ヒトＧ−ＣＳＦの調整方法
【課題】単純でロバストな方法を用いて、プラスミドの高安定性を維持することによって、Ｇ−ＣＳＦを高体積収量で調整する代替方法を開発する、明らかな必要性が存在する。
【解決手段】本発明は、生産段階の間の、プラスミド安定性が高塩誘導によって増加されるのを介した、高収量でのＧ−ＣＳＦの、改善された生産方法を開示する。
【解決手段】本発明は、生産段階の間の、プラスミド安定性が高塩誘導によって増加されるのを介した、高収量でのＧ−ＣＳＦの、改善された生産方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生産段階の間の、高塩誘発によるプラスミド安定性の増加を介した、Ｇ−ＣＳＦの高収率での改良された生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の治療により、重篤な慢性好中球減少症を有する患者の生活の質が著しく改善する（非特許文献１）。Ｇ−ＣＳＦは、骨髄の貯蔵庫からの好中球の放出および抗菌作用の増強活性化のための、潜在的な内因性要因である。Ｇ−ＣＳＦは、さまざまな急性疾患の前臨床モデルにおいて幅広く評価されており、おおむね良好な結果を得ている（非特許文献２）。化学療法サイクル間の証明された有効性のために、Ｇ−ＣＳＦは腫瘍学において用いられる、重要な生物医薬品である。Ｇ−ＣＳＦはさまざまな種類の細胞でクローン化され、発現しており、例えば微生物細胞（非特許文献３および４）、酵母細胞（非特許文献５および特許文献１）、イネ細胞（非特許文献６）、ネコ細胞（非特許文献７）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（非特許文献８）、昆虫細胞（非特許文献９）、およびさらにはトランスジェニックヤギ（非特許文献１０）がある。医薬的な使用のために、Ｇ−ＣＳＦは初めに大腸菌で、封入体として産生され（非特許文献１１）、封入体は本来ではないコンフォメーションでの、不溶性の組換えタンパク質の会合体であり（非特許文献１２）、一般的に生物学的活性を有しない（非特許文献１３）。Ｇ−ＣＳＦの分泌産生技術についても報告されている（非特許文献１４および１５）。分泌発現は通常、適切に折り畳まれたＧ−ＣＳＦを、ペリプラズム空間または細胞外培地内に放出させるが、その収量は、封入体で得られる場合に比べて遥かに少ない。したがって、封入体として大腸菌でＧ−ＣＳＦを発現させるのは、工業用の利点がある。適切に折り畳まれた、生物学的に活性のあるＧ−ＣＳＦタンパク質は、封入体の単離および可溶化の後で、変性および再生を適用させることによって、工業的に実行可能な態様で封入体から容易に得られる（非特許文献１６および１７）。
【０００３】
大腸菌における組換えタンパク質産生のもっとも効率的な方法の一つは、フェドバッチ培養であり、循環（ｃｙｃｌｉｃ）モードおよび非循環モードで実行され得る。非循環方法は、より複雑ではないので、工業生産により適している。事実、先行技術には、非循環フェドバッチ培養方法からの最もＧＣＳＦの収率が高いものの一つが記載されており、それは４．２〜４．４ｇ／Ｌの範囲である（非特許文献１８）。より高い累積収率を得るための循環モードでのフェドバッチ培養による発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を行うと、プラスミドの不安定性が高くなり（非特許文献１９）、それゆえに、この方法のロバスト性が制限される。
【０００４】
一般的に、高発現の産物を有するために、この産物の遺伝子を含有する染色体外プラスミドを、適切な形態で細胞中に保持し続けることが不可欠である。これは、通常、培養ブロスに適切な抗生物質を加えることによって、組換え微生物への選択圧を維持することにより達成される。組換え株の「分離不安定性」を減少させるための発酵の間、１〜２ｈごとに抗生物質（アンピシリン）を加えることによって、Ｇ−ＣＳＦの発現レベルが上昇することが報告されている（特許文献２）。最終産物からの抗生物質のクリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の証拠を調節的に要求することが、使用の制限を必然的に伴わせる。高用量の抗生物質もまた、望ましくない環境への影響を潜在的に高く有する可能性がある。しかし、抗生物質の選択圧の減少は、しばしば、方法のロバスト性を危うくする、プラスミドの安定性および発現レベルの減少という結果になる。したがって、特に生産段階の間に、プラスミドの安定性および産物の発現レベルを増加させる一方で、抗生物質の使用を制限しようという技術的な挑戦がある。さらに、生産段階の間のプラスミドの低安定性は、代謝性ストレスに起因する可能性もあり（非特許文献２０）、特に高培養液量において、低発現レベルへとつながる可能性がある（非特許文献２１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】Lee S.M. et al. Korean patent KR 160934 B1 19981116
【特許文献２】Krivopalova G.N. et al. Russian Patent RU 2158303 C2 20001027
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jones et al. JAMA 270: 1132-1133 (1993)
【非特許文献２】Marshall J.C. Shock 24: 120-9 (2005)
【非特許文献３】Souza L.M. Science 232: 61-65 (1986)
【非特許文献４】Hu Z.Y. et al. Zhongguo Shenghua Yaowu Zazhi (1999), 20: 55-57
【非特許文献５】Lasnik M.A. et al. Biotechnol. Bioeng. 81: 768-774 (2003)
【非特許文献６】Hong et al. Protein Expr Purif. Epub ahead of print (2005)
【非特許文献７】Yamamoto et al. Gene 274: 263-269 (2001)
【非特許文献８】Monaco L. et al. Gene. 180:145-150 (1996)
【非特許文献９】Shinkai et al. Protein Expr Purif. 10: 379-385 (1997)
【非特許文献１０】Ko J.H. et al. Transgenic Res. 9: 215-22 (2000)
【非特許文献１１】Jevsevar S. et al. Biotechnol. Prog. 21: 632-639 (2005)
【非特許文献１２】Baneyx F. & Mujacic M. Nature Biotechnol. 22: 1399-1408 (2004)
【非特許文献１３】Bernardez C.E. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-163 (1998)
【非特許文献１４】Jeong K.J. & Lee S.Y. Protein Expr Purif. 23: 311-318 (2001)
【非特許文献１５】Lee S.Y. et al. Methods Mol. Biol. 308: 31-42 (2005)
【非特許文献１６】Rudolph R, In Protein Engineering: Principles and Practice; Cleland, J. L., Craik, S. C., Eds.; Wiley-Liss, Inc.: New York, 1996; pp 283-298
【非特許文献１７】Rathore A.S. et al. J Pharm Biomed Anal. 32:1199-1211 (2003)
【非特許文献１８】Yim SC et al. Bioprocess and Biosystems Engineering (2001), 24, 249-254
【非特許文献１９】Choi S.-J. et al. J. Microbiol. Biotechnol. 10: 321-326 (2000)
【非特許文献２０】Saraswat V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 179: 367-373 (1999)
【非特許文献２１】Cheng C. et al Biotechnol. Bioeng. 56: 23-31 (1997)
【非特許文献２２】Schweder T. et al. Appl Microbiol Biotechnol. 38:91-93 (1992)
【非特許文献２３】Pan S.H. and Malcom B.A. Biotechniques. 29:1234-1238 (2000)
【非特許文献２４】Smith & Bidochka Can. J. Microbiol. 44: 351- 355 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗生物質による高選択圧を維持するのに加えて、プラスミド安定性は、ベクター構築の段階で改善され得る（非特許文献２２および２３）。方法において、プラスミド安定性は、栄養飢餓を避けるなどの、培養条件を調節することによって改善され得る（非特許文献２４）。大規模な基質制限フェドバッチ培養方法を実行する間、栄養制限／栄養飢餓は差し迫った問題であり、あまりに頻繁に、または大量に抗生物質を加えることは、複雑さが低い方法での、高収量の産物およびプラスミドの高安定性を維持するためには非現実的であり高価な溶液である。したがって、単純でロバストな方法を用いて、プラスミドの高安定性を維持することによって、Ｇ−ＣＳＦを高体積収量で調整する代替方法を開発する、明らかな必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、生産培地および培養ブロスにおいて、高濃度の、マグネシウムイオンもしくはナトリウムイオンと組み合わせたカリウムイオンを用いて、培養物でのプラスミドの高安定性を維持することによって、大腸菌において高体積収量で顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を生産するための、非循環フェドバッチ培養方法について記述する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バッチの収穫時の、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞でのＧ−ＣＳＦ遺伝子を含有しているプラスミドの安定性に関しての、生産段階での高濃度のカリウムおよびナトリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ２は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩で実行し、バッチ１は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩なしで実行した。これらのバッチは３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図２】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関する生産段階での高濃度のカリウムおよびナトリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ２は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩で実行し、バッチ１は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩なしで実行した。これらのバッチは３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図３】バッチの収穫時の、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞でのＧ−ＣＳＦ遺伝子を含有しているプラスミドの安定性に関しての、生産段階での高濃度のマグネシウムおよびカリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ４は高濃度のマグネシウム塩で実行し、バッチ３は高濃度のマグネシウム塩は用いなかった。両バッチは高濃度のカリウム塩で、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図４】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関する高濃度のマグネシウムおよびカリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ４は高濃度のマグネシウム塩で実行し、バッチ３は高濃度のマグネシウム塩は用いなかった。両バッチは高濃度のカリウム塩で、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図５】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関しての生産段階での高特異的な成長速度の使用効果を示す図である。生産段階の間、バッチ４は約０．０４ｌ／ｈの平均特異的成長速度を有し、バッチ５は約０．０７ｌ／ｈの平均特異的成長速度を有した。両バッチは高濃度のカリウムおよびマグネシウム塩で、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図６】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関する生産段階での高濃度のチアミンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ１は７ｇ／Ｌのチアミンを生産培地で有し、バッチ６は生産培地にチアミンを少しも用いず行った。両バッチは、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、体積収量（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｙｉｅｌｄｓ）が改善された水準での、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の産生のための、発酵方法の改善に関する。それはまた、さらにはＧ−ＣＳＦの高体積収量につながる、プラスミドの安定性の改良に関する培養条件を開示する。本発明の方法は、生産培地での高濃度の、ナトリウム、マグネシウムなどの他の無機塩と組み合わせて、高濃度のカリウムの存在下で実行される、複数回誘導（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓ）を介しての、非循環フェドバッチ培養方法に関与する。驚くべきことに、これ以降詳細に記述される、本発明での塩を用いるこのような方法を、特異的な高成長速度と組み合わせて用いた場合には、プラスミドの高安定性がそれでもなお維持され、さらなる体積収量の増加へとつながる。
【００１１】
本発明は、以下にさらに詳細に記述される。
【００１２】
任意の顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」ともまた呼ばれる）ポリペプチドを利用してよい。用語「顆粒球コロニー刺激因子」または「Ｇ−ＣＳＦ」は、天然のＧ−ＣＳＦ、突然変異タンパク質、断片、融合タンパク質、アナログおよびそれらの派生物であって、天然のｈＧ−ＣＳＦのレセプター結合活性の少なくとも６０％を生物学的に示すか、あるいはアミノ酸同一性で少なくとも約８０％を保持しているものを意味する。このようなＧ−ＣＳＦ配列の例には、Ｇｅｎｂａｎｋ配列番号ＧＩ：２７４３７０４８が含まれ、それらは、米国特許第４８１０６４３号に記載される。
【００１３】
大腸菌細胞は、当該技術分野に著名な形質転換技術を用いて、他のベクター成分とともに、Ｇ−ＣＳＦならびにｔ７、ｔａｃおよび類似のプロモーターから選択される適切なプロモーターのコード配列を含む、適切な発現ベクターで形質転換される。
【００１４】
以下で記載される方法において、発酵とは、Ｇ−ＣＳＦの産生のための、微生物、好ましくは組換え大腸菌の好気生育を意味する。このような方法では、成長のバッチ段階（ｂａｔｃｈ ｐｈａｓｅ）とは、播種後の、（もし必要があれば）発酵槽の培養ブロスに水酸化アンモニウムを加えるのを除いては、栄養物のない期間を指す。培養ブロスは、細胞、培地ならびに（もしあれば）培地と細胞の派生物の懸濁液である。成長段階での基質制限フェドバッチ培養とは、主な炭素／エネルギー源（例えばグルコース）の濃度が制限されているような方法で、フェドバッチ培養基を培養ブロスに加えることによって、バイオマスの主要な増加（少なくとも２倍に）が生じる成長段階でのそれを意味する。前記培地の流量が、培養物の特異的な成長速度を決定する。前誘導培地とは、誘導体（例えばＩＰＴＧ）を加える前に、培養ブロスに加えられる培養基とは異なる組成物を有する培地を指す。誘導とは、誘導体（例えばＩＰＴＧおよびラクトース）の添加によって、先行技術によって知られているツールによって決定されるように、細胞中のＧ−ＣＳＦの濃度を感知できるほどに増加させる方法である。生産培地は、培養基（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ）とは異なる組成物を有し、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の誘導の間、発酵槽中の培養ブロスに添加される。生産培地は、基質（例えばグルコース）の濃度を制限するような方法でも、加えられた。生産培地の流量は、生産段階の間の培養物の特異的な成長速度を決定する。
【００１５】
Ｇ−ＣＳＦをコードする適切な発現ベクターで事前に形質転換された、宿主である大腸菌は、最初にシェーカーフラスコ内で３７℃で培養して、発酵槽のための種を成長させた。この種培養物を、発酵槽中の無菌の培養基を播種するために用いた。組換え大腸菌培養物が成長をし始め、培養ブロス中のグルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ以下にいったん落ちると、発酵の成長段階での基質制限フェドバッチ培養モードが開始される。基質制限フェドバッチ培養の態様で、フェドバッチ培養用培養基の供給が、成長段階の間、（指数的にまたは定速で）連続して、あるいは不連続で続けられた。培養ブロス中の、乾燥細胞重量で１〜６０ｇ／Ｌの細胞密度およびグルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ未満に到達した後、前生産培地を添加し、続いて生産培地の供給を開始して、連続または不連続の基質制限態様で続けた。Ｇ−ＣＳＦの複数回誘導を、ＩＰＴＧで行った。誘導体の添加の間もしくは後、平均的な特異的成長速度は減少しない。ｐＨを約５〜７に維持する。温度を約３０〜４２℃に維持する。前生産培地を添加して２から４８ｈ後に、培地を取り除いて、記載される技術に従い、ダウンストリーム処理（ｄｏｗｎ ｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を行った。
【００１６】
成長段階の培地は、グルコース、グリセロール、などまたはそれらの混合物を含む群から選択される炭素およびエネルギー源、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、大豆（ｓｏｙａｂｅａｎ）カゼイン加水分解物など、またはそれらの混合物を含む群から選択される複合培地成分、クエン酸、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、酪酸ナトリウム、チアミン、グリシン、および塩化亜鉛を含む群から選択される、適切な塩／栄養物を含む。
【００１７】
エアレーション、撹拌、播種、播種の時間などのような、他の発酵条件は、便宜上すべて取り入れるものは、先行技術で周知である。
【００１８】
前生産培地は、例えばチアミン、グリシンなどまたはそれらの混合物のような栄養物、カナマイシン、およびアンピシリンなどのような抗生物質とともに、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、大豆カゼイン加水分解物から選択される、複合培地成分を含む。適切な塩は、培地が高濃度水準のＫイオンをＮａもしくはＭｇイオンのいずれかとともに含む、クエン酸、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、酪酸ナトリウム、および塩化亜鉛を含む群から選択される。
【００１９】
生産培地は、前生産培地の構成成分に加えて、炭素源を含む。適切な炭素源は、グリセロール、グルコース、フルクトースなどまたはそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明の好ましい炭素源はグルコースである。生産段階の間、培養ブロスは、ＮａもしくはＭｇイオンのいずれかとともに高濃度水準のＫイオンで維持される。培養ブロス中で、Ｋイオンの濃度は約６０ｍＭから約３００ｍＭ、Ｎａイオンの濃度は約６０ｍＭから約３００ｍＭ、Ｍｇイオンの濃度は約１５０ｍＭから約２５０ｍＭで維持される。好ましい実施態様では、培養ブロス中、Ｋイオンの濃度は９０ｍＭから１５０ｍＭ、Ｎａイオンの濃度は６０ｍＭから１２０ｍＭ、およびＭｇイオンの濃度は１８０ｍＭから２２０ｍＭの範囲である。
【００２０】
さらなる実施態様では、高濃度（５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲で）のチアミンの添加により、５〜６ｇ／Ｌの範囲のＧ−ＣＳＦの収量が提供される。
【００２１】
本発明の方法により、成長段階および生産段階（７５〜９０％）を通して、プラスミドの高安定性の維持を伴う、Ｇ−ＣＳＦの高収量（５〜９．５ｇ／Ｌ）での産生がもたらされる。
【００２２】
ある態様において、本発明は以下の通りである：
【００２３】
［態様１］
ＮａまたはＭｇから選択される高濃度の無機陽イオンとともに、６０ｍＭから１８０ｍＭの濃度範囲でＫイオンを含む培養ブロスでの発酵での、高体積収量の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を得るための改良方法。
【００２４】
［態様２］
前記Ｎａイオンの濃度が９０ｍＭから３００ｍＭの範囲であり、Ｍｇイオンの濃度が１５０ｍＭから２５０ｍＭの範囲である、態様１に記載の方法。
【００２５】
［態様３］
前記培養ブロスが、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、および大豆カゼイン加水分解物からなる群から選択される複合培地成分を含む、態様１または２に記載の方法。
【００２６】
［態様４］
基質制限フェドバッチ培養方法である、態様１から３のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
［態様５］
生産段階の間に、遺伝子の複数回誘導を行う、態様１から４のいずれか一項に記載の方法。
【００２８】
［態様６］
前記培養ブロスがさらに、グルコース、グリセロール、およびフルクトースから選択される炭素源を含む、態様１から５のいずれか一項に記載の方法。
【００２９】
［態様７］
生産段階と前生産段階の間に、平均的な特異的成長速度が同一であるように維持される、態様１から６のいずれか一項に記載の方法。
【００３０】
［態様８］
Ｋイオンの濃度が９０ｍＭから１５０ｍＭであり、Ｎａイオンの濃度が６０ｍＭから１２０ｍＭであり、Ｍｇイオンの濃度が１８０ｍＭから２２０ｍＭの濃度である、態様１から７のいずれか一項に記載の方法。
【００３１】
［態様９］
プラスミドの安定性が少なくとも７５％である、態様１から８のいずれか一項に記載の方法。
【００３２】
［態様１０］
培養ブロスへの６０ｍＭから１８０ｍＭの範囲でＫイオンの添加によってＧ−ＣＳＦのプラスミド安定性を改善させる方法。
【００３３】
［態様１１］
生産段階の抗生物質の濃度が、成長段階で用いられる濃度よりも低い、態様１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【００３４】
［態様１２］
ｉ） Ｇ−ＣＳＦをコードする適切な発現ベクターであらかじめ形質転換された適切な大腸菌の培養物を発酵槽に播種する工程と、
ｉｉ） バイオマスを増加させるための、成長段階のバッチ培養およびフェドバッチ培養のモードの工程と、
ｉｉｉ） 適切な前誘導培地の添加の工程と、
ｉｖ） 前記遺伝子の複数回誘導を行う前記基質制限フェドバッチ培養モードでの適切な生産培地の添加の工程を含み、
ｖ） 前記培養ブロス中のＫ、ＮａおよびＭｇイオンの最終濃度が、態様１から１１の一項もしくは複数項に規定された濃度である、
Ｇ−ＣＳＦの生産方法。
【００３５】
［態様１３］
前記Ｇ−ＣＳＦの体積収量が５ｇ／Ｌから９．５ｇ／Ｌの範囲である、態様１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【００３６】
［態様１４］
培養ブロスが、５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲でチアミンを含む、発酵での高体積収量のＧ−ＣＳＦを得るための改良方法。
【００３７】
以下に、本発明の例示として実施例を開示する。
【実施例１】
【００３８】
プラスミドの安定性および体積収量に関するＮａおよびＫイオンの高濃度の効果
【００３９】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００４０】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
（Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
【００４１】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００４２】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００４３】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ
【００４４】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、６．８〜７．０の範囲にｐＨを維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。バッチ２で（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。
【００４５】
組成物 濃度
酵母抽出物 ８４．３８ｇ／Ｌ
塩化カリウム ７５．４１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム １２３．１３ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ８．４４ｇ／Ｌ
【００４６】
培養ブロス中のカリウムおよびナトリウム陽イオンの最終濃度は、それぞれ約１２０ｍＭおよび２５０ｍＭであった。
【００４７】
以下の生産培地の供給を、続いて開始した。
【００４８】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ
塩化カリウム ８．９４ｇ／Ｌ（バッチ２でのみ）
塩化ナトリウム １７．５ｇ／Ｌ（バッチ２でのみ）
【００４９】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。バッチ２の生産段階の間に用いられたカナマイシンの量（一度のみ３７．５ｍｇが添加された）は、バッチ１で用いられた量（複数回添加、２９２５ｍｇ）の約１％であったので、プラスミドの安定性に関する塩の効果について試すこととなった。
【００５０】
プラスミドの安定性は、はじめに無菌的に最後のバッチのサンプルを無菌チューブに回収してから、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）有りもしくはなしのＬＢ培地上に、適切に希釈したサンプルを適量、無菌的に塗ることによって決定した。プレートを３７℃で４８時間インキュベーションしてから、統計的に有意性のあるコロニーを、これらのプレートでカウントした。カナマイシンを含むプレートで得られるコロニー数を、カナマイシンを含まないプレートで得られるコロニー数で割ることによって得られる値を、プラスミドの安定性を計算するために用いた。バッチ２のプラスミド安定性（９６．８％）は、バッチ１のプラスミド安定性（４５．０％）と比較して2倍以上であったので、プラスミド安定性を改善するのにナトリウムおよびカリウムイオンの重要性が示された（図１）。
【００５１】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、信憑性のあるスタンダードを用いた標準プロットに対してのＧＣＳＦバンドの比重の（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ）定量化によって決定し、バッチ１で５．３８ｇ／Ｌおよびバッチ２で５．８１ｇ／Ｌであった。バッチ２の体積収量は、バッチ１のそれより約８％高かった（図２）。
【００５２】
［実施例２］
プラスミドの安定性および体積収量に関するマグネシウムおよびカリウム陽イオンの高濃度の効果
【００５３】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。両バッチ（バッチ３およびバッチ４）の生産段階培地は、マグネシウム陽イオンの濃度のみを除いて、カリウム陽イオンの濃度をも含む、同一であり、その結果は、カリウムおよびマグネシウム陽イオンの組み合わせの効果を反映した。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００５４】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
【００５５】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００５６】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００５７】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ
【００５８】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、６．８〜７．０の範囲にｐＨを維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。
【００５９】
組成物 濃度
酵母抽出物 ８４．３８ｇ／Ｌ
塩化カリウム ７５．４４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ８．３８ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム １８７．０６ｇ／Ｌ（バッチ４でのみ）
【００６０】
以下の生産培地の供給を、続いて開始した。
【００６１】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム １ｇ／Ｌ（バッチ３でのみ）
硫酸マグネシウム ５０．３ｇ／Ｌ（バッチ４でのみ）
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ
塩化カリウム ８．９４ｇ／Ｌ
【００６２】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。生産段階の間、等量のカナマイシン（一度のみ３７．５ｍｇが添加された）を用いた。培養ブロス中のカリウムおよびマグネシウム陽イオンの濃度は、生産段階の間、それぞれ約１２０ｍＭおよび２００ｍＭであった。
【００６３】
プラスミドの安定性は、前に記載したように決定した。バッチ４のプラスミド安定性（９７．３％）は、バッチ３のプラスミド安定性（９１．８％）と比較して約６％高かったので、プラスミド安定性を改善するのにマグネシウムおよびカリウムイオンの有効性が示された（図３）。マグネシウムおよびカリウム陽イオンの存在下で得られるプラスミド安定性は、バッチ１（生産段階での高濃度の塩がない）でのそれより１１６．２％高かった。
【００６４】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、信憑性のあるスタンダードを用いた標準プロットに対してのＧＣＳＦバンドの比重の定量化によって決定し、バッチ３で５．４８ｇ／Ｌおよびバッチ４で８．３５ｇ／Ｌであった（図４）。バッチ４の体積収量は、バッチ１のそれより約５５％高かった。
【００６５】
［実施例３］
体積収量に関しての生産段階の間の高特異的な成長速度の効果
【００６６】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。両バッチ（バッチ４およびバッチ５）の生産段階の培地組成物は、マグネシウムおよびカリウム陽イオンの濃度を含めて同一であった。バッチ５の生産段階の間の平均的な特異的成長速度は、バッチ４の生産段階のそれより高かった。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００６７】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
【００６８】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００６９】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００７０】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ
【００７１】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、６．８〜７．０の範囲にｐＨを維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。
【００７２】
組成物 濃度
酵母抽出物 ８４．３８ｇ／Ｌ
塩化カリウム ７５．４４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ８．３８ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム １８７．０６ｇ／Ｌ
【００７３】
以下の生産培地の供給を、続いて開始した。
【００７４】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム ５０．３ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ
塩化カリウム ８．９４ｇ／Ｌ
【００７５】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。生産段階の間、等量のカナマイシン（一度のみ３７．５ｍｇが添加された）を用いた。バッチ４の生産段階の間の平均的な特異的成長速度は約０．０４ｌ／ｈであり、バッチ５のそれは約０．０７ｌ／ｈであった。
【００７６】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、すでに述べたようにして、バッチ４で８．３５ｇ／Ｌであり、バッチ５で９．９４ｇ／Ｌであると決定された。バッチ５の体積収量はバッチ４のそれより約１９％高かった（図５）。両バッチの最後のバッチのサンプルでのプラスミド安定性は高かった（＞７５％）。
【００７７】
［実施例４］
体積収量に関しての生産段階での高濃度のチアミンを用いる効果
【００７８】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００７９】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ（バッチ１において）
アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ（バッチ６において）
【００８０】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００８１】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００８２】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ（バッチ１において）
アンピシリン バッチ６においてのみ培養ブロスに各添加５０ｍｇ／
Ｌで。バッチの「フェドバッチ培養成長」段階の間に、
全部で６回の添加がなされた。
【００８３】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ約６．８を維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の生産培地の供給を開始した。
【００８４】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ（バッチ１においてのみ）
カナマイシン ２．９２５ｇ（バッチ１で複数回添加された）
アンピシリン ２．６８９ｇ（バッチ６で複数回添加された）
【００８５】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。
【００８６】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、すでに述べたようにして決定された。バッチ１（高チアミンバッチ）の最後のバッチのサンプルでの体積収量は、バッチ６（４．８６ｇ／Ｌ）のそれよりも約１０．７％高かったので、Ｇ−ＣＳＦの体積収量を改善させるのに、高濃度のチアミンの効果が示された（図６）。
【００８７】
方法の利点
（１）高体積収量により、スモールスケールでの収量がより多くなるので、スケールアップに関する資本支出を制限するのが可能になる。
（２）高体積収量は、非常に低いコストの培地成分（マグネシウム、カリウムおよびマグネシウム塩）を用いて達成される。
（３）高プラスミド安定性を有する培養により、例えば高特異的な成長速度の条件でのＧ−ＣＳＦ遺伝子の発現のような、代謝性ストレスの高い条件でのＧ−ＣＳＦの体積収量を産生することがより可能になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生産段階の間の、高塩誘発によるプラスミド安定性の増加を介した、Ｇ−ＣＳＦの高収率での改良された生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の治療により、重篤な慢性好中球減少症を有する患者の生活の質が著しく改善する（非特許文献１）。Ｇ−ＣＳＦは、骨髄の貯蔵庫からの好中球の放出および抗菌作用の増強活性化のための、潜在的な内因性要因である。Ｇ−ＣＳＦは、さまざまな急性疾患の前臨床モデルにおいて幅広く評価されており、おおむね良好な結果を得ている（非特許文献２）。化学療法サイクル間の証明された有効性のために、Ｇ−ＣＳＦは腫瘍学において用いられる、重要な生物医薬品である。Ｇ−ＣＳＦはさまざまな種類の細胞でクローン化され、発現しており、例えば微生物細胞（非特許文献３および４）、酵母細胞（非特許文献５および特許文献１）、イネ細胞（非特許文献６）、ネコ細胞（非特許文献７）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（非特許文献８）、昆虫細胞（非特許文献９）、およびさらにはトランスジェニックヤギ（非特許文献１０）がある。医薬的な使用のために、Ｇ−ＣＳＦは初めに大腸菌で、封入体として産生され（非特許文献１１）、封入体は本来ではないコンフォメーションでの、不溶性の組換えタンパク質の会合体であり（非特許文献１２）、一般的に生物学的活性を有しない（非特許文献１３）。Ｇ−ＣＳＦの分泌産生技術についても報告されている（非特許文献１４および１５）。分泌発現は通常、適切に折り畳まれたＧ−ＣＳＦを、ペリプラズム空間または細胞外培地内に放出させるが、その収量は、封入体で得られる場合に比べて遥かに少ない。したがって、封入体として大腸菌でＧ−ＣＳＦを発現させるのは、工業用の利点がある。適切に折り畳まれた、生物学的に活性のあるＧ−ＣＳＦタンパク質は、封入体の単離および可溶化の後で、変性および再生を適用させることによって、工業的に実行可能な態様で封入体から容易に得られる（非特許文献１６および１７）。
【０００３】
大腸菌における組換えタンパク質産生のもっとも効率的な方法の一つは、フェドバッチ培養であり、循環（ｃｙｃｌｉｃ）モードおよび非循環モードで実行され得る。非循環方法は、より複雑ではないので、工業生産により適している。事実、先行技術には、非循環フェドバッチ培養方法からの最もＧＣＳＦの収率が高いものの一つが記載されており、それは４．２〜４．４ｇ／Ｌの範囲である（非特許文献１８）。より高い累積収率を得るための循環モードでのフェドバッチ培養による発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を行うと、プラスミドの不安定性が高くなり（非特許文献１９）、それゆえに、この方法のロバスト性が制限される。
【０００４】
一般的に、高発現の産物を有するために、この産物の遺伝子を含有する染色体外プラスミドを、適切な形態で細胞中に保持し続けることが不可欠である。これは、通常、培養ブロスに適切な抗生物質を加えることによって、組換え微生物への選択圧を維持することにより達成される。組換え株の「分離不安定性」を減少させるための発酵の間、１〜２ｈごとに抗生物質（アンピシリン）を加えることによって、Ｇ−ＣＳＦの発現レベルが上昇することが報告されている（特許文献２）。最終産物からの抗生物質のクリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の証拠を調節的に要求することが、使用の制限を必然的に伴わせる。高用量の抗生物質もまた、望ましくない環境への影響を潜在的に高く有する可能性がある。しかし、抗生物質の選択圧の減少は、しばしば、方法のロバスト性を危うくする、プラスミドの安定性および発現レベルの減少という結果になる。したがって、特に生産段階の間に、プラスミドの安定性および産物の発現レベルを増加させる一方で、抗生物質の使用を制限しようという技術的な挑戦がある。さらに、生産段階の間のプラスミドの低安定性は、代謝性ストレスに起因する可能性もあり（非特許文献２０）、特に高培養液量において、低発現レベルへとつながる可能性がある（非特許文献２１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】Lee S.M. et al. Korean patent KR 160934 B1 19981116
【特許文献２】Krivopalova G.N. et al. Russian Patent RU 2158303 C2 20001027
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jones et al. JAMA 270: 1132-1133 (1993)
【非特許文献２】Marshall J.C. Shock 24: 120-9 (2005)
【非特許文献３】Souza L.M. Science 232: 61-65 (1986)
【非特許文献４】Hu Z.Y. et al. Zhongguo Shenghua Yaowu Zazhi (1999), 20: 55-57
【非特許文献５】Lasnik M.A. et al. Biotechnol. Bioeng. 81: 768-774 (2003)
【非特許文献６】Hong et al. Protein Expr Purif. Epub ahead of print (2005)
【非特許文献７】Yamamoto et al. Gene 274: 263-269 (2001)
【非特許文献８】Monaco L. et al. Gene. 180:145-150 (1996)
【非特許文献９】Shinkai et al. Protein Expr Purif. 10: 379-385 (1997)
【非特許文献１０】Ko J.H. et al. Transgenic Res. 9: 215-22 (2000)
【非特許文献１１】Jevsevar S. et al. Biotechnol. Prog. 21: 632-639 (2005)
【非特許文献１２】Baneyx F. & Mujacic M. Nature Biotechnol. 22: 1399-1408 (2004)
【非特許文献１３】Bernardez C.E. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-163 (1998)
【非特許文献１４】Jeong K.J. & Lee S.Y. Protein Expr Purif. 23: 311-318 (2001)
【非特許文献１５】Lee S.Y. et al. Methods Mol. Biol. 308: 31-42 (2005)
【非特許文献１６】Rudolph R, In Protein Engineering: Principles and Practice; Cleland, J. L., Craik, S. C., Eds.; Wiley-Liss, Inc.: New York, 1996; pp 283-298
【非特許文献１７】Rathore A.S. et al. J Pharm Biomed Anal. 32:1199-1211 (2003)
【非特許文献１８】Yim SC et al. Bioprocess and Biosystems Engineering (2001), 24, 249-254
【非特許文献１９】Choi S.-J. et al. J. Microbiol. Biotechnol. 10: 321-326 (2000)
【非特許文献２０】Saraswat V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 179: 367-373 (1999)
【非特許文献２１】Cheng C. et al Biotechnol. Bioeng. 56: 23-31 (1997)
【非特許文献２２】Schweder T. et al. Appl Microbiol Biotechnol. 38:91-93 (1992)
【非特許文献２３】Pan S.H. and Malcom B.A. Biotechniques. 29:1234-1238 (2000)
【非特許文献２４】Smith & Bidochka Can. J. Microbiol. 44: 351- 355 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗生物質による高選択圧を維持するのに加えて、プラスミド安定性は、ベクター構築の段階で改善され得る（非特許文献２２および２３）。方法において、プラスミド安定性は、栄養飢餓を避けるなどの、培養条件を調節することによって改善され得る（非特許文献２４）。大規模な基質制限フェドバッチ培養方法を実行する間、栄養制限／栄養飢餓は差し迫った問題であり、あまりに頻繁に、または大量に抗生物質を加えることは、複雑さが低い方法での、高収量の産物およびプラスミドの高安定性を維持するためには非現実的であり高価な溶液である。したがって、単純でロバストな方法を用いて、プラスミドの高安定性を維持することによって、Ｇ−ＣＳＦを高体積収量で調整する代替方法を開発する、明らかな必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、生産培地および培養ブロスにおいて、高濃度の、マグネシウムイオンもしくはナトリウムイオンと組み合わせたカリウムイオンを用いて、培養物でのプラスミドの高安定性を維持することによって、大腸菌において高体積収量で顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を生産するための、非循環フェドバッチ培養方法について記述する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バッチの収穫時の、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞でのＧ−ＣＳＦ遺伝子を含有しているプラスミドの安定性に関しての、生産段階での高濃度のカリウムおよびナトリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ２は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩で実行し、バッチ１は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩なしで実行した。これらのバッチは３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図２】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関する生産段階での高濃度のカリウムおよびナトリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ２は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩で実行し、バッチ１は高濃度のカリウムおよびナトリウム塩なしで実行した。これらのバッチは３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図３】バッチの収穫時の、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞でのＧ−ＣＳＦ遺伝子を含有しているプラスミドの安定性に関しての、生産段階での高濃度のマグネシウムおよびカリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ４は高濃度のマグネシウム塩で実行し、バッチ３は高濃度のマグネシウム塩は用いなかった。両バッチは高濃度のカリウム塩で、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図４】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関する高濃度のマグネシウムおよびカリウム陽イオンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ４は高濃度のマグネシウム塩で実行し、バッチ３は高濃度のマグネシウム塩は用いなかった。両バッチは高濃度のカリウム塩で、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図５】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関しての生産段階での高特異的な成長速度の使用効果を示す図である。生産段階の間、バッチ４は約０．０４ｌ／ｈの平均特異的成長速度を有し、バッチ５は約０．０７ｌ／ｈの平均特異的成長速度を有した。両バッチは高濃度のカリウムおよびマグネシウム塩で、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【図６】収穫バッチでのＧ−ＣＳＦの体積収量に関する生産段階での高濃度のチアミンの使用効果を示す図である。生産段階において、バッチ１は７ｇ／Ｌのチアミンを生産培地で有し、バッチ６は生産培地にチアミンを少しも用いず行った。両バッチは、３０Ｌの発酵槽で別々に実行された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、体積収量（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｙｉｅｌｄｓ）が改善された水準での、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の産生のための、発酵方法の改善に関する。それはまた、さらにはＧ−ＣＳＦの高体積収量につながる、プラスミドの安定性の改良に関する培養条件を開示する。本発明の方法は、生産培地での高濃度の、ナトリウム、マグネシウムなどの他の無機塩と組み合わせて、高濃度のカリウムの存在下で実行される、複数回誘導（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓ）を介しての、非循環フェドバッチ培養方法に関与する。驚くべきことに、これ以降詳細に記述される、本発明での塩を用いるこのような方法を、特異的な高成長速度と組み合わせて用いた場合には、プラスミドの高安定性がそれでもなお維持され、さらなる体積収量の増加へとつながる。
【００１１】
本発明は、以下にさらに詳細に記述される。
【００１２】
任意の顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」ともまた呼ばれる）ポリペプチドを利用してよい。用語「顆粒球コロニー刺激因子」または「Ｇ−ＣＳＦ」は、天然のＧ−ＣＳＦ、突然変異タンパク質、断片、融合タンパク質、アナログおよびそれらの派生物であって、天然のｈＧ−ＣＳＦのレセプター結合活性の少なくとも６０％を生物学的に示すか、あるいはアミノ酸同一性で少なくとも約８０％を保持しているものを意味する。このようなＧ−ＣＳＦ配列の例には、Ｇｅｎｂａｎｋ配列番号ＧＩ：２７４３７０４８が含まれ、それらは、米国特許第４８１０６４３号に記載される。
【００１３】
大腸菌細胞は、当該技術分野に著名な形質転換技術を用いて、他のベクター成分とともに、Ｇ−ＣＳＦならびにｔ７、ｔａｃおよび類似のプロモーターから選択される適切なプロモーターのコード配列を含む、適切な発現ベクターで形質転換される。
【００１４】
以下で記載される方法において、発酵とは、Ｇ−ＣＳＦの産生のための、微生物、好ましくは組換え大腸菌の好気生育を意味する。このような方法では、成長のバッチ段階（ｂａｔｃｈ ｐｈａｓｅ）とは、播種後の、（もし必要があれば）発酵槽の培養ブロスに水酸化アンモニウムを加えるのを除いては、栄養物のない期間を指す。培養ブロスは、細胞、培地ならびに（もしあれば）培地と細胞の派生物の懸濁液である。成長段階での基質制限フェドバッチ培養とは、主な炭素／エネルギー源（例えばグルコース）の濃度が制限されているような方法で、フェドバッチ培養基を培養ブロスに加えることによって、バイオマスの主要な増加（少なくとも２倍に）が生じる成長段階でのそれを意味する。前記培地の流量が、培養物の特異的な成長速度を決定する。前誘導培地とは、誘導体（例えばＩＰＴＧ）を加える前に、培養ブロスに加えられる培養基とは異なる組成物を有する培地を指す。誘導とは、誘導体（例えばＩＰＴＧおよびラクトース）の添加によって、先行技術によって知られているツールによって決定されるように、細胞中のＧ−ＣＳＦの濃度を感知できるほどに増加させる方法である。生産培地は、培養基（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ）とは異なる組成物を有し、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の誘導の間、発酵槽中の培養ブロスに添加される。生産培地は、基質（例えばグルコース）の濃度を制限するような方法でも、加えられた。生産培地の流量は、生産段階の間の培養物の特異的な成長速度を決定する。
【００１５】
Ｇ−ＣＳＦをコードする適切な発現ベクターで事前に形質転換された、宿主である大腸菌は、最初にシェーカーフラスコ内で３７℃で培養して、発酵槽のための種を成長させた。この種培養物を、発酵槽中の無菌の培養基を播種するために用いた。組換え大腸菌培養物が成長をし始め、培養ブロス中のグルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ以下にいったん落ちると、発酵の成長段階での基質制限フェドバッチ培養モードが開始される。基質制限フェドバッチ培養の態様で、フェドバッチ培養用培養基の供給が、成長段階の間、（指数的にまたは定速で）連続して、あるいは不連続で続けられた。培養ブロス中の、乾燥細胞重量で１〜６０ｇ／Ｌの細胞密度およびグルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ未満に到達した後、前生産培地を添加し、続いて生産培地の供給を開始して、連続または不連続の基質制限態様で続けた。Ｇ−ＣＳＦの複数回誘導を、ＩＰＴＧで行った。誘導体の添加の間もしくは後、平均的な特異的成長速度は減少しない。ｐＨを約５〜７に維持する。温度を約３０〜４２℃に維持する。前生産培地を添加して２から４８ｈ後に、培地を取り除いて、記載される技術に従い、ダウンストリーム処理（ｄｏｗｎ ｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を行った。
【００１６】
成長段階の培地は、グルコース、グリセロール、などまたはそれらの混合物を含む群から選択される炭素およびエネルギー源、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、大豆（ｓｏｙａｂｅａｎ）カゼイン加水分解物など、またはそれらの混合物を含む群から選択される複合培地成分、クエン酸、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、酪酸ナトリウム、チアミン、グリシン、および塩化亜鉛を含む群から選択される、適切な塩／栄養物を含む。
【００１７】
エアレーション、撹拌、播種、播種の時間などのような、他の発酵条件は、便宜上すべて取り入れるものは、先行技術で周知である。
【００１８】
前生産培地は、例えばチアミン、グリシンなどまたはそれらの混合物のような栄養物、カナマイシン、およびアンピシリンなどのような抗生物質とともに、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、大豆カゼイン加水分解物から選択される、複合培地成分を含む。適切な塩は、培地が高濃度水準のＫイオンをＮａもしくはＭｇイオンのいずれかとともに含む、クエン酸、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、酪酸ナトリウム、および塩化亜鉛を含む群から選択される。
【００１９】
生産培地は、前生産培地の構成成分に加えて、炭素源を含む。適切な炭素源は、グリセロール、グルコース、フルクトースなどまたはそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明の好ましい炭素源はグルコースである。生産段階の間、培養ブロスは、ＮａもしくはＭｇイオンのいずれかとともに高濃度水準のＫイオンで維持される。培養ブロス中で、Ｋイオンの濃度は約６０ｍＭから約３００ｍＭ、Ｎａイオンの濃度は約６０ｍＭから約３００ｍＭ、Ｍｇイオンの濃度は約１５０ｍＭから約２５０ｍＭで維持される。好ましい実施態様では、培養ブロス中、Ｋイオンの濃度は９０ｍＭから１５０ｍＭ、Ｎａイオンの濃度は６０ｍＭから１２０ｍＭ、およびＭｇイオンの濃度は１８０ｍＭから２２０ｍＭの範囲である。
【００２０】
さらなる実施態様では、高濃度（５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲で）のチアミンの添加により、５〜６ｇ／Ｌの範囲のＧ−ＣＳＦの収量が提供される。
【００２１】
本発明の方法により、成長段階および生産段階（７５〜９０％）を通して、プラスミドの高安定性の維持を伴う、Ｇ−ＣＳＦの高収量（５〜９．５ｇ／Ｌ）での産生がもたらされる。
【００２２】
ある態様において、本発明は以下の通りである：
【００２３】
［態様１］
ＮａまたはＭｇから選択される高濃度の無機陽イオンとともに、６０ｍＭから１８０ｍＭの濃度範囲でＫイオンを含む培養ブロスでの発酵での、高体積収量の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を得るための改良方法。
【００２４】
［態様２］
前記Ｎａイオンの濃度が９０ｍＭから３００ｍＭの範囲であり、Ｍｇイオンの濃度が１５０ｍＭから２５０ｍＭの範囲である、態様１に記載の方法。
【００２５】
［態様３］
前記培養ブロスが、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、および大豆カゼイン加水分解物からなる群から選択される複合培地成分を含む、態様１または２に記載の方法。
【００２６】
［態様４］
基質制限フェドバッチ培養方法である、態様１から３のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
［態様５］
生産段階の間に、遺伝子の複数回誘導を行う、態様１から４のいずれか一項に記載の方法。
【００２８】
［態様６］
前記培養ブロスがさらに、グルコース、グリセロール、およびフルクトースから選択される炭素源を含む、態様１から５のいずれか一項に記載の方法。
【００２９】
［態様７］
生産段階と前生産段階の間に、平均的な特異的成長速度が同一であるように維持される、態様１から６のいずれか一項に記載の方法。
【００３０】
［態様８］
Ｋイオンの濃度が９０ｍＭから１５０ｍＭであり、Ｎａイオンの濃度が６０ｍＭから１２０ｍＭであり、Ｍｇイオンの濃度が１８０ｍＭから２２０ｍＭの濃度である、態様１から７のいずれか一項に記載の方法。
【００３１】
［態様９］
プラスミドの安定性が少なくとも７５％である、態様１から８のいずれか一項に記載の方法。
【００３２】
［態様１０］
培養ブロスへの６０ｍＭから１８０ｍＭの範囲でＫイオンの添加によってＧ−ＣＳＦのプラスミド安定性を改善させる方法。
【００３３】
［態様１１］
生産段階の抗生物質の濃度が、成長段階で用いられる濃度よりも低い、態様１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【００３４】
［態様１２］
ｉ） Ｇ−ＣＳＦをコードする適切な発現ベクターであらかじめ形質転換された適切な大腸菌の培養物を発酵槽に播種する工程と、
ｉｉ） バイオマスを増加させるための、成長段階のバッチ培養およびフェドバッチ培養のモードの工程と、
ｉｉｉ） 適切な前誘導培地の添加の工程と、
ｉｖ） 前記遺伝子の複数回誘導を行う前記基質制限フェドバッチ培養モードでの適切な生産培地の添加の工程を含み、
ｖ） 前記培養ブロス中のＫ、ＮａおよびＭｇイオンの最終濃度が、態様１から１１の一項もしくは複数項に規定された濃度である、
Ｇ−ＣＳＦの生産方法。
【００３５】
［態様１３］
前記Ｇ−ＣＳＦの体積収量が５ｇ／Ｌから９．５ｇ／Ｌの範囲である、態様１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【００３６】
［態様１４］
培養ブロスが、５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲でチアミンを含む、発酵での高体積収量のＧ−ＣＳＦを得るための改良方法。
【００３７】
以下に、本発明の例示として実施例を開示する。
【実施例１】
【００３８】
プラスミドの安定性および体積収量に関するＮａおよびＫイオンの高濃度の効果
【００３９】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００４０】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
（Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
【００４１】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００４２】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００４３】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ
【００４４】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、６．８〜７．０の範囲にｐＨを維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。バッチ２で（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。
【００４５】
組成物 濃度
酵母抽出物 ８４．３８ｇ／Ｌ
塩化カリウム ７５．４１ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム １２３．１３ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ８．４４ｇ／Ｌ
【００４６】
培養ブロス中のカリウムおよびナトリウム陽イオンの最終濃度は、それぞれ約１２０ｍＭおよび２５０ｍＭであった。
【００４７】
以下の生産培地の供給を、続いて開始した。
【００４８】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ
塩化カリウム ８．９４ｇ／Ｌ（バッチ２でのみ）
塩化ナトリウム １７．５ｇ／Ｌ（バッチ２でのみ）
【００４９】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。バッチ２の生産段階の間に用いられたカナマイシンの量（一度のみ３７．５ｍｇが添加された）は、バッチ１で用いられた量（複数回添加、２９２５ｍｇ）の約１％であったので、プラスミドの安定性に関する塩の効果について試すこととなった。
【００５０】
プラスミドの安定性は、はじめに無菌的に最後のバッチのサンプルを無菌チューブに回収してから、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）有りもしくはなしのＬＢ培地上に、適切に希釈したサンプルを適量、無菌的に塗ることによって決定した。プレートを３７℃で４８時間インキュベーションしてから、統計的に有意性のあるコロニーを、これらのプレートでカウントした。カナマイシンを含むプレートで得られるコロニー数を、カナマイシンを含まないプレートで得られるコロニー数で割ることによって得られる値を、プラスミドの安定性を計算するために用いた。バッチ２のプラスミド安定性（９６．８％）は、バッチ１のプラスミド安定性（４５．０％）と比較して2倍以上であったので、プラスミド安定性を改善するのにナトリウムおよびカリウムイオンの重要性が示された（図１）。
【００５１】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、信憑性のあるスタンダードを用いた標準プロットに対してのＧＣＳＦバンドの比重の（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ）定量化によって決定し、バッチ１で５．３８ｇ／Ｌおよびバッチ２で５．８１ｇ／Ｌであった。バッチ２の体積収量は、バッチ１のそれより約８％高かった（図２）。
【００５２】
［実施例２］
プラスミドの安定性および体積収量に関するマグネシウムおよびカリウム陽イオンの高濃度の効果
【００５３】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。両バッチ（バッチ３およびバッチ４）の生産段階培地は、マグネシウム陽イオンの濃度のみを除いて、カリウム陽イオンの濃度をも含む、同一であり、その結果は、カリウムおよびマグネシウム陽イオンの組み合わせの効果を反映した。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００５４】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
【００５５】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００５６】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００５７】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ
【００５８】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、６．８〜７．０の範囲にｐＨを維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。
【００５９】
組成物 濃度
酵母抽出物 ８４．３８ｇ／Ｌ
塩化カリウム ７５．４４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ８．３８ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム １８７．０６ｇ／Ｌ（バッチ４でのみ）
【００６０】
以下の生産培地の供給を、続いて開始した。
【００６１】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム １ｇ／Ｌ（バッチ３でのみ）
硫酸マグネシウム ５０．３ｇ／Ｌ（バッチ４でのみ）
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ
塩化カリウム ８．９４ｇ／Ｌ
【００６２】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。生産段階の間、等量のカナマイシン（一度のみ３７．５ｍｇが添加された）を用いた。培養ブロス中のカリウムおよびマグネシウム陽イオンの濃度は、生産段階の間、それぞれ約１２０ｍＭおよび２００ｍＭであった。
【００６３】
プラスミドの安定性は、前に記載したように決定した。バッチ４のプラスミド安定性（９７．３％）は、バッチ３のプラスミド安定性（９１．８％）と比較して約６％高かったので、プラスミド安定性を改善するのにマグネシウムおよびカリウムイオンの有効性が示された（図３）。マグネシウムおよびカリウム陽イオンの存在下で得られるプラスミド安定性は、バッチ１（生産段階での高濃度の塩がない）でのそれより１１６．２％高かった。
【００６４】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、信憑性のあるスタンダードを用いた標準プロットに対してのＧＣＳＦバンドの比重の定量化によって決定し、バッチ３で５．４８ｇ／Ｌおよびバッチ４で８．３５ｇ／Ｌであった（図４）。バッチ４の体積収量は、バッチ１のそれより約５５％高かった。
【００６５】
［実施例３］
体積収量に関しての生産段階の間の高特異的な成長速度の効果
【００６６】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。両バッチ（バッチ４およびバッチ５）の生産段階の培地組成物は、マグネシウムおよびカリウム陽イオンの濃度を含めて同一であった。バッチ５の生産段階の間の平均的な特異的成長速度は、バッチ４の生産段階のそれより高かった。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００６７】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ
【００６８】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００６９】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００７０】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ
【００７１】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、６．８〜７．０の範囲にｐＨを維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。
【００７２】
組成物 濃度
酵母抽出物 ８４．３８ｇ／Ｌ
塩化カリウム ７５．４４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ８．３８ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム １８７．０６ｇ／Ｌ
【００７３】
以下の生産培地の供給を、続いて開始した。
【００７４】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム ５０．３ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ
塩化カリウム ８．９４ｇ／Ｌ
【００７５】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。生産段階の間、等量のカナマイシン（一度のみ３７．５ｍｇが添加された）を用いた。バッチ４の生産段階の間の平均的な特異的成長速度は約０．０４ｌ／ｈであり、バッチ５のそれは約０．０７ｌ／ｈであった。
【００７６】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、すでに述べたようにして、バッチ４で８．３５ｇ／Ｌであり、バッチ５で９．９４ｇ／Ｌであると決定された。バッチ５の体積収量はバッチ４のそれより約１９％高かった（図５）。両バッチの最後のバッチのサンプルでのプラスミド安定性は高かった（＞７５％）。
【００７７】
［実施例４］
体積収量に関しての生産段階での高濃度のチアミンを用いる効果
【００７８】
この実験を３０Ｌの発酵槽で実行した。ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。
【００７９】
組成物 播種前の濃度
ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４．０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 １．０ｇ／Ｌ
グルコース １０．０ｇ／Ｌ
クエン酸 １．７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０．０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ（バッチ１において）
アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ（バッチ６において）
【００８０】
微量金属溶液：
組成物 濃度
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．１６２ｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０１４４ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０１２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００６ｇ／Ｌ
ＣｕＣｌ２ １．９ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｇ／Ｌ
【００８１】
基質制限フェドバッチ培養モードに、以下の「フェドバッチ培養用培養基」を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた：
【００８２】
組成物 濃度
グルコース ７００ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ
微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ
カナマイシン ５００ｍｇ／Ｌ（バッチ１において）
アンピシリン バッチ６においてのみ培養ブロスに各添加５０ｍｇ／
Ｌで。バッチの「フェドバッチ培養成長」段階の間に、
全部で６回の添加がなされた。
【００８３】
成長段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ約６．８を維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。（６００ｎｍで）約５０ＡＵの光学濃度に到達した後に、以下の生産培地の供給を開始した。
【００８４】
組成物 濃度
グルコース ２７０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ２１４ｇ／Ｌ
塩化水素チアミン ７ｇ／Ｌ（バッチ１においてのみ）
カナマイシン ２．９２５ｇ（バッチ１で複数回添加された）
アンピシリン ２．６８９ｇ（バッチ６で複数回添加された）
【００８５】
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、ｐＨ６．８に維持するためのｐＨ調節剤として用いた。温度を３７℃に維持した。
【００８６】
Ｇ−ＣＳＦの体積収量は、すでに述べたようにして決定された。バッチ１（高チアミンバッチ）の最後のバッチのサンプルでの体積収量は、バッチ６（４．８６ｇ／Ｌ）のそれよりも約１０．７％高かったので、Ｇ−ＣＳＦの体積収量を改善させるのに、高濃度のチアミンの効果が示された（図６）。
【００８７】
方法の利点
（１）高体積収量により、スモールスケールでの収量がより多くなるので、スケールアップに関する資本支出を制限するのが可能になる。
（２）高体積収量は、非常に低いコストの培地成分（マグネシウム、カリウムおよびマグネシウム塩）を用いて達成される。
（３）高プラスミド安定性を有する培養により、例えば高特異的な成長速度の条件でのＧ−ＣＳＦ遺伝子の発現のような、代謝性ストレスの高い条件でのＧ−ＣＳＦの体積収量を産生することがより可能になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養ブロスが、５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲でチアミンを含む、発酵での高体積収量のＧ−ＣＳＦを得るための改良方法。
【請求項１】
培養ブロスが、５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲でチアミンを含む、発酵での高体積収量のＧ−ＣＳＦを得るための改良方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−２２９５４１（Ｐ２０１１−２２９５４１Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７８３３２（Ｐ２０１１−１７８３３２）
【出願日】平成２３年８月１７日（２０１１．８．１７）
【分割の表示】特願２００８−５５７９０２（Ｐ２００８−５５７９０２）の分割
【原出願日】平成１９年３月５日（２００７．３．５）
【出願人】（５０７３６５９２７）カディラ・ヘルスケア・リミテッド (26)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１７日（２０１１．８．１７）
【分割の表示】特願２００８−５５７９０２（Ｐ２００８−５５７９０２）の分割
【原出願日】平成１９年３月５日（２００７．３．５）
【出願人】（５０７３６５９２７）カディラ・ヘルスケア・リミテッド (26)
【Ｆターム（参考）】
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