ヒトＢリンパ芽腫細胞系から分泌される抗ガングリオシド抗体
【課題】腫瘍の診断に有用な医薬組成物を提供する。
【解決手段】Ｌ６１２として同定され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）にＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１０７２４として寄託されているヒトＢリンパ芽腫細胞系から分泌される抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る医薬組成物である。
【解決手段】Ｌ６１２として同定され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）にＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１０７２４として寄託されているヒトＢリンパ芽腫細胞系から分泌される抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る医薬組成物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
当発明は、エプスタインバーウイルス（ＥＢウイルス、ＥＢＶ）によって感染し形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系（B-lymphoblastoid cell line）に関するものである。より詳しくは、この発明は、当該細胞系により産生される、直接腫瘍を治療するのに使用できまたは抗原代用物質や診断用試薬用に使用できる抗ガングリオシド抗体に関するものである。
【０００２】
当発明は、エプスタインバーウイルス（ＥＢウイルス、ＥＢＶ）によって感染し形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系（B-lymphoblastoid cell line）に関するものである。より詳しくは、この発明は、直接腫瘍を治するのに使用できまたは抗原代用物質や診断用試薬用の抗ガングリオシド抗体を産生するのに使用でる抗体を産生する能力のある同細胞系に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景を説明しかつその実施に関し詳細な追加説明を行うためにここに参照する出版物および他の参照資料は、ここに参照として編入するものである。便宜のため、参照資料は、付属の参考文献のところに番号を付しグループ分けしてある。これらの出版物および参照資料の内容は、この明細書に参照として編入する。
【０００４】
免疫グロブリンの可変部が外部抗原として作用し得る可能性は、Ｊｅｒｎｅによりイディオタイプネットワーク説（参照資料１）によって最初に唱えられた。この説によると、抗原結合部位上のまたはＡＢ１の骨格上のイディオタイプの認識は、それぞれ抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄまたはＡＢ２）βまたはαの産生をもたらす。このような「内部像」抗イディオタイプは、その元の抗原結合部位との相補性のため、元の抗原を模倣し、しばしば類似の生物学的挙動を呈する。内部像（internal image）の概念は、ある種のＡＢ２分子が抗原代用物質として振る舞うことができ、それらの投与がＡＢ１の類似特性を呈する抗抗イディオタイプ抗体の産生をもたらすことができる事実を称している。
【０００５】
抗イディオタイプを抗原代用物質として使用する免疫発生は、研究者らの間に非常な興味を生じさせ、多くの研究者がウイルス、バクテリアそして他の病原体に対して作用する特異な免疫を発生させるためにＡＢ２ワクチンで実験してきている（参照資料２、３）。この手法は、従来のワクチンや抗体が入手不能なとき、または対応する抗原が遺伝子工学にとって好ましくない産生物であるときに有用である。そのうえ、抗イディオタイプは、癌に対する免疫性を向上させるための免疫調節剤として、さらには移植臓器の拒絶反応を抑制したり自己免疫病の進行を抑制したりするための免疫抑制剤として使用することができる。
【０００６】
ガングリオシドは、ヒトの組織において基本的な膜構成要素であるグリコスフィンゴリピドである。ガングリオシドは、正常細胞の悪性形質転換の際に特性が変化するので、癌の免疫療法のための好ましい標的抗原である。悪性黒色腫瘍は、大量のガングリオシドを合成するため、ガングリオシドの免疫療法標的としての可能性を評価するための有用な実験モデルとしての役を果たしてきた。多くのヒトの黒色腫瘍の腫瘍関連ガングリオシドおよびそれらの各免疫原性が定義されてきている（参照資料１２〜２９）。加えて、多数の研究がガングリオシド抗原による活性免疫で黒色腫瘍患者の生存を延ばしたことを報告している（参照資料４、５）。しかしながら、この技術は、多くの方面で、ガングリオシド抗原が何倍も希である、すなわち供給が足りないという不便に遭遇している。
【０００７】
腫瘍関連の抗原は、多くの場合、自然界に低いレベルでしか存在せず、大量に精製することが比較的困難である。これに対して、抗イディオタイプは、ハイブリドーマ細胞から低コストで長期に亘って産生できる。そのうえ、現代の遺伝子工学の技術は、ガングリオシドエピトープには応用できないものの、抗イディオタイプペプチドを合成するのには使用することができる。以前にヒトの癌の活性特異免疫療法のために開発された抗イディオタイプは、免疫原としてマウスのモノクローナル抗体（ＭｕＭａｂｓ）を使用してきた（参照資料６〜１１）。
【０００８】
マウスのモノクローナル抗体は、抗原代用物質としての使用に加えて、ヒトの癌細胞の多くの抗原分子を定義し特徴づけるのにも採用されてきている。マウスのモノクローナル抗体は、ヒトのモノクローナル抗体に比べて、腫瘍抗原への強い親和性、ハイブリドーマ腹水による高い抗体産生、そして腫瘍細胞上の高い抗原密度を含むいくつかの利点を有している。しかしながら、治療上の使用に関しては、マウスのモノクローナルを用いた最近の臨床的試みによると、ＭｕＭＡｂｓの繰り返し注入は実質上全患者に抗マウスＩｇ抗体を誘発するので、ヒトのモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂｓ）の方が好ましいであろうことを示している。これは、潜在的に危険な複雑さを伴う免疫複合や免疫反応の形成につながる。加えて、ＨｕＭＡｂｓは、マウスの免疫系では見逃されたエピトープを認識できる。
【０００９】
ヒトの癌細胞上のガングリオシド抗原と反応するＨｕＭＡｂｓの開発および臨床レベルにおける抗腫瘍効果の実証が報告されている（参照資料２３、１２）。再発性黒色腫瘍の患者がガングリオシドＧＤ２またはＧＭ２に対するＨｕＭＡｂの腫瘍内注入を受け、役７０％の患者において部分的または完全な退行が認められた。免疫療法が効かなかった黒色腫瘍患者においては、標的抗原ＧＤ２もＧＭ２も腫瘍細胞上に現れなかった。Ｌ１５およびＬ７２として同定される２種類のＨｕＭＡｂがＥＢウイルスにより形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系から産生された（参照資料２９）。Ｌ１５およびＬ７２抗体は、いずれも多種の腫瘍細胞に反応することが分かっていた。
【００１０】
ヒトの黒色腫瘍上のガングリオシドの量および質は異なる癌患者の間で大きく異なるので、各々の患者の腫瘍細胞上でどのガングリオシドが優位であるかを同定するための処置前バイオプシの検査により、不必要なＨｕＭＡｂの投与を避けることが好ましい。
【００１１】
与えられた腫瘍上に存在するガングリオシドの質および量を検出するために使われてきた免疫学的検定には、３種類の異なるものがある。それらは、免疫粘着検定法（ＩＡ）、蛍光性ミクロスフェアを用いる直接免疫蛍光法、並びにＩＡ吸収法および生化学的検定法を含む。これらの検定には、それぞれある限界および利点がある。免疫学的検定には、生体採取した腫瘍組織からの単細胞懸濁液が必要である。しかしながら、生存可能な高収率の腫瘍細胞個体群を得るのはしばしば困難である。また、光学顕微鏡の下では、腫瘍細胞は、単球やマクロファージから容易に区別できないかも知れない。生化学的検定は、無傷の細胞を必要としない。しかしながら、ガングリオシドの抽出および糖脂質製剤中のシアル酸の測定のために、比較的大きいボリュームの腫瘍が必要である。
【００１２】
マウスのモノクローナル抗体を使用する生体採取標本上の抗原表記を定義するために最も普通に利用される免疫学的技法は、組織セクションの免疫組織化学的染色である。しかしながら、この好感度の方法は、ヒトのモノクローナル抗体およびヒトの組織の組合せには容易には応用することができない。二次抗体（抗ヒトＩｇ）を用いたヒト腫瘍組織の間接的な染色は、通常、豊富な内生的ヒトＩｇへの非特異的結合からの高レベルの背景ノイズという結果になる。バイオティニレートされたヒトモノクローナル抗体を使った直接免疫染色法は、この高レベル背景ノイズを克服するかも知れない（参照資料３０）。しかしながら、この方法は、通常感度が低く、細胞表面に高密度の抗体が存在するときに最も効果的である。
【００１３】
現在、腫瘍上に存在するガングリオシドについて免疫性の抗体を産生する能力のある追加のヒト細胞系を開発すべき必要性が引き続き存在している。新しい細胞系により産生される抗ガングリオシド抗体は、腫瘍の直接的な処置に、および抗原代用物質または診断用試薬として使うための抗イディオタイプの産生にも有用であろう。
【００１４】
先行技術文献として、下記の非特許文献を挙げる。
【００１５】
【００１６】
【００１７】
【００１８】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
癌の治療や診断に応用可能な抗体を含む医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この発明により、各種の腫瘍に反応し黒色腫の治療に効果的であることが実証された抗ガングリオシド抗体を分泌するヒトのＢリンパ芽腫細胞系（Ｂリンパ芽球様細胞系（B-lymphoblastoid cell line））が開発された。抗体は、癌の治療や診断に応用可能である。この発明の細胞系は、Ｌ６１２と名付けられており、カリフォルニア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学科（Division of Surgical Oncology at the University of California at Los Angeles School of Medicine）において保存維持されている。Ｌ６１２細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）（American Type Culture Collection, Rockville, Maryland）にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０７２４として寄託されている。
【００２１】
この発明の特徴として、Ｌ６１２細胞系は、腫瘍抗原に反応するＩｇＭκ抗体を産生するのに使われる。Ｌ６１２抗体は、局所注射により投与したときに、黒色腫瘍の治療に効果があることが示されている。
【００２２】
この発明の他の特徴として、Ｌ６１２抗体は、抗原代用物質として利用できまたは診断手法において使用できるマウスの抗イディオタイプモノクローナル抗体を作るのに使われる。
【００２３】
以下の詳細な説明を参照してこの発明がよりよく理解されるにつれて、この発明の上記特徴および他の多くの特徴並びに付随する利点が明らかになるであろう。
【発明の効果】
【００２４】
癌の治療や診断に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｌ６１２抗体Ｈ鎖の可変部（Ｖ領域）のためのヌクレオチド／アミノ酸の配列である。相補性決定領域（complementary determining regions）に下線を施した。
【図２】Ｌ６１２抗体Ｌ鎖の可変部（Ｖ領域）のためのヌクレオチド／アミノ酸の配列である。相補性決定領域に下線を施した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
この発明の細胞系は、エプスタインバーウイルス形質転換法で形質転換されたＢリンパ芽腫細胞系である。この細胞系は、Ｌ６１２と命名され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学部に保存されている。このＬ６１２細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, Rockville, Maryland）にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０７２４で寄託される。
【００２７】
Ｌ６１２細胞系は、２種の他のヒトモノクローナル抗ガングリオシド抗体類、Ｌ５５（抗−ＧＭ２）およびＬ７２（抗ＧＤ２）を産生するために使用したのと同じエプスタインバーウイルス形質転換法（参照資料２６〜２７および２９）によってリンパ球から培養によって樹立した。（参照資料２９）に詳細に述べられているのと同じ形質転換法に従って、Ｌ６１２細胞系を樹立した。従来のＬ５５とＬ７２の細胞系およびこの発明のＬ６１２の細胞系を樹立するのに用いられるエプスタインバーウイルス形質転換法は、公知でかつこの技術分野の研究者が使用する通常の方法である。
【００２８】
Ｌ６１２細胞系を樹立するのに使用した具体的方法は、次のとおりである。
【００２９】
乳房切除中の乳癌患者から所属リンパ節を入手した。まず、このリンパ節を小片に切断し、次いで、その小片をハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に懸濁させることによって、リンパ球をこれらリンパ節から単離した。次に、この懸濁液をステンレス金網を通過させて大きな組織の塊を分離し、次にＦｉｃｏ１１の密度勾配溶液を用いて遠心分離してリンパ球を凝集分離した。Ｅロゼット形成法を用いてＴリンパ球を除去し、次いでＢリンパ球画分をＨＢＳＳで３回洗浄し、次に１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）とともに２０時間インキュベートした。細胞を限界希釈法によってクローン化し、先に記載したＩＡ検定法（参照資料２９）によって抗体の産生について監視した。
【００３０】
ヒト乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ４３６（参照資料３１）とヒト黒色腫細胞系のＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１２（参照資料３２）を標的として使用した。４３６乳癌細胞系に対して陽性の抗体を分泌するクローンは、樹立後すぐに抗体の産生を停止したが、Ｍ１２黒色腫細胞系に反応するクローンは、抗体の産生を続け、そして安定であった。抗体を分泌するクローンを、低濃度のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０に徐々に添加した。次に、そのクローンを、成長因子を含有する血清なしの培地（ＦＤＡはIrvine Scientific Co. 社（米国、カリフォルニア州、アービン所在）から入手できるＨＢシリーズの血清なしの培地を承認した）内で７回再クローン化した。Ｌ６１２細胞系の倍加時間は、１日間より短い。この細胞系は、２０μｇ／ｍｌを越える量のＩｇＭκモノクローナル抗体を分泌した。使用済培地中のＬ６１２抗体を先に述べたようにして精製した（参照資料２５）。さらに、Ｌ６１２細胞系によって産生された抗体は、細胞培養物から抗体を取り出して精製するのに用いるいずれかの通常の方法によって単離する。
【００３１】
精製されたＬ６１２抗体は、各種のヒト腫瘍組織との反応性について試験した。Ｌ６１２抗体は、補体の存在下で、抗原陽性ヒト腫瘍細胞に対して強い細胞障害活性を有する。その反応性は、免疫粘着（ＩＡ）検定法と免疫粘着吸収（ＩＡＡ）検定法の両者を用いて試験した。試験結果を［表１］に要約した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
合計２１個の生検黒色腫、３２名の別個のドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および別の４４名のドナー由来の赤血球を試験した。２１個の黒色腫組織のうちの１３個（６２％）が抗原陽性であったが、これに対してＰＢＬ（０／３２）と赤血球（０／４４）は全く陰性であった。培養したヒト悪性細胞系も抗原の存在について試験した（表Ｉ）。直接ＩＡ検定法で試験した１６個の黒色腫細胞系のうち１２個（７５％）が陽性であった。残りの癌細胞系の陽性反応性は、次のとおりであった。肺癌：４／４、乳癌：５／７、消化器癌：２／７、他のタイプの癌：１／４。しかし、試験した黒色腫細胞系に対して自己由来の、エプスタインバーウイルスで形質転換されたＢ細胞系１１個は、敏感なＩＡ吸収検定法でも陰性であった。黒色腫の陽性試料の百分率は肺癌の試料より低いが、単位試料当たりの全反応性は、他の組織学的タイプの癌より黒色腫の方がはるかに高かった。試験した黒色腫細胞系のうち、Ｍ１５とＭ１２が最高の反応性を示した。これらの細胞系をノイラミニダーゼ（受容体破壊酵素）で処理すると、これら細胞系の抗原性は完全に破壊されたが、トリプシンで処理したものは、破壊されなかった。
【００３４】
各種の基準糖脂質に対するＬ６１２抗体の反応性も測定した。これらの糖脂質と、それぞれのＬ６１２抗体に対する抗原力価を、［表２］に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
基準糖脂質（５ｎｍｏｌ）をＩＡ阻害試験法でＬ６１２の抗原活性について試験した。３種のガングリオシド：ＧＭ4、ＧＭ3およびＳＰＧは陽性の反応性を示したが、これらの中の２種のＧＭ4とＧＭ3はＳＰＧ（１：１６）より強い結合性（１：６４）を示した。ＩＩ3ＮｅｕＧｃ−Ｌａｃ−Ｃｅｒ、ＩＶ3ＮｅｕＧｃ−ｎＬｃＯｓｅ4−Ｃｅｒ、ＧＭ2、ＧＭ1a、ＧＤ3、ＧＤ2、ＧＤ1a、ＧＤ1bおよびＧＴ1bを含む他のガングリオシド類ならびにＧｂＯｓｅ3−Ｃｅｒ、ＧｂＯｓｅ4−ＣｅｒおよびＧｇＯｓｅ4−Ｃｅｒを含む中性糖脂質は、抗原活性を全く示さなかった。上記結果をさらに確認するため、基準の糖脂質について、ＴＬＣプレート上でＥＬＩＳＡ法と酵素免疫染色法を行った。ＥＬＩＳＡ法と酵素免疫染色法で得た結果は、ＩＡ阻害検定法の結果と類似していた。ＥＬＩＳＡ法は、微量滴定ウェル（microtiter wells）に結合させた１５個の基準糖脂質を用いて行った。やはり３種のガングリオシドＧＭ3、ＧＭ4およびＳＰＧが固相ＥＬＩＳＡ法で明確な結合活性を示した。残りのガングリオシド類は反応性を全く示さなかった。
【００３７】
ＧＭ４、ＧＭ３、ＳＰＧ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、Ｎ−グリコリルＧＭ３、ＣＤＨ、グロボシドおよびアシアロＧＭ１（１μｇ）によるＴＬＣプレートの酵素免疫染色試験も実施した。ＧＭ３とＧＭ４で強い陽性を示した。ＳＰＧについては、より緩やかな反応性が観測された。ＧＭ２については、ごく僅かな反応性が観察された。その外の糖脂質は、染色できなかった。これら異なる３種の免疫検定法の結果は、ＨｕＭＡｂのＬ６１２がＮｅｕＡｃα２−３ガラクトース残基を有するＧＭ３とＧＭ４のようなガングリオシド類の末端の糖を検出することを実証している。
【００３８】
凍結切片をＨｕＭａｂＬ６１２で免疫染色すると、黒色腫、結腸腺癌および肺腺癌を含む新生物組織に対する強い特異性を示した。ＨｕＭａｂは、ある種の新生物組織を同定するためま優れたマーカを提供する。ＨｕＭａｂのＬ６１２は、腎細胞線癌に結合することが報告されている（参照資料３５）。
【００３９】
Ｌ６１２抗体のＬ鎖とＨ鎖の両者の可変部のＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で決定した。チオシアン酸グアニジウム／塩化セシウム法を用いて、Ｌ６１２Ｂ−リンパ芽球系から全ＲＮＡを調製した（参照資料３４）。１０μｇのＲＮＡを６０ｐｍｏｌのμＨ鎖またはκＬ鎖の３′プライマと混合し、７０℃で１０分間加熱した。得られた混合物を、１０μｌの５Ｘ逆転写酵素緩衝液（ＢＲＬ）、４μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの最終濃度：２００μＭ）および３μｌの６００単位逆転写酵素（Superscript, ＢＲＬ）を含有する、５０μｌの逆転写酵素反応溶液に添加した。得られた混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【００４０】
次に、９７μｌのＰＣＲ混合物を３μｌのＲＮＡ−ｃＤＮＡ混合物に添加して、標準のＰＣＲ反応を実施した。そのＰＣＲ混合物は、１０ＸのＰＣＲ緩衝液（米国、カリフォルニア州所在のPerkin Elmer社）、各ｄＮＴＰの最終濃度が６０μＭである１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物、５単位のＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社）および６０μＭの適正な５′と３′のＨ鎖とＬ鎖のプライマを含有していた。得られた混合物を、Perkin Elmer/Cetus 熱サイクラの中で、９１℃で１分間、５２℃で２分間および７２℃で１．５分間の増幅を３５サイクル行い、次いで最終のインキュベーションを７２℃で１０分間行った。そのＰＣＲ産物の一部は、２％アガロースゲル上に正しい大きさのバンドを生成した。μＨ鎖とκＬ鎖のプライマは、それぞれ４９５個と６０３個の塩基対のｃＤＮＡ産物を生成した。ゲルが正しい大きさの単一産物を示した場合、残りのＰＣＲ−ｃＤＮＡ産物をＰＣＲに付してさらに産物を得た。
【００４１】
ゲルによる産物を単離し、集め、フェノール／クロロホルムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。次に、そのＤＮＡを、適正な制限酵素で消化し、抽出し、沈澱させ、次にGeneClean（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏ１０１）で精製した。そのＤＮＡを、Bluescriptベクター（米国、カリフォルニア州、Stratagene社）の適正な切断制限部位に結合させた。可変部のμ鎖の１０個の独立クローンおよび可変部のκ鎖の４個の独立クローンを単離して、配列を決定した。ＪH Ｈ鎖のプローブを用いて、Ｈ鎖クローンを選別して確認した。配列決定は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase, 米国、オハイオ州、クリーブランド所在のＵＳＢ社）を用い、メーカのプロトコルにしたがって、ジデオキシヌクレオチド法によって行った。使用したプライマは次のとおりであった。Ｈμ鎖のリーダプライマ（３個のプライマー）（参照資料２９）：
ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧ（ＡＧ）ＴＣ（ＣＴ）ＴＣＴ（ＧＴ）Ｃと、ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧ（ＣＴ）ＴＴＧＧＧＣＴＧＡ（ＣＧ）ＣＴＧＧ（ＣＧ）ＴＴＴ（ＣＴ）Ｔと、そしてＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧ（ＡＧ）Ａ（ＡＣ）（ＡＣ）（ＡＴ）ＡＣＴ（ＧＴ）ＴＧ（ＧＴ）（ＡＴ）（ＣＧ）Ｃ（ＡＴ）（ＣＴ）（ＣＧ）ＣＴ（ＣＴ）ＣＴＧである。これらのプライマには、クローン化を容易にするＥｃｏＲＩ制限部位（下線を付けた部分）が含まれている。Ｈμ鎖のＪ領域のプライマは、ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴであった。このプライマは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線部分）を含んでいる。Ｌκ鎖のリーダプライマは、次のとおりであった（２個のプライマ）（引例文献３０）。すなわち、ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡと、ＧＡＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡである。これらのプライマには、ＳａｃＩ部位が含まれている（下線部分）。Ｌκ鎖のＪ領域のプライマは、ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＧであった。このプライマには、Ｘｂａ部位が含まれている（下線部分）。
【００４２】
Ｈ鎖の可変部についてクローン化されたｃＤＮＡヌクレオチド配列とそのコード化アミノ酸配列を配列ＩＤ番号１に示す。上記のＨ鎖可変部のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号２に示す。Ｌ鎖の可変部についてクローン化されたｃＤＮＡヌクレオチド配列とそのコード化アミノ酸配列を配列ＩＤ番号３に示す。上記のＬ鎖可変部のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号４に示す。
【００４３】
また、Ｈ鎖可変部についてヌクレオチド／アミノ酸配列を図１に示す。その相補性決定領域（complementary determining regions,ＣＤＲ）１、２および３には、下線を付けてある。また、Ｌ鎖可変部についてヌクレオチド／アミノ酸配列を図２に示す。また、そのＣＤＲ１，２および３にも下線を付けてある。
【００４４】
この発明によるＬ６１２抗体は、ＧＭ３ガングリオシドまたはＮｅｕＡｃ２−３ガラクトースエピトープを含有する腫瘍を治療するため患者に投与される。ＧＭ３ガングリオシドは、Ｎｅｕα２−３ガラクトース残基を有する末端糖を有している。上記のような組織を治療するため、患者に抗体を投与するのに用いられる通常の手法のいずれも用いることができる。これらの手法としては、静脈注射もしくは腹腔注射および病変部内注射がある。病変部内注射は、再発性の皮膚腫瘍に対する好ましい投与法である。Ｌ６１２抗体およびこの抗体の産生細胞系は、公知の方法で変形もしくは変化させて、他の免疫グログリンのイソタイプおよび腫瘍細胞を効率よく結合して殺すことができる抗体を産生する細胞を形成させることができる（参照資料３３）。利用される特定の投与量は、腫瘍の抗原性によって変わり、そしてＬ５５およびＬ７２のような抗体を投与する公知の方法にしたがって決定することができる。Ｌ６１２モノクローナル抗体は、ヒト黒色腫瘍の生検試料と強く反応する。また、Ｌ６１２抗体は、肺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および腎臓癌由来のヒト腫瘍生検試料とも反応するが、反応程度は低い。ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２黒色腫細胞系は、Ｌ６１２モノクローナル抗体で試験した細胞系のなかで最高の反応性細胞系であると確認された。ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部外科腫瘍学科に保存されている。
【００４５】
Ｌ６１２ＨｕＭａｂを、悪性皮膚黒色腫を治療する治療剤として使用した。ＨｕＭａｂＬ６１２は、ヒトに使用する場合、先に述べたようにして生成した（参照資料２５）。ヒト抗ＧD2ＨｕＭａｂＬ７２の病変部内注射によって皮膚黒色腫を退行させることができるということは、以前の研究で実証された（参照資料２３）。この実施例において、ＨｕＭａｂＬ６２とＨｕＭａｂＬ７２の効能を比較する。
【００４６】
８４歳の女性が、彼女の左頬の急速に増殖する皮膚黒色腫病変部（１．９×１．６ｃｍ）の外科切除を受けた。組織切片の病理試験を行ったところ、クラークレベルＩＶの黒色腫であることが分かった。病変部生検試料のガングリオシド発現は、ＧM3に対しては中程度に陽性でありＧD2に対して陰性であることが分かった。外科手術を行ってから２週間後、その切開部位に再発が起こった。上部病変部位は１週間毎に１ｍｌのＨｕＭａｂＬ６１２で治療し、下部病変部を１ｍｌのＨｕＭａｂ７２ＨｕＭａｂで治療した。１カ月間治療した後（３回治療後）、ＨｕＭａｂＬ６１２で治療された病変部の壊死と軟化が観察された。これに対して、ＨｕＭａｂＬ７２ＨｕＭａｂで治療された病変部は全く反応を示さず、実際にはさらに進行した。この患者は、肝臓と脳に広く転移したため結局死亡した。
【００４７】
また、Ｌ６１２抗体は、抗原代用物質または診断用試薬として用いられる抗イディオタイプを産生するのに利用できるハイブリドーマを産生するのに有用である。ハイブリドーマの産生とそれに続く抗イディオタイプの生成は、以下の実施手法において説明する。
【００４８】
完全フロイントアジュバント中の精製Ｌ６１２モノクローナル抗体２００μｇを皮下注射することによって、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。２週間後に、不完全フロイントアジュバント中のＬ６１２を別個に皮下注射してマウスの追加免疫を行った。この追加免疫を行ってから１１日後、マウスに食塩水中のＬ６１２の２００μｇを腹腔内に注射した。３日後に脾臓を取り出し、標準手法を用いて脾細胞を黒色腫細胞系ＳＰ２／０と融合させてハイブリドーマを製造した。
【００４９】
ＨＡＴ培地選択を行った後、ハイブリドーマの培養ウェルを、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体について試験した。抗イディオタイプ（ＡＢ２）を分泌するハイブリドーマを、ＨｕＭＡｂＬ６１２に対する強力な結合反応性があることと、３種の他の対照のヒトＩｇＭ：Ｌ５５、Ｌ７２およびヒト血清ＩｇＭに対する反応性がないことで同定した。抗原として用いる関連のないタンパク質としては、ウシ胎仔血清とヒト血清アルブミンがある。５０μｌのＩｇＭまたはタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）で９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートをコートして抗原として用い、ＡＢ２を検出した。ペルオキシダ−ゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭをＡＢ２検出プローブとして使用し、続いて基質を加え次いで先に記載したように４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った（参照資料１９）。
【００５０】
上記のようにして調製した約２５００個のハイブリドーマ培養ウェルのＨＡＴ選択を行って、Ｌ６１２ＨｕＭＡｂに対して明確な反応性を有しているが、３種の他の対照のヒトＩｇＭおよび２種の関連のない血清タンパク質抗原には全く反応性を示さない抗体を分泌する４０個のハイブリドーマを得た。これらの抗６１２抗体がＬ６１２の抗原結合部位に対するＡＢ２βタイプの抗体であるか、またはＬ６１２の抗原結合部位の外側のペプチド領域に結合されたＡＢ２α抗体であるかを決定するために、ＧＭ３陽性標的細胞系にもしくは精製抗原のガングリオシドＧＭ３に結合するＬ６１２に対するこれらの抗６１２抗体の阻害活性を３種の検定システム：ＩＡ阻害法、細胞ＥＬＩＳＡ阻害法およびＧＭ３−ＥＬＩＳＡ阻害法を使って試験した。検定において、試験した４０個の抗体のうち、７個が抗原陽性標的黒色腫細胞系（ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２）に結合するＬ６１２を阻害し、５０％以上がＧＭ３に結合するＬ６１２を阻害したが、残りの１２個は阻害活性が弱いかまたは阻害活性を全く示さなかった。
【００５１】
７個の阻害活性抗イディオタイプのうち、４Ｃ１０として識別されたものを、腫瘍を治療するのに用いる好ましいβ型抗イディオタイプとして、クローン化するために選択した。非阻害性群から１８Ｃ６として識別された抗イディオタイプを、免疫診断検定法に使用する好ましいα型抗イディオタイプとして、クローン化するため選択した。抗イディオタイプの４Ｃ１０と１８Ｃ６の両者を、イソタイプの抗グロブリンで試験した結果、ＩｇＧ１クラスのものでありかつκＬ鎖を含有することが見出された。
【００５２】
４Ｃ１０と１８Ｃ６でクローン化されたハイブリドーマ細胞系を、ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させ、５〜１０μｇ／ｍｌの抗体を培養物上澄液中に分泌させた。これら培養物の上澄み液中の、Ｌ６１２に対する抗イディオタイプのＥＬＩＳＡ法による力価は、１：２００〜１：１０００／１０6ハイブリドーマの範囲内であった。抗イディオタイプの１８Ｃ６は、ＩＡ検定法において標的細胞に対しおよびＥＬＩＳＡ法においてガングリオシドＧＭ３に対しＨｕＭＡｂＬ６１２の低い結合阻害活性を実証し、一方４Ｃ１０は、同じ抗体濃度で、ＥＬＩＳＡ検定法とＩＡ検定法の両方において強い阻害性を示した。対照標準の検定として、４Ｃ１０と１８Ｃ６は、関連のない抗原システムのＨｕＭＡｂＬ７２の、Ｍ１４標的細胞またはＧＤ２抗原に対する結合を阻害できなかった。１８Ｃ６の結合阻害性が欠如していることは、ＧＭ３抗原結合部位の外側に、Ｌ６１２抗体の結合部位があることを示し、そして４Ｃ１０の特異的結合阻害は、その結合部位が抗原結合部位の中かその近傍にあることを示す。
【００５３】
４Ｃ１０と１８Ｃ６のモノクローナル抗イディオタイプを分泌するハイブリドーマ細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部の外科腫瘍学科に保存されている。
【００５４】
Ｌ６１２に対して産生される４Ｃ１０抗イディオタイプおよび他のβ型抗イディオタイプは、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用して腫瘍を治療することができる。それらは、黒色腫の治療に用いられるのに好まれる。これらのβ型イディオタイプは、抗癌免疫を高め、臓器移植の拒絶反応を抑制し、そして自己免疫病を抑制するための免疫モジュレータとして使用することもできる。
【００５５】
β−抗イディオタイプは、抗体を患者に導入するのに使用する通常の手法のいずれによっても投与することができる。これらの手法としては、皮下注射、静脈注射または腫瘍内注射がある。β型の抗イディオタイプは、ＫＬＨと結合させ次いでフロイントの完全アジュバントのような適切な担体中に乳化することが好ましい。β型抗イディオタイプに用いる特定の投与量は、治療される腫瘍および多数の他の要因によって変わる。投与レベルは、一般的に知られていて、抗原免疫化剤またはモノクローナル抗体で患者を治療する場合に利用される公知の方法と原理によって規定される。
【００５６】
Ｌ６１２抗体に対するβ型抗イディオタイプの免疫原的有用性が以下のように実証された。
【００５７】
５頭の共通遺伝子系のＢａ１ｂ／ｃマウスを精製４Ｃ１０−ＫＬＨで免疫化した。対照標準として４頭のマウスをＩｇＧ１−ＫＬＨで免疫化し一頭のマウスをＫＬＨ単独で免疫化した。その免疫化された血清を、精製ＧＭ３を抗原の起源として用いてＥＬＩＳＡ法によって監視し、そして抗原陽性Ｍ１２黒色腫細胞系を用いてＩＡ検定法で監視した。ＥＬＩＳＡ法の場合、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を二次抗体として用いた。
【００５８】
測定可能な抗体（ＡＢ３）が、１００μｇの４Ｃ１０−ＫＬＨによる５頭の免疫化のうちの３頭に産生された。免疫化血清は、ＧＭ３に結合したが、ＣＤＨ（アシアロＧＭ３）には結合したかった。ＩｇＧ−ＫＬＨによりまたはＫＬＨだけにより免疫化された５頭のマウス由来の血清は、いずれの糖脂質にも全く反応を示さなかった。ＡＢ３のＩｇクラスを決定する別の分析法（ＥＬＩＳＡ法とＴＬＣ免疫染色法）では、反応性の大部分は、ＩｇＭであると同定された。
【００５９】
ＩＡ検定法において、Ｍ１２細胞と反応するかも知れない種特異性の天然抗体を除くために、免疫化されたマウス血清を、ヒト赤血球で、４℃で一夜、予め吸収させた。４＋のＩＡスコアを、吸収血清の１：１０希釈によって得た。対照標準の血清は、１：２の希釈でも反応性を全く示さなかった。陽性反応性が細胞表面上でＧＭ３抗原に対して起こったことを確認するため、ＩＡ阻害試験を行った。この試験には、ＧＭ３（１０μｇ）、ＣＤＨ（１０μｇ）、４Ｃ１０（１０μｇ）およびＢａｌｂ／ｃハイブリドーマ腹水から精製した関連のないＩｇＧ１（１０μｇ）を用いた。ＧＭ３や精製４Ｃ１０では反応性が完全に阻害されたが、ＣＤＨや関連のないＩｇＧ１では全く阻害されなかった。
【００６０】
上記の実施例によって、β型抗イディオタイプが黒色腫に免疫反応性であるＡＢ３抗体を産生することが実証された。したがって、Ｌ６１２抗体に応答して生成するこれらβ型抗イディオタイプは、黒色腫を治療する際の免疫化剤として有効である。
【００６１】
Ｌ６１２抗体に応答して産生されるα型抗イディオタイプは、３ステップ細胞ＥＬＩＳＡ法および腫瘍組織切片の３ステップ免疫ペルオキシターゼ染色法のような免疫診断法に使用することができる。実施例は次のとおりである。
【００６２】
［３ステップ細胞ＥＬＩＳＡ法］
生育可能なＭ１２細胞（１×１０5）を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでプリブロッキング（pre-blocking）を行った後、Ｕ字型底の９６０ウェル微量滴定プレート（Immulon-1, Dynatec）上にプレートした。５０μｌのＬ６１２（１００μｇ／ｍｌ）を添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。混合物を洗浄して未結合のＨｕＭＡｂＬ６１２を除いた後、細胞を、マウスモノクロナル抗イディオタイプの１８Ｃ６（１００μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、５０μｌのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１／１０，０００希釈）（Jackson Immuno Research）を添加し、プレートを３０分間インキュベートした。ＰＢＳ溶液で洗浄した後、ペルオキシダーゼに対する基質を添加し、次いで結合活性を、Ｖｍａｘ動的マイクロプレートリーダを用いて、４９０ｎｍにおける吸光度の関数として求めた。
【００６３】
Ｌ６１２の抗原結合部位が、腫瘍細胞に発現されるＧＭ３で占有されている場合、細胞に捕捉されたＨｕＭＡｂＬ６１２は、抗イディオタイプβに対するその結合活性は減少している筈であるが、抗イディオタイプαに対しては充分な結合活性を依然として保持している。高密度の対応する抗原を発現する培養Ｍ１２黒色腫細胞を用いて、上述の手法により、このプロセスが確認された。
【００６４】
上記の細胞結合検定法は、ＥＬＩＳＡ技法の変形である。陽性反応の特異性を確証するために、いくつかの対照標準検定を行った。対照標準の抗ガングリオシドＨｕＭＡｂとしてはＬ５５（ＩｇＭ抗ＧＭ２）およびＬ７２（ＩｇＭ抗ＧＤ２）があるが、これら両者は、ＧＭ２およびＧＤ２が豊富なＭ１４黒色腫細胞系に対して強い結合活性を示す（参照資料２６、２７）。抗イディオタイプの１８６Ｃ６は、ＨｕＭａＢＬ６１２とともに予めインキュベートした後のＭ１２細胞に強く反応したが、Ｌ５５またはＬ７２のＨｕＭＡｂとともに予めインキュベートしたＭ１４細胞には反応しなかった。ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇも、マウス抗イディオタイプ単独、Ｌ６１２、またはＬ６１２プラス（抗イディオタイプβ）を含む他の対照標準の場合、Ｍ１２細胞と反応しなかった。
【００６５】
次いで、細胞ＥＬＩＳＡ検定法を、他のいくつかのヒト腫瘍細胞系に適用した。２ステップ細胞結合検定法（ＨｕＭＡｂ＋ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＭ）を、３ステップ細胞結合検定法と比較して、３ステップ検定法の有効性を評価した。３ステップ検定法は、２ステップ検定法と並行した反応性を有し、そしてほとんどすべての細胞系で感度がわずかに高かった。このデータは、３ステップ検定法のＥＬＩＳＡ吸光度値が、細胞表面のＧＭ３抗原の密度の違いを正確に反映し、かつ生体外の検定法の２ステップ法と密接に関連していることを示している。
【００６６】
［組織切片の３ステップ免疫ペルオキシダーゼ染色法］
４μｍ厚の組織切片を、ＯＴＣ化合物中に新たに凍結させた組織から切り取り、直ちに冷ホルムアルデヒド緩衝液（１２ｇのトリス緩衝液、９ｇの塩化ナトリウム、４０ｍｌの３７％ホルムアルデヒド、ｐＨ７．４）で固定し、次いで風乾した。スライドをトリス緩衝液中に５分間浸漬し、次に３％過酸化水素で１０分間処理して、内因性のペルオキシダーゼ活性をクエンチした。
【００６７】
流動水中で５分間洗浄した後、切片を５％の正常ヒト血清で２０分間覆った。次いで、ＨｕＭＡｂＬ６１２（２００μｌ中１０μｇのＩｇＭ）を添加し、４５分間インキュベートした。スライドをトリス緩衝液中で５分間洗浄し、精製抗イディオタイプ１８Ｃ６（２００μｌ中１０μｇのＩｇＧ１）を添加し、３０分間インキュベートした。
【００６８】
スライドを再び洗浄した後、三次抗体として１／１００に希釈したビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国、カリフォルニア州、バーリンゲーム所在のVector Laboratories社）を添加し、２５分間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ストレプタビジン（１／１０００希釈度）（米国、サンフランシスコ所在のZymed Laboratories社）を添加し、２０分間インキュベートした。洗浄後、スライドを、６ｍｌのアミノエチルカルバゾール、５０ｍｌの０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．１）および０．４ｍｌの新たに調製した３％過酸化水素水を含有する基質溶液中に５分間浸漬した。スライドを水道水でもう一度洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色を行い、次いでグリセリン−ゼラチンを用いてカバースリップで染色切片をカバーした。免疫ペルオキシダーゼの３ステップ検定法を用いて、スナップ凍結されていた外科採取腫瘍組織に対するＬ６１２抗体の結合を検出するのに成功した。
【００６９】
この発明の代表的な実施態様を説明してきたが、ここに開示されているのは例示に過ぎず、その外の各種の代替、適合および変更がこの発明の範囲内でなされ得ることを、当該技術分野の当業者は理解すべきである。例えば、Ｌ６１２抗体を用いて、各種の治療にまたは診断用試薬として有用なキメラ抗体を製造することができる。したがって、この発明は、ここに例示されている特定の実施態様に限定されず、後記の請求の範囲によってのみ限定される。
［配列リスト］
（１）一般情報
（ｉ）出願人 イリエ レイコ エフ
（ｉｉ）発明の名称 抗ガングリオシド抗体を産生するヒトのＢリンパ芽腫細胞系
（ｉｉｉ）配列の数 ４
（ｉｖ）連絡住所
（Ａ）宛先 Ｐｏｍｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｌａｎｄｅ ＆ Ｒｏｓｅ
（Ｂ）街 アベニューオブザスターズ ２１２１ １４００号室
（Ｃ）市 ロサンゼルス
（Ｄ）州 カリフォルニア
（Ｅ）国 アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号 ９００６７
（ｖ）コンピュータ読み取り書式
（Ａ）メディアタイプ フロッピディスク
（Ｂ）コンピュータ ＩＢＭ−ＰＣコンパチ
（Ｃ）ＯＳ ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０，
Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５
（ｖｉ）本出願データ
（Ａ）出願番号 ＵＳ
（Ｂ）出願日
（Ｃ）分類
（ｖｉｉ）先出願データ
（Ａ）出願番号 ＵＳ ０７／６０９８０３
（Ｂ）出願日 １９９０年１１月０５日
（ｖｉｉｉ）代理人情報
（Ａ）氏名 Ｏｌｄｅｎｋａｍｐ，Ｄａｖｉｄ Ｊ
（Ｂ）登録番号 ２９４２１
（Ｃ）整理番号 ９４２６８
（ｉｘ）通信情報
（Ａ）電話 ３１０７８８５０４６
（Ｂ）ＦＡＸ ３１０２７７１２９７
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 １
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ ４３２塩基対
（Ｂ）配列の型 核酸
（Ｃ）鎖の数 一本鎖
（Ｄ）トポロジ 直鎖状
（ｉｉ）配列の種類 ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス Ｎｏ
（ｖｉ）起源
（Ａ）生物名 ホモサピエンス
（Ｇ）細胞の種類 ＥＢウイルスによる形質転換Ｂ細胞
（Ｈ）セルライン Ｌ６１２
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置 １．．４３２
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「Ｈ鎖」
／生産物＝「免疫グロブリン可変部」 ／標準名称＝「ＨｕＭａｂ Ｌ６１２Ｈ鎖可変部配列」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 １４８．．１６２
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域１（ＣＤＲ１）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ２７１．．３００
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域２（ＣＤＲ２）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ３９７．．４２９
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域３（ＣＤＲ３）」
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 １
【００７０】
【００７１】
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 ２
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ １４４アミノ酸
（Ｂ）配列の型 アミノ酸
（Ｄ）トポロジ リニア
（ｉｉ）配列の種類 蛋白質
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ２
【００７２】
【００７３】
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 ３
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ ３６０塩基対
（Ｂ）配列の型 核酸
（Ｃ）鎖の数 一本鎖
（Ｄ）トポロジ 直鎖状
（ｉｉ）配列の種類 ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル Ｎｏ
（ｉｖ）アンティセンス Ｎｏ
（ｖｉ）起源
（Ａ）生物体 ホモサピエンス
（Ｃ）個体単離 ＥＢウイルスによる形質転換Ｂ細胞
（Ｇ）細胞の種類 Ｂ細胞
（Ｈ）セルライン Ｌ６１２
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置 １．．３６０
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「免疫グロブリンＬ鎖」
／生産物＝「ＨｕＭａｂ Ｌ６１２Ｌ鎖可変部」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ５８．．１０８
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域１（ＣＤＲ１）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 １５４．．１７４
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域２（ＣＤＲ２）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ２７１．．２９７
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域３（ＣＤＲ３）」
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ３
【００７４】
【００７５】
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 ４
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ １２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型 アミノ酸
（Ｄ）トポロジ リニア
（ｉｉ）配列の種類 蛋白質
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ４
【００７６】
【技術分野】
【０００１】
当発明は、エプスタインバーウイルス（ＥＢウイルス、ＥＢＶ）によって感染し形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系（B-lymphoblastoid cell line）に関するものである。より詳しくは、この発明は、当該細胞系により産生される、直接腫瘍を治療するのに使用できまたは抗原代用物質や診断用試薬用に使用できる抗ガングリオシド抗体に関するものである。
【０００２】
当発明は、エプスタインバーウイルス（ＥＢウイルス、ＥＢＶ）によって感染し形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系（B-lymphoblastoid cell line）に関するものである。より詳しくは、この発明は、直接腫瘍を治するのに使用できまたは抗原代用物質や診断用試薬用の抗ガングリオシド抗体を産生するのに使用でる抗体を産生する能力のある同細胞系に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景を説明しかつその実施に関し詳細な追加説明を行うためにここに参照する出版物および他の参照資料は、ここに参照として編入するものである。便宜のため、参照資料は、付属の参考文献のところに番号を付しグループ分けしてある。これらの出版物および参照資料の内容は、この明細書に参照として編入する。
【０００４】
免疫グロブリンの可変部が外部抗原として作用し得る可能性は、Ｊｅｒｎｅによりイディオタイプネットワーク説（参照資料１）によって最初に唱えられた。この説によると、抗原結合部位上のまたはＡＢ１の骨格上のイディオタイプの認識は、それぞれ抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄまたはＡＢ２）βまたはαの産生をもたらす。このような「内部像」抗イディオタイプは、その元の抗原結合部位との相補性のため、元の抗原を模倣し、しばしば類似の生物学的挙動を呈する。内部像（internal image）の概念は、ある種のＡＢ２分子が抗原代用物質として振る舞うことができ、それらの投与がＡＢ１の類似特性を呈する抗抗イディオタイプ抗体の産生をもたらすことができる事実を称している。
【０００５】
抗イディオタイプを抗原代用物質として使用する免疫発生は、研究者らの間に非常な興味を生じさせ、多くの研究者がウイルス、バクテリアそして他の病原体に対して作用する特異な免疫を発生させるためにＡＢ２ワクチンで実験してきている（参照資料２、３）。この手法は、従来のワクチンや抗体が入手不能なとき、または対応する抗原が遺伝子工学にとって好ましくない産生物であるときに有用である。そのうえ、抗イディオタイプは、癌に対する免疫性を向上させるための免疫調節剤として、さらには移植臓器の拒絶反応を抑制したり自己免疫病の進行を抑制したりするための免疫抑制剤として使用することができる。
【０００６】
ガングリオシドは、ヒトの組織において基本的な膜構成要素であるグリコスフィンゴリピドである。ガングリオシドは、正常細胞の悪性形質転換の際に特性が変化するので、癌の免疫療法のための好ましい標的抗原である。悪性黒色腫瘍は、大量のガングリオシドを合成するため、ガングリオシドの免疫療法標的としての可能性を評価するための有用な実験モデルとしての役を果たしてきた。多くのヒトの黒色腫瘍の腫瘍関連ガングリオシドおよびそれらの各免疫原性が定義されてきている（参照資料１２〜２９）。加えて、多数の研究がガングリオシド抗原による活性免疫で黒色腫瘍患者の生存を延ばしたことを報告している（参照資料４、５）。しかしながら、この技術は、多くの方面で、ガングリオシド抗原が何倍も希である、すなわち供給が足りないという不便に遭遇している。
【０００７】
腫瘍関連の抗原は、多くの場合、自然界に低いレベルでしか存在せず、大量に精製することが比較的困難である。これに対して、抗イディオタイプは、ハイブリドーマ細胞から低コストで長期に亘って産生できる。そのうえ、現代の遺伝子工学の技術は、ガングリオシドエピトープには応用できないものの、抗イディオタイプペプチドを合成するのには使用することができる。以前にヒトの癌の活性特異免疫療法のために開発された抗イディオタイプは、免疫原としてマウスのモノクローナル抗体（ＭｕＭａｂｓ）を使用してきた（参照資料６〜１１）。
【０００８】
マウスのモノクローナル抗体は、抗原代用物質としての使用に加えて、ヒトの癌細胞の多くの抗原分子を定義し特徴づけるのにも採用されてきている。マウスのモノクローナル抗体は、ヒトのモノクローナル抗体に比べて、腫瘍抗原への強い親和性、ハイブリドーマ腹水による高い抗体産生、そして腫瘍細胞上の高い抗原密度を含むいくつかの利点を有している。しかしながら、治療上の使用に関しては、マウスのモノクローナルを用いた最近の臨床的試みによると、ＭｕＭＡｂｓの繰り返し注入は実質上全患者に抗マウスＩｇ抗体を誘発するので、ヒトのモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂｓ）の方が好ましいであろうことを示している。これは、潜在的に危険な複雑さを伴う免疫複合や免疫反応の形成につながる。加えて、ＨｕＭＡｂｓは、マウスの免疫系では見逃されたエピトープを認識できる。
【０００９】
ヒトの癌細胞上のガングリオシド抗原と反応するＨｕＭＡｂｓの開発および臨床レベルにおける抗腫瘍効果の実証が報告されている（参照資料２３、１２）。再発性黒色腫瘍の患者がガングリオシドＧＤ２またはＧＭ２に対するＨｕＭＡｂの腫瘍内注入を受け、役７０％の患者において部分的または完全な退行が認められた。免疫療法が効かなかった黒色腫瘍患者においては、標的抗原ＧＤ２もＧＭ２も腫瘍細胞上に現れなかった。Ｌ１５およびＬ７２として同定される２種類のＨｕＭＡｂがＥＢウイルスにより形質転換されたヒトのＢリンパ芽腫細胞系から産生された（参照資料２９）。Ｌ１５およびＬ７２抗体は、いずれも多種の腫瘍細胞に反応することが分かっていた。
【００１０】
ヒトの黒色腫瘍上のガングリオシドの量および質は異なる癌患者の間で大きく異なるので、各々の患者の腫瘍細胞上でどのガングリオシドが優位であるかを同定するための処置前バイオプシの検査により、不必要なＨｕＭＡｂの投与を避けることが好ましい。
【００１１】
与えられた腫瘍上に存在するガングリオシドの質および量を検出するために使われてきた免疫学的検定には、３種類の異なるものがある。それらは、免疫粘着検定法（ＩＡ）、蛍光性ミクロスフェアを用いる直接免疫蛍光法、並びにＩＡ吸収法および生化学的検定法を含む。これらの検定には、それぞれある限界および利点がある。免疫学的検定には、生体採取した腫瘍組織からの単細胞懸濁液が必要である。しかしながら、生存可能な高収率の腫瘍細胞個体群を得るのはしばしば困難である。また、光学顕微鏡の下では、腫瘍細胞は、単球やマクロファージから容易に区別できないかも知れない。生化学的検定は、無傷の細胞を必要としない。しかしながら、ガングリオシドの抽出および糖脂質製剤中のシアル酸の測定のために、比較的大きいボリュームの腫瘍が必要である。
【００１２】
マウスのモノクローナル抗体を使用する生体採取標本上の抗原表記を定義するために最も普通に利用される免疫学的技法は、組織セクションの免疫組織化学的染色である。しかしながら、この好感度の方法は、ヒトのモノクローナル抗体およびヒトの組織の組合せには容易には応用することができない。二次抗体（抗ヒトＩｇ）を用いたヒト腫瘍組織の間接的な染色は、通常、豊富な内生的ヒトＩｇへの非特異的結合からの高レベルの背景ノイズという結果になる。バイオティニレートされたヒトモノクローナル抗体を使った直接免疫染色法は、この高レベル背景ノイズを克服するかも知れない（参照資料３０）。しかしながら、この方法は、通常感度が低く、細胞表面に高密度の抗体が存在するときに最も効果的である。
【００１３】
現在、腫瘍上に存在するガングリオシドについて免疫性の抗体を産生する能力のある追加のヒト細胞系を開発すべき必要性が引き続き存在している。新しい細胞系により産生される抗ガングリオシド抗体は、腫瘍の直接的な処置に、および抗原代用物質または診断用試薬として使うための抗イディオタイプの産生にも有用であろう。
【００１４】
先行技術文献として、下記の非特許文献を挙げる。
【００１５】
【００１６】
【００１７】
【００１８】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
癌の治療や診断に応用可能な抗体を含む医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この発明により、各種の腫瘍に反応し黒色腫の治療に効果的であることが実証された抗ガングリオシド抗体を分泌するヒトのＢリンパ芽腫細胞系（Ｂリンパ芽球様細胞系（B-lymphoblastoid cell line））が開発された。抗体は、癌の治療や診断に応用可能である。この発明の細胞系は、Ｌ６１２と名付けられており、カリフォルニア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学科（Division of Surgical Oncology at the University of California at Los Angeles School of Medicine）において保存維持されている。Ｌ６１２細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）（American Type Culture Collection, Rockville, Maryland）にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０７２４として寄託されている。
【００２１】
この発明の特徴として、Ｌ６１２細胞系は、腫瘍抗原に反応するＩｇＭκ抗体を産生するのに使われる。Ｌ６１２抗体は、局所注射により投与したときに、黒色腫瘍の治療に効果があることが示されている。
【００２２】
この発明の他の特徴として、Ｌ６１２抗体は、抗原代用物質として利用できまたは診断手法において使用できるマウスの抗イディオタイプモノクローナル抗体を作るのに使われる。
【００２３】
以下の詳細な説明を参照してこの発明がよりよく理解されるにつれて、この発明の上記特徴および他の多くの特徴並びに付随する利点が明らかになるであろう。
【発明の効果】
【００２４】
癌の治療や診断に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｌ６１２抗体Ｈ鎖の可変部（Ｖ領域）のためのヌクレオチド／アミノ酸の配列である。相補性決定領域（complementary determining regions）に下線を施した。
【図２】Ｌ６１２抗体Ｌ鎖の可変部（Ｖ領域）のためのヌクレオチド／アミノ酸の配列である。相補性決定領域に下線を施した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
この発明の細胞系は、エプスタインバーウイルス形質転換法で形質転換されたＢリンパ芽腫細胞系である。この細胞系は、Ｌ６１２と命名され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学部に保存されている。このＬ６１２細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, Rockville, Maryland）にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０７２４で寄託される。
【００２７】
Ｌ６１２細胞系は、２種の他のヒトモノクローナル抗ガングリオシド抗体類、Ｌ５５（抗−ＧＭ２）およびＬ７２（抗ＧＤ２）を産生するために使用したのと同じエプスタインバーウイルス形質転換法（参照資料２６〜２７および２９）によってリンパ球から培養によって樹立した。（参照資料２９）に詳細に述べられているのと同じ形質転換法に従って、Ｌ６１２細胞系を樹立した。従来のＬ５５とＬ７２の細胞系およびこの発明のＬ６１２の細胞系を樹立するのに用いられるエプスタインバーウイルス形質転換法は、公知でかつこの技術分野の研究者が使用する通常の方法である。
【００２８】
Ｌ６１２細胞系を樹立するのに使用した具体的方法は、次のとおりである。
【００２９】
乳房切除中の乳癌患者から所属リンパ節を入手した。まず、このリンパ節を小片に切断し、次いで、その小片をハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に懸濁させることによって、リンパ球をこれらリンパ節から単離した。次に、この懸濁液をステンレス金網を通過させて大きな組織の塊を分離し、次にＦｉｃｏ１１の密度勾配溶液を用いて遠心分離してリンパ球を凝集分離した。Ｅロゼット形成法を用いてＴリンパ球を除去し、次いでＢリンパ球画分をＨＢＳＳで３回洗浄し、次に１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）とともに２０時間インキュベートした。細胞を限界希釈法によってクローン化し、先に記載したＩＡ検定法（参照資料２９）によって抗体の産生について監視した。
【００３０】
ヒト乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ４３６（参照資料３１）とヒト黒色腫細胞系のＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１２（参照資料３２）を標的として使用した。４３６乳癌細胞系に対して陽性の抗体を分泌するクローンは、樹立後すぐに抗体の産生を停止したが、Ｍ１２黒色腫細胞系に反応するクローンは、抗体の産生を続け、そして安定であった。抗体を分泌するクローンを、低濃度のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０に徐々に添加した。次に、そのクローンを、成長因子を含有する血清なしの培地（ＦＤＡはIrvine Scientific Co. 社（米国、カリフォルニア州、アービン所在）から入手できるＨＢシリーズの血清なしの培地を承認した）内で７回再クローン化した。Ｌ６１２細胞系の倍加時間は、１日間より短い。この細胞系は、２０μｇ／ｍｌを越える量のＩｇＭκモノクローナル抗体を分泌した。使用済培地中のＬ６１２抗体を先に述べたようにして精製した（参照資料２５）。さらに、Ｌ６１２細胞系によって産生された抗体は、細胞培養物から抗体を取り出して精製するのに用いるいずれかの通常の方法によって単離する。
【００３１】
精製されたＬ６１２抗体は、各種のヒト腫瘍組織との反応性について試験した。Ｌ６１２抗体は、補体の存在下で、抗原陽性ヒト腫瘍細胞に対して強い細胞障害活性を有する。その反応性は、免疫粘着（ＩＡ）検定法と免疫粘着吸収（ＩＡＡ）検定法の両者を用いて試験した。試験結果を［表１］に要約した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
合計２１個の生検黒色腫、３２名の別個のドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および別の４４名のドナー由来の赤血球を試験した。２１個の黒色腫組織のうちの１３個（６２％）が抗原陽性であったが、これに対してＰＢＬ（０／３２）と赤血球（０／４４）は全く陰性であった。培養したヒト悪性細胞系も抗原の存在について試験した（表Ｉ）。直接ＩＡ検定法で試験した１６個の黒色腫細胞系のうち１２個（７５％）が陽性であった。残りの癌細胞系の陽性反応性は、次のとおりであった。肺癌：４／４、乳癌：５／７、消化器癌：２／７、他のタイプの癌：１／４。しかし、試験した黒色腫細胞系に対して自己由来の、エプスタインバーウイルスで形質転換されたＢ細胞系１１個は、敏感なＩＡ吸収検定法でも陰性であった。黒色腫の陽性試料の百分率は肺癌の試料より低いが、単位試料当たりの全反応性は、他の組織学的タイプの癌より黒色腫の方がはるかに高かった。試験した黒色腫細胞系のうち、Ｍ１５とＭ１２が最高の反応性を示した。これらの細胞系をノイラミニダーゼ（受容体破壊酵素）で処理すると、これら細胞系の抗原性は完全に破壊されたが、トリプシンで処理したものは、破壊されなかった。
【００３４】
各種の基準糖脂質に対するＬ６１２抗体の反応性も測定した。これらの糖脂質と、それぞれのＬ６１２抗体に対する抗原力価を、［表２］に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
基準糖脂質（５ｎｍｏｌ）をＩＡ阻害試験法でＬ６１２の抗原活性について試験した。３種のガングリオシド：ＧＭ4、ＧＭ3およびＳＰＧは陽性の反応性を示したが、これらの中の２種のＧＭ4とＧＭ3はＳＰＧ（１：１６）より強い結合性（１：６４）を示した。ＩＩ3ＮｅｕＧｃ−Ｌａｃ−Ｃｅｒ、ＩＶ3ＮｅｕＧｃ−ｎＬｃＯｓｅ4−Ｃｅｒ、ＧＭ2、ＧＭ1a、ＧＤ3、ＧＤ2、ＧＤ1a、ＧＤ1bおよびＧＴ1bを含む他のガングリオシド類ならびにＧｂＯｓｅ3−Ｃｅｒ、ＧｂＯｓｅ4−ＣｅｒおよびＧｇＯｓｅ4−Ｃｅｒを含む中性糖脂質は、抗原活性を全く示さなかった。上記結果をさらに確認するため、基準の糖脂質について、ＴＬＣプレート上でＥＬＩＳＡ法と酵素免疫染色法を行った。ＥＬＩＳＡ法と酵素免疫染色法で得た結果は、ＩＡ阻害検定法の結果と類似していた。ＥＬＩＳＡ法は、微量滴定ウェル（microtiter wells）に結合させた１５個の基準糖脂質を用いて行った。やはり３種のガングリオシドＧＭ3、ＧＭ4およびＳＰＧが固相ＥＬＩＳＡ法で明確な結合活性を示した。残りのガングリオシド類は反応性を全く示さなかった。
【００３７】
ＧＭ４、ＧＭ３、ＳＰＧ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、Ｎ−グリコリルＧＭ３、ＣＤＨ、グロボシドおよびアシアロＧＭ１（１μｇ）によるＴＬＣプレートの酵素免疫染色試験も実施した。ＧＭ３とＧＭ４で強い陽性を示した。ＳＰＧについては、より緩やかな反応性が観測された。ＧＭ２については、ごく僅かな反応性が観察された。その外の糖脂質は、染色できなかった。これら異なる３種の免疫検定法の結果は、ＨｕＭＡｂのＬ６１２がＮｅｕＡｃα２−３ガラクトース残基を有するＧＭ３とＧＭ４のようなガングリオシド類の末端の糖を検出することを実証している。
【００３８】
凍結切片をＨｕＭａｂＬ６１２で免疫染色すると、黒色腫、結腸腺癌および肺腺癌を含む新生物組織に対する強い特異性を示した。ＨｕＭａｂは、ある種の新生物組織を同定するためま優れたマーカを提供する。ＨｕＭａｂのＬ６１２は、腎細胞線癌に結合することが報告されている（参照資料３５）。
【００３９】
Ｌ６１２抗体のＬ鎖とＨ鎖の両者の可変部のＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で決定した。チオシアン酸グアニジウム／塩化セシウム法を用いて、Ｌ６１２Ｂ−リンパ芽球系から全ＲＮＡを調製した（参照資料３４）。１０μｇのＲＮＡを６０ｐｍｏｌのμＨ鎖またはκＬ鎖の３′プライマと混合し、７０℃で１０分間加熱した。得られた混合物を、１０μｌの５Ｘ逆転写酵素緩衝液（ＢＲＬ）、４μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの最終濃度：２００μＭ）および３μｌの６００単位逆転写酵素（Superscript, ＢＲＬ）を含有する、５０μｌの逆転写酵素反応溶液に添加した。得られた混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【００４０】
次に、９７μｌのＰＣＲ混合物を３μｌのＲＮＡ−ｃＤＮＡ混合物に添加して、標準のＰＣＲ反応を実施した。そのＰＣＲ混合物は、１０ＸのＰＣＲ緩衝液（米国、カリフォルニア州所在のPerkin Elmer社）、各ｄＮＴＰの最終濃度が６０μＭである１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物、５単位のＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社）および６０μＭの適正な５′と３′のＨ鎖とＬ鎖のプライマを含有していた。得られた混合物を、Perkin Elmer/Cetus 熱サイクラの中で、９１℃で１分間、５２℃で２分間および７２℃で１．５分間の増幅を３５サイクル行い、次いで最終のインキュベーションを７２℃で１０分間行った。そのＰＣＲ産物の一部は、２％アガロースゲル上に正しい大きさのバンドを生成した。μＨ鎖とκＬ鎖のプライマは、それぞれ４９５個と６０３個の塩基対のｃＤＮＡ産物を生成した。ゲルが正しい大きさの単一産物を示した場合、残りのＰＣＲ−ｃＤＮＡ産物をＰＣＲに付してさらに産物を得た。
【００４１】
ゲルによる産物を単離し、集め、フェノール／クロロホルムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。次に、そのＤＮＡを、適正な制限酵素で消化し、抽出し、沈澱させ、次にGeneClean（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏ１０１）で精製した。そのＤＮＡを、Bluescriptベクター（米国、カリフォルニア州、Stratagene社）の適正な切断制限部位に結合させた。可変部のμ鎖の１０個の独立クローンおよび可変部のκ鎖の４個の独立クローンを単離して、配列を決定した。ＪH Ｈ鎖のプローブを用いて、Ｈ鎖クローンを選別して確認した。配列決定は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase, 米国、オハイオ州、クリーブランド所在のＵＳＢ社）を用い、メーカのプロトコルにしたがって、ジデオキシヌクレオチド法によって行った。使用したプライマは次のとおりであった。Ｈμ鎖のリーダプライマ（３個のプライマー）（参照資料２９）：
ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧ（ＡＧ）ＴＣ（ＣＴ）ＴＣＴ（ＧＴ）Ｃと、ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧ（ＣＴ）ＴＴＧＧＧＣＴＧＡ（ＣＧ）ＣＴＧＧ（ＣＧ）ＴＴＴ（ＣＴ）Ｔと、そしてＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧ（ＡＧ）Ａ（ＡＣ）（ＡＣ）（ＡＴ）ＡＣＴ（ＧＴ）ＴＧ（ＧＴ）（ＡＴ）（ＣＧ）Ｃ（ＡＴ）（ＣＴ）（ＣＧ）ＣＴ（ＣＴ）ＣＴＧである。これらのプライマには、クローン化を容易にするＥｃｏＲＩ制限部位（下線を付けた部分）が含まれている。Ｈμ鎖のＪ領域のプライマは、ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴであった。このプライマは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線部分）を含んでいる。Ｌκ鎖のリーダプライマは、次のとおりであった（２個のプライマ）（引例文献３０）。すなわち、ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡと、ＧＡＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡである。これらのプライマには、ＳａｃＩ部位が含まれている（下線部分）。Ｌκ鎖のＪ領域のプライマは、ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＧであった。このプライマには、Ｘｂａ部位が含まれている（下線部分）。
【００４２】
Ｈ鎖の可変部についてクローン化されたｃＤＮＡヌクレオチド配列とそのコード化アミノ酸配列を配列ＩＤ番号１に示す。上記のＨ鎖可変部のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号２に示す。Ｌ鎖の可変部についてクローン化されたｃＤＮＡヌクレオチド配列とそのコード化アミノ酸配列を配列ＩＤ番号３に示す。上記のＬ鎖可変部のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号４に示す。
【００４３】
また、Ｈ鎖可変部についてヌクレオチド／アミノ酸配列を図１に示す。その相補性決定領域（complementary determining regions,ＣＤＲ）１、２および３には、下線を付けてある。また、Ｌ鎖可変部についてヌクレオチド／アミノ酸配列を図２に示す。また、そのＣＤＲ１，２および３にも下線を付けてある。
【００４４】
この発明によるＬ６１２抗体は、ＧＭ３ガングリオシドまたはＮｅｕＡｃ２−３ガラクトースエピトープを含有する腫瘍を治療するため患者に投与される。ＧＭ３ガングリオシドは、Ｎｅｕα２−３ガラクトース残基を有する末端糖を有している。上記のような組織を治療するため、患者に抗体を投与するのに用いられる通常の手法のいずれも用いることができる。これらの手法としては、静脈注射もしくは腹腔注射および病変部内注射がある。病変部内注射は、再発性の皮膚腫瘍に対する好ましい投与法である。Ｌ６１２抗体およびこの抗体の産生細胞系は、公知の方法で変形もしくは変化させて、他の免疫グログリンのイソタイプおよび腫瘍細胞を効率よく結合して殺すことができる抗体を産生する細胞を形成させることができる（参照資料３３）。利用される特定の投与量は、腫瘍の抗原性によって変わり、そしてＬ５５およびＬ７２のような抗体を投与する公知の方法にしたがって決定することができる。Ｌ６１２モノクローナル抗体は、ヒト黒色腫瘍の生検試料と強く反応する。また、Ｌ６１２抗体は、肺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および腎臓癌由来のヒト腫瘍生検試料とも反応するが、反応程度は低い。ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２黒色腫細胞系は、Ｌ６１２モノクローナル抗体で試験した細胞系のなかで最高の反応性細胞系であると確認された。ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部外科腫瘍学科に保存されている。
【００４５】
Ｌ６１２ＨｕＭａｂを、悪性皮膚黒色腫を治療する治療剤として使用した。ＨｕＭａｂＬ６１２は、ヒトに使用する場合、先に述べたようにして生成した（参照資料２５）。ヒト抗ＧD2ＨｕＭａｂＬ７２の病変部内注射によって皮膚黒色腫を退行させることができるということは、以前の研究で実証された（参照資料２３）。この実施例において、ＨｕＭａｂＬ６２とＨｕＭａｂＬ７２の効能を比較する。
【００４６】
８４歳の女性が、彼女の左頬の急速に増殖する皮膚黒色腫病変部（１．９×１．６ｃｍ）の外科切除を受けた。組織切片の病理試験を行ったところ、クラークレベルＩＶの黒色腫であることが分かった。病変部生検試料のガングリオシド発現は、ＧM3に対しては中程度に陽性でありＧD2に対して陰性であることが分かった。外科手術を行ってから２週間後、その切開部位に再発が起こった。上部病変部位は１週間毎に１ｍｌのＨｕＭａｂＬ６１２で治療し、下部病変部を１ｍｌのＨｕＭａｂ７２ＨｕＭａｂで治療した。１カ月間治療した後（３回治療後）、ＨｕＭａｂＬ６１２で治療された病変部の壊死と軟化が観察された。これに対して、ＨｕＭａｂＬ７２ＨｕＭａｂで治療された病変部は全く反応を示さず、実際にはさらに進行した。この患者は、肝臓と脳に広く転移したため結局死亡した。
【００４７】
また、Ｌ６１２抗体は、抗原代用物質または診断用試薬として用いられる抗イディオタイプを産生するのに利用できるハイブリドーマを産生するのに有用である。ハイブリドーマの産生とそれに続く抗イディオタイプの生成は、以下の実施手法において説明する。
【００４８】
完全フロイントアジュバント中の精製Ｌ６１２モノクローナル抗体２００μｇを皮下注射することによって、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。２週間後に、不完全フロイントアジュバント中のＬ６１２を別個に皮下注射してマウスの追加免疫を行った。この追加免疫を行ってから１１日後、マウスに食塩水中のＬ６１２の２００μｇを腹腔内に注射した。３日後に脾臓を取り出し、標準手法を用いて脾細胞を黒色腫細胞系ＳＰ２／０と融合させてハイブリドーマを製造した。
【００４９】
ＨＡＴ培地選択を行った後、ハイブリドーマの培養ウェルを、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体について試験した。抗イディオタイプ（ＡＢ２）を分泌するハイブリドーマを、ＨｕＭＡｂＬ６１２に対する強力な結合反応性があることと、３種の他の対照のヒトＩｇＭ：Ｌ５５、Ｌ７２およびヒト血清ＩｇＭに対する反応性がないことで同定した。抗原として用いる関連のないタンパク質としては、ウシ胎仔血清とヒト血清アルブミンがある。５０μｌのＩｇＭまたはタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）で９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートをコートして抗原として用い、ＡＢ２を検出した。ペルオキシダ−ゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭをＡＢ２検出プローブとして使用し、続いて基質を加え次いで先に記載したように４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った（参照資料１９）。
【００５０】
上記のようにして調製した約２５００個のハイブリドーマ培養ウェルのＨＡＴ選択を行って、Ｌ６１２ＨｕＭＡｂに対して明確な反応性を有しているが、３種の他の対照のヒトＩｇＭおよび２種の関連のない血清タンパク質抗原には全く反応性を示さない抗体を分泌する４０個のハイブリドーマを得た。これらの抗６１２抗体がＬ６１２の抗原結合部位に対するＡＢ２βタイプの抗体であるか、またはＬ６１２の抗原結合部位の外側のペプチド領域に結合されたＡＢ２α抗体であるかを決定するために、ＧＭ３陽性標的細胞系にもしくは精製抗原のガングリオシドＧＭ３に結合するＬ６１２に対するこれらの抗６１２抗体の阻害活性を３種の検定システム：ＩＡ阻害法、細胞ＥＬＩＳＡ阻害法およびＧＭ３−ＥＬＩＳＡ阻害法を使って試験した。検定において、試験した４０個の抗体のうち、７個が抗原陽性標的黒色腫細胞系（ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ１２）に結合するＬ６１２を阻害し、５０％以上がＧＭ３に結合するＬ６１２を阻害したが、残りの１２個は阻害活性が弱いかまたは阻害活性を全く示さなかった。
【００５１】
７個の阻害活性抗イディオタイプのうち、４Ｃ１０として識別されたものを、腫瘍を治療するのに用いる好ましいβ型抗イディオタイプとして、クローン化するために選択した。非阻害性群から１８Ｃ６として識別された抗イディオタイプを、免疫診断検定法に使用する好ましいα型抗イディオタイプとして、クローン化するため選択した。抗イディオタイプの４Ｃ１０と１８Ｃ６の両者を、イソタイプの抗グロブリンで試験した結果、ＩｇＧ１クラスのものでありかつκＬ鎖を含有することが見出された。
【００５２】
４Ｃ１０と１８Ｃ６でクローン化されたハイブリドーマ細胞系を、ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させ、５〜１０μｇ／ｍｌの抗体を培養物上澄液中に分泌させた。これら培養物の上澄み液中の、Ｌ６１２に対する抗イディオタイプのＥＬＩＳＡ法による力価は、１：２００〜１：１０００／１０6ハイブリドーマの範囲内であった。抗イディオタイプの１８Ｃ６は、ＩＡ検定法において標的細胞に対しおよびＥＬＩＳＡ法においてガングリオシドＧＭ３に対しＨｕＭＡｂＬ６１２の低い結合阻害活性を実証し、一方４Ｃ１０は、同じ抗体濃度で、ＥＬＩＳＡ検定法とＩＡ検定法の両方において強い阻害性を示した。対照標準の検定として、４Ｃ１０と１８Ｃ６は、関連のない抗原システムのＨｕＭＡｂＬ７２の、Ｍ１４標的細胞またはＧＤ２抗原に対する結合を阻害できなかった。１８Ｃ６の結合阻害性が欠如していることは、ＧＭ３抗原結合部位の外側に、Ｌ６１２抗体の結合部位があることを示し、そして４Ｃ１０の特異的結合阻害は、その結合部位が抗原結合部位の中かその近傍にあることを示す。
【００５３】
４Ｃ１０と１８Ｃ６のモノクローナル抗イディオタイプを分泌するハイブリドーマ細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部の外科腫瘍学科に保存されている。
【００５４】
Ｌ６１２に対して産生される４Ｃ１０抗イディオタイプおよび他のβ型抗イディオタイプは、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用して腫瘍を治療することができる。それらは、黒色腫の治療に用いられるのに好まれる。これらのβ型イディオタイプは、抗癌免疫を高め、臓器移植の拒絶反応を抑制し、そして自己免疫病を抑制するための免疫モジュレータとして使用することもできる。
【００５５】
β−抗イディオタイプは、抗体を患者に導入するのに使用する通常の手法のいずれによっても投与することができる。これらの手法としては、皮下注射、静脈注射または腫瘍内注射がある。β型の抗イディオタイプは、ＫＬＨと結合させ次いでフロイントの完全アジュバントのような適切な担体中に乳化することが好ましい。β型抗イディオタイプに用いる特定の投与量は、治療される腫瘍および多数の他の要因によって変わる。投与レベルは、一般的に知られていて、抗原免疫化剤またはモノクローナル抗体で患者を治療する場合に利用される公知の方法と原理によって規定される。
【００５６】
Ｌ６１２抗体に対するβ型抗イディオタイプの免疫原的有用性が以下のように実証された。
【００５７】
５頭の共通遺伝子系のＢａ１ｂ／ｃマウスを精製４Ｃ１０−ＫＬＨで免疫化した。対照標準として４頭のマウスをＩｇＧ１−ＫＬＨで免疫化し一頭のマウスをＫＬＨ単独で免疫化した。その免疫化された血清を、精製ＧＭ３を抗原の起源として用いてＥＬＩＳＡ法によって監視し、そして抗原陽性Ｍ１２黒色腫細胞系を用いてＩＡ検定法で監視した。ＥＬＩＳＡ法の場合、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を二次抗体として用いた。
【００５８】
測定可能な抗体（ＡＢ３）が、１００μｇの４Ｃ１０−ＫＬＨによる５頭の免疫化のうちの３頭に産生された。免疫化血清は、ＧＭ３に結合したが、ＣＤＨ（アシアロＧＭ３）には結合したかった。ＩｇＧ−ＫＬＨによりまたはＫＬＨだけにより免疫化された５頭のマウス由来の血清は、いずれの糖脂質にも全く反応を示さなかった。ＡＢ３のＩｇクラスを決定する別の分析法（ＥＬＩＳＡ法とＴＬＣ免疫染色法）では、反応性の大部分は、ＩｇＭであると同定された。
【００５９】
ＩＡ検定法において、Ｍ１２細胞と反応するかも知れない種特異性の天然抗体を除くために、免疫化されたマウス血清を、ヒト赤血球で、４℃で一夜、予め吸収させた。４＋のＩＡスコアを、吸収血清の１：１０希釈によって得た。対照標準の血清は、１：２の希釈でも反応性を全く示さなかった。陽性反応性が細胞表面上でＧＭ３抗原に対して起こったことを確認するため、ＩＡ阻害試験を行った。この試験には、ＧＭ３（１０μｇ）、ＣＤＨ（１０μｇ）、４Ｃ１０（１０μｇ）およびＢａｌｂ／ｃハイブリドーマ腹水から精製した関連のないＩｇＧ１（１０μｇ）を用いた。ＧＭ３や精製４Ｃ１０では反応性が完全に阻害されたが、ＣＤＨや関連のないＩｇＧ１では全く阻害されなかった。
【００６０】
上記の実施例によって、β型抗イディオタイプが黒色腫に免疫反応性であるＡＢ３抗体を産生することが実証された。したがって、Ｌ６１２抗体に応答して生成するこれらβ型抗イディオタイプは、黒色腫を治療する際の免疫化剤として有効である。
【００６１】
Ｌ６１２抗体に応答して産生されるα型抗イディオタイプは、３ステップ細胞ＥＬＩＳＡ法および腫瘍組織切片の３ステップ免疫ペルオキシターゼ染色法のような免疫診断法に使用することができる。実施例は次のとおりである。
【００６２】
［３ステップ細胞ＥＬＩＳＡ法］
生育可能なＭ１２細胞（１×１０5）を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでプリブロッキング（pre-blocking）を行った後、Ｕ字型底の９６０ウェル微量滴定プレート（Immulon-1, Dynatec）上にプレートした。５０μｌのＬ６１２（１００μｇ／ｍｌ）を添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。混合物を洗浄して未結合のＨｕＭＡｂＬ６１２を除いた後、細胞を、マウスモノクロナル抗イディオタイプの１８Ｃ６（１００μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、５０μｌのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１／１０，０００希釈）（Jackson Immuno Research）を添加し、プレートを３０分間インキュベートした。ＰＢＳ溶液で洗浄した後、ペルオキシダーゼに対する基質を添加し、次いで結合活性を、Ｖｍａｘ動的マイクロプレートリーダを用いて、４９０ｎｍにおける吸光度の関数として求めた。
【００６３】
Ｌ６１２の抗原結合部位が、腫瘍細胞に発現されるＧＭ３で占有されている場合、細胞に捕捉されたＨｕＭＡｂＬ６１２は、抗イディオタイプβに対するその結合活性は減少している筈であるが、抗イディオタイプαに対しては充分な結合活性を依然として保持している。高密度の対応する抗原を発現する培養Ｍ１２黒色腫細胞を用いて、上述の手法により、このプロセスが確認された。
【００６４】
上記の細胞結合検定法は、ＥＬＩＳＡ技法の変形である。陽性反応の特異性を確証するために、いくつかの対照標準検定を行った。対照標準の抗ガングリオシドＨｕＭＡｂとしてはＬ５５（ＩｇＭ抗ＧＭ２）およびＬ７２（ＩｇＭ抗ＧＤ２）があるが、これら両者は、ＧＭ２およびＧＤ２が豊富なＭ１４黒色腫細胞系に対して強い結合活性を示す（参照資料２６、２７）。抗イディオタイプの１８６Ｃ６は、ＨｕＭａＢＬ６１２とともに予めインキュベートした後のＭ１２細胞に強く反応したが、Ｌ５５またはＬ７２のＨｕＭＡｂとともに予めインキュベートしたＭ１４細胞には反応しなかった。ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇも、マウス抗イディオタイプ単独、Ｌ６１２、またはＬ６１２プラス（抗イディオタイプβ）を含む他の対照標準の場合、Ｍ１２細胞と反応しなかった。
【００６５】
次いで、細胞ＥＬＩＳＡ検定法を、他のいくつかのヒト腫瘍細胞系に適用した。２ステップ細胞結合検定法（ＨｕＭＡｂ＋ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＭ）を、３ステップ細胞結合検定法と比較して、３ステップ検定法の有効性を評価した。３ステップ検定法は、２ステップ検定法と並行した反応性を有し、そしてほとんどすべての細胞系で感度がわずかに高かった。このデータは、３ステップ検定法のＥＬＩＳＡ吸光度値が、細胞表面のＧＭ３抗原の密度の違いを正確に反映し、かつ生体外の検定法の２ステップ法と密接に関連していることを示している。
【００６６】
［組織切片の３ステップ免疫ペルオキシダーゼ染色法］
４μｍ厚の組織切片を、ＯＴＣ化合物中に新たに凍結させた組織から切り取り、直ちに冷ホルムアルデヒド緩衝液（１２ｇのトリス緩衝液、９ｇの塩化ナトリウム、４０ｍｌの３７％ホルムアルデヒド、ｐＨ７．４）で固定し、次いで風乾した。スライドをトリス緩衝液中に５分間浸漬し、次に３％過酸化水素で１０分間処理して、内因性のペルオキシダーゼ活性をクエンチした。
【００６７】
流動水中で５分間洗浄した後、切片を５％の正常ヒト血清で２０分間覆った。次いで、ＨｕＭＡｂＬ６１２（２００μｌ中１０μｇのＩｇＭ）を添加し、４５分間インキュベートした。スライドをトリス緩衝液中で５分間洗浄し、精製抗イディオタイプ１８Ｃ６（２００μｌ中１０μｇのＩｇＧ１）を添加し、３０分間インキュベートした。
【００６８】
スライドを再び洗浄した後、三次抗体として１／１００に希釈したビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国、カリフォルニア州、バーリンゲーム所在のVector Laboratories社）を添加し、２５分間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ストレプタビジン（１／１０００希釈度）（米国、サンフランシスコ所在のZymed Laboratories社）を添加し、２０分間インキュベートした。洗浄後、スライドを、６ｍｌのアミノエチルカルバゾール、５０ｍｌの０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．１）および０．４ｍｌの新たに調製した３％過酸化水素水を含有する基質溶液中に５分間浸漬した。スライドを水道水でもう一度洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色を行い、次いでグリセリン−ゼラチンを用いてカバースリップで染色切片をカバーした。免疫ペルオキシダーゼの３ステップ検定法を用いて、スナップ凍結されていた外科採取腫瘍組織に対するＬ６１２抗体の結合を検出するのに成功した。
【００６９】
この発明の代表的な実施態様を説明してきたが、ここに開示されているのは例示に過ぎず、その外の各種の代替、適合および変更がこの発明の範囲内でなされ得ることを、当該技術分野の当業者は理解すべきである。例えば、Ｌ６１２抗体を用いて、各種の治療にまたは診断用試薬として有用なキメラ抗体を製造することができる。したがって、この発明は、ここに例示されている特定の実施態様に限定されず、後記の請求の範囲によってのみ限定される。
［配列リスト］
（１）一般情報
（ｉ）出願人 イリエ レイコ エフ
（ｉｉ）発明の名称 抗ガングリオシド抗体を産生するヒトのＢリンパ芽腫細胞系
（ｉｉｉ）配列の数 ４
（ｉｖ）連絡住所
（Ａ）宛先 Ｐｏｍｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｌａｎｄｅ ＆ Ｒｏｓｅ
（Ｂ）街 アベニューオブザスターズ ２１２１ １４００号室
（Ｃ）市 ロサンゼルス
（Ｄ）州 カリフォルニア
（Ｅ）国 アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号 ９００６７
（ｖ）コンピュータ読み取り書式
（Ａ）メディアタイプ フロッピディスク
（Ｂ）コンピュータ ＩＢＭ−ＰＣコンパチ
（Ｃ）ＯＳ ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０，
Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５
（ｖｉ）本出願データ
（Ａ）出願番号 ＵＳ
（Ｂ）出願日
（Ｃ）分類
（ｖｉｉ）先出願データ
（Ａ）出願番号 ＵＳ ０７／６０９８０３
（Ｂ）出願日 １９９０年１１月０５日
（ｖｉｉｉ）代理人情報
（Ａ）氏名 Ｏｌｄｅｎｋａｍｐ，Ｄａｖｉｄ Ｊ
（Ｂ）登録番号 ２９４２１
（Ｃ）整理番号 ９４２６８
（ｉｘ）通信情報
（Ａ）電話 ３１０７８８５０４６
（Ｂ）ＦＡＸ ３１０２７７１２９７
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 １
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ ４３２塩基対
（Ｂ）配列の型 核酸
（Ｃ）鎖の数 一本鎖
（Ｄ）トポロジ 直鎖状
（ｉｉ）配列の種類 ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス Ｎｏ
（ｖｉ）起源
（Ａ）生物名 ホモサピエンス
（Ｇ）細胞の種類 ＥＢウイルスによる形質転換Ｂ細胞
（Ｈ）セルライン Ｌ６１２
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置 １．．４３２
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「Ｈ鎖」
／生産物＝「免疫グロブリン可変部」 ／標準名称＝「ＨｕＭａｂ Ｌ６１２Ｈ鎖可変部配列」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 １４８．．１６２
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域１（ＣＤＲ１）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ２７１．．３００
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域２（ＣＤＲ２）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ３９７．．４２９
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域３（ＣＤＲ３）」
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 １
【００７０】
【００７１】
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 ２
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ １４４アミノ酸
（Ｂ）配列の型 アミノ酸
（Ｄ）トポロジ リニア
（ｉｉ）配列の種類 蛋白質
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ２
【００７２】
【００７３】
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 ３
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ ３６０塩基対
（Ｂ）配列の型 核酸
（Ｃ）鎖の数 一本鎖
（Ｄ）トポロジ 直鎖状
（ｉｉ）配列の種類 ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル Ｎｏ
（ｉｖ）アンティセンス Ｎｏ
（ｖｉ）起源
（Ａ）生物体 ホモサピエンス
（Ｃ）個体単離 ＥＢウイルスによる形質転換Ｂ細胞
（Ｇ）細胞の種類 Ｂ細胞
（Ｈ）セルライン Ｌ６１２
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置 １．．３６０
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「免疫グロブリンＬ鎖」
／生産物＝「ＨｕＭａｂ Ｌ６１２Ｌ鎖可変部」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ５８．．１０８
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域１（ＣＤＲ１）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 １５４．．１７４
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域２（ＣＤＲ２）」
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）名称／キー ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置 ２７１．．２９７
（Ｄ）他の情報 ／機能＝「相補性決定領域３（ＣＤＲ３）」
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ３
【００７４】
【００７５】
（２）配列情報 配列ＩＤ番号 ４
（ｉ）配列特性
（Ａ）配列の長さ １２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型 アミノ酸
（Ｄ）トポロジ リニア
（ｉｉ）配列の種類 蛋白質
（ｘｉ）配列 配列ＩＤ番号 ４
【００７６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ６１２として同定され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）にＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ１０７２４として寄託されているヒトＢリンパ芽腫細胞系から分泌される、ＧＭ３、ＧＭ４またはＳＰＧガングリオシド抗原に特異的に結合する抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。
【請求項２】
配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を含んで成るＨ鎖可変部および配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列を含んで成るＬ鎖可変部を含む抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。
【請求項３】
ヌクレオチド／アミノ酸配列：
（ここに、下線アミノ酸は、相補性決定領域を表す。）
に記載のＨ鎖可変部、および
（ここに、下線アミノ酸は、相補性決定領域を表す。）
に記載のＬ鎖可変部を含む抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。
【請求項１】
Ｌ６１２として同定され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）にＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ１０７２４として寄託されているヒトＢリンパ芽腫細胞系から分泌される、ＧＭ３、ＧＭ４またはＳＰＧガングリオシド抗原に特異的に結合する抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。
【請求項２】
配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を含んで成るＨ鎖可変部および配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列を含んで成るＬ鎖可変部を含む抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。
【請求項３】
ヌクレオチド／アミノ酸配列：
（ここに、下線アミノ酸は、相補性決定領域を表す。）
に記載のＨ鎖可変部、および
（ここに、下線アミノ酸は、相補性決定領域を表す。）
に記載のＬ鎖可変部を含む抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２０９２８７（Ｐ２０１１−２０９２８７Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０９９０４（Ｐ２０１１−１０９９０４）
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【分割の表示】特願平６−５１９０２７の分割
【原出願日】平成６年２月９日（１９９４．２．９）
【出願人】（５１１１１８５８４）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【分割の表示】特願平６−５１９０２７の分割
【原出願日】平成６年２月９日（１９９４．２．９）
【出願人】（５１１１１８５８４）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (1)
【Ｆターム（参考）】
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