フォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体の認識領域からなる構成物
フォンビルブラント因子（ｖｏｎ ＷｉｌｌｅｂｒａｎｄＦａｃｔｏｒ：以下、ｖＷＦと称することがある）の特異的切断酵素（以下、ＡＤＡＭＴＳ−１３と称することがある）に対する抗体（以下、本抗体を抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体と称することがある）が認識するエピトープ及び当該エピトープ領域を含むポリペプチドを提供する。 抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体が認識するＡＤＡＭＴＳ−１３を構成するアミノ酸配列の４４９位から６８７位領域に存在するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本願発明は、医療用医薬品の分野に関する。詳細には、血液凝固に関与するフォンビルブラント因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ：以下、ｖＷＦと称することがある）の特異的切断酵素（以下、ＡＤＡＭＴＳ−１３と称することがある）に対する抗体（以下、本抗体を抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体と称することがある）が認識するエピトープ及び当該エピトープ領域を含むポリペプチドならびに当該ポリペプチドを認識する抗体に関する。
本願発明で提供されるＡＤＡＭＴＳ−１３に対する抗体の認識するエピトープ領域を含むポリペプチドあるいはペプチド断片により、ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する自己抗体の有無の診断あるいは自己抗体の吸収剤あるいは自己抗体陽性にともなう疾病患者へのＡＤＡＭＴＳ−１３の補充療法の可能性が拓かれる。
【背景技術】
ｖＷＦは、血管内皮細胞や骨髄巨核球で産生され、２０５０アミノ酸残基（モノマー約２５０ｋＤａ）からなる単一サブユニットがＳ−Ｓ結合にて結ばれたマルチマー構造（分子量５００〜２０，０００ｋＤａ）を持って存在している止血因子である。血中濃度は約１０μｇ／ｍｌで、一般に高分子量のものほど比活性が高い。
ｖＷＦには２つの大きな止血因子としての機能があり、１つは血液凝固第ＶＩＩＩ因子と結合し、これを安定化させるキャリアー蛋白質としての働き、もう１つは傷害血管壁の血管内皮細胞下組織に血小板を粘着・凝集させ、血小板血栓を形成する機能である。
血栓性血小板減少性紫斑病（以下、ＴＴＰと称することがある）は、全身の体組織細動脈と毛細血管に血小板血栓を生じる疾患であり、今日の医療技術の進歩にもかかわらず、当該疾患での関連死亡率は１９７１〜１９９１年にかけて約３倍に増加している。病理学的に、ＴＴＰは血管内皮細胞障害や血管内血小板凝集によって惹き起こされると考えられており、免疫組織学的には生じた血小板血栓中に多量のｖＷＦの存在が認められ、ｖＷＦがこの成因に大きな役割を果たしていると考えられている。ＴＴＰには遺伝的素因を有すると考えられる家族性（先天性）のものと特に成人において発症する後天性（特発性）のものなどに大別される。ＴＴＰ患者のｖＷＦのマルチマー構造は正常もしくは高分子量が優位となっており、特に通常では見られない超高分子量のｖＷＦ（ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｌａｒｇｅ ｖＷＦ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ＵＬｖＷＦＭ）や高分子量ｖＷＦ重合体（ｌａｒｇｅ ｖＷＦ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ＬｖＷＦＭ）が、高ずり応力下での血小板凝集の促進と微小血栓形成に大きな役割を果たしていることが推察される。一方で、ｖＷＦは健常人の循環血液中で高ずり応力下、ｖＷＦ切断酵素（ｖＷＦ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の作用により８４２Ｔｙｒ−８４３Ｍｅｔの位置で分解を受けることが知られていた。したがって、ＴＴＰは血漿中の当該酵素活性が何らかの原因で低下して、ＵＬｖＷＦＭないしＬｖＷＦＭが増加して血小板凝集が亢進し、血管内に血小板血栓が形成されるためというシナリオが描かれている。
２００１年、前記酵素活性を有する活性本体であるｖＷＦ切断酵素、別名ＡＤＡＭＴＳ−１３をコードする遺伝子が本願発明者等によりクローニングされた（特開２００３−２８４５７０号公報）。以下に、ＡＤＡＭＴＳ−１３の分子構造に関する知見を整理する。括弧内におおよその目安となる開始コドン（ＡＴＧ）のメチオニンからの残基番号の位置を示す（配列番号１参照）。
ＡＤＡＭＴＳ−１３のドメイン構成はＳｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅに続いてＰｒｏｐｅｐｔｉｄｅが存在し、次いで、Ｆｕｒｉｎの切断モチーフのＲＱＲＲ配列が存在し、ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨＤのコンセンサス配列からなるＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎタイプの亜鉛キレート領域を含むＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎが続く（アミノ酸残基番号２８４位（Ｐ２８５Ｘ）まで）。そして、蛇毒メタロプロテアーゼで見出されるようなＤｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎを経て（アミノ酸残基番号３８６位（Ｗ３８７Ｘ）まで）、一般的に分子認識に重要と考えられているおよそ５０〜６０残基からなる最初のＴｓｐ１ ｍｏｔｉｆ（Ｔｓｐ１−１）（アミノ酸残基番号４４８位（Ｑ４４９Ｘ）まで）へとつながり、さらに、細胞接着モチーフの１つであるＲＧＤＳ配列が含まれるＣｙｓ−ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ（アミノ酸残基番号５８０位（Ｔ５８１Ｘ）まで）へと続く。次いで、システイン残基を全く含まない約１３０アミノ酸残基からなるＳｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ（アミノ酸残基番号６８７位（Ｗ６８８Ｘ）まで）を経て、再びＴｓｐ１ ｍｏｔｉｆの繰り返し（Ｔｓｐ１−２〜８）の後、補体成分Ｃ１ｒあるいはＣ１ｓの中に最初に見つかったとされるＣＵＢ ｄｏｍａｉｎ−１，２が続く。
ところで、ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する主要な中和エピトープ領域に関しての知見はこれまでのところ全く得られていない。また、当該酵素に対する自己抗体陽性患者の簡便な診断法も確立されていない。
斯かる状況に鑑み、本願発明の第一の課題は、ＡＤＡＭＴＳ−１３上に存在する中和エピトープの同定とそれにより発案される自己抗体を主たる対象とする抗体の中和・吸収材に係る発明である。
本願発明の第二の課題は、斯かる中和・吸収材の製造方法を提供することにある。
本願発明の第三の課題は、斯かる中和・吸収材の用途を提供することにある。
本願発明の第四の課題は、斯かるエピトープを改変することにより得られるｖＷＦ特異的切断酵素全長もしくは部分改変分子の製造方法を提供することにある。
本願発明の第五の課題は、斯かるエピトープを改変することにより得られるｖＷＦ特異的切断酵素全長もしくは部分改変分子の用途を提供することにある。
ｖＷＦ特異的切断酵素の先天的欠損患者及び後天性の当該酵素に対する抗体陽性患者の治療法として、現在までプラズマ交換療法が施されており、当該酵素の精製品または遺伝子組換え体等純品による補充療法の確立が望まれる。家族性ＴＴＰ患者は、先天的にｖＷＦ特異的切断酵素が欠損しており、非家族性では後天的に当該酵素に対する自己抗体の産生が原因と報告されている。したがって、家族性ＴＴＰ患者には、当該酵素の補充療法が望ましく（現実には血漿投与が行われている）、非家族性では、血漿交換による自己抗体の除去と当該酵素の補充が必要である。
しかし、自己抗体陽性患者へのＡＤＡＭＴＳ−１３の補充投与においては患者血液中に存在する当該酵素に対する抗体、すなわち自己抗体によって中和されることにより、投与された酵素は酵素活性を失い実質的には濃度が減ぜられる。しかし、先の出願（特願２００２−２７９９２４）のＡＤＡＭＴＳ−１３に対する抗体のエピトープの決定方法、あるいは本願発明において同定された中和領域の利用ならびに本願発明において用いられた競合阻害法のウェスタンブロッティングを行うことにより新たに同定されうる中和エピトープ領域を部分改変した分子を調製することで、当該酵素に対する抗体陽性患者への投与が可能になる。あるいは本願発明によって提供される中和領域を含むポリペプチド等による抗体の吸収が可能になる。
【発明の開示】
上述の状況の下、本願発明者等は先の出願（特開２００３−２８４５７０号公報）においてｖＷＦ切断酵素の単離同定を達成するべく、鋭意研究を重ねた結果、従来報告のなかった所望のｖＷＦ切断酵素の精製単離に成功し、その成熟型蛋白質のアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を同定するに至った。
そして、先の出願（特開２００３−２８４５７０号公報）記載の遺伝子組換え技術を利用して得られた知見に基づき、活性発現に必須と考えられる領域を特定した（特願２００２−２７９９２４）。この知見に基づいて調製された変異体分子を利用した本願発明の後天性ＴＴＰ患者の抗ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する自己抗体の認識する主要中和領域解析の結果、該自己抗体の認識領域は前記の活性発現に必須と考えられる領域と一致して、Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ領域（４９９位程度）からＳｐａｃｅｒ領域（６８７位程度）に存在することが明らかとなった。よって、本願発明で提供される抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体に関する主要な中和エピトープ領域の主たる要件は、ＡＤＡＭＴＳ−１３を構成するポリペプチド中のＣｙｓ−ｒｉｃｈ領域（４９９位程度）からＳｐａｃｅｒ領域（６８７位程度）の領域または同等のアミノ酸配列を有するペプチド断片である。すなわち、本発明はフォンビルブランド因子特異的切断酵素（以下、ｖＷＦＣＰもしくはＡＤＡＭＴＳ−１３と称することがある）に対する抗体が認識する、当該酵素の中和エピトープ領域を包含するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片であり、前記中和エピトープ領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位領域に存在するものである請求項１記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片である。さらに、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体が認識するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片である。ここで、１個または数個とは１個から５個、好ましくは１個から３個さらに好ましくは１個もしくは２個をいう。
そして、この知見から得られるＡＤＡＭＴＳ−１３のアミノ酸配列を基に調製される中和エピトープ領域のポリペプチド等を抗原にして、通常の免疫方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ．ＭｃＣＡＦＦＥＲＴＹ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）あるいはＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．ＢＯＲＲＥＢＡＥＣＫ（１９９５））によってモノクローナル及びポリクローナル抗体等の作製が可能である。あるいは、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｒｉａｎ Ｋ．Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ．ＭｃＣＡＦＦＥＲＴＹ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、あるいはＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．ＢＯＲＲＥＢＡＥＣＫ（１９９５））により当該蛋白質（ＡＤＡＭＴＳ−１３）と結合する抗体の作出が可能である。あるいは、これらの技術に基づき、本酵素に対する自己抗体陽性であるＴＴＰ患者検体からの本酵素活性の中和抗体もしくは単なる結合抗体の単離も可能である。そして、これらの抗体を用いることで、本酵素量の変動を伴う疾病、例えばＴＴＰなどの疾患の診断及び治療への応用が可能となる。本発明はこれらの抗体をも含有する。
一実施態様において、本発明は、ＴＴＰ様の疾患またはｖＷＦ依存性の血栓症の恐れのある患者を診断する方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
本酵素量の変動を伴う疾病に関する診断的アッセイは、患者からの生物学的試料を用いて行われる。これらの試料は、直接的に用いられることができ、またはいくつかの事例においては、アッセイを行う前に処置、例えば干渉する可能性のある試料中の物質を除去することなどを必要とすることができる。適した生物学的試料の例は、血液、尿、汗、組織または血清である。該方法は、上記生物学的試料中のｖＷＦ切断酵素に対する自己抗体を検出することを含む。
（ａ）患者から得られた生物学的試料を、ＡＤＡＭＴＳ−１３もしくはその部分ペプチド断片を固定化した固型支持物と接触させること；
（ｂ）固型支持物を、現像剤標識化抗ヒト免疫グロブリン抗体と接触させること；
及び、（ｃ）試料中における抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の濃度に相応する値を得るために、工程（ｂ）において特異的に結合している現像剤の標識を検出すること。
上記診断は、公知のイムノアッセイ方法により行うことができ、固形支持物としてはポリスチレン等の樹脂製のビーズ、プレート等を用いることができ、現像剤としては、放射性同位元素、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、蛍光物質等を用いることができる。
本願発明の他の実施態様として、本発明のポリペプチドは、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者への投与による自己抗体の中和剤としてまたは、自己抗体除去剤としても有用である。この場合、自己抗体の中和とは、自己抗体に結合し自己抗体がｖＷＦ切断酵素に結合することを阻害することをいう。この方法において、ポリペプチドは、場合によっては適した支持物等、当該分野に公知の方法を用いて固定化される。次いで、除去すべき抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を含む試料、たとえば患者血液と固定化したポリペプチドを接触させることで患者試料中から自己抗体を除去する。この際、抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体に特異的なリガンドが結合した担体と患者の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体を前記リガンドに結合させることにより血液または血漿から該抗体を除去し、次いで抗体を除去した血液または血漿を患者に再注入すればよい。ここで、抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体に特異的なリガンドとしては、前記ポリペプチドまたはポリペプチド由来のペプチド断片を用いることができる。また、接触は例えば患者血液または血漿を上記リガンドが結合した担体に通過させればよい。さらに、本発明は上記のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が結合した担体と抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体を前記リガンドに結合させ血液または血漿から該抗体を除去することにより抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を含まない血液または血漿を製造する方法を包含する。
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者への投与する自己抗体の中和剤は、上記のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者処置用医薬組成物である。さらに、ポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が分子置換・欠失・挿入などの改変により抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体との反応性が消失したポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者処置用医薬組成物である。ここで、分子置換・欠失・挿入などの改変とは、例えば上記ポリペプチドまたは該ポリペプチド由来のペプチド断片のアミノ酸配列において、１個または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることをいう。このような改変により、例えばポリペプチドまたはペプチド断片の構造が変化し、エピトープを喪失することにより、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体との反応性が消失する。例えば、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者への投与による自己抗体の中和剤として本発明の抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の認識するポリペプチドを使用する場合、生理食塩水、緩衝液等で希釈して製剤化し、医薬組成物を得ることもできる。製剤のｐＨは体液のｐＨに近い弱酸性〜中性域のｐＨが望ましく、その下限は５．０〜６．４が望ましく、その上限はｐＨ６．４〜７．４が望ましい。また、凍結乾燥形態等の長期間保存可能な形態で提供することもでき、この場合使用時に水、生理食塩水、緩衝液等で所望の濃度になるように溶解して使用することができる。本発明の製剤は、通常医薬品に用いられる薬理学的に許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分を含有していてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、１〜１０ｗ／ｖ％程度が添加されていることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等により有効量で投与することができ、１回または数回に分けて投与される。その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、１回あたり、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましい。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０７１９７９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗体のエピトープを決定するためのＣ末欠失変異体作製法を示す図である。
図２は、調製されたＣ末欠失変異体の発現を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて非還元下ウェスタンブロットにてその存在量を確認した写真である。
図３は、後天性ＴＴＰ患者００３に由来する精製ＩｇＧによる非還元下ウェスタンブロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図４は、後天性ＴＴＰ患者００４に由来する精製ＩｇＧによる非還元下ウェスタンブロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図５は、後天性ＴＴＰ患者００９に由来する精製ＩｇＧによる非還元下ウェスタンブロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図６は、後天性ＴＴＰ患者に由来する精製ＩｇＧのより詳細な認識領域の確認を行った写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例】
調製例１
（ＡＤＡＭＴＳ−１３Ｃ末欠失変異体の作製）
先の特許出願（特願２００２−２７９９２４）記載の全長及びＣ末端より逐次ドメインを欠失させた変異体（Ｆｕｌｌ１４２７、Ｔ１１３５Ｘ、Ｗ１０１６Ｘ、Ｗ８９７Ｘ、Ｗ８０８Ｘ、Ｗ７４６Ｘ、Ｗ６８８Ｘ、Ｔ５８１Ｘ、Ｑ４４９Ｘ、Ｗ３８７Ｘ、Ｐ２８５Ｘ、：それぞれの数字は開始コドンＡＴＧのコードするＭｅｔから終結コドンまでのアミノ酸の残基数を示し、Ｘはｓｔｏｐコドンを表す。）遺伝子発現ベクターを利用して、Ｈｅｌａ細胞を用いて、以下の手順でトランスフェクトした。図１に各変異体の全長配列中における位置を示す。
まず初めに、トランスフェクションの２４時間前に１−３×１０５個／３５ｍｍ ｄｉｓｈで細胞を捲き、その翌日に上記発現ベクターを２μｇ当たり１０μｌのＰｏｌｙａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔであるＴｒａｎｓＩＴ（ＴＡＫＡＲＡ社製）をとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ等の無血清培地２００μｌに添加して、試薬添付文書に従い、ＤＮＡとのコンプレックスを調製後、準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、６時間インキュベーションし、その７２時間後、培地を回収した。それぞれの変異体を適宜濃縮したものの検出は抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（コダック社製）を用いたウエスタンブロット法により、抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ酵素標識抗体系で染色して行った（図２に発現の様子を確認した結果を示す。）。
【実施例１】
（ウェスタンブロットを利用した後天性ＴＴＰ患者抗体のエピトープの解析）
常法により、プロテインＡカラムを用いて後天性患者血漿よりＩｇＧ画分を調製し（抗体濃度約２−５ｍｇ／ｍｌ）、それを２００倍希釈してウェスタンブロットを行った。フィルターは二次抗体に抗ヒトＩｇＧアルカリフォスファターゼ標識抗体を用いてＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質により染色し可視化した（図３〜５）。これらにより決定された抗体の認識領域は３者の抗体画分いずれにおいてもＷ６８８Ｘまで反応しＱ４４９Ｘで反応しないことからＱ４４９ＸよりもＣ末端側に存在することが確認された。
【実施例２】
（競合阻害の原理に基づくウェスタンブロットを利用した後天性ＴＴＰ患者抗体の詳細なエピトープの解析）
次にさらに詳細な本中和抗体の認識エピトープを絞り込むために、Ｗ６８８Ｘ及びＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅの上清を電気泳動しＰＶＤＦ膜へトランスファーしたものを、前述の患者抗体を予め大過剰のＱ４４９Ｘ、Ｗ６８８Ｘ、あるいはＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅの発現上清の濃縮物とプレインキュベーションしたものを一次抗体反応液として用いることで競合阻害の系により、Ｗ６８８Ｘによりいずれの検体もＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅの陽性バンドが消失することを確認した（図６）。
このことからこの３者の抗体はいずれもＷ６８８ＸよりもＮ末側を認識していることが示唆された。
以上、実施例１，２に示す結果により、用いた３者の自己抗体は、Ｑ４４９Ｘ末側でＷ６８８ＸよりもＮ末側すなわちＱ４４９ＸとＷ６８８Ｘの間であるＣｙｓ−ｒｉｃｈ領域からＳｐａｃｅｒ領域が主要な中和領域であることが確認された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本願発明によりもたらされた知見により、この発明のポリペプチドは、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体に対して特異的に免疫反応性を示す。したがって抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体量の迅速な検出、本酵素変動に伴う疾病の診断あるいは抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の結合あるいは阻害活性の中和が可能となる。このように、本願発明で提供されるポリペプチドは、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の検出をはじめとする多種多様の用途を提供するものでもある。
本願発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【技術分野】
本願発明は、医療用医薬品の分野に関する。詳細には、血液凝固に関与するフォンビルブラント因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ：以下、ｖＷＦと称することがある）の特異的切断酵素（以下、ＡＤＡＭＴＳ−１３と称することがある）に対する抗体（以下、本抗体を抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体と称することがある）が認識するエピトープ及び当該エピトープ領域を含むポリペプチドならびに当該ポリペプチドを認識する抗体に関する。
本願発明で提供されるＡＤＡＭＴＳ−１３に対する抗体の認識するエピトープ領域を含むポリペプチドあるいはペプチド断片により、ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する自己抗体の有無の診断あるいは自己抗体の吸収剤あるいは自己抗体陽性にともなう疾病患者へのＡＤＡＭＴＳ−１３の補充療法の可能性が拓かれる。
【背景技術】
ｖＷＦは、血管内皮細胞や骨髄巨核球で産生され、２０５０アミノ酸残基（モノマー約２５０ｋＤａ）からなる単一サブユニットがＳ−Ｓ結合にて結ばれたマルチマー構造（分子量５００〜２０，０００ｋＤａ）を持って存在している止血因子である。血中濃度は約１０μｇ／ｍｌで、一般に高分子量のものほど比活性が高い。
ｖＷＦには２つの大きな止血因子としての機能があり、１つは血液凝固第ＶＩＩＩ因子と結合し、これを安定化させるキャリアー蛋白質としての働き、もう１つは傷害血管壁の血管内皮細胞下組織に血小板を粘着・凝集させ、血小板血栓を形成する機能である。
血栓性血小板減少性紫斑病（以下、ＴＴＰと称することがある）は、全身の体組織細動脈と毛細血管に血小板血栓を生じる疾患であり、今日の医療技術の進歩にもかかわらず、当該疾患での関連死亡率は１９７１〜１９９１年にかけて約３倍に増加している。病理学的に、ＴＴＰは血管内皮細胞障害や血管内血小板凝集によって惹き起こされると考えられており、免疫組織学的には生じた血小板血栓中に多量のｖＷＦの存在が認められ、ｖＷＦがこの成因に大きな役割を果たしていると考えられている。ＴＴＰには遺伝的素因を有すると考えられる家族性（先天性）のものと特に成人において発症する後天性（特発性）のものなどに大別される。ＴＴＰ患者のｖＷＦのマルチマー構造は正常もしくは高分子量が優位となっており、特に通常では見られない超高分子量のｖＷＦ（ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｌａｒｇｅ ｖＷＦ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ＵＬｖＷＦＭ）や高分子量ｖＷＦ重合体（ｌａｒｇｅ ｖＷＦ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ＬｖＷＦＭ）が、高ずり応力下での血小板凝集の促進と微小血栓形成に大きな役割を果たしていることが推察される。一方で、ｖＷＦは健常人の循環血液中で高ずり応力下、ｖＷＦ切断酵素（ｖＷＦ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の作用により８４２Ｔｙｒ−８４３Ｍｅｔの位置で分解を受けることが知られていた。したがって、ＴＴＰは血漿中の当該酵素活性が何らかの原因で低下して、ＵＬｖＷＦＭないしＬｖＷＦＭが増加して血小板凝集が亢進し、血管内に血小板血栓が形成されるためというシナリオが描かれている。
２００１年、前記酵素活性を有する活性本体であるｖＷＦ切断酵素、別名ＡＤＡＭＴＳ−１３をコードする遺伝子が本願発明者等によりクローニングされた（特開２００３−２８４５７０号公報）。以下に、ＡＤＡＭＴＳ−１３の分子構造に関する知見を整理する。括弧内におおよその目安となる開始コドン（ＡＴＧ）のメチオニンからの残基番号の位置を示す（配列番号１参照）。
ＡＤＡＭＴＳ−１３のドメイン構成はＳｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅに続いてＰｒｏｐｅｐｔｉｄｅが存在し、次いで、Ｆｕｒｉｎの切断モチーフのＲＱＲＲ配列が存在し、ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨＤのコンセンサス配列からなるＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎタイプの亜鉛キレート領域を含むＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎが続く（アミノ酸残基番号２８４位（Ｐ２８５Ｘ）まで）。そして、蛇毒メタロプロテアーゼで見出されるようなＤｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎを経て（アミノ酸残基番号３８６位（Ｗ３８７Ｘ）まで）、一般的に分子認識に重要と考えられているおよそ５０〜６０残基からなる最初のＴｓｐ１ ｍｏｔｉｆ（Ｔｓｐ１−１）（アミノ酸残基番号４４８位（Ｑ４４９Ｘ）まで）へとつながり、さらに、細胞接着モチーフの１つであるＲＧＤＳ配列が含まれるＣｙｓ−ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ（アミノ酸残基番号５８０位（Ｔ５８１Ｘ）まで）へと続く。次いで、システイン残基を全く含まない約１３０アミノ酸残基からなるＳｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ（アミノ酸残基番号６８７位（Ｗ６８８Ｘ）まで）を経て、再びＴｓｐ１ ｍｏｔｉｆの繰り返し（Ｔｓｐ１−２〜８）の後、補体成分Ｃ１ｒあるいはＣ１ｓの中に最初に見つかったとされるＣＵＢ ｄｏｍａｉｎ−１，２が続く。
ところで、ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する主要な中和エピトープ領域に関しての知見はこれまでのところ全く得られていない。また、当該酵素に対する自己抗体陽性患者の簡便な診断法も確立されていない。
斯かる状況に鑑み、本願発明の第一の課題は、ＡＤＡＭＴＳ−１３上に存在する中和エピトープの同定とそれにより発案される自己抗体を主たる対象とする抗体の中和・吸収材に係る発明である。
本願発明の第二の課題は、斯かる中和・吸収材の製造方法を提供することにある。
本願発明の第三の課題は、斯かる中和・吸収材の用途を提供することにある。
本願発明の第四の課題は、斯かるエピトープを改変することにより得られるｖＷＦ特異的切断酵素全長もしくは部分改変分子の製造方法を提供することにある。
本願発明の第五の課題は、斯かるエピトープを改変することにより得られるｖＷＦ特異的切断酵素全長もしくは部分改変分子の用途を提供することにある。
ｖＷＦ特異的切断酵素の先天的欠損患者及び後天性の当該酵素に対する抗体陽性患者の治療法として、現在までプラズマ交換療法が施されており、当該酵素の精製品または遺伝子組換え体等純品による補充療法の確立が望まれる。家族性ＴＴＰ患者は、先天的にｖＷＦ特異的切断酵素が欠損しており、非家族性では後天的に当該酵素に対する自己抗体の産生が原因と報告されている。したがって、家族性ＴＴＰ患者には、当該酵素の補充療法が望ましく（現実には血漿投与が行われている）、非家族性では、血漿交換による自己抗体の除去と当該酵素の補充が必要である。
しかし、自己抗体陽性患者へのＡＤＡＭＴＳ−１３の補充投与においては患者血液中に存在する当該酵素に対する抗体、すなわち自己抗体によって中和されることにより、投与された酵素は酵素活性を失い実質的には濃度が減ぜられる。しかし、先の出願（特願２００２−２７９９２４）のＡＤＡＭＴＳ−１３に対する抗体のエピトープの決定方法、あるいは本願発明において同定された中和領域の利用ならびに本願発明において用いられた競合阻害法のウェスタンブロッティングを行うことにより新たに同定されうる中和エピトープ領域を部分改変した分子を調製することで、当該酵素に対する抗体陽性患者への投与が可能になる。あるいは本願発明によって提供される中和領域を含むポリペプチド等による抗体の吸収が可能になる。
【発明の開示】
上述の状況の下、本願発明者等は先の出願（特開２００３−２８４５７０号公報）においてｖＷＦ切断酵素の単離同定を達成するべく、鋭意研究を重ねた結果、従来報告のなかった所望のｖＷＦ切断酵素の精製単離に成功し、その成熟型蛋白質のアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を同定するに至った。
そして、先の出願（特開２００３−２８４５７０号公報）記載の遺伝子組換え技術を利用して得られた知見に基づき、活性発現に必須と考えられる領域を特定した（特願２００２−２７９９２４）。この知見に基づいて調製された変異体分子を利用した本願発明の後天性ＴＴＰ患者の抗ＡＤＡＭＴＳ−１３に対する自己抗体の認識する主要中和領域解析の結果、該自己抗体の認識領域は前記の活性発現に必須と考えられる領域と一致して、Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ領域（４９９位程度）からＳｐａｃｅｒ領域（６８７位程度）に存在することが明らかとなった。よって、本願発明で提供される抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体に関する主要な中和エピトープ領域の主たる要件は、ＡＤＡＭＴＳ−１３を構成するポリペプチド中のＣｙｓ−ｒｉｃｈ領域（４９９位程度）からＳｐａｃｅｒ領域（６８７位程度）の領域または同等のアミノ酸配列を有するペプチド断片である。すなわち、本発明はフォンビルブランド因子特異的切断酵素（以下、ｖＷＦＣＰもしくはＡＤＡＭＴＳ−１３と称することがある）に対する抗体が認識する、当該酵素の中和エピトープ領域を包含するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片であり、前記中和エピトープ領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位領域に存在するものである請求項１記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片である。さらに、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体が認識するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片である。ここで、１個または数個とは１個から５個、好ましくは１個から３個さらに好ましくは１個もしくは２個をいう。
そして、この知見から得られるＡＤＡＭＴＳ−１３のアミノ酸配列を基に調製される中和エピトープ領域のポリペプチド等を抗原にして、通常の免疫方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ．ＭｃＣＡＦＦＥＲＴＹ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）あるいはＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．ＢＯＲＲＥＢＡＥＣＫ（１９９５））によってモノクローナル及びポリクローナル抗体等の作製が可能である。あるいは、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｒｉａｎ Ｋ．Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ．ＭｃＣＡＦＦＥＲＴＹ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、あるいはＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．ＢＯＲＲＥＢＡＥＣＫ（１９９５））により当該蛋白質（ＡＤＡＭＴＳ−１３）と結合する抗体の作出が可能である。あるいは、これらの技術に基づき、本酵素に対する自己抗体陽性であるＴＴＰ患者検体からの本酵素活性の中和抗体もしくは単なる結合抗体の単離も可能である。そして、これらの抗体を用いることで、本酵素量の変動を伴う疾病、例えばＴＴＰなどの疾患の診断及び治療への応用が可能となる。本発明はこれらの抗体をも含有する。
一実施態様において、本発明は、ＴＴＰ様の疾患またはｖＷＦ依存性の血栓症の恐れのある患者を診断する方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
本酵素量の変動を伴う疾病に関する診断的アッセイは、患者からの生物学的試料を用いて行われる。これらの試料は、直接的に用いられることができ、またはいくつかの事例においては、アッセイを行う前に処置、例えば干渉する可能性のある試料中の物質を除去することなどを必要とすることができる。適した生物学的試料の例は、血液、尿、汗、組織または血清である。該方法は、上記生物学的試料中のｖＷＦ切断酵素に対する自己抗体を検出することを含む。
（ａ）患者から得られた生物学的試料を、ＡＤＡＭＴＳ−１３もしくはその部分ペプチド断片を固定化した固型支持物と接触させること；
（ｂ）固型支持物を、現像剤標識化抗ヒト免疫グロブリン抗体と接触させること；
及び、（ｃ）試料中における抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の濃度に相応する値を得るために、工程（ｂ）において特異的に結合している現像剤の標識を検出すること。
上記診断は、公知のイムノアッセイ方法により行うことができ、固形支持物としてはポリスチレン等の樹脂製のビーズ、プレート等を用いることができ、現像剤としては、放射性同位元素、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、蛍光物質等を用いることができる。
本願発明の他の実施態様として、本発明のポリペプチドは、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者への投与による自己抗体の中和剤としてまたは、自己抗体除去剤としても有用である。この場合、自己抗体の中和とは、自己抗体に結合し自己抗体がｖＷＦ切断酵素に結合することを阻害することをいう。この方法において、ポリペプチドは、場合によっては適した支持物等、当該分野に公知の方法を用いて固定化される。次いで、除去すべき抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を含む試料、たとえば患者血液と固定化したポリペプチドを接触させることで患者試料中から自己抗体を除去する。この際、抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体に特異的なリガンドが結合した担体と患者の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体を前記リガンドに結合させることにより血液または血漿から該抗体を除去し、次いで抗体を除去した血液または血漿を患者に再注入すればよい。ここで、抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体に特異的なリガンドとしては、前記ポリペプチドまたはポリペプチド由来のペプチド断片を用いることができる。また、接触は例えば患者血液または血漿を上記リガンドが結合した担体に通過させればよい。さらに、本発明は上記のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が結合した担体と抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体を前記リガンドに結合させ血液または血漿から該抗体を除去することにより抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を含まない血液または血漿を製造する方法を包含する。
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者への投与する自己抗体の中和剤は、上記のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者処置用医薬組成物である。さらに、ポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が分子置換・欠失・挿入などの改変により抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体との反応性が消失したポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者処置用医薬組成物である。ここで、分子置換・欠失・挿入などの改変とは、例えば上記ポリペプチドまたは該ポリペプチド由来のペプチド断片のアミノ酸配列において、１個または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることをいう。このような改変により、例えばポリペプチドまたはペプチド断片の構造が変化し、エピトープを喪失することにより、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体との反応性が消失する。例えば、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者への投与による自己抗体の中和剤として本発明の抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の認識するポリペプチドを使用する場合、生理食塩水、緩衝液等で希釈して製剤化し、医薬組成物を得ることもできる。製剤のｐＨは体液のｐＨに近い弱酸性〜中性域のｐＨが望ましく、その下限は５．０〜６．４が望ましく、その上限はｐＨ６．４〜７．４が望ましい。また、凍結乾燥形態等の長期間保存可能な形態で提供することもでき、この場合使用時に水、生理食塩水、緩衝液等で所望の濃度になるように溶解して使用することができる。本発明の製剤は、通常医薬品に用いられる薬理学的に許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分を含有していてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、１〜１０ｗ／ｖ％程度が添加されていることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等により有効量で投与することができ、１回または数回に分けて投与される。その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、１回あたり、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましい。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０７１９７９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗体のエピトープを決定するためのＣ末欠失変異体作製法を示す図である。
図２は、調製されたＣ末欠失変異体の発現を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて非還元下ウェスタンブロットにてその存在量を確認した写真である。
図３は、後天性ＴＴＰ患者００３に由来する精製ＩｇＧによる非還元下ウェスタンブロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図４は、後天性ＴＴＰ患者００４に由来する精製ＩｇＧによる非還元下ウェスタンブロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図５は、後天性ＴＴＰ患者００９に由来する精製ＩｇＧによる非還元下ウェスタンブロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図６は、後天性ＴＴＰ患者に由来する精製ＩｇＧのより詳細な認識領域の確認を行った写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例】
調製例１
（ＡＤＡＭＴＳ−１３Ｃ末欠失変異体の作製）
先の特許出願（特願２００２−２７９９２４）記載の全長及びＣ末端より逐次ドメインを欠失させた変異体（Ｆｕｌｌ１４２７、Ｔ１１３５Ｘ、Ｗ１０１６Ｘ、Ｗ８９７Ｘ、Ｗ８０８Ｘ、Ｗ７４６Ｘ、Ｗ６８８Ｘ、Ｔ５８１Ｘ、Ｑ４４９Ｘ、Ｗ３８７Ｘ、Ｐ２８５Ｘ、：それぞれの数字は開始コドンＡＴＧのコードするＭｅｔから終結コドンまでのアミノ酸の残基数を示し、Ｘはｓｔｏｐコドンを表す。）遺伝子発現ベクターを利用して、Ｈｅｌａ細胞を用いて、以下の手順でトランスフェクトした。図１に各変異体の全長配列中における位置を示す。
まず初めに、トランスフェクションの２４時間前に１−３×１０５個／３５ｍｍ ｄｉｓｈで細胞を捲き、その翌日に上記発現ベクターを２μｇ当たり１０μｌのＰｏｌｙａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔであるＴｒａｎｓＩＴ（ＴＡＫＡＲＡ社製）をとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ等の無血清培地２００μｌに添加して、試薬添付文書に従い、ＤＮＡとのコンプレックスを調製後、準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、６時間インキュベーションし、その７２時間後、培地を回収した。それぞれの変異体を適宜濃縮したものの検出は抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（コダック社製）を用いたウエスタンブロット法により、抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ酵素標識抗体系で染色して行った（図２に発現の様子を確認した結果を示す。）。
【実施例１】
（ウェスタンブロットを利用した後天性ＴＴＰ患者抗体のエピトープの解析）
常法により、プロテインＡカラムを用いて後天性患者血漿よりＩｇＧ画分を調製し（抗体濃度約２−５ｍｇ／ｍｌ）、それを２００倍希釈してウェスタンブロットを行った。フィルターは二次抗体に抗ヒトＩｇＧアルカリフォスファターゼ標識抗体を用いてＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質により染色し可視化した（図３〜５）。これらにより決定された抗体の認識領域は３者の抗体画分いずれにおいてもＷ６８８Ｘまで反応しＱ４４９Ｘで反応しないことからＱ４４９ＸよりもＣ末端側に存在することが確認された。
【実施例２】
（競合阻害の原理に基づくウェスタンブロットを利用した後天性ＴＴＰ患者抗体の詳細なエピトープの解析）
次にさらに詳細な本中和抗体の認識エピトープを絞り込むために、Ｗ６８８Ｘ及びＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅの上清を電気泳動しＰＶＤＦ膜へトランスファーしたものを、前述の患者抗体を予め大過剰のＱ４４９Ｘ、Ｗ６８８Ｘ、あるいはＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅの発現上清の濃縮物とプレインキュベーションしたものを一次抗体反応液として用いることで競合阻害の系により、Ｗ６８８Ｘによりいずれの検体もＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅの陽性バンドが消失することを確認した（図６）。
このことからこの３者の抗体はいずれもＷ６８８ＸよりもＮ末側を認識していることが示唆された。
以上、実施例１，２に示す結果により、用いた３者の自己抗体は、Ｑ４４９Ｘ末側でＷ６８８ＸよりもＮ末側すなわちＱ４４９ＸとＷ６８８Ｘの間であるＣｙｓ−ｒｉｃｈ領域からＳｐａｃｅｒ領域が主要な中和領域であることが確認された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本願発明によりもたらされた知見により、この発明のポリペプチドは、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体に対して特異的に免疫反応性を示す。したがって抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体量の迅速な検出、本酵素変動に伴う疾病の診断あるいは抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の結合あるいは阻害活性の中和が可能となる。このように、本願発明で提供されるポリペプチドは、抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体の検出をはじめとする多種多様の用途を提供するものでもある。
本願発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォンビルブランド因子特異的切断酵素（以下、ｖＷＦＣＰもしくはＡＤＡＭＴＳ−１３と称することがある）に対する抗体が認識する、当該酵素の中和エピトープ領域を包含するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項２】
前記中和エピトープ領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位領域に存在するものである請求項１記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体が認識するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片に結合性を有する抗体。
【請求項６】
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者血液中に存在する請求項５の抗体。
【請求項７】
非家族性血小板減少性紫斑病（以下、当該疾病をＴＴＰと称することがある）患者血液中に存在する請求項５または６に記載の抗体。
【請求項８】
ＡＤＡＭＴＳ−１３を構成するポリペプチドの全配列または請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を含む抗体測定試薬。
【請求項９】
ＴＴＰ患者の自己抗体を検出対象とする請求項８記載の抗体測定試薬。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体腸性患者処置用医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が分子置換・欠失・挿入などの改変により抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体との反応性が消失したポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む請求項１０記載の抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者処置用医薬組成物。
【請求項１２】
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者の処置のための、患者への投与による抗体の中和に用いられる請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者を処置するための抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体に特異的なリガンドを含む組成物であって、担体に結合させ前記患者の血漿と接触させ抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を患者の血漿から除去するための用いられる請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む組成物。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が結合した担体と抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体を前記リガンドに結合させ血液または血漿から該抗体を除去することにより抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を含まない血液または血漿を製造する方法。
【請求項１】
フォンビルブランド因子特異的切断酵素（以下、ｖＷＦＣＰもしくはＡＤＡＭＴＳ−１３と称することがある）に対する抗体が認識する、当該酵素の中和エピトープ領域を包含するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項２】
前記中和エピトープ領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位領域に存在するものである請求項１記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４９位から６８７位のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体が認識するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片に結合性を有する抗体。
【請求項６】
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者血液中に存在する請求項５の抗体。
【請求項７】
非家族性血小板減少性紫斑病（以下、当該疾病をＴＴＰと称することがある）患者血液中に存在する請求項５または６に記載の抗体。
【請求項８】
ＡＤＡＭＴＳ−１３を構成するポリペプチドの全配列または請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を含む抗体測定試薬。
【請求項９】
ＴＴＰ患者の自己抗体を検出対象とする請求項８記載の抗体測定試薬。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体腸性患者処置用医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が分子置換・欠失・挿入などの改変により抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体との反応性が消失したポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む請求項１０記載の抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者処置用医薬組成物。
【請求項１２】
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者の処置のための、患者への投与による抗体の中和に用いられる請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者を処置するための抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体に特異的なリガンドを含む組成物であって、担体に結合させ前記患者の血漿と接触させ抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を患者の血漿から除去するための用いられる請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片を有効成分として含む組成物。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が結合した担体と抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体陽性患者の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗ＡＤＡＴＳ−１３抗体を前記リガンドに結合させ血液または血漿から該抗体を除去することにより抗ＡＤＡＭＴＳ−１３抗体を含まない血液または血漿を製造する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３２５０
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３７２５（Ｐ２００５−５０３７２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３６０２
【国際出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３６０２
【国際出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
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