ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により発症された腫瘍性又は癌性病変に対するワクチン、処置、用途及び方法
【課題】 ヒトパピローマウイルス（HPV)により発症された腫瘍性又は癌性病変に対する新規なワクチンを提供する。
【解決手段】 本発明のワクチンはＥ７ペプチド球状粒子と、所望により、アジュバントとからなり、球状粒子はオリゴマーである。このオリゴマー球状粒子は直径が約５０ｎｍであり、分子量が約７００ｋＤａである。本発明のワクチンはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連病変の予防又は治療若しくは同時に予防と治療を行うのに有用である。
【解決手段】 本発明のワクチンはＥ７ペプチド球状粒子と、所望により、アジュバントとからなり、球状粒子はオリゴマーである。このオリゴマー球状粒子は直径が約５０ｎｍであり、分子量が約７００ｋＤａである。本発明のワクチンはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連病変の予防又は治療若しくは同時に予防と治療を行うのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により発症された腫瘍性又は癌性病変に対するワクチンに関する。特に、本発明は、前記ウイルスのＥ７−ペプチド球状粒子と場合によりアジュバントとからなるワクチンに関する。ここで、前記球状粒子はオリゴマーである。オリゴマー球状粒子の直径は約５０ｎｍであり、分子量は約７００ｋＤａである。本発明によるワクチンはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連病変の予防又は治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＰＶは子宮頸癌の病原体であり、世界中の癌罹患女性の死亡原因の第２位である。概算値であるが、子宮頸癌の罹患患者の約５０万人は発展途上国の人々である。その理由は、これら発展途上国の人々についてルーチン検査するための例えば、パパニコロー塗抹標本（Ｐａｐ）が欠如しているためである。
【０００３】
現在までに発見されている１００個を越えるＨＰＶ遺伝子型のうち、４０％が粘膜領域に感染する。高リスクＨＰＶによる持続性感染は子宮頸癌発生のための重要なファクター（ケースのうち＞９５％）である。しかし、この癌は、膣（６５〜９０％）、外陰（４０％）、ペニス（４０％）及び肛門管（９０％）などのようなその他の肛門性器腫瘍にも関連し、極僅かではあるが、口腔腫瘍（ケースのうち＜３０％）にも関連する（非特許文献１参照）。子宮頸癌の半数超がＨＰＶ第１６遺伝子型により発生される。この第１６遺伝子型は、高リスクタイプのＨＰＶ第１８，３１及び４５遺伝子型と共に、全てのケースのうちのほぼ８０％を示す（非特許文献２参照）。ＨＰＶ第６及び１１のような低リスク遺伝子型は、良性生殖器疣贅（ゆうぜい）を発生する。これは恐らく、最も一般的な性感染症である。
【０００４】
現存の予防ワクチンは、ＨＰＶ第１６及び１８のような最も高リスクな優勢遺伝子型による感染に対して体液免疫保護効果を創成するのに極めて有効であることが証明されている。しかし、ＨＰＶ感染を予防するのに〜１００％有効であるにも拘わらず、これらのワクチンは既に存在する腫瘍形成過程に関して治療効果を有しない。従って、これらのワクチンは子宮頸癌発病率に対して直ちに影響を与えることはない（非特許文献３参照）。
【０００５】
子宮頸癌は、組織学的に極めて明確に認められる子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）の前駆病変スペクトルから生じる。このタイプの病変は、細胞学的探査プログラムの過程で極普通に検出され、通常、レーザ治療又は冷凍療法により外科的に除去されるか又は破壊される。多くの感染女性は依然として生殖可能年齢であり、これらの進行は或る程度の関連病的状態を必然的に伴い、また、不妊症の原因となることもあり得るので、別の治療法の開発が絶対的に必要である。
【０００６】
持続性感染は高度ＣＩＮの発生の先行必要条件であり、また、この感染は屡々臨床症状が現れる数年以上も前に先行することが追試研究により明らかにされた。従って、たとえ曝露後の状態であっても、子宮頸癌治療には貴重な長い時間窓が存在するものと思われる（非特許文献４参照）。
【０００７】
発症したＨＰＶ感染を処置するために治療ワクチンを使用できる。従って、これらのワクチンはＨＰＶ関連悪性腫瘍の罹患率に即時的効果を有するであろう。治療ワクチン戦略は、感染細胞に対する細胞性免疫の発生により先在病変及び悪性腫瘍も消去しようとする。従って、現存の病変を消去するために、治療ワクチンは感染した悪性変換細胞内に構成要素的に発現されるＨＰＶ抗原を狙い打ちしなければならない。多くの理由により、ＨＰＶ初期タンパク質Ｅ６及びＥ７はこの目的のための理想的な目標となる。その第１の理由は、これらタンパク質はＨＰＶ腫瘍内に構成要素的に発現されるからである。また第２の理由は、Ｅ６及びＥ７はＨＰＶ感染細胞への細胞形質転換の誘発及び維持のために決定的なので、腫瘍細胞が抗原の消失により免疫攻撃を逃れることができるということはあり得ないからである。更に第３の理由は、Ｅ６及びＥ７は両方とも外来タンパク質なので、免疫寛容などのような癌ワクチンに付随する一般的問題の幾つかを避けることが出来るからである（非特許文献５参照）。これら２個の腫瘍ウイルスタンパク質のうち、最も関連性のあるのはＥ７ペプチドである。
【０００８】
最近、幾つかの報告は、前臨床及び臨床研究におけるＨＰＶ１６系ワクチン由来のＥ７の治療有効性を示している。これらのＨＰＶワクチン候補は、Ｅ７情報を帯有する組み換え生ベクター、精製Ｅ７タンパク質、Ｅ７-ＨＬＡペプチドエピトープ及びＥ７発現プラスミドなどである。これらの多くのケースにおいて、戦略はＥ７タンパク質、ペプチド又は遺伝子と、炎症又は免疫を高める別の公知の分子との融合も含む（非特許文献５参照）。ＤＮＡ系ワクチン技術に関してこの１０年間に起こった桁外れの進歩及び実験モデルで達成された見込みのある結果にもかかわらず、優れた生物における乏しい免疫原性及び倫理的問題の両方が依然としてこれらの主要な欠点として存在する。これに関して、タンパク質系ワクチンは、安全性を提供し、比較的低コストであり、更に高免疫原性により、依然として第１の選択肢を構成する。この他、前代のアジュバントの使用は、宿主又はＴ細胞介在治療の体液保護を助力する必要性に応じて、候補タンパク質免疫原性特性を一層変性する。これらアジュバントの使用により、融合免疫賦活性遺伝子に対する長たらしくて飽き飽きする技術的ステップ及び過剰な望ましからざる生理学的反応を避けることができる。
【０００９】
Ｅ７は、そのｃ末端ドメインを介して亜鉛に結合された小さな酸性ペプチドである。一般的に、ＨＰＶワクチン候補の治療有効性は子宮頸癌-Ｔｃ１マウス腫瘍について試験される。これはＨＰＶ１６-腫瘍表現型に似ている。Ｔｃｌ細胞系は、ＨＰＶ１６由来のＥ６及びＥ７で不死化され、かつ、ｃ-Ｈａ-ｒａｓ発癌遺伝子で形質転換されたＣ５７ＢＬ／６-マウスの主要上皮細胞から得られる（非特許文献６参照）。この同時形質転換は腫瘍原性細胞系を産生した。この腫瘍原性細胞系は、Ｅ６及びＥ７腫瘍性タンパク質を発現し、固有配列を子宮頸癌進行に似せる。これらの腫瘍性タンパク質は細胞を不死化し、そして、その後の細胞前癌遺伝子への突然変異はこれらを転移可能性を有する腫瘍細胞に形質転換する。得られたＴｃ１細胞系は高い分裂速度を有し、急速に成長する。腫瘍成長に関する試験によれば、５ｘ１０４個の細胞の皮下接種は注射後２０日以内にマウス内で１００％腫瘍を発生させるのに十分であることが示された（非特許文献６参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Parkin, D.M. and Bray, F.(2006)Capter 2:The burden of HPV-related cancers. Vaccine, 24 Suppl 3, S11-25
【非特許文献２】Clifford, G. et al.,(2006)Capter 3: HPV type distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine, 24 Suppl 3, S26-34
【非特許文献３】Kols, A. et al.,(2006). PATH, Seattle, WA. USA and Leggatt, G.R. and Frazer, I.H.(2007) Curr Opin Immunol, 19, 232-238
【非特許文献４】Michel, N., et al.,(2002)Intervirology, 45, 290-299
【非特許文献５】Hung, C.F., et al., (2008)Expert Opin. Biol. Ther., 8, 421-439
【非特許文献６】Lin, K.Y., et al.,(1996)Cancer Re.s, 56, 21-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＨＰＶにより発症された癌性病変に対する新規なワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、ＨＰＶにより発症された癌性病変に対する新規なワクチンとして、パピローマウイルスのＥ７ペプチド球状粒子と、所望によりアジュバントとからなり、前記球状粒子はオリゴマーであるワクチンを提供する。オリゴマー球状粒子の直径は約５０ｎｍであり、分子量は約７００ｋＤａである。本発明によるワクチンはＨＰＶ関連病変を予防又は治療することができる。
【００１３】
また、上記の課題を解決するために、本発明は、前記球状粒子の安定化方法を提供する。この球状粒子安定化方法は、前記球状粒子を酸化することからなる。好ましい実施態様では、この酸化は、球状粒子を硫酸銅と接触させることにより行われる。球状粒子を硫酸銅と接触させたら、続いて、培養し、そして、その後、残留銅を除去する。
【００１４】
更に、本発明は、ＨＰＶにより発症された病変部の治療用薬剤を製造するための前記球状粒子の用途を提供する。
【００１５】
また、上記の課題を解決するために、本発明は、ＨＰＶ病変抗体陽性者の治療方法を提供する。この治療方法は、ＨＰＶＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個体に投与することからなる。
【００１６】
更に、上記の課題を解決するために、本発明は、ＨＰＶに対する免疫付与方法を提供する。この免疫付与方法は、パピローマウイルスＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個体に投与することからなる。
【発明の効果】
【００１７】
以上述べたように、本発明により、ＨＰＶにより発症された癌性病変に対する新規なワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１に従ってＥ７-ＭＰＬ及びＥ７ＳＯ-ＭＰＬで予防的ワクチン接種を行った結果を示す特性図であり、図１Ａは、横軸に示された各日時におけるＭＰＬ、Ｅ７-ＭＰＬ、Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬ及びＥ７ＳＯがワクチン接種された各マウスの腫瘍体積を示す。図１Ａにおいて＊記号が付されたマウスは不健康な全身状態と腫瘍の異常位置を示す。図１Ｂは各治療における無腫瘍期間の特性曲線を示す。図中、−○−はＥ７-ＭＰＬ、−□−はＥ７ＳＯ-ＭＰＬ、−△−はＭＰＬ、−×−はＥ７ＳＯをそれぞれ示す。図１Ａの縦軸：腫瘍体積（ｃｍ３）、横軸：時間（日数）を表す。図１Ｂの縦軸：無腫瘍マウス（％）、横軸：Ｔｃ１による接種後日数を表す。
【図２】実施例２に従ってＴｃｌ腫瘍保有マウスの治療結果を示す特性図である。図中、−○−はＥ７-ＭＰＬ粒子からなる組成物、−□−はＥ７ＳＯ-ＭＰＬ球状粒子からなる組成物、及び−△−は対照としてのＭＰＬからなる組成物をそれぞれ示す。腫瘍体積成長は治療後の経過日数の関数として示すことが出来る。図２の縦軸：腫瘍体積（ｃｍ３），横軸：Ｔｃ１による接種後日数を表す。
【図３】実施例２に従ってＴｃｌ腫瘍保有マウスの治療結果を示す特性図である。図中、−○−はＥ７-ＭＰＬ二量体粒子からなる組成物、−□−はＥ７ＳＯ-ＭＰＬ球状粒子からなる組成物、及び−△−は対照としてのＭＰＬからなる組成物をそれぞれ示す。治療効果は腫瘍保有マウスの生存率の関数として示される。図３の縦軸：生存率（％），横軸：腫瘍の接種後日数を表す。
【図４】ＯＤＮ２００６アジュバントと併用されるＥ７（Ｅ７ＳＯ）オリゴマー粒子からなるワクチンの治療能力を示す。この能力は腫瘍サイズを測定することにより評価した。図４の縦軸：腫瘍体積（ｃｍ３），横軸：腫瘍の接種後日数を表す。 （図中の「Desafio」は「攻撃感染」の意である
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について、添付図面を参照しながら詳述する。
【００２０】
本明細書において、「ワクチン」という用語は、ＨＰＶ病変に対して保護又は治療活性の一方又は両方を同時に有する組成物を意味する。
【００２１】
本明細書において、「Ｅ７」という頭辞語は、Ｅ７二量体粒子からなるワクチンに対応することを意味する。「Ｅ７-ＭＰＬ」は、Ｅ７二量体粒子とＭＰＬアジュバントからなるワクチンに対応する。「Ｅ７-ＳＯ」は、Ｅ７オリゴマー球状粒子とＭＰＬアジュバントからなるワクチンに対応する。驚くべきことに、オリゴマー球状粒子は非常に高い抗腫瘍活性を示した。
【００２２】
Ｅ７オリゴマー球状粒子（Ｅ７ＳＯ）と所望によりアジュバントとからなる本発明によるワクチンの予防抗腫瘍効果を評価した。ＨＰＶ１６Ｅ７を発現するＴｃｌ腫瘍細胞系に対する粒子の保護能力を評価した。これに基づき、ワクチン投与量の最後の投与から７日目（２８日目）に、免疫化した全てのマウスに、致死量のＴｃｌ細胞を攻撃感染させた。図１はクチン接種されたマウスの様々な群に関する腫瘍成長曲線を示す。
【００２３】
これらのデータによれば、ＭＰＬアジュバントで免疫化されたマウスの１００％が、攻撃感染後７〜１５日以内に大きな侵略的腫瘍を発生し、全てのマウスが３５日目に死亡した（図１Ａ及びＢ参照）。これに対して、オリゴマー球状粒子とアジュバントからなる本発明によるワクチン（Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬ、例えば、ＭＰＬ）を投与すると、８０％のマウスで腫瘍の発生が阻止され、更に９０日間経過後も無腫瘍のままであった。この他、腫瘍が発生された２匹のマウスにおいて、前記腫瘍の出現は、ＭＰＬだけを予防接種された対照マウスに対して、１０〜２０日間も遅かった。
【００２４】
興味深いことに、全てのＥ７ＳＯ免疫化マウスが腫瘍を発生したが、ＭＰＬだけの対照群により示された腫瘍発生に対して、腫瘍発生が遅かった。この事実は、Ｅ７ＳＯはたとえアジュバントが無くても、或る程度の抗腫瘍効果を有することを意味する。
【００２５】
Ｔｃ１腫瘍を有する被攻撃感染動物を保護するための、球状粒子とアジュバントとからなる本発明のワクチン（Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬ）の能力を示したが、ＨＰＶ１６Ｅ７発癌遺伝子を発現する腫瘍保有マウスの治療のための前記ワクチンの能力を評価した。この場合、メスのマウスに５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射により接種させ、腫瘍が触知できたら（７日目）、マウスをＥ７-ＭＰＬ又はＥ７ＳＯ-ＭＰＬからなるワクチンで処置した。第２回目の投与は２週間後（２１日目）に行った。図２に示されるように、本発明によるワクチンの予防接種は腫瘍成長を顕著に遅延させた。３２日目に、ＭＰＬ免疫化マウス（対照群）の殆どは腫瘍の拡大により死亡した。Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬワクチン接種マウスにおける腫瘍の平均体積は対照群よりも４倍も小さかった（〜２．３ｃｍ３（対照群）ｖｓ〜０．６ｃｍ３（本発明））。更に、Ｅ７-ＭＰＬでワクチン接種されたマウスも３２日目に対照群の腫瘍サイズと同様な腫瘍サイズ増大を示し、Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬワクチン処置マウスにおける腫瘍サイズよりもほぼ４倍大きかった。
【００２６】
治療効果の差も、様々なマウス群の生存率により示される。Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬで処置された群の３５日目の生存率は１００％であったが、ＭＰＬ処置群（対照群）の生存率は０％であった（図３参照）。腫瘍に対する保護に関する実験において、Ｅ７二量体粒子からなるワクチンは治療効果がさほど高くないことも示された（図２及び図３参照）。この事実は、腫瘍保有メスマウスでは、Ｅ７オリゴマー状態は、細胞毒性Ｔ細胞により仲介される効果的な抗腫瘍反応の誘発に必須要件であることを意味する。
【００２７】
本発明によるワクチン（例えば、Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬワクチン）を低投与量でメスのマウスに予防接種すると、完全な体液及び細胞免疫反応を誘発した。即ち、抗Ｅ７血清特異性ＩｇＧ力価とＴｃｌ腫瘍細胞発現Ｅ７に対する保護免疫性を誘発した。更に、腫瘍保有メスマウスへのＥ７ＳＯ-ＭＰＬワクチンのワクチン接種は、過大な腫瘍成長の進行を遅らせ、そして、生存期間を延長させた。従って、免疫治療薬としてのワクチン潜在能力が示された。
【００２８】
図４から明らかなように、Ｅ７ＳＯオリゴマー球状粒子は、例えば、二量体Ｅ７に比較して、高い治療効果を有する。ヒト細胞におけるアジュバントとして有効性が証明されているオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ２００６）と併用されるＥ７オリゴマー球状粒子からなるワクチンの治療能力を評価した（Hartmann, G. et al., (2000) J. Immunol., 164, 1617-1624参照）。
【００２９】
本発明のワクチンは、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）アジュバント又はＯＤＮアジュバントのようなアジュバントと併用することができる。ＭＰＬアジュバントは、グラム陰性バクテリア壁内のリポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体である。ワクチン製造分野における専門家は、任意のアジュバントが使用可能であることを知っている。従って、全てのアジュバントが本発明のワクチンとともに使用できる。好ましい実施態様では、アジュバントはＭＰＬ又はＯＤＮである。
【００３０】
本発明によるワクチンの抗原特性をワクチン接種マウス血清抗体の力価のＥＬＩＳＡ適用量により評価した。本発明のＥ７ＳＯ-ＭＰＬワクチンによる免疫化はＥ７高リスクペプチドに対するＩｇＧ抗体の特異的力価（〜１／６０００）を生じる。
【００３１】
本発明の実施態様において、大腸菌(Escherichia coli)内で組み換え的に発現された化学的に純粋なＥ７タンパク質を大量に得ることを可能にする精製方法が示され、かつ、主な種は分子量が２２ｋＤａの二量体であることが実証された。本発明の別の実施態様では、平均分子量が７９０ｋＤａで直径が５０ｎｍの均質な球状粒子に集合させることができるタンパク質を得る方法が示される。この集合は非常に緩慢なプロセスであり、タンパク質は、その三次構造の同時連結を伴う実質的な立体配座転移を被る。得られた粒子（Ｅ７ＳＯ）は非常に安定であり、協同して襞を形成し、かつ、これらの粒子は可溶性又は不溶性アミロイド中に発見されるβシート構造に似ている。
【実施例１】
【００３２】
生体内予防に関する実験
マウス群（ｎ＝５）を様々なグループにランダムに分配させ、２１日間隔で２回腹腔内注射によりワクチン接種した、接種したワクチンは、Ｅ７二量体５０μｇ又は高精製Ｅ７可溶性オリゴマー５０μｇと、ＭＰＬアジュバント２５μｇ（すなわち、Ｅ７-ＭＰＬ接種群とＥ７ＳＯ-ＭＰＬ接種群）、アジュバント無しのＥ７可溶性オリゴマー５０μｇ（Ｅ７ＳＯ接種群）又はＭＰＬのみ２５μｇ（ＭＰＬ接種群）であった。最後の免疫強化から７日経過後（２８日目）、マウスに診査出血を受けさせ、次いでマウスの左側に５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射で接種した。全ての実験において、マウス内に埋め込まれた腫瘍細胞の生存能力は＞９０％であった。腫瘍成長は１週間当たり２回、電子的測径器を用いて測定し、また、腫瘍体積は（長さｘ幅２）／２の式に基づいて計算した。腫瘍のサイズが約３ｃｍ３になった時点でマウスを殺した。
【実施例２】
【００３３】
治療実験
治療実験のために、先ず、マウスの左側に５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射で攻撃感染させた（０日目）。全てのマウスに触知可能な腫瘍が生じた時点（７日目）で、マウスを自由裁量的に各群（１群５匹）に割り当て、Ｅ７-ＭＰＬ、E7SO-ＭＰＬ又はMPL単独を腹腔内にワクチン接種した。ワクチン投与量は実施例１で使用された投与量と同じであった。２１日目に２回目の免疫強化を行った。腫瘍のサイズが約２．５ｃｍ３に達した時点でマウスを殺した。
【実施例３】
【００３４】
ワクチンで使用するＥ７二量体及びＥ７ＳＯオリゴマーの製造
ＨＰＶ１６由来のＥ７を、Alonso, L.G., et al., (2002). Biochemistry, 41, 10510-10518に記載された方法に従って精製した。Ｅ７ＳＯは、Alonso, L.G., et al., (2004). Biochemistry, 43, 3310-3317に記載された方法に従って培養された高純度Ｅ７二量体粒子から製造した。その後、Ｅ７ＳＯ４０μＭのリン酸ナトリウム１０ｍＭ溶液（ｐＨ７．０）に、最終濃度が２０μＭになるまで硫酸銅を添加した。そして、２８℃で２４時間培養した。酸化後、サンプルをリン酸ナトリウム１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析させ、過剰量のＣｕを除去した。オリゴマー酸化状態を還元剤無しにＳＤＳ-ＰＡＧＥ１５％中で評価した。
【実施例４】
【００３５】
ワクチンの製造
ＭＰＬアジュバントの水溶液をBaldrige, J.R. and Crane, R.T.,(1999). Method, 19, 103-107に記載された方法に従って製造した。その後、この水溶液を４℃で維持した。所望の最終濃度（０．２５μｇ／μＬ）までＰＢＳ緩衝液で希釈されたＥ７ＨＰＶ１６の二量体粒子及びオリゴマー粒子を、投与する直前に、実施例１に述べた割合でＭＰＬアジュバントと混合させた。各マウスに投与された最終容量は２００μＬであった。
【実施例５】
【００３６】
アジュバントＯＤＮを含有するワクチンの製造
ＯＤＮ２００６アジュバントの水溶液をHartmann, G. et al., (2000) J. Immunol., 164, 1617-1624に記載された方法に従って製造した。その後、この水溶液を−２０℃で維持した。Ｅ７ＳＯ粒子（投与量６０μｇ）をＰＢＳ緩衝液中で希釈し、投与直前にＯＤＮ２００６アジュバント（投与量３０μｇ）と混合させた。各マウスに投与された最終容量は２００μＬであった。
【実施例６】
【００３７】
ＯＤＮによる治療実験
先ず、メスのマウスの左側に５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射で接種させることにより治療実験を行った（０日目）。４日間経過後（４日目）、マウスを自由裁量的に各群に割り当て、マウスの尻尾の付け根にワクチンを皮下注射により接種した。接種したワクチンは、高精製Ｅ７可溶性オリゴマー６０μｇ＋ＯＤＮ２００６アジュバント３０μｇ（Ｅ７ＳＯ-ＯＤＮ接種群；１群当たりマウス８匹）又はＯＤＮ２００６アジュバントのみ（ＯＤＮ接種群；１群当たりマウス４匹）であった。１１日目に２回目の免疫強化接種を行った。腫瘍のサイズが約２．５ｃｍ３に達した時点でマウスを殺した。
【００３８】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するために用いてはならない。また、同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。用語「又は」に関して、例えば「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」、「Ｂのみ」ならず、「ＡとＢの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により発症された腫瘍性又は癌性病変に対するワクチンに関する。特に、本発明は、前記ウイルスのＥ７−ペプチド球状粒子と場合によりアジュバントとからなるワクチンに関する。ここで、前記球状粒子はオリゴマーである。オリゴマー球状粒子の直径は約５０ｎｍであり、分子量は約７００ｋＤａである。本発明によるワクチンはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連病変の予防又は治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＰＶは子宮頸癌の病原体であり、世界中の癌罹患女性の死亡原因の第２位である。概算値であるが、子宮頸癌の罹患患者の約５０万人は発展途上国の人々である。その理由は、これら発展途上国の人々についてルーチン検査するための例えば、パパニコロー塗抹標本（Ｐａｐ）が欠如しているためである。
【０００３】
現在までに発見されている１００個を越えるＨＰＶ遺伝子型のうち、４０％が粘膜領域に感染する。高リスクＨＰＶによる持続性感染は子宮頸癌発生のための重要なファクター（ケースのうち＞９５％）である。しかし、この癌は、膣（６５〜９０％）、外陰（４０％）、ペニス（４０％）及び肛門管（９０％）などのようなその他の肛門性器腫瘍にも関連し、極僅かではあるが、口腔腫瘍（ケースのうち＜３０％）にも関連する（非特許文献１参照）。子宮頸癌の半数超がＨＰＶ第１６遺伝子型により発生される。この第１６遺伝子型は、高リスクタイプのＨＰＶ第１８，３１及び４５遺伝子型と共に、全てのケースのうちのほぼ８０％を示す（非特許文献２参照）。ＨＰＶ第６及び１１のような低リスク遺伝子型は、良性生殖器疣贅（ゆうぜい）を発生する。これは恐らく、最も一般的な性感染症である。
【０００４】
現存の予防ワクチンは、ＨＰＶ第１６及び１８のような最も高リスクな優勢遺伝子型による感染に対して体液免疫保護効果を創成するのに極めて有効であることが証明されている。しかし、ＨＰＶ感染を予防するのに〜１００％有効であるにも拘わらず、これらのワクチンは既に存在する腫瘍形成過程に関して治療効果を有しない。従って、これらのワクチンは子宮頸癌発病率に対して直ちに影響を与えることはない（非特許文献３参照）。
【０００５】
子宮頸癌は、組織学的に極めて明確に認められる子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）の前駆病変スペクトルから生じる。このタイプの病変は、細胞学的探査プログラムの過程で極普通に検出され、通常、レーザ治療又は冷凍療法により外科的に除去されるか又は破壊される。多くの感染女性は依然として生殖可能年齢であり、これらの進行は或る程度の関連病的状態を必然的に伴い、また、不妊症の原因となることもあり得るので、別の治療法の開発が絶対的に必要である。
【０００６】
持続性感染は高度ＣＩＮの発生の先行必要条件であり、また、この感染は屡々臨床症状が現れる数年以上も前に先行することが追試研究により明らかにされた。従って、たとえ曝露後の状態であっても、子宮頸癌治療には貴重な長い時間窓が存在するものと思われる（非特許文献４参照）。
【０００７】
発症したＨＰＶ感染を処置するために治療ワクチンを使用できる。従って、これらのワクチンはＨＰＶ関連悪性腫瘍の罹患率に即時的効果を有するであろう。治療ワクチン戦略は、感染細胞に対する細胞性免疫の発生により先在病変及び悪性腫瘍も消去しようとする。従って、現存の病変を消去するために、治療ワクチンは感染した悪性変換細胞内に構成要素的に発現されるＨＰＶ抗原を狙い打ちしなければならない。多くの理由により、ＨＰＶ初期タンパク質Ｅ６及びＥ７はこの目的のための理想的な目標となる。その第１の理由は、これらタンパク質はＨＰＶ腫瘍内に構成要素的に発現されるからである。また第２の理由は、Ｅ６及びＥ７はＨＰＶ感染細胞への細胞形質転換の誘発及び維持のために決定的なので、腫瘍細胞が抗原の消失により免疫攻撃を逃れることができるということはあり得ないからである。更に第３の理由は、Ｅ６及びＥ７は両方とも外来タンパク質なので、免疫寛容などのような癌ワクチンに付随する一般的問題の幾つかを避けることが出来るからである（非特許文献５参照）。これら２個の腫瘍ウイルスタンパク質のうち、最も関連性のあるのはＥ７ペプチドである。
【０００８】
最近、幾つかの報告は、前臨床及び臨床研究におけるＨＰＶ１６系ワクチン由来のＥ７の治療有効性を示している。これらのＨＰＶワクチン候補は、Ｅ７情報を帯有する組み換え生ベクター、精製Ｅ７タンパク質、Ｅ７-ＨＬＡペプチドエピトープ及びＥ７発現プラスミドなどである。これらの多くのケースにおいて、戦略はＥ７タンパク質、ペプチド又は遺伝子と、炎症又は免疫を高める別の公知の分子との融合も含む（非特許文献５参照）。ＤＮＡ系ワクチン技術に関してこの１０年間に起こった桁外れの進歩及び実験モデルで達成された見込みのある結果にもかかわらず、優れた生物における乏しい免疫原性及び倫理的問題の両方が依然としてこれらの主要な欠点として存在する。これに関して、タンパク質系ワクチンは、安全性を提供し、比較的低コストであり、更に高免疫原性により、依然として第１の選択肢を構成する。この他、前代のアジュバントの使用は、宿主又はＴ細胞介在治療の体液保護を助力する必要性に応じて、候補タンパク質免疫原性特性を一層変性する。これらアジュバントの使用により、融合免疫賦活性遺伝子に対する長たらしくて飽き飽きする技術的ステップ及び過剰な望ましからざる生理学的反応を避けることができる。
【０００９】
Ｅ７は、そのｃ末端ドメインを介して亜鉛に結合された小さな酸性ペプチドである。一般的に、ＨＰＶワクチン候補の治療有効性は子宮頸癌-Ｔｃ１マウス腫瘍について試験される。これはＨＰＶ１６-腫瘍表現型に似ている。Ｔｃｌ細胞系は、ＨＰＶ１６由来のＥ６及びＥ７で不死化され、かつ、ｃ-Ｈａ-ｒａｓ発癌遺伝子で形質転換されたＣ５７ＢＬ／６-マウスの主要上皮細胞から得られる（非特許文献６参照）。この同時形質転換は腫瘍原性細胞系を産生した。この腫瘍原性細胞系は、Ｅ６及びＥ７腫瘍性タンパク質を発現し、固有配列を子宮頸癌進行に似せる。これらの腫瘍性タンパク質は細胞を不死化し、そして、その後の細胞前癌遺伝子への突然変異はこれらを転移可能性を有する腫瘍細胞に形質転換する。得られたＴｃ１細胞系は高い分裂速度を有し、急速に成長する。腫瘍成長に関する試験によれば、５ｘ１０４個の細胞の皮下接種は注射後２０日以内にマウス内で１００％腫瘍を発生させるのに十分であることが示された（非特許文献６参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Parkin, D.M. and Bray, F.(2006)Capter 2:The burden of HPV-related cancers. Vaccine, 24 Suppl 3, S11-25
【非特許文献２】Clifford, G. et al.,(2006)Capter 3: HPV type distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine, 24 Suppl 3, S26-34
【非特許文献３】Kols, A. et al.,(2006). PATH, Seattle, WA. USA and Leggatt, G.R. and Frazer, I.H.(2007) Curr Opin Immunol, 19, 232-238
【非特許文献４】Michel, N., et al.,(2002)Intervirology, 45, 290-299
【非特許文献５】Hung, C.F., et al., (2008)Expert Opin. Biol. Ther., 8, 421-439
【非特許文献６】Lin, K.Y., et al.,(1996)Cancer Re.s, 56, 21-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＨＰＶにより発症された癌性病変に対する新規なワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、ＨＰＶにより発症された癌性病変に対する新規なワクチンとして、パピローマウイルスのＥ７ペプチド球状粒子と、所望によりアジュバントとからなり、前記球状粒子はオリゴマーであるワクチンを提供する。オリゴマー球状粒子の直径は約５０ｎｍであり、分子量は約７００ｋＤａである。本発明によるワクチンはＨＰＶ関連病変を予防又は治療することができる。
【００１３】
また、上記の課題を解決するために、本発明は、前記球状粒子の安定化方法を提供する。この球状粒子安定化方法は、前記球状粒子を酸化することからなる。好ましい実施態様では、この酸化は、球状粒子を硫酸銅と接触させることにより行われる。球状粒子を硫酸銅と接触させたら、続いて、培養し、そして、その後、残留銅を除去する。
【００１４】
更に、本発明は、ＨＰＶにより発症された病変部の治療用薬剤を製造するための前記球状粒子の用途を提供する。
【００１５】
また、上記の課題を解決するために、本発明は、ＨＰＶ病変抗体陽性者の治療方法を提供する。この治療方法は、ＨＰＶＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個体に投与することからなる。
【００１６】
更に、上記の課題を解決するために、本発明は、ＨＰＶに対する免疫付与方法を提供する。この免疫付与方法は、パピローマウイルスＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個体に投与することからなる。
【発明の効果】
【００１７】
以上述べたように、本発明により、ＨＰＶにより発症された癌性病変に対する新規なワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１に従ってＥ７-ＭＰＬ及びＥ７ＳＯ-ＭＰＬで予防的ワクチン接種を行った結果を示す特性図であり、図１Ａは、横軸に示された各日時におけるＭＰＬ、Ｅ７-ＭＰＬ、Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬ及びＥ７ＳＯがワクチン接種された各マウスの腫瘍体積を示す。図１Ａにおいて＊記号が付されたマウスは不健康な全身状態と腫瘍の異常位置を示す。図１Ｂは各治療における無腫瘍期間の特性曲線を示す。図中、−○−はＥ７-ＭＰＬ、−□−はＥ７ＳＯ-ＭＰＬ、−△−はＭＰＬ、−×−はＥ７ＳＯをそれぞれ示す。図１Ａの縦軸：腫瘍体積（ｃｍ３）、横軸：時間（日数）を表す。図１Ｂの縦軸：無腫瘍マウス（％）、横軸：Ｔｃ１による接種後日数を表す。
【図２】実施例２に従ってＴｃｌ腫瘍保有マウスの治療結果を示す特性図である。図中、−○−はＥ７-ＭＰＬ粒子からなる組成物、−□−はＥ７ＳＯ-ＭＰＬ球状粒子からなる組成物、及び−△−は対照としてのＭＰＬからなる組成物をそれぞれ示す。腫瘍体積成長は治療後の経過日数の関数として示すことが出来る。図２の縦軸：腫瘍体積（ｃｍ３），横軸：Ｔｃ１による接種後日数を表す。
【図３】実施例２に従ってＴｃｌ腫瘍保有マウスの治療結果を示す特性図である。図中、−○−はＥ７-ＭＰＬ二量体粒子からなる組成物、−□−はＥ７ＳＯ-ＭＰＬ球状粒子からなる組成物、及び−△−は対照としてのＭＰＬからなる組成物をそれぞれ示す。治療効果は腫瘍保有マウスの生存率の関数として示される。図３の縦軸：生存率（％），横軸：腫瘍の接種後日数を表す。
【図４】ＯＤＮ２００６アジュバントと併用されるＥ７（Ｅ７ＳＯ）オリゴマー粒子からなるワクチンの治療能力を示す。この能力は腫瘍サイズを測定することにより評価した。図４の縦軸：腫瘍体積（ｃｍ３），横軸：腫瘍の接種後日数を表す。 （図中の「Desafio」は「攻撃感染」の意である
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について、添付図面を参照しながら詳述する。
【００２０】
本明細書において、「ワクチン」という用語は、ＨＰＶ病変に対して保護又は治療活性の一方又は両方を同時に有する組成物を意味する。
【００２１】
本明細書において、「Ｅ７」という頭辞語は、Ｅ７二量体粒子からなるワクチンに対応することを意味する。「Ｅ７-ＭＰＬ」は、Ｅ７二量体粒子とＭＰＬアジュバントからなるワクチンに対応する。「Ｅ７-ＳＯ」は、Ｅ７オリゴマー球状粒子とＭＰＬアジュバントからなるワクチンに対応する。驚くべきことに、オリゴマー球状粒子は非常に高い抗腫瘍活性を示した。
【００２２】
Ｅ７オリゴマー球状粒子（Ｅ７ＳＯ）と所望によりアジュバントとからなる本発明によるワクチンの予防抗腫瘍効果を評価した。ＨＰＶ１６Ｅ７を発現するＴｃｌ腫瘍細胞系に対する粒子の保護能力を評価した。これに基づき、ワクチン投与量の最後の投与から７日目（２８日目）に、免疫化した全てのマウスに、致死量のＴｃｌ細胞を攻撃感染させた。図１はクチン接種されたマウスの様々な群に関する腫瘍成長曲線を示す。
【００２３】
これらのデータによれば、ＭＰＬアジュバントで免疫化されたマウスの１００％が、攻撃感染後７〜１５日以内に大きな侵略的腫瘍を発生し、全てのマウスが３５日目に死亡した（図１Ａ及びＢ参照）。これに対して、オリゴマー球状粒子とアジュバントからなる本発明によるワクチン（Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬ、例えば、ＭＰＬ）を投与すると、８０％のマウスで腫瘍の発生が阻止され、更に９０日間経過後も無腫瘍のままであった。この他、腫瘍が発生された２匹のマウスにおいて、前記腫瘍の出現は、ＭＰＬだけを予防接種された対照マウスに対して、１０〜２０日間も遅かった。
【００２４】
興味深いことに、全てのＥ７ＳＯ免疫化マウスが腫瘍を発生したが、ＭＰＬだけの対照群により示された腫瘍発生に対して、腫瘍発生が遅かった。この事実は、Ｅ７ＳＯはたとえアジュバントが無くても、或る程度の抗腫瘍効果を有することを意味する。
【００２５】
Ｔｃ１腫瘍を有する被攻撃感染動物を保護するための、球状粒子とアジュバントとからなる本発明のワクチン（Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬ）の能力を示したが、ＨＰＶ１６Ｅ７発癌遺伝子を発現する腫瘍保有マウスの治療のための前記ワクチンの能力を評価した。この場合、メスのマウスに５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射により接種させ、腫瘍が触知できたら（７日目）、マウスをＥ７-ＭＰＬ又はＥ７ＳＯ-ＭＰＬからなるワクチンで処置した。第２回目の投与は２週間後（２１日目）に行った。図２に示されるように、本発明によるワクチンの予防接種は腫瘍成長を顕著に遅延させた。３２日目に、ＭＰＬ免疫化マウス（対照群）の殆どは腫瘍の拡大により死亡した。Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬワクチン接種マウスにおける腫瘍の平均体積は対照群よりも４倍も小さかった（〜２．３ｃｍ３（対照群）ｖｓ〜０．６ｃｍ３（本発明））。更に、Ｅ７-ＭＰＬでワクチン接種されたマウスも３２日目に対照群の腫瘍サイズと同様な腫瘍サイズ増大を示し、Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬワクチン処置マウスにおける腫瘍サイズよりもほぼ４倍大きかった。
【００２６】
治療効果の差も、様々なマウス群の生存率により示される。Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬで処置された群の３５日目の生存率は１００％であったが、ＭＰＬ処置群（対照群）の生存率は０％であった（図３参照）。腫瘍に対する保護に関する実験において、Ｅ７二量体粒子からなるワクチンは治療効果がさほど高くないことも示された（図２及び図３参照）。この事実は、腫瘍保有メスマウスでは、Ｅ７オリゴマー状態は、細胞毒性Ｔ細胞により仲介される効果的な抗腫瘍反応の誘発に必須要件であることを意味する。
【００２７】
本発明によるワクチン（例えば、Ｅ７ＳＯ-ＭＰＬワクチン）を低投与量でメスのマウスに予防接種すると、完全な体液及び細胞免疫反応を誘発した。即ち、抗Ｅ７血清特異性ＩｇＧ力価とＴｃｌ腫瘍細胞発現Ｅ７に対する保護免疫性を誘発した。更に、腫瘍保有メスマウスへのＥ７ＳＯ-ＭＰＬワクチンのワクチン接種は、過大な腫瘍成長の進行を遅らせ、そして、生存期間を延長させた。従って、免疫治療薬としてのワクチン潜在能力が示された。
【００２８】
図４から明らかなように、Ｅ７ＳＯオリゴマー球状粒子は、例えば、二量体Ｅ７に比較して、高い治療効果を有する。ヒト細胞におけるアジュバントとして有効性が証明されているオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ２００６）と併用されるＥ７オリゴマー球状粒子からなるワクチンの治療能力を評価した（Hartmann, G. et al., (2000) J. Immunol., 164, 1617-1624参照）。
【００２９】
本発明のワクチンは、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）アジュバント又はＯＤＮアジュバントのようなアジュバントと併用することができる。ＭＰＬアジュバントは、グラム陰性バクテリア壁内のリポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体である。ワクチン製造分野における専門家は、任意のアジュバントが使用可能であることを知っている。従って、全てのアジュバントが本発明のワクチンとともに使用できる。好ましい実施態様では、アジュバントはＭＰＬ又はＯＤＮである。
【００３０】
本発明によるワクチンの抗原特性をワクチン接種マウス血清抗体の力価のＥＬＩＳＡ適用量により評価した。本発明のＥ７ＳＯ-ＭＰＬワクチンによる免疫化はＥ７高リスクペプチドに対するＩｇＧ抗体の特異的力価（〜１／６０００）を生じる。
【００３１】
本発明の実施態様において、大腸菌(Escherichia coli)内で組み換え的に発現された化学的に純粋なＥ７タンパク質を大量に得ることを可能にする精製方法が示され、かつ、主な種は分子量が２２ｋＤａの二量体であることが実証された。本発明の別の実施態様では、平均分子量が７９０ｋＤａで直径が５０ｎｍの均質な球状粒子に集合させることができるタンパク質を得る方法が示される。この集合は非常に緩慢なプロセスであり、タンパク質は、その三次構造の同時連結を伴う実質的な立体配座転移を被る。得られた粒子（Ｅ７ＳＯ）は非常に安定であり、協同して襞を形成し、かつ、これらの粒子は可溶性又は不溶性アミロイド中に発見されるβシート構造に似ている。
【実施例１】
【００３２】
生体内予防に関する実験
マウス群（ｎ＝５）を様々なグループにランダムに分配させ、２１日間隔で２回腹腔内注射によりワクチン接種した、接種したワクチンは、Ｅ７二量体５０μｇ又は高精製Ｅ７可溶性オリゴマー５０μｇと、ＭＰＬアジュバント２５μｇ（すなわち、Ｅ７-ＭＰＬ接種群とＥ７ＳＯ-ＭＰＬ接種群）、アジュバント無しのＥ７可溶性オリゴマー５０μｇ（Ｅ７ＳＯ接種群）又はＭＰＬのみ２５μｇ（ＭＰＬ接種群）であった。最後の免疫強化から７日経過後（２８日目）、マウスに診査出血を受けさせ、次いでマウスの左側に５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射で接種した。全ての実験において、マウス内に埋め込まれた腫瘍細胞の生存能力は＞９０％であった。腫瘍成長は１週間当たり２回、電子的測径器を用いて測定し、また、腫瘍体積は（長さｘ幅２）／２の式に基づいて計算した。腫瘍のサイズが約３ｃｍ３になった時点でマウスを殺した。
【実施例２】
【００３３】
治療実験
治療実験のために、先ず、マウスの左側に５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射で攻撃感染させた（０日目）。全てのマウスに触知可能な腫瘍が生じた時点（７日目）で、マウスを自由裁量的に各群（１群５匹）に割り当て、Ｅ７-ＭＰＬ、E7SO-ＭＰＬ又はMPL単独を腹腔内にワクチン接種した。ワクチン投与量は実施例１で使用された投与量と同じであった。２１日目に２回目の免疫強化を行った。腫瘍のサイズが約２．５ｃｍ３に達した時点でマウスを殺した。
【実施例３】
【００３４】
ワクチンで使用するＥ７二量体及びＥ７ＳＯオリゴマーの製造
ＨＰＶ１６由来のＥ７を、Alonso, L.G., et al., (2002). Biochemistry, 41, 10510-10518に記載された方法に従って精製した。Ｅ７ＳＯは、Alonso, L.G., et al., (2004). Biochemistry, 43, 3310-3317に記載された方法に従って培養された高純度Ｅ７二量体粒子から製造した。その後、Ｅ７ＳＯ４０μＭのリン酸ナトリウム１０ｍＭ溶液（ｐＨ７．０）に、最終濃度が２０μＭになるまで硫酸銅を添加した。そして、２８℃で２４時間培養した。酸化後、サンプルをリン酸ナトリウム１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析させ、過剰量のＣｕを除去した。オリゴマー酸化状態を還元剤無しにＳＤＳ-ＰＡＧＥ１５％中で評価した。
【実施例４】
【００３５】
ワクチンの製造
ＭＰＬアジュバントの水溶液をBaldrige, J.R. and Crane, R.T.,(1999). Method, 19, 103-107に記載された方法に従って製造した。その後、この水溶液を４℃で維持した。所望の最終濃度（０．２５μｇ／μＬ）までＰＢＳ緩衝液で希釈されたＥ７ＨＰＶ１６の二量体粒子及びオリゴマー粒子を、投与する直前に、実施例１に述べた割合でＭＰＬアジュバントと混合させた。各マウスに投与された最終容量は２００μＬであった。
【実施例５】
【００３６】
アジュバントＯＤＮを含有するワクチンの製造
ＯＤＮ２００６アジュバントの水溶液をHartmann, G. et al., (2000) J. Immunol., 164, 1617-1624に記載された方法に従って製造した。その後、この水溶液を−２０℃で維持した。Ｅ７ＳＯ粒子（投与量６０μｇ）をＰＢＳ緩衝液中で希釈し、投与直前にＯＤＮ２００６アジュバント（投与量３０μｇ）と混合させた。各マウスに投与された最終容量は２００μＬであった。
【実施例６】
【００３７】
ＯＤＮによる治療実験
先ず、メスのマウスの左側に５ｘ１０４個のＴｃｌ細胞を皮下注射で接種させることにより治療実験を行った（０日目）。４日間経過後（４日目）、マウスを自由裁量的に各群に割り当て、マウスの尻尾の付け根にワクチンを皮下注射により接種した。接種したワクチンは、高精製Ｅ７可溶性オリゴマー６０μｇ＋ＯＤＮ２００６アジュバント３０μｇ（Ｅ７ＳＯ-ＯＤＮ接種群；１群当たりマウス８匹）又はＯＤＮ２００６アジュバントのみ（ＯＤＮ接種群；１群当たりマウス４匹）であった。１１日目に２回目の免疫強化接種を行った。腫瘍のサイズが約２．５ｃｍ３に達した時点でマウスを殺した。
【００３８】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するために用いてはならない。また、同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。用語「又は」に関して、例えば「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」、「Ｂのみ」ならず、「ＡとＢの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（HPV)により発症された腫瘍性又は癌性病変に対するワクチン。
【請求項２】
アジュバントを更に有することを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
球状粒子がオリゴマーであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
球状粒子の直径が１５ｎｍ以上であることを特徴とする請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
球状粒子の分子量が５０ｋＤａ以上であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
アジュバントは３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）であることを特徴とする請求項２に記載のワクチン。
【請求項７】
アジュバントはＯＤＮ２００６であることを特徴とする請求項２に記載のワクチン。
【請求項８】
球状粒子は反復性アミロイド様βシート構造を有することを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
球状粒子は２〜１００個のＥ７ペプチドモノマーからなることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
ＨＰＶ関連病変の予防に使用されることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
ＨＰＶ関連病変の治療に使用されることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
球状粒子の酸化を制御することからなることを特徴とする球状粒子の安定化方法。
【請求項１３】
(1)球状粒子を硫酸銅と接触させ、その後、培養するステップと、
(2)残留銅を除去するステップと、
からなることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＰＶ関連病変の治療に使用される薬剤を製造するための請求項１に記載のワクチンの用途。
【請求項１５】
パピローマウイルスＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個人に投与することからなるパピローマウイルス関連病変保有者の治療方法。
【請求項１６】
パピローマウイルスＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個人に投与することからなることを特徴とするＨＰＶ関連病変の免疫化方法。
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（HPV)により発症された腫瘍性又は癌性病変に対するワクチン。
【請求項２】
アジュバントを更に有することを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
球状粒子がオリゴマーであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
球状粒子の直径が１５ｎｍ以上であることを特徴とする請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
球状粒子の分子量が５０ｋＤａ以上であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
アジュバントは３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）であることを特徴とする請求項２に記載のワクチン。
【請求項７】
アジュバントはＯＤＮ２００６であることを特徴とする請求項２に記載のワクチン。
【請求項８】
球状粒子は反復性アミロイド様βシート構造を有することを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
球状粒子は２〜１００個のＥ７ペプチドモノマーからなることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
ＨＰＶ関連病変の予防に使用されることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
ＨＰＶ関連病変の治療に使用されることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
球状粒子の酸化を制御することからなることを特徴とする球状粒子の安定化方法。
【請求項１３】
(1)球状粒子を硫酸銅と接触させ、その後、培養するステップと、
(2)残留銅を除去するステップと、
からなることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＰＶ関連病変の治療に使用される薬剤を製造するための請求項１に記載のワクチンの用途。
【請求項１５】
パピローマウイルスＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個人に投与することからなるパピローマウイルス関連病変保有者の治療方法。
【請求項１６】
パピローマウイルスＥ７ペプチドの球状粒子からなるワクチンを十分な量、各個人に投与することからなることを特徴とするＨＰＶ関連病変の免疫化方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５１２９１４（Ｐ２０１３−５１２９１４Ａ）
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２１７６（Ｐ２０１２−５４２１７６）
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８６５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６８９３４
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５１２１４４６９０）コンセヨ ナショナル デ インベスティガシオン シエンティフィカ イ テクニカ (1)
【出願人】（５１２１４４７０４）
【出願人】（５１１０５１２３６）イニス バイオテック エル エル シー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８６５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６８９３４
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５１２１４４６９０）コンセヨ ナショナル デ インベスティガシオン シエンティフィカ イ テクニカ (1)
【出願人】（５１２１４４７０４）
【出願人】（５１１０５１２３６）イニス バイオテック エル エル シー (2)
【Ｆターム（参考）】
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