本発明はファージ提示型ポリペプチドの翻訳後修飾に関する。これらの提示型ポリペプチドは適切な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切な直交ｔＲＮＡ種を含むｉｎ ｖｉｖｏ直交翻訳系を使用することにより、ファージ提示型融合ポリペプチドの選択された位置に組込まれた少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン等のアリール−アジドアミノ酸又はパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン等のアルキニルアミノ酸）を含む。これらの非天然アミノ酸はアジド−アルキン［３＋２］シクロ付加反応やスタウディンガー修飾等の翻訳後修飾のターゲットに利用できるという利点がある。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを含むファージであって、前記ポリペプチドが少なくとも１個の翻訳後修飾アリール−アジド非天然アミノ酸残基を含み、前記翻訳後修飾アリール−アジド非天然アミノ酸残基がスタウディンガーライゲーション反応により生成される前記ファージ。
【請求項２】
前記ファージが生存可能である請求項１に記載のファージ。
【請求項３】
前記ファージが繊維状ファージである請求項１に記載のファージ。
【請求項４】
前記ファージがＭ１３に由来するファージである請求項１に記載のファージ。
【請求項５】
前記ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項１に記載のファージ。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドが部位特異的プロテアーゼにより特異的に開裂可能なペプチドリンカープロテアーゼ認識配列を含む請求項５に記載のファージ。
【請求項７】
前記部位特異的プロテアーゼが第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、カリクレイン、トロンビン、第ＸＩＩａ因子、コラゲナーゼ及びエンテロキナーゼから選択される請求項６に記載のファージ。
【請求項８】
前記アリール−アジド非天然アミノ酸残基がパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基である請求項１に記載のファージ。
【請求項９】
前記ファージが固体支持体に固定化されている請求項１に記載のファージ。
【請求項１０】
請求項１に記載の複数のファージ。
【請求項１１】
複数の異なるポリペプチドを提示する請求項１に記載の複数のファージ。
【請求項１２】
前記複数のファージがファージディスプレイライブラリーを含む請求項１１に記載の複数のファージ。
【請求項１３】
前記ファージが精製又は単離されている請求項１に記載のファージ。
【請求項１４】
翻訳後修飾ファージの作製方法であって、
（ａ）少なくとも１個のアリール−アジド非天然アミノ酸残基を組込んだポリペプチドを含むファージを提供する段階と；
（ｂ）前記非天然アミノ酸残基がスタウディンガーライゲーション反応を含む共有結合的修飾を受ける条件下で前記ファージを反応させることにより、翻訳後修飾ファージを作製する段階を含む前記方法。
【請求項１５】
前記方法により作製された前記翻訳後修飾ファージが生存可能である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１個のアリール−アジド非天然アミノ酸残基がパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記提供段階が、
（ｉ）Ａ）前記ファージをコードする核酸分子（但し、前記核酸分子は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドサブ配列を含み、前記ポリヌクレオチドサブ配列は少なくとも１個のセレクターコドンを含む）と；
Ｂ）前記宿主細胞で直交性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードする核酸分子と；
Ｃ）前記宿主細胞で直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードする核酸分子（但し、前記Ｏ−ＲＳは前記宿主細胞で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、前記セレクターコドンは前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される）と；
Ｄ）アリール−アジド非天然アミノ酸を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階と；
（ｉｉ）前記宿主細胞を培養することにより、前記ポリヌクレオチドサブ配列によりコードされるポリペプチドを生成し、翻訳中にセレクターコドンに応答して前記アリール−アジド非天然アミノ酸を前記ポリペプチドに組込むと共に、前記ポリヌクレオチドサブ配列によりコードされるポリペプチドを含むファージを作製し、前記アリール−アジド非天然アミノ酸を前記ポリペプチドに組込む段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記提供段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記提供段階がＯ−ＲＳをコードする核酸分子を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階を含み、前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記提供段階がＯ−ＲＳをコードする核酸分子を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階を含み、前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記提供段階がＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階を含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドを含む生存可能なファージであって、前記ポリペプチドが少なくとも１個の翻訳後修飾非天然アミノ酸残基を含む前記ファージ。
【請求項２３】
前記翻訳後修飾非天然アミノ酸残基がアリール−アジド非天然アミノ酸残基である請求項２２に記載の生存可能なファージ。
【請求項２４】
前記翻訳後修飾非天然アミノ酸残基がパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基である請求項２２に記載の生存可能なファージ。
【請求項２５】
前記翻訳後修飾非天然アミノ酸残基がスタウディンガーライゲーション反応により生成される請求項２２に記載の生存可能なファージ。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【公表番号】特表２００９−５１１０５３（Ｐ２００９−５１１０５３Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３５６４８（Ｐ２００８−５３５６４８）
【出願日】平成１８年１０月１１日（２００６．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３９７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４７３０１
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ　スクリップス　リサーチ　インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】