＬ、ＤＮＡと蛋白質濃度の比はOD260/280=1.87となった。各々のプラスミド溶液はTE緩衝液で希釈し１ng/μＬの溶液とした。得られたプラスミドＤＮＡの配列は、配列番号５および以下に記載の配列番号７に示すプライマーを用い、ダイターミネーター法にて分析することによって配列番号２のＤＮＡ配列のうち、５番目〜６５５番目の塩基を含む配列であることが確認された。
５’−プライマー；５’−ｃａｔｃｇａｇａｔｃａａｃｃｃｃｇａｃｔｇ−３’（配列番号７）
【００２６】
７）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼプラスミドＤＮＡの大腸菌 BL21 CODON PLUS (DE3) RP への形質転換
精製したＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼプラスミドDNA1.0μＬ(1.0ng/μＬ)を０℃で融解した大腸菌BL21 CODON PLUS (DE3) RP 細胞懸濁液50μＬに加え、０℃で３０分間静置した。この混合物に強く振盪すること無しに４２℃で４０秒間の熱ショックを与え、０℃で１０分間冷却した。次いで、450μＬのSOC培地を細胞懸濁溶液に加え、３７℃で１時間振盪した。得られた混合物をLB-アンピシリン培地のプレート(直径. 9cm, アンピシリン濃度100μｇ/mL)に蒔き、３７℃で１５時間静置培養した。
【００２７】
８）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの発現
形質転換後の大腸菌BL21 CODON PLUS (DE3) RP のプレートからＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを発現するためのプラスミドを保有している大腸菌のコロニーを拾い上げ、10ｍＬのLB-アンピシリン培地（アンピシリン濃度100μｇ/ml）に投入した。上記混合物はOD600nm値が0.24になるまで３７℃にて４時間振盪培養を行った。培養液の一部50μＬはグリセロールストックとした。また1.0ｍＬをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド添加前サンプルとして分取した。分取後の残りの混合溶液に0.1Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを9.0μＬ加え２０℃で６時間振盪した。次いで、混合物を12,000rpmで15分間遠心し、大腸菌ペレットを回収し使用時まで−80℃で凍結保存した。
【００２８】
９）ＧＳＴ融合組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼのトロンビン処理
８）から得られたセルペレットは１セルペレット当たり1.8ｍＬのBugBuster溶液(Novagen)により15分間室温にて穏やかに撹拌しながら処理した。得られたライゼートを12,000rpmで15分間遠心し、上澄み液を回収した。次いで、予めD−PBS（DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE）にて平衡化し、D−PBSで50％に再懸濁させた。400μＬのグルタチオン４B Sepharoseの（レジンベッドボリューム200μＬ）を上記上澄み溶液に加え、得られた混合物を4℃にて30分間振盪した。振盪後の混合物をフィルターによりレジンと濾液に分別した。得られたレジンを500μＬのD−PBSで5回洗浄し、300μＬのトロンビン処理用緩衝液（150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 10 % glycerol, 2.5 mM CaCl2, 0.5 % β-オクチル−D−グルコピラノシド）で３回洗浄した。次いで、レジンにトロンビン処理用緩衝液を加え500μＬとし、トロンビン（アマシャムバイオサイエンス）５ユニットを加えた。レジン混合液は４℃で１５時間穏やかに撹拌し、その一部をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、トロンビン処理により組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに該当するバンドが検出された。一部のレジン混合液をろ過して得られた蛋白質の濃度は258μｇ/ｍＬであった。更にエレクトロスプレー四重極型質量分析器にて当該組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分子量を測定したところ観測値＝23994.97となり、配列番号１記載のペプチドから算出される理論値=23997.67と良い一致をみた。
【００２９】
１０）組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの固相抽出による精製と透析処理
トロンビン処理後のレジン懸濁液を空きカラムにロードしその濾液を回収した。次いでこの操作で得られた濾液をGSTrap FF（アマシャムバイオサイエンス）にぺリスタポンプでロードし、その濾液を回収した。この濾液を2.0リットルの緩衝液（10mM NaCl, 10% Glycerol, 20mM Tris pH7.0, 0.5%β−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド, 4.0mM ジチオスレイトール）を用いて一晩透析した。
【００３０】
１１）Super Q-5PWカラムクロマトグラフィー
透析後のサンプル溶液を約10〜12ｍＬ（蛋白質の量として約10mg相当）を0.5ｍＬ/minの流速で予め緩衝液A（10mM NaCl, 10% Glycerol, 20mM Tris pH7.0, 0.5%β−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド, 4.0mM ジチオスレイトール ）にて平衡化されたSuper Q-5PWカラムにロードした。このカラムから目的蛋白質を0.5ｍＬ/minで緩衝液B (10% glycerol, 50mM Tris pH7.0, 4.0mM ジチオスレイトール, 0.2% β−オクチル−D−グルコピラノシド, 700mM NaCl )によりリニアグラジエントで溶出させた（（0％の緩衝液Bで7分間（Super Q-5PWカラム体積の約４倍量相当）、0-20％の緩衝液Bで70分間（Super Q-5PWカラム体積の約４0倍量相当）、20-100%の緩衝液Bで2分間（Super Q-5PWカラム体積の約１倍量相当））。その結果、開始から約50分の溶出により得られるピークをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し、組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分子量を与える事を確認した。
【００３１】
１２）Superdex HR75 prep gradeカラムクロマトグラフィー
１１）で得られたフラクションを合一し、YM-10膜（ミリポア社）により約４ｍＬにまで濃縮した。緩衝液（10% glycerol, 50mM MES pH6.5, 1.0mM ジチオスレイトール,2.5mM MgCl２）で予め２時間平衡化したSupedex HR75 prep gradeカラム（アマシャムバイオサイエンス）に1.0ｍＬのサンプル溶液をロードし、流速1.0ml/minにて溶出を行った。70分後に溶出される分画を組変えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼとして採取した。また、この溶出された分画は組変えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分子量を与えることをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。得られた組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの分画をDevelosil C4カラム（野村化学株式会社）により分析し、95％以上の純度であることを確認した。
【００３２】
実施例２
（組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；３，５−ジニトロカテコール；およびマグネシウムイオンの四成分複合体の結晶化）
実施例１で調整した組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼを含むフラクション10mLをYM-10膜（ミリポア社）により約1.5mLにまで濃縮し、その濃縮液を更にセントリコン-10膜（ミリポア社）にて最終濃度として5.0〜4.8mg/mLとなるように濃縮した。目的濃度にまで濃縮したヒトカテコールＯ-メチルトランスフェラーゼ溶液60μLに60mMのS−アデノシルメチオニン溶液を3.0μL加えて０℃で３０分インキュベーションした。次いで20mM の3,5-ジニトロカテコール溶液を6.0μl加え、同様に０℃で３０分インキュベーションした。結晶化のスクリーニングはハンプトンリサーチ社のCrystal Screen I, IIを使用し、ハンギングドロップ法にてセットアップし、２０℃によりインキュベーションを行った。その結果、0.1M Hepes pH7.5, 2% (v/v)PEG400, 2.0M （ＮＨ４）２ＳＯ４で規定される条件から約４日で黄色の楔状結晶が得られた。
得られた結晶を図１に示す。これらの結晶は、格子定数a=50.584, b=50.584, c=167.240Åで、空間群Ｐ３２２１に属する。それらは１非対称単位に当たり1分子を含み（Ｍｗ= 23.99kDa） 51.85%の溶媒含量であった。（Ｖｍ= 2.57 ; Matthews B.W., 「J. Mol. Biol.」, 1968年, 33巻, p.491-497）
【００３３】
得られた四成分複合体結晶を10〜15％グリセロールを含む結晶化バッファーに約３０〜６０秒浸し、０．５〜０．７mm径クライオループ（ハンプトンリサーチ社）にて掬い取り、液体窒素中に直漬けすることにより急速凍結させた。
【００３４】
実施例３
（組換えヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；３，５−ジニトロカテコール；およびマグネシウムイオンからなる四成分複合体結晶の三次元構造の解析）
１）結晶のデータ収集
実施例２で得られた四成分複合体の結晶の回折データの収集を、ＳＰｒｉｎｇ−８大型放射光施設のビームラインＢＬ３２Ｂ２にて行った。予め凍結してある結晶を−１７３±１．０℃の冷却液体窒素気流中に浸すようにマウントし、波長１．０ÅにてジュピターCCD（株式会社リガク）を使用して測定した。ＣＣＤ検出器と結晶との間の距離は150mmである。データセットは−６０°〜６０°までの範囲を振動角度１．０°〜１．２°にて計１００〜１２０枚のイメージを取得した。Ｘ線の露出時間は４０秒から６０秒/イメージであった。
【００３５】
２）回折データの処理
Mosflm Ver 6.2.1により得られたイメージファイルのデータセットの反射強度の積分を行った。得られたmtzファイルをプログラムsortmtz, プログラムscala, プログラムtruncate（Collaborative Computational Project:(1994) Acta Crystallogr. D50, 760-763 ; CCP4 suite Ver 4.2.2）にて順次処理することで分子置換法用のファイルに変換した。各データセットの統計を下記に示す。
全反射数=29525
独立反射の数=9033
データの完全性(全体/最外殻)=98.9/98.4 (%)
Rマージ(全体/最外郭)=0.085/0.205
リダンダンシー(全体)=3.3
【００３６】
３）空間群の決定
分子置換はプロテインデータバンク（PDB）中のpdb1vid.entからS−アデノシルメチオニン、マグネシウムイオン、３，５−ジニトロカテコール、及び水分子を除いた蛋白質座標をサーチモデルとして使用し、ヒトとラットで種差に起因するアミノ酸の違いについてはアラニンに置換した。AMoRe（Navaza, J. (1994) AmoRe : 分子置換の為の自動パッケージ,Acta Cryst.D50,157-163 CCP4 Ver.4.2）パッケージにて回転と併進の位置を決定した結果、空間群はＰ３２２１と決定できた。結果の詳細を下記に示す。
分解能の範囲：20.0〜3.0 (Å)
剛体Ｒ因子：0.429
【００３７】
４）四成分複合体構造の精密化
構造の精密化はCNX2002 （アクセルリス株式会社）にて行った。テストセットとしては全反射の10％を使用した。主鎖及び側鎖のトレース、及びアミノ酸の置換はQUANTA2000（アクセルリス株式会社）を使用し、CNX2002で作成したオミットマップを参考にしながらモデルの修正を実施した。バルク水マスクはバビネットモデルを使用した。水分子はFo-Fc差フーリエマップを解釈しながらQUANTA2000のSolvation モジュールを使用し、マグネシウムイオン、S−アデノシルメチオニン等のリガンドはプログラム2-D sketcher, プログラムMolecular Editorを使用してモデリングを行い、Fo-Fc差フーリエマップの電子密度に合致するようにマニュアルフィッテイングによるモデリングを行った。個別温度因子精密化を実施した最終の精密化統計値は R=0.254となった。精密化された構造の質を評価する統計諸量を下記に示す。
最終精密化パラメータ
分解能の範囲：10.0-2.5Å
反射：9025
Ｒ因子：0.254
Ｒフリー因子：0.283
残基数：212
原子数：1660
RMS偏差（結合長）：0.010
RMS偏差（結合角）：1.445
平均温度因子（タンパク質）：12.94
平均温度因子（水分子）：21.15
【００３８】
得られた四成分複合体結晶の原子座標を、生体高分子の座標を扱う際の標準的形式であるプロテインデータバンク（ＰＤＢ）のフォーマットに準じて、下記の表１に示した。
【００３９】
【表１】
上記の表において、１〜１３列目はそれぞれ以下：１列目の「ATOM」は原子座標の一つ一つを意味し、「HETATM」は蛋白質以外の化学種を意味する；２列目の数字は原子の通し番号を表す；３列目は各アミノ酸残基、Ｓ−アデノシルメチオニンまたは３，５−ジニトロカテコールにおける位置を表す；４列目は、その原子が属するアミノ酸残基の種類を表し、MGはマグネシウムイオン、SAMはＳ−アデノシルメチオニン、DNCは３，５−ジニトロカテコールを表す；５列目は蛋白質鎖の識別記号を表す；６列目は、そのアミノ酸残基のＮ末端からの番号を表す；７、８および９列目は、それぞれＸ座標、Ｙ座標およびＺ座標（Å単位）を表す；１０列目は占有率を表す；１１列目は等方性温度因子を表す；１２列目はチェインアイデイーを表す；１３列目は原子を表す。
【００４０】
５）リガンド収容ポケットの特性化
図２には、本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体結晶のうち、リガンドを収容するポケット近傍の構造を示した。
ヒトカテコールＯ-メチルトランスフェラーゼのリガンド収容ポケットには、リガンドとマグネシウムイオンとが収容され、活性中心に存在するマグネシウムイオンは、Asp１４３、Asn１７２、Glu２０１の３つのアミノ酸残基の側鎖と配位相互作用を形成し、さらに３，５−ジニトロカテコールの２つの水酸基とも配位相互作用を形成していることが確認された。さらに、Glu２０１の側鎖は３，５−ジニトロカテコールの片方のヒドロキシル酸素原子と水素結合を形成し、複合体を安定化していると考えられる。Trp４０の側鎖であるインドール環は３，５−ジニトロカテコールのベンゼン環とEdge-to-FaceのＣＨ−π相互作用を起こしていることが確認された。また、Pro１７６のγ位の炭素原子は３，５−ジニトロカテコールのベンゼン環とファンデルワールス相互作用を形成していた。さらにLys１４６の側鎖のＮｚ原子は３，５−ジニトロカテコールのＳ−アデノシルメチオニン側のヒドロキシル酸素原子方向に向き、複合体を静電気的に安定化していると考えられる。
リガンド収容ポケットの近傍では、Arg２０３の側鎖はGlu３６と水素結合を形成し、３，５−ジニトロカテコール側に配向していないことが明らかになった。本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶と、公知のラットカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体結晶の三次元構造とを比較したところ、ラットカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼでは、Arg２０３に相当するアミノ酸残基が疎水性を有するメチオニンであって、このメチオニン残基の側鎖はリガンドの位置する方向に突き出ているのに対して、ヒトカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼでは、図２に示すようにArg２０３の側鎖がリガンドと反対方向に向いてGlu３６と水素結合を形成しており、ヒトカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、ラットラットカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼに比べて広いリガンド収容ポケットを有することが明らかとなった。係る知見は、本発明の四成分複合体の結晶を解析することによって初めて明らかとされたものである。
【００４１】
６）Ｓ−アデノシルメチオニン収容ポケットの特性化
図３には、本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体結晶のうち、Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケット近傍の構造を示した。
Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケットを以下のように特性化した。すなわち、ＱＵＡＮＴＡ（アクセルリス社製）を用い、Ｓ−アデノシルメチオニンから５Åの範囲内に位置するアミノ酸残基を切り出したところ、以下のアミノ酸残基：Met４２、Asn４３、Val４４、Leu６７、Gly６８、Ala６９、Tyr７０、Cys７１、Gly７２、Tyr７３、Ser７４、Ile９１、Glu９２、Ile９３、Asn９４、Cys９７、Gly１１９、Ala１２０、Ser１２１、Gln１２２、Phe１４１、Asp１４３、His１４４およびTrp１４５が同定された。
Trp１４５は、Ｓ−アデノシルメチオニンのアデニン環とedge-to-faceの相互作用を起こし安定化していた。同様に、His１４４はＳ−アデノシルメチオニンのアデニン環とedge-to-faceの相互作用を形成していた。またIle９３の側鎖はＳ−アデノシルメチオニンのアデニン環の環上に位置し、ファンデルワールス相互作用を成していた。Glu９２はＳ−アデノシルメチオニンのリボース環上の２つの水酸基と水素結合を形成していた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドの四成分複合体結晶により、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼに関する詳細な三次元構造が得られるので、当該結晶は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤の分子設計に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、本発明のヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体の結晶の写真を示す。
【図２】図２は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体のうち、リガンドを収容するポケット近傍の三次元構造を示す。黒いボールアンドステイックモデルはＳ−アデノシルメチオニンを示す。マグネシウムイオンを灰色の球として示す。灰色のボールアンドステイックモデルは３，５−ジニトロカテコールを示す。
【図３】図３は、ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；および３，５−ジニトロカテコール四成分複合体のうち、Ｓ−アデノイルメチオニンを収容するポケット近傍の三次元構造を示す。黒いボールアンドステイックモデルはＳ−アデノシルメチオニンを示す。マグネシウムイオンを灰色の球として示す。灰色のボールアンドステイックモデルは３，５−ジニトロカテコールを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶であって、
該ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、
該結晶が、空間群Ｐ３2２１を有し、格子定数が、ａが５０．５８ű０．３Å、ｂが５０．５８ű０．３Å、ｃが１６７．２４ű０．４Å、αが９０．０°、βが９０．０°、γが１２０．０°に等しい値を有する、結晶。
【請求項２】
前記リガンドが、３，５−ジニトロカテコールである、請求項１記載の結晶。
【請求項３】
表１に記載される原子座標を有する、請求項２記載の結晶。
【請求項４】
前記ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケットを有し、該ポケットが、Ｓ−アデノシルメチオニンから５Åの範囲に含まれる、Met４２、Asn４３、Val４４、Leu６７、Gly６８、Ala６９、Tyr７０、Cys７１、Gly７２、Tyr７３、Ser７４、Ile９１、Glu９２、Ile９３、Asn９４、Cys９７、Gly１１９、Ala１２０、Ser１２１、Gln１２２、Phe１４１、Asp１４３、His１４４およびTrp１４５、を含むアミノ酸残基により形成される、請求項１〜３のいずれか一項記載の結晶。
【請求項５】
前記ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、リガンドを収容するポケットを有し、該ポケットが、Trp４０、Met４２、Asp１４３、Trp１４５、Lys１４６、Asp１７１、Asn１７２、Pro１７６、Leu２００およびGlu２０１、を含むアミノ酸残基により形成される、請求項１〜４のいずれか一項記載の結晶。
【請求項１】
ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ；Ｓ−アデノシルメチオニン；マグネシウムイオン；およびリガンドからなるヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼの結晶であって、
該ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、
該結晶が、空間群Ｐ３2２１を有し、格子定数が、ａが５０．５８ű０．３Å、ｂが５０．５８ű０．３Å、ｃが１６７．２４ű０．４Å、αが９０．０°、βが９０．０°、γが１２０．０°に等しい値を有する、結晶。
【請求項２】
前記リガンドが、３，５−ジニトロカテコールである、請求項１記載の結晶。
【請求項３】
表１に記載される原子座標を有する、請求項２記載の結晶。
【請求項４】
前記ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、Ｓ−アデノシルメチオニンを収容するポケットを有し、該ポケットが、Ｓ−アデノシルメチオニンから５Åの範囲に含まれる、Met４２、Asn４３、Val４４、Leu６７、Gly６８、Ala６９、Tyr７０、Cys７１、Gly７２、Tyr７３、Ser７４、Ile９１、Glu９２、Ile９３、Asn９４、Cys９７、Gly１１９、Ala１２０、Ser１２１、Gln１２２、Phe１４１、Asp１４３、His１４４およびTrp１４５、を含むアミノ酸残基により形成される、請求項１〜３のいずれか一項記載の結晶。
【請求項５】
前記ヒトカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼが、リガンドを収容するポケットを有し、該ポケットが、Trp４０、Met４２、Asp１４３、Trp１４５、Lys１４６、Asp１７１、Asn１７２、Pro１７６、Leu２００およびGlu２０１、を含むアミノ酸残基により形成される、請求項１〜４のいずれか一項記載の結晶。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２３（Ｐ２００６−２３Ａ）
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１７７８００（Ｐ２００４−１７７８００）
【出願日】平成１６年６月１６日（２００４．６．１６）
【出願人】（０００１０４５６０）キッセイ薬品工業株式会社 (78)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１６日（２００４．６．１６）
【出願人】（０００１０４５６０）キッセイ薬品工業株式会社 (78)
【Ｆターム（参考）】
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